Chapitre II : Hybridation moléculaire et vecteurs de clonage

I- Hybridation moléculaire de l’ADN

I-1 Principe

Lorsqu’un ADN bicaténaire est chauffé à une température supérieure à la température dite de
fusion (Tm), les deux brins de la molécule se séparent par suite de la rupture des liaisons
hydrogène qui les maintiennent appariés.

Le passage de la forme bicaténaire à la forme simple brin est brutal pour une très faible
variation de température autour de la Tm, du fait du caractère coopératif de la réaction.

Le passage de la forme bicaténaire à la forme monocaténaire s’objective très facilement par

simple mesure de la variation de densité optique (DO) à 260nm, le coefficient d’extinction de
l’ADN monocaténaire étant sensiblement plus élevé que celui de l’ADN bicaténaire (effet
hyperchrome).

Après une séparation de brins par fusion aucune réassociation de brins n’est observée si la
température est abaissée brutalement, l’ADN restant sous forme simple-brin et prenant une
structure dans l’espace non ordonnée.
Par contre, si après séparation l’ADN est refroidi lentement dans des conditions de milieu
favorables une réassociation des brins est progressivement observée. Elle porte le nom
d’hybridation moléculaire.
La réassociation entre deux séquences monocaténaires est conditionnée par la présentation
des nucléotides complémentaires face à face. Celle–ci est un phénomène aléatoire
conditionnée par la fréquence des rencontres des molécules. Pour une température donnée,
elles sont augmentées par la concentration des molécules interagissantes et la durée de
l’expérience.

Plus la concentration de l’ADN est élevée, plus le nombre de copies des séquences
complémentaires est important. Il en résulte que la probabilité de rencontre de deux
séquences complémentaires, donc la vitesse d’hybridation, augmente avec la concentration
de l’ADN. De même, plus le temps de réaction est long plus la probabilité que les séquences
complémentaires se rencontrent est grande. Dans les analyses d’hybridation ces deux facteurs
sont considérés en même temps.

I-1 Les différents types d’hybridation et leurs applications

I-1.1 L’hybridation sur milieu liquide

Les séquences complémentaires dont on désire obtenir l’hybridation sont en solution dans
un tampon. Elles s’associeront si du fait de l’agitation thermique des molécules elles se
rencontrent et si la température de la solution est inférieure d’au moins quelques degrés à la
Tm.

Trois types de techniques sont utilisables pour l’analyse quantitative des hybrides :

ƒ Les méthodes Spectrophotométriques (l’abaissement de la DO à 260 nm correspond à

l’augmentation des hybrides).

ƒ Les méthodes Chromatographiques (sur hydroxylapatite, seuls les double-brin se fixent.

Après élution la quantité d’ADN est déterminée par spectrophotométrie).

ƒ Les méthodes Enzymatiques (la nucléase S1 ne digère pas les hybrides qui seront
récupérés et quantifiés).

Applications :

o Comparaison des tailles de génomes sans séquences répétitives (virus, bactéries,

mitochondries..).

o Analyse globale des pourcentages d’homologie de séquence entre deux espèces proches :
A réaction complète, le % d’hybrides peut être assimilé grossièrement au % de séquences
homologues.
I-1.2 L’hybridation sur milieu solide

L’immobilisation de l’une des séquences complémentaires (le plus souvent la cible) facilite
d’une part les manipulations, d’autre part la séparation des fractions hybridées et non
hybridées ; enfin, elle empêche la réassociation des brins d’ADN, cibles des sondes. La
nitrocellulose fut le 1er support utilisé pour l’immobilisation des acides nucléiques. Aussi, il
existe des membranes synthétiques à base de nylon.

a- Le Southern blot

Cette méthode a été initialement décrite par E.M. SOUTHERN en 1975. Elle consiste à
détecter spécifiquement des fragments d’ADN transférés sur filtre par leur hybridation à des
séquences complémentaires marquées par un radioisotope.

Les étapes successives de cette technique sont les suivantes :

- Extraction de l’ADN génomique : cette extraction s’effectue à partir des cellules séparées
(ex : des leucocytes circulants obtenus à partir de sang total etc..)

- Digestion par des enzymes de restriction : l’ADN génomique est digéré par des enzymes
de restriction différentes : dans le tube 1, on réalisera une digestion par l’enzyme 1; dans le
tube 2, une digestion par l’enzyme 2; etc....). On peut bien entendu réaliser des digestions par
deux enzymes dans un même tube. Dans ces conditions, on obtient un très grand nombre de
fragments, mais seuls quelques fragments correspondent à une partie ou à la totalité du gène
étudié.

