N° d’ordre UNIVERSITÉ CADI AYYAD N° d’ordre :

FACULTÉ DES SCIENCES

SEMLALIA - MARRAKECH

****************************
Errassifi Farid

THÈSE
présentée à la Faculté pour obtenir le grade de :

Docteur
UFR : Physico-Chimie des Matériaux
Mécanismes d’adsorption du risédronate par des phosphates de calcium biologiques :

Spécialité : Physico-Chimie des Matériaux

tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

MECANISMES D’ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR

DES PHOSPHATES DE CALCIUM BIOLOGIQUES :
Applications aux biomatériaux

APPLICATIONS AUX BIOMATERIAUX

Par

Farid ERRASSIFI
(DESA : Physico-Chimie des Matériaux)

Soutenue le 30 Avril 2011 devant la commission d’examen :

Président :
C. Rey PES Institut National Polytechnique, ENSIACET, Toulouse
Examinateurs :
E. Zahidi PES Université Chouaib Doukkali, FS, El Jadida
M. Lakraimi PES Université Cadi Ayyad, ENS, Marrakech
A. Baçaoui PES Université Cadi Ayyad, FSS, Marrakech
S. Sarda MC Université Paul Sabatier, IUT, Toulouse
A. Legrouri PES Université Al Akhawayn, FSI, Ifrane
A. BarrougCADI PES
UNIVERSITE Université Cadi Ayyad, FSS, Marrakech
AYYAD N° d'ordre:
2011/C

Invité : S. Zayane PhD Chirurgien Orthopédiste et Traumatologue, Marrakech

 UNIVERSITE CADI AYYAD N° d’ordre
FACULTE DES SCIENCES
SEMLALIA – MARRAKECH

****************************

THÈSE
Présentée à la Faculté pour obtenir le grade de:
Docteur

UFR: Physico-Chimie des Matériaux

Spécialité: Physico-Chimie des Matériaux
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

MECANISMES D’ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR

DES PHOSPHATES DE CALCIUM BIOLOGIQUES :
APPLICATIONS AUX BIOMATERIAUX

Par:
Farid ERRASSIFI
(DESA : Physico-Chimie des Matériaux)

Soutenue le 30 Avril 2011 devant la commission d’examen :

Président :
C. Rey PES Institut National Polytechnique, ENSIACET, Toulouse
Examinateurs :
E. Zahidi PES Université Chouaib Doukkali, FS, El Jadida
M. Lakraimi PES Université Cadi Ayyad, ENS, Marrakech
A. Baçaoui PES Université Cadi Ayyad, FSS, Marrakech
S. Sarda MC Université Paul Sabatier, IUT, Toulouse
A. Legrouri PES Université Al Akhawayn, FSI, Ifrane
A. Barroug PES Université Cadi Ayyad, FSS, Marrakech
Invité : S. Zayane PhD Chirurgien Orthopédiste et Traumatologue, Marrakech
 Vous pouvez tout faire, penser ou croire,
posséder toute la science du monde, si vous
n'aimez pas, vous n'êtes rien
Marcelle Sauvageot (1900-1934)
Laissez-Moi
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

A la mémoire de ma mère
A ma Chère aimée
A mon père
A mes frères Ahmed, Omayma & Nizare
A tous mes amis
 Remerciements

Les études rapportées dans ce mémoire ont été réalisées en co-direction entre le
Laboratoire de Physico-Chimie des Matériaux et Environnement de la Faculté des
Sciences Semlalia de Marrakech et l’équipe de Phosphates, Pharmacotechnie et
Biomatéraiux de l’Institut National Polytechnique de Toulouse. Ce travail a bénéficié
du support financier alloué à l’action intégérée du ministère de l’éducation nationale
(AI Volubilis MA/05/122).

Je suis profondément reconnaissant à Monsieur le Professeur A. Barroug de m’avoir

encadré tout au long de ces années et m’avoir fait bénéficier de ses précieuses idées et
connaissances scientifiques. Ses conseils avisés m’ont permis une réflexion lors de la
rédaction de ce mémoire. Nos longues discussions animées et fructueuses ont
conduit à l’aboutissement de ce travail. Je lui exprime ma plus grande gratitude pour
la confiance et l’attention exprimées à mon égard.
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Il m’est aussi agréable d’exprimer ma gratitude à Monsieur le Professeur A. Legrouri,

doyen de la Faculté des Sciences et d’Ingénierie d’Al Akhawayn, qui a coencadré ce
travail malgré ses nombreuses occupations. Qu’il trouve ici l’expression de mes
sincères remerciements pour les précieux conseils et encouragements tout au long de
ce travail.

Que Monsieur C. Rey, Professeur à l’Institut National Polytechnique de Toulouse,

trouve ici l’expression de ma profonde et sincère gratitude pour m’avoir accueilli au
sein de son équipe, pour l’intérêt constant qu’il a manifesté pour mes recherches et
les conseils éclairés qu’il m’a prodigué pour le développement de ce travail. Merci
pour votre sens de la pédagogie, votre sens de l’humanité et des valeurs. Vous
m’avez fait un grand honneur en acceptant de présider le jury de cette thèse.

La grande rigueur, la disponibilité et patience ainsi que les qualités humaines dont a
fait preuve le Dr S. Sarda, Maître de Conférences de l’Université Paul Sabatier de
Toulouse, m’ont permis d’atteindre un niveau d’exigence remarquable qui me met
grandement en valeur. Je tiens à l’assurer de mon entière reconnaissance et du réel
plaisir éprouvé au cours de mon séjour scientifique.

Un grand hommage à Monsieur A. Lebugle, Directeur de recherche au C.N.R.S, qui

n’a cessé de me prodiguer conseils et attention, clairvoyantes critiques, et rigoureux
jugements, toujours accompagnés d’une grande gentillesse dans la progression de ce
travail. Qu’il trouve ici l’expression de ma profonde reconnaissance.

J’exprime mes vifs remerciements à Messieurs les Professeurs E. Zahidi, M. Lakraimi

et A. Baçaoui pour l’honneur qu’ils m’ont fait en acceptant d’être les rapporteurs de
ce travail ainsi que pour l’intérêt et les critiques à l’égard du contenu de ce manuscrit.
 Qu’il me soit permis de témoigner de ma profonde gratitude à Monsieur Dr. S.
Zayane pour les moments de réflexion concernant l’intérêt médical de cette étude et
de me faire l’honneur de participer à ce jury.

Mes remerciements vont tout naturellement à Madame C. Combes, Maître de

Conférences et responsable de l’équipe de Phosphates, Pharmacotechnie et
Biomatéraiux à l’Institut National Polytechnique de Toulouse, pour son accueil, ses
encouragements et son aide précieuse sans jamais perdre le sourire.

Le savoir faire dans le domaine de la RMN du solide et l’expérience très large de

Monsieur H. Sfihi, Professeur agrégé de l’Université Paris 13, m’ont été d’une grande
utilité et d’une véritable contribution à ce travail. Je lui exprime ma respectueuse
gratitude.

Comme il ne m’est pas possible de citer toutes les personnes sans qui tout aurait été
nettement plus fade et que je souhaite éviter d’en oublier, je voudrais exprimer toute
mon amitié à :
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- tous les membres de l’équipe Phosphates, Pharmacotechnie et Biomatériaux

pour leur gentillesse, le partage des connaissances scientifiques, leur collaboration,
leur soutien, l’esprit d’équipe et la joie de vivre qu’ils font rayonner autour d’eux.
- tous mes collègues chercheurs du centre Jabir pour la sympathie qu’ils m’ont
témoignée tout au long de ces années passées à la FSSM.
- mes anges d’enfance et aux beaux moments vécus ensemble à Essaouira.

Sachez que votre amitié et votre solidarité m’ont permis d’éviter la noyade pour
arriver sur la rive d’en face, celle de la soutenance. Vous êtes ma grande famille, ma
richesse et ma source d’inspiration inépuisable.

Les meilleures choses ont une fin et à cet instant en ce qui concerne ce manuscrit
pour moi c’est fini. C’est donc avec une certaine émotion que je vous confie cet
épisode passionnant de ma vie résumé dans ces quelques pages en souhaitant par-
dessus tout qu’il vous soit utile.
Bonne lecture, Farid Errassifi.
-
 RESUME
Notre travail de thèse porte sur la réactivité de phosphates de calcium biomimétiques vis-à-vis d’un
agent thérapeutique de la famille des bisphosphonates : le risédronate. Ce médicament actuellement
commercialisé sous le nom de « Actonel », est préconisé pour le traitement de certaines affections du tissu
osseux telle que l'ostéoporose. Nous nous proposons dans cette contribution d’élucider les mécanismes
d'interaction se produisant à l'interface entre des matériaux apatitiques de choix et le risédronate; pour cela les
propriétés physico-chimiques des supports examinés ainsi que les caractéristiques de la solution d’incubation ont
été prises comme variables expérimentales.
L’étude d'adsorption nous a amené dans un premier temps à élaborer des phosphates de calcium
présentant différentes caractéristiques physico-chimiques. Pour cela nous avons fait varier les conditions de
synthèse (taux de saturation, température, durée de maturation, vitesse d’adition des réactifs…). Nous avons
ensuite préparé des sels de risédronate de calcium, et ce afin de spécifier la nature des interactions entre
molécules de risédronate et ions calcium en solution. Pour préciser les caractéristiques physicochimiques des
précipités (index de cristallinité, modifications structurales, altérations morphologiques…), nous avons fait
appel à diverses techniques physico-chimiques complémentaires (DRX, FTIR, Raman, RMN de l'état solide,
MEB, MET, ATD/ATG, BET, complexométrie et analyses chimiques).
Les solides précipités sont des apatites phosphocalciques qui présentent des compositions chimiques
variables (rapport atomique Ca/P de 1,33 à 1,65) ainsi que des propriétés structurales et microstructurales
différentes. Leur surface spécifique couvre la gamme de 49 à 201 m²/g. Les solides élaborés dans des conditions
physiologiques de pH et de température sont des apatites nanocristallines de basse cristallinité, analogues au
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minéral osseux; ils sont dotés à leur surface d'une couche hydratée riche en environnements non apatitiques. Ces
espèces labiles sont absentes pour l'hydroxyapatite bien cristallisée.
L'étude d’adsorption des molécules de risédronate dans tous les cas examinés montre que la fixation de
ces espèces par les supports apatitiques se fait selon une cinétique rapide, ce qui atteste de la grande réactivité de
ces matériaux vis-à-vis de leur environnement. L’allure des isothermes d’adsorption obtenues dans un domaine
de faibles concentrations sont de type Langmuir. La réactivité des solides examinés vis-à-vis des molécules
d’adsorbat a été discutée sur la base des caractéristiques physico-chimiques du système. Ainsi divers facteurs
sont à prendre en considération pour expliquer la différence de comportement de ces matériaux (composition
chimique du support et de la solution, état de surface et présence d'environnement labiles en particulier,
microstructure…).
L’analyse globale des résultats d’adsorption issus des effets de la composition de la solution sur la
fixation des molécules de risédronate et de l’adsorption sur les proportions des ions en solution met en évidence
une corrélation entre les groupements phosphonate de la solution et les ions phosphate de la surface des supports.
Cette observation traduit l’existence d’un processus d’échange impliquant ces espèces à l’interface minéral-
milieu environnant. L’étude menée avec des apatites de basse cristallinité à différents stades de maturation
confirme l’implication de cette force motrice. Toutefois, l'évolution des proportions en ions calcium échangées
lors de l'adsorption laisse penser que d'autres phénomènes peuvent intervenir. Ainsi l’étude menée dans une
gamme de concentration élevée en adsorbat montre des isothermes à plateaux, traduisant l’existence de
processus complexes à la surface du solide. En outre, l'étude approfondie réalisée par spectroscopies Infrarouge
et Raman et par RMN, sur des supports après contact avec les molécules d’adsorbat, atteste de la présence de
fortes interactions impliquant les groupements fonctionnels de l'adsorbat et les sites calcium de la surface des
apatites. L'étude comparée avec les sels de risédronate de calcium précipités confirme la formation de phase
amorphe typique du composé Ca2BP.
L'évolution des nanocristaux apatitiques en présence des molécules de risédronate affecte très peu la
composition de la couche hydratée à leur surface et inhibe, par conséquent leur processus de maturation. Sur le
plan biologique, la localisation de ces principes actifs à la surface du minéral osseux pourrait être bénéfique dans
la mesure où ces espèces peuvent bloquer le processus de vieillissement du tissu osseux et préserver sa réactivité.
Afin de limiter les effets secondaires des molécules de bisphosphonates, d’une part, et d’améliorer leur
biodisponibilité locale en vue d’élargir leur champ d’application thérapeutique, d’autre part, une approche par
diffusion locale semble une voie intéressante. L’ensemble des résultats issus de ce travail constitue une plate
forme pour la mise au point d'un dispositif de vectorisation locale du risédronate par des substituts osseux
phosphocalciques.
- Mots clés : Adsorption, Apatite, Bisphosphonate, Désorption, Echange ionique, Maturation,
Phosphates de calcium, Risédronate.
 ABSTRACT
Our work is focused on the reactivity of biomimetic calcium phosphate towards a therapeutic agent
from Bisphosphonates family: risedronate. This drug is currently marketed under the name of “Actonel” and
used in the treatment of several diseases related to bone tissue such as osteoporosis. We purpose in this paper to
elucidate the mechanisms of interaction occurring at the interface between apatite and risedronate. In order to do
that, the physico-chemical properties of materials examined and the characteristics of the solution were taken as
experimental variables.

The study of adsorption led us initially to develop calcium phosphates with different physico-chemical
characteristics. For this the experimental synthesis conditions are varied (degree of saturation, temperature,
maturation time, pH…). In order to specify the nature of the interactions between risedronate molecules and
calcium ions in solution, a calcium risedronate salt are prepared. To clarify the physico-chemical characteristics
of the precipitates (cristallinity index, structural and morphological changes, formation of insoluble salts) several
complementary physico-chemical techniques are used ( XRD, FTIR, Raman, solide state NMR, SEM, TEM,
DTA/TGA, BET, chemical analysis and complexometric study).

The precipitated solids are calcium phosphate apatites wich have variable chemical compositions
(atomic ration Ca/P from 1,33 to 1,65) as well as different structural and microstructural properties. Their
specific surface area covers the range from 49 to 201 m²/g. The solids synthesized under physiological
conditions of pH and temperature are nanocrystalline apatites of low crystallinity, similar to bone mineral. One
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of the most interesting characteristics of these biomimetic apatite nanocrystals is the existence of a surface
hydrated layer essentially formed of non-apatitic environments of phosphate and carbonate ions. These labile
species are not observed on well crystallized hydroxyapatite.
In all cases, the adsorption data were well described by a Langmuir adsorption isotherm. The rate of
risedronate adsorption is extremely rapid, witch attests to the high interaction between calcium phosphate surface
and bisphosphonate species. The reactivity of solids examined versus the adsorbate molecules was discussed on
the basis of the physico-chemical system characteristics. Then, various factors are taken into consideration to
explain the difference in behaviour of these materials (chemical composition of both adsorbents and solution,
surface reactivity and existence of non-apatitic environments, microstructure,…).
The overall analysis of results from the solution composition influence on the risedronate binding and
adsorption effect on the apatite dissolution shows a correlation between the phosphonate groups of the solution
and phosphate ions from the surface of the supports. This observation reflects the existence of an exchange
process involving these species in mineral-interface environment. The study of poorly crystalline at different
stages of maturation confirms the involvement of this surface substitution reaction. However, the evolution of
calcium content during the adsorption suggests that other phenomena may intervene. Thus at higher
concentrations of adsorbate the uptake curve increase steeply, indicating the existence of complex processes at
the mineral surface. In addition, a study conducted by Raman and Infrared spectroscopy and NMR, on supports
after contact with the adsorbate molecules, attests to the presence of strong interactions involving the functional
groups of the adsorbate and calcium sites on apatite surface. The study compared with risedronate salts of
calcium precipitates confirmed the formation of amorphous phase typical of Ca2BP compound.
The evolution of apatite nanocrystals in the presence of risedronate molecules affects very little the
composition of surface hydrated layer and inhibits therefore their maturation process. Biologically, the location
of these drugs on the surface of bone mineral may be beneficial to the extent that these species can block the
aging process of bone tissue and maintaining its reactivity.
To minimize the side effects of bisphosphonates molecules and improve their local bioavailability in
order to broaden their scope of treatment, a local diffusion approach seems an interesting way. All results from
this work are a platform for the development of biomaterials as a risedronate delivery system.
Keywords: Adsorption, Apatite, Bisphosphonate, Desorption, Ionic Exchange,
Maturation, Calcium Phosphate, Risedronate.
 ‫ملخص‬
‫تتركز األبحات التي أنجزت في إطار ھذا الع مل على دراسة تفاعلية فوسفاتات الكالسيوم بدواء ينت مي إلى فصيلة‬
‫البيسفوسفونات و يسمى بالغيزيدغونات )‪ . (Risédronate‬يجري تسويق ھذا الدواء تحت إسم " ‪ ." Actonel‬يستعمل ھذا‬
‫الدواء خاصة لعالج أمراض معينة تصيب النسيج العظ مي مثل ترقق العظام أو ھشاشتھا‪ .‬نقترح في ھذا الع مل إلقاء الضوء‬
‫على آليات و ميكانيزمات التفاعل بين مواد معدنية اسطناعية بديلة للنسيج العظ مي و الم كون األساسي لدواء الغيزيدرونات‪.‬‬
‫لھذا الغرض فالخصائص الكيميائية و الفيزيائية لل مواد المعدنية و محاليل التفاعل أخدت كمت غيرات تجريبية‪ .‬المعارف‬
‫المكتسبة من ھذا العمل يمكن تسخيرھا في تطوير مواد مركبة لسد الخصاص العظ مي و عالجه‪.‬‬
‫من أجل دراسة خصائص التصاق جزيئات ھذا الدواء و تفاعليته قمنا بتصنيع فوسفاتات الكالسيوم ذات خصائص فيزيائية و‬
‫كيميائية مختلفة‪ .‬لھذا الغرض قمنا بتغيير ظروف ترسيب ھذه ال مواد )درجة اإلشباع‪ ,‬درجة ال حرارة‪ ,‬مدة النضج‪ .(...‬قمنا‬
‫كذلك بترسيب أمالح من الكالسيوم و الغيزيدرونات لكي نلم بطبي عة التفاعلية بينھ ما‪ .‬لتوضيح و معرفة الخصائص الفيزيائية‬
‫و الكيميائية لل مواد المح ضرة )درجة الب لورة‪ ,‬الت غيرات الھيكلية و ال م ورفولوج ية‪ (....‬استخدمنا عدة تقنيات متكاملة في ما‬
‫بينھا )حيود األشعة ال سينية‪ , DRX‬رامان ‪ ,Raman‬التحليل الطيفي باألشعة ما تحت الح مراء ‪ ,FTIR‬الرنين المغناطيسي‬
‫النوو يي ‪ ,RMN‬المج ھر اإلل كتروني للمسح و لإلنتقال ‪ ,MEB/MET‬التحليل ال حراري ‪ , ATD/ATG‬طريقة ‪ BET‬و‬
‫معايرة العناصر الكيميائية(‪.‬‬
‫الرواسب المحضرة ھي فو سفا ت‬
‫ات الكالسيوم ذات تراكيب كيميائية مختلفة )نسبة الكالسيوم‪/‬نسبة الفوسفات تتراوح ما بين‬
‫‪ 1,33‬و‪ ( 1,65‬و خصائص ھيكلية و مجھريه مختلفة‪ .‬مساحة السطح المحددة بطريقة ‪ BET‬تغطي نطاق ‪ 49‬حتى ‪201‬‬
‫‪ . m²/g‬المواد الصلبة التي أنتجت في ظروف فيزيولوجية ھي فوسفاتات الكالسيوم ذات درجة بلورة منخفضة و تشبه‬
‫المعادن التي تشكل النسيج العظمي و يتشكل سطحھا من طبقة غنية بأيونات الفوسفات و الكربونات ال غير األباتيتيكية‪ .‬ھذه‬
‫‪tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012‬‬

‫الخصائص ال نلحظھا في الم عادن دات درجة بلورة عالية كالھيدروكسيأباتيت‪.‬‬

‫دراسة التصاق جزيئات الغيزيدغونات في جميع الحاالت تبين أن الربط يتم بحركية سريعة م ما يدل على تفاعلية عالية‬
‫لسطح ھذه ال مواد مع جزيئات الغيزيدغونات‪ .‬شكل منحنيات اإللتصاق بالنسبة لتركيزات منخفضة من جزيئات‬
‫الغيزيدغونات تنتمي إلى نوع النج مير)‪ .(Langmuir‬أخدت في عين اإلعتبار عوا مل مختلفة لشرح الفرق في سلوك ھذه‬
‫ال مواد )التركيبة الكيميائية للم عادن و للمحاليل‪ ,‬طبي عة السطح و اح توا ئه على طبقة غنية بأيونات الفو سفات و الكاربونات‬
‫ذات الحركية العال ية(‪.‬‬
‫التحليل الشامل للنتائج التي عترنا علي ھا من خالل دراسة مف عول تركيبة المحاليل على التصاق الغيزيدغونات و كذلك‬
‫مفعول االلتصاق على تر كيزات أيونات الفوسفات و الكالسيوم يبين على وجود عالقة بين أيونات الفوسفاط في المحلول و‬
‫تلك التي تتواجد على سطح الم عادن‪ .‬ھذه المالحظة تعكس وجود عملية تبادل أيوني بين فوسفونات جزيئات الغيزيدغونات‬
‫و الفوسفات المتواجد على سطح الم عادن المدرو سة‪ .‬دراسة المعادن ذات درجة بلورة ضعيفة و في مراحل مختلفة من‬
‫النضج تؤكد على تواجد مي كانيزم التبادل األيوني‪ .‬و مع ذلك‪ ,‬فإن التغيرات الملحوظة في نسب أيونات الكالسيوم خالل‬
‫عملية االلتصاق يدل على تواجد ظواھر أخرى يجب أخدھا بعين االعتبار‪ .‬و بالتالي فإن الدرا سة التى أنجزت بتراكيز عالية‬
‫من جزيئات الغيزيدغونات تشير إلى وجود ميكانيزمات معقدة على سطح الم عادن المدروسة‪ .‬باإلظافة إلى ذلك فإن الدرا سة‬
‫الشاملة التي أجريناھا بتقنيات را مان و التحليل الطيفي باألشعة ماتحت الح مراء والرنين المغناطيسي النوويي تبين على‬
‫وجود تفاعالت قوية بين جزيئات الغيزيدغونات ومواقع الكالسيوم على سطح الم عادن‪ .‬من جھة أخرى أكدت المقارنة مع‬
‫أمالح الكالسيوم و الغيزيدغونات على احتمال ترسب مواد غير متبلورة تشبه الملح المترسب ‪. Ca2BP‬‬

‫تطور البلورات النانونية لآل باتيت في محاليل الغيزيدرونات يعرقل عملية بلورتھا و يعيق تطور تركيبة سطحھا‪ .‬بيولوجيا‬
‫تموقع جزيئات ھذا الدواء على سطح النسيج العظ مي قد ي كون مفيدا إلى حد أن ھذه الجزيئات يم كن أن تعرقل عملية‬
‫شيخوخة العظام و الحفاظ على تفاعليت ھا‪.‬‬
‫لتقليل اآلثار الجانبية لجزيئات البيسفوسفونات من ج ھة و تحسين التوافر البيولوجي المحلي ل ھذا الدواء من ج ھة أخرى ‪ ,‬فإن‬
‫توفيره في األجزاء المريضة من النسيج العظ مي بطريقة مباشرة قد يبدو حال مثيرا لالھت مام‪ .‬جميع نتائج ھذا العمل قد تشكل‬
‫قاعدة بيانات مختبرية مھمة لتطوير مواد مكونة من فوسفاتات الكالسيوم و البيسفوسفونات إلطالقه بطريقة مباشرة ومنظ مة‬
‫في النسيج العظ مي‪.‬‬

‫كلمات مفتاح‪ :‬التصاق‪ ,‬آباتيت‪ ,‬بيسفوسفونات‪ ,‬تبادل أيوني‪ ,‬نضج‪ ,‬فوسفاتات الكالسيوم‪,‬غيزيدغرونات‪.‬‬
 AVANT PROPOS
Nom et prénom de l’auteur : ERRASSIFI Farid
Intitulé du travail :

Mécanismes d'adsorption du risédronate par des phosphates de calcium

biologiques : Applications aux biomatériaux
Encadrant:
• Nom et prénom : Barroug Allal
• Grade : PES
• Laboratoire et Institution : Laboratoire de Physico-Chimie des Matériaux et
Environnment
Co-encadrant :
• Nom et prénom : Legrouri Ahmed
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

• Grade : PES
• Laboratoire et Institution: Faculté des Sciences et d’Ingénierie,
Université Al Akhawayn, Ifrane
Laboratoires ou les travaux ont été réalisés:
• Laboratoire de Physico-Chimie des Matériaux et Environement, Faculté
des Sciences Semlalia, Université Cadi Ayyad
• Laboratoire de Phosphates, Pharmacotechnie et Biomatériaux, Ecole
Nationale Supérieure des Ingénieurs en Arts Chimiques et
Technologiques, Institut Nationale Polytechnique, Toulouse, France.
• -Laboratoire de Transfert de Technologie, Institut Universitaire de
Technologie, Castres, France.
Date de commencement du travail : Septembre 2005
Rapporteurs :
• Zahidi El Mamoune : PES, Faculté des Sciences, Université Chouaib
Doukkali, El Jadida
• Baçaoui Abdelaziz : PES, Faculté des Sciences Semlalia, Université Cadi
Ayyad, Marrakech
• Lakraimi Mohammed : PES, Ecole Normale Supérieure, Université Cadi
Ayyad, Marrkech
Cadre de coopération: Action intégrée Franco-Marocaine (AI Volubilis MA/05/122).
 Principales publications et communications
auxquelles ce travail a donné lieu

Publications
1. Errassifi F., Menbaoui A., Autefage H., Benaziz L., Ouizat S., Santran V., Sarda
S., Lebugle A., Combes C., Barroug A., Sfihi H., Rey C. Adsorption on Apatitic
Calcium Phosphates. Applications to Drug Delivery. Advances in Bioceramics and
Biotechnologies, Ceramic transactions, Volume 218, pp 159-174, August 2010.
2. Al-Kattan A., Errassifi F., Sautereau A.M., Sarda S., Dufour P., Barroug A., Dos
Santos I., Combes C., Grossin D., Rey C., and Drouet C. Medical Potentialities of
Biomimetic Apatites through Adsorption, Ionic Substitution and Mineral/Organic
Associations: Three Illustrative Examples. Advanced Engineering Materials,
Volume 12, issue 7, pp B224-B233, Juin 2010.
3. Errassifi F., Sarda S., Barroug A., Lebugle A., Legrouri A., Sfihi H A., Rey C.
Adsorption of a bisphosphonate onto apatitic calcium phosphates: Role of surface
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

characteristics. Proceeding of the third Conference on the Valorization of

Phosphates and Phosphorous compounds (COVAPHOS III), Volume 6, pp 153-
159, Marrakech 2009.
4. Errassifi F., Barroug A., Sarda S., Rey C., Lebugle A., Legrouri A. Etude de
l’interaction entre le risédronate de sodium avec des phosphates de calcium
analogues au minéral osseux. Proceeding of the second Conference on the
Valorization of Phosphates and Phosphorous compounds (COVAPHOS II), Volume
4, pp 239-300, Marrakech 2006.
Communications orales
1. Barroug A., Errassifi F., Menabaoui A., Benaziz L., Legrouri A., Sarda S., Combes
C., Rey C., Glimcher J. Adsorption behaviours onto calcium phosphate and
consequences for biomaterials The third Conference on the Valorization of
Phosphates and Phosphorous compounds (COVAPHOS III), 18-20 Mars 2009,
Marrakech-Maroc.
2. Sarda S., Errassifi F., Autefage H., Benaziz L., Ouizat S., Santran V., Lebugle A.,
Combes C., Barroug A., Sfihi H., Rey C. Adsorption on apatite nanocrystals:
Consequences on bone function and applications in biomimetic biomaterials.
South-West European Conference on Nanoscience and Nanotechnology
(NanoSWEC), 2-4 November 2009, Bordeaux-France.
3. Rey C., Errassifi F., Menbaoui A., Autefage H., Santran V., Sarda S., Lebugle A.,
Barroug A., Sfihi H. Adsorption onto nanocrystalline apatitic calcium phosphates.
Applications to growth factors and drugs delivery. 8th Pacific Rim conference on
ceramic and glass technology (PAC RIM8), 31May-05 juin 2009, Vancouver-
Canada.
4. Errassifi F., Sarda S., Lebugle A., Rey C., Barroug A., Legrouri A. Bisphosphonate
adsorption onto hydroxyapatite crystals as local released biomaterial. 3rd edition
 of the Iberian Biomaterials Congress (SIBB BioBCN), 17-19 September 2008,
Barcelona-Espagne.
5. Errassifi F., Sarda S., Barroug A., Lebugle A., Rey C., Legrouri A. Etude de
l’interaction entre bisphosphonates et phosphates de calcium apatitiques. Effets
physico-chimiques et conséquences sur le plan biologique. Journées Jeunes
Chercheurs Sociétés Française de Chimie (SFC) -Midi Pyrénées, 10 Avril 2008,
Toulouse-France.
6. Barroug A., Errassifi F., Ouizat S., Benaziz L., Legrouri A., Sarda S., Lebugle A.,
Rey C. Interaction of biomolecules with calcium phosphates and implications in
biomaterials. 11ème Rencontre Marocaine sur la Chimie de l’Etat Solide
(REMCES 11), 16-18 Avril 2009, Kénitra-Maroc.

Communications par affiche

1. Pascaud P., Errassifi F., Sarda S., Barroug A., Legrouri A., Rey C.
Nanocrystalline apatite as model of bone mineral for drug delivery: Mechanism of
action of bisphosphonates. XXVèmes journées du Goupe Thématique de Recherche
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

sur la Vectorisation (GTRV), 6-8 Décembre 2010, Toulouse-France.

