Module de

Control de qualité
microbiologique

(Cours+TD +
Corrigés des TD)

Par Mme ADDI N.

1
Répertoire :

Cour 1 : Politique de contrôle Microbiologique…………………………………………………………….3

Cour 2 : Techniques classiques de numération de microorganismes………………………………..7

Cour3 : Identification phénotipique des bactéries………………………………………………………11

Cour 4 : Les techniques rapides de détection et Réalisation du control microbiologique…..17

TD 4…………………………………………………………………………………………………………………….21

TD 5…………………………………………………………………………………………………………………….22

TD 6…………………………………………………………………………………………………………………….23

TD 7…………………………………………………………………………………………………………………….24

Corrigé des TD………………………………………………………………………………………………………25

2
 Cour 1 : Politique de contrôle Microbiologique

Introduction :
Le contrôle microbiologique de la fabrication des produits destinés à la
consommation humaine et / ou animale fait partie d’un système de
régulation, dont la fonction est de détecter, le plutôt possible, toute anomalie
de ce système de façon à permettre une réaction préventive destinée à
empêcher toute évolution défavorable de la qualité.

1 Niveaux de contrôle
On a trois niveaux de contrôle : avant, en cours et après la fabrication du
produit.

Contrôle préventif : effectué, avant la fabrication, sur les matières

premières et les adjuvants.
Contrôle en cours de fabrication : effectué sur le produit mais aussi sur le
matériel, les locaux, et le personnel.

Contrôle sur les produits finis : effectué sur le produit fini afin de conclure
sa conformité aux normes.

2 .Fréquence des contrôles

La fréquence de contrôle est établie sur la base de l’expérience et les moyens
disponibles et en fonction de type de produit (type de fabrication), même
selon le type d’usine (unité de production). Un contrôle répété permet de
déterminer les points critiques.

3 Paramètres à contrôler
Les microorganismes à contrôler varient suivant la technologie et les
caractéristiques physicochimiques du produit en cours de fabrication et du
produit fini, mais cependant, on peut les répartir en deux groupes :

1/Microorganismes responsables d’une altération de la qualité

hygiénique :
Bactéries pathogènes : Clostridium spp., Salmonella spp., St. aureus,
Streptocoques fécaux, Escherichia coli, Shigella, Listeria monocytogenes,
Bacillus spp., Yersinia enerocolitica, Campylobacter jejuni.
Bactéries témoins de contamination : St. aureus (témoin d’une
contamination cutanéomuqueuse, Streptocoques fécaux, coliformes et
coliformes fécaux (témoins d’une contamination fécale).

2/Microorganismes responsables d’une altération de la qualité

marchande :
Levures dans les produits sucrés ou les produits acides, moisissures dans
les produits peu hydratés, bactéries lactiques et acétiques dans les
produits acides.

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4.Méthodes de contrôle
Les méthodes de contrôles sont devisées en deux :

1/Techniques microbiologiques de culture qui sont longues, couteuses, et

demandent un délai de réponse très important ;

2/ Techniques microscopiques (état frais, coloration simple : de bleu de

méthylène et double de Gram) qui sont simples, rapides, et de faible cout.
Toutefois, la sensibilité de ces derniers n’étant pas toujours suffisante, donc
il est recommandé de faire, en parallèle, un contrôle par les techniques
microbiologiques de culture dites classiques.

Les techniques microbiologiques de culture peuvent, quelques fois, être

efficacement remplacées par le contrôle de paramètres physicochimiques liés
à la présence de microorganismes tel que : la teneur en eau (H%), la matière
sèche (MS%), le potentiel d’hydrogène (pH) et l’acidité.

D’une façon générale, lors du contrôle microbiologique, les méthodes

employées doivent être, simples, rapides, moins couteuses et sensibles pour
qu’une correction soit, éventuellement, possible dans la fabrication.

5. Prélèvement, transport et préparation des échantillons

Il est important que le laboratoire d’analyse microbiologique reçoive un
échantillon représentatif du lot de produit, non endommagé ou modifié lors
du transport et du stockage. Et dès lors, il sera utile de donner les
définitions suivantes :

Produit : la matière qu’on veut analyser.

Lot : l'ensemble d'individus d'un produit de caractéristiques uniformes.
Échantillon : une ou plusieurs unités d'échantillonnage prélevées.
Échantillon global : l’ensemble des unités d’échantillons prélevés du même
lot.
Échantillon pour laboratoire : nombre réduit d’unités de l’échantillon
global, de quantité représentative nécessaire pour analyse au laboratoire
(cinq (5) unités pour l’analyse microbiologique, et trois (3) unités pour
l’analyse physicochimique).
Non endommagé ou modifié : l’échantillon doit être gardé protégé contre
toute contamination provenant de l’environnement, et même conservé dans
des conditions réduisant toute modification du nombre de microorganismes
présents.
Selon les normes ISO et les normes algériennes (NA), la majorité des
techniques
utilisées pour l'échantillonnage des produits se présentant sous forme
préemballée
peuvent être résumées dans trois techniques :
Technique des pourcentages : pour les lots considérés très importants
(1 % s’agit d'un grand lot, 10 % lorsqu'il s'agit d'un lot plus au moins petit).

