²-è-

Gamir Rania
1ère année du second cycle
Spécialité Biologie moléculaire
Groupe 01

Compte rendu de l’atelier de

biochimie

Dirigé par : Mme Haddi A

Mme Belhadj H

Année Universitaire : 2022 – 2023

Sommaire :
Matériel et méthodes .............................................................................................. 3
1. Obtention du lactosérum lyophilisé ........................................................................... 3
1.1. Obtention du lactosérum .................................................................................. 3
1.2. Dialyse du lactosérum ...................................................................................... 3
1.3. Lyophilisation du lactosérum ............................................................................ 3
2. Dosage des protéines totales par spectrophotométrie .............................................. 4
2.1. Méthode de Bradford (1976) ............................................................................ 4
2.2. Méthode de Lowry & al (1951) ......................................................................... 4
3. Dosage de l’activité d’une protéase ........................................................................... 5
4. Hydrolyse enzymatique des protéines ....................................................................... 5
5. Mesure du degré d’hydrolyse...................................................................................... 6
6. Etude qualitative des protéines par SDS-PAGE ...................................................... 6

Résultats et discussion ........................................................................................... 7

1. Obtention du lactosérum lyophilisé ........................................................................... 9

2. Dosage des protéines totales par spectrophotométrie .............................................. 9
2.1. Méthode de Lowry & al (1951) ........................................................................ 9
3. Dosage de l’activité d’une protéase ......................................................................... 10
4. Taux de l’hydrolyse enzymatique des protéines ..................................................... 10
5. Etude qualitative des protéines par SDS-PAGE .................................................... 11

Conclusion ..............................................................................................................12

Bibliographie ..........................................................................................................13

Annexe .....................................................................................................................14

2
Matériel et méthodes :

1. Obtention de lactosérum lyophilisé :

Le lactosérum, également appelé petit-lait ou sérum, est la partie liquide résiduelle de la coagulation du
lait. Le lactosérum est un liquide jaune-verdâtre, composé d'environ 94 % d'eau, de sucre (le lactose),
de protéines et de très peu de matières grasses.

1.1. Obtention du lactosérum :

Afin d’obtenir du lactosérum à partir de lait de vache frais :
1) Ecrémer le lait (retirez la matière grasse) en centrifugeant à 3500g pendant 15 minutes à 4°C
puis retirer le culot blanchâtre (répéter l’étape si nécessaire).
2) Ajuster le pH du lait écrémé à 4,6 en ajoutant du HCl 1N progressivement.
3) Centrifuger à 3500g pendant 15 minutes à 4°C puis éliminer le caillé, le liquide restant est le
lactosérum.

1.2. Dialyse du lactosérum :

Cette dialyse a pour but d’éliminer les molécules et les protéines de faible taille moléculaire qui nous
sont inutiles. Elle se fait par une membrane de cellulose ayant une porosité de 3500 Da suspendue dans
un tampon de contre dialyse (eau distillé) pendant 24 heures.
Le tampon de contre dialyse étant mois concentré que le lactosérum, va attirer les molécules ayant une
taille de moins de 3500 Da à travers la membrane.
Une fois la dialyse terminée, récupérer le contenu de la membrane pour le lyophiliser.

1.3. Lyophilisation du lactosérum :

Cette lyophilisation consiste à extraire l'eau contenue dans le lactosérum par interaction des techniques
du vide et du froid. Le lactosérum, préalablement congelé à basse température (entre -10°C et -80°C),
est placé dans une enceinte sous vide. L'abaissement de la pression en deçà du point d'équilibre sur la
courbe de tension de vapeur de l'eau entraîne une sublimation de la glace, c'est-à-dire que l'eau à l'état
de glace s'élimine sous forme de vapeur sans passer par l'état liquide. Un cycle de lyophilisation
comporte plusieurs phases :
− La congélation du produit.
− La dessiccation primaire.
− La dessiccation secondaire.

