Chapitre III : Marquage des acides nucléiques & Hybridation moléculaire L3 Biochimie

III.1. Marquage des acides nucléiques

III.1.1. Sondes nucléiques

Les sondes nucléiques sont des molécules d’ADN ou d’ARN utilisées pour détecter une séquence
spécifique (d’un génome ou d’une banque). Pour servir de système de détection, les sondes doivent
être complémentaires et antiparallèles à la séquence recherchée, elles doivent être aussi marquées, le
plus souvent par l’ajout des molécules radioactives. En pratique la taille des sondes varie de quelques
dizaines de nucléotides à quelques kb. Elles sont entre autres utiles pour détecter un fragment d’ADN
ou d’ARN sur une membrane ou une expérience de retardement sur gel. Une sonde peut aussi être
utilisée comme substrat dans une réaction de séquençage, dans ce cas, le terme « amorce » est plus
approprié que « sonde ». Dans tous les cas, il est nécessaire de connaître la séquence d’une sonde,
puisqu’elle permet de diriger l’analyse vers une molécule précise. Il existe plusieurs possibilités pour
obtenir une sonde nucléotidique:

o Une sonde oligonucléotidique peut être fabriquée par synthèse chimique, si la séquence de l’ADN
à repérer est connue. Si elle est inconnue, on peut étudier la protéine correspondante et remonter
grâce au code génétique à la séquence d’ADN. Dans ce dernier cas, le travail est particulièrement
laborieux (nombre de codons élevé pour un même acide aminé).

o Une sonde peut être un ADNc. Une partie seulement de l’ADNc est utilisée (après action
d’enzymes de restriction et clonage des fragments obtenus).

III.1.2. Différentes techniques de marquage des acides nucléiques

L’hybridation des acides nucléiques est un outil fondamental en biologie moléculaire pour détecter une
séquence d’ADN d’intérêt. Elle est très fréquemment utilisée soit lors de criblage de banque d’ADNc
ou génomique, soit lors d’études de l’organisation de régions spécifiques du génome (par Southern
blot), soit lors de l’analyse de l’accumulation des transcrits dans les cellules. Le succès de ces
techniques dépend de la possibilité d’obtenir des sondes d’ADN marquées à l’aide de nucléotides
radioactifs ou modifiés chimiquement. Les techniques de marquage permettent d’obtenir des sondes
marquées soit uniformément (marquage interne) soit à leur extrémités (marquage aux extrémités).

III.1.2.1. Marquage chaud (radioactivité)

Le marquage des sondes peut être réalisé par plusieurs isotopes radioactifs (tableau 02), dont leur
choix dépendra principalement de l’utilisation de la sonde. Malgré que le soufre n’est pas présent
dans les acides nucléiques mais comme il est proche chimiquement de l’oxygène des analogues
soufrés des nucléotides dans lesquels un oxygène est remplacé par un soufre sont synthétisés.

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Tableau 02 : Isotopes radioactifs utilisés pour le marquage des acides nucléiques

Isotope Demi-vie Energie

32
P β- 14,3 jours 1.7 MeV
35
S, β- 87.2 jours 0.17 MeV
14
C, β- 5700 ans 0.16 MeV
3
H, β- 12.3 ans 0.02 MeV

L’intensité du rayonnement déponde de la méthode de détection (rayonnement fort pour une détection
sur un filtre, et un rayonnement moins énergétique pour une détection en microscopie). La détection
des radioisotopes radioactifs peut se faire de plusieurs manières : par un compteur à scintillation, par
radioautographie (film sensible ou émulsion), par un scanner spécial ou le phosphoimager.

 Marquage interne

o Marquage par translation de coupure (Nick-translation)

Le marquage interne résulte d’une polymérisation in vitro de l’ADN en présence de nucléotides

marqués. Cette polymérisation repose sur la complémentarité des deux brins d’ADN. Le fragment de
Klenow de l’ADN polymérase I isolée d’Escherichia coli est capable, en utilisant comme modèle le
brin complémentaire, d’ajouter des nucléotides à une extrémité 3’OH d’ADN, qui apparait lorsque
l’un des brins d’une molécule d’ADN est coupé. Cette enzyme présente également une activité
5’exonucléasique qui élimine des nucléotides du coté 5’-P de la coupure. Ces deux actions conjuguées
provoquent un mouvement du site de coupure (translation de coupure) le long de l’ADN. Avant
l’action de la polymérase, les coupures sont réalisées par la DNase I. Cette endonucléase provoque des
coupures simple brin et au hasard sur l’ADN (Fig.08). Si l’on utilise des nucléotides marqués au 32P à
haute radioactivité spécifique, on obtient des molécules d’ADN bicaténaires dont certaines portions
sont fortement marquées (de l’ordre de 107 cpm/μg).