4
Technique de la racine carrée (2√) : pour les lots considérés pas trèsgrands
(2√ de l'effectif du lot).

Technique de la racine cubique (3√) : pour les lots considérés assez

grands (3√ de l'effectif du lot).
Le prélèvement de l'échantillon global se fait d'une façon systématique ou
aléatoire, à partir des endroits différents du lot. Le prélèvement de
l'échantillon pour laboratoire est la dernière étape de l'échantillonnage, il est
effectué à partir de
l'échantillon global.
Cependant les produits ne sont pas toujours contenus dans leurs
emballages, ils
peuvent se présenter en vrac de nature solide ou liquide : le blé dans les
silos ou
dans des bateaux, l’huile dans les citernes.

5.1 Cas des aliments solides

Pour mieux expliquer la procédure d’échantillonnage des produits en vrac
solide ,on prend l’exemple des grains, dont l’échantillonnage se fait avec le
matériel suivant : pelle à main, sonde cylindrique.
Prélèvement en bateau : se fait pendant l’opération de déchargement en
plusieurs endroits et à des intervalles de temps déterminés, ainsi à partir de
l’échantillon global, on réalise l’échantillon de laboratoire.
Prélèvement dans les citernes (Wagons ou dans des camions) : se fait
dans toute la hauteur de la couche à l’aide d’une sonde cylindrique, et à des
endroits de prélèvement au centre et à environ 50 cm des parois.

5.2 Cas des aliments liquides

La procédure d’échantillonnage des produits en vrac liquides se fait à l’aide
d’un
échantillonneur de fond ou à soupape , à partir de :
Citernes (fixes, wagons, camions, navire) : se fait sur un produit homogène
et à différents niveaux, et à partir de l’échantillon global on obtient
l’échantillon de laboratoire. Si, le produit n’est pas homogène, on doit
réaliser des prélèvements, séparés par intervalle de temps, de haut en bas.
Dans le cas des citernes navires, l’échantillonnage s’effectue en cours de
transvasement, par de prises fréquentes à intervalle régulier.

Remarque :
L’échantillonnage doit être effectué, aseptiquement, avec les mains propres,
ou avec des gants propres en latex, en se servant des récipients propres et
stériles ou des sachets stériles ;

Les échantillons doivent être identifiés clairement et intégralement ;

Les échantillons doivent avoir un transport rapide et un stockage bref ;
Les températures suivantes sont recommandées durant le transport :
- Produits stables : température ambiante (inférieure à 40 °C) ;
- Produits congelés ou surgelés : de préférence inférieure à −18 °C ;
- Autres produits non stables à température ambiante : de 1 °C à 8 °C.
5
Les températures suivantes sont recommandées durant le stockage :
- Produits stables : température ambiante (de 18 °C à 27 °C) ;
- Produits congelés ou surgelés : de préférence inférieure à −18 °C ;
- Autres produits non stables à température ambiante : 3 °C ± 2 °C.

5.3 Échantillonnage en surface

Dans certains cas, on réalise un échantillonnage en surface :

En règle générale on met la surface à analyser en contact avec un diluant
stérile, puis on prélève la suspension microbienne ;
Par écouvillonnage de la surface, à l’aide d’un écouvillon qui est ensuite mis
en suspension dans un diluant stérile, ou directement étalé sur un milieu
gélosé ;
Au moyen de boites de contact ou lames d'immersion remplies du milieu
gélosé, qui est pressée contre la surface à soumettre à l'essai.

Techniques de dilution

Une fois arrivés au laboratoire, les échantillons doivent être préparés en vue
du contrôle microbiologique.
Pour l’échantillon liquide, il constitue la solution mère (SM) et si nécessaire
des dilutions décimales sont réalisées dans un diluant stérile, et utilisées
pour la recherche et le dénombrement de microorganismes selon les
méthodes de dénombrement.
Quant à l’échantillon solide, celui-ci nécessite un broyage dans un diluant
stérile à l’aide des broyeurs de laboratoire, cet ensemble (échantillon et
diluant) constitue la dilution mère (DM), et si nécessaire d’autres dilutions
décimales sont réalisées.

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 Cour 2 : Techniques classiques de numération
de microorganismes

1 Numération microscopique

Les techniques de numération microscopique offrent une possibilité de

détecter les microorganismes lors de contrôle de produits, simplement en
regardant un échantillon directement sous microscope optique. Bien qu’il
soit généralement relativement facile de repérer, avec soin et patience, les
bactéries, les levures et les moisissures à l’état frais, il est possible de
réaliser des colorations afin de rendre ces microorganismes plus facilement
visibles, ainsi les deux colorations couramment employées sont la coloration
simple au bleu de méthylène et la coloration complexe (double) de Gram.
Dans le cas de certains produits liquides (lait, yaourt, et jus de fruits), il est
nécessaire de diluer l'échantillon ce qui permettra de réduire la
concentration de microorganismes et de constituants supplémentaires.

a. Utilisation des cellules à numération

Les lames type hématimètre comme les cellules de THOMA et de MALASSEZ,

pourraient être employées pour le dénombrement des microorganismes. Ces
lames sont conçues en verre de 2 à 3 mm d’épaisseur comportant une
surface délimitée et quadrillée et recouverte d’une lamelle de sorte qu’elle
emprisonne une quantité connue de la solution-dilution de l’aliment à
examiner.
Cellule de THOMA : d’une taille de 0.2 x 0.2 mm, une profondeur de
0.1 mm et elle emprisonne un volume de 1 mm3 . La cellule est formée de
seize (16) grands carrés, composés chacun de seize (16) petits carrés (fig.1).
Cellule de MALASSEZ : d’une taille de de 0.2 x 0.2 mm, une profondeur de
0.2 mm et elle emprisonne un volume de 1 mm3 (Fig.2).