3
2. Dosage des protéines totales par spectrophotométrie :
L’objectif et de quantifier les protéines contenues dans le lyophilisat du lactosérum extrait par
différentes méthodes colorimétriques.

2.1. Méthode de Bradford (1976) :

Principe :
Cette méthode est basée sur le changement de la couleur du bleu de Coomassie G-250 après liaison
avec les acides aminés aromatiques (phénylalanine, tyrosine, tryptophane) et les résidus hydrophobes
présents dans les protéines.
Il existe deux versions de la méthode de Bradford :
• Standard assay : pour détecter des quantités de protéines allant de 10µg jusqu’à 100µg.
• Microassay : capable de détecter entre 1µg et 10µg de protéines.

Le protocole ci-dessous correspond au standard assay.

Protocole :
1) Préparer 100ml du réactif de Bradford en mélangeant 5ml de méthanol, 10ml d’acide
phosphorique (H3PO4) et 50ml d’eau distillé. Filtrer la solution puis compléter avec 35ml d’eau
distillé.
2) Préparer les échantillons en mélangeant 1V de la solution de lyophilisat de lactosérum à 1mg/ml
avec 50V du réactif puis incuber pendant 10min à température ambiante.
3) Préparer la gamme étalon en mélangeant 1V de la solution de BSA (Sérum albumine bovine) à
différentes concentrations (2 mg/ml | 1,5 mg/ml | 1 mg/ml | 0,75 mg/ml | 0,5 mg/ml | 0,25 mg/ml
| 0,125 mg/ml | 0 mg/ml) avec 50V du réactif puis incuber pendant 10min à température ambiante.
4) Lire l’absorbance des échantillons ainsi que de la gamme étalon à 595nm contre un blanc
contenant le réactif seul.

2.2. Méthode de Lowry & al (1951) :

Principe :
Cette méthode est basée sur une double séquence de réactions qui se terminent par la génération
de couleur. La première est la réaction de Biuret, où les liaisons peptidiques des protéines réagissent
avec le cuivre dans des conditions alcalines pour produire Cu+. Le Cu+ réagit alors avec le réactif de
Folin, dans la réaction de Folin Ciocalteau, où en substance le phosphomolybdotungstate est réduit en
bleu d'hétéropolymolybdène par l'oxydation catalysée par Cu+.

4
 Protocole :
1) Préparer les solutions B1, B2 et A comme suit :
• Solution A (alcaline) : 2% Na2CO3 dissout dans du NaOH à 0,1M
• Solution B1 : 5% CuSO4 dissout dans du H2O distillé
• Solution B2 : 10% de Tartrate de K+ et Na- dissout dans du H2O distillé.
2) Préparer la solution B en mélangeant 1V de la solution B1, 1V de la solution B2 et 8V d’eau
distillée.
3) Préparer le réactif de Biuret en mélangeant 1V de la solution B avec 50V de la solution A.
4) Préparer les échantillons en mélangeant 1ml de la solution de lyophilisat de lactosérum à 1mg/ml
avec 5ml du réactif de Biuret puis incuber pendant 10min à température ambiante.
5) Préparer la gamme étalon en mélangeant 1ml de la solution de BSA (Sérum albumine bovine) à
différentes concentrations (100 µg/ml | 80 µg/ml | 60 µg/ml | 40 µg/ml | 20 µg/ml | 10 µg/ml | 0
µg/ml) avec 5ml du réactif puis incuber pendant 10min à température ambiante.
6) Ajouter 500µl de Folin 1M à tous les tubes d’échantillons et de la gamme étalon puis incuber
pendant 30min à température ambiante.
7) Lire l’absorbance des échantillons ainsi que de la gamme étalon à 750nm contre un blanc
contenant le réactif seul.