5’ 3’
3’ 5’
DNAse I coupe l’ADN simple
3’OH
5’P

(coupure au hasard)
5’ 3’
3’ 5’
dNTP dont un marqué (*)
ADN polymérase

5’ ***** ******** 3’
3’ 5’

Fig.08 : Marquage d’ADN par translation de coupure (Nick translation)

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o Marquage par amorçage aléatoire (Random- priming)

Un mélange d’héxanucléotides de séquences aléatoires est utilisé comme source d’amorces pour la
synthèse in vitro d’ADN à partir d’une molécule d’ADN double brin préalablement dénaturée (les
deux brins sont séparés par la chaleur). Si le mélange d’héxanucléotides est suffisamment hétérogène,
il se forme des hybrides sur n’importe quelle séquence de l’ADN matrice rendu monocaténaire. Ces
structures hybrides bicaténaires servent de point d’ancrage à une ADN polymérase le fragment de
Klenow de l’ADN polymérase I d’E. coli) qui copie le brin complémentaire. L’utilisation de
nucléotides marqués permettra la synthèse d’une molécule spécifique d’ADN radioactive (Fig.09). Les
sondes obtenues ont une radioactivité spécifique très élevée de l’ordre de 108 cpm/μg.

 Marquage externe (aux extrémités)

Ce type de marquage est utilisé par exemple pour de petites molécules de quelques dizaines de
nucléotides, comme un oligonucléotide. Cette technique est également utile lorsque l’on désire une
polarité du marquage comme pour les empreintes à la DNAse I (Fig.10). La limite de ce marquage est
l’introduction d’un seul atome marqué par molécule d’ADN, d’où une activité spécifique assez faible.
Deux enzymes différentes permettent de réaliser le marquage de chacune des extrémités.

o La polynucléotide kinase du bactériophage T4 : qui catalyse le transfert du phosphate radioactif

du γ-32P ATP (ATP marqué au 32P sur le troisième phosphate) sur l’extrémité 5’-P d’un fragment
d’ADN. Cette technique est notamment appliquée pour obtenir des oligonucléotides marqués qui
seront utilisés comme sonde pour le criblage de banques.

o La transférase terminale : comme cette enzyme est capable d’ajouter un didésoxynucléotide

(nucléotide modifié chimiquement) marqué en 3’-OH d’un fragment d’ADN. La séquence de la
molécule marquée ainsi obtenue est donc allongée d’un analogue de nucléotide à chacune de ses
extrémités.

Il est important de signaler que les sondes radioactives et malgré qu’elles présentent une sensibilité
importante plus élevée que les sondes froides, présentent de nombreux inconvénients : nécessité de se
protéger contre le rayonnement émis, un maniement des sondes inconfortable décroissance rapide du
32
P, d'où besoin de marquer les sondes fréquemment. Pour pallier à ces problèmes, on peut avoir
recours aux sondes froides.

III.1.2.2. Marquage froid

De plus en plus, les nucléotides radioactifs sont remplacés par des nucléotides marqués à l’aide de
molécules non radioactives (d’où le terme sondes froides, par opposition aux sondes chaudes).
Différents types de marquage existent, avec parfois une sensibilité de détection supérieur même à celle

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des sondes radioactives. Les principes de marquage sont les mêmes que ceux décrits dans les
paragraphes précédents, seuls les techniques de détection différent d’un type de marquage froid à
l’autre.

5’ 3’
3’ 5’
Dénaturation

5’ 3’
3’ 5’
Hybridation avec amorces
héxanucléotidiques
5’ 3’
3’ 5’

dNTP dont un marqué (*)

ADN polymérase

5’ 3’
**** ***** *****
3’ ***** ***** 5’

Fig.09 : Marquage d’ADN par amorçage aléatoire (random priming)

A
5’-P 3’-OH
3’-OH 5’-P
γ-32P- ATP
T4 polynucléotide kinase
ADP
32
P 3’-OH
32
3’-OH P

B
5’-P 3’-OH
3’-OH 5’-P
α-32P- ddNTP
Transférase terminale
PPi 32
5’-P P-ddNMP
32
P-ddNMP 5’-P

Fig.10 : Marquage d’ADN aux extrémités. A : Marquage de l’extrémité 5’, B : Marquage

de l’extrémité 3’.