- Séparation électrophorétique : des fragments d’ADN par électrophorèse dans un gel

d’agarose. Après électrophorèse des fragments d’ADN bicaténaires obtenus par digestion
enzymatique, on réalise une dénaturation des fragments par un traitement alcalin du gel
d’électrophorèse. Ce traitement transforme les fragments d’ADN double brin (bicaténaires)
en fragments d’ADN monobrin (monocaténaires).

- Transfert des fragments monocaténaires du gel d’agarose à un support souple (feuille de

nylon par exemple). Le transfert des fragments monocaténaires du gel d’agarose à un support
type nylon s’effectue par simple capillarité.

- Fixation des fragments monocaténaires d’ADN sur le support souple et hybridation avec
une sonde complémentaire marquée à un radioisotope.

- Lavages et révélation (dans ce cas par autoradiographie) : Après de nombreux lavages, le

support solide est mis en contact avec un film photographique pendant plusieurs jours. Le
film est ensuite révélé. Les bandes d’ADN monocaténaires hybridées avec la sonde
radioactive sont visibles sous forme de bandes noires sur un fond blanc.
Quelques exemples d’application : La technique du Southern blot peut être appliquée à la
recherche d’altérations sur un gène, dans les empreintes génétiques… etc. Nous citerons
parmi les applications de cette technique :

Ex1 : Comparaison de l’ADN de différents individus avec mise en évidence des

polymorphismes de restriction : En présence de mutation(s) ponctuelle(s) dans des sites de
restriction, des variations dans la taille de certains fragments seront observées et ceci par
exemple à l’intérieur d’une même population. Ces petites différences entre des individus dans
une même population sont appelées le polymorphisme de taille des fragments de restriction
(ou RFLP pour « restriction fragment length polymorphism »).

Ex2 : Carte de restriction de l’ADN : Les enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau de
séquences parfaitement définies. Il est donc possible d’établir une véritable carte d’un gène
donné par la technique de Southern. L’ADN à étudier est réparti en différentes fractions.
 b- Le Northern blot :

Le principe est le même que pour le Southern Blot mais ici ce sont les ARNs qui sont
étudiés. Donc on ne peut plus digérer par enzyme de restriction.

La visualisation d'un ARN par une sonde permet :

- d’apprécier sa distribution dans les tissus, étudier son abondance relative

- de déterminer sa taille

- de détecter les intermédiaires de maturation et les différentes formes d'épissage de l'ARN.

c- Le Dot blot :

Cette technique permet de quantifier un ARN ou fragment d'ADN donné sans séparation
préalable sur gel d'électrophorèse.

Les produits PCR peuvent après transformation en monobrins être hybridés avec des sondes
oligonucléotidiques fixées sur un support solide. Ces sondes correspondent à des séquences
normales et pathologiques (présence de mutations ponctuelles par exemple) pour un gène
donné.

d- Hybridation « in situ » (ISH)

On appelle hybridation in situ (ISH) l'utilisation de sondes d'acides nucléiques marquées

avec des isotopes radioactifs pour mettre en évidence et localiser, dans des cellules ou des
tissus, des séquences d'acides nucléiques, complémentaires à la sonde par leurs bases.

L'ISH est un outil incomparable pour étudier l'expression des gènes. Elle est très proche, dans
son principe, des Southern et des Northern blots et repose, comme eux, sur l'hybridation
d'une sonde d'acide nucléique (ADN ou ARN) marquée avec une séquence complémentaire
d'acides nucléiques que l'on cherche à identifier et à localiser.

Mais les Southern et Northern blot se font sur des broyats de tissus, alors que l'ISH
s'effectue sur une coupe histologique de tissu ou sur une préparation cytogénétique
(Chromosomes), apportant ainsi des informations précises sur la localisation des acides
nucléiques étudiés.
d-1 Genomic in situ hybridation (GISH)

Est une technique de biologie moléculaire d'hybridation in situ qui consiste à analyser la
similarité des génomes des espèces proches (du mem genre) afin d’élucider leur relation
phylogénétique ainsi que les liens de parentés et leur origine.

Elle se fait sur des plaques chromosomique (génomiques) et par imagerie moléculaire en
recourant à des sondes disposant d'un marqueur fluorescent.

d-2 Fluorescence in situ hybridation (FISH)

La FISH (Fluorescence in Situ Hybridization) repose sur la capacité d'hybridation de deux

brins d'ADN complémentaires.