3. Dosage de l’activité d’une protéase :

L’objectif est de mesurer l’activité enzymatique d’une protéase pour contrôler sa qualité en l’utilisant
pour hydrolyser des échantillons de caséine. En digérant les caséines, l’enzyme libère des acides aminés
tyrosine qui réagirons avec le réactif du Folin pour donner une couleur bleu mesurable au spectrophotomètre
à 660nm. Plus l’enzyme sera active, plus il y aura de tyrosine libre et plus la couleur sera intense. Les
absorbances obtenues seront après comparés à une gamme étalon de L-Tyrosine.
Le protocole utilisé est celui de « Universal Protease Activity Assay using Casein as a Substrate »
fourni par Sigma (lien cité dans les références).

4. Hydrolyse enzymatique des protéines :

Principe :
Hydrolyser par méthode enzymatique les protéines du lactosérum précédemment extrait en utilisant la
trypsine et stopper la réaction à différents temps afin d’étudier la cinétique enzymatique.

5
 Protocole :
1) Préparer la solution protéique ayant une concentration en protéines de 2mg/ml en faisant dissoudre
le lyophilisat de lactosérum dans 9ml de PBS 50 mM.
2) Préparer la solution enzymatique de trypsine dans du PBS 50 mM.
3) Ajouter la solution enzymatique à la solution protéique à un ratio E/S de 1% (pour une solution
enzymatique ayant une concentration initiale de 4mg/ml, prendre 45µl soit 0,18mg d’enzyme pour
18mg de protéine).
4) Mettre le mélange réactionnel au bain marie à une température de 37°C pour induire la catalyse.
5) Aliquoter 1,8ml du mélange 5 fois dans des tubes séparés à différents moments d’incubation (0 min,
5 min, 10 min, 15 min, 20 min) et stopper la réaction tout de suite en ajoutant 5µl de HCl à chaque
aliquot (la baisse brusque du pH stoppe la réaction).
6) Réserver les aliquots dans de la glace jusqu’à prochaine utilisation.

5. Mesure du degré d’hydrolyse :

Principe :
Mesurer le degré de l’hydrolyse enzymatique précédemment réalisée en utilisant la méthode
colorimétrique décrite par Doi et al (1981). Cette méthode consiste à utiliser la ninhydrine qui réagit avec
les groupements α-NH2 libres des acides aminés issues de l’hydrolyse pour former des chromophores qu'il
est possible de quantifier par spectrophotométrie.

Protocole :
1) Préparer les échantillons en mélangeant 500 µl de chaque aliquot d’hydrolysat avec 1ml de solution
de ninhydrine puis incuber à 84°C pendant 10 min.
2) Préparer la gamme étalon en mélangeant 500 µl de solution de leucine à différentes concentrations
(100 µg/ml, 75 µg/ml, 50 µg/ml, 25 µg/ml, 12,5 µg/ml, 0 µg/ml) avec 1ml de solution de ninhydrine
puis incuber à 84°C pendant 10 min.
3) Lire l’absorbance des échantillons ainsi que de la gamme étalon à 585nm contre un blanc contenant
de l’eau distillée.

6. Etude qualitative des protéines par SDS-PAGE :

Principe :
L’électrophorèse SDS-PAGE (électrophorèse en gel de polyacrylamide contenant du dodécylsulfate de
sodium) est une technique consistant à faire migrer des protéines dans un gel, sous l’influence d’un champ
électrique, permettant ainsi leur séparation.

6
 La manipulation nécessite :
• Une cuve à électrophorèse + un générateur électrique,
• Un gel de polyacrylamide (précoulé en cassette ou à préparer) contenant des puits pour dépôt,
• Des solutions tampons adaptées au gel.

Le gel de polyacrylamide est créé par la polymérisation d’acrylamide et de bis-acrylamide, en présence

d’agents de polymérisation (TEMED et persulfate d’ammonium). Plus la concentration en acrylamide est
élevée, plus les pores seront petits et plus les molécules seront freinées dans le gel.

Dans la SDS-PAGE, la séparation est réalisée en conditions dénaturantes en raison de l’ajout de SDS
qui est un détergent fort possédant une longue queue hydrocarbonée hydrophobe et une extrémité chargée
négativement. Il intéragit avec les protéines par sa portion hydrocarbonée en liant leurs régions
hydrophobes. En se liant à la protéine, le SDS empêche son repliement et lui confère une charge nette
négative.