Figure 1 : représentation schématique : (a) quadrillage de la cellule de

THOMA (b) cellule de THOMA.

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 Figure 2 : représentation schématique : quadrillage de la cellule
de MALASSEZ.

La méthode de Breed
Cette méthode utilise des lames comportant une zone délimitée de un
centimètre cube (1 cm2) sur laquelle on dépose 0.01 ml de la suspension de
l’aliment à examiner. Après séchage, fixation et coloration au bleu de
méthylène ou éventuellement la coloration de Gram, les microorganismes
sont comptés dans 30 à 50 champs microscopiques.

B. Méthode de filtration à épifluorescence directe (DEFT)

C’est une technique de numération microscopique, qui est appliquée pour le
dénombrement des microorganismes dans toutes sortes de produits. Elle
permet d'obtenir une sensibilité nettement accrue de 103 à 104
microorganismes par ml, suite à une concentration des microorganismes
contenus dans la suspension de l’aliment à examiner sur un filtre à
membrane, suivie d’une coloration à orange d'acridine. Les microorganismes
retenus sur la membrane sont comptés directement sous le microscope à
épifluorescence.

D. Numération après passage sur un milieu d’enrichissement

Cette technique non quantitative est utilisée pour des espèces déterminées
(Lactobacilles, Salmonelles, etc.) ou il excite une corrélation entre le nombre
de microorganismes au début et à l’issue de l’incubation. Une suspension de
l’aliment à examiner dans un milieu d’enrichissement sélectif est réalisée,
suivie par une incubation aux temps et température appropriés du
microorganisme, puis une numération sur lame au microscope optique.

2 Numération en et sur milieu solide

a. Dans la masse (pour plate)
C’est la méthode standard d’énumération des germes aérobies, dont
l’utilisation nécessite un milieu de croissance claire pour permettre le
comptage des colonies au moyen d’un compteur de colonies. Les germes
anaérobies ont besoin d’une deuxième couche de gélose qui permet de
maintenir un environnement anaérobie (méthode de la double couche).

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B. Étalement en surface (spread plate)

Cette méthode est préférable lorsque des milieux sélectifs sont utilisés pour
le dénombrement de groupe spécifique de microorganismes aérobies, car elle
permet
la manifestation de propriétés coloniales de ces microorganismes, telles que :
morphologie, pigmentation, hémolyse, halos de précipitation, ou
changements de
couleur du milieu de culture.

C. Étalement en surface en spirale (spiral plate)

Pour cette technique, une machine distribue un petit volume entre 0.05 et
0.4 ml de la suspension de l’aliment à examiner, à la surface des boites (à
contenu
uniforme en milieu de culture) qui sont en rotation, ceci en suivant une
distribution
spirale à partir du centre vers la périphérie de la boite, ou bien dans d’autres
cas
dans le sens inverse à partir de la périphérie vers le centre de la boite. Après
incubation, le comptage de colonies se fait à l’aide d’un compteur de colonie
muni d’une grille de visualisation ou avec un compteur de colonies à laser

D. Numération en tubes (roll tube count)

À la place des boites de Pétri, on emploie des tubes contenant 2 à 4 ml de

milieu glosé. Ensuite, 0.1 ml de la solution-dilution de l’aliment à examiner
est inoculé dans le milieu en surfusion, et les tubes sont roulés
horizontalement sous l’action de l’eau froide. Après incubation les colonies
sont comptées.

E. Filtration sur membrane

Cette technique est utilisée pour estimer le nombre de microorganismes lors

du contrôle des liquides alimentaire (l’eau, boissons…). Elle consiste à une
concentration de microorganismes sur membrane au moyen d’un appareil de
filtration mono ou pluri-postes. Les filtres utilisés sont conçus à partir de :

mélange d’esters de cellulose ; de polymères similaires (nitrate de cellulose,

acétate de cellulose) ; à partir d’autres polymères : polyamide, polypropylène,
polycarbonate, polytétrafluoroethylène (PTFE)).
Le nombre de colonies N par ml d’échantillon est calculé de la manière
suivante :
N = n / v, avec n nombre de colonies, v est le volume de l’échantillon qui est
égal, généralement, à 100ml.

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3. Numération en milieu liquide

Cette numération en milieu liquide est connue sous le nom de la méthode du

nombre le plus probable (NPP) de Mc GRADY, elle est utilisée, généralement,
pour la recherche et le dénombrement des coliformes totaux, coliformes
fécaux, et Streptocoques fécaux dans l’eau.
Cette technique est basée sur l'utilisation de trois tubes de milieu liquide
(simple
ou double concentration), ensemencé avec (1 ou 10 ml) de trois dilutions
décimales
de l’aliment à examiner (méthodes de 3).
Après incubation on compte le nombre de tubes positifs dans chaque série
de trois et on détermine le nombre caractéristique formé de trois chiffres qui
est ensuite reporté dans la table de Mc GRADY. La croissance est appréciée
par le trouble microbien, par le virage de couleur du milieu, ou par la
production de gaz carbonique.

Tableau de Mc Grady :

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 Cour3 : Identification phénotipique des
bactéries

Introduction :
De nombreux caractères sont exploités pour identifier une bactérise, déjà
isolé à l’état pur. Dans ce manuscrit, que la catégorie de caractères
phénotypique ou phénétique (culturaux, morphologiques, biochimique et
physiologiques, immunologique, et de pouvoir pathogène) sera discutée.