2. Errassifi F., Sarda S., Barroug A., Lebugle A., Legrouri A., Sfihi H., Rey.
Adsorption of bisphosphonate onto apatitic calcium phosphates: Role of surface
characteristics. The third Conference on the Valorization of Phosphates and
Phosphorous compounds (COVAPHOS III), 18-20 Mars 2009, Marrakech-Maroc.
3. Errassifi F., Sarda S., Barroug A., Lebugle A., Legrouri A., Sfihi H., Rey.
Nanocrystalline apatite as model of bone mineral. Interaction with
bisphosphonates: Risedronate. South-West European Conference on Nanoscience
and Nanotechnology (NanoSWEC), 3-5 November 2008, Bordeaux-France.
4. Errassifi F., Barroug A., Sarda S., Rey C., Lebugle A., Legrouri A. Etude de
l’interaction entre le risédronate de sodium avec des phosphates de calcium
analogues au minéral osseux. The second Conference on the Valorization of
Phosphates and Phosphorous compounds (COVAPHOS II), 9-11 Novembre 2006,
Marrakech-Maroc.
 ABREVIATIONS

Matériaux

ANC: Apatite Nanocristalline Carbonatée

OCPa: Phosphate Octocalcique Apatitique
OCPa-c: Phosphate Octocalcique Apatitique carbonaté
HA: Hydroxyapatite
BPs: Bisphosphonates
BP: Risédronate monosodique
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Techniques utilisées
DRX: Diffraction des rayons X
FTIR: Spectroscopie Infrarouge à transformée de fourrier.
Micro Raman: Spectroscopie par diffusion Raman
RMN-MAS: Résonance magnétique nucléaire en phase solide couplée à la rotation à
l'angle magique
RMN 31P SPE-MAS: impulsion unique du phosphore
RMN 1H SPE-MAS: impulsion unique du proton
RMN 1H- 31P CP-MAS: Polarisation croisée du proton vers le phosphore
MEB: Microscopie électronique à balayage
MET: Microscopie électronique de transmission
ATG: Analyse thermique gravimétrique
ATD: Analyse thermique différentielle
ICP/OES: Spectrométrie d'émission optique par plasma à couplage inductif
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SOMMAIRE
 INTRODUCTION GENERALE 1

Chapitre I
MISE AU POINT BIBLIOGRAPHIQUE
I- APATITES PHOSPHOCALCIQUES BIOLOGIQUES ET SYNTHETIQUES 5
I-1- Tissu osseux 5
I-1-1- Généralités 5
I-1-1-1- Os naturel 5
I-1-1-2- Dent 6
I-1-2- Composition chimique et structure 6
I-1-2-1- Phase minérale 6
I-1-2-2- Phase organique 9
I-1-3- Remodelage osseux 9
I-1-3-1- Cellules osseuses 9
I-1-3-2- Cycle du remodelage osseux 10
I-1-4- Biominéralisation 13
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I-1-4-1- Mécanismes 14
I-1-4-2- Rôle du collagène et protéines non-collagéniques dans le processus de
biominéralisation 15
I-1-4-3- Précurseur de la biominéralisation 17
I-2- Phosphates de calcium synthétiques 18
I-2-1- Généralités 18
I-2-2- Hydroxyapatite (HA) 21
I-2-3- Apatites non stoechiométriques 22
I-2-3-1- Apatites Nanocristallines Carbonatées (ANC) 23
I-2-3-2- Phosphate Octocalcique Apatitique (OCPa) 24
I-2-3-3- Phosphate Octocalcique Apatitique Carbonaté (OCPa-c) 25
II- OSTEOPOROSE ET BISPHOSPHONATES 26
II-1- Ostéoporose 26
II-1-1- Définition 26
II-1-2- Traitements médicamenteux 27
II-2- Bisphosphonates 27
II-2-1- Historique 27
II-2-2- Propriétés structurales 28
II-2-3- Mécanismes d'action 30
II-2-3-1- Inhibition de minéralisation (Calcification) 30
II-2-3-2- Résorption osseuse 30
III- ADSORPTION AUX INTERFACES :CAS DU SOLIDE-LIQUIDE 32
III-1- Enjeu de l'étude des processus d'adsorption 32
III-2- Adsorption 32
III-2-1- Lois d'adsorption 33
III-2-1-1- Isotherme de Gibbs 33
III-2-1-2- Isotherme de Langmuir 34
 III-2-1-3- Isotherme de Freundlich 34
III-2-1-4- Isothermes de Langmuir-Freundlich et Tòth 35
III-2-1-5- Isotherme BET 35
III-3- Eude expérimentale d'adsorption 36
III-3-1- Cinétique d'adsorption 36
III-3-2- Isothermes d'adsorption 37
III-3-3- Réversibilité du processus 37
III-3-4- Paramètres impliqués dans le processus d'adsorption 39
III-3-4-1- Influence du pH 39
III-3-4-2- Influence de la force ionique 39
III-3-4-3- Influence de la teneur en ions minéraux 40
III-3-4-4- Influence de la température 41
III-3-4-5- Influence des propriétés physico-chimiques du support 42
III-3-5- Mécanismes d'adsorption 43

Chapitre II
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SYNTHESE ET CARACTERISATION DE PHOSPHATES DE

CALCIUM & DE SELS DE RISEDRONATE DE CALCIUM

Partie A
SYNTHESE ET CARACTERISATION DE PHOSPHATES DE CALCIUM
I- INTRODUCTION 45
II- HYDROXYAPATITE STOECHIOMETRIQUE 47
II-1- Synthèse 47
II-2- Caractérisation 47
II-2-1- Diffraction des rayons X 47
II-2-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier (IRTF) 48
II-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman 51
II-2-4- Spectroscopie RMN de l'état solide 51
II-2-5- Analyse chimique et surface spécifique 51
III- APATITES NANOCRISTALLINES CARBONATEES (ANC) 53
III-1- Synthèse 53
III-2- Caractérisation 53
III-2-1- Diffraction des rayons X 53
III-2-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier 55
III-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman 61
III-2-4- Spectroscopie RMN de l'état solide 62
III-2-5- Analyse chimique et surface spécifique 67
 IV- PHOSPHATES OCTOCALCIQUES 69
IV-1- Synthèse 69
IV-1-1- Phosphate Octocalcique Apatitique (OCPa) 69
IV-1-2- Phosphate Octocalcique Apatitique Carbonaté (OCPa-c) 69
IV-2- Caractérisation 70
IV-2-1- Diffraction des rayons X 70
IV-2-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier 71
IV-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman 71
IV-2-4- Analyse chimique et surface spécifique 71
V- CONCLUSION 71

Partie B
ELABORATION ET CARACTERISATION DE SELS
DE RISEDRONATE DE CALCIUM
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I- INTRODUCTION 77
II- PREPARATION DES SELS DE RISEDRONATE DE CALCIUM 79
II-1- Généralités sur le risédronate monosodique 79
II-1-1- Présentation 79
II-1-2- Analyses thermo-gravimétriques (ATD/ATG) 79
II-1-3- Diagramme de spéciation 80
II-1-4- Spectroscopie UV-Visible 82
II-2- Synthèse et caractérisation de sels de risédronate de calcium 83
II-2-1- Synthèse 83
II-2-2- Caractérisation 84
II-2-2-1- Diffraction des rayons X 84
II-2-2-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier 86
II-2-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman 88
II-2-2-4- Spectroscopie RMN de l'état solide 91
II-2-2-5- Microscopie électronique à balayage (MEB) 92
II-2-2-6- Analyses chimiques 94
II-3- Etude complexométrique 95
II-3-1- Etude par conductimétrie 95
II-3-2- Caractérisations du précipité obtenu 96
III- DISCUSSION 100
IV- CONCLUSION 102
 Chapitre III

ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR L'HYDROXYAPATITE

I- INTRODUCTION 103
II- ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR L'HYDROXYAPATITE 104
II-1- Matériaux et méthodes 104
II-1-1- Protocole expérimental 104
II-1-2- Adsorbant et adsorbat 104
II-1-3- Adsorption 104
II-1-4- Réversibilité 105
II-1-5- Etude de libération 105
II-1-6- Analyse chimique 106
II-2- Résultats 106
II-2-1- Cinétique d’adsorption 106
II-2-2- Isotherme d’adsorption 107
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II-2-3- Réversibilité du processus 111

II-2-4- Libération du risédronate 113
II-2-5- Influence de la composition chimique du milieu sur l’adsorption 116
II-2-5-1- Influence du pH 116
II-2-5-2- Influence des ions phosphate 116
II-2-5-3- Influence des ions calcium 121
II-2-6- Influence de l'adsorption sur la composition du milieu 123
II-2-7- Adsorption du risédronate à partir de solutions concentrées 126
II-2-7-1- Isotherme d’adsorption 126
II-2-7-2- Influence de l'adsorption sur la composition du milieu. 129
II-3- Caractérisation du support après adsorption 131
II-3-1- Conditions expérimentales 131
II-3-2- Résultats 131
II-3-2-1- Diffraction des rayons X 131
II-3-2-2- Spectrométrie infrarouge par transformée de Fourier 133
II-3-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman 133
II-3-2-4- Spectroscopie RMN de l'état solide 134
II-3-2-5- Analyse chimique 135
III- DISCUSSION 140
IV- CONCLUSION 149
 Chapitre IV

ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR LES APATITES DE BASSE

CRISTALLINITE

I- INTRODUCTION 150
II- ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR LES APATITES NANOCRISTALLINES
CARBONATEES 151
II-1- Matériaux et méthodes 151
II-1-1- Adsorption 151
II-1-2- Réversibilité 151
II-1-3- Analyses chimiques 151
II-1-4- Caractérisation du support après adsorption 152
II-1-5- Evolution des supports ANC en présence de risédronate 152
II-2- Résultats 152
II-2-1- Cinétique d’adsorption 152
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II-2-2- Isotherme d’adsorption 153

II-2-3- Réversibilité 153
II-2-4- Influence de l'adsorption sur la composition du milieu 157
II-3- Caractérisation du support après adsorption 160
II-3-1- Diffraction des rayons X 160
II-3-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier 160
II-3-4- Spectrométrie par diffusion Raman 163
II-3-5- Spectroscopie RMN de l'état solide 163
II-3-6- Analyses thermogravimétrique et différentielle 164
II-3-7- Microscopie électronique à transmission (MET) 170
II-4- Evolution des supports ANC en présence de risédronate 172
II-4-1- Résultats 172
II-4-1-1- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier 172
II-4-1-2- Spectrométrie par diffusion Raman 179
III- ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR LES APATITES OCTOCALCIQUES
182
III-1- Matériaux et méthodes 182
III-1-1- Adsorption 182
III-2- Résultats 182
III-2-1- Cinétique d’adsorption 182
III-2-2- Isotherme d’adsorption 184
III-2-3- Influence de l'adsorption sur la composition du milieu 184
III-3- Caractérisation du support après adsorption 189
III-3-1- Conditions expérimentales 189
III-3-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier 189
III-3-3- Spectrométrie par diffusion Raman 189
 IV- DISCUSSION 192
V- INTERACTION PHOSPHATES DE CALCIUM-BISPHOSPHONATES &
CONSEQUENCES BIOLOGIQUES 204
VI- CONCLUSION 208
CONCLUSION GENERALE 209
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 212
ANNEXES 232
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tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

INTRODUCTION GENERALE
 Les processus d'adsorption qui interviennent aux interfaces entre phosphates de
calcium et molécules biologiques sont impliqués dans de nombreux domaines. En
biologie, ces processus semblent contrôler et réguler les phénomènes de
biominéralisation (Glimcher, 1989; Boskey, 1998). En médecine, les phénomènes de
surface des apatites phosphocalciques sont à la base de la conception des substituts
osseux et des biomatériaux vecteurs de médicaments (Shinto et al., 1992; Aoki 1994;
Pham et al., 2002; Barroug et al., 2004; Billon-Chabaud et al., 2008; Zayane, 2010).
Les propriétés d'adsorption de ces matériaux sont également d'usage en chimie
analytique, notamment dans la séparation et la purification de molécules organiques
par chromatographie en phase liquide (Gorbunoff, 1984; Kawazaki, 1991). Ces
phénomènes sont aussi observés dans la fabrication de produits pharmaceutiques, de
dentifrice, de fertilisants ou de détergents.
Dans les milieux vivants, les phosphates de calcium apatitiques jouent un rôle
crucial dans les processus biologiques. Ils constituent la phase minérale des tissus
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

calcifiés (os et dents) et contribuent par conséquent aux fonctions vitales de

l'organisme (LeGeros, 1991). Ainsi, ils assurent la rigidité du matériau permettant aux
tissus de jouer leurs fonctions de soutien et de protection et sont également impliqués
dans le processus de régulation de la teneur en ions minéraux des fluides biologiques
(Glimcher, 1992). Ils sont associés, en outre, à diverses macromolécules organiques
(collagène et protéines non-collagéniques) de manière à former un composite minéral-
organique résistant et autoréparable (Glimcher, 1984; LeGeros, 1991; Boskey, 1998).
Le minéral osseux est composé de fines plaquettes d’apatite de taille
nanométrique qui se déposent parallèlement aux fibres de collagène (Kuhn et al.
2008). Longtemps assimilé à une hydroxyapatite substituée, le minéral osseux
correspond en fait à une apatite carbonatée déficiente en ions calcium et hydroxyde. Sa
composition peut varier considérablement selon la nature du tissu, l'âge des individus
(Legros, 1984), le régime alimentaire (Grynpas et Rey, 1992) et les maladies (Harrison
et al., 1980; Pettifor et al., 1984).
Une caractéristique majeure des apatites biologiques est la présence
d'environnements ioniques qui n'existent pas dans les apatites bien cristallisées. Ces
environnements ont été attribués (Rey et al.,1989a; Eichert et al. 2002) à la présence
en surface des cristaux d’une couche hydratée bien organisée, mais labile, contenant
des ions minéraux (environnements des ions CO 32− , HPO 24− et PO 34− notamment). Cette
couche hydratée, qui évolue au cours du temps, serait responsable de la très grande
réactivité de surface des apatites biologiques. Ces apatites présentent de très fortes
capacités d’échanges ioniques et d’adsorption, ce qui leur permet d’interagir
facilement avec les fluides biologiques. Ces propriétés pourraient être liées à la

1
 présence de cette couche hydratée, qui contient des espèces ioniques relativement
mobiles et facilement échangeables (Ouizat et al., 1999; Cazalbou, 2000; Rey et al.,
2007b; Barroug et al., 2008;).
Par ailleurs, les dimensions nanométriques des cristaux (à l’exception toutefois
des cristaux de l’émail dentaire) ainsi que leur étroite association avec la matrice
organique, rendent l’étude directe sur ces composites difficile et ouvrent la voie à des
interprétations faiblement étayées. La plupart des progrès réalisés dans la connaissance
des minéralisations biologiques ont eu pour moteur l’étude de composés de synthèse
modèles. Ces composés se révèlent en outre nécessaires pour acquérir une meilleure
connaissance des mécanismes qui gouvernent les interactions impliquant le minéral
osseux et le milieu environnant.
Les apatites de synthèse se sont imposées depuis une vingtaine d’années dans
l'élaboration de biomatériaux (Heughebaert et al., 1988; LeGeros, 1991; Aoki, 1994;
Rey at al., 2007b), en raison de leurs propriétés particulières de bioactivité et
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d’ostéoconduction (aptitude de faciliter la repousse osseuse et l'intégration aux tissus

osseux). Ce type de réactivité implique la formation d'une couche de phosphate de
calcium analogue au minéral osseux à la surface du biomatériaux en contact des
fluides biologiques (Rey et al., 1995a). La grande réactivité de ces cristaux néoformés,
leur permet de fixer des protéines favorisant l'adhésion et l'expression des cellules
ostéoblastes, responsables de la construction osseuse. Cependant, cette néoformation
est défavorable dans les environnements atteints d'affections osseuses (ostéoporose,
tumeurs osseuses, ostéomyélite…) qui représentent la majorité des besoins réels de
recapitalisation osseuse.
En effet, ces situations pathologiques semblent affecter les performances de
l'implant phosphocalciques en termes de substitution et/ou processus de résorption
osseuse (Verron, et al., 2010). Aujourd'hui, diverses études ont été engagées dans le
développement de systèmes mixtes combinant substituts osseux et molécules
thérapeutiques (facteurs de croissance, antibiotiques, anticancéreux…). Cette nouvelle
génération de biomatériaux phosphocalciques vecteurs d'agents thérapeutiques vise,
d'une part, à améliorer le potentiel ostéogénique des substituts osseux dans les sites
sains de l'os (ossification, repousse osseuse) et, d'autre part, à traiter localement les
maladies osseuses (Itokazu et al., 1995; Pham et al., 2002; Krisanapiboon et al., 2006;
Vechasilp, 2007; Zayane,2010). Les systèmes de libération locale vont permettre en
outre une amélioration de la biodisponibilité d'agents thérapeutiques et diminuer leurs
effets indésirables induits par le traitement systémique.
Parmi les maladies osseuses qui ont suscité un grand intérêt des scientifiques
ces dernières années, l'ostéoporose est d'importance épidémiologique considérable,

2
 dont l'incidence augmente avec l'âge (Meunier et al., 1999). Cette maladie se
caractérise par une baisse de la masse osseuse et une dégradation de son architecture,
ce qui entraîne un risque important de fractures chez les patients atteints. Cette
pathologie est induite par un déséquilibre cellulaire dans le remodelage osseux dû à un
surcroît d'activité des ostéoclastes (cellules qui résorbent l'os) par rapport aux
ostéoblastes (cellules qui reconstruisent l'os). Actuellement, selon le groupe de
recherche et d’information sur l’ostéoporose, 4 millions de personnes souffrent de
cette maladie en France dont 70 % de femmes à 80 ans. Avec l’accroissement de
l’espérence de vie, l'ostéoporose est devenue un problème majeur de santé publique et
de nombreuses recherches ont été entreprises pour y remédier. La voie habituellement
utilisée pour ralentir la dégradation de la matière osseuse consiste donc à diminuer
l’activité des ostéoclastes. Divers principes actifs de la famille de bisphosphonates ont
montré un pouvoir inhibiteur de l'activité ostéoclastique (Fleisch, 1998; Russell et
Rogers, 1999; Fleisch, 2003).
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Les bisphosphonates utilisées à ce jour pour le traitement de lésions osseuses

sont utilisés par voie systémique et génèrent de ce fait quelques effets secondaires
indésirables. Ils peuvent provoquer des troubles rénaux lorsqu'ils sont administrés par
voie intraveineuse, et des troubles du système digestif (oesophagites, ulcères) lorsqu'ils
sont administrés par voie orale (Thiebaud et al., 1994; Lin, 1996). Une faible
biodisponibilité est également un autre inconvénient de l'administration par voie orale.
Dans ce cadre plusieurs recherches se sont concentrées sur la mise au point d'un
dispositif de libération locale de bisphosphonates par des biomatériaux
phosphocalciques (Seshima et al., 2006; Billon-Chabaud et al., 2008 et 2010; Jindong
et al., 2010).
Par ailleurs, les recherches concernant l’adsorption par les apatites de principes
actifs, et plus particulièrement les bisphosphonates, se sont considérablement
développées ces dernières années en raison, d'une part, de l'intérêt de ces phénomènes
dans le développement de nouvelles générations de biomatériaux vecteurs d'agents
thérapeutiques et, d'autre part, de leur utilisation en tant que marqueurs du squelette en
médecine nucléaire après association aux éléments radioactifs (scintigraphie gamma).
La plupart de ces études ont généralement porté sur des apatites bien cristallisées
(Claessens et Kolar, 1999; Grossmann et al., 2000; Josse et al., 2005; Nancollas et al.,
2006; Cukrowski et al., 2007; Vitha et al., 2008; Rill et al., 2009). Cependant, peu
d'études ont été consacrées aux apatites nanocristallines analogues au minéral osseux
(Palazzo et al., 2007). De plus, aucune étude systématique à notre connaissance n'a été
engagée sur l'interaction de molécules de bisphosphonates avec des apatites mal
cristallisées en milieu aqueux.

3
 Malgré les intenses investigations menées sur les propriétés de surface
d'apatites de synthèse, les phénomènes à l'interface entre minéral osseux et
bisphosphonates ainsi que leur mode d'action physico-chimique restent relativement
méconnus et toujours mal élucidés. Le présent travail a pour but d'examiner les
processus d'adsorption et de désorption du risédronate, un agent thérapeutique de la
famille des bisphosphonates, par des apatites phosphocalciques de synthèse
rencontrées dans les milieux biologiques. Ce médicament est actuellement
commercialisé sous le nom de « Actonel », et est préconisé pour le traitement de
certaines affections du tissu osseux telle l'ostéoporose. Les adsorbants examinés
présentent différentes caractéristiques physico-chimiques. Il s'agit (i) d'une
hydroxyapatite stoechiométrique considérée comme prototype minéral des os et des
dents et est utilisée dans l'élaboration de biomatériaux, (ii) d’apatites nanocristallines
carbonatées de structure et composition similaire au minéral osseux et (iii) de
phosphates octocalciques apatitiques.
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Le premier chapitre de ce mémoire traitera des généralités sur les phosphates de

calcium naturels et synthétiques, l'ostéoporose et les bisphosphonates. Nous avons
également présenté un aperçu sur le processus d'adsorption et les travaux réalisés sur la
réactivité de surface des apatites. Le deuxième chapitre fera l’objet de synthèse et
caractérisation des divers phosphates de calcium utilisés comme adsorbants et
également des sels de risédronate de calcium susceptibles de se former en solution lors
d’interaction de l’adsorbat en présence d’ions calcium. Le troisième chapitre portera
sur l’étude détaillée d’adsorption et de désorption du risédronate par l'hydroxyapatite.
Le quatrième chapitre présentera les résultats d'adsorption du bisphosphonate étudié
par les apatites nanocristallines carbonatées et les phosphates octocalciques
apatitiques.

4
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Chapitre I
MISE AU POINT BIBLIOGRAPHIQUE
 I- APATITES PHOSPHOCALCIQUES BIOLOGIQUES ET SYNTHETIQUES

I-1- Tissu osseux

I-1-1- Généralités
L’os est un tissu conjonctif qui constitue avec le cartilage, le squelette. Celui-ci,
assure deux grands rôles dans l’organisme. D’une part, il doit, pour assurer ses
fonctions mécaniques et protectrices, constituer une structure rigide et mobile sur
laquelle repose organes vitaux et autres tissus mous; d’autre part, il participe, en plus
de la formation des cellules sanguines, au maintien de l’équilibre phosphocalcique et
d’autres espèces qui entrent dans sa composition (Mg2+, Na+, CO 32− ). Ainsi, il a été
établi que les ions carbonate associés à l’os interviennent dans la régulation du pH des
liquides biologiques (Legros, 1984).
Le tissu osseux est assimilable à un matériau composite constitué
principalement de fibres organiques, le collagène, inscrites dans une matrice minérale
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(Glimcher, 1989; Einhorn, 1996). La répartition massique des deux phases dans le
tissu est variable suivant la partie du corps considérée. Ainsi, on peut distinguer deux
types de tissus osseux: l’os et la dent.
I-1-1-1- Os naturel
L’os est considéré comme une association fonctionnelle et biologique de
plusieurs tissus. Il est constitué d’une fraction organique (23 % de la masse sèche) et
d’une fraction minérale (65 % de la masse sèche) auxquelles s’ajoute la contribution
de l’eau (12 %) (LeGeros, 1981).
On distingue deux types d’os (Figure I-1):
- Os compact (os cortical ou Haversien): dur et dense, il constitue la coque
externe des os et comprend des ostéons. Ces derniers sont des canaux neurovasculaires
dont la paroi est formée de plusieurs couches concentriques de fibres de collagènes sur
lesquelles se développent les cristaux d’apatites. L’os cortical représente 80 % de la
masse osseuse chez l’adulte (surface d’échange de 3,5 m²), mais de part sa structure
dense et compacte, il n’intervient que très peu dans les échanges métaboliques.
- Os spongieux (os trabéculaire): résistant aux contraintes de flexion, de
traction, de compression et de cisaillement, il s’appuie sur l’os compact auquel il
transmet les forces. Il occupe la part la plus volumineuse du tissu mais ne représente
que 20% de sa masse, soit une surface d’échange métabolique de 7 m². A l’échelle
cellulaire, l’os trabéculaire renferme différents types de cellules responsables du
remodelage osseux: ostéoblastes, ostéclastes et ostéocytes.

5
 I-1-1-2- Dent
Les dents sont constituées essentiellement de deux tissus osseux distincts:
l’émail et la dentine (Figure I-2). Ces deux tissus entourent la pulpe dentaire qui est
logée dans la chambre pulpaire au niveau de la couronne et dans les canaux
radiculaires au niveau des racines.
L’émail dentaire recouvre la dentine au niveau de la couronne. C’est le tissu le
plus dur de l’organisme, et ne contient que 0,5 % en masse de phase organique et 2 %
d’eau. Il offre à la dent ses propriétés mécaniques (dureté) et augmente sa résistance à
l’abrasion et aux attaques acides. Contrairement à tous les autres tissus osseux, l’émail
ne contient pas de collagène et ne se régénère pas une fois endommagé.
La dentine (ou ivoire) est recouverte de la couronne (partie visible de la dent)
par l’émail, et au niveau des racines par le cément (tissus d’origine osseuse). Elle se
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

compose en masse de 75 % de phase minérale, de 20 % de phase organique et de 5 %

d’eau. C’est le deuxième tissu le plus dur de l’organisme.
I-1-2- Compositions chimiques et structure
I-1-2-1- Phase minérale
La fraction minérale des tissus calcifiés (os et dents) est essentiellement
constituée de phosphate et de calcium, associés à des groupements carbonates
(Tableau I-1); à ces constituants majeurs s’ajoutent d’autres éléments minéraux
importants mais en faible proportion (magnésium, sodium, potassium, chlore,
fluor,….) ou à l’état de trace (strontium, plomb, zinc,…) (LeGeros, 1991; Elliott,
1994). Cependant, comme le mettent en évidence les données présentées dans le
tableau I-1, chaque tissu possède sa propre composition chimique et celle ci peut
évoluer au sein d’un même tissu. Il a également été montré que les différentes teneurs
ioniques au sein des tissus osseux évoluent selon l’âge du sujet (Legros, 1984).
Le constituant minéral des tissus calcifiés est comparable à une apatite
phosphocalcique carbonatée plus au moins lacunaire et mal cristallisée, comparée à
l’hydroxyapatite (Legros et al., 1986); si l’on considère uniquement les éléments
majeurs, on établit une formule chimique décrivant l’os comme une apatite déficiente
de type AB.
Ca8,3 1,7(PO4)4,3(CO3)1(HPO4)0,7(OH,CO3)0,3 1,7

Avec l’âge, le rapport CO 32 − / HPO 24 − augmente sensiblement mais le minéral

reste très lacunaire.

6
 Lamelles

Ostéon
interstitielles
Os compact

Travées osseuses
(détail dans la figure a)

Canaux de
Havers
Périoste

Os spongieux
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Canal de
Volkman

Vaisseaux sanguins Canal de Havers

de périoste

Travées osseuses

Espace pour moelle

Ostéocyte
rouge

Lamelles interstitielles
Ostéoclaste
Lamelles
Interstitielles
Ostéoclaste

Ostéocyte

Ostéoblaste
Ostéoblastes
(a) : Agrandissement de travées (b) : Détails d’une coupe de
d’os spongieux travée osseuse

Figure I-1: Schéma de l’os cortical et spongieux

7
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Figure I-2: Coupe transversale schématique d’une dent

Tableau I-1: Composition chimique (% massique) de la phase minérale de

l’émail, de la dentine et de l’os (Elliot, 1994).

Elément Os Email Dentine

Ca 36,60 37,60 40,30
P 17,10 18,30 18,60
CO3 4,80 3,00 4,80
Na 1,00 0,70 0,10
K 0,07 0,05 0,07
Mg 0,60 0,20 1,10
Sr 0,05 0,03 0,04
Cl 0,10 0,40 0,27
F 0,10 0,01 0,07
Ca/P 1,65 1,59 1,67

8
 I-1-2-2- Phase organique
L’os contient différentes structures organiques intervenant dans son poids sec
déminéralisé. Le collagène de type I y prédomine très nettement, suivi d’une
proportion beaucoup plus faible de collagène de type V et de protéines non
collagéniques telles les protéoglycanes et les ostéocalcines (Glimcher, 1989; Boskey et
al., 1989a).
Le collagène de type I comporte deux chaînes α1 et une chaîne α2, de
compositions légèrement différentes en acides aminés, organisées en triple hélice. Ces
chaînes sont très riches en glycine (environ un tiers), de proline, d’hydroxyproline et
d’hydroxylysine (Legros, 1984). Ces acides aminés confèrent une orientation
particulière à la chaîne polypeptidique et lui assure sa rigidité.
La synthèse du collagène de type I constitue la première étape de la formation
du tissu supportant la minéralisation par étapes successives. Les fibres de collagène
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subissent au niveau de l’os un processus continu de synthèse et de dégradation

intervenant dans le cycle de remodelage du tissu.
I-1-3- Remodelage osseux
I-1-3-1- Cellules osseuses
Au niveau cellulaire, l’os contient différents types de cellules:
Les ostéoblastes (Figure I-3-a): ce sont des cellules osseuses immatures,
responsables de la synthèse d’une substance appelée ostéoide, substance organique qui
va ensuite se minéraliser rapidement en emprisonnant les ostéoblastes pour former
l’os. Ils sont situés à la surface des travées osseuses et dans les lacunes de résorption
de l'os compact. Leur rôle est de synthétiser les éléments de la matrice osseuse et de
permettre sa calcification.
Les ostéocytes (Figure I-3-b): ce sont des ostéoblastes qui ont été
progressivement emprisonnés par la matrice qu’ils ont élaboré. Elles sont enfermées
dans une petite cavité, l’ostéoplaste, et communiquent avec les ostéocytes voisins par
de fins prolongements cytoplasmiques. Ils détectent les tensions mécaniques au sein de
l’os et participent au remodelage osseux.
Les ostéoclastes (Figure I-3-c): ce sont des cellules multinucléées issues de
monocytes en circulation (type de globule blanc). Ils opèrent à des pH acides (Figure
I-3-d), ce qui entraîne d’une part une solubilisation du minéral (résorption osseuse), et
d’autre part l’activation d’enzymes lysosomiales qui dégradent la matrice organique.

9
 I-1-3-2- Cycle du remodelage osseux
En tant que structure adaptée, adaptable et optimisée, l’architecture osseuse est
continuellement régénérée par formation (apposition) et résorption locale d’os: c’est le
remodelage osseux. Ces processus de formation et de résorption sont couplés et
synchronisés par l’intermédiaire de paquets d’ostéoblastes et d’ostéoclastes
couramment appelés unité de remodelage. La figure I-4 présente le cycle fonctionnel
simplifié du remodelage osseux. Ce processus se déroule en cinq étapes:
Phase d’activation: le long de la surface osseuse inactive recouverte de cellules
bordantes, ou ostéoblastes quiescents, surviennent les précurseurs mononuclées des
ostéoclastes.
Phase de résorption: les ostéoclastes dissolvent puis endocytent (inclusion
cellulaire) le tissu osseux et creusent des lacunes de résorption.
Phase d’inversion: les ostéoclastes ayant terminé de former les lacunes
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subissent une apoptose et sont remplacées par les cellules mononuclées précurseurs
ostéoblastiques.
Phase de formation: les ostéoblastes comblent les cavités en apposant une
nouvelle matrice osseuse.

10
 (a) (b)
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(c) (d)

Figure I-3: (a) tapis d'ostéoblastes, (b) Ostéocyte dans la matrice osseuse,
(c) ostéoclaste creusant une lacune, (d) schéma d'un ostéoclaste
opérant à pH acide.

11
 Ostéoblastes Ostéoclastes

Activation

Résorption: 10 jours
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Formation: 3 mois

Minéralisation Inversion

Figure I-4: Remodelage osseux

12
 I-1-4- Biominéralisation
La biominéralisation est le processus par lequel les cristaux minéraux sont
déposés d’une façon organisée au sein de la matrice extra et intracellulaire (Boskey,
1998). Ce processus est à l’origine d’une nucléation hétérogène de phosphate de
calcium, suivie d’une étape de croissance cristalline. D’une façon simplifiée, la
formation du tissu osseux minéralisé peut être effectuée en deux temps:
- Synthèse et sécrétion d’une matrice organique (substance pré-osseuse) par des
cellules spécialisées (ostéoblastes); ceci correspond à la matrice extracellulaire (MEC)
dont les principaux constituants sont regroupés dans le tableau I-2 (Ea, 2007).
- Minéralisation de la MEC pour former des structures extrêmement dures (os et
dents).
Tableau I-2: Eléments de la matrice extracellulaire intervenant dans la minéralisation
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Pro-minéralisants Inhibiteurs
Vésicules matricielles Pyrophosphates
Corps apoptotiques Gla protéines matricilelles
Calcium et phosphate Ostéopontine
Phosphatases alcalines Ostéocalcine
Pyrophosphatases Eau
Glycoprotéines Protéoglycanes
Annexines Protéine ANK (transporteur des PP)
Collagènes I, II et X
Métalloprotéases

Cependant, les mécanismes de minéralisation de la matrice organique ne sont

toujours pas entièrement élucidés malgré d’innombrables travaux sur ce sujet. Dans
quels sites débute la minéralisation? Quels sont les mécanismes mis en jeu? Quelle est
la nature physico-chimique de la phase minérale? Telles sont les grandes questions qui
sont largement débattues depuis de nombreuses années et sur lesquelles nous allons
faire le point de façon succincte.