En présence de SDS, les protéines auront donc toutes une charge apparente négative, elles migreront
donc toutes vers l’anode. Cela signifie que seul le poids moléculaire des protéines sera le facteur de leur
séparation. Les protéines ayant un petit poids moléculaire, seront moins retenues dans les pores du gel de
polyacrylamide et migreront donc plus loin que les grosses.

Protocole :
1) Préparer le gel de séparation à 12% en mélangeant :
• 1,33 ml de Tris 2M (pH 8,8)
• 2,4 ml de 40% acrylamide : bis-acrylamide (38:2)
• 100 µl de SDS 10%
• 4,27 ml d’eau distillée
• 80 µl de persulfate d’ammonium 10%
• 16 µl de TEMED
2) Préparer le gel de concentration à 5% en mélangeant :
• 0,6 ml de Tris 0,5M (pH 6,8)
• 0,4 ml de 40% acrylamide : bis-acrylamide (38:2)
• 50 µl de SDS 10%
• 4 ml d’eau distillée
• 40 µl de persulfate d’ammonium 10%
• 16 µl de TEMED

7
 (Le persulfate d’ammonium et le TEMED doivent être ajoutés juste avant de couler le gel car c’est eux
qui induisent la polymérisation).
3) Préparer la cuve a électrophorèse et s’assurer de son étanchéité.
4) Couler le gel de séparation entre les deux plaques en verre et ajouter de l’éthanol par-dessus pour
éliminer les bulles et égaliser la surface du gel.
5) Après solidification du gel de séparation, éliminer l’éthanol et couler le gel de concentration puis
placer le peigne pour créer les puits et laisser le gel se polymériser.
6) Préparer le tampon de migration (pH 8,3) qui contient 12g de Tris-HCL, 57,6g de Glycine et 2g de
SDS dissouts dans 2000 ml d’eau distillée.
7) Remplir le compartiment intérieur (entre la cassette de gel et la plaque de barrage) et le compartiment
principal de la cuve avec le tampon de migration sans atteindre la limite de remplissage.
8) Préparer le tampon de charge composé de Tris pH 6,8 + Glycérol 20% + SDS 4% + Bleu de
Bromophénol 0,03g + β-Mercaptoéthanol 3%.
9) Mélanger 25µl de chaque échantillon (lactosérum à 2mg/ml et hydrolysats T5, T10, T15, T20) avec
25µl du tampon de charge, les échantillons auront une couleur jaune (acide) due au HCl.
10) Neutraliser les échantillons en ajoutant 5µl de Tris à chacun, leur couleur deviendra bleue.
11) Incuber les échantillons dans un cristallisoir à 95°C pendant 5 minutes.
12) A l’aide d’une seringue Hamilton, déposer 10µl du marqueur de taille dans le premier puis du gel puis
déposer 10µl de chaque échantillon dans les puits suivants.
13) Fermer la cuve à électrophorèse avec le couvercle porte-électrodes, accorder les électrodes au
générateur, puis régler les conditions de migrations (130 V, 100 mA, durée 100 minutes) et
commencer la migration.
14) Préparer 100ml de solution de coloration composée de Bleu de Coomassie R-250 0,2% + Ethanol 30%
+ Acide acétique 5%.
15) Préparer 1000ml de solution de décoloration composée d’Ethanol 30% + Acide acétique 5% + Eau
distillée 65%.
16) Après la fin de la migration, ouvrir le couvercle, sortir le bloc support + gel d’électrophorèse.
17) Eliminer le tampon de migration (ce dernier peut être récupéré et réutilisé).
18) Démonter les différentes fixations pour récupérer délicatement la cassette de gel se trouvant entre les
deux plaques en verre.
19) Transférer le gel dans un bac rempli de la solution de coloration et laisser colorer pendant 45 minutes.
20) Après 45 minutes, transférer le gel dans un bac rempli de la solution de décoloration et laisser
décolorer jusqu’à transparisation complète du fond du gel.