La région à étudier (située sur un chromosome préalablement légèrement dénaturé par

traitement chimique pour le débarrasser des protéines associées) est repéré grâce à une sonde
oligonucléotidique complémentaire.

Certains de ces nucléotides de cette sonde sont couplés à une molécule antigénique reconnue
par un anticorps fluorescent. En utilisant diverses sondes, greffées à des antigènes différents,
on peut ainsi visualiser simultanément plusieurs séquences (gènes) sur un ou plusieurs
chromosomes.

Technique permettant de déterminer la position d'un fragment d'ADN (gènes) dans le génome
: le repérage se fait par rapport au bras du chromosome (p:bras court et q:bras long) et par
rapport aux bandes (mises en évidence par la coloration ou fluorescence sur le chromosome).

I-1.3 L’hybridation sur colonie de bactéries

Ce type d'hybridation permet la détection parmi un grand nombre de bactéries ou de phages

recombinants (plage de lyse) celle ou celui qui contient le fragment d'ADN cible.

La réalisation de cette technique passe par les étapes suivantes :

- Culture pure sur boite de Petri (colonies ou plage de lyse)

- Transfert sur membrane de nylon ou de nitrocellulose
- Lyse alcaline des bactéries et dénaturation de l'ADN
- Fixation par la chaleur ou les UV
- Hybridation avec une sonde marquée
- Lavage
- Autoradiographie
 II- Clonage moléculaire de l’ADN

1- Principe du clonage moléculaire

Le clonage désigne principalement le processus de multiplication d'un organisme,

d'une cellule souche ou d'un gène, en grand nombre d'exemplaires identiques (soit in
vitro, soit in vivo) avec conservation exacte du même génome pour tous les descendants (les
clones).

En biotechnologie, il est possible de produire des copies génétiques exactes du gène, ou un

fragment d'ADN. Cette opération, appelée clonage moléculaire, constitue
une part importante de l'activité conduite dans les laboratoires de recherche où l'on
pratique la biologie et la génétique moléculaires. Elle repose sur un ensemble de
techniques de génie génétique qui permettent d'isoler et de reproduire des gènes.
 2- Les banques d’ADN

Une banque d’ADN est un ensemble de larges fragments d’ADN d’un génome
d’intérêt qui sont clonés dans un vecteur réplicatif (type plasmide) et introduit
dans une cellule hôte facile à répliquer (généralement une bactérie).

Il existe deux types de banque d’ADN :

A- Les banques d’ADN génomique

Collection de clones représentant la totalité du génome d’un organisme d’intérêt obtenue par
digestion partielle, à l'aide d'une ou plusieurs enzymes de restriction, de l'ADN génomique.

Dans une banque d’ADN génomique :

L’ADN cloné est l’ADN chromosomique.

L ’ADN est obtenu à partir de lignées cellulaires, de tissus ou d’organismes entiers en

fonction de la taille de l’organisme.

Les banques créées à partir de l’ADN génomique purifié des différents types cellulaires sont
strictement identiques.

Les banques d’ADN génomique contiennent tous les gènes présents dans l’organisme.

Pour un organisme donné qu’elle que soit la cellule de départ, la banque génomique sera
toujours la même.

Chaque gène est représenté dans les mêmes proportions au sein de la banque

On retrouve dans les fragments d’ADN clonés.

-Les gènes morcelés (introns + exons).

-Les régions de régulation des gènes (promoteur, sites activateurs et répresseurs)
-L’ADN intergénique (non codant et non régulateur).
-Les séquences répétées
 B- Les banques d’ADN complémentaire (ADNc)

Collection de clones représentant l’ensemble des ARNm présent à un moment donné dans un
tissu ou dans un organe donné.

L’ADN cloné est l’ADN complémentaire issus de la retro-transcription de l’ARNm par une
enzyme d’origine virale : la TRANSCRIPTASE INVERSE ou REVERSE
TRANSCRIPTASE

L’ARNm est obtenu à partir de lignées cellulaires, de tissus ou d’organismes entiers.

Chaque type cellulaire exprime un lot donné de gènes donc pour un organisme l’ARNm est
différent pour chaque type cellulaire.

L ’ADN complémentaire est un ADN synthétisé à partir d’une molécule d’ARNm

L’ADN obtenu par retro-transcripton ou reverse transcription est complémentaire à l’ARN

matrice : c’est l’ADN complémentaire ou ADNc
 3- Les vecteurs du clonage

A- Définition

Un vecteur de clonage est un petit élément génétique à réplication autonome, utilisé pour
produire de multitude de copie du gène d’intérêt.