13
 I-1-4-1- Mécanismes
Les fluides biologiques comportent une certaine proportion d’ions calcium et
phosphate. Cette solution est métastable ne favorisant pas ainsi une précipitation
spontanée des ions en solution vers une phase solide. L’organisme est donc obligé
d’avoir recours à la nucléation hétérogène. Des sites particuliers de la phase organique
(vésicules, fibrilles de collagène ou autres) sont utilisés comme initiateurs de cette
précipitation; des facteurs biologiques ainsi que des réactions biochimiques
interviennent également dans le processus (Boskey, 1989b). Ainsi, la minéralisation ne
débute qu’à des endroits définis, même si certaines conditions physico-chimiques sont
remplies dans d’autres sites (Glimcher, 1989).
La multiplicité des sites et des mécanismes de minéralisation rend l’étude de ce
phénomène assez complexe. Il a été établi à l’issu de nombreuses recherches (Boskey,
1998; Olszta et al., 2007) que le processus de minéralisation ne peut être généralisé, et
que selon chaque type de tissus prédomine tel ou tel mode de formation.
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Ainsi, la calcification du cartilage débute à l’intérieur des poches appelées

vésicules matricielles (VM) (Ozawa et al., 2008). Celles ci sont de petite taille (0,1 à
0,2 µm) délimitées par une membrane trilaminaire typique. Elles renferment diverses
protéines (lipides) et une variété d’enzymes (phosphatases alacalines,
pyrophosphatases, peptidases neutres et protéases). Les vésicules constituent un
microenvironnement dans lequel les ions calcium et phosphate vont être concentrés, et
former avec les phospholipides des complexes ternaires capables d’initier la
minéralisation (Wu et al., 1997). La première phase de la minéralisation (initiation) se
produit lorsque la concentration intravésiculaire des sels de phosphate de calcium
dépasse son seuil de saturation (Anderson, 1995). Ces foyers de nucléation primaire
vont alors croître et rompre la membrane des VM puis être déversés dans le milieu
extracellulaire pour servir de foyers secondaires et permettre la propagation de la
minéralisation. Celle-ci est régulée par les composants de la matrice extracellulaire,
notamment les pyrophosphates et les protéines non-collagéniques, qui peuvent
l’accélérer ou la retarder. Notons que ces vésicules ne se trouvent pas dans l’émail et la
dentine.
Pour le tissu osseux c’est plutôt les fibrilles du collagène qui sont fortement
considérés comme sites privilégiés d’initiation de la minéralisation. Parfois, les deux
mécanismes (VM, fibrilles de collagène) fonctionnent simultanément (Boskey, 1998).
De nombreux travaux suggèrent que les stades précoces de la minéralisation
(formation des premiers dépôts minéraux) se déroulent au sein des bandes à trous des
fibrilles de collagène (Glimcher, 1987; Hodge, 1989). Cette partie est moins riche en
acides aminés du fait du décalage des chaînes les unes par rapport aux autres. Ces

14
 trous agissent comme étant des compartiments permettant l’accumulation des ions
calcium et phosphate et la précipitation sous la forme d’un dépôt minéral.
Peu à peu, les cristaux vont envahir les trous puis les espaces longitudinaux
pour finir par recouvrir entièrement les fibrilles de collagène.
I-1-4-2- Rôle du collagène et protéines non-collagéniques dans le processus
de biominéralisation
Le rôle important du collagène dans l’initiation de la minéralisation
physiologique a été discuté dans plusieurs études. Glimcher (1989) a noté lors d’une
étude in vitro que le collagène hautement purifié (déprotéiné) peut nucléer les cristaux
de phosphate de calcium à partir d’une solution métastable d’ion calcium et phosphate
(solution ne produisant pas de nucléation spontanée). Les résultats issus de cette
recherche indiquent la présence de sites actifs spécifiques de nucléation dans les
fibrilles du collagène. Neuman et Neuman (1958) ont avancé une hypothèse suivant
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

laquelle le collagène de la dentine joue le rôle d’agent de nucléation entraînant

l’apparition d’une phase cristalline. Ces observations expérimentales témoignent de
l’existence d’une relation étroite entre les cristaux formés et des groupements
fonctionnels des fibrilles.
Bien que le collagène joue incontestablement un rôle important dans le
processus de biominéralisation, il semblerait que du point de vue biologique, sa
présence dans la matrice extracellulaire est nécessaire mais pas suffisante, et que
d’autres composés spécifiques faisant partie des constituants de la MEC sont
impliqués. Pautard (1966) a constaté que le collagène peut parfois être absent et que
des protéines non-collagéniques peuvent jouer, comme le collagène, un rôle direct
dans la minéralisation. Parmi ces protéines non-collagéniques, on trouve les
phosphoprotéines (osteopontines, sialoprotéines et glycoprotéines), le Gla-protéine
(osteocalcine), l’ostéonectine et les protéoglycanes (Boskey, 1989). Ces protéines,
classées comme inhibiteurs de croissance cristalline ou comme agents de nucléation,
semblent réguler le processus de minéralisation des os et dents (Boskey, 1998). Les
mécanismes d’inhibition et/ou d’initiation de la croissance sont complexes et encore
incompris pour certaines molécules.
L’ostéopontine, les sialoprotéines, et les glycoprotéines sont trois
phosphoprotéines qui ont été localisées au front de la minéralisation des tissus calcifiés
(os et dents) (Reynolds et al., 1982; Glimcher, 1989). Ces protéines polyanioniques se
caractérisent par une grande densité de charges négatives, due essentiellement aux
groupements sulfates, carboxyles, et phosphates. Cela leur confère une grande
propension à se lier au calcium et une affinité élevée pour les fibrilles de collagène
(Eanes, 1992). Plusieurs études ont mit l’accent sur le rôle multiple de ces

15
 macromolécules dans la biominéralisation. Ainsi, elles ont été identifiées comme
agents assurant la liaison par complexation entre les protéines de la MEC, modulateurs
de la fonction des ostéoclastes, nucléateurs du dépôt minéral d’hydroxyapatite, et
inhibiteurs de la formation et la croissance des cristaux d’apatites (Glimcher, 1989;
Boskey, 1992). D’autres études réalisées in vitro ont suggéré que l’action multiple des
phosphoprotéines est fortement conditionnée par leur concentration dans le milieu
extracellulaire (Boskey et al., 1993). En effet, elles facilitent la nucléation des cristaux
phosphocalciques à de faibles concentrations ou lorsqu’elles s’adsorbent à la surface
des fibrilles du collagène, et inhibent la biominéralisation à de fortes concentrations
(Linde et al., 1989; Boskey et al., 1990). Des observations similaires ont été rapportées
lors de l’étude menée in vitro sur l’effet de l’albumine sur la croissance cristalline du
phosphate octocalcique triclinique (Combes et Rey, 2002).
L’action inhibitrice des phosphoprotéines, en particulier les ostéopontines, a été
attribuée aux phénomènes d’adsorption intervenant à l’interface protéines-minéral et
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impliquant les groupements phosphate; cela se traduit par un blocage des sites
spécifiques responsables du processus de croissance cristalline (Termine et al., 1981;
Aoba et Moreno., 1985).
Contrairement aux phosphoprotéines, l’ostéocalcine et l’ostéonectine n’ont pas
été observées dans les régions où la formation des premiers cristaux s’amorce, mais
sont plutôt localisées durant les derniers stades de minéralisation de la MEC. De ce
fait, elles sont impliquées dans la régulation et le contrôle de la taille des cristaux
néoformés et la vitesse de croissance cristalline (Roach, 1994).
L’ostéocalcine (OC) ou GLA-protéine osseuse est la protéine non collagénique
la plus abondante de l’os. Les groupements carboxyles sont responsables de la grande
affinité de ces macromolécules pour les sites calcium à la surface des cristaux
phosphocalciques de l’os (Flade et al., 2001). Hauschka et al. (1989) suggèrent une
adsorption préférentielle de l’ostéocalcine sur le plan (001) de l’hydroxyapatite ; ceci a
été expliqué par la grande similarité entre les distances interatomiques des ions
calcium dans le plan de croissance de l’hydroxyapatite (5,45 Å) et la distance qui
sépare les groupements carboxyliques (5,4 Å) (Flade et al., 2001). Toutefois, une
question se pose quant au rôle de l’adsorption préférentielle: est ce que ce phénomène
peut-il expliquer l’effet de ces macromolécules comme agent de nucléation et/ou
inhibiteur de la croissance cristalline des biominéraux ?
Des études menées sur les phénomènes de dissolution-reprécipitation des
phosphates de calcium dans des conditions biomimétiques ont montré que l’activité de
l’ostéocalcine se distingue suivant la concentration examinée (Hunter et al., 1996a;
Gelinsky et al., 2004). Ainsi, à de faibles concentrations (<100µg/ml) l’OC montre un

16
 effet inhibiteur, tandis qu’ils observent un effet inverse à de fortes concentrations
(>100µg/ml).
Les effets des protéines matricielles sur la minéralisation ne sont pas clairement
élucidés et semblent dépendre du système étudié, de leur conformation, de leur
concentration ainsi que de la présence ou non d’autres molécules avec lesquelles elles
peuvent interagir (Cuisinier, 1996; Boskey, 1996a; Hunter, 1996b). Devant
l’incohérence apparente de certains résultats expérimentaux, des auteurs ont suggéré
que la stabilisation et l’orientation de la croissance des amas de phosphate de calcium
ne dépendraient que des contraintes spatiales imposées par les protéines matricielles et
non pas d’interactions spécifiques avec le cristal (Cuisinier, 1996).
I-1-4-3- Précurseur de la biominéralisation
Il est important de souligner que les études chimiques sur les apatites
synthétiques ont révélé que leur formation est souvent précédée par l’apparition très
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transitoire d’autres phosphates de calcium. Cependant, l’existence de tels précurseurs

au cours de la biominéralisation du tissu osseux n’a pas pu être montrée avec certitude.
Les méthodes d’analyse imposent une technique de préparation des échantillons qui
peut modifier le phosphate de calcium. Le mauvais état de cristallisation de la phase
minérale, la petite taille de ses cristaux, et enfin la présence de la matrice organique
sont autant de facteurs limitant pour les informations obtenues par les techniques
physico-chimiques d’investigations.
Si la détermination de la nature du premier minéral formé dans les milieux
physiologiques pose encore de nombreux problèmes techniques, de nombreux travaux
ont émis l’hypothèse de différents précurseurs potentiels. Le phosphate de calcium
amorphe (ACP) a été proposé comme phase initiale (Betts et Posner., 1974). Il a été
également suggéré que la première phase solide formée pourrait être de la brushite
(phosphate dicalcique dihydraté ou DCPD) (CaHPO4, 2H2O), dans des conditions de
sursaturation et de bas pH (Roufosse et al., 1984). Cette brushite pourrait être un
précurseur de l’apatite et/ou servir de germe pour une croissance apatitique en surface
du cristal de brushite. Le phosphate octocalcique (OCP) pourrait être un autre
précurseur, capable de se transformer en apatite dans des conditions physiologiques de
pH et de sursaturation (Brown et al., 1988).
Bien que l’OCP, la DCPD et l’ACP soient proposés comme précurseurs du
minéral de l’os, leur mise en évidence par DRX et d’autres méthodes d’analyses reste
encore controversée. La plupart des résultats, signalant la présence de ces phases aux
tous premiers stades de la minéralisation de l’os, n’ont pu être confirmées.

17
 Des études plus précises, utilisant la diffraction des rayons X et les fonctions de
distributions radiales, ont invalidé la théorie de précurseurs amorphe (ACP) précédant
la formation du minéral osseux (Blumenthal et al., 1981; Grynpas et al., 1984).
Ces auteurs ont montré que le minéral osseux même au premier jour de sa
formation (os enbryonnaire) est essentiellement formé d’une phase apatitique mal
cristallisée.
Par ailleurs, dans une étude menée par micro spectrométrie Raman de l'os
crânien intra-membranaire Crane et al. (2006), semblent identifier des phases
transitoires distinctes qui précèdent la formation d'apatites mal cristallisées de l'os, tel
le phosphate octocalcique triclinique (OCP) et/ou le phosphate de calcium amorphe
(ACP). Ces observations ont suscitées des critiques différentes dans la littérature. En
effet, il a été établi que les premières phases mal cristallisées de l'os contiennent un
grand nombre d'ions carbonate labiles localisés dans des environnements non-
apatitiques (Grynpas et Omelon, 2007; Rey et al., 2009). Or aucune structure
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octocalcique ou autres phases cristallines non-apatitiques contenant des ions carbonate

n’a été identifiée (Lyengar et Tandon, 1999). Cela rend incompatible les conclusions
déduites par le groupe de Crane. De plus, aucune phase autre que l'apatite ne peut
rendre compte des différents types d'environnements non-apatitiques mis en évidence
dans le minéral osseux.
L’étude microscopique (Crane et al., 2006) a uniquement focalisé sur l'ion
phosphate pour identifier les dites phases transitoires. En dépit des analogies qui
existent entre les bandes infrarouges des groupements phosphates dans les apatites mal
cristallisées et l'OCP triclinique, on peut facilement déceler la présence de cette phase
(OCP) grâce à la bande spécifique aux ions phosphate qui apparaît vers 915cm-1. Cette
bande n'a jamais été détectée dans des échantillons de l'os (Eichert et al., 2004). Cela
rend incompatible l’identification de cette phase minérale comme précurseur du
minéral osseux.

I-2- Phosphates de calcium synthétiques

I-2-1- Généralités
Les phosphates de calcium jouent un rôle important dans divers domaines. Dans
l’industrie, ces minerais sont la source principale des engrais phosphatés et servent à
préparer l’acide phosphorique et différents dérivés phosphatés (Amjad, 1997). De plus,
leurs propriétés électroniques sont largement mises à profit dans la conception des
lampes fluorescentes (Budin et al., 1979) et des matériaux pour Laser (Wright et al,
2009). Ils sont également utilisés en chromatographie pour la séparation et la
purification des molécules organiques (Gorbunoff, 1994; Shibusawa et al., 1994).

18
 Outre leur importance industrielle, les phosphates de calcium apatitiques ont connu un
grand essor dans le domaine des biomatériaux. En effet, grâce à leur composition
chimique proche de la phase minérale des tissus osseux, leurs propriétés de
biocompatibilité et de bioactivité les rendent utilisables sous diverses formes :
substituts osseux, système de libération de principes actifs, céramiques et ciments
etc…( LeGeros, 1991; Aoki, 1994; Ginebra et al., 2006; Tadier, 2009).
Les sels de calcium de l'acide orthophosphorique (H3PO4) constituent une
grande famille de composés solides: les orthophosphates de calcium. Ces composés
dérivent en général de la neutralisation de la première acidité (sels monobasiques :
MCPA et MCPM), de la deuxième acidité (sels dibasiques : DCPA et DCPD) et / ou
de la troisième acidité de H3PO4 (sels tribasiques : OCP, PTCa). Les équations de
réactions acido-basiques suivantes représentent les neutralisations successives des
différentes acidités de l’acide orthophosphorique.
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H3PO 4 + H2O H2PO −4 + H3O+ Ka1 = 5,8610-3 à 37°C

H2PO −4 + H2O HPO 24 − + H3O+ Ka2 = 6,85 10-8 à 37°C

HPO 24 − + H2O PO 34− + H3O+ Ka3 = 6,62 10-13 à 37°C

Les propriétés de dissolution de ces phosphates de calcium dépendent de leurs

caractéristiques physico-chimiques, en particulier le rapport molaire Ca/P, la structure
cristallographique et la surface spécifique (Hina, 1996). Ainsi, en fonction du rapport
molaire Ca/P qui varie de 1,33 à 1,67, nous pouvons définir plusieurs familles
d’orthophosphates de calcium répertoriées dans le tableau I-3.
Parmi ces phosphates de calcium, notre choix a porté sur trois types d’apatites
connues par leurs applications dans le domaine des biomatériaux :
Hydroxyapatite (HA);
Apatites nanocristallines carbonatées;
Phosphate octocalcique apatitique (OCPa) et phosphate octocalcique apatitique
carbonatée (OCPa-c).

19
 Tableau I-3: Orthophosphates de calcium et caractéristiques : rapport atomique
(Ca/P) et solubilité.

Phosphate de Calcium Nom abrégé Formule Chimique Ca/P Solubilité

(pKs)*
Phosphate monocalcique
anhydre MCPA Ca(H2PO4)2 0,50
monohydraté MPCM Ca(H2PO4)2, H2O 0,50
Phosphate dicalcique
anhydre (monétite) DCPA CaHPO4 1,00 6,04
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dihydraté (brushite) DCPD CaHPO4, 2H2O 1,00 6,73

Phosphate octocalcique
triclinique OCPt Ca8(PO4)4(HPO4)2, 5H2O 1,33 98,6
apatitique OCPa Ca8(HPO4)2,5(PO4)3,5(OH)0,5 1,33
amorphe OCPam Ca8(PO4)4(HPO4)2, nH2O 1,33
Phosphate tricalcique
α ou β TCP(α,β) Ca3(PO4)2 28,5- 29,6
apatitique TCPa Ca9(PO4)5(HPO4)(OH)
amorphe ACP Ca9(PO4)6, nH2O
Hydroxyapatite
hosphocalcique*
stoechiométrique HA Ca10(PO4)6(OH)2 1,67 117,2
non-stoechiométrique PCA Ca10-x((PO4)6-x(HPO4)x)(OH)2-x 1,33-
1,67

* Produit de solubilité (pKs) à 37°C (Wang et Nancollas, 2008)

20
 I-2-2- Hydroxyapatite
Une des formes les plus répandues du phosphate de calcium est
l’hydroxyapatite (HA). De formule chimique Ca10(PO4)6(OH)2, elle appartient à une
grande famille de composés isomorphes. L’hydroxyapatite phosphocalcique cristallise
dans le système hexagonal (groupe spatial P63/m) avec les paramètres
cristallographiques suivants (Elliott, 1994) :
a = b = 9,432 Ǻ et c = 6,881 Ǻ ; α = β= 90° et γ = 120°
La maille cristalline contient un motif Ca10(PO4)6(OH)2. Sa structure peut être
décrite en considérant un empilement hexagonal de groupements PO43- qui laisse
-

apparaître deux types de tunnels parallèles à l'axe c (Figure I-5).

Les premiers types de tunnels sont centrés sur les axes ternaires de la structure
et sont occupés par 4 ions Ca2+ (communément désignés par Ca-I). Leur diamètre est
d'environ 2 Å. Ils apparaissent sur la projection de la structure par rapport au plan
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

(010). Le second type de tunnel est centré sur les axes à symétrie hexagonale parallèles
à l'axe c. Leur diamètre est compris entre 3 et 3,5 Å. Ils sont occupés par 2 ions OH-
(au centre) et par 6 ions Ca2+ (notés Ca-II). La projection de la structure sur le plan
(001) met en évidence la symétrie hexagonale de ces tunnels.

OXYGENE
CALCIUM
PHOSPHORE
OH

Figure I-5 : Projection de la structure de HA sur le plan de base (001).

21
 Les tunnels revêtent une importance particulière dans le comportement
physicochimique de l'apatite par leur aptitude à favoriser les échanges ioniques. En
effet, les ions OH- jouissent d'une grande mobilité et peuvent donc être facilement
substitués soit par des ions monovalents (Cl- ou F-) , soit par des ions bivalents (CO 32 − ,
O2-, S2- ) et/ou des lacunes (Elliot, 1994; Trombe, 1972). Des substitutions sont
également possibles sur les sites Ca2+ (Mg2+, Na+, Zn2+ ...) (Tomazic et al., 1991) ainsi
que sur les sites PO 34− (CO 32 − , HPO 24 − ...) (Bonel, 1972; Heughebaert, 1977). Afin de
maintenir l'électroneutralité au sein de la maille, les échanges ioniques mettant en jeu
des espèces de valences différentes entraînent la création de lacunes sur les sites Ca2+
et/ou sur les sites OH-. Les sites PO 34− sont toujours saturés à 6 ions par maille quels
que soient les écarts à la stoechiométrie engendrés par les multiples substitutions.
A l'échelle atomique, que ce soit par la création de lacunes et/ou pour des
raisons d'encombrement stérique, les substitutions ioniques modifient les paramètres
de maille de la structure. A plus grande échelle, les substitutions engendrent, de
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manière générale, une baisse de cristallinité, une diminution de la stabilité thermique

ainsi qu'une augmentation de la solubilité (Merry, 2000). Le cas de la substitution des
ions OH- par les ions F- (fluoroapatite) déroge cependant à cette règle. En effet, la
substitution par le fluor tend à renforcer la structure du composé et à en réduire la
solubilité, peut être en raison de l'existence de liaisons hydrogène entre les ions
fluorures et les ions OH − (LeGeros, 1991).
I-2-3- Apatites non stoechiométrique
Comme cela a été rapporté précédemment, la phase inorganique des tissus
osseux s'apparente à une apatite phosphocalcique non stoechiométrique (poly-
substituée). Les ions de substitution sont de nature diverse et se répartissent sur chacun
des trois sites qu'offre la structure apatitique. Leurs teneurs sont variables et dépendent
du tissu considéré. Au côté des ions alcalins, alcalino-terreux et halogènes qui
n'entrent dans la structure qu'en faibles proportions (teneur totale < 1,5 % en masse),
les ions carbonate font état d'ions de substitution prépondérants. Leur teneur varie
entre 3 % et 7 % suivant les tissus (Legros et al., 1986).
Les ions carbonate autorisent deux types de substitutions distinctes au sein de la
structure apatitique communément désignés par A et B. Dans une substitution dite de
type A, les ions carbonate trouvent place dans les sites OH- ; la substitution de type B
correspond à un remplacement partiel des ions phosphate par les ions carbonate
(Bonel, 1972). Ce type de substitution des ions PO 34− et/ou des ions OH- par les ions
carbonate engendre des perturbations dans la structure apatitique qui conduisent à une
augmentation de la solubilité du composé par rapport à celle de l'HA (LeGeros, 1991).
De plus, la présence des ions carbonate dans le minéral apatitique intervient d'une

22
 façon notable dans les processus biologiques tels le développement des caries
dentaires, la résorption osseuse et les liaisons minéral-organique (Rey et al., 1989b).
La phase minérale des tissus osseux présente les deux types de substitutions
(Elliott et al., 1985; Legros et al., 1986); elle s'assimile à une apatite carbonatée mixte
de type AB. De plus, différentes études suggèrent que les carbonates substitués en site
de type B sont majoritaires dans l’émail, l’os et la dentine (Barroug, 1982; Rey et al.,
1991b). La proportion de carbonates de type A augmente cependant au cours du temps
dans l’os (Kuhn et al., 2008).
Le nombre de sites A pouvant être carbonatés découle du nombre d'ions
carbonate en site B. Cependant, hormis cette condition restrictive, il n'existe aucun lien
entre la teneur en ions carbonate en site B et celle en site A (Vignoles, 1984; Elliott,
1994). Les apatites mixtes AB peuvent alors répondre à la formule suivante :
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Ca10-x+u x-u (PO4)6-x (CO3)x (OH)2-x+2u-2y (CO3)y x-2u+y

avec (0 ≤ x ≤ 2), (0 ≤ 2u ≤ x) et (0 ≤ y ≤ 2-x+2u)

Selon le mode de synthèse choisi, il est possible d'obtenir des apatites

carbonatées bien ou mal cristallisées. Nous nous sommes particulièrement intéressés
aux phosphates de calcium carbonatés mal cristallisés, nommés Apatites
Nanocristallines Carbonatées (ANC), et ce vues les caractéristiques physico-chimiques
particulières qu’ils présentent ainsi que leur grande similitude avec le minéral du tissu
osseux (Hina, 1996; Cazalbou, 2000; Rey et al., 2007a).
I-2-3-1- Apatites Nanocristallines Carbonatées (ANC)
Ces composés, fraîchement préparés à température ambiante et à pH neutre,
possèdent les caractéristiques des apatites biologiques au niveau de la microstructure
(taille et morphologie des cristallites), de la surface spécifique, de la composition
chimique ainsi qu’à la présence d’une couche hydratée à leur surface.
Une caractéristique majeure de ces matériaux est la présence dans cette couche
d'environnements non apatitiques, qui n'existent pas dans les apatites bien cristallisées
(Rey et al., 1996; Hina, 1996). Cette couche hydratée est riche en ions minéraux
labiles et facilement échangeable, notamment les espèces carbonates et phosphates;
elle évolue au cours du temps et est responsable de la grande réactivité de ces
matériaux en termes d’échanges ioniques et capacité d’adsorption vis-à-vis de leur
milieu biologique environnant (Ouizat et al., 1999; Cazalbou, 2000; Benaziz et al.,
2002; Barroug et al., 2004 et 2008).

23
 La formule chimique des précipités ANC peut être établie si en considère que la
majorité des ions carbonate étaient substitués aux ions phosphate, qu’il n’existait pas
de lacune dans les sites de ces ions et que les sites anioniques des tunnels étaient
inoccupés. Ces apatites peuvent répondre à la formule chimique suivante:
Ca10-x (PO4)6-(u+v) (HPO4)u (CO3)v. 0≤ x ≤2 et 0 ≤ u+v ≤ x
Rappelons en effet, que les apatites comportant des lacunes dans les sites
phosphates, n’ont jamais été décrite. Il semble que ces ions volumineux constituent le
squelette du réseau qui ne peut exister avec des défauts importants sur ces sites. En ce
qui concerne la localisation des ions carbonate, l’hypothèse est justifiée dans la mesure
où la majorité de ces groupements se substituent aux ions phosphate (Vignoles et al.,
1988). L’absence d’ions dans les tunnels n’est pas rigoureusement exacte puisque des
ions carbonate de type A sont souvent identifiés par FTIR (Rey et al., 2007b; Eichert
et al., 2008). Par ailleurs les bandes OH ne sont pas formellement identifiées et leur
concentration est très faible comme dans le minéral osseux (Legros, 1984, Rey el al.,
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1995b).
L’établissement des formules chimiques de ce type de composés ayant une très
grande surface spécifique est toutefois critiquable dans la mesure où une grande partie
des ions se trouvent à proximité de la surface minérale probablement très perturbée.
Bien que ces formules chimiques autorisent une comparaison aisée des différentes
apatites nanocristallines au cours de leur maturation, nous éviterons dans ce travail ce
type de présentation qui ne rend pas en compte de l’hétérogénéité des échantillons.
I-2-3-2-Phosphate Octocalcique Apatitique (OCPa)
Le phosphate octocalcique apatitique (OCPa) est le composé apatitique le plus
riche en lacunes cationiques (Ca/P = 1,33). Il diffère des apatites nanocristallines
citées précédemment par son mode de préparation. En effet, les apatites ANC sont
formées aisément dans un milieu aqueux par précipitation rapide à température
ambiante et à pH neutre, tandis que les phosphates octocalciques de structure
apatitique sont obtenus par séchage à l’étuve à 80°C du gel d’OCP amorphe. Ce
dernier a été précipité en milieu eau-éthanol à pH basique et 37°C (Zahidi, 1984).
L’introduction de l’éthanol dans le milieu réactionnel exerce une influence sur
la canstante diélectrique du milieu et par conséquent sur les propriétés acido-basiques
de l’acide phosphorique. Ainsi, le pKa de la troisième acidité de H3PO4 dans un
mélange eau-éthanol est très élevé par rapport à sa valeur dans l’eau. Ceci a pour effet
la réduction de la force du couple acidobasique HPO 24 − /PO 34− . Il en résulte qu’à pH
donné, où existent préférentiellement les deux formes conjuguées; le rapport
HPO 24 − /PO 34− est beaucoup plus élevé dans le mélange eau-éthanol que dans l’eau.

24
 On favorise ainsi la formation de phosphates plus riches en HPO 24 − et de rapport Ca/P
faibles (OCPam). Au cours du séchage, l’OCPam cristallise et subit l’hydrolyse partielle
d’un demi groupement PO 24 − (Zahidi, 1984). La réaction se produisant lors du séchage
est la suivante (Lebugle et al., 1986):
Ca8(HPO4)2(PO4)4 → Ca8 (HPO4)2,5(PO4)3,5(OH)0,5

I-2-3-3- Phosphate Octocalcique Apatitique Carbonaté (OCPa-c)

Ces matériaux sont obtenus dans les mêmes conditions expérimentales que
l’OCPa (milieu eau-ethanol à 37°C). L’introduction des ions carbonate dans les
solutions de synthèse donne lieu, après séchage des gels obtenus à 80°C, à des
phosphates octocalciques apatitiques carbonatés similaires au minéral osseux (Dabbarh
et al., 2000). L’état de cristallisation de ces composés se dégrade au fur et à mesure
que le taux des carbonates augmente. Il a été montré par ailleurs, que les ions
carbonate se fixent essentiellement en site B et beaucoup plus faiblement en site A
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(Bennani et al., 1993). La formule générale s’exprime de la façon suivante:

Ca8+0,57b(PO4)3,5+1,64b(HPO4)2,5-2,5b(CO3)0,86b(OH)0,5-0,5b avec 0 ≤ b ≤ 1
Ces apatites déficientes et de composition chimique plus proche de celle des
tissus calcifiés, ont une aptitude remarquable à la compaction et ont été proposées en
tant que support de médicaments implantables à libération retardée (Lebugle et al.,
2002).

25
 II- OSTEOPOROSE ET BISPHOSPHONATES

II-1- Ostéoporose
II-1-1- Définition
Selon l’organisation mondiale de la santé (OMS), l’ostéoporose est une maladie
caractérisée par une densité minérale faible et une détérioration de la microarchitecture
de l’os, conduisant à une fragilité osseuse accrue et à une augmentation secondaire du
risque de fracture (Figure I-6). A l’échelle biologique, cette affection du squelette est
induite par un déséquilibre cellulaire dans le remodelage osseux suite à un surcroît
d’activité des ostéoclastes par rapport aux ostéoblastes (Fleisch, 1998).
Le risque d’apparition du déficit osseux est plus important avec la disparition
des hormones sexuelles, en particulier chez la femme lors de la ménopause. En effet, à
ce moment là, la production d’œstrogènes diminue substantiellement parce que les
ovaires, qui produisent la quasi-totalité de ces hormones, cessent de fonctionner. Une
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femme peut perdre de 2 à 5 % de sa densité osseuse tous les 5 ou 10 ans suivant sa

ménopause. Cela explique que l’ostéoporose frappe une femme sur 4 et seulement un
homme sur 8 après 50 ans. D’autres éléments comme les carences alimentaires en
calcium et en vitamine D, la sédentarité et l’absence d’exercice physique sont
également des facteurs de risques de fragilisation osseuse (Breuil et Euller-Ziegler,
2004).

Figure I-6: Vue microscopique d'un os sain (à gauche) et d'un os ostéporotique

(à droite).

26
 II-1-2- Traitements médicamenteux
Le traitement de l’ostéoporose (préventif ou curatif) a longtemps été dominé par
le traitement hormonal substitutif (THS). Ce traitement a constitué pendant près de 50
ans la thérapeutique la plus largement utilisée dans tous les pays pour la prévention et
le traitement de l’ostéoporose. Cette situation a été remise en cause car l’absence de
protection cardio-vasculaire et une augmentation légère du risque de cancer du sein
notée dans les populations étudiées n’apparaissaient plus compatibles avec l’utilisation
prolongée d’un traitement hormonal (Fournier et al., 2003).
Si l’usage du THS est nettement remis en question du fait d’un rapport
bénéfice/risque globalement défavorable à long terme (Azoulay, 2004), les
bisphosphonates (BPs) demeurent une alternative thérapeutique efficace dans la
prévention et le traitement de l’ostéoporose (Fleisch, 2003; Russell et al., 2008). En
effet, ils constituent une référence dans le traitement de diverses affections du tissu
osseux, notamment celles impliquant des désordres du remodelage (Russell et Rogers,
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1999).