8
Résultats et discussion :

1. Obtention de lactosérum lyophilisé :

Le protocole employé pour obtenir le lactosérum s’est avéré efficace et a donné des résultats
satisfaisants. Le lactosérum obtenu est de couleur jaunâtre a un pH acide due à l’utilisation du HCl.
Après la dialyse et la lyophilisation du lactosérum, on obtient une poudre blanchâtre riche en protéine.

2. Dosage des protéines totales par spectrophotométrie :

Seuls les résultats d’une seule méthode ont été présentés. Cependant, les méthodes de Lowry ainsi que de
Bradford devraient fournir des résultats très proches voir identiques suite au dosage.

2.1. Méthode de Lowry & al (1951) :

Après lecture de l’absorbance de la gamme étalon BSA et de l’échantillon de lactosérum dilué x4, les
résultats (tableau 1 et tableau 2, voir annexe) ont été utilisés pour tracer la droite d’étalonnage suivante :

Droite d'étalonage de la BSA

(Lowry)
0,3

0,25

0,2
DO (750 nm)

0,15

0,1
y = 0,0023x + 0,0178
0,05 R² = 0,9695
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentrations (µg/ml)

Figure 1 : Courbe d'étalonnage de la méthode de Lowry en utilisant la BSA

 La concentration de protéines contenues dans le lactosérum est de : 342,08 µg/ml

Le volume initial du lactosérum étant inconnu, la concentration de protéines obtenue est en fait
équivalente à 342,08 µg/mg de poudre de lyophilisat de lactosérum soit 0,342%.

9
 Il est donc difficile de de déduire la masse protéique contenue dans le volume initial de lactosérum
extrait. Néanmoins, les résultats obtenus semblent très loin de la marge de 7 à 10 mg/ml reportée par ALAIS
(1981). La différence des résultats doit être due à la méthode utilisée pour obtenir le lactosérum.

3. Dosage de l’activité d’une protéase :

Après lecture de l’absorbance de la gamme étalon Tyrosine et de l’échantillon de caséine dilué x4, les
résultats (tableau 3 et tableau 4, voir annexe) ont été utilisés pour tracer la droite d’étalonnage suivante :

Droite d'étalonnage du L-tyrosine

0,9
0,8
0,7
0,6
DO (660 nm)

0,5
0,4
0,3
y = 0,003x + 0,0137
0,2
R² = 0,9947
0,1
0
0 50 100 150 200 250 300
Concentrations (µmol)

Figure 2 : Courbe d'étalonnage du L-tyrosine

 La concentration de tyrosine libérée par l’échantillon est : 15,1 µmol

 L’activité enzymatique est égale à : 519,062 u/ml

L’activité enzymatique trouvée est plus basse que le nombre inscrit sur la boite (1500 u/ml). Cette baisse
de l’activité enzymatique de la trypsine doit être du à des conditions de stockage non-adaptés.

4. Taux de l’hydrolyse enzymatique des protéines :

Il n’y a pas eu de coloration au niveau des hydrolysats, ce qui implique qu’il n’y a pas eu d’hydrolyse
par la Trypsine. Cela doit être du au faite que l’enzyme utilisée soit vieille, de mauvaise qualité ou qu’elle
a été stockée dans des conditions non-adaptés.

10
5. Etude qualitative des protéines par SDS-PAGE :
Le résultat de la migration du lactosérum à 2mg/ml et des aliquots d’hydrolyse T5, T10, T15, T20 par
SDS-PAGE est affiché sur la figure 3 :

Figure 3 : Profil électrophorétique des protéines du lactosérum.

1 : Marqueur de taille (26.600 Da – 180.000 Da) ;
2 : lyophilisat de lactosérum à 2mg/ml ;
3 : Aliquot d’hydrolyse T5 ;
4 : Aliquot d’hydrolyse T10 ;
5 : Aliquot d’hydrolyse T15 ;
6 : Aliquot d’hydrolyse T20.

