Extraction ADN

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Extraction d'ADN :

1- Structure ADN :
La structure de l’ADN (acide désoxyribonucléique) est composée de groupement
phosphate lié à un sucre (le désoxyribose) qui est lui-même fixé à une des 4 bases
azotées, A (adénine), C (cytosine), G (guanine), T thymine). Un groupe « phosphate-
sucre-base azotée » constitue un nucléotide. Les nucléotides sont liés les uns aux
autres pour former un brin d’ADN. L’ADN est donc un polymère de nucléotides. Deux
brins d’ADN interagissent entre eux par les bases azotées formant une molécule d’ADN
double brin. Cette molécule est similaire à une échelle dans laquelle les groupements
phosphate-ribose constitueraient les montants et les bases azotées formeraient les
barreaux. Les deux brins d’ADN dans cette échelle sont en orientation opposées
(antiparallèle). Cette échelle est torsadée donnant la fameuse forme de double hélice à
l’ADN double-brin.

La distance entre 2 résidus est de 0.34 nm (0.34 x 10-9 m). 1 tour d’hélice contient
paires de bases (3,4 nm). Le diamètre de l’hélice d’ADN est de 2 nm. La taille d’un
génome humain est de 3.2 milliard de paires de bases par génome haploïde soit 6.4
milliard de paires de bases réparties sur les 23 paires de chromosomes. Mis bout à
bout, cela donne plus de 2 mètres d’ADN par cellule ! Pour empaqueter tout cet ADN
dans le noyau, l’ADN est fortement replié et compresser avec l’aide de protéines pour
former la chromatine. L’empaquetage extrême de l’ADN forme les chromosomes
mitotiques.
- Principaux procédés d’extraction des acides nucléiques :

Les méthodes d’extraction des acides nucléiques peuvent se classer en trois


principales classes en fonction du principe auquel elles font appel : les méthodes
utilisant des solvants organiques, les méthodes utilisant des solvants non organiques,
les méthodes basées sur l’utilisation de microcolonnes de résines échangeuses d’ions.

Quelle que soit la méthode d’extraction des acides nucléiques utilisée à partir du sang
fraîchement recueilli ou décongelé, le sang doit être initialement vigoureusement
mélangé à une solution hypotonique pour faire éclater les globules rouges. Les
solutions de lyse des globules rouges sont nombreuses et variées. Par exemple, les
solutions suivantes peuvent être utilisées : a) Tris 10 mM/MgCl2 10 mM/NaCl 10 mM, b)
NH4CO3H 0,9 mM/NH4Cl 131 mM, c) Tris 20 mM pH7,5/MgCl2 5 mM et d) Tris 10 mM
pH7,4/EDTA (éthylène diamine tetra-acetic acid) 10 mM. La lyse est en général réalisée à
4 °C pendant 20 à 30 minutes.

Le lysat est centrifugé (15 min, 1 500 g) et, après élimination du surnageant, le culot
cellulaire contenant les leucocytes (0,3 % des cellules circulantes) est repris dans une
solution saline (NaCl 0,15 M/EDTA 0,1 M pH 10,5, par exemple) et est traité par une
solution de lyse des globules blancs. Il existe un grand nombre de solutions de lyse en
fonction de la nature du détergent anionique utilisé. Par exemple, les solutions
aqueuses suivantes peuvent être utilisées : a) TPNS (tri-iso-propyl-naphtalènes-
sulfonique acid) 6 %/butanol-2 8 %/SDS (sodium dodecyl sulfate) 3 %, b) Tris 10 mM pH
7,4/EDTA 10 mM pH 8/NaCl 50 mM/Sarcosyl 2 %, c) Tris 20 mM pH 7,5/NaCl 400
mM/EDTA 2 mM/Sarcosyl 2 %. L’ADN nucléaire libéré dans le milieu est alors le plus
souvent traité par une protéinase très active, la protéinase K, qui a pour but de digérer
les protéines qui lui étaient associées. En fonction des protocoles, le traitement par la
protéinase K (10 mg/ml) est effectué 1 à 2 h à 65 °C ou 30 min à 1 h à 55 °C ou 3 à 18 h à
37 °C.

C’est à ce stade en général que les procédés d’extraction et de purification varient.

Méthodes utilisant des solvants organiques :

• Méthode au phénol-chloroforme [1]. Dans cette méthode dite « de référence », le


principe consiste à traiter le lysat cellulaire dans un premier temps par du phénol
volume à volume, puis, après centrifugation (3 000 g, 10 min) à éliminer la phase
phénolique, par un mélange chloroforme-alcool isoamylique (24 :1), qui a
notamment pour objectif d’éliminer les traces éventuelles de phénol qui auraient
pu être emportées avec la phase aqueuse et qui sont fortement inhibitrices des
réactions enzymatiques. Le phénol, équilibré à pH 8,0, saturé en eau, dégazé,
avec ou sans agent antioxydants (8-hydroxyquinoléine), est un puissant agent
déprotéinisant dans lequel les acides nucléiques ne sont pas solubles. D’autres
alternatives à son utilisation ont été préconisées, telle que l’utilisation du
perchlorate de sodium à 5 M (Nucleon-Bacc, Amersham Pharmacia Biotech) [3].