II-2- Bisphosphonates
II-2-1- Historique
Les bisphosphonates ont été connus des chimistes au milieu du 19ème siècle
(Fleisch, 1998). Le premier bisphosphonate qui fut synthétisé « étidronate » a été
utilisé pour traiter la myosite ossifiante (ossification de la musculature) (Basset et al.,
1969). Les médicaments à base de bisphosphonates ont été mis au point au cours des
trois dernières décennies pour le traitement de diverses pathologies liées à l'os, dents et
métabolisme du calcium.
Les bisphosphonates ont également été utilisés comme inhibiteur de corrosion,
et comme agent complexant dans l'industrie textile, engrais et les industries pétrolières
(Browning et Fogler, 1996). Leur capacité à inhiber la précipitation du carbonate de
calcium, à l'instar des polyphosphates, a été mise à profit dans la prévention de
l’entartrage (Blomen, 1995)
La connaissance des caractéristiques biologiques de bisphosphonates remonte à
une trentaine d'années. Les résultats des premières investigations ont été publiés par
Fleisch et al. (1968). Ces auteurs ont trouvé que le plasma et l'urine contenaient des
composés qui inhibent la précipitation de phosphate de calcium. Il s’agit du
pyrophosphate inorganique, un composé qui n'a pas été décrit précédemment dans la
littérature scientifique. Le pyrophosphate a ensuite montré in vitro sa capacité à
empêcher la formation et la dissolution des cristaux de phosphate de calcium. In vivo,
le pyrophosphate joue un rôle physiologique comme agent inhibiteur de la

27
 calcification des tissus osseux et régulateur de la biominéralisation (Russell et Rogers,
1999).
Cependant, l’hydrolyse rapide des pyrophosphates a limité considérablement
leur application dans le domaine médical. Toutefois, ces composés ont pu être utilisés
dans la scintigraphie et contre les calculs dentaires (Guy et al., 1988). Cela a conduit
les chercheurs à développer des analogues structuraux aux pyrophosphates possédant
des activités physico-chimiques similaires mais résistant à l’hydrolyse enzymatique et
donc non dégradés métaboliquement. Les bisphosphonates remplissent ces conditions.
II-2-2- Propriétés structurales
Le remplacement d'un atome d'oxygène de la molécule de pyrophosphate (P–
O–P) par un atome de carbone (P–C–P) permet d'obtenir un groupe de molécules qui
résistent à la pyrophosphatase (enzyme qui catalyse l'hydrolyse des pyrophosphates)
tout en conservant les propriétés physicochimiques du pyrophosphate (Figure I-7-A).
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Il s'agit donc d'analogues stables du pyrophosphate qui sont résistants à l'hydrolyse. La

liaison d'un atome de carbone à deux groupements phosphonate a donné à ces
composés leur nom de bisphosphonates (BPs). La structure P-C-P autorise un grand
nombre de variations possibles, en changeant les deux chaînes latérales (R1, R2) sur
l'atome de carbone. C'est ainsi que l'on distingue deux catégories majeurs de
bisphosphonates (Figure I-7-B): les non-amino bisphosphonates (non N-BPs) ou
composés dits de première génération et les amino-bisphosphonates (N-BPs). Ces
derniers possèdent une fonction amine sur l'une des chaînes latérales ; la fonction
amine peut être présente dans ces dérivés sous forme d'un groupe aminoalkyle (dérivé
de seconde génération) ou sous forme d'un hétérocycle avec un ou plusieurs atomes
d'azotes (dérivé de troisième génération).

28
 (A) Bisphosphonate Pyrophosphate
O O
R1 OH OH
P P
OH OH
C O
OH OH
R2 P P
OH OH
O O

(B)
O O O
OH OH OH
H3C P P P
OH H2N
OH OH
C C C
HO OH HO OH OH
P HO
P P
OH OH OH
O O N O
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Etidronate
Pamidronate Risédronate
O
OH O
Cl P OH
P O
OH
C OH
OH P
Cl OH H2N C N
P OH OH
HO N C
OH P
O OH HO OH
O P
OH
O
Clodronate Alendronate
O O
OH H3C OH Zolédronate
HO P P
N OH
OH
C C
Cl S OH HO OH
P P
OH OH
O O

CH3
Tiludronate Ibandronate

Figure I-7 : (A) Analogie structurale entre bisphosphonate et pyrophosphate;

(B) Classification des bisphosphonates basée sur leurs
mécanismes d'action biologique (Russell et al., 2007a).

29
 II-2-3- Mécanismes d'action
L'inhibition de minéralisation normale ou ectopique ainsi que la diminution de
la résorption osseuse sont les principaux effets des bisphosphonates. La
compréhension du mode d'action des bisphosphonates a fait de grand progrès, mais la
nature exacte de ces mécanismes n'est pas encore entièrement démêlée. Il se pourrait
bien que plusieurs mécanismes opèrent simultanément.
II-2-3-1- Inhibition des minéralisations (Calcification)
Comme le pyrophosphate, les bisphosphonates inhibent in vitro la formation,
l'agrégation et ralentissent aussi la dissolution des cristaux de phosphate de calcium
(Fleisch, 2003). Tous ces effets sont à mettre en relation avec l'affinité marquée de ces
composés pour le phosphate de calcium en phase solide, à la surface duquel ils
s'adsorbent fortement. Cette propriété est de grande importance parce que c'est la base
de l'utilisation de ces composés en tant que marqueurs du squelette en médecine
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nucléaire et la base de leur localisation sélective dans l'os quand ils sont utilisés
comme drogues (Fleisch, 2003).
De façon similaire, les bisphosphonates inhibent efficacement la calcification
normale ou ectopique in vivo (Fleisch et al., 1970). La dose nécessaire pour induire
ces effets est relativement importante et varie selon les sujets étudiés et la durée du
traitement. Par ailleurs, il existe une forte relation entre l'habilité des BPs a inhiber la
formation des phosphates de calcium in vitro et leur efficacité sur les calcifications
ectopiques in vivo. Cette relation suggère que l'effet inhibiteur in vivo peut être
expliqué par des mécanismes physico-chimiques (Fleisch, 1993).
II-2-3- 2-Résorption osseuse
A l’origine, par analogie avec leurs propriétés rencontrées in vitro, on pensait
que les bisphosphonates agissaient sur la résorption osseuse selon un effet inhibiteur
de la dissolution du cristal. Avec l’arrivée de nouveaux composés, il est devenu clair
que le pouvoir antirésorbant in vivo et in vitro de ces composés n’est pas seulement lié
à leur aptitude à inhiber la croissance et la dissolution du cristal in vitro (Shinoda et al.,
1983). Ceci est notamment illustré avec le cas du clodronate, qui en dépit d’une
moindre affinité pour l’os que l’étidronate, possède un pouvoir antirésorbant supérieur
(Russel et al., 1970). Ceci suggère donc que l’action antirésorbante des
bisphosphonates n’est pas uniquement due à des effets physico-chimiques et toutes les
données actuelles sont en faveur d’un mécanisme d’action cellulaire.
Le mécanisme d'action des bisphosphonates sur la résorption osseuse peut être
considéré (Fleisch, 2003) à quatre niveaux liés les uns aux autres : (i) inhibition du
recrutement des ostéoclastes, (ii) inhibition de l'adhésion des ostéoclastes à la matrice

30
 minéralisée, (iii) raccourcissement de la durée de vie des ostéoclastes à cause d'une
apoptose précoce et (iiii) inhibition de l'activité des ostéoclastes. Il est possible que les
bisphosphonates agissent aussi, au moins en partie, via d'autres cellules telles les
ostéoblastes. Il est admis que ces cellules ostéoblastiques contrôlent le recrutement et
l'activité des ostéoclastes. Cela rend très probable que les BPs induisent les
ostéoblastes à synthétiser un ou des inhibiteur(s) du recrutement des ostéoclastes et
donc de la résorption osseuse.
Etant donné l'étendue de leurs effets sur les cellules, les mécanismes d'action
cellulaire des BPs sur la résorption osseuse sont étroitement liés à leurs propriétés
structurales. Ainsi, les non-amino-bisphosphonates (tiludronate, étidronate,
clodronate…) s'incorporent dans l’ostéoclaste et aboutissent à la formation de
métabolites toxiques de l’adénosine triphosphate (ATP) (Van Beek et al., 2003); ces
espèces non hydrolysables, s’accumulent dans la cellule, l’inhibent puis la tuent
(Russell, 2007b). Cependant, les amino-bisphosphonates (pamidronate, alendronate,
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ibandronate, risédronate, zolédronate…) ne sont pas métabolisés (incorporés) dans

l’ostéoclaste mais agissent principalement en inhibant une enzyme de la biosynthèse
du mévalonate, la farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) (Van Beek et al., 2003).
Cette inhibition enzymatique empêche la prénylation et inhibe la fonction de petites
protéines régulatrices responsables de l’hydrolyse de la guanosine triphosphate (GTP)
(GTPases Ras, Rab, Rho et Rac), indispensable au processus de signalisation
intracellulaire. Ceci perturbe la fonction cellulaire, et désorganise notamment le
cytosquelette, fait disparaître la bordure en brosse, et aboutit à l’inactivation puis à
l’apoptose de l’ostéoclaste (Russell, 2007c).

31
 III- ADSORPTION AUX INTERFACES : CAS DE L'INTERFACE
SOLIDE-LIQUIDE

III-1- Enjeu de l'étude des processus d'adsorption

Les processus d'adsorption aux interfaces solide-liquide interviennent
directement dans différents domaines (biologie, géologie, minéralogie, procédés
industrielles,...). En chimie industrielle par exemple, les phénomènes d'adsorption
jouent un rôle fondamental dans les procédés associés à l'utilisation de catalyseurs
(Weiss et Rank, 2002). Les propriétés d'adsorption sont également à la base de
procédés de séparation solide-liquide par flottation (Vanthuyne et Maes, 2002) et du
développement des colonnes utilisées comme supports de séparation et purification des
molécules organiques par chromatographie (Gorbunoff, 1984).
Dans le domaine biomédical, la connaissance des mécanismes d'adsorption
contribue directement ou indirectement à mieux comprendre les processus de
biominéralisation. Il est bien admis, sur la base des différentes études, que la
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régulation du processus de minéralisation des tissus (initiation de minéralisation et/ou

croissance cristalline) est fortement contrôlée par des phénomènes d'adsorption
impliquant les molécules organiques présentes dans les tissus calcifiés (Glimcher et
Muir, 1984; Boskey, 1989b; Combes et Rey, 2002).
Au vu du contexte général de cette étude, il paraît évident que l'étude des
processus d'adsorption aux interfaces entre biomatériaux apatitiques et molécules
thérapeutiques ouvrirait la voie à de nouvelles stratégies de traitement local des
maladies osseuses. Les progrès réalisés dans la compréhension des mécanismes mis en
jeu dans l'interaction entre principes actifs et phosphate de calcium sont à la base de la
conception de matériaux bio-inorganiques à fonctionnalités élargies permettant la
libération contrôlée d'agents thérapeutiques et de facteurs de croissance.
Cette partie rappelle les principes généraux de l'adsorption et présente quelques
études réalisées dans ce domaine. Nous nous intéresserons particulièrement aux
travaux effectués sur l'interaction de molécules biologiques et à visées thérapeutiques
avec des phosphates de calcium synthétiques.

III-2- Adsorption
L'adsorption est la rétention d'un composé à une interface liquide-gaz, liquide-
liquide, solide-gaz ou liquide-solide. D'une manière générale, elle est définie comme
une accumulation de molécules d'un gaz ou d'un soluté (adsorbat) qui se produit au
contact d'une surface d'un adsorbant (Barroug, 1989).
On distingue principalement deux types d'adsorption qui diffèrent par les
chaleurs de réaction mises en jeu:

32
 - Adsorption physique (ou physisorption), où les molécules d'adsorbat sont liées
à l'adsorbant par des forces de Van der Waals. La chaleur de réaction est faible (2 à 5
kcal/mol). La nature chimique des molécules physisorbées ne subit pas des
modifications notables par rapport à celle à l'état gazeux ou à l'état liquide. En général,
ce processus d'adsorption est rapide et réversible.
- Adsorption chimique (ou chimisorption), où une véritable réaction chimique a
lieu entre l'adsorbant et l'adsorbat. Les chaleurs de réaction sont beaucoup plus
importantes; elles peuvent atteindre plusieurs centaines de kilocalories. Dans ce cas, la
structure moléculaire de l'adsorbat est fortement modifiée.
Notons que certains modes d'interaction adsorbant-adsorbat échappent à ces
deux types d'adsorption. Elles correspondent à des énergies d'adsorption
intermédiaires: c'est le cas par exemple des liaisons assurées par un transfert de charge
entre les molécules adsorbées et la surface de l'adsorbant.
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Ces différents types d'adsorption ne s'excluent pas mutuellement et on peut

trouver plusieurs types de liaison pour un système adsorbant-adsorbat donné.
III-2-1- Lois d'adsorption
Plusieurs types d'isothermes d'adsorption (expressions mathématiques) ont été
développés pour décrire les courbes expérimentales de la quantité en éléments
adsorbées en fonction de la concentration en solution à l'équilibre. Nous nous
proposons de décrire brièvement les isothermes les plus couramment rencontrées dans
le cas de l'adsorption solide-solution (Barroug, 1989; Rill et al., 2009).
III-2-1-1- Isotherme de Gibbs
Selon Gibbs l'adsorption consiste en une modification de la tension interfaciale
solide-liquide. La loi d'adsorption repose uniquement sur des considérations
thermodynamiques: elle ne suppose pas la présence des centres d'adsorption à la
surface du solide, ni des propriétés particulières du film adsorbé. La relation générale
de l'isotherme d'adsorption de Gibbs est donnée par l'équation:
C ∂γ
Q=− ⋅
RT ∂C
Q désigne la quantité d'adsorbat adsorbée par unité de surface, C la
concentration de l'adsorbat à l'équilibre et γ la tension interfaciale. R et T
correspondent respectivement à la constante des gaz parfaits et la température.

33
 III-2-1-2- Isotherme de Langmuir
Cette loi suppose que le phénomène d'adsorption peut être considéré comme
une réaction équilibrée entre un centre actif de la surface de l'adsorbant et une
molécule de l'adsorbat. Le modèle de Langmuir repose sur les hypothèses suivantes:
Tous les sites d'adsorption possèdent la même énergie.
Formation d'une monocouche à la surface.
Les interactions entre molécules adsorbées à la surface sont négligeables.
L'équation caractéristique de cette réaction d'équilibre ainsi obtenue s'écrit:
KNC
Q=
1 + KC
Q: Quantité d'adsorbat fixée par unité de surface de l'adsorbant (µmol/m²).
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C: Concentration de l'adsorbat à l'équilibre dans la solution (µmol/L).

N: Nombre maximum de sites d'adsorption par unité de surface (µmol/m²).
K: Constante d'affinité de l'adsorbat pour la surface de l'adsorbant (L/µmol).
Les paramètres caractéristiques d'adsorption, K et N, sont obtenus à partir de
l’équation de Langmuir linéarisée sous l'une des formes suivantes:
1 1 1 C C 1 Q
= + ; = + ; Q=N−
Q KNC N Q N KN KC

III-2-1-3- Isotherme de Freundlich

La loi de Freundlich s'applique le plus souvent lorsque la quantité adsorbée est
très faible. L'équation caractéristique de cette loi s'écrit :

Q = aC m
Où Q est la quantité de l'élément adsorbée à la surface de l'adsorbant et C la
concentration de l'adsorbat dans la solution; a représente l'affinité de l'adsorbat pour la
surface de l'adsorbant et m (<1) une constante. Les paramètres caractéristiques a et m
sont généralement déterminés à partir de la forme logarithmique de l'équation:

log Q = log a + m ⋅ log C

34
 III-2-1-4- Isothermes de Langmuir-Freundlich et Tòth
Ces modèles (Langmuir-Freundlich et Tòth) dérivent de celui de Langmuir et
prennent en compte l'hétérogénéité de surface des sites d'adsorption. Les équations
caractéristiques de ces lois considèrent une distribution gaussiènne de l'énergie de
surface et s'expriment par les formules suivantes:

N (KC) n
Langmuir-Freundlich
Q=
1 + (KC) n
1/ n
⎡ (KC) n ⎤
Q = N⎢ n ⎥
⎣1 + (KC) ⎦
Tòth

où n représente le paramètre de l'hétérogénéité de surface.

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III-2-1-5- Isotherme BET

La théorie de Brunauer, Emmet et Teller (BET) est une extension de la loi de
Langmuir (adsorption d'une monocouche); elle repose sur l'adsorption physique en
multicouches. Cette loi peut être exprimée par l'équation suivante:
P
P0 1 C -1 P
= +( ⋅ )
P Vm C Vm C P0
Vads (1 − )
P0
P : pression à l'équilibre;
Po : Pression de vapeur saturante de l'adsorbat à la température de l'expérience;
P/Po: Pressions relative;
Vads : Volume adsorbé à l'équilibre sous la pression P;
Vm : Volume d'adsorbant nécessaire à la formation d'une monocouche;
C : Constante liée aux caractéristiques thermodynamiques du système
gaz-solide.
La relation de BET présente un intérêt pratique important car elle est utilisée
pour déterminer les aires spécifiques externes des minéraux. En fait, l'équation de BET
correspond à l'équation d'une droite de type y = ax + b :
1 (C - 1)
b= l'ordonnée à l'origine et a = la pente de la droite
CVm CVm

35
 A partir de ces équations on peut déduire les valeurs des paramètres Vm et C :
1 1+ b
Vm = et C=
(a + b) a

Connaissant Vm(cm3) on peut calculer la surface spécifique de l'échantillon:

1 V
S= ⋅ N ⋅as ⋅ m
m VM
m : Masse de l'échantillon après séchage (g).
N : Constante d'Avogadro.
as : Aire effective occupée par une molécule de l'adsorbat m².
VM : Volume molaire de l'adsorbat cm3.
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III-3- Eude expérimentale d'adsorption

III-3-1- Cinétique d'adsorption
L'étude cinétique du processus d'adsorption a fait l'objet de nombreux travaux.
Généralement la durée de contact nécessaire pour atteindre l'équilibre pour les
composés phosphocalciques est de quelques minutes à 2 heures. C'est le cas de
l’interaction entre l'hydroxyapatite et divers adsorbats tels les acides aminés (Misra,
1997, Benaziz, 2002), l'ion acétate (Barroug et al., 1985), l'acide citrique (Misra,
1996), les citrates et phosphocitrates (Johnosson et al.,1991), les polyphosphonates
(Rawls et al., 1982) et les protéines (Barroug, 1989; Shimabayashi et al., 1991; Suzuki
et al., 1995; Ouizat, 2000). Ces cinétiques rapides ont aussi été notées lors de
l'adsorption de bisphosphonates par des phosphates de calcium (Classens et Kolar,
1999. Roussière et al., 2005; Nancollas et al., 2006).
Des cinétiques relativement lentes (18 à 75 heures) ont par ailleurs été
rapportées pour l'adsorption par des apatites phosphocalciques de la glycine (Barroug
et al., 1985), la catalase (Barroug et al., 1998), l'acide polyacrylique (Misra, 1991a) et
quelques protéines salivaires (Kambara et Norde, 1995).
Notons toutefois que, dans le cas des apatites, les cinétiques d'adsorption
peuvent changer avec la composition et la nature du milieu (présence d’ions minéraux,
pH…). En effet, la présence en solution d'ions calcium ou phosphate ralentit ou
accélère le processus d'adsorption selon le pH et le caractère acido-basique de la
molécule. Ainsi, les ions phosphate réduisent la vitesse d'adsorption de
macromolécules acides, alors que les ions calcium ont un effet inverse (Barroug et al.,
1998 et 2008). Par ailleurs, la variation du pH du milieu modifie la composition

36
 chimique de surface de l'adsorbant et de l'adsorbat et donne lieu à des conditions dans
lesquelles les partenaires peuvent être de même signe de charge (cinétique lente) ou de
charge opposées (cinétique rapide).
III-3-2-Isothermes d'adsorption
Le processus d'adsorption de molécules d'intérêt biologique par les apatites
phosphocalciques est généralement décrit par des isothermes de type Langmuir. C'est
le cas des molécules présentant divers groupements fonctionnels actifs tels les acides
aminées (Misra, 1997; Benaziz, 2002), des principes actifs (Misra, 1991b; Barroug et
al., 2004; Vitha et al., 2008) et des protéines (Ouizat, 2000; Barroug et al., 1998). Le
même type d'isotherme a aussi été noté pour la rétention de macromolécules par des
supports de caractéristiques diverses (Norde et Haynes, 1995).
Dans le cas où l'adsorption est faible, les observations expérimentales suivent
généralement la loi de Freundlich. C’est le cas de la fixation de la serine (Benaziz et
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al., 2001), d’ions acétate (Barroug, 1982) et du cisplatine (Barroug et Glimcher, 2002)
par des apatites phosphocalciques.
Enfin, notons que dans certains cas, les isothermes d'adsorption présentent des
formes relativement complexes et ne s'attachent pas à un type simple (Voegel et Frank,
1981; Misra, 1991b; Embery et al., 1998). Ces formes font souvent état de la
multiplicité de mécanismes intervenant à la surface de l'adsorbant (adsorption en
multicouches; précipitation de surface…) et dépendent fortement de la concentration
en molécules d'adsorbat. C'est le cas par exemple des isothermes à paliers et sigmoïdal
observé pour l'adsorption d'acides aminés, protéines, acides phosphoniques et
antibiotiques par des supports apatitiques (Cho et al., 1984; Govers et al., 1994;
D'Andrea et Fadeev, 2003). D'autres études menées sur l'adsorption par HA de la
phosphoserine et du pamidronate ont observé, pour les grandes concentrations, une
partie ascendante qui se manifeste après le palier de saturation (Misra, 1997;
Schüessele, 2007). Dans ce cas les auteurs suggèrent la formation à la surface du
minéral d'agrégats impliquant les ions minéraux du support (en particulier le calcium)
et les molécules d'adsorbats.
III-3-3- Réversibilité du processus
Un processus d'adsorption est dit réversible si la déviation par rapport à
l'équilibre initialement établi est tellement petite que les variables caractérisant l'état
du système passent par les mêmes valeurs dans le sens inverse du processus (Norde et
Haynes, 1995).
Le terme de "réversibilité" ne se réfère pas toujours au même phénomène et les
résultats présentés dans la littérature paraissent parfois contradictoires. En effet la

37
 procédure expérimentale peut être examinée de différentes manières : simple dilution
de la teneur en adsorbat à l’équilibre, modification de la composition de la solution
suite à l’ajout d’électrolytes actifs, variation du pH du milieu (Barroug, 1982). En
outre, il est bien admis que le processus est fortement dépendant des caractéristiques
physicochimiques du système adsorbant-adsorbat (Norde et al., 1986): nature de la
surface de l'adsorbant, température, durée de contact, stabilité conformationnelle de
l'adsorbat....
Le processus d'adsorption peut être selon les cas, totalement réversible, semi-
réversible ou irréversible. Ainsi, l'adsorption du lyzozyme par l'hydroxyapatite est
totalement réversible vis-à-vis de la dilution (Barroug et al., 1989), alors que le
processus devient semi réversible lorsque la protéine est chimiquement modifiée
(Barroug et al., 1997). Cette différence a été attribuée par les auteurs aux types
d'interactions mis en jeu lors de la rétention de la protéine; ces interactions sont
purement électrostatiques dans le premier cas et hydrophobes dans le second.
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L’interaction de la catalase avec le support HA est totalement irréversible vis-à-vis de

la dilution ou d'ajout d'ions phosphate dans le milieu (Barroug et al., 1998); le
changement conformationnel de la protéine dans ce cas, suite à sa fixation (perte
d’activité), maximise le contact et stabilise ainsi la protéine à la surface du solide.
L'adsorption de complexes de terbium de ligands possédant des groupements
phosphonate (Tb-DOTP) par HA est semi réversible vis-à-vis de la dilution (Rill et al.,
2009). L’irréversibilité de ces espèces est essentiellement due à la nature des
interactions établies entre groupements phosphonate des molécules d'adsorbat et ions
calcium de la surface de l'apatite.
L'étude de l'adsorption de molécules simples par des apatites phosphocalciques
apatitiques a montré que le phénomène est réversible vis-à-vis de la dilution pour l'ion
acétate, alors que la glycine se fixe de manière irréversible (Barroug et al., 1985). Des
résultats similaires ont été rapportés pour le cisplatine (Barroug et Glimcher, 2002);
cependant, une libération des molécules fixées a été observé après l'ajout des ions
chlorure dans le milieu d'incubation. L'irréversibilité du processus d'adsorption pour
les acides aminés tels la phosphoserine et la serine atteste de la forte interaction mise
en jeu à la surface de l'apatite phosphocalcique (Benaziz, 2002).
La désorption dépend aussi du taux de recouvrement de la surface de
l'adsorbant. Beissinger et Leonard (1981) ont rapporté que la désorption par dilution
est plus importante lorsqu'on atteint le plateau d'adsorption qui indique la saturation de
la surface du solide. Par ailleurs, l'adsorption de l'albumine de sérum humain par HA a
été décrite comme irréversible vis-à-vis de la dilution et semi réversible vis-à-vis du
pH (Hlady et Füredi-Milhofer, 1979).

38
 III-3-4- Paramètres impliqués dans le processus d'adsorption
Les interactions mises en jeu à l'interface du système adsorbant-adsorbat sont
étroitement liées à la fois à la nature du milieu d'incubation (pH, force ionique,
température, concentration en ions actifs…) et aux propriétés physico-chimiques du
solide (composition chimique, cristallinité, texture de surface,….).
III-3-4-1-Influence du pH
Ce paramètre semble très influent sur les mécanismes d'adsorption et plus
particulièrement d’espèces ioniques. Il fixe, d'une part, le degré d'ionisation des
groupements fonctionnels acide ou basique des adsorbats et contrôle par conséquent la
spéciation en solution et modifie, d'autre part, la charge de surface du support tels les
phosphates de calcium.
Il a été rapporté dans de nombreuses études (Barroug et al., 1989 et 1997;
Lo'pez-Macipe et al., 1998) que selon la nature du système adsorbant-adsorbat et les
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conditions expérimentales adoptées, la variation du pH du milieu d’incubation favorise

la rétention lorsque les partenaires sont de charges opposées (attraction
électrostatiques) et montre un effet inverse lorsqu’ils sont de même signe de charge
(répulsions électrostatiques).
La variation du pH du milieu d'incubation affecte également le caractère
hydrophobe ou hydrophile de la surface de l'adsorbat (Sharpe et al., 1997). En effet,
l'affinité et la quantité de protéines adsorbées (ribonucléase, lysozyme et α-
lactalbumine) diminuent fortement avec l'augmentation du pH pour des adsorbants
hydrophiles. Ces paramètres restent cependant inchangés pour des supports
hydrophobes.
III-3-4-2-Influence de la force ionique
La force ionique peut intervenir dans le processus d'adsorption de différentes
façons (Barroug, 1989):
- Elle exerce un effet écran sur la charge de surface du support et sur celle des
molécules protéiques et affecte ainsi l'interaction entre adsorbant-adsorbat, d'une part,
et entre molécules d'adsorbat, d'autre part.
- Elle peut affecter la stabilité conformationnelle de molécules protéiques;
- Elle peut aussi intervenir par l'adsorption simultanée de molécules d'adsorbat
et d'ions électrolytes.
- Elle peut intervenir par la formation de paires d'ions qui diminuent la
concentration en molécule libre du milieu.

39
 Les résultats rapportés dans la littérature sur l'effet de la force ionique
paraissent parfois contradictoires et dépendent des conditions expérimentales adoptées.
Ainsi, l'augmentation de la teneur de chlorure de sodium dans le milieu d'adsorption
conduit à une diminution de la quantité d'albumine de sérum bovin fixée à la surface
de HA (Shimabayashi et al., 1991). Cependant, des études réalisées sur la même
protéine ont montré que l’élévation de la force ionique par ajout de NaCl dans le
milieu conduit à une légère augmentation des quantités adsorbées à la saturation,
accompagnée d'une diminution de l'affinité (Wassell et al., 1995). Une tendance
similaire a été également notée pour l'adsorption d'acides aminés par HA (Benaziz,
2002). Par ailleurs, la fixation de l'albumine de sérum humain par HA est indépendante
de la force ionique (Aptel et al., 1988). Les mêmes observations ont été notées pour la
rétention du lysozyme par HA, avec toutefois une diminution de la constante d'affinité
(Barroug et al., 1989).
III-3-4-3- Influence de la teneur en ions minéraux
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L’ajout d’ions minéraux constituant le réseau apatitique dans le milieu

d’incubation modifie considérablement les propriétés de l’interface entre ces
matériaux et leur environnement. Le rôle des ions phosphate et calcium est
généralement décrit dans la littérature en termes d’ions déterminant du potentiel et
l’adsorption est discutée en terme de phénomènes purement électrocinétiques (Mishra
et al., 1980; Somasundaran et Wang, 1984; Amankonah et Somasundran, 1985).
Cependant, cette approche ne peut expliquer la fixation d’espèces par des supports
présentant le même signe de charge et ne prend pas en compte les interactions
spécifiques impliquant la charge locale des sites d'adsorption ainsi que le degré
d'ionisations des groupements fonctionnels des molécules d'adsorbats. Ainsi, la
fixation de molécules anioniques telle la catalase à la surface de HA a lieu bien que les
partenaires soient tous les deux négativement chargés et se traduit par une mise en
solution d’ions phosphates (Barroug et al., 1998).
Il est bien admis que les ions phosphate présentent une grande affinité pour la
surface du minéral apatitique et inhibent par conséquent la fixation de molécules
anioniques, suite à leur compétition pour les sites actifs à la surface du minéral. Par
ailleurs, les ions phosphate sont utilisés en chromatographie en phase liquide pour
éluer les espèces anioniques.
Les observations expérimentales relatives à l’influence des ions phosphate dans
l’adsorption et inversement, traduisent l’existence d’une réaction d’échange
impliquant les molécules d’adsorbats de la solution et les ions phosphate de la surface
du minéral apatitique (Barroug et al., 1998 et 2008).