Le profile électrophorétique ci-dessus ne montre pas de différence significative entre la composition du

lactosérum et des hydrolysats, ce qui confirme que l’hydrolyse précédemment effectuée à donnée des
résultats négatifs dus au non-fonctionnement de la trypsine.
Cependant, il montre que les poids moléculaires des protéines composants le lactosérum varient
d’envirent 180.000 Da jusqu’à moins que 15.000 Da.
Ce résultat permet de supposer la composition en protéines du lactosérum affichés dans le tableau 5.

11
 Nombre des résidus d'acides
Protéine Poids moléculaire (kDa)
aminés
β-Lactoglobuline (monomère) 18,277 162

β-Lactoglobuline ( dimère) 36,000 324

α-Lactalbumine 14,175 123
Sérum albumine bovine 66,267 582
Immunoglobulines (A, M et C) 150,000 - 180,000 -

Lactoferrine 80,000 700

Lactoperoxidase 70,000 612

Lactopeptidase 100,000 - 140,000 -
αS1-caséine 24,529 214
αS2-caséine 26,019 222
β-caséine 25,107 224

K-caséine 21,269 190

Tableau 5 : Protéines pouvant être contenues dans le lactosérum

Conclusion :
Le lactosérum a longtemps été considéré comme un sous-produit encombrant, généré en grandes
quantités par l'industrie fromagère et polluant, mais de nouvelles techniques ont permis d'en séparer les
principaux constituants afin d'en tirer des ingrédients très élaborés, comme les concentrés de protéines de
lactosérum. Ceux-ci sont incorporés dans des transformations agroalimentaires.

12
Bibliographie :
Adler-Nissen J. Determination of the degree of hydrolysis of 26;97(20):10723-8. doi: 10.1073/pnas.97.20.10723. PMID:
food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid. J 11005854; PMCID: PMC27090.
Agric Food Chem. 1979 Nov-Dec;27(6):1256-62. doi:
10.1021/jf60226a042. PMID: 544653. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J.
(1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent.
Aich R, Batabyal S, Joardar SN. Isolation and purification of J. Biol. Chem. 193, 265–275. PMID: 14907713.
beta-lactoglobulin from cow milk. Vet World. 2015
May;8(5):621-4. doi: 10.14202/vetworld.2015.621-624. Madureira AR, Pereira CI, Gomes AMP, Pintado ME, Xavier
Epub 2015 May 15. PMID: 27047145; PMCID: Malcata F. Bovine whey proteins – Overview on their main
PMC4774723. biological properties. Food Res Int. 2007 Dec;40(10):1197–
211. doi: 10.1016/j.foodres.2007.07.005. Epub 2007 Aug 3.
Alais C. (1984). Sciences du lait. Principes des Techniques PMCID: PMC7126817.
Laitières, SEPAIC, Paris, 4e édition
Navarrete del Toro, M.A. and García-Carreño, F.L. (2003),
Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the Evaluation of the Progress of Protein Hydrolysis. Current
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the Protocols in Food Analytical Chemistry, 10: B2.2.1-
principle of protein-dye binding. Analyt. Biochem. 72, B2.2.14. https://doi.org/10.1002/0471142913.fab0202s10
248–254. doi: 10.1006/abio.1976.9999. PMID: 942051.
The Protein Protocols Handbook: Second Edition / edited by
Doi E., Shibata D., Matoba T. (1981). Modified colorimetric John M. Walker. ISBN 0-89603-940-4 (HB); 0-89603-941-
ninhydrin methods for peptidase assay. An. Biochem., 118, 2 (PB). Qp551. P697512 2002. 572'.6--dc21
173-184.
Vincent D, Elkins A, Condina MR, Ezernieks V, Rochfort S.
Enroth C, Eger BT, Okamoto K, Nishino T, Nishino T, Pai EF. Quantitation and Identification of Intact Major Milk
Crystal structures of bovine milk xanthine dehydrogenase Proteins for High-Throughput LC-ESI-Q-TOF MS
and xanthine oxidase: structure-based mechanism of Analyses. PLoS One. 2016 Oct 17;11(10):e0163471. doi:
conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Sep 10.1371/journal.pone.0163471. PMID: 27749892; PMCID:
PMC5066972.