1 Caractères culturaux
La taille, la forme, la couleur, l’opacité, la surface, la consistance, l’odeur, et
évidemment tout changement produit à la surface du milieu solide, sont les
caractères fréquemment utilisés pour caractériser macroscopiquement une
coloniebactérienne (amas de cellules) (Figure 1).
À l’oeil nu ou à l’aide d’une loupe binoculaire, les colonies sont observées par
transparence, réflexion ou transillumination oblique, ceci en lumière
naturelleet / ou artificielle (Figure 1).

La taille ou le diamètre : peut-être mesurée à l'aide d'une règle

millimétrique graduée ;
L'aspect de la surface : peut-être lisse ou rugueux ;
La forme : (plan, relief, bord) centre parfois surélevé, ombiliqué en creux ;
L'opacité : les colonies sont décrites comme : opaques (ne laissent pas
passer la lumière) ; translucides (laisse passer la lumière mais on ne voit pas
les formes au travers, comme le verre dépoli ; transparentes (laissent passer
la lumière et voir les formes au travers, comme le verre) ;
La consistance : au moment du prélèvement il est possible d'apprécier si
les colonies sont : grasses / crémeuses (on obtient facilement des
suspensions homogènes) ; sèches / muqueuses (on obtient difficilement
des suspensions homogènes) ;

La couleur (pigmentation) : sur des géloses ordinaires, les colonies sont

habituellement crème, alors que sur des milieux sélectifs, les colonies,
sont d’une couleur différente, ceci est due à divers pigments de couleur
jaune, rouge, orange, violet, etc. ;
Odeur : une odeur caractéristique peut être présente (Pseudomonas
aeruginosa, odeur fruitée associée à celle des pommes vertes).

En rassemblant les caractères dessus, trois types de colonies peuvent être

distingués :
(1) Colonie S (Smooth - lisse) : à surface lisse et bords réguliers, bombés,
de
consistance crémeuse et donnant des suspensions homogènes ;
(2) Colonie R (Rough - Rugueux) : à surface rugueuse et bords dentelés,
plats, de consistance sèche et donnant des suspensions hétérogènes ;
(3) Colonie M (Muqueuse) : à surface lisse et bords réguliers, bombés,
filants sous l'anse, et donnant des suspensions hétérogènes.
11
 Figure 1 : représentation schématique des caractères fréquemment

2. Caractères morphologiques et structuraux

a. Coloration de Gram
La coloration de Gram (le premier test à réaliser) permet de diviser les
bactéries en deux grands groupes : celles à paroi type Gram+ (qui retiennent
le violet de gentiane) et celles à paroi type Gram- (qui prennent la couleur de
la safranine après lavage par l’alcool).
Cette méthode est basée sur la structure et la composition de la paroi. Les
lipides assez forts chez les Gram- que les Gram+, sont extraits par l’action de
l’alcool entraînant, ensuite, une augmentation de la perméabilité et
l’extraction du complexe violet de gentiane-iode, ceci lui permettant de
prendre la couleur de la safranine (fuschine).
Aussi, ce test permet de diviser les bactéries selon leurs forme en deux
grands
groupes : cocci et bacille, et il fournit de précieuses informations en ce qui
concerne
le mode de groupement qui peut être en : diplocoques, chainettes, tétrades,
amas,
et palissades. Il est à noter que même sans ce type de coloration (coloration
complexe et / ou double), à l’état frais la forme, le groupement et la mobilité
pouvons être observés.

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b. Coloration de Ziehl-Neelsen (acid-fast stain)

La coloration de Ziehl-Neelsen est spécialement désignée pour les

Mycobactéries qui sont caractérisées par leur aptitude à ne pas être
décolorées par les acides dilués et l’alcool, après avoir été colorées par la
safranine ou la fuchsine.
Ils sont dits bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR), exemple : Mycobcterium
tuberculosis, qui apparait rose- rouge, souvent parlé et légèrement incurvée.

c. Coloration de la capsule
La présence d'une capsule est révélée par la coloration à l'encre de Chine, sa
mise en évidence est un indice important pour identifier les microorganismes
en deux groupes : les capsulés et ceux acapsulés, exemple : des diplocoques
Gram+ entourés d'une capsule importante, ceci évoque Streptococcus
pneumoniae.

d. Coloration des endospores (sporulation)

La sporulation permet de diviser les bactéries en deux groupes : sporulées et
asporulées, ce test est réalisé soit par coloration au vert de malachite
solution à 5 %, soit tout simplement par essai de culture après
pasteurisation. La position de la spore permet l’identification des bactéries
en groupes à l'intérieur de la même famille.

3 Caractères biochimiques et physiologiques

a. Demande en O2
Ce caractère permet de classer les bactéries, selon leurs réponses de
croissance
en présence et en absence d'oxygène, en 5 groupes :
(1) Aérobie strict : l’accepteur final de l’hydrogène est obligatoirement l’O2
de l’air, exemple : Pseudomonas aeruginosa ;
(2) Anaérobie strict : l’accepteur est de nature différente et l’O2 est toxique ;
(3) Anaérobie aérotolérant : sont capables de croître en présence ou en
l'absence d’O2, l’accepteur est de nature différente et l’O2 n’est pas toxique,
exemple : Campylobacter jejuni ;
(4) Anaérobie facultatif (aéroanaérobie) : la bactérie se développe
indifféremment dans des conditions d’aérobie ou d’anaérobiose mais se
développe mieux en sa présence, exemple : Entérobactéries ;
(5) Microaérophile : ont besoin d’O2 mais à un niveau acceptable.

b. Oxydation-fermentation est assimilation des sucres

La détermination de l’oxydation-fermentation et la possibilité que d’autres
sucres soient assimilés comme seule source de carbone sont importantes à
des fins taxinomiques.