Ces vecteurs de clonage sont spécialement conçus pour permettre l’intégration de la portion
d’ADN exogène (gène d’intérêt) dans un site spécifique sans que cela affecte sa propre
réplication. Il existe plusieurs types de vecteurs pouvant introduire des molécules d’ADN
recombinées dans les bactéries, les levures, les cellules végétales ou les cellules animales et
humaines.

Pour insérer un fragment d'ADN dans un vecteur, on utilise une enzyme de restriction qui
est mélangée avec des fragments d'ADN produits avec la même enzyme. Par la suite,
l'enzyme phosphatase alcaline est ajoutée, qui est chargée d'empêcher la recircularisation du
vecteur, car il ajoute une extrémité phosphate 3' qui évite l'union des deux extrémités ainsi
que la complémentarité et la formation d'une liaison phosphodiester. Immédiatement, l'ADN
qui a l'intention d'être inséré dans le vecteur est ajouté, où l'une des extrémités est jointe par
complémentarité et une ligase est utilisée pour générer l'union et sa recircularisation. Les
vecteurs qui portent un fragment inséré sont appelés vecteurs recombinants.

B- Les caractéristiques principales d’un vecteur

Chaque vecteur de clonage doit contenir les éléments suivants :

• Origine de réplication : C'est la région qui code pour le début de la synthèse d'ADN,
ce qui lui donne la qualité de pouvoir se répliquer indépendamment de l'ADN
chromosomique.
• Agent de sélection : Ce sont des gènes contenus dans la séquence vectorielle, qui
confèrent des caractéristiques supplémentaires au système de clonage (bactéries,
levures, etc.), qui permettent l'identification et la sélection de clones recombinants,
c'est-à-dire des clones qui contiennent le Fragment d'ADN d'intérêt. Des exemples de
cela sont les gènes qui codent pour la résistance aux antibiotiques, tels que ceux pour
la résistance à l'ampicilline ou à la tétracycline.
• Site de multiclonage (polylinker) : région contenue dans les séquences des gènes qui
codent pour les marqueurs, qui contiennent plusieurs sites de restriction, c'est-à-dire
plusieurs sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction, qui permettent
l'insertion de fragments d'ADN à cloner dans un système.
 C- Les différents types de vecteur

La bactérie E. coli est la bactérie la plus utilisée en clonage moléculaire, l'ADN

recombinant peut être introduit sous forme de : Plasmides, Phages, cosmides, BAC, YAC
etc…

a- Les vecteurs bactériens (Les plasmides)

Les principaux vecteurs de clonage sont les plasmides car ils ont été les premiers vecteurs
développés et sont encore largement utilisés.

Ces vecteurs proviennent de molécules d'ADN double brin extrachromosomiques

naturelles qui se répliquent de manière autonome dans les cellules bactériennes en nombre de
copies important et qu’ils sont aisément purifiables.

Les marqueurs de sélection (Ex. gènes de résistance aux antibiotiques) permettent

l’identification des bactéries recombinantes (transformées) qu’ils les portent.
 Plasmide 1er génération (exemple pBR 322)

Le pBR322 appartient à une série de vecteurs de clonage de première génération,

partiellement construit par génie génétique. Qui fut construit sur la base d’une chimère
rassemblant les éléments intéressants des plasmides naturels et en augmentant le nombre de
sites uniques de coupure par les enzymes de restriction.

pBR322 est un petit plasmide constitué de 4361 pb, dont la séquence nucléotidique est
complètement connue.

Il est maintenu de façon stable dans son hôte à un niveau voisin de 20 à 30 copies par cellule.

Sa production peut être portée à plusieurs milliers de copies (1000 à 3000 copies par cellule)
lorsque l’on inhibe la synthèse protéique par l’addition de chloramphénicol dans la culture.

Il est facilement purifiable sous la forme superenroulée par les techniques usuelles
d’extraction et d’isolement.

Il est possible d’y insérer un fragment d’ADN de bonne dimension sans toutefois dépasser la
taille de 10kpb sous peine de l’instabilité plasmidique.

Il possède deux gènes de résistances aux antibiotiques : l’un pour l’ampicilline (ApR), l’autre
pour la tétracycline (TcR), l’expression de l’un de ces deux gènes facilite la sélection
des clones recombinants.

Il possède également vingt sites uniques pour des enzymes de restriction.

Il est facilement transférable par transformation ou par électroporation.

Plasmide de 2em génération (exemple pUC19)

Les vecteurs de clonage de seconde génération ce sont des petits plasmides d’environ
2700pb.