https://www.universalis.fr/encyclopedie/lyophilisation/2-principe/

https://droguet-sebastien.e-monsite.com/pages/activites-technologiques-terminale-2014-2015/at04-comparaison-methodes-de-
dosage.html

https://cellculture.altervista.org/the-lowry-method-to-quantify-
protein/?lang=fr&doing_wp_cron=1680012136.0698149204254150390625

https://www.sigmaaldrich.com/DZ/fr/technical-documents/protocol/protein-biology/elisa/protease-activity-assay

https://sms-bse-bgb.ac-normandie.fr/Electrophorese-SDS-PAGE-principe-et-exemple-d-application-en-STL

https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02662/entry

https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02663/entry

https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02666/entry

https://www.uniprot.org/uniprotkb/P02668/entry

13
Annexe :
Tableau 1 : Résultats de la lecture de la gamme étalon BSA au spectrophotomètre :
Standards (BSA) Blanc Std1 Std2 Std3 Std4 Std5 Std6
Concentrations (µg/ml) 0 10 20 40 60 80 100
DO (750 nm) 0 0,036 0,074 0,12 0,162 0,213 0,222

Tableau 2 : Résultats de la lecture des échantillons dilués x4 de lactosérum au spectrophotomètre :

Echantillons E1 E2 Moyenne
DO (750 nm) 0,207 0,222 0,2145

Calcule de la concentration des protéines totales contenues dans le lactosérum :

L’équation du graphe 2 : y = 0,0023x + 0,0178
DO de l’échantillon (750nm) = 0,2145

𝑦𝑦 − 0,0178
𝑥𝑥 =
0,0023

0,2145 − 0,0178
𝑥𝑥 =
0,0023

𝑥𝑥 ≃ 85,52 µ𝑔𝑔/𝑚𝑚𝑚𝑚

[C] = x × Facteur de dilution

[C] = 85,52 × 4 = 342,08 µg/ml

Tableau 3 : Résultats de la lecture de la gamme étalon Tyrosine au spectrophotomètre :

Standards (Tyrosine) Blanc Std1 Std2 Std3 Std4 Std5
Concentrations (µmol) 0 27,59 55,19 110,38 220,6 275,95
DO (660 nm) 0 0,089 0,182 0,355 0,703 0,797

Tableau 4 : Résultats de la lecture des échantillons de caséine au spectrophotomètre :

Echantillon E1 E2 E3 Moyenne
V enzyme (ml) 0,5 0,7 1
DO (660 nm) 0,028 0,041 0,063
DO x facteur de dilution 0,056 0,058 0,063 0,059

14
Calcule de la concentration de tyrosine libérée par l’échantillon :
L’équation du graphe 2 : y = 0,003x – 0,0137
DO de l’échantillon (660nm) = 0,059

𝑦𝑦 + 0,0137
𝑥𝑥 =
0,003

0,059 + 0,0137
𝑥𝑥 =
0,003

𝑥𝑥 = 15,1 µ𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚𝑚

[C] = 15,1 µmol

Calcule de l’activité enzymatique :

Nbr de µmol d′ équiv de tyrosine libérée × V total du tube
L′ activité enzymatique =
Temps del′ activité enz × V utilisé dans le test × V de la cuve

15,1 µmol × 11 ml
L′ activité enzymatique = = 8,305 𝑢𝑢/𝑚𝑚𝑚𝑚
10 min × 1 ml × 2 ml

Nbr d′ unité / ml
L′ activité enzymatique =
[C d′ enzyme en mg] / ml
8,305 u / ml
L′ activité enzymatique = = 519,062 𝑢𝑢/𝑚𝑚𝑚𝑚
0,016 mg / ml

15