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Les bactéries assimilent le (s) sucre (s) en produisant de l’acide et
fréquemment du CO2 en présence ou en absence d’O2. L’acidification du
milieu est détectée par changement de couleur du milieu dû à la présence
d’un indicateur coloré (BCPL, rouge de phénol, bleu de bromothymol, etc.).
Le CO2 est révélé par l’élévation de la cloche du durham car il est libéré au
fond du tube (cas de la voie oxydative il est produit en surface donc n’y a pas
élévation de la cloche). Plusieurs techniques utilisant différents milieux
(MEVAG, TSI, bouillon divers…) sont pratiquées.

c. Types fermentaires (tests RM / VP)

Ces deux tests sont de grande utilité en identification. La réaction au Rouge
de Méthyle caractérise le type fermentaire acide mixte de la fermentation
butylène glycolique chez les Entérobactéries. La réaction de Voges Proskauer
caractérise la voie d’acétoïne chez les Entérobactéries et autres groupes. Les
deux sont réalisés sur milieu glucosé Clark et Lubs.

d. Accepteurs de l’H2
La sulfito-réduction : les anaérobies sulfito-réducteurs sont capables
d’utiliser les sulfites comme accepteurs d’H2 en les réduisant en sulfures.
Ce test est réalisé sur milieux solides (VF) ou bien semi-solide contenant
de sulfite de sodium et l’alun de fer. Après incubation la réduction se traduit
par un noircissement (la production d’ H2S) .
La réduction des nitrates : les anaérobies sont, aussi, capables d’utiliser
les nitrates comme accepteurs d’H2 en les réduisant en nitrites. Ce test est
réalisé sur milieux solides ou bouillons à 1 ‰ de nitrate de potassium.
Après incubation, la réduction nitrates en nitrites est révélée par l’ajout de
0.1 ml du réactif NiT1 et NiT2. Une coloration instantanée rouge ou rose
indique la réduction des nitrates. Un résultat négatif doit être vérifié par
l’addition de poudre de zinc.

e. Enzymes respiratoire

Catalase : une enzyme qui hydrolyse le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en

eau et en oxygène (un dégagement de bulles d’air, instantanément, indique
sa présence). Ce test réalisé, généralement par deux techniques, constitue
un bon élément de différenciation et divise les bactéries en deux groupes
celles à catalase+ et à celles catalase-. La catalase est un test clé
communément utilisé pour l’identification des bactéries à Gram+.
Exemple : Staphylocoques ; Listeria monocytogène sont catalase+ /
Streptocoques est catalase- ;

Cytochrome oxydase : la dernière enzyme de la chaîne respiratoire, elle

catalyse le transfert de l’H2 sur L’O2, elle est mise en évidence par la
réaction d’oxydation de l’oxalte de diméthyl-paraphénylène-diamine, ce
substrat est incolore sous forme réduite est rouge sous forme oxydée.
Inversement à son précédant, l’oxydase est un test clé communément
utilisé pour l’identification des bactéries à Gram-. Exemple : Pseudomonas
spp. et Neisseria spp. sont oxydase+ / Acinetobacter spp. est oxydase-.

14
f. Dégradation des acides aminés

TDA, Tryptophanase et PDA : enzymes utilisées en identification

bactérienne. Le tryptophane-désaminase (TDA) catalyse la réaction de la
désamination du tryptophane en acide indole-pyruvique et ammoniac.
Tandis que la tryptophanase catalyse la réaction de dégradation du
tryptophane en indole, acide pyruvique, et ammoniac. L’addition de chlorure
de fer III (FeCl3) réagit avec l’acide indole-pyruvique en donnant un précipité
de couleur marron et l’addition de réactif de Kovacs réagit avec l’indole en
donnant un anneau rouge en surface. Exemple : E. coli est Indole+. Alors
que, la phényl-alanine-désaminase (PDA) catalyse la
réaction de la désamination de la phénylalanine en acide phénylpyruvique et
ammoniac. L’activité de la phényl-alanine-désaminase (PDA) est réalisée sur
gélose inclinée à la phényl-alanine. L’acide phényl pyruvique (APP) donne
une teinte verte en présence de chlorure de fer.

l’ornithine-décarboxylase (ODC), la lysine-décarboxylase (LDC) et

l’arginine-déhydrolase (ADH) : la possession de ces enzymes est un
caractère souvent étudié en identification des bacilles Gram- notamment les
Entérobactéries et les Pseudomonas. Les milieux les plus utilisés,
enanaérobiose, sont ceux de Falkow (dont la technique a été étendue par
Möller), ces milieux contiennent, le glucose, un indicateur coloré
(généralement le BCPL) et ne renferment qu'un seul acide aminé, celui dont
on veut étudier l'utilisation.

g. Dégradation du lactose

ONPG : la possession de la ß galactosidase est un caractère couramment

utilisé pour l'identification des bactéries, il est particulièrement pratiqué
pour les Entérobactéries uniquement ceux à lactose-. Cette enzyme
hydrolyse un analogue du lactose : l’ortho-nitro-phényl-galactopyraniside
(ONPG) en galactose et ortho-nitro-phénol qui présente une couleur jaune.

h. Dégradation de l’urée

Uréase : hydrolyse l’urée en ammoniac et carbonate d’ammonium aboutit à

l’alcalinisation du milieu, qui est décelable par changement de couleur du
milieu dû à la présence d’un indicateur coloré (généralement le rouge de
phénol). Ce test permet d'identifier certaines espèces d'entérobactéries,
Corynebacterium urealyticum, et Helicobacter pylori.