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 Marquage indirect

Les deux types de marquage froid les plus fréquentes sont les marquages à la biotine et à la
digoxigénine (Fig.11). L’utilisation de ces composés est commencée au début des années 80, dont le
radical libre des nucléotides (le plus souvent l'uridine triphosphate-dUTP) est substitué par la biotine
ou la digoxigénine attachée au bout d'une chaîne carbonée de longueur variable selon le fabricant. Les
sondes se révèlent grâce à des anticorps couplés à des fluorochromes, qui sont des substances
chimiques capables d'émettre de la lumière après excitation.

o La biotine La biotine qui corresponde à la vitamine B8 ou appelée encore la vitamine H est une
coenzyme qui participe au métabolisme des acides gras, des glucides et des acides aminés, ainsi
qu'à la biosynthèse des vitamines B9 et B12. D'un point de vue biologique, on la retrouve dans
toutes les espèces vivantes. La biotine est utilisée en biologie moléculaire et biochimie
expérimentale du fait de son affinité très élevée pour la streptavidine ainsi que pour l'avidine
(Fig.04). Cette dernière est une protéine du blanc d'œuf, elle comporte 4 sites de liaison pour la
biotine. Elle est généralement produite par génie génétique dans Streptomyces avidinii, sous une
forme non glycosylée et prend alors le nom de streptavidine. La streptavidine ou les anticorps
n'ont pas d'activité enzymatique propre, on utilise des protéines de fusion pour les détecter.
L'anticorps ou la streptavidine sont couplés avec une protéine ayant une activité enzymatique
facilement détectable comme la phosphatase alcaline ou la péroxydase.

o Digoxigénine (DIG) : La taille relativement petite de ce stéroïde naturel et la facilité avec laquelle
il peut être lié à des molécules biologiques, ainsi que la disponibilité d'anticorps ciblant cette
molécule en font un outil utile en biologie moléculaire. Dans ce cas la digoxigénine est conjuguée
à un nucléotide, le plus souvent au dUTP, qui peut être incorporée par les ARN et ADN
polymérases lors de la synthèse in vitro de brins complémentaires (dans le cas d'ADN
polymérases, le DIG-UTP s'incorpore à la place de la thymidine). La DIG conjuguée aux acides
nucléiques ou à des glucides (permettant par la suite son incorporation dans les glycoprotéines)
peuvent alors être détectées à l'aide d'anticorps antidigoxigénine (Fig.12).

A B

Fig.11. Structure chimique de A : La digoxigénine (DIG), B : La biotine.

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: Anti-DIG ou
Streptavidine
DIG ou biotine

Fig.12 : Marquage indirect d’ADN.

 Marquage direct (Fluorescent)

Aujourd’hui, les fluorochromes sont directement fixés sur les nucléotides (sans anticorps). Les
fluorochromes sont des molécules capables d’être excitées (accumulation d’énergie) par une longueur
d’onde donnée, appelée longueur d’onde d’excitation (λexc) et de restituer une partie de cette énergie
sous l’aspect d’une longueur d’onde de moindre énergie appelée longueur d’onde d’émission (λem).
Ils sont donc tous caractérisés par une longueur d’onde d’excitation et une longueur d’onde
d’émission. Différentes techniques sont utilisées pour incorporer un fluorochrome dans un fragment
d’ADN. Les plus connues sont le Random-priming et la Nick-translation (déjà citées dans la
radioactivité). Les fluorochromes couramment utilisés sont :

o Le DAPI : 4’,6-diamidino-2-phenylindole (310 nm – 372 nm), se fixe sur les régions riches en AT
de l’ADN et est appliqué directement sur les préparations chromosomiques après l’hybridation
pour colorer de façon aspécifique tous les chromosomes, ce qui permet de les repérer.
o Le FITC : Fluorescein isothiocyanate (exc 495 nm – λem 519 nm), fluoresce dans le vert.
o La Cy3 : Cyanine 3 (λexc 495 nm – λem 519 nm), fluoresce dans l’orange.
o Le Texas red (λexc 589 nm – λem 615 nm), fluoresce dans le rouge.
o La Cy5 : Cyanine 5 (λexc 650 nm – λem670 nm), fluoresce dans le rouge.