• Méthode au chlorure de guanidium [2]. Le principe consiste à traiter le lysat


cellulaire obtenu après action de la solution de lyse des globules rouges par une
solution d’un agent chaotropique, le chlorure de guanidium (hydrochloride de
guanidium 6 M 10 ml/acétate d’ammonium 7,5 M 0,5 ml), puis par une solution
détergente et déprotéinisante (protéinase K 10 mg/ml, 300 ml/sarcosyl 5 % 1,5
ml) 2 h à 56 °C.

Méthodes utilisant des solvants non organiques [4] :

Dans ces méthodes, le principe consiste à traiter uniquement le lysat cellulaire par une
solution saline, dont l’objectif est d’éliminer par précipitation sélective les protéines. En
fonction des protocoles, des étapes de prétraitement par la RNase sont proposées.
Différentes solutions salines ont été préconisées : par exemple, NaCl 2,5 M. Quelques
kits commercialisés par des industriels utilisent ce procédé.

Extraction par NACl :


. Préparation des leucocytes :

1-Dans un tube Falcon de 50 ml, mettre le sang et compéter à 25 ml avec do TF 205


Laisser 10 min dans la glace.

2. Centrifuger 10 min a 3900 g (3800 гриз)

3. Aspirer le surnageant avec la trompe à vide

4. Ajouter quelques ml de TE 20 5 au culot et le remettre en suspension avec une


pastette stérile

5 Compléter à 25 al avec du TE 20 5 et laisser 10 min dans la glace

6. Centrifuger dans les mêmes conditions que la première fois

7 aspirer le surnageant avec la trompe à vide : Obtention d’un culot des leucocytes (sion
s’arrêter à ce niveau les mettre dans un tube nunc de 1.5 ml avec du TE 10 el les
conserver à -20° dans le frigo)

Extraction de ADN :
1. Transvaser le culot de leucocytes dans un tube Falcon de 15 ml

2. Ajouter 3 ml de tampon de lyse (NaCl 400 mM, EDTA 2mM, Tris 10 mM, pH 8.2))
en, Jilacerant le culot avec une pastette stérile

3-Ajouter 200 µl de SDS à 10%

4-Ajouter 100ul de protéinase K à 10 mg/ml-

5-Agiter le tube sur une roue à 37°C une nuit

6-Le lendemain, refroidir dan, la glace Ajouter 1 ml de NaCl 4 M et agiter


vigoureusement à la main

7. Remettre 5 min dans la glace (précipitation des protéines)

8. Centrifuger 15 min à 2500 rpm

9- Transvaser le surnageant dans un tube Falcon de 15 ml, ajouter 2 fois son volume
d’éthanol absolu préalablement refroidi (environ 8 ml) et agiter en retournant le tue
plusieurs fois : La pelote d’ADN se forme

10-Laisser éventuellement 30 min à -20°C si la pelote ne se forme pas

11-. Récupérer la pelote d’ADN avec une pipette Pasteur et la rincer 2 fois dans l’éthanol
a 70%

12- Mettre la pelote dans un tube nunc

3. Solubilisation :

! Ajouter entre 300 et 1000 pl de TE 101 selon la grosseur de pelote et la concentrations


souhaitée

Laisser une nuit sur agitateur rotateur à 37°C, puis à température ambiante jusqu’à
dissolution complète (1 à 2 jours).

Méthodes basées sur l’utilisation de colonnes résines échangeuses


d’ions :

Ces méthodes d’extraction et de purification des acides nucléiques sont les dernières
récemment apparues. Elles sont basées sur la propriété qu’ont les particules de silice
d’adsorber sélectivement les acides nucléiques. Les solutions de lavage permettent de
se débarrasser des contaminants tels que l’hémoglobine, les protéines plasmatiques
ou les ions Fe2+.

Quelle que soit la méthode utilisée pour l’extraction et la purification des acides
nucléiques, la récupération des acides nucléiques se fait en général par une élution,
puis par une précipitation.

La précipitation est le plus souvent réalisée par l’alcool éthylique absolu froid à haute
concentration (2,5 volumes par volume d’échantillon) à haute force ionique (acétate
d’ammonium 2,5 M). Dans ces conditions, l’ADN précipite sous forme de filaments,
visibles à l’œil nu, qui peuvent être récupérés par enroulement sur une fine baguette de
verre. Le temps de précipitation varie en fonction de la concentration des acides
nucléiques, de 15 min à 10 h. Une alternative séduisante à l’alcool éthylique consiste à
utiliser l’isopropanol ; dans ce cas, le sel n’est pas nécessaire, la précipitation se fait en
général volume à volume et est particulièrement adaptée aux grands volumes.

Dans tous les cas, le précipité est ensuite lavé avec une solution d’alcool éthylique à 70
°C pour se débarrasser des traces éventuelles de sels ou d’isopropanol, puis séché et
resuspendu dans une solution d’hydratation (en général, Tris 10 mM pH 7,5/EDTA 1 mM

REFERENCES :

1. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning : a laboratory manual. Cold


Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York, 1989.

2. Jeanpierre M. A rapid method for the purification of DNA from blood. Nucleic
Acids Res 1987 ; 15 : 9611.

3. Johns MB, Paulus-Thomas JE. Purification of human genomic DNA from whole
blood using sodium perchlorate in place of phenol. Anal Biochem 1989 ; 180 :
276-8.

4. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting-out for extracting DNA from
human nucle

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