I.Caractères biochimiques et physiologiques divers

Mobilité : est recherchée sur milieu semi-solide (en culot).
L’ensemencement est réalisé par piqûre centrale, après incubation la
mobilité se traduit par l’envahissement du milieu.

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Températures de croissance, halophilie-osmophilie et pH : l’évaluation
de l’habilité de croissance dans des conditions hostiles, présente parfois
un grand intérêt en identification. L’habilité à croître à différentes
températures, à différentes concentrations en NaCl ou en saccharose et à
différentes valeurs de pH est réalisée sur milieux liquides ou solides.

Résistance aux antibiotiques et aux inhibiteurs : l’habilitée à croitre en

présence de certains antibiotiques ou agents inhibiteurs est largement
utilisée en taxinomie. La présence ou l’absence de multiplication indique la
sensibilité ou la résistance de la bactérie. Ce test est réalisé sur milieux
liquide ou solide. Il est important de souligner que, contrairement aux Gram-
, les Gram+ sont sensibles avec exception (Entérococci, Lactobacilli,
Leuconostoc et Pediococcus spp.) à la vancomycine.

En revanche, les Gram- sont sensibles aux colistine et polymyxine, alors que
les Gram+ ne le sont pas.

4 Caractères immunologiques (sérologique)

Les réactions sérologiques : de type bactérie-anticorps (réaction
d’agglutination) ou de type antigène-anticorps (réaction de précipitation) sont
utilisées en taxinomie essentiellement pour les Entérobactéries dont
contiennent trois types d’antigènes : H, O, et K ; et les streptocoques dont le
plus important est le type C : A, B, C, D, N. Ces tests sérologiques se font
principalement suivant la technique de Lancefield basée sur l'utilisation de
polysaccharides (notamment la polyoside C) de l'enveloppe cellulaire en tant
qu'antigène.

5 Pouvoir pathogène

Coagulase : ce caractère permet seul d'affirmer la présence de St. aureus qui

est coagulase+ des autres Staphylococcus qui sont à coagulase- (St.
epidermidis, St. saprophyticus). St. aureus produit deux types de coagulase :
(1) coagulase libre (enzyme extracellulaire) et la coagulase liée (protéine
associée à la paroi). Les deux enzymes sont
capables in vitro de coaguler le plasma de lapin (la formation d'un caillot de
fibrine insoluble).

Hémolysines α, ß et γ : enzymes responsables de la lyse des hématies, ils

sont mises en évidence par culture sur gélose au sang.
Hémolysines α (zone verdâtre due à la metmyoglobine, exemple : S.
pneumonia ; Hémolysines ß (auréole claire due à la libération de
l’hémoglobine, exemple : St. aureus) ; Hémolysines γ (pas de modification,
pas d’hémolyse autour des colonies, exemple : E. faecalis).

ADNase : enzyme qui détruit le noyau des cellules, elle est mise en évidence
sur milieux contenant de l’ADN. L’hydrolyse de l’ADN est caractérisée par
une zone claire, exemple : St. aureus+.

16
Cour 4 : Les techniques rapides de détection et
Réalisation du control microbiologique

A/ Les techniques rapides de détection

Introduction :
L’évaluation de l'activité microbienne est aussi importante que l’évaluation
du nombre de microorganismes. Un certain nombre de techniques de
détection, relativement récentes, ont été développées, qui visent à donner des
réponses plus rapides et ils sont donc souvent dénommées « techniques
rapides de détection » .

4.1 Spectroscopiques
a. Réduction des colorants
Le principe repose sur la réponse d’un colorant redox à la présence de
microorganismes métaboliquement actifs qui se traduit par un changement
de couleur. Deux colorants sont couramment utilisés pour estimer le nombre
de microorganismes viables : le bleu de méthylène (passe du bleu au blanc)
et la résazurine, qui a été utilisée dans des contrôles des laits et les viandes
fraiches et hachées. Ce colorant est réduit et passe du bleu au rose à
l'incolore. Le temps nécessaire à la décoloration peut être mesuré pour
évaluer le nombre de microorganismes viables. L’appréciation de la
décoloration s’effectue généralement à l’oeil ou à l’aide d’un
spectrophotomètre.

b. Mesure d’activités enzymatiques

La technique des colorants redox repose sur l’évaluation de l’activité de la
réductase, cependant de nombreux autres enzymes ont été utilisés pour
détecter et évaluer la présence des microorganismes, c’était le cas des :
phosphatases, estérases (pour évaluer le nombre des bactéries viables dans
le lait, viandes et le poissons), et la glutamate décarboxylase (pour évaluer le
nombre d’E. coli).