Il est également possible de marquer une sonde avec plusieurs fluorochromes. On obtient alors une
sonde dont la fluorescence est complexe, composée des longueurs d'émission des différents
fluorochromes. Le signal de ce type de sonde ne peut être analysé qu'après numérisation. En utilisant 5
fluorochromes (avec lesquels 31 combinaisons sont possibles), il est possible de construire 23 sondes
de peinture, chacune spécifique d'une paire chromosomique donnée, ouvrant la voie au caryotype en
multifluorescence. Par le même procédé, on peut obtenir des sondes spécifiques de chaque extrémité
subtélomérique ou de chaque centromère

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III.2. Hybridation moléculaire

Toutes les méthodes de biologie moléculaire reposent au départ sur le principe de l’hybridation
moléculaire. Il s’agit de la propriété que présente une molécule d’ADN monobrin de s’associer
spontanément et de façon spécifique et réversible à une autre molécule monobrin si celle-ci lui est
complémentaire et antiparallèle. L’hybridation moléculaire est permise par les liaisons hydrogènes
que peuvent établir les bases puriques et pyrimidiques constituant l’ADN (A=T, C G).

III.2.1. Facteurs influençant l’hybridation moléculaire

L'hybridation moléculaire sonde-fragment d'ADN à repérer nécessite des conditions physicochimiques

parfaites (tampon, pH, temperature, force ionique etc.). Ces conditions sont appelées la stringence.
Plusieurs facteurs peuvent également intervenir comme la longueur de la sonde et la complémentarité
sonde-fragment avec possibilité de mauvais appariements. Le paramètre déterminant dans la
spécificité et la réversibilité de l’hybridation moléculaire est la température de fusion (Tm : melting
temperature). Le Tm se définie par la température à laquelle la moitié de l’ADN est sous forme
monobrin et l’autre moitié sous forme double brin (Fig.13). Le passage d’une forme à l’autre est brutal
du fait du caractère coopératif de la réaction, que ce soit dans un sens ou dans l’autre. Ce passage se
visualise clairement si on mesure la densité optique « DO » à 260 nm (UV) car l’ADN simple brin
absorbe plus les UV que l’ADN double brin. Le Tm dépend de nombreux facteurs tels que la longueur
du fragment d’ADN considéré, sa richesse en cytosines et guanines et la concentration en ion Na dans
le milieu réactionnel. En pratique, l’expérimentateur peut gérer l’hybridation moléculaire en
choisissant une température du milieu réactionnel inférieure, égale ou supérieure au Tm. Il est possible
de mesurer directement la température de fusion d’un ADN double brin en mesurant l’augmentation
de l’absorbance de la solution à 260 nm en fonction de la température. Toutefois, on se contente la
plupart du temps d’une estimation à partir de la composition de l’oligonucléotide

DO à 260 nm

DO2

DO1
Température
Tm

Fig.13: Présentation de la Tm.

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o Si celui-ci a une longueur égale ou inférieure à 20 nucléotides, on compte 2°C par couple A:T et
4°C par couple G:C.
Tm (°C)= (A+T)*2+ (G+C)*4

o Si l’oligonucléotide a une longueur supérieure à 20 nucléotides, on corrige d’un multiplicateur

proportionnel à la longueur au-delà de ce chiffre : 1 + [(N-20)/20], et la formule sera la suivante :

Tm (°C)= [(A+T)*2+ (G+C)*4]*(1+ [(N-20)/20]

o Pour être plus précis, il faut tenir compte aussi de la concentration en sodium du tampon
d’hybridation. Lorsque cette concentration n’excède pas 1M, on utilise la formule :

Tm = 81.5 + 16.6(Log10 [Na+]) + 0.41[(G+C)/N] - (600/N)

III.2.2. Techniques d’hybridation moléculaire

III.2.2.1. Hybridation sur support : Southern blot

Le Southern blot est une technique permettant, après une phase de séparation sur gel, de visualiser
spécifiquement des fragments d’ADN (ou loci ciblés). Cette technique a été mise au point par Edwin.
M. Southern en 1975 qui a combiné l’électrophorèse, le transfert et l’hybridation avec une sonde
marquée pour permettre une détection spécifique d’ADN cible. Le Southern blot (blot : tache en
français) est utilisé pour la détection de polymorphisme au niveau des sites de restriction (RFLP :
Restriction Fragment Length Polymorphism) et l’hybridation in situ (sur colonies ou sur tissu). Les
différentes étapes d’hybridation sur un support selon Southern sont détaillées ci-dessous et présentées
dans la figure 14.