40
 Peu d’études ont reporté sur le rôle des ions calcium sur l’adsorption et leur
phénomène reste mal élucidé. Pour des teneurs relativement importantes, ces ions
peuvent donner lieu en présence d’adsorbats anioniques à des complexes solubles
et/ou insolubles: c’est par exemple le cas de BSA (Shimabayashi et al., 1991), et de
polyphosphonates (Rawls et al., 1982).
III-3-4-4- Influence de la température
La plupart des études d'adsorption par des supports phosphocalciques ont été
effectuées à température ambiante (entre 20 et 25°C) ou à température physiologique;
c’est notamment le cas de bisphosphonates (Vitha et al., 2008), de protéines (Barroug,
1989; Ouizat et al 1999), d'acides aminés (Moreno et al., 1984; Benaziz et al., 2001),
et d'agents anticancéreux (Lebugle et al., 2002; Barroug et al., 2004). Cependant peu
d'études ont été consacrées à l'effet de la température sur les phénomènes intervenant à
l'interface entre adsorbant et adsorbat.
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Rill et al. (2009) ont montré que la quantité de complexes de terbium de ligand
phosphonique (Tb-BPPED) adsorbée à la saturation augmente d’environ 70 % lorsque
la température passe de 20 à 37°C. Ceci a été attribué essentiellement à la
déshydratation des molécules d'adsorbat ainsi qu'au déplacement des molécules d'eau
de la surface de l'apatite ce qui favorise les interactions hydrophobes entre adsorbant et
adsorbat. Le processus a été décrit comme étant endothermique. Le même effet a été
noté pour l’interaction de supports phosphocalciques avec des complexes de
lanthanide de bisphosphonates (Alves et al., 2003) et du cisplatine (Barroug et al.,
2004). Cependant, l'adsorption du carboxymethylcellulose par HA n'est pas affectée
par la variation de la température de 0 à 55°C (Areas et Galembek, 1991).
L’élévation de la capacité de rétention avec la température a été attribuée à
l'influence de ce paramètre sur la vitesse d'équilibre entre adsorbant et adsorbat ou sur
l'équilibre lui-même (Jung et al., 1973). Dans le cas de protéines, la température
semble induire en outre des changements structuraux ; ceci explique les valeurs
positives des variations d’enthalpies (ΔH > 0) notées pour l'adsorption de
phosphoprotéines par HA (Moreno et al., 1982). Des observations similaires ont été
rapportées pour la fixation de l'ADN (Chen et al., 2007) et du peroxydiphosphate
(Shimabayashi et al., 1982) par la surface de HA.

41
 III-3-4-5- Influence des propriétés physicochimiques du support
Les caractéristiques microstructurales des supports (cristallinité, morphologie,
porosité, faciès cristallin, taille des cristallites et par conséquent la surface spécifique)
sont aussi des paramètres à prendre en considération dans leur réactivité de surface.
Ces propriétés microstructurales sont intiment liées aux conditions de synthèse de ces
matériaux, à savoir : composition des solutions réactants, pH, température, durée de
précipitation, maturation, conditions de synthèse…
La capacité de rétention d'albumine de sérum bovin (BSA) par des apatites de
rapports atomiques (Ca/P) proches est plus importante lorsque les cristallites sont de
grandes dimensions (Kandori et al., 1995a et 1995b): ainsi, la quantité fixée à la
saturation par des cristaux de 84 nm de longueur (97mg/g) est environ le double que
celle notée pour les cristallites de 37 nm (97mg/g). En fait, les cristallites de HA
allongés selon l’axe c développent une proportion importante en faces (100), riche en
sites calcium, favorable à la fixation de protéines acides. L'adsorption préférentielle
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sur les faces (100) a également été observée dans le cas de phosphoserine,
proteoglycanes, ostonectine et Gla-protéines (Fujisawa et Kuboki, 1991). Cependant,
les protéines basiques s'adsorbent sur les sites associés aux ions phosphate dans les
faces (001) (Kawazaki et al., 1990; Kandori et al., 2002).
La composition chimique des apatites affecte considérablement les propriétés
physico-chimiques de ces matériaux, et influe par conséquent sur leurs propriétés
d'adsorption.
Les diverses substitutions qu'offre la structure apatitique influent
considérablement sur la réactivité de ces matériaux. Ainsi, la substitution calcium-
strontium dans le réseau cristallin de HA fait croître sa capacité de rétention des
molécules de BSA (Kandori et al., 1995c). Le même effet a été noté pour l'adsorption
du sulfure d'hydrogène par une HA dans laquelle le calcium a été substitué au nickel
(Cherif, 1993). L'introduction d'ions hydrogénophosphate et magnésium dans le réseau
apatitique favorise également l'adsorption de la BSA (Ouizat, 2000). Cependant, la
présence des ions carbonate dans la structure des apatites défavorise l'adsorption de la
BSA (Kandori, 1995b).
Dans le cas des ions fluorure, plusieurs controverses ont été rapportées dans la
littérature quand à l'influence de ces ions sur les propriétés d'adsorption des apatites.
L'adsorption de protéines de la dentine augmente avec le degré de fluoration de HA
(Tanabe et al., 1988). De même, la capacité de rétention de la BSA est plus importante
pour la fluroapatite (FA), comparée au support de référence HA. Cependant, aucune
variation significative de ces paramètres n'a été observée pour la même protéine suite à

42
 la présence d'ions fluorure dans la structure de HA (Moreno et al., 1978) et pour les
quantités de protéines salivaires retenues par HA et FA (Mandel et Concool, 1975).
Par ailleurs, Il a été noté que le taux fixé de phosposerine et de serine est plus
grand quand l'apatite est déficiente en calcium (Benaziz, 2002). Des observations
similaires ont été notées pour l'adsorption du lysozyme par des apatites présentant
différents degrés de déficience en calcium (Barroug, 1989).
L’indice de cristallinité est également important dans la réactivité des
phosphates de calcium. Ainsi la fixation d’alendronate (Palazzo et al., 2007), de
cisplatine (Barroug et al., 2004), de BSA (Ouizat et al., 1999), de phosphoserine et
serine (Benaziz, 2002) se fait en quantité relativement importante pour les supports de
basse cristallinité, comparés aux supports mieux cristallisés. La grande réactivité dans
le premier cas a été attribuée à l’existence d’environnements labiles et facilement
échangeables à la surface des cristaux qui les constituent.
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L'évolution en solution des apatites nanocristallines modifie les propriétés

microstructurales (cristallinité, dimensions des cristallites, surface spécifique) de ces
matériaux et par conséquent leurs propriétés d'adsorption (Hina, 1996). En effet, les
apatites présentant le plus faible temps de maturation présentent une capacité de
rétention de la BSA supérieure (Ouizat et al., 1999; Benaziz, 2002). Cet effet a été
relié à la présence d'une couche hydratée instable et riche en ions labiles, donnant aux
nanoapatites leur forte réactivité de surface. Il a été montré également que l'adsorption
de protéines tels le VEGF et le FGF est largement accrue pour des apatites possédant à
leur surface une grande quantité d'ions labiles comparée aux poudres d'HA bien
cristallisé (Midy et al., 1998 et 2001).
III-3-5- Mécanismes d'adsorption
L'adsorption de biomolécules par les surfaces apatitiques est le résultat de
différents types d'interactions dans lesquelles plusieurs paramètres expérimentaux
doivent être pris en considération. Les caractéristiques du support (texture,
microstructure, densité de charge, hydrophobicité, composition chimique,…), de la
solution (pH, température, composition chimique), ainsi que les propriétés intrinsèques
de l'adsorbat (pie, conformation, hydrophobicité, dimension, stabilité,…) sont des
facteurs largement discutées pour élucider les mécanismes d'adsorption (Barroug,
1989; Barroug et al., 1997; Misra, 1997; Barroug et al., 1998; Ouizat et al., 1999;
Benaziz, 2002; Barroug et al., 2008; Al-Kattan et al., 2010).
Les mécanismes qui gouvernent les phénomènes à l'interface apatite-
biomolécule restent mal élucidés et divers modes d'adsorption ont été proposés
(Norde et Haynes, 1995; Josse, 2003; Chen et al., 2007, Jouillard et al., 2010).

43
 - Interactions coulombiennes adsorbant-adsorbat ;
- Déshydratation de la partie hydrophobe de la surface du support et/ou des
molécules d'adsorbat (interactions hydrophobes) ;
- Réaction d’échange ionique entre ions minéraux de la surface et groupements
fonctionnels de l'adsorbat;
- Dissolution du minéral;
- Réaction de complexation et/ou précipitation.
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44
 Chapitre II
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SYNTHESE ET CARACTERISATION
DE PHOSPHATES DE CALCIUM
&
DE SELS DE RISEDRONATE DE
CALCIUM
 Partie A
Synthèse et caractérisation des phosphates de calcium

I- INTRODUCTION
Les minéralisations des tissus calcifiés des vertébrés (os et dents) sont
constituées de cristaux phosphocalciques de structure apatitique. Le mauvais état de
cristallisation, les dimensions nanométriques des cristaux (à l'exception de l'émail
dentaire), et leur étroite association avec la matrice organique rendent cependant
difficile l'étude de la réactivité du minéral osseux dans le milieu naturel et ouvrent
souvent la voie à des interprétations faiblement étayées. La plupart des progrès réalisés
dans la connaissance des minéralisations biologiques ont eu pour moteur l'étude des
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analogues de synthèse. Ces apatites synthétiques se révèlent en outre indispensables

pour l’étude des différents processus liés aux propriétés des apatites naturelles et leur
réactivité vis-à-vis du milieu environnant (Hina, 1996).
Les méthodes de préparation des apatites phosphocalciques peuvent être
subdivisées en deux groupes (Elliott, 1994):
- La voie sèche qui met en jeu des réactions à haute température entre composés
solides,
- La voie humide qui se caractérise par l’utilisation de solvants. Cette procédure
englobe : (1) synthèse hydrothermale, (2) procédé sol-gel, (3) neutralisation de l’acide
phosphorique par la chaux, et (4) synthèse par double décomposition.
Pour la préparation de nos échantillons, nous avons utilisé la méthode double
décomposition en milieu aqueux. Cette méthode est largement employée pour
l’élaboration d'apatites phosphocalciques utilisées notamment comme biomatériaux
orthopédiques et également des apatites de basse cristallinité qui s’apparentent au
minéral osseux. Elle offre l’avantage (Barroug, 1989) de permettre le contrôle des
différents paramètres physico-chimiques qui déterminent les caractéristiques
structurales, morphologiques et superficielles des composés apatitiques: (pH des
solutions, température, vitesse de précipitation, concentrations des sels de départ,
rapport solution/solide, durée de précipitation, conditions de lavage et de séchage); en
outre, cette méthode donne lieu à des solides de composition connue.
Les caractéristiques physico-chimiques des apatites influent considérablement
sur les propriétés interfaciales de ces matériaux (Barroug, 1989; Ouizat, 2000). En

45
 outre, une interprétation précise des phénomènes se produisant à l’interface solution-
solide nécessite une bonne connaissance des propriétés texturales et superficielles des
adsorbants. Il nous a donc paru important d’une part, de décrire de façon détaillée la
méthode de préparation de nos échantillons, et de préciser d’autre part, les
caractéristiques de chaque support utilisé dans la suite de cette étude.
Dans le présent chapitre nous décrivons l’élaboration et la caractérisation
d’apatites phosphocalciques impliquées dans l’élaboration de biomatériaux:
- Hydroxyapatite: stœchiométrique et bien cristallisée, ce matériau est considéré
comme prototype minéral des os et des dents et entre dans la composition des
biomatériaux les plus utilisés (Aoki, 1994; Dorozhkin and Epple, 2002).
- Apatites nanocristallines: non-stoechiométriques et mal cristallisées, ces
composés se caractérisent par une composition et une structure similaire au minéral
osseux. Ces supports jouent un rôle primordial dans les phénomènes de
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biominéralisation et sont utilisées comme biominéraux bioactifs destinés aux

applications orthopédiques (Rey et al., 2007b). Le processus de maturation de ces
composés a été examiné.
- Phosphates octocalciques apatitiques: de composition chimique proche de
celle du phosphate octocalcique triclinique, ces composés, en raison de leur aptitude
remarquable à la compaction, sont utilisés comme support de médicaments
implantables à libération retardée (Lebugle et al., 2002).

46
 II- HYDROXYAPATITE STOECHIOMETRIQUE

II-1- Synthèse
Le composé stœchiométrique (HA) a été préparé selon la méthode de double
décomposition; celle-ci consiste à effectuer, à température voisine de 90°C, une
précipitation relativement lente (3 heures ) en milieu basique entre une solution de
nitrate de calcium et une solution de phosphate d'ammonium (Trombe, 1972). La
composition des solutions a été choisie à partir des coefficients stœchiométriques
correspondant à l'équation suivante:
10 Ca(NO3)2 + 6 (NH4)2HPO4 + 8 NH4OH → Ca10(PO4)6(OH)2 + 20 NH4NO3 + 6 H2O
La composition des solutions réactant est la suivante :
- Solution cationique : 262,3 g (1,11 mol) de nitrate de calcium Ca(NO3)2,4H2O
sont dissous dans 1100 ml d'eau permutée décarbonatée.
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- Solution anionique : 88 g (0,66 mol) d'hydrogénophosphate diammonique

(NH4)2HPO4 sont dissous dans 433 ml d'eau permutée décarbonatée.
La solution cationique a été portée à ébullition puis additionnée de 80 ml
d'ammoniaque concentré (d = 0,91). La solution anionique a été ensuite ajoutée goutte
à goutte à l'aide d'une pompe péristaltique pendant 3 heures, avec une vitesse
d'agitation maintenue constante à 150 tr.min-1. La présence d'ammoniaque en excès est
nécessaire pour maintenir le milieu basique (pH = 9). Une fois la préparation terminée,
le mélange est maintenue à ébullition et sous agitation pendant une demi-heure.
Le précipité obtenu est filtré à chaud sur büchner puis lavé abondamment par de
l'eau permutée décarbonatée. Il est ensuite congelé puis lyophilisé pendant 3 jours.

II-2- Caractérisation
II-2-1- Diffraction des rayons X
Le diagramme de DRX du précipité préparé dans les conditions de synthèse
examinées (Figure II-1) montre des raies fines et résolues, caractéristiques d'une
apatite bien cristallisée. Le solide préparé est minéralogiquement pur; en effet, aucune
phase étrangère autre que l'apatite n'a été décelée. Les dimensions apparentes des
cristallites ont été obtenues à partir de la relation de Scherrer (1918). Les mesures ont
été réalisées sur les raies qui permettent de déterminer les dimensions apparentes des
cristaux suivant deux axes perpendiculaires : l'axe c de la maille hexagonale (002) et
un plan perpendiculaire (310). Les valeurs obtenues pour les deux raies examinées
(002) et (310) sont respectivement 574 et 275 Å. Ces valeurs montrent que les cristaux
de HA sont allongés selon l'axe c (L(002)> L(310)).

47
 II-2-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier (IRTF)
La figure II-2 présente le spectre IR de l'apatite synthétisée. Les attributions
ainsi que les intensités relatives des bandes de vibrations observées sont consignées
dans le tableau II-1.
On note la présence de bandes attribuables à des molécules d’eau (vers 3500
cm ), des ions hydroxyle OH- (630 et 3570 cm-1) ainsi que des bandes dues aux
-1

vibrations des groupements phosphate PO43- (vers 1000-1100 cm-1 et 560 et 600 cm-1)
caractéristiques d’environnements apatitiques. On observe également une bande de
faible intensité à 875 cm-1 ainsi que deux épaulements vers 1140 et 1230 cm-1,
correspondant à des groupements hydrogénophosphate HPO 24− ; la présence de ces
espèces en faible quantité, substituées aux groupements PO 34− , atteste que l’apatite
préparée est légèrement sous stoechiométrique.
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48
 Tableau II-1: Positions et intensités des bandes IR de HA (m: moyenne; f: faible
ép: épaulement ; F : forte ; l: large).

Position (cm-1) et intensité Attributions

des bandes IR

3000-3400 (m) Elongation symétrique et antisymétrique des

molécules d'eau

3570 (ép) Elongation symétrique des ions OH- mode νS

1630 (f) Déformation des molécules d'eau

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1087 (F,l) Elongation antisymétrique des ions PO 34− mode

1046 (F,l) ν3 (F2)

962 (m) Elongation symétrique des ions PO 34−

mode ν1 (A1)
875 (f) Elongation P-OH des groupements HPO 24−
633 (F) Libration ν des OH-
571 (F) Déformation antisymétrique des ions PO 34− mode
601 (F) ν4 (F2)

474 (f) Déformation symétrique des ions PO 34−

mode ν2 (E)

49
 (211)
(112)
(002)

(300)

(213)
(202)

(222)

(004)
(310)

(321)
(102)
(210)

(312)
(200)
(111)

(410)
(402)
(212)
(301)
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20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

2θ (degrés)
Figure II-1: Diagramme de diffraction de rayons X de HA.

ν3PO4

ν4PO4
ν1PO4

OH OH
H 2O
HPO4

H 2O
NO3

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II-2: Spectre Infrarouge de HA.

50
 II-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman
Le spectre Raman réalisé sur la poudre de l’échantillon préparé présente des
modes de vibrations typiques d'une hydroxyapatite stœchiométrique (Figure II-3). Les
bandes dans les domaines 430-450, 570-629 et 1020-1080 cm-1 correspondent
respectivement aux modes ν2 PO4, ν4 PO4 et ν3 PO4 des groupements phosphate de
l'apatite. La bande la plus intense à 964cm-1 est assignée à ν1 PO4.
II-2-4- Spectroscopie RMN de l'état solide ( 1H SPE-MAS et 31P SPE-MAS)
Les mesures de RMN du 1H du 31P en impulsion unique (SPE: Single Pulse
Excitation) et polarisation croisée (CP : Cross Polarization) 1H→31P et 1H→13C,
combinées à la rotation à l’angle magique (MAS: Magic Angle Spinning) et au
découplage haute puissance des 1H, ont été réalisées respectivement à 500,13 et 202,47
MHz à l'aide d'un spectromètre Bruker ASX 500 opérant dans un champ magnétique
de 11.7 T. Les rotors utilisés sont de zirconium (∅ = 4 mm) et la vitesse de rotation
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MAS est comprise entre 12 et 14 kHz selon les échantillons. La durée entre chaque
accumulation (D1) est de 10 s pour le 1H, 350 s pour le 31P et 100 s pour le 13C en
accord avec les temps de relaxation spin réseau respectifs de ces spins.
Les déplacements chimiques sont référencés par rapport au tétraméthylesilane
(TMS) pour le 1H et à l’acide phosphorique à 85 % (H3PO4) pour le 31P.
Les spectres 1H SPE-MAS et 31P 1H SPE-MAS obtenus sur HA sont indiqués
sur la figure II-4. Le spectre 1H SPE-MAS montre essentiellement deux pics à 0,2 et
5,5 ppm attribués respectivement aux ions OH- dans les tunnels apatitiques et à l'eau
structurale et/ou adsorbée (Wilson et al., 2006).
Le spectre RMN 31P SPE-MAS est constitué d'un seul pic centré à 2,6 ppm
relatif aux groupements orthophosphates de l'apatite.
II-2-5- Analyse chimique et surface spécifique
Les résultats de l'analyse chimique indiquent que le précipité présente un
rapport atomique Ca/P (1,64) légèrement inférieur à celui de l’hydroxyapatite
stoechiométrique (1,67). Il s’agit d'une apatite légèrement déficiente en calcium; cette
observation est compatible avec la présence d’ions hydrogénophosphate dans le
spectre IR correspondant. La surface spécifique du solide élaboré, déterminée par la
méthode Brunauer-Emmett-Teller (BET), est de l'ordre de 59 m2/g. Cette valeur est
généralement observée pour des apatites préparées dans les mêmes conditions (Ouizat,
2000; Barroug, 1989).

51
 ν1 PO4

ν3 PO4 ν4 PO4 ν2 PO4

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1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

-1
Nombre d'onde (cm )
Figure II-3: Spectre de diffusion Raman de HA

(A) (B)

25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15 15 10 5 0 -5 -10 -15

(ppm/TMS)
(ppm/H3PO4)

Figure II-4: Spectres 1H SPE-MAS (A) et 31P SPE-MAS (B) de HA.

52
 III-APATITES NANOCRISTALLINES CARBONATEES (ANC)

III-1- Synthèse
Les analogues de synthèse au minéral osseux ont été obtenus par double
décomposition à température ambiante entre une solution de nitrate de calcium et une
solution de phosphate d'ammonium et de bicarbonate de sodium.
L'un des principaux avantages de cette méthode, outre sa mise en œuvre aisée,
réside dans le fait que le pH reste constant; la solution de synthèse est tamponnée par
un grand excès de phosphate et de carbonate largement supérieur à la quantité
stœchiométrique. De plus, cette procédure restreint fortement l'apparition de phases
étrangères au cours de la précipitation et assure une assez bonne reproductibilité.
Les solutions de synthèse ont la composition suivante:
- Solution cationique: 52,2 g (0,22 mol) de Ca(NO3),4H2O sont dissous dans
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750 ml d'eau permutée.

- Solution anionique : 90 g (0,68 mol) de (NH4)2HPO4 ainsi que 90 g (1,07 mol)
de NaHCO3 sont dissous dans 1500 ml d'eau permutée.
La solution cationique a été versée rapidement à température ambiante (20 ±
2°C) dans la solution anionique. La suspension obtenue est agitée durant quelques
secondes afin d’assurer l'homogénéité; le pH mesuré est proche de 7,4. Le précipité
formé est ensuite laissé maturer sans agitation, dans des récipients totalement
hermétiques afin d'éviter toute perte (ou fixation) du gaz carbonique.
Après des durées de maturation de 1 jour, 6 jours, et 30 jours, les précipités sont
filtrés sur büchner, lavés soigneusement plusieurs fois avec de l'eau permutée
décarbonatée, lyophilisés puis stockés au congélateur (-18°C) afin d'éviter toute
évolution. Les solides préparés sont ainsi désignés ANC-1j, ANC-6j et ANC-30j.

III-2- Caractérisation
III-2-1- Diffraction des rayons X
Tous les précipités formés à différents temps de maturation fournissent des
diagrammes semblables où on observe des raies larges et mal résolues caractéristiques
d'apatites phosphocalciques nanocristallines, similaires à la phase minérale du tissu
osseux (Figure II-5). Par ailleurs, aucune phase cristalline outre que l'apatite n'a été
décelée dans nos préparations.
Le Tableau II-2 regroupe les dimensions apparentes des cristallites, calculées à
partir de la formule de Scherrer. Nous remarquons tout d'abord que les cristaux de
l'ensemble des échantillons sont allongés selon l'axe c (L(002)>L(310)). Les dimensions

53
 des cristaux préparées sont comparables à celles calculées pour un os humain d’un
adulte (Hina, 1996). On note également que les dimensions (longueur et largeur)
augmentent légèrement avec le temps de maturation. Des observations similaires ont
été rapportées pour des apatites préparées dans des conditions semblables (Hina, 1996;
Cazalbou, 2000; Ouizat, 2000).

(002)
(310)

Os

ANC- 30j
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ANC- 6J

ANC-1j

20 30 40 50 60 70

2θ (degré)

Figure II-5: Diagrammes de DRX des apatites préparées à différents

temps de maturation.

Tableau II-2: Dimensions apparentes des cristallites d'apatites préparées en

fonction du temps de maturation

Dimensions apparentes des cristallites

Echantillon
L(002) ± 5 Å L(310) ± 5 Å L(002)/L(310)

ANC-1j 242 86 2,8

ANC-6j 295 90 3,3
ANC-30j 349 98 3,6
Os humain d'adulte* 213 68 3,1
*Hina, 1996

54
 III-2-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier (IRTF)
Les spectres d'absorption infrarouge des solides préparés à différents temps de
maturation sont caractéristiques d'apatites nanocristallines carbonatées (Figure II-6),
en accord avec la basse cristallinité des solides observée par DRX. Les positions des
différentes bandes observées ainsi que leurs attributions sont regroupées dans le
tableau II-3.

Tableau II-3: Position et intensité des bandes IR des apatites nanocristallines

synthétisées.

Position (cm-1) et intensité Attributions

des bandes IR
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3000-3400 (F,l) Elongation symétrique et antisymétrique de

molécules d'eau

1644 (f) Déformation des molécules d'eau

1476 (m)
Elongation C-O des ions CO 32− mode ν3
1419 (m)

1380-1400 (f) Elongation N-O des ions NO 3−

Elongation P-OH des groupements HPO 24−

1140
1093 (F,l) Elongation antisymétrique des ions PO 34−
1033 (F,l) mode ν3 (F2)
961 (m) Elongation symétrique des ions PO 34− mode
ν1 (A1)
878 (f) Elongation C-O des ions CO 32− mode ν2
871 (ep)
604 (F) Déformation antisymétrique des ions PO 34−
563 (F) mode ν4 (F2)

55
 ν1,ν3 PO4

ν4 PO4
H2O ν3 CO3
H2O

ANC- 30j
HPO4
+ν2 CO3

ANC- 6j

NO3

ANC-1j

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

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-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II-6: Spectres IR d'apatites obtenues à différentes durées de maturation

La bande large et intense dans le domaine 3000-3400 cm-1 témoigne de la

présence d'eau adsorbée à la surface des nanocristaux ou éventuellement d'eau
intracristalline (LeGeros et al., 1978). Les bandes dans les domaines 1000-1150 cm-1
et 550-650 cm-1 correspondent respectivement aux modes ν3 PO 34− et ν4 PO 34− des
groupements phosphate situés dans des sites apatitiques. La bande à 961 cm-1 est
assignée à ν1 PO 34− . L'épaulement vers 1140 cm-1 est attribué aux ions HPO 24− dans le
réseau apatitique.
Les modes ν3 et ν2 des groupements carbonate apatitiques apparaissent
respectivement dans les domaines 1350-1500 cm-1 et 850-900 cm-1. Le premier
domaines met en évidence deux bandes vers 1419 cm-1 et 1476 cm-1 caractéristiques
d’ions carbonate localisés dans les sites PO 34− (carbonate type B) (Rey et al., 1989b;
Elliott, 1994). La deuxième région spectrale (850-900 cm-1) fait apparaître une bande à
871 cm-1 attribuée aux vibrations des carbonates type B, et un épaulement vers 879
cm-1 attribué aux carbonates qui occupent les sites monovalents de la structure
apatitique (carbonate type A) (Elliott, 1994; Vignoles, 1984). Ces observations
indiquent qu'il s'agit d'apatites nanocristallines carbonatées mixtes de type AB.
Afin de mieux mettre en évidence l'évolution des spectres IR des solides lors du
processus de maturation, nous avons procédé à la décomposition des principales
bandes d'absorption d'ions carbonate 850-900 cm-1 (ν2 CO3) et d'ions phosphate entre
480 et 660 cm-1 (ν4 PO4). Pour cela, nous avons opéré par des traitements

56
 mathématiques de décomposition sur les régions spectrales sélectionnées en utilisant le
logiciel GRAMS/AI version 8.0. Ces décompositions, conformément aux différents
travaux effectuées dans ce domaine (Rey et al., 1991a,b et 1995b), ont été effectuées
en considérant une forme de bande lorentzienne pour chaque bande IR.
Les attributions des bandes correspondant aux domaines ν4 PO4 et ν2 CO3 sont
illustrées respectivement sur les figures II-7 et II-8. Dans le domaine ν4 PO4, on note la
présence de bandes spécifiques aux groupements HPO 24− et PO 34− non-apatitiques
situées à 535 et 550 cm-1. La décomposition dans le domaine ν2 CO3 fait apparaître, en
plus des bandes spécifiques aux ions carbonate type A et B, une bande large vers 866
cm-1 caractéristique des espèces carbonate labiles. Le rapport des aires des bandes des
espèces PO4 non-apatitique, HPO4 apatitique et HPO4 non-apatitique, par rapport à
l'aire de l'ensemble de la bande phosphate, a été calculé. Nous avons procédé de la
même manière pour les espèces carbonate (CO3 de type A, CO3 de type B et CO3
labiles).
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L'évolution de l'environnement des ions phosphate au cours de la maturation est

reportée sur la figure II-9. On assiste à une diminution significative de la proportion de
groupements HPO4 non-apatitiques après 6 jours de maturation, et à une augmentation
de la quantité relative aux ions HPO 24− apatitiques, tandis que la proportion des
groupements phosphate labiles évolue faiblement. La diminution de la teneur en ions
HPO 24− labiles semble liée à l'augmentation progressive mais relative de la proportion
des groupements HPO42- apatitiques. Des évolutions identiques ont été rapportées pour
la maturation d'apatites nanocristallines carbonatées (Hina, 1996; Cazalbou, 2000).
Cette diminution serait due à une substitution partielle des ions phosphate par des
groupements carbonate (Rey et al., 1995c).
Par ailleurs, sur la base des variations des quantités relatives aux espèces
carbonate lors de la maturation (Figure II-10), on assiste à l'augmentation des
carbonates de type B et de type A, alors que la quantité en carbonate dans les
environnements labiles (situés à la surface) diminue. Ces évolutions montrent
clairement une redistribution des ions carbonate, durant la maturation, de la surface
des cristaux vers les sites apatitiques les plus stables.

57
 ANC-30j
PO4 apatitique

PO4 non HPO4 apatitique

apatitique
HPO4 non
apatitique

ANC-6j
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ANC-1j

660 640 620 600 580 560 540 520 500 480
-1
Nombre d'onde (cm )
Figure II-7: Décomposition des bandes ν4 PO4 (480-670 cm-1).

58
 ANC-30j

CO3 type A CO3 type B

CO3 et HPO4
Labiles

ANC- 6j
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ANC-1j

940 920 900 880 860 840 820 800

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II-8: Décomposition des bandes ν2 CO3 (900-850 cm-1)

59
 0,4
PO4 non-apatitique
HPO4 apatitique
HPO4 non-apatitque
Aire relative des bandes
0,3

0,2

0,1

0,0
1 jour 6 jours 30 jours
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Temps de maturation

Figure II-9 : Evolution des quantités relatives des ions phosphate

au cours de la maturation.

CO3 type A
0,8 CO3 type B
Labiles
Aire relative des bandes

0,6

0,4

0,2

0,0
1 jour 6 jours 30 jours

Temps de maturation

Figure II-10 : Evolution des intensités relatives des bandes IR

des ions carbonate au cours de la maturation.

60
 III-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman
Les spectres de diffusion Raman des précipités obtenus à différents temps de
maturation (Figure II-11) mettent en évidence la présence de bandes de vibrations de
groupements phosphate caractéristiques d'apatites carbonatées mal cristallisées. Les
attributions des bandes observées sont consignées dans le tableau II-4.

ν1 PO4

ν3 PO4
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+
ν1CO3 (B)
ν4 PO4 ν2 PO4

ANC-30j

ANC- 6j

ANC-1j

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II-11: Spectres de diffusion Raman des précipités obtenus à différentes

durées de maturation.

61
 Tableau II-4: Attribution des bandes caractéristiques des apatites
nanocristallines carbonatées analysées par Raman.

ANC-1j ANC-6j ANC-30j Os* Email*

429 430 430 432 433

ν2 PO 34−
450 450 450 452 450

590 590 590 590 588

ν4 PO 34−
609 609 609 611 608

ν1 PO 34− 961 961 961 959 961

1046 1046 1046 1044 1043

ν3 PO 34−
1071-1072 1071-1072 1071-1072 1071 1071
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ν1 CO 32− (B) 1071-1072 1071-1072 1071-1072 1071 1071

* (Penel et al., 2003)

III-2-4- Spectroscopie RMN de l'état solide

(1H SPE-MAS, 31P SPE-MAS et 1H→ 13C CP-MAS)
Les spectres 1H SPE-MAS des apatites préparées (Figure II-12 (A)) exhibent un
pic intense à ~ 5,4 ppm caractéristique de l’eau structurale et/ou adsorbée (Wilson et
al., 2006). Le pic de très faible intensité situé vers 0,2 ppm est attribué aux ions OH-
localisés dans les tunnels apatitiques (Panda et al., 2003). L’intensité de ce pic (0,2
ppm) est extrêmement faible et augmente légèrement avec la durée de maturation. Il
est à noter que ni la spectroscopie IR, ni la spectroscopie Raman n’ont révélé la
présence d’ions OH-. Cela est probablement dû à leur faible teneur. En effet, il est bien
connu que ces deux techniques ne permettent pas de détecter ces ions lorsque leur
teneur n’excède pas les 5 %. La présence probable de carbonates de type A (substitués
partiellement aux ions OH-) serait à l’origine de la faible concentration d’ions OH-
dans le tunnel apatitique, même si la plupart des carbonates contenus dans ces
échantillons sont de type B (substitution partielle au niveau des groupements
phosphates). Ce type de résultat a déjà été rapporté par Labarthe et Bonel (1973). En
effet ces auteurs avaient observé une réduction considérable de la concentration en
ions OH- lorsque des ions carbonate sont incorporés dans le tunnel apatitique. Nous
reviendrons plus en détail, dans les paragraphes suivants, sur la présence éventuelle
d’ions carbonate dans le tunnel apatitique des échantillons étudiés dans ce travail.