c. Dosage de coenzymes (réaction de bioluminescence du

système ATP-luciférine-luciférase)
Cette technique (ATP-métrie) utilise le système ATP-luciférine-luciférase.
Certains microorganismes peuvent émettre de la lumière en conséquence de
l'activité de la luciférase sur la luciférine. La réaction nécessite la présence
de Mg++ et de l'ATP qui facilite la formation du complexe ATP-luciférine-
luciférase, le complexe est oxydé par l'oxygène en donnant l'oxyluciférine
dans un état excité.
L'état excité de la molécule retourne à l'état stable (fondamental d'énergie
inférieure) et libère un photon de lumière (se dissocie et libére à nouveau
l'enzyme luciférase). Il est possible de mesurer soit l’intensité de la lumière
émise à son maximum, soit la quantité de la lumière émise. Dans les deux
cas, les résultats obtenus sont proportionnels à la concentration d'ATP

17
présente et éventuellement proportionnels au nombre de microorganismes
présents. Avant le dosage, une extraction de l'ATP microbienne doit être
réalisée par lyse des cellules microbiennes. Cette technique est, cependant,
utilisée pour surveiller l'hygiène dans les industries.

d. Marqueurs radiométriques
Cette technique est basée sur l'incorporation des 14C marqué dans un milieu
de croissance de sorte que, lorsque les microorganismes utilisent ce
métabolite, le 14CO2 est libéré et ainsi il mesuré par utilisation d'un
compteur de radioactivité ou par un spectrophotomètre. Le 14C est incorporé
en 14C-glucose pour les microorganismes qu’ils utilisent habituellement,
sinon il est incorporé en 14C-formate ou 14C-glutamate pour les autres. La
technique consiste à réaliser une culture en milieu contenant la molécule
marquée et après l'incubation la culture est testée périodiquement pour
déterminer la présence de 14CO2. Le temps nécessaire pour détecter le 14CO2
est inversement proportionnel au nombre de microorganismes présents.

7.2 Électrochimique
a. Impédancemétrie
Cette technique mesure la baisse de l'impédance dans un milieu pourvu de
microorganismes (l'impédance électrique qui est la résultante de la présence
et de l’activité des microorganismes) par rapport au même milieu dépourvu
de microorganismes (l'impédance électrique du milieu). Au cours du temps
les microorganismes présents dans le milieu dégradent de grandes molécules
électriquement neutres ou faiblement chargées (protéines, polyosides…) et
produisent des molécules plus petites ionisées (acides aminés, acides
organiques…) conduisant à la diminution de l'impédance du milieu. La
technique consiste à réaliser des cultures dans des cuvettes, au fond
desquelles sont fixées des électrodes de mesure du bactomètre (appareil qui
assure automatiquement l'incubation et la lecture simultanément). Elle est
utilisée pour la détection et l’évaluation des principaux contaminants
(germes aérobies, Entérobactéries, coliformes, bactéries lactiques, levures et
moisissures).

7.3 Autres Procédés (Microcalorimétrie)

Cette technique repose sur la mesure des faibles variations de chaleur
(mesure
de l'enthalpie impliquée dans la dégradation de substrats de croissance). La
production de chaleur mesurée, au moyen de microcalorimètres, est
étroitement liée aux activités cataboliques des microorganismes.

18
B/ Réalisation du contrôle microbiologique
1 Contrôle des matières premières
Le contrôle microbiologique des matières premières doit permettre de vérifier
que celles-ci ne referment ni les microorganismes risquant de gêner le
déroulement de la fabrication, ni les microorganismes pouvant altérer le
produit. Il faut distinguer, ici :
Les industries de fermentation, où le contrôle est le plus souvent un contrôle
de stérilité du milieu / un contrôle de propreté microbiologique du levain ;
Les autres industries, où le contrôle consiste à rechercher les
microorganismes potentiellement dangereux (germes aérobies, levures et
moisissures, Clostridium spp., Salmonella spp., Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Coliformes, Coliformes fécaux, Streptocoques fécaux…),
et à analyser les paramètres physicochimiques habituels (H%, MS%, pH et
acidité…).

2 Contrôle des levains

Le contrôle des levains doit permettre de détecter des contaminants présents
à des taux souvent très faibles par rapport aux cellules de cultures. Trois
grands types de levains sont utilisés dans les industries de fermentation et la
recherche de contaminants se fait par les techniques de culture ou par les
techniques microscopiques.
(1) Les levains à Saccharomyces : les contaminants les plus fréquents sont
les levures sauvages, les bactéries lactiques et acétiques ;

(2) Les levains à levures et moisissures : les contaminants les plus

fréquents
sont les bactéries ;

(3) Les levains bactériens : les contaminants sont fréquemment d’autres

bactéries et bactériophages.

3 Contrôle de la fabrication
Le contrôle de la fabrication consiste à suivre le processus de fabrication :
Les industries de fermentation, où le contrôle consiste essentiellement à
suivre, aussi bien le développement du levain que l’apparition et le
développement des contaminants (les techniques microscopiques les plus
utilisées : technique de numération et technique de coloration) ;
Les autres industries, où le contrôle consiste essentiellement à surveiller les
paramètres de transformations, mais aussi de rechercher et dénombrer les
microorganismes potentiellement dangereux (germes aérobies, levures et
moisissures, Clostridium spp., Salmonella spp., Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Coliformes, Coliformes fécaux, Streptocoques fécaux, etc…).