1. Après l’extraction de génome total, l’ADN est digéré par les enzymes de restriction.

2. Les fragments d’ADN résultant de la digestion enzymatique sont soumis à une électrophorèse en
gel d'agarose afin d'obtenir une séparation en fonction de leur taille (à la fin de la migration, on
n’observe pas sur le gel des bandes séparées mais une trainée d'ADN due aux fragments de taille
très proche les uns des autres).

3. Le gel d’électrophorèse est immergé dans une solution alcaline (contenant habituellement de
l’hydroxyde de sodium) permettant la dénaturation de l’ADN bicaténaire en ADN simple brin,
pour qu’il soit accessible à l’appariement avec la sonde.

4. l'empreinte du gel est réalisée par transfert et fixation des fragments d'ADN sur une membrane
(filtre) de nitrocellulose ou de nylon. Une pression est appliquée sur le gel en plaçant une pile de
serviette de papier absorbant et par un poids sur la membrane et le gel. Ceci va permettre le

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passage de l’ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarité grâce à une solution saline,
ce qui conduit à la fixation de l’ADN sur la membrane.

5. La membrane est alors chauffée (80°C), dans le cas de nitrocellulose, ou exposée au rayonnement
ultra-violet s’il s’agit de nylon, afin de fixer de manière permanente l’ADN sur la membrane
(formation des liaisons covalentes entre l’ADN et la membrane). Une étape de pré-hybridation
ensuite est réalisée permettant de traiter les sites laissés libres, ils seront saturés par une solution
contenant une protéine (solution de blocage) telle que le sérum d’albumine et/ou à l’aide d’un
détergent comme le laurylsulfate de sodium.

6. La membrane est ensuite mise en contact avec une sonde spécifique marquée complémentaire de
l’ADN cible (l'hybridation est réalisée en milieu liquide sous agitation).

7. Après hybridation, la membrane est lavée pour éliminer la sonde en excès non appariée.

8. Une phase de visualisation (révélation) de l’hybridation aura lieu soit par autoradiographie, dans le
cas d’une sonde radioactive ou par développement d’un film photographique impressionné après
réaction de chimioluminescence (sonde fluorescente). La sonde va révéler la position sur la
membrane des fragments d’ADN recherchés.

III.2.2.2. Hybridation in situ (HIS)

On appelle hybridation in situ (HIS) l'utilisation de sondes d'acides nucléiques pour mettre en évidence
et localiser, dans des cellules ou des tissus, des séquences d'acides nucléiques, complémentaires de la
sonde par leurs bases. L'HIS est un outil incomparable pour étudier l'expression des gènes. Elle est très
proche, dans son principe, des Southern et des Northern Blot et repose, comme eux, sur l'hybridation
d'une sonde d'acide nucléique (ADN ou ARN) marquée avec une séquence complémentaire d'acides
nucléiques que l'on cherche à identifier et à localiser. Mais les Southern et Northern Blot se font sur
des broyats de tissus, alors que l'HIS s'effectue sur une coupe histologique de tissu, apportant ainsi des
informations précises sur la localisation des acides nucléiques étudiés. Les sondes utilisées sont le plus
souvent de l'ADN (double brin ou plus rarement monobrin), un ARN-messager (riboprobes) ou des
oligonucléotides synthétiques (de 20 à 50 nucléotides).

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Dépôts des échantillons d’ADN

Marqueur de taille
2

poids
La solution remonte par capillarité et
papier absorbant
transfert les fragments d’ADN du
membrane
gel à la membrane gel
Gel éponge
Membrane solution saline

ADN transféré à la
6 membrane

Après l’incubation dans une solution

de blocage, la membrane est placée
dans un sac scellé avec une solution
contenant la sonde marquée

7
Excès de sondes Les sondes hybridées avec leurs
séquences complémentaires

Dans le puis 2 et 3 seuls les

fragments hybridés sont révélés

Autoradiogramme

Fig.14: Hybridation moléculaire sur support par la technique de Southern blot.

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