62
 La présence d’ions OH- dans le tunnel apatitique signifierait donc l’existence
dans la structure de ces échantillons de domaines ayant des environnements analogues
à ceux des apatites stoechiométriques. En plus des pics attribués aux ions OH- dans le
tunnel apatitique (0,2 ppm) et aux molécules d’eau (~ 5,4 ppm), le spectre 1H SPE-
MAS de l’apatite maturée un jour (ANC-1j) fait apparaitre deux épaulements dont un
relativement large centré autour de 14 ppm et l’autre à ~ 7,2 ppm. Si le premier, qui
apparaît également dans les spectres 1H SPE-MAS des apatites maturées 6 jours
(ANC-6j) et 30 jours (ANC-30j) mais avec une intensité beaucoup plus faible (Figure
II-12 (A)), est attribuable sans ambiguïté aux ions hydrogènophosphate (HPO42-), le
pic à 7.2 ppm peut correspondre aussi bien à des molécules d’eau fortement adsorbées
ou proches des ions HPO42- qu’à des ions ammonium (NH4+) piégés dans le réseau lors
de la préparation de l’échantillon tel rapporté dans le cas des fluoroapatites
carbonatées et faiblement hydroxylées (Sfihi et Rey, 2002). Toutefois, étant donné
l’intensité relativement élevée de ce pic et son absence dans les spectres 1H SPE-MAS
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des apatites maturées 6 et 30 jours, cette dernière hypothèse paraît peu probable.
La diminution de l’intensité du pic à 14 ppm lorsqu’on passe de l’apatite
maturée 1 jour à celles maturées 6 et 30 jours traduirait une diminution de la
concentration en ions HPO42- avec la durée de maturation des échantillons. Par
ailleurs, l’examen détaillé de ce pic (Figure II-12 (A)) révèle en fait une structure à
deux pics centrés à ~12,5 et ~ 15,5 ppm particulièrement visibles dans le spectre de
l’apatite maturée un jour. L’existence de ces deux pics met ainsi en évidence la
présence dans ces apatites de deux types d’ions HPO42- caractérisés par des
environnements différents. Toutefois, le pic à 15,5 ppm semble totalement disparaître
des spectres des deux apatites maturées à 6 et 30 jours.
La présence du pic à ~ 15,5 ppm dans le spectre 1H SPE-MAS de l’apatite
maturée un jour est probablement lié au pic supplémentaire de l’eau qui apparaît à 7,5
ppm, car ces deux pics disparaissent totalement (ou tout au moins leur intensités sont
considérablement réduites) des spectres des deux apatites maturées pendant 6 et 30
jours. Ce résultat conforterait ainsi l’attribution du pic à 7.5 ppm à des molécules d’eau
dans l’environnement des ions HPO42- et plus précisément de ceux localisés à ~ 15,5
ppm.
Afin de confirmer ou d’infirmer l’hypothèse avancée précédemment sur la
présence éventuelle d’ions carbonate dans le tunnel apatitique (carbonates de type A),
des mesures 13C SPE-MAS et 1H→ 13C CP-MAS ont été réalisées sur les trois
échantillons. La figure II- 13 (A) montre les spectres 1H→ 13C CP-MAS obtenus avec
un temps de contact de 2 ms. On constate que quel que soit la durée de maturation, le
spectre contient une raie dont la position (∼ 169 ppm) correspond à celle des

63
 carbonates de type B (Beshah et al., 1990; Sfihi et Rey, 2002) et un épaulement vers
166 ppm, dont l’intensité relative ne semble pas évoluer de façon significative avec le
temps de maturation, attribué aux carbonates de type A (Beshah et al., 1990). Ainsi, la
présence d’ions OH- apatitique, même à faible concentration, signifierait donc
l’existence dans la structure de ces échantillons de petits domaines ayant des
environnements analogues à ceux des apatites stœchiométriques. Par ailleurs et
concernant la raie des carbonates de type B, des mesures en 1H→ 13C CP-MAS
réalisées à différents temps de contact sur l’apatite maturée un jour (Figure II-13 (B))
révèlent l’existence de deux types de ces carbonates. En effet, au fur et à mesure que le
temps de contact augmente la largeur de la raie diminue. Cette diminution, qui
s’accompagne d’un déplacement du centre de gravité de la raie vers les bas champs
magnétiques, est davantage accentuée lorsqu’on passe au spectre 13C SPE-MAS
(Figure II-13 (C)). Ce résultat ne peut s’expliquer que par la présence de deux types de
carbonates de «type B» dont les carbones correspondant seraient caractérisés par des
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temps de polarisation différents. Des résultats similaires ont déjà été rapportés dans la
littérature sur une fluorapatite carbonatée et faiblement hydroxylée (Sfihi et Rey,
2002). Ces deux types de carbonates ont été attribués à des carbonates de type B
(localisés à haut champs magnétique) et à des carbonates labiles (localisés à bas
champs magnétique). Ces derniers seraient donc polarisés essentiellement par les
protons des molécules d’eau adsorbées en surface, ce qui expliquerait leur polarisation
beaucoup plus rapide que celle des carbonates de type B. Toutefois, sur la base des
mesures 2-D HetCor (Hetero-Correlation Chemical Shift), comme on le verra de façon
détaillée au chapitre IV, les carbonates de type B sont polarisés par les mêmes protons
que ceux qui polarisent les 13C associés aux carbonates labiles, c'est-à-dire les protons
des molécules d'eau adsorbées en surface. Par ailleurs, en SPE-MAS tous les carbones
sont détectés alors qu’en CP-MAS seuls ceux dans le voisinage immédiat des protons
le sont; sur la base de la largeur de la raie observée par ces deux méthodes, on déduit
que la proportion de carbonates labiles est beaucoup plus faible que celle des
carbonates de type B (la raie obtenue en SPE-MAS serait dominée par les carbonates
de type B, alors qu’en CP-MAS elle le serait par les carbonates labiles) et que tous les
carbones des carbonates de type B ne sont pas entièrement polarisés et cela quel que
soit le temps de contact (la largeur de la raie obtenue en SPE-MAS est plus faible que
celle de la même raie obtenue en CP-MAS). Cela résulterait des temps de relaxation
spin réseau des protons dans le repère tournant (T1ρ) plus courts que le temps de
transfert de polarisation des 1H de l'eau vers les 13C des carbonates de type B. les
temps de transfert de polarisation dépendent de l'intensité des couplages dipolaires
entre ces deux systèmes de spins et donc des distances qui les séparent.

64
 Les spectres 31P SPE-MAS des trois apatites (Figure II-12 (B)) sont
relativement identiques et sont constitués d’une seule raie dissymétrique centré autour
de 3,3 ppm et dont la largeur diminue lorsqu’on passe successivement de l’apatite
maturée 1 jour (ANC-1j) aux apatites maturées 6 (ANC-6j) et 30 jours (ANC-30j).
L’anisotropie de déplacement chimique étant totalement supprimée par la rotation de
l’échantillon à l’angle magique (MAS), la dissymétrie de la raie s’expliquerait donc
par l’existence de différents types de phosphores qui correspondraient essentiellement
à ceux des groupements PO4 et à ceux des ions HPO42-. La diminution de la largeur de
raie lorsqu’on passe de l’apatite maturée 1 jour aux apatites maturées 6 et 30 jours,
signifierait donc une diminution de la teneur en ions HPO42- avec la maturation, ce qui
serait en parfait accord avec les résultats des mesures en 1H SPE-MAS. Cependant
étant donné la proportion relativement faible des ions HPO42- par rapport à celle des
ions phosphate qui dominent la raie, la réduction de largeur de raie résulterait
davantage d’une meilleure cristallisation des apatites avec la maturation que de la
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diminution de la proportion des ions HPO42-. La diminution de la proportion des ces

derniers avec la maturation ne contribuerait que très faiblement à la diminution de
largeur de raie.

B
A

ANC -30j

ANC-30j

ANC-6j
ANC-6j

ANC-1j

×4
ANC-1j

15 10 5 0 -5 -10 -15
20 10 0 - 10
(ppm/TMS) ppm/H3PO4

Figure II-12: Spectres 1H SPE-MAS (A) et 31P SPE-MAS (B) des apatites obtenues à
différents temps de maturation.

65
 B
A

ANC-30j C SPE-MAS

SPE-MAS

CP-MAS
(tc = 5 ms)
ANC-6j
tc = 5 ms
CP-MAS
(tc = 0,5 ms)
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tc = 2 ms

ANC-1j
tc = 0,5 ms

180 170 160 180 170 160 175 170 165 160
(ppm/TMS) (ppm/TMS
(ppm/TMS)

Figure II-13: Spectres 1H→13C CP-MAS obtenus à 2 ms dans les apatites maturées
à différentes durées (A) et à différents temps de contact dans l’apatite
maturée un jour (B). Ces derniers sont comparés au spectre obtenu
par 13C SPE-MAS sur le même échantillon enrichi en 13C. Les spectres
de la figure C correspondent à une extension d’échelle de certains
spectres de la figure B.

66
 III-2-5- Analyse chimique et surface spécifique
Les résultats des dosages du calcium, du phosphate, de carbonates ainsi que les
mesures de surface spécifique effectuées sur les précipités sont rassemblés dans le
tableau II-5. Les solides obtenus à différents temps de maturation présentent des
rapports atomiques Ca/P et Ca/(P+C) faibles, caractéristiques d'apatites déficientes en
calcium; cette observation corrobore la présence de bandes de vibrations relatives aux
groupements carbonate et hydrogénophosphate dans les spectres infrarouge
correspondant.
Au cours de la maturation, la quantité d'ions phosphate diminue tandis que les
espèces carbonates ont tendance à s'incorporer dans la structure apatitique. Ceci atteste
bien de la substitution des ions phosphate par les ions carbonate au sein du solide. Si
on suppose que ce type de substitutions est très majoritaire, c'est le rapport Ca/(P+C)
qui représente l'écart à la stœchiométrie et non plus le rapport Ca/P. Ce rapport varie
très peu au cours du temps et reste proche de 1,39; ainsi, la maturation ne semble pas
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modifier dans ces conditions la stoechiométrie de ces apatites.

Il existe cependant une amélioration de la cristallinité observée par diffraction
des rayons X qui correspond à la fois à un accroissement des dimensions des domaines
apatitiques et une diminution du désordre cristallin (Cazalbou, 2002). Cet
accroissement de la dimension cristalline a été attribué à une croissance des domaines
apatitiques aux dépends de la couche de surface hydratée. Notons qu'il n'existe pas de
relations entre la taille des domaines apatitiques déterminée par diffraction des rayons
X et la mesure de la surface spécifique. En fait outre l'existence d'une couche hydratée
de surface non-apatitique, inobservable par diffraction des rayons X, les nanocristaux
ont la propriété de se lier et de fusionner, phénomène qui tend à diminuer la surface
accessible des cristaux.

67
 Tableau II-5 : Composition chimique (% massique ± erreur relative) et surface
spécifique des apatites ANC à différents temps de maturation.

Echantillon Ca (%) P (%) CO3 (%) Ca/P Ca/(P+C) SBET (m²/g)

(± 0,5 %) (± 0,5 %) (± 1 %) (± 1 %) (± 2 %) (± 5%)
ANC-1j 33,65 17,02 3,54 1,53 1,38 96
ANC-6j 33,81 16,47 4,50 1,59 1,39 201
ANC-30j 34,02 16,33 5,05 1,61 1,39 176
Os * 34,16 16,46 5,03 1,61 1,39 150-200
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HA 37,20 17,57 - 1,64 - 59

* Kuhn et al., 2008

68
 IV- PHOSPHATES OCTOCALCIQUES

IV-1- Synthèse
IV-1-1- Phosphate Octocalcique Apatitique (OCPa)
La méthode d’élaboration de l'OCPa consiste à précipiter le phosphate de
calcium par double décomposition, à partir d'une solution de sel de calcium et d'une
solution basique d'ions orhtophosphate (Zahidi, 1984). Les solutions ont été préparées
dans un milieu eau éthanol dans les proportions 50 %-50 % en volume; elles
présentent les compositions suivantes avec un rapport atomique en solution (Ca/P)L
égal à 1.
* Solution cationique: 7,09 g (0,03 mol) de Ca(NO3)2, 4H2O sont dissous dans
100 ml d'eau permutée décarbonatée et 100 ml d'éthanol absolu (95%).
* Solution anionique: 3,96 g (0,03 mol) de (NH4)2HPO4 sont dissous dans 250
ml d'eau permutée décarbonatée. A cette solution, sont ajoutés successivement 45 ml
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d'une solution d'ammoniaque à 20 % (d = 0,92) et 295 ml d'éthanol absolu (95 %).

IV-1-2- Phosphate Octocalcique Apatitique Carbonaté (OCPa-c)
Le protocole expérimental suivi pour la synthèse des échantillons d'OCPa-c est
proche de celui adopté pour l'OCPa (Bennani, 1991). La précipitation a été effectuée à
partir d’une solution contenant des ions calcium et une solution basique contenant des
ions phosphate et carbonate dans un rapport atomique CO3/(CO3+PO4)L égal à 40 %.
Ce rapport permet l'obtention d'apatites contenant dans leur structure à la fois des ions
hydrogénophosphate (HPO 24− ) et carbonate (CO 32− ). La composition des solutions
réactant est la suivante:
* Solution cationique: 7,09 g (0,030 mol) de Ca(NO3)2, 4H2O sont dissous dans
100 ml d'eau permutée décarbonatée et 100 ml d'éthanol absolu (95%).
* Solution anionique: 2,38 g (0,018 mol) de (NH4)2HPO4 et 1,15g (0,012 mol)
de (NH4)2CO3 sont dissous dans 250 ml d'eau permutée décarbonatée. A cette solution,
sont ajoutés successivement 45 ml d'une solution d'ammoniaque à 20 % (d = 0,92) et
295 ml d'éthanol absolu (95 %).
La précipitation des composés OCPa et OCPa-c a été effectuée à 37°C en
versant rapidement, tout en agitant, la solution cationique dans la solution anionique.
Les précipités formés ont été séparés des solutions mères par filtration sur büchner,
puis lavés avec une solution basique constituée de 180 ml d'eau permutée
décarbonatée, 30 ml d'une solution d'ammoniac (d = 92) et 210 ml d'éthanol absolu (95
%). La phase de filtration et de lavage dure environ 25 min. Le précipité est ensuite
séché durant une nuit dans une étuve à 80°C.

69
 IV-2- Caractérisation
IV-2-1- Diffraction des rayons X
Les diagrammes de diffractions des rayons X des échantillons préparés OCPa et
OCPa-c sont représentés sur la figure II-14. On note la présence des raies
caractéristiques d'une phase apatitique mal cristallisée. L’analyse des dimensions des
cristallites (Tableau II-6) indique qu’elles sont de taille nanométrique. Il apparaît, dans
ce cas que l'introduction des ions carbonate dans la structure apatitique inhibe la
croissance des cristallites, et plus particulièrement dans la direction de l'axe c. Des
observations similaires ont été rapportées par Bennani (1998).
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(002)

(310)

OCPa-c

OCPa

20 30 40 50 60 70
2θ (degré)

Figure II-14: Diagrammes de DRX de l'OCPa et l'OCPa-c

70
 Tableau II-6: Dimensions apparentes des cristallites de l'OCPa et l'OCPa-c.

Dimensions apparentes des cristallites

Echantillon
L(002) (± 5 Å) L(310) (± 5 Å) L(002)/L(310)

OCPa 187 55 3,4

OCPa-c 122 44 2,8

Os* 213 68 3,1

* Hina, 1996

IV-2-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier (IRTF)

Les spectres IR des solides préparés OCPa et OCPa-c sont représentés dans la
figure II-15. On distingue dans les deux cas des bandes larges et mal résolues
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confirmant la faible cristallinité des solides, notée par DRX. Ces composés présentent
les mêmes bandes phosphate à 571, 601, 962, 1033 et 1089 cm-1, propres aux
groupements PO 34− dans un environnement apatitique.
La décomposition dans le domaine ν4 PO4 des échantillons examinés (OCPa et
OCPa-c) permet d'identifier les bandes attribuables aux ions phosphate non-apatitiques
appartenant à la couche hydratée de surface (Figure II-16). Pour les deux solides on
note la présence de bandes situées vers 535 et 617 cm-1 spécifiques aux groupements
HPO 24− et PO 34− labiles. Le spectre du composé OCPa montre en outre une bande à 630
cm-1 attribuée aux ions OH- de la structure apatititique.
Le spectre IR de l'OCPa-c fait apparaître dans le domaine spectrale 1400-1500
cm deux bandes vers 1420 et 1455 cm-1 relatives au mode de vibration ν3 des
-1

groupements carbonate apatitiques situés en sites de type B (Vignoles, 1984). Il révèle,

en outre, une bande vers 875 cm-1 qui peut être attribuée à la fois aux ions carbonate et
hydrogénophosphate. Aucune bande de vibration des groupements hydroxyle n'a été
observée. La décomposition de la bande d'absorption d'ions carbonate entre 850 et 900
cm-1 (ν2 CO3) met en évidence, en plus des bandes de vibration associées aux ions
carbonate labiles vers 860 cm-1, la présence d'ions carbonate qui occupent les sites A et
B (Figure II-17). Ces bandes apparaissent dans la plupart des apatites mixtes de type
AB et dans la phase minérale de l'os et de l'émail (Rey et al., 1991b).

71
 ν1,ν3 PO4

ν4 PO4

H2O
HPO4
H2O
ν3 CO3 + ν2CO3

OCPa-c
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HPO4
NH4 OH
OH

OCPa

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II-15: Spectres IR de l'OCPa et l'OCPa-c

72
 OCPa

PO4 apatitique

PO4 non-napatitique HPO4 apatitique

HPO4 non-apatitique
OH apatitique
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OCPa-c

680 660 640 620 600 580 560 540 520 500 480
-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II-16: Décomposition des bandes ν4 PO4 (480-670 cm-1).

73
 2- 2-
CO3 type A CO3 type B
Absorbance

ν1 − ν3 PO4 2-
CO3 non apatitique

2-
HPO4
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900 880 860 840 820 800

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II-17: Décomposition de la bande ν2 CO3 (800-900 cm-1) de l'OCPa-c.

IV-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman

Les spectres Raman des précipités OCPa et OCPa-c (Figure II-18) présentent
les mêmes bandes de vibration des groupements phosphate notées dans l’apatite de
basse cristallinité (tableau II-4) et sont analogues au minéral osseux. Cependant, des
bandes de vibration caractéristiques d’ions OH- apparaissent à 3570 cm-1 et 3573 cm-1
pour l’COPa et l’OCPa-c, respectivement. La bande à 3573 cm-1 est généralement
observée dans les apatites carbonatées de type B (Penel et al., 2003).
IV-2-4- Analyses chimiques et surface spécifique
Les résultats des analyses chimiques (calcium, phosphate, carbonates) ainsi que
les mesures de surface spécifique effectuées sur les précipités sont reportés dans le
tableau II-8. Le composé préparé en absence d’ions carbonate présente un rapport
Ca/P de 1,33; le solide préparé en présence de carbonates quant à lui montre une
valeur de 1,65. L’OCPa-c se caractérise par une grande surface spécifique (90 m²/g),
comparable à l’apatite carbonatée nanocristalline. La surface spécifique notée pour
l'OCPa (49 m²/g) reste très faible si on considère la taille des nanocristaux déterminées
par DRX. Cela peut être probablement lié à l’agglomération des cristaux réduisant
ainsi le nombre de sites d'adsorption accessibles aux molécules d'azote.

74
 ν1PO4

OH

ν3 PO4
+
ν1CO3 (B)
ν4PO4 ν2PO4

OCPa-c
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ν3PO4

OCPa
3600 3450 3300 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II-18: Spectres de diffusion Raman de l'OCPa et l'OCPa-c

Tableau II-7: Composition chimique (% massique ± erreur relative) et surface

spécifique de l'OCPa et l'OCPa-c.

Echantillons Ca (%) P (%) CO3 (%) Ca/P SBET (m²/g)

± 0,5 % ± 0,5 % ± 1% (± 1%) (± 5%)
OCPa 32,54 18,90 - 1,33 49
OCPa-c 32,31 15,24 5,52 1,65 90
ANC-1j 33,65 17,02 3,54 1,53 96
Os bovin 34,16 16,46 5,03 1,61 150-200
HA 37,20 17,57 - 1,64 59

75
 V- CONCLUSION

Dans le cadre de ce travail nous avons élaboré et caractérisé des phosphates de

calcium présentant différentes caractéristiques physicochimiques en vue d’examiner
leurs propriétés d’adsorption.
L’hydroxyapatite préparée est une apatite bien cristallisée, minéralogiquement
pure et sensiblement stœchiométrique. Elle est caractérisée par une surface spécifique
de 59 m²/g et est constituée de cristallites de longueur moyenne proche de 57 nm.
Les solides synthétisés dans des conditions physiologiques de pH et de
température sont des apatites nanocristallines carbonatées de type AB similaires au
minéral osseux, et exempt de toute phase étrangère autre que l’apatite. Ces précipités
se caractérisent par des surfaces spécifiques variant de 96 à 201 m²/g.
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Le processus de maturation de ces apatites est fortement lié à l’existence d’une

importante proportion d’environnements phosphate et carbonate non apatitiques
labiles, localisés à la surface des cristallites. Ce processus est accompagné par un
déplacement des ions CO3 et HPO4 labiles, durant la maturation de ces précipités, de la
surface vers les sites apatitiques les plus stables. Ainsi, cette évolution est attestée par
une augmentation à la fois de la taille apparente des cristallites et du rapport Ca/P de
ces matériaux. Cela traduit une amélioration de la cristallinité des apatites étudiées.
Les phosphates octocalciques formés en milieu eau-éthanol sont similaires à
une phase apatitique mal cristallisée; cependant les surfaces spécifiques de ces
composés sont relativement faibles, comparées aux apatites nanocristallines (ANC).
Les divers phosphates de calcium ainsi préparées et caractérisés serviront de
supports pour l’étude d’interaction vis-à-vis du risédronate, un bisphosphonate de
troisième génération.

76
 Partie B
Elaboration et caractérisation des sels
de risédronate de calcium

I- INTRODUCTION
Les bisphosphonates sont des analogues synthétiques stables en milieu
biologique des pyrophosphates (Fleisch et al., 1998), et se caractérisent par une
structure de type P-C-P (liaison phosphore-carbone-phosphore) non présente
naturellement dans l’organisme. Ils sont particulièrement indiqués dans le traitement
préventif ou curatif de certaines affections du tissu osseux, notamment celles
impliquant des désordres du remodelage (Russel et Rogers, 1999). Ainsi, ils inhibent
la formation, l’agrégation, et ralentissent aussi la dissolution des cristaux de phosphate
de calcium (Fleisch, 2002). Les chaînes latérales rattachées au carbone central sont
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responsables de l’affinité pour le tissu osseux et de l’effet biologique. Les

bisphosphonates sont classés en « générations » selon leur pouvoir d’anti-résorption
osseuse qui est fortement lié à la nature de la chaîne latérale R2 sur l'atome de carbone
(chapitre I, paragraphe II-2-2).
Le mécanisme d’action in-vivo des espèces bisphosphonate s’explique
principalement par une forte capacité à s’adsorber sur le minéral osseux, dont ils
diminuent la résorption en inhibant l’activité des ostéoclastes. Il s’agit donc à la fois
d’un phénomène physico-chimique et biologique. L’étude des propriétés chélatantes
des acides bisphosphoniques montre (Matczak-Jon et Videnova-Adrabinska, 2005)
que ces espèces sont des ligands très efficaces de nombreux ions métalliques (Cu2+,
Zn2+, Ca2+ et Mg2+). Des études cristallographiques menées sur ces composés et sur
leurs complexes métalliques ont mis en évidence que la nature de la chaîne
hydrocarbonée substituée influence les propriétés chélatantes des bisphosphonates
(Matzak et al., 2006); ceci se traduit par la modification de la flexibilité et des degrés
d’ionisation de leur fonction hydroxybisphosphonique. Les bisphosphonates peuvent
former in-vivo des complexes solubles et/ou insolubles avec les ions métalliques
présents dans le plasma, en particulier le calcium et le magnésium (Matzak-jon et al.,
2006). Les complexes solides formés, considérés comme phases étrangères, sont
retenues et éliminées par l’organisme (mécanisme de phagocytose) via le système
réticulo-endothélial 1 (Fleisch, 1993; Hirabayabayashi et al., 2002). La solubilité des
bisphosphonates ainsi que les complexes solubles et/ou insolubles susceptibles de se
former semblent être d’une grande importance dans le processus de fixation des

1
Ensemble de cellules jouant un rôle d’épuration de l’organisme, notamment en absorbant les particules étrangères (phagocytose) et en participant aux
réactions de défense immunitaire de l’organisme (Dictionnaire médical).

77
 bisphosphonates par le minéral osseux (Hirabayachi et al., 2001). Ainsi, dans le but de
mieux appréhender le processus d’interaction des bisphosphonates avec le minéral
osseux et les phénomènes de rétention à long terme, l’étude systématique de l’aptitude
de ces acides à former des sels et/ou des complexes avec le calcium s’avère
indispensable.
Nous nous intéressons dans le cadre de cette partie de travail à l’étude des
interactions entre le risédronate monosodique et le calcium en solution aqueuse. Après
une introduction concernant le bisphosphonate utilisé comme adsorbat, nous
présenterons la synthèse de différents sels de calcium/risédronate (CaxBPy) ; pour cela
diverses conditions expérimentales ont été adoptées (pH, rapport Ca/BP en solution).
Les produits ainsi obtenus ont été caractérisés à l'aide de techniques physico-
chimiques complémentaires (spectrophotométries IRTF et Raman, DRX, RMN du
solide et MEB). Ensuite, une étude complexométrique par conductimétrie a été
réalisée dans des conditions physiologiques (pH ∼ 7,3 et T ∼ 37°C) afin de confirmer
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la nature des interactions mises en jeu entre ions calcium et espèces risédronate.

78
 II- PREPARATION DES SELS DE RISEDRONATE DE CALCIUM

II-1- Généralités sur le risédronate monosodique

II-1-1- Présentation
Le risédronate est un dérivé aminé à fort pouvoir d’antirésorption de la
troisième génération des bisphosphosphonates; il est indiqué particulièrement dans les
traitements préventifs et curatifs de la perte osseuse postménopausique précoce (Leung
et al., 2004; Delmas, 2008; Watts, 2008).
L’échantillon de bisphosphonate utilisé pour nos tests expérimentaux est un
risédronate monosodique sous forme hémi-pentahydratée de grande pureté (99,99 %),
fourni gracieusement par les laboratoires Procter & Gambles Pharmaceuticals. Ce
principe actif rentre dans la composition de comprimés commercialisés sous le nom
d’Actonel®. Ses caractéristiques sont les suivantes:
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- Formule moléculaire : C7H10NO7P2Na 2,5H2O

- Masse moléculaire : 350,1 g/mol
- Formule développée :

O - +
O Na
4' 2 P 2' 6'
1
5' 3' OH 2.5 H2O
C
HO OH 1 3' 5'
P
2 4'
6' 2' OH
N O

Figure II B-1: Sel monosodique [1-hydroxy-2-(3-pyridinyl)éthylidène]bis[acide

phosphonique] hémi-pentahydrate
Pour une simplification et commodité d’écriture, le bisphosphonate ou
risédronate utilisé a été désigné dans la suite de ce travail par « BP ».

II-1-2- Analyses thermo-gravimétriques (ATD/ATG)

La courbe obtenue par analyses thermo-gravimétrique (ATG) et différentielle
(ATD) sous air (Figure II B-2), confirme le taux d’hydratation donné par le
fournisseur. On observe trois pertes de masse, entre 28 et 225°C, attribuables à
l’élimination de l’eau d’hydratation. Ces pertes sont accompagnées de trois pics
endothermiques vers 75, 145 et 195°C. Au delà de 225°C, la dégradation thermique
des molécules de risédronate se manifeste par l’apparition d’un pic exothermique à
environ 247°C (Redman-Furey et al., 2004).

79
 La perte globale de masse observée entre 28 et 225°C est de 12,8 %, ce qui
correspond à environ 2,5 moles d’eau par mole de risédronate monosodique.

-2 Exo
20
-4

-6

-8

ATD (µV)
ATG (%)

10
-10

-12
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-14 0

-16

-18

-20 -10
50 100 150 200 250 300
Température (C°)

Figure II B-2: Courbe thermo-gravimétrique et différentielle (ATD/ATG) du

risédronate de sodium.

II-1-3- Diagramme de spéciation

La figure II B-3 présente les différents équilibres de dissociation du risédronate
monosodique. Le calcul des proportions des différentes formes ioniques de la molécule
de risédronate a été réalisé sur la base des données de constantes d'acidité issues de la
bibliographie (Nancollas et al., 2006; Takami et al., 2002; Hounslow et al., 2008). La
figure II B-4 montre les différentes formes ioniques selon les conditions du pH du
milieu.

80
 H4HPBP + H3HPBP H2HPBP -
O O -
O -
O O
OH P P
P
OH OH
OH pKa C pKa2 C
C 1
OH
OH HO OH HO
HO P P -
P 1,60 2,77 O
OH + OH +
+ N O N O
N O
H H pKa3
H 5,25 (Pyridine)

O O O -
- -
O O O
P P P
- -
O O OH
C pKa5 C pKa4 C
- OH
HO O HO OH HO
P 10,45 P 6,79 P -
- -
O O O
N N O N O
O
BP 4 - HBP 3 - H2BP 2-
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Figure II B-3: Equilibres de dissociation du risédronate monosodique

(Hp désigne le proton porté par le groupement pyridine).

100
H4HPBP+
H2HPBP-
HBP3- BP4-

80
Concentration molaire (%)

H2BP2-

H3HPBP

60

40

20

0
0 2 4 pKa3 6 8 10 12 14
pKa1 pKa2 pKa4 pKa5

pH

Fig II B-4: Diagramme de spéciation du risédronate monosodique.

81
 II-1-4- Spectroscopie UV-Visible
La molécule de risédronate monosodique présente un maximum d'absorption
(λmax = 262 nm) dans le domaine UV-Visible (Figure II B-5). Cette Longueur d'onde
correspond au maximum d'absorbance du groupement aromatique (pyridine) présent
dans la molécule. Aucune variation du maximum d’absorption n’a été observée dans
les conditions expérimentales étudiées (T, pH, ajout de chlorure de potassium, ajout de
sels de phosphate et de calcium…). La concentration en risédronate est déterminée en
utilisant la loi de Beer-Lambert. Pour chaque expérience réalisée dans ce travail une
droite d’étalonnage a été effectuée dans la gamme de concentration explorée (0,1 à 0,3
mM). Le coefficient d’extinction molaire du risédronate (ε) déterminé à partir de
l’ensemble des droites obtenues est de 3,77.103 L.mol-1.cm-1, valeur similaire à celle
rapportée (3,90.103 L.mol-1.cm-1) dans la littérature (Vallano et al., 2003).
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1.0
262
Absorbance

0.5

0.0

200 220 240 260 280 300

λ (nm)

Figure II B-5: Spectre UV-Visible du risédronate monosodique 0,2 mM dans un

milieu KCl 1mM à pH 7,4 et 25°C.