19
4 Contrôle de nettoyage et de la désinfection

Le nettoyage et la désinfection se font généralement, soit de façon

systématique, soit entre deux fabrications successives. Dans les deux cas, le
contrôle est pour vérifier l’efficacité de l’opération du nettoyage et de la
désinfection à détruire les microorganismes indésirables. Pour cela
différentes techniques sont utilisées : boites de contacts et lames pour le
contrôle microbiologique des surfaces, écouvillonnage pour le contrôle
microbiologique de dispositifs moins accessibles (vannes, robinets,
canules…).
L’air ambiant est aussi sujet de contrôle microbiologique, ceci tout
simplement par utilisation des boites de Pétri remplies de milieu de culture,
qu’on laisse ouvertes pendant maximum 15 min.

5 Contrôle Des Produits finis

Le contrôle microbiologique des produits finis porte sur leur qualité

hygiénique et leur qualité marchande. Ce contrôle consiste à la recherche et
au dénombrement des microorganismes potentiellement dangereux (germes
aérobies, levures et moisissures, Clostridium spp., Salmonella spp.,
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Coliformes, Coliformes fécaux,
Streptocoques fécaux…) et porte pour conclure la conformité de produit vis-
vis les normes (critères ou spécifications).

20
 TD 4 : CONTROL DE QUALITE

Questions :
1/Quels sont les objectifs du control microbiologique ?

2/Quels sont les niveaux de control microbiologique ?

3/Quels sont les paramètres à contrôler ?

4/Quand utilise-t-on les milieux de culture sélectifs ?

5/Citez les étapes de la coloration de Gram ?

6/Définissez les termes: Lot, échantillon, produit.

7/Quel sont les sortes d’échantillonnage existants ?

Exercice : 1 ml 0.1 ml 1 ml

1 ml

1ml de
lait

9.9ml
Lait 9ml eau 9ml eau 9ml eau eau 9ml eau

Solution
mère

1/ Définissez l’étape échantillonnage sur cet exemple ?

2/ Quels sont les dilutions trouvés dans cet exemple ?

Par Mme ADDI

21
 TD 5 : Control de qualité

I. Rappel sur les méthodes de dénombrement :

• Dénombrement sur milieu Solide
• Dénombrement sur milieu liquide
• Méthode de Breed

Questions :
Quels sont les différentes techniques de control microbiologiques utilisées ?

Quels sont les méthodes de dénombrement classiques ?

EXERCICE 1 :

Donnez un schéma pour avoir les dilutions suivantes :

10-1 10-2 10-4 10-6 10-7

EXERCICE 2 : Analyse du lait :

Nous avons un échantillon de lait à analyser,

1) Comment procéder à l’Analyse de cet échantillon ?

2) Calculez les dilutions et le nombre de microorganismes par « ml » de ce qui suit :

1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml

Dilutions : 10-3 1ml ? ? ? ?

300 130 32
Condensées,
350 300 42 indénombrables

22
 TD 6 : Control de qualité

EXERCICE 1 : 0.1ml 5ml 1ml

1ml

A B C D
1g de Viande

9 ml Eau 9ml Eau 9,9ml Eau 45ml Eau 9ml Eau

Dilutions : 10-1 ? ? ? ?

1) Donnez les dilutions des tubes A, B, C, D ?

2) Le comptage des colonies sur boites de pétri, nous a permis de réaliser le tableau
suivant :
TUBES B C D
Dilutions .? .? .?
Nombre de colonies 245 123 40
Par boite 214 110 23
Contaminée 100 15

- Calculez le nombre de micro-organismes par millilitre ?

EXERCICE 2 :

-Calculez la flore présente dans l’échantillon de lait, selon les résultats du tableau suivant : (on donne
le nombre de tubes positifs)
Tableau de Mc Crady :
DILUTIONS 10-3 10-4 10-5 10-6
Flore 3 3 2 1 NPP NC
indologène 322 210
Flore 3 2 1 1 321 150
putride
320 93

Par Mme ADDI N .

23
 TD 7 : Control de qualité

Exposés sur les thèmes suivants (qui sont les méthodes de

fractionnement) :

o La Sédimentation

o La dyalise

o Méthode de filtration

o Méthodes chromatographiques

o Méthodes éléctrophorétiques

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 Corrigés des TD

TD 4 :
o Pour les questions : les reposes sont sur le cour.

EX :

o L’échantillonnage : nous mettons 1ml de lait dans 9ml d’eau distillée

stérile.

o les dilutions Trouvés sont :

10-1, 10-2, 10-3, 10-5, 10-6

TD 5 :
Les rappels et les réponses des questions sont sur le cour.

EX1 :

Schéma pour les dilutions :

1ml 0 , 1ml 0,1ml 0,1ml 1ml

9ml 9ml 9.9ml 9.9ml 9.9ml 9ml

10-1 10-2 10-4 10-6 10-7

EX 2 :

Les dilutions sont : 10-4, 10-6, 10-8, 10-10

Nombre de micro-organismes par millilitre : 17 x 107 UFC/ml .

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TD 6 :
EX1 :

1/ Les dilutions sont :

A : 10-2,

B : 10-4,

C : 10-5,

D : 10-6

2/ Le nombre de micro-organismes par millilitre est :

N = 1,1 x 106 UFC/ml.

EX 2 :

Le nombre de micro-organismes trouvé :

N flore indologène = 15x 106 UFC/ml.

N flore putride = 21 X 105 UFC/ml.

TD 7 :
Les exposés par les étudiants pour les thèmes suivants:
o La Sédimentation
o La dyalise
o Méthode de filtration
o Méthodes chromatographiques
o Méthodes éléctrophorétiques.

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