Le plasmide pUC19 contient le gène de résistance à l’ampicilline de pBR322, mais en plus il

possède une partie du gène lacZ dans lequel a été introduit un site multiple de clonage
(Polylinker), contenant toute une série de sites de coupure unique.

L’utilisation d’un inducteur coloré comme le X-gal (5-bromo-4chloro-3-indonyl-β

Dgalactoside), l'hydrolyse de ce dernier en dibromo-5,5-dichloro-4, 4-indigo (de
couleur bleu), indique la production de β-galactosidase.
 b- Les vecteurs viraux (Les phages)

Phage ʎ

Le bactériophage λ a été découvert par E.M. Lederberg en 1950. C'est un virus d’E. coli.

L’ADN de ce phage est une molécule linéaire d'ADN double brin de 48 kb. A chaque
extrémité 5' se trouve une région monocaténaire de 12 nucléotides, l'une complémentaire de
l'autre et leur association donne une structure circulaire à l'ADN dans la cellule hôte.

L’association de ces extrémités cohésives naturelles forme le site cos (essentiel pour la
réplication et l'encapsidation de bactériophage λ).

Au sein des bactéries (E. coli), les vecteurs se répliquent et forment de nombreuses copies du
phage infectieux, qui portent tous le fragment d'ADN d'intérêt pour le clonage.

Les vecteurs phages peuvent transporter des fragments jusqu'à 20 kb (kilobases).

 Bacteriophage M13

Comme le bactériophage λ, le M13 est un petit virus d’E. coli (6407 kb).

L'ADN de ce phage est sous forme simple brin circulaire positif. Mais lors de la réplication
un ADN négatif complémentaire est synthétisé, c'est la forme réplicative (replicative
form) ou la forme intermédiaire. La forme réplicative présente toutes les qualités des
vecteurs plasmidiques.

En plus cette forme sert de matrice à la synthèse d'ADN simple brin qui peut être encapsidé et
par conséquent facilement isolable.

Le M13 à des dérivés contenant une partie du gène lacZ (peptide α), avec un polylinker
(MCS: multiple cloning site) de 13 sites uniques de restriction (54 pb). Ce qui permet
d'insérer des fragments d'ADN dans ces sites, et la sélection des colonies blanches sur
des boites contenant l'analogue X-gal.

Ce vecteur et ces dérivés peuvent être utilisés :

- Pour séquencer des fragments d'ADN même de séquences inconnues par la technique
de Sanger.

- Pour le clonage des fragments d'ADN de taille jusqu'à six fois plus grand que l'ADN viral.

- Pour la transfection des cellules compétentes d’E. coli par les deux formes (MC et BC).

- Dans la mutagénèse dirigée.

c- Les vecteurs artificiels

Les cosmides

Les cosmides sont des vecteurs hybrides utilisant des parties du bactériophage λ et des
plasmides.

Ils ont la séquence cos du phage λ, nécessaire pour le conditionnement de l'ADN du phage
dans sa couche protéique.

Ils contiennent également des séquences plasmidiques nécessaires à la réplication et aux

gènes de résistance aux antibiotiques.

Les cosmides peuvent transporter près de 50 kb d'ADN inséré.

 Chromosome artificiel bactérien (BAC = Bacterial Artificial Chromosomes)

Un BAC est un chromosome artificiel bactérien, basé sur le plasmide de fertilité (facteur F
de 99.2 kb) des bactéries. Il contient qu’une petite partie du facteur f, sa taille est de 6.5 kb.

Le facteur F est un plasmide à réplication indépendante qui transfère des informations

génétiques lors de la conjugaison bactérienne.

Comme un plasmide, le BAC possède un polylinker, gène de résistance à un antibiotique

comme marqueur de sélection (cat : résistance au chloramphénicol) et une origine de
réplication.

Les BAC sont circulaires et très stables, donc ils ne se cassent pas. Et peuvent transporter des
inserts entre 100 et 300 kb.

Ils ne permettent qu'une seule copie du chromosome par cellule.

Chromosome artificiel des levures (YAC = Yeast Artificial Chromosomes)

Les YAC sont des chromosomes de levure artificielle.

Un YAC a des télomères à ses extrémités, une origine de réplication et un centromère.

Ces composants sont liés à des gènes marqueurs de sélection et à un groupe d'enzymes de
restriction pour insérer de l'ADN exogène.

Ces chromosomes de levure artificielle permettent le clonage de gros morceaux d'ADN, 100–
1000 kb.