82
 II-2- Synthèse et caractérisation de sels de risédronate de calcium
II-2-1- Synthèse
Afin de préciser les caractéristiques physico-chimiques des composés que le
risédronate pourrait former en présence du calcium (CaxBPy), nous avons procédé à la
synthèse et la caractérisation des sels du risédronate de calcium. La préparation de ces
composés a été réalisée par co-précipitation entre une solution de nitrate de calcium et
une solution de risédronate dans différentes conditions expérimentales (concentrations
des espèces, pH et rapport molaire (Ca/BP)L en solution).
La solution de nitrate de calcium a été ajoutée goutte à goutte, à température
ambiante, à la solution de risédronate maintenue sous agitation et dont le pH a été
initialement ajusté à la valeur désirée par ajout d’une solution d’ammoniaque (65 %).
Le précipité formé est laissé maturer pendant un jour, puis filtré sur millipore
(0,45 µm) et lavé abondamment par de l'eau permutée décarbonatée. Il est ensuite
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séché à l'étuve (37°C) pendant 20 heures.

Ainsi nous avons préparé 3 sels de risédronate de calcium (CaxBPy) que nous
noterons Ca2BP, CaBP(A) et CaBP(B), selon les conditions expérimentales et la
composition des solutions :
Sel Ca2BP :
- Solution de calcium : 520 mg de Ca(NO3)2, 4H2O sont dissous dans 10 ml
d'eau décarbonatée (0,22 M).
- Solution de risédronate : 350 mg de risédronate sont dissous dans 25 ml d'eau
décarbonatée (0,04 M). Le pH de la solution a été ensuite ajusté à une valeur voisine
de 10. La valeur du pH de fin de réaction est proche de 9,7.
- Rapport en solution (Ca/BP)L ∼ 2
Sel CaBP(A) :
- Solution de calcium : 265 mg de Ca(NO3)2, 4H2O sont dissous dans 10 ml
d'eau décarbonatée (0,11 M).
- Solution de risédronate : 350,1 mg de risédronate sont dissous dans 25 ml
d'eau décarbonatée (0,04 M) puis le pH a été ajusté à une valeur voisine de 8. A la fin
de la réaction le pH est proche de 6,8.
- Rapport en solution (Ca/BP)L ∼ 1,1

83
 Sel CaBP(B) :
- Solution de calcium : 75,71 mg de Ca(NO3)2, 4H2O sont dissous dans 10 ml
d'eau décarbonatée (0,32 M).
- Solution de risédronate : 100 mg de risédronate sont dissous dans 25 ml d'eau
décarbonatée (0,04 M). Le pH de cette solution a été ajusté à une valeur voisine de 11.
La valeur du pH de fin de réaction est proche de 9,30.
- Rapport en solution (Ca/BP)L ∼ 1,1
II-2-2- Caractérisation
II-2-2-1 Diffraction des rayons X
Le diagramme de diffraction des rayons X du risédronate monosodique hémi-
pentahydrate (BP) est celui d’un solide cristallin (Figure II B-6). La structure
cristalline de ce bisphosphonate est bien connue (Redman-Furey, 2004): il cristallise
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dans le système monoclinique (a = 21,7463Å, b = 8,9667Å ; c = 15,1193Å ; Z=8;

groupe d’espace C2/c).
Un premier examen des diagrammes fournis par les sels de risédronate de
calcium synthétisés montre trois composés différents. Le sel Ca2BP présente des raies
larges et mal résolues, caractéristiques d'un solide amorphe. Cependant, les sels
CaBP(A) et CaBP(B) montrent des raies fines et bien résolues, spécifiques aux solides
cristallins. Toutefois, le sel CaBP(A) obtenu à pH neutre et à forte concentration est
mieux cristallisé que CaBP(B) préparé à pH basique et à plus faible concentration.
Ainsi pour un même rapport molaire initial en solution de (Ca/BP ∼ 1), les solides
obtenus sont cristallins mais de structure dépendante du pH. Le pH est donc un facteur
déterminant dans la formation de ces sels. A notre connaissance, les sels de risédronate
de calcium de type CaBP et Ca2BP n’ont pas été décrits auparavant dans la littérature.

84
 CaBP(A)
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CaBP(B)

Ca2BP

BP

20 30 40 50 60 70 80
2θ
Figure II B-6: Diagramme de DRX des sels de risédronate de calcium préparés
et du risédronate monosodique (BP).

85
 II-2-2-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier (IRTF)
Le spectre infrarouge réalisé sur l’échantillon de risédronate monosodique
(Figure II B-7) est comparable à ceux des sels de sodium semi-pentahydratés du
risédronate (Redman-Flurey et al., 2004). Il indique la présence de deux bandes de
faible intensité vers 3557 et 3614 cm-1 caractéristiques de deux environnements
différents des molécules d’eau dans la structure cristalline du risédronate de sodium.
La bande large centrée vers 3366 cm-1 est attribuée à des groupements OH- impliqués
dans les liaisons hydrogène. L'épaulement observé vers 3333 cm-1 est associé aux
groupes hydroxyles OH attachés au carbone central du risédronate (C-OH). La région
spectrale située entre 900 et 1200 cm-1 est dominée par des bandes intenses
caractéristiques d'acides phosphoniques, superposées à celles de la fonction pyridine.
Les bandes attribuées aux modes de vibrations symétrique et asymétrique des
groupements phosphonates (PO3) apparaissent dans la région 1000 – 1150 cm-1. La
vibration des liaisons P−OH est observée vers 935 cm-1. Le spectre montre également
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des bandes larges situées entre 1600 et 2700 cm-1, attribuées aux ions OH- associés aux
groupements O=P−OH (Redman-Flurey et al., 2004). Les bandes de vibration
caractéristiques de liaisons P−C sont situées entre 650 et 795 cm-1 (Socrates, 2004).
Un premier examen des spectres obtenus pour les sels de calcium synthétisés
(Figure II B-7) montre qu’ils présentent des bandes de vibration similaires dans la
région caractéristique des groupements phosphonates (PO3) et des fonctions pyridine.
La bande de l’eau dans ces composés est plus intense que celle du sel de sodium. Il
parait difficile de différencier entre les sels de calcium précipités du fait qu’aucun
déplacement significatif de bandes n’est observé. Cependant, les spectres des sels
désignés CaBP(A) et CaBP(B) présentent d’une manière générale des bandes plus
fines et mieux résolues comparées à celles du précipité Ca2BP, notamment dans la
région spectrale spécifique aux modes de vibrations des groupements PO3 où un
dédoublement est observé. Ces observations sont en accord avec l'état cristallin des
précipités révélés par la diffraction des rayons X.

86
 PO3
H2O

P-C
H2O

CaBP(A)

CaBP(B)
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Ca2BP

P-OH
C-OH
O=P-OH P-C
OH
BP

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II B-7: Spectres IR des sels de risédronate de calcium synthétisés et du

risédronate monosodique (BP).

87
 II-2-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman
La spectrométrie Raman est complémentaire à la spectrométrie IR et est plus
sensible aux modes de vibrations du groupement pyridine présent dans le
bisphosphonate étudié. La figure II B-8 montre les spectres Raman du risédronate de
sodium et des précipités synthétisés. Les différentes bandes de vibration observées
pour ces composés et les attributions correspondantes sont regroupées dans le tableau
II B-1. Il apparaît clairement que l’interaction du risédronate avec les ions calcium
dans les sels préparés se traduit par le déplacement de bandes caractéristiques des
divers groupements par rapport à celles du sel de sodium. Afin de mettre en évidence
les différences ainsi notées, plusieurs domaines de vibration ont été examinés:
- Domaine de vibration 575 – 775 cm-1 (Figure II B-8, b): cette région spectrale
est caractéristique du domaine de vibration des liaisons C–P. Les deux bandes intenses
qui apparaissent vers 629 et 661 cm-1 sur le spectre du sel de sodium (BP) sont
déplacées vers les nombres d’ondes élevés (respectivement 642 et 677 cm-1) dans le
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cas du Ca2BP et sont dédoublées pour le solide CaBP(A). Pour le solide CaBP(B),
seule la bande vers 642 cm-1 est dédoublée. Ces déplacements de fréquence traduisent
l’existence de fortes interactions entre les molécules de risédronate et les ions calcium.
- Domaine de vibration 800 – 1100 cm-1 (Figure II B-8, c): pour le risédronate
seul, on note des bandes intenses vers 1024 et 1054 cm-1 attribuées aux modes de
déformation des liaison C – H du groupement pyridine (Redeman-Fuery et al., 2005);
ces bandes sont déplacées sur les spectres des sels de calcium préparés respectivement
vers 1035 et 1050 cm-1.
- Domaine de vibration 1500 – 1700 cm-1 (Figure II B-8, d): ce domaine spectral
est sensible aux liaisons hydrogène crées par les molécules d’eau (Redeman-Fuery et
al., 2005). Le spectre du sel de sodium (BP) montre une bande intense vers 1638 cm-1
avec un épaulement vers 1626 cm-1 ainsi qu’un pic moins intense à 1570 cm-1, assignés
aux vibrations du groupement pyridine. Dans les solides préparés, la bande intense et
l’épaulement sont toujours présents mais sont déplacés respectivement vers 1595 cm-1
et 1581 cm-1, tandis que le pic vers 1570 cm-1 figure seulement dans le composé
CaBP(A). Les spectres des précipités CaBP montrent en outre une bande vers 1635
cm-1, dédoublée pour le composé A et non dédoublée pour B. Ce domaine de vibration
permet donc de différencier entre la forme libre et les différents sels du risédronate de
calcium.

88
 (a)

CaBP(A)

CaBP(B)

Ca2BP

δC-H(pyr)
υ C=C, υ C=N

υ P-O(H)
υ P-O(H)

υ C-C-O
υ P=O

υ C-P
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δC-C
s
s

BP

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
-1
Nombre d'onde (cm )

(d) (c) (b)

677
1626

1595

1050

633
1638

1581
1569

642
1035

971

CaBP (A)

CaBP (B)

Ca2BP

BP

1700 1600 1500 1100 1000 900 800 750 700 650 600
-1 -1 -1
Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm )

Figure II B-8: Spectres de diffusion Raman du risédronate de sodium (BP) et des sels
de calcium élaborés dans différents domaines de vibration :
(a) domaine 200 - 2000 cm-1 ; (b) domaine 575 - 775 cm-1 ;
(c) domaine 800 - 1100 cm-1; (d) domaine 1500 - 1700 cm-1.

89
 Tableau II B-1: Attributions de principales bandes de vibrations observées dans les
spectres Raman du risédronate monosodique et des précipités.

Attributions Risédronate a,b Ca2BP CaBP(A) CaBP(B)

276 m - - -
δ C−C
320 f 324 f l - -

642 f 642 tf
629 m 642 m, l
ν C−P 633 f 633 m

661 m 677 m, l 677 m 673 m

ν C−C−O 823 f 807 m, l 807 m,l 807 m

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δ (P-OH) 862 m 849 f 855 m -

932 f 914 f, l 923 f -

νs P−O(H) 970 m 967 m, l 965 m 959 f,l

1033 ép - - -

1024 F 1034 tF 1031 tF 1033 F

δ (C−H) pyridine
1054 F 1048 F 1048 tF 1050 tF

ν P=O/δ∏ POH 1222 p 1229 m 1229 m 1223 m

δ (C-H) pyridine 1315 m 1325 ml - 1323 ép

1445 f 1439 fl 1439 fl 1445 fl

ν (C=N), 1569 m - - -
ν (C=C) pyridine
1625 tf 1582 tf 1581 tf 1581 tf

1637 F 1596 F 1596 F 1596 m

p: petite ; m: moyenne; ml: moyenne et large; F: forte; tF : très forte ;

f : faible ; tf : très faible ; ép: épaulement
a: CuKrowski et al 2007 ; b: Socrates, 2004

90
 II-2-2-4- Spectroscopie RMN de l'état solide
Les expériences menées par RMN 31P du solide sur le risédronate monosodique
et les sels de calcium permettent de clarifier l'environnement local des noyaux de
phosphore. Pour cela deux types de mesures RMN ont été réalisés sur les poudres, à
savoir des séquences HPDEC 31P {1H} (Découplage dipolaire et scalaire à haute
puissance du proton) et polarisation croisée à l’angle magique de rotation (1H-31P CP
MAS). Rappelons que dans le cas de la technique HPDEC, il s’agit d’une polarisation
directe des noyaux de phosphore sans passer par le proton; la polarisation croisée
quant à elle consiste en un transfert d’aimantation du proton vers le phosphore, ce qui
permet de réduire les temps d’acquisition et d’augmenter la sensibilité en exaltant la
contribution des noyaux de phosphore à proximité immédiate de protons.
En fait, si on considère les spectres obtenus, les deux méthodes donnent la
même résolution et des déplacements chimiques du même ordre. Pour cette raison,
seuls les spectres obtenus par polarisation croisée (1H-31P CP MAS) sont présentés.
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Le spectre du risédronate de sodium (Figure II B-9) montre deux pics vers

19,01 ppm et 17,12 ppm, qui indiquent deux environnements différents du 31P dans la
structure. En effet les deux groupements phosphonate ne sont pas chimiquement
équivalents dans la molécule et, par ailleurs, l’ion sodium et les molécules d’eau
n’interagissent pas de façon identique avec ces deux groupements, en accord avec les
déterminations structurales de Redman-Flurey et al. (2005).
Dans le cas du précipité Ca2BP, les deux pics caractéristiques du risédronate
disparaissent et sont remplacés par un massif large centré à 18,14 ppm. Ce résultat
confirme le changement significatif de l'environnement des noyaux du phosphore suite
à l’interaction avec le calcium. L'allure du massif est en accord avec l'état amorphe de
ce composé révélé par la DRX.
Dans le cas des solides CaBP(A) et CaBP(B) préparés dans un rapport Ca/BP
de 1, les spectres RMN 1H→31P CP MAS présentent différents pics avec des positions
variables, qui pourraient être attribués aux différences d’environnement des noyaux de
phosphore et du taux d’hydratation. Pour le composé CaBP(B), on note la présence de
deux pics larges vers 16 et 19 ppm ainsi qu’un épaulement à 13,5 ppm. Ces pics sont
déplacés par rapport au sel de sodium, et les deux groupements phosphonate là encore
possèdent deux environnements chimiques différents. Pour le composé CaBP(A), le
spectre présente 2 raies fines à 11,84 et 19,47 ppm et un épaulement vers 22,19 ppm.
Ces observations attestent de l’état bien cristallisé du composé, en accord avec le
diagramme DRX. Ces trois raies apparaissent sur une bande large centrée vers 19 ppm
ressemblant à celle observée pour le solide Ca2BP.

91
 19.5

11.8
22.2
CaBP(A)

19.0

16.0

13.5
18.1
CaBP(B)
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17.1
19.0

Ca2BP

BP

40 30 20 10 0
ppm/H3PO4

Figure II B-9: Spectres RMN 1H→31P CP MAS du risédronate de sodium (BP) et des
sels de risédronate de calcium élaborés.

92
 II-2-2-5- Microscopie électronique à balayage (MEB)
Les observations par MEB du risédronate de sodium montrent des blocs de
plusieurs dizaines de µm de longueur, lesquels sont formés de lamelles accolées
d’épaisseur proche du µm (Figure II B-10). Les photos MEB du précipité Ca2BP
montrent des blocs de forme anguleuse de taille hétérogène allant jusqu’à plusieurs
dizaines de µm de longueur. Dans le cas de CaBP(A) et CaBP(B) on note la présence
de petits cristaux de longueur avoisinant le µm, attestant d’une cristallinité meilleure
de ces précipités, en accord avec les résultats obtenus par DRX.

II-2-2-6- Analyses chimiques

Les dosages du calcium et du risédronate ont été réalisé après solubilisation des
précipités dans de l’acide nitrique (3N), respectivement par volumétrie en retour après
complexation par l'EDTA et par spectroscopie UV-Visible. Les résultats obtenus
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(Tableau II B-2) indiquent que le solide Ca2BP présente un rapport molaire (Ca/BP =
1,94) proche de 2; pour les solides CaBP(A) et CaBP(B) préparés dans un rapport
Ca/BP en solution de 1, les rapports molaires sont de 0,89 et 1,23, respectivement.

Tableau II B-2: Composition chimique (% massique ± erreur relative) des sels de

risédronate de calcium préparés.

Echantillon Ca % BP % Ca/BP
(± 0,5 %) (± 0,5 % ) (± 1 %)

Ca2BP 2,45 11,06 1,94

CaBP (A) 1,03 10,10 0,89

CaBP (B) 1,10 7,89 1,23

93
 BP

Ca2BP
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CaBP(A) CaBP(B)

Figure II B-10: Observations par MEB du risédronate de sodium (BP) et des sels du
risédronate de calcium.

94
 II-3- Etude complexométrique
II-3-1- Etude par conductimétrie
Afin d'étudier les interactions susceptibles d'avoir lieu dans des conditions
physiologiques (pH ∼ 7,3 et T ∼ 37°C) entre les ions calcium et le risédronate
monosodique, la conductivité ionique corrigée (χc) d'une solution aqueuse de
risédronate de concentration donnée (2,9 10-4 M) a été suivie en fonction de l’ajout
(2ml/min) d'une solution de nitrate de calcium de concentration connue (10-2 M). Le
dispositif expérimental utilisé est présenté ci-dessous (Figure II B-11).

Solution aqueuse de Ca(NO3)2, 4H2O (10-2 M)

Electrode de conductivité
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Electrode de pH

100 ml d'une solution aqueuse

Bain thermostaté à 37 °C de risédronate (2,9 10-4 M)

Figure II B-11: Dispositif expérimental de mesure de conductivité

En l’absence de risédronate, la courbe témoin obtenue est une droite (Figure II

B-11) de pente proche de 33 µS.cm-1, caractéristique de l’ajout de nitrate de calcium
dans le milieu.
La courbe obtenue pour la solution contenant du risédronate (Figure II B-12
« BP »), comparée à celle du témoin, montre deux segments de droites de pentes
différentes. Au-delà du point d’intersection des deux segments, la droite ascendante
montre une pente similaire à celle de la courbe témoin (∼ 33 µS.cm-1); cette allure est
caractéristique de l’ajout de nitrate de calcium dans le milieu et traduit donc l’absence
d’interaction entre ions calcium et molécules de bisphosphonates. Le changement de
pente noté est progressif et devient total lorsque la pente prend la valeur de celle de la
droite témoin; la quantité en ions calcium relative à ce changement de pente est aux
alentours de 5-6 mL (soit environ 4,5 10-5 mol). Le rapport Ca/BP présent dans le
milieu se rapproche alors de 2. Par ailleurs, le segment en dessous du point
d’intersection présente une faible valeur de pente (∼ 19 µS.cm-1) et traduit la
consommation des ions calcium suite à leur interaction avec le risédronate. Cette
association du calcium et du risédronate pourrait être le résultat de la formation de sels

95
 de risédronate de calcium. Il est à noter que le changement de pente ne s’accompagne
pas instantanément de la formation d’un précipité visible; l’apparition de ce précipité
est progressive, ce qui pourrait expliquer que le changement de pente n’est pas brutal
mais progressif.
Par ailleurs, l’addition des ions calcium dans la solution de bisphosphonates
s’accompagne d’une diminution de pH (7,3 à 6,3), ce qui témoigne du passage de
protons H+ en solution (Figure II B-13); cette baisse est moins importante (7,3 à 6,8)
dans la solution aqueuse sans risédronate (témoin).

III-3-2-Caractérisations du précipité obtenu

Lorsque la quantité de calcium ajoutée est assez importante (V ≥ 10 ml) et/ou
que le temps de réaction est suffisamment long, le milieu réactionnel devient trouble.
Le précipité blanc ainsi formé a été immédiatement isolé par filtration sur millipore
(0,45 µm), séché une nuit à 37°C puis analysé par spectroscopie infrarouge. Le spectre
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

IR obtenu (Figure II B-14) a été comparé à celui du sel de sodium (BP) et du sel
Ca2BP.
Les différences principales notées par rapport au sel de sodium concernent :
- la disparition des bandes attribuées aux modes de vibration des groupements
(OH) et l'apparition de bandes larges vers 3400 cm-1 et 1640 cm-1 attribuées à l'eau de
structure.
- le déplacement des bandes attribuées aux groupements PO3 et élargissement
de celles-ci après interaction avec le calcium.
- la disparition de la bande de vibration des liaisons P−OH (935 cm-1) dans les
groupements phosphonate et apparition d'une bande vers 985 cm-1.
- les bandes de vibrations des liaisons P−C ont été déplacées vers la région 680
- 801 cm-1.
Nous remarquons en outre que le spectre IR du précipité récupéré CaxBPy est
similaire à celui du Ca2BP précédemment synthétisé et analysé; ceci est en accord avec
la valeur du rapport Ca/BP (proche de 2) correspondant au changement de pente relevé
par conductimétrie. La faible quantité de précipité récupéré lors de cette étude
complexométrique ne nous a pas permis d’approfondir notre investigation.

96
 600 Témoin

BP
400
χc(µS.cm )
-1

200
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

0
0 3 6 9 12 15
Calcium ajouté (ml)

Figure II B-11: Variation de la conductivité corrigée en fonction du volume de

solution queuse de calcium ajoutée ([Ca] = 10-2 M) sans
risédronate (témoin) et en présence de risédronate de
concentration ([BP] = 2,910-4 M).

97
 8.00

Témoin
7.75
BP

7.50

7.25

7.00
pH

6.75
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

6.50

6.25

6.00
0 2 4 6 8 10 12 14
Calcium ajouté (ml)

Figure II B-12: Variation du pH en fonction du volume de solution

aqueuse de calcium ajoutée ([Ca] = 10-2 M) sans risédronate
(témoin) et en présence de risédronate ([BP] = 2,9 10-4 M).

98
 PO3

H2O

P-C
H2O

Ca2BP
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

CaXBPY

P-OH

C-OH
OH O=P-OH P-C

BP

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure II B-13: Spectres infrarouge du risédronate monosodique (BP), du sel de

risédronate de calcium formé (CaxBPy).et du précipité Ca2BP
synthétisé.

99
 III- DISCUSSION
L’étude menée par les différentes techniques physico-chimiques montre d’une
manière générale que la réaction en solution des ions calcium avec les molécules de
bisphosphonate peut donner lieu, selon les conditions expérimentales, à deux types de
précipités: des composés amorphes (Ca2BP) ou cristallins (CaBP(A) et CaBP (B)). Des
observations similaires ont été rapportées pour la réaction de l'étidronate (molécule
modèle des bisphosphonates) en présence d’une solution de calcium (Browning et
Fogler, 1996).
Dans le but de clarifier les phénomènes observés, les réactions chimiques qui
gouvernent la formation de chaque type de précipité doivent être établies. Dans les
conditions de pH examinées (6,8 < pHfinal < 9,7), les espèces bisphosphonate
prédominantes sont de forme H2BP2- et HBP3-. Cependant, on ne peut pas pour autant
en conclure que les formes CaBP et Ca2BP sont favorisées sans prendre en compte les
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

solubilités respectives des différents sels susceptibles de se former.

Pour le sel CaBP, la réaction de précipitation est la suivante:
Ca 2+ + H 2 BP 2− ⇔ CaH 2 BP (1)

La constante d’équilibre (K1) de cette réaction s’exprime par la relation:

a CaH 2 BP 1
K1 = = (2)
a Ca 2+ a H 2− Ks1
2 BP

où ai désigne l’activité de l’espèce « i » et Ks1 le produit de solubilité du sel CaH2BP.

De la même manière, la réaction chimique correspondant à la formation du sel

Ca2BP s’écrit:
2 Ca 2+ + HBP 3− ⇔ Ca 2 BP + H + (3)

a Ca BP
a H+ 1
K2 = 2
= (4)
a 2 2+ a 3− Ks 2
Ca HBP

En plus de ces deux réactions, l’équilibre de dissociation impliquant les espèces

prédominantes dans le domaine du pH exploré doit être également pris en
considération :
H 2 BP 2− ⇔ HBP3− + H + (5)

100
 a HBP3− a H +
Ka 4 =
aH (6)
2−
2 BP

Ka4 désigne la constante de la quatrième acidité du risédronate.

A partir de ces équations établies, un équilibre reliant les deux types de
précipités peut être exprimé de la manière suivante:
Ca 2 + + CaH 2 BP ⇔ 2 H + + Ca 2 BP (7)
En mettant une valeur de 1 pour l’activité des sels de calcium de risédronate, la
constante d’équilibre correspondante (K) devient:

a 2H + K Ks
K= = Ka 4 2 = Ka 4 1 (8)
a Ca 2+ K1 Ks2
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Il est maintenant clair à partir de l’équation 7 et la constante d’équilibre

correspondante (8) que l’augmentation de la teneur en ions calcium et/ou la diminution
de la concentration des protons (augmentation du pH) aura pour effet un déplacement
de l’équilibre 7 vers la droite et favorisera donc la formation du précipité Ca2HBP.
Ces observations montrent clairement que la nature du précipité formé dépend
fortement du pH du milieu réactionnel et du rapport Ca/BP en solution. En fait,
l’habilité des molécules de risédronate à précipiter en présence des ions calcium
dépend fortement de la capacité des groupements phosphonate de ces molécules à
perdre des protons et donc constituer des sites favorables pour l’attaque des ions
calcium. Ce processus de déprotonation est assez dépendant du pH des solutions de
précipitation. Cela a un impact direct sur le nombre d’ions calcium capable de se lier
aux groupements phosphonate de la molécule. Des études similaires menées sur les
précipités obtenus entre ions calcium et le diethylentriamine penta
(methylenephosphonique acide - DTPMP), un acide phosphonique contenant 5
groupements phosphonate, ont montré qu'à des valeurs de pH comprises entre 4 et 5,5,
trois ions calcium peuvent former des liaisons avec le DTPMP (Kan et al., 1994).
Nous avons montré par l’intermédiaire de différentes techniques de
caractérisation que les précipités CaBP(A) et CaBP(B) obtenus dans un rapport
molaire Ca/BP en solution de 1, sont de même nature cristalline mais de morphologies
différentes. Cette différence peut être due, en plus du pH, au degré de sursaturation du
milieu réactionnel. Ce dernier paramètre dépend à la fois des concentrations initiales
en ions calcium et risédronate utilisées ainsi que de la solubilité des précipités formés.
Il a été montré dans le cas des précipités d'étidronate de calcium formés à des pH
acides, que le degré de sursaturation affecte considérablement la forme et la taille des

101
 cristallites obtenus (Browning et Fogler, 1995). Cela est dû essentiellement à
l'influence du degré de sursaturation sur la nucléation des cristaux et leur croissance
cristalline.

IV- CONCLUSION
Ce travail nous a amené, dans un premier temps, à préparer des sels de
risédronate de calcium. Pour cela diverses conditions expérimentales ont été adoptées.
Nous avons noté que la précipitation des sels de calcium de risédronate était gouvernée
par différents facteurs (pH et rapport Ca/BP en solution). L’examen des poudres
obtenues par différentes techniques de caractérisation physico-chimiques nous a
permis d'identifier trois familles de sels de calcium de risédronate :
Ca2BP : obtenu à de forte concentration et à pH basique dans un rapport Ca/BP
en solution de 2. Dans ces conditions la précipitation est rapide et le produit obtenu est
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

amorphe, de rapport final Ca/BP de 2.

CaBP(A) : obtenu à de forte concentration et à pH légèrement acide dans un
rapport Ca/BP en solution de 1. le composé formé est bien cristallisé et présente un
rapport molaire Ca/BP de 0,9.
CaBP (B) : obtenu à de faible concentration et à pH basique avec un rapport
Ca/BP en solution de 1. La précipitation est plus lente et le produit cristallisé issu
montre un rapport molaire Ca/BP de 1,2.
Dans une seconde étape, l’étude complexométrique a permis de mettre en
évidence les interactions susceptibles d'avoir lieu dans des conditions physiologiques
entre les ions calcium et le risédronate monosodique. Le sel de calcium alors récupéré
est proche du Ca2BP précédemment décrit.
Les résultats de ce chapitre seront d’un apport considérable à la compréhension
des phénomènes susceptibles de se produire à la surface du minéral osseux. L’étude de
l’adsorption du risédronate sur les modèles osseux apatitiques ne pourra être complète
que par une caractérisation fine des solides récupérés après adsorption. Aussi l’étude
des sels de calcium du risédronate constitue un point de départ important pour la suite
de ce travail de thèse.

102
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Chapitre III
ADSORPTION DU RISEDRONATE
MONOSODIQUE PAR
L'HYDROXYAPATITE
 I- INTRODUCTION
L’étude des phénomènes qui interviennent à l’interface entre phosphates de
calcium et molécules biologiquement actives a fait l’objet de nombreux travaux en
raison de leur importance dans le domaine biomédical. Parmi ces principes actifs, les
bisphosphonates (BPs) ont retenu l’attention de plusieurs chercheurs durant ces
dernières décennies. Il a été bien établi in vitro que les effets physico-chimiques de
divers BPs sont similaires à ceux du pyrophosphate et que ces espèces inhibent la
formation, l’agrégation, et ralentissent également la dissolution des cristaux de
phosphate de calcium (Fleisch, 2003). Ces effets ont été attribués à l’affinité marquée
des groupements phosphonate de ces molécules pour la surface du matériau
phosphocalcique. Nancollas et al. (2006) ont rapporté que cette affinité dépend
fortement de la structure chimique de la molécule, et spécialement du groupement
situé sur la chaîne carbonée.
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Divers modes d’interaction des bisphosphonates avec l’hdyroxyapatite ont été

proposés. Selon Josse et al. (2005), la fixation du zolédronate est gouvernée par un
phénomène d’échange ionique entre les groupements phosphonate de la molécule et
phosphate de la surface du support HA. Un phénomène similaire a été observé pour
l’interaction in vitro de différents bisphosphonates vis-à-vis de l’os humain
(Mukherjee et al., 2008). Par ailleurs, l’étude menée par Raman et RMN du solide sur
les supports obtenus après adsorption de l’étidronate (Curkrowski et al., 2007) suggère
la formation de complexes avec les sites calcium à la surface de l’hydroxyapatite. La
formation de cristaux solides en surface a aussi été notée lors de l’interaction du
zolédronate avec le phosphate tricalcique-β (Roussière et al., 2008). Cependant peu
d’études systématiques ont été engagées sur le rôle des ions minéraux dans le
processus d’adsorption des bisphosphonates à la surface des apatites et les données
d’adsorption sur le risédronate sont rares.
Dans cette perspective, nous nous proposons dans ce chapitre d’examiner
l’influence de la composition du milieu sur la fixation et la libération des BPs, d’une
part, et de corréler entre les teneurs des ions minéraux libérés en solution et les espèces
BPs adsorbées, d’autre part. Cette approche nous permet de quantifier les échanges
susceptibles d’avoir lieu entre la solution et les particules solides de l’apatite. En outre,
la caractérisation des poudres issues des tests d’adsorption, moyennant différentes
techniques physico-chimiques (DRX, FTIR, Raman, RMN de l’état solide et analyses
chimiques), permettrait de mieux comprendre l’évolution du système et déceler toute
éventuelle modification structurale, altération morphologiques des solides et/ou
formation de sels insolubles.

103
 II- ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR L'HYDROXYAPATITE

II-1- Matériaux et méthodes

II-1-1- Protocole expérimental
Les tests d'adsorption peuvent être réalisés soit par suivi de la diminution de la
concentration de l'adsorbat dans la solution ou par dosage de la quantité fixée à la
surface du solide. Toute éventuelle désorption (partielle ou totale) des molécules
d'adsorbats lors du lavage du solide, conduirait à des résultats erronés lors de la
quantification des espèces fixées par l'adsorbant. Pour ces raisons, nous avons opté
pour la première méthode.
II-1-2- Adsorbant et adsorbat
L'adsorbant utilisé dans cette étude est une apatite de synthèse obtenue par
précipitation en 3 heures. Il s'agit d'une hydroxyapatite (HA) bien cristallisée,
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

légèrement déficiente en calcium (Ca/P = 1,64) et présentant une surface spécifique de

59 m²/g.
Le bisphosphonate que nous avons utilisé est le risédronate monosodique semi
penta hydraté fourni par les laboratoires Procter & Gamble Pharmaceuticals. Ce
principe actif rentre dans la composition de comprimés commercialisés sous le nom
« d’Actonel ». Nous rappelons que le risédronate monosodique sera désigné par BP
(bisphosphonate).
Les différentes caractéristiques physico-chimiques de ces matériaux ont fait
l'objet du deuxième chapitre de ce manuscrit.
II-1-3- Adsorption
Les solutions utilisées comme milieu d'adsorption sont fraîchement préparées;
elles ont été obtenues en dissolvant la quantité appropriée de risédronate dans une
solution standard de chlorure de potassium (KCl, 1 mM) ou dans le même milieu
contenant du chlorure de calcium (CaCl2, 2H2O; 0-0,2 mM) ou du phosphate de
potassium (KH2PO4; 0-10 mM). Dans certains cas, la force ionique des solutions
d’adsorption a été ajustée par addition de solutions de KCl (0-10 mM). Le pH des
solutions d'adsorbats (pHinitial) a été ajusté selon le cas, par addition d'une solution de
KOH (0,5-3,5 M) et/ou d’une solution de HCl (0,5-2,5 M).
La démarche adoptée pour nos tests d'adsorption repose sur des expériences
réalisées en conditions statiques, sous forme de tests en «batch». Le dénominateur
commun de ces tests est la mise en suspension des poudres d’apatites (50 mg) dans des
tubes en polyéthylène de contenance 10 ml, avec 5 ml de solutions d’adsorption. La
gamme de concentration examinée varie entre 0 et 5,7 mM. Après agitation des

104
 suspensions aux ultrasons (2 à 3 min), les tubes ont été incubés durant deux heures
dans une étuve dont la température a été préalablement fixée à 25 ± 1°C ou à 37 ± 1°C.
Les suspensions ainsi obtenues ont été centrifugées durant 20 min à 15000 tr/min, puis
filtrées sur millipore (∅ 0,2 µm). Les mesures du pH d’équilibre (pHéquilibre ou
pHadsorption) ont été réalisées sur le surnageant obtenu après chaque test d’adsorption.
Dans tous les cas, des témoins contenant seulement la solution de
bisphosphonates ont été traités dans les mêmes conditions que les expériences
d’adsorption, afin de tenir compte de toute éventuelle fixation d’adsorbat sur les parois
des tubes utilisés. Nous avons conclu qu’aucune adsorption du risédronate ne se
produit sur les parois des tubes.
La quantité de bisphosphonate adsorbée (Q) a été déterminée par différence
entre la concentration initiale de la solution d’adsorbat (Co) et celle obtenue à
l’équilibre (Ce) selon la relation :
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

V
Q = (C o − C e ) ×
m
où V désigne le volume de la solution utilisé (L) et m la masse de l’adsorbant
(g). La quantité adsorbée Q peut être rapportée à l’unité de masse ou de surface
spécifique du support. Des tests d’adsorption ont été réalisés plusieurs fois (2 à 3 fois)
afin d’estimer l’erreur sur la quantité d’adsorbat fixée à la surface du support. La
reproductibilité de nos observations expérimentales a été estimée à environ 5 %.
II-1-4- Réversibilité
L’examen de la réversibilité du processus de fixation des molécules de
risédronate a été examiné vis-à-vis de la dilution. Pour cela, une quantité bien définie
du surnageant obtenu après adsorption a été remplacée soit par un volume égal d’une
solution de KCl (1mM, pHinitial ∼ 7,4) pré-équilibrée dans les mêmes conditions
d’adsorption en présence du solide, soit par une solution de pHinitial ∼ 7,4 contentant du
KCl (1mM) et du KH2PO4 (0-25 mM). La nouvelle suspension a été incubée pendant 2
h; après centrifugation, le surnageant obtenu a été analysé afin de déterminer la
quantité de risédronate éventuellement libérée par le solide. Ces tests de la réversibilité
vis-à-vis de la dilution ont été réalisés aux températures 25 ± 1°C et 37 ± 1°C.
II-1-5- Etude de libération
Les tests d’adsorption ont été réalisés dans des conditions physiologiques de pH
et température (pHinitial ~ 7,4 et T ~ 37°C) avec une concentration initiale en adsorbat
représentative du plateau de saturation (Co = 3,25 mM).

105
 Les échantillons d’apatites récupérés après centrifugation ont été lavés à trois
reprises avec 100 ml de solution aqueuse décarbonatée (pHinitial ∼ 7,4) puis séchés à
l’étuve. L’analyse des eaux issues des opérations de lavage indique qu’aucune
désorption des molécules de risédronate initialement fixées par les cristaux de l’apatite
n’a été détectée.
Les poudres ainsi obtenues ont été remises en suspension, soit avec 5 ml de
solution de chlorure de potassium (KCl, 1 mM) préalablement équilibrée en présence
du solide HA, soit avec 5 ml d’une solution contenant du chlorure de potassium (KCl,
1 mM) et du phosphate de potassium (KH2PO4, 10 mM). Le pH initial de ces milieux
de désorption utilisés a été ajusté à des valeurs de 4,5, 7,4 et 9,5. Les nouvelles
suspensions ont ensuite été incubées à T ~ 37°C pour des périodes allant de 1 heure à 3
jours. Après centrifugation, les surnageants récupérés ont fait l’objet d’analyse pour
déterminer toute éventuelle libération des molécules de risédronate.
II-1-6- Analyse chimique
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Le dosage du risédronate dans les solutions d’adsorption a été réalisé par

spectrophotométrie UV-Visible à 262 nm. Les détails relatifs à cette méthode ont été
décrits dans la partie B du deuxième chapitre de ce manuscrit.
La quantification des espèces phosphore et calcium dans les filtrats a été
réalisée respectivement par colorimétrie utilisant le complexe phospho-vanado-
molybdique et par spectrométrie d'émission optique par plasma à couplage inductif
(ICP/OES). Les solutions d’adsorption ont également été examinées par RMN 31P du
liquide.

II-2- Résultats
II-2-1- Cinétique d’adsorption
La durée de contact adsorbant-adsorbat nécessaire pour atteindre l’équilibre a
été déterminée en milieu KCl (1 mM ; pHinitial 7,4) avec une concentration initiale en
adsorbat voisine de 0,86 mM. L’évolution de la quantité de risédronate adsorbée a été
reportée en fonction de la durée d’incubation (Figure III-1). Comme on peut le voir,
l’équilibre est atteint environ 20 min après addition de la solution de risédronate à
l’apatite, attestant ainsi de la rapidité du processus de fixation du BP par le support
dans les conditions examinées.
Pour la suite de notre étude relative à l’échantillon HA, nous avons opté pour
une durée de contact de 2 h, temps largement suffisant pour atteindre l’équilibre.

106
 Quantité adsorbée (µmol/m²)

1
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

0
0 20 40 60 80
Duréedud'incubation
Figure III-1: Cinétique d’adsorption (mn)
risédronate dans un milieu KCl (1 mM)
par HA à T ∼ 37°C et pHinitial ∼ 7,4.

II-2-2- Isotherme d’adsorption

Les expériences d’adsorption menées avec des solutions en risédronate (pHinitial
∼ 7,4) de concentrations couvrant la gamme de 0 à 3,8 mM ont été réalisées à
températures voisines de 37°C et 25°C. Le pH des suspensions obtenues à l’équilibre
(pHadsorption) avoisine 7,7. Une simple comparaison des résultats obtenus dans les
conditions examinées (Tableau III-1) montre une grande capacité d’adsorption des
cristaux de HA à la température 37°C, comparée à 25°C. En effet, pour des solutions
de concentration initiale identique, le taux d’adsorption à température physiologique
varie entre 91% et 42%, tandis que cette variation est de 84% et 32% à température
ambiante.

107
 Tableau III-1: Données d’adsorption du risédronate à pHinitial ∼ 7,4 par HA à 37°C
et à 25°C: concentration initiale (Co), concentration à l’équilibre (Ce),
quantité fixée (Q) et pourcentage d’adsorption (%).

Température 25 °C Température 37 °C
Co Ce Q Ads Co Ce Q Ads
(mM) (mM) (µmol/m²) (%) (mM) (mM) (µmol/m²) (%)
0 0 0 0 0 0 0 0
0,12 0,02 0,18 84 0,25 0,02 0,38 91
0,35 0,05 0,52 87 0,52 0,03 0,84 95
0,45 0,06 0,66 86 0,69 0,05 1,08 92
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

0,56 0,09 0,81 85 0,82 0,07 1,27 92

0,82 0,20 1,04 75 1,03 0,16 1,48 85
1,17 0,44 1,24 62 1,41 0,32 1,85 77
1,83 0,93 1,53 49 2,12 0,97 1,95 54
2,84 1,92 1,56 32 2,83 1,64 2,02 42

108
 La variation de la quantité de risédronate retenue par l’échantillon HA, en
fonction de sa concentration à l’équilibre, est décrite par une isotherme de type
Langmuir, et ce pour les deux températures examinées (Figure III-2). L’allure des
courbes obtenues indique que le plateau de saturation est atteint pour des faibles
concentrations en risédronate, ce qui atteste de la grande affinité des molécules
d’adsorbat pour la surface du support.
Les paramètres caractéristiques de l’adsorption, à savoir la quantité adsorbée à
la saturation N (µmol/m²) et la constante apparente d’affinité de l’adsorbat pour la
surface du solide K (L/mmol), ont été déterminées à partir de l’équation de Langmuir
(Q = KNC / (1+KC)) linéarisée sous la forme suivante:
Ce Ce 1
= +
Q N KN
L’évolution de Ce/Q en fonction Ce donne lieu à des droites (Figure III-2) avec
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

des coefficients de corrélation d’environ 99,9%. Les valeurs des paramètres

caractéristiques de l’adsorption (K et N) ainsi déduites sont regroupées dans le tableau
III-2. L’augmentation de la température se traduit par une élévation à la fois de la
quantité adsorbée à la saturation (N) et de l’affinité apparente (K) de l’adsorbat pour la
surface du minéral. La quantité de molécules de risédronate fixée à la saturation dans
les conditions étudiées donne lieu à une surface occupée (δ) de 0,7 à 1,1 nm² par
molécule. Cette valeur a été estimée en tenant compte de la surface spécifique de
l’apatite considérée et de la quantité adsorbée à la saturation (mol/g) selon l’équation :
SBET
δ=
N × 6,02.1023
L’étude menée sur l’interaction de HA avec le pamidronate et l’étidronate
(Claessens et Kolar., 2000; Vitha et al., 2008) montre les mêmes capacités de
rétention. Cependant différentes valeurs de la constante d’affinité K sont reportées
pour des molécules appartenant à la famille de bisphosphonate, et parfois pour la
même espèce tel l’étidronate. Ces divergences pourraient être en partie liées aux
conditions expérimentales adoptées par les auteurs (gamme de concentration explorée,
peu de points expérimentaux exploités dans la partie ascendante de l’isotherme…).

109
 2,5 2
Quantité adsorbée (µmol/m²)

2,0

Ce/Q (m²/ml)
1,5

1,0

0,5

37°C
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

0,0 0
0,0 0,5 1,0 1,5
Concentration à l'équilibre (mM)
2,0 2
Quantité adsorbée (µmol/m²)

1,5

Ce/Q (m²/ml)
1,0 1

0,5

25°C

0,0 0
0 1 2
Concentration à l'équilibre (mM)

Figure III-2: Isothermes d’adsorption du risédronate par HA dans un milieu KCl

(1mM ; pHinitial ∼7,4) à 37°C et à 25°C.

110
 Tableau III-2: Paramètres d’adsorption du risédronate par HA en milieu
KCl (1 mM ; pHinitial ∼ 7,4) à 37°C et à 25°C.

N ± ΔN K ± ΔK
δ (nm²)
(µmol/m²) (L/mmol)
Risédronate (37°C) 2,3 ± 0,1 7,3 ± 3,6 0,7
Risédronate (25°C) 1,7 ± 0,1 8,6 ± 1,2 1,1
Pamidronate (25°C)
1,8 44 0,8 – 1,0
(Vitha et al., 2008)
Etidronate (25°C)
1,5 53 0,8 – 1,0
(Vitha et al., 2008)
Etidronate (25°C)
2,9 3,3 0,6
(Claessens et Kolar, 2000)
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II-2-3- Réversibilité du processus

La figure III-3 donne les isothermes d’adsorption du risédronate par HA à
pHinitial voisin de 7,4 et de désorption vis-à-vis de la dilution par une solution de KCl
(1 mM) pré-équilibrée en présence du solide, et ce pour les deux températures
examinées. La non superposition des points d’adsorption et de désorption traduit que
le processus est pratiquement irréversible dans les conditions expérimentales
examinées. Cette observation suggère que les molécules initialement fixées à la
surface de l’apatite ne sont pas déplacées de leur site d’attache par simple dilution avec
une solution de KCl.
Cependant, l’étude de la réversibilité vis-à-vis de la dilution en présence des
ions phosphate (0-25 mM) montre une tendance différente (Figure III-4). L’ajout de
ces espèces dans le milieu favorise le déplacement des molécules d’adsorbats de la
surface de l’HA et leur mise en solution; la quantité de risédronate désorbée augmente
avec la teneur en ions phosphate ajoutés.

111
 Quantité adsorbée (µmol/m²) 2 37°C

25°C

0
0 1 2
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Concentration à l'équilibre (mM)

Figure III-3: Isothermes d’adsorption (symbole fermé) et de désorption (symbole
ouvert) de risédronate par HA en milieu KCl (1 mM; pHinitial ∼ 7,4).

6
Risedronate désorbé (%)

0 10 20 30

Phosphate ajouté (mM)

Figure III-4: Evolution de la quantité de risédronate libérée en fonction de la quantité

de phosphate ajoutée (T ∼ 37°C; pHinitial ∼ 7,4; milieu KCl 1 mM
contenant du KH2PO4).

112
 II-2-4- Libération du risédronate
L’étude de libération a été réalisée avec des solutions contenant soit du KCl
seul (1mM; T ~ 37°C), soit du KCl additionné de KH2PO4 (10 mM); ces tests ont été
menés sur des poudres de HA ayant fixée une quantité de risédronate correspondante
au plateau de saturation (Qads = 2 µmol/m²; pHinitial 7,4; pHads ~ 7,7 et T ~ 37°C). Les
pH des solutions de désorption ont été initialement ajustés (pHinitial) à des valeurs de
4,5, 7,4 et 9,5; les pH des surnageants (pHéquilibre) obtenus après incubation de 3 jours
dans un milieu KCl (1 Mm) sont respectivement de 6,5, 7,3 et 7,9. Comme on peut le
voir (Tableau III-3), le taux de libération dépend à la fois de la nature de l’électrolyte,
du pH du milieu et de la durée d’incubation: le taux de relarguage le plus important est
obtenu lorsque l’éluant est un phosphate à pH basique.
L’analyse des résultats obtenus indique qu’aucune libération significative ne se
produit en présence du chlorure de potassium seul; dans ces conditions, le taux de
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libération du risédronate ne dépasse guère 5% même après 3 jours de traitement.

Cependant, lorsque le milieu de traitement est additionné d’ions phosphate ce taux
varie entre 8 et environ 30 % selon le pH du milieu.
Le profil de libération du support HA dans un milieu phosphate de pHinitial 7,5
(Figure III-5), valeur proche de celle du milieu d’adsorption, montre une augmentation
progressive (15 à 21 %) lorsque le temps d’incubation passe de 1h à 72h. Par ailleurs,
on note une légère diminution du taux de libération (1 à 4 %) lorsque le milieu de
traitement est acide ou alcalin. Dans tous les cas, on assiste à une variation brusque du
taux de libération durant les premières heures d’incubation.

113
 Tableau III-3: Taux de libération à T∼ 37°C de molécules de risédronate par HA
en fonction du temps : solutions de KCl (1mM) et KCl (1mM) et de
KH2PO4 (10 mM) à différents pHinitial (4,5, 7,4 et 9,5).

Milieu de pHinitial 4,5

KCl (1mM) KCl (1mM)+ KH2PO4 (10mM)

Temps d’incubation (h) Taux libéré ± 10 (%)
1 1,11 9,56
2 0,96 10,04
24 0,44 8,91
48 0,16 8,34
72 0,11 7,99
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Milieu de pHinitial 7,4

KCl (1mM) KCl (1mM)+ KH2PO4 (10mM)

Temps d’incubation (h) Taux libéré ± 10 (%)

1 2,48 14,95
2 2,15 17,15
24 1,98 17,70
48 1,23 19,36
72 0,81 21,32

Milieu de pHinitial 9,5

KCl (1mM) KCl (1mM)+ KH2PO4 (10mM)

Temps d’incubation (h) Taux libéré ± 10 (%)
1 5,13 29,27
2 5,24 27,02
24 5,15 26,23
48 4,06 25,60
72 3,89 25,31

114
 pHi = 4,5 pHi = 7,5 pHi = 9,5
40
Taux de risédronate libéré(%)

30

20

10
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0
10 20 30 40 50 60 70 80
Durée d'incubation (h)

Figure III-5: Profil de libération de risédronate par HA dans un milieu KCl (1 mM)
additionné de KH2PO4 (10 mM) à différents valeurs de pHinitial.

115
 II-2-5- Influence de la composition chimique du milieu sur l’adsorption
II-2-5-1- Influence du pH
Le solide a été dispersé dans des solutions d’adsorbat dont les valeurs initiales
de pH ont été ajustées à 4,8, 7,2 et 11; les valeurs de pH obtenues à l’équilibre
(pHéquilibre) sont respectivement proches de 6,6, 7,5 et 9,5. Le tableau III-4 regroupe les
données d’adsorption obtenues ainsi que les mesures de pH des solutions obtenues
avant et après adsorption. Les isothermes d’adsorption obtenues en milieu KCl (1 mM)
à 25°C aux différents pH considérés sont de type Langmuir (Figure III-6); les
paramètres d’adsorption correspondant sont reportées dans le tableau III-7 (A).
L’examen des résultats obtenus montre que la variation du pH du milieu
d’incubation affecte considérablement les propriétés d’adsorption du matériau. On
remarque que l’élévation du pH des solutions d’adsorbat s’accompagne d’une
diminution à la fois de la constante d’affinité (K) adsorbant-adsorbat et de la quantité
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adsorbée à la saturation (N) (Figure III-7). Il semble que les milieux acides favorisent
l’adsorption des molécules de risédronate. Ainsi, la capacité de rétention du support à
pH 6,6 est environ trois fois plus grande que celle notée à pH 9,5 (Tableau III-7 (A).
II-2-5-2- Influence des ions phosphate
L’influence des ions phosphate ajoutés (1-10 mM) dans les solutions
d’adsorption sur la fixation du risédronate par l’apatite a été examinée à 37°C et à pH
7,4. La force ionique du milieu (I) a été maintenue constante et proche de 11 mM;
cette valeur a été fixée par la solution la plus concentrée en phosphates (10 mM). Pour
les autres solutions, une quantité appropriée de KCl a été ajoutée. Les données
d’adsorption sont regroupées dans le tableau III-5.
La comparaison des paramètres d’adsorption obtenus (Tableau III-7 (B))
suggère que la présence des ions phosphate dans le milieu inhibe l’adsorption des
molécules de risédronate à la surface de l’apatite. En effet, les paramètres
caractéristiques des isothermes d’adsorption diminuent lorsque la teneur de ces
espèces ajoutées croît (Figure III-8).

116
 Tableau III-4 : Données d’adsorption du risédronate par HA à 25°C aux pH
étudiés : concentrations initiale (Co) et à l’équilibre (Ce), quantité
fixée (Q) et pH des solutions avant adsorption (pHinitial) et après
adsorption (pHéquilibre).
pHads = 6,6 ± 0,1
Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²) pHinitial - pHéquilibre
0,00 0,00 0,00 4,7 - 6,3
0,11 0,00 0,19 4,8 - 6,5
0,22 0,00 0,36
0,33 0,01 0,55
0,43 0,00 0,72 4,8 - 6,6
0,53 0,01 0,88
0,79 0,03 1,29
0,96 0,08 1,49 4,8 - 6,7
1,15 0,14 1,72
1,33 0,24 1,83
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1,64 0,40 2,10 4,8 - 6,6

pHads = 7,5 ± 0,1
Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²) pHinitial – pHéquilibre
0 0 0 7,2 - 7,3
0,12 0,02 0,18 7,2 - 7,5
0,35 0,05 0,52
0,45 0,06 0,66
0,56 0,09 0,81 7,3 - 7,5
0,82 0,20 1,04
0,98 0,31 1,15
1,17 0,44 1,24 7,2 - 7,5
1,37 0,53 1,43
1,66 0,76 1,53 7,2 - 7,5
pHads = 9,5 ± 0,1
Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²) pHinitial – pHéquilibre
0 0 0 11,0 - 9,1
0,13 0,08 0,08 11,2 - 9,5
0,22 0,12 0,16
0,31 0,14 0,28
0, 39 0,17 0,38 10,8 - 9,5
0,49 0,24 0,42
0,73 0,39 0,57
0,99 0,62 0,63 10,9 - 9,5
1,09 0,69 0,69
1,25 0,85 0,68
1,56 1,15 0,69 11,1 - 9,6

117
 Tableau III-5 : Données d’adsorption du risédronate par HA en milieu KCl (1 mM)
contenant du phosphate de potassium (KH2PO4 1-10 mM) :
T ∼ 37°C et force ionique I ∼ 11 mM.

Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²)

0,00 0,00 0,00
0,30 0,01 0,49
0,56 0,02 0,91
Phosphates ajoutés

0,99 0,13 1,46

1 mM

1,36 0,37 1,67

1,68 0,61 1,81
2,17 1,02 1,95
2,56 1,38 2,00
2,90 1,66 2,09
3,78 2,49 2,18
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Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²)

0,00 0,00 0,00
0,30 0,01 0,48
0,55 0,05 0,85
Phosphates ajoutés

0,98 0,21 1,32

5 mM

1,34 0,47 1,48

1,67 0,70 1,66
2,19 1,13 1,80
2,57 1,52 1,77
3,36 2,30 1,81
3,80 2,70 1,86

Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²)

0,00 0,00 0,00
0,30 0,04 0,44
0,56 0,08 0,81
Phosphates ajoutés

0,99 0,26 1,24

10 mM

1,49 0,65 1,44

1,69 0,78 1,54
2,20 1,19 1,71
2,62 1,60 1,72
2,90 1,85 1,79
3,83 2,75 1,84

118
 Tableau III-6: Données d’adsorption du risédronate par HA en milieu KCl (1mM)
contenant du chlorure de calcium (CaCl2, 2H2O ; 0 - 0,2 mM):
T ∼ 37°C et force ionique I ∼ 2 mM.

Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²)

0,00 0,00 0,00
0,31 0,00 0,52
0,56 0,02 0,91
Calcium ajouté

0,98 0,12 1,47

0,05 mM

1,35 0,36 1,68

1,74 0,62 1,90
2,20 1,03 1,98
2,60 1,37 2,09
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2,92 1,67 2,11

Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²)

0,00 0,00 0,00
0,29 0,00 0,48
0,55 0,01 0,92
Calcium ajouté

0,99 0,11 1,50

0,2 mM

1,37 0,36 1,71

1,69 0,59 1,87
2,20 1,05 1,95
2,60 1,39 2,05
2,91 1,67 2,11

119
 Quantité adsorbée (µmol/m²) 2
pH = 6,6

pH = 7,5

1
pH = 9,5

0.0 0.5 1.0

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Concentration à l'équilibre (mM)

Figure III-6: Isothermes d’adsorption à 25°C du risédronate par HA à différents pH.

2.8 K N 60

2.1
N (µmol/m²)

40
K (l/mmol)

1.4
20

0.7
0
6 7 8 9 10
pH

Figure III-7: Evolution des paramètres d’adsorption à 25°C du risédronate

en fonction du pH du milieu.

120
 2.50
K
N
15

2.25
N (µmol/m²)

K (l/mmol)
10

2.00

1.75
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0 4 8 12
Phosphates ajoutés (mM)

Figure III-8: Evolution des paramètres d’adsorption à T ∼ 37°C du risédronate par

HA en fonction de la quantité d’ions phosphate ajoutés.

II-2-5-3- Influence des ions calcium

Contrairement aux ions phosphate, la gamme de concentration explorée pour le
calcium est relativement faible (0,05 - 0,2 mM), et ce afin d’éviter toute éventuelle
précipitation de ces espèces en présence du risédronate. Les résultats d’adsorption
obtenus sont consignés dans le tableau III-6.
L’ajout d’ions calcium semble affecter très peu les paramètres d’adsorption
lorsque la concentration de ces espèces passe de 0,05 à 0,20 mM (Tableau III-7 (C)).
On assiste à une légère augmentation de l’affinité apparente du risédronate pour la
surface apatitique tandis que la quantité adsorbée à la saturation reste constante.

121
 Tableau III-7 : Influence de la composition de la solution sur l’adsorption du
risédronate par HA : quantité adsorbée à la saturation (N),
constante d’affinité apparente (K) et surface occupée par molécule
de risédronate adsorbée (δ).

A. Influence du pH : milieu KCl (1 mM) à T ∼ 25°C

pH inital pH adsorption N ± ΔN K ± ΔK δ
(± 0,1) (± 0,1) (µmol/m²) (L/mmol) (nm²/molecule)

4,8 6,6 2,1 ± 0,1 53,3 ± 15,7 0,7

7,2 7,5 1,7 ± 0,1 7,6 ± 1,2 1,0
11,0 9,5 0,8 ± 0,1 4,9 ± 1,0 2,1
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B. Influence des ions phosphate : T ∼ 37°C et force ionique I ∼ 11 mM

Phosphates ajoutés N ± ΔN K ± ΔK δ
(mM) (µmol/m²) (L/mmol) (nm²/molécule)

1 2,19 ± 0,05 12,4 ± 4,2 0,8

5 1,90 ± 0,02 11,8 ± 2,2 0,9
10 1,87 ± 0,03 9,7 ± 2,2 0,9

C. Influence des ions calcium : T ∼ 37°C et force ionique I ∼ 2 mM

Calcium ajouté N ± ΔN K ± ΔK δ
(mM) (µmol/m²) (L/mmol) (nm²/molecule)

0,05 2,1 ± 0,1 18,9 ± 6,8 0,8

0,20 2,1 ± 0,1 22,7 ± 10,3 0,8

122
 II-2-6- Influence de l'adsorption sur la composition du milieu
L’influence de l’adsorption sur la composition de la solution a été suivie en
déterminant les teneurs en ions calcium, phosphate et hydroxyle en solution en
fonction de la quantité de risédronate fixée à la surface du support. Les résultats
obtenus sont regroupés dans le tableau III-8.
L’adsorption du risédronate par l’apatite dans la gamme de concentration
examinée (0 - 5,7 mM) ne provoque pas de variation significative de pH (tout au plus
une élévation de 0,1 à 0,3 unité). L’analyse chimique des solutions, quant à elle, révèle
que la fixation des molécules de risédronate à la surface du support se traduit par une
modification des teneurs en ions minéraux en solution. Ainsi, la comparaison des
résultats obtenus avec le témoin (suspension sans adsorbat) indique que les ions
phosphate libérés en solution lors de l’adsorption sont en quantité relativement
importante, tandis que la teneur en ions calcium varie légèrement. La concentration en
ions phosphate mise en solution augmente linéairement avec la quantité adsorbée;
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

cependant, l’évolution de la teneur en ions calcium est non monotone. Cette

corrélation entre les ions minéraux en solution et la quantité adsorbée est illustrée sur
la figure III-9.
Par ailleurs, l’analyse des solutions d’adsorption par RMN 31P confirme la
libération des ions phosphate au cours du processus d’adsorption. Ainsi, en plus du
multiplet centré vers 17,2 ppm qui est caractéristique du risédronate, on note la
présence d’un pic intense situé à 2 ppm attribuable aux ions phosphate mis en solution
lors de l’adsorption (Figure III-10).

123
 Tableau III-8: Composition des solutions après adsorption en milieu chlorure de
potassium (1mM) à T ∼ 37°C.

Co Ce Q P en solution Ca en solution
pHi - pHads
(mM) (mM) (µmol/m²) (mM) (mM)
0 0 0 0,10 0,16 7,4 - 7,3
0,71 0,02 1,16 0,91 0,03 7,3 - 7,4
1,41 0,32 1,85 1,27 0,11 7,5 - 7,7
2,12 0,97 1,95 1,32 0,12 7,4 - 7,6
2,83 1,64 2,02 1,34 0,19 7,5 - 7,7
3,53 2,33 2,04 1,33 0,22 7,4 - 7,7
4,24 2,95 2,19 1,37 0,17 7,4 - 7,7
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4,95 3,61 2,26 1,46 0,18 7,4 - 7,7

5,66 4,31 2,29 1,48 0,22 7,4 - 7,6

P Ca
Calcium et Phosphate (mM)

1.5

1.0

0.5

0 1 2
Quantité adsorbée (µmol/m²)

Figure III-9: Evolution de la teneur en ions minéraux mis en solution en fonction de

la quantité de risédronate adsorbée: milieu KCl (1mM) à T ∼ 37°C.

124
 H3PO4 (2%)

Phosphate
libéré

Risédronate
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

ppm 20 10 0 -10

Figure III-10: Spectre RMN 31P représentatif de filtrats obtenus après adsorption du
risédronate en milieu KCl (1 mM): pHi ∼ 7,4 et T ∼ 37°C. Le pic de
H3PO4 (2%) correspond à l’étalon externe.

125
 II-2-7- Adsorption du risédronate à partir de solutions concentrées
L’étude d’adsorption du risédronate par HA a été étendue à une gamme de
concentration allant jusqu’à 23 mM, et ce afin de mettre en évidence toute interaction
réactive susceptible de se produire entre les ions minéraux et les espèces risédronate à
la surface du minéral. Le protocole expérimental adopté est identique à celui utilisé
pour la gamme de concentration initialement explorée (0 - 5,7 mM): 50 mg de solide
dans 5 ml de solution d’adsorbat en milieu KCl (1 mM) de pHinitial ∼7,4 et à T ∼ 37°C.
Les données d’adsorption ainsi que les teneurs en ions minéraux dans les
surnageants obtenus après adsorption sont consignés dans le tableau III-9. Ce dernier
regroupe tous les résultats récoltés pour les deux gammes de concentrations examinées
(0 à 23 mM) en vue d’une étude complète des phénomènes physico-chimiques
intervenant à la surface du minéral.
II-2-7-1- Isotherme d’adsorption
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L’évolution de la quantité de risédronate adsorbée par HA en fonction de sa

concentration résiduelle à l’équilibre dans toute la gamme de concentration allant de 0
à 23 mM est reportée sur la figure III-11. L’allure de la courbe obtenue met en
évidence deux étapes distinctes selon la concentration en adsorbat. Dans le premier
domaine (Ce < 10 mM), l’évolution de la quantité de risédronate adsorbée montre un
pallier au niveau de la saturation, bien défini et atteint dès les faibles concentrations;
ce domaine a fait l’objet de l’étude détaillée décrite dans le paragraphe II-2-2. Dans la
seconde zone (Ce ≥ 10 mM), l’isotherme change d’allure et la quantité adsorbée croît à
nouveau après le plateau, en fonction de la quantité de risédronate en solution à
l’équilibre. La présence de cette marche traduit l’existence d’un autre mode
d’interaction à la surface du matériau qui se manifeste dans le domaine de grandes
concentrations.

126
 Tableau III-9: Données d’adsorption à T ∼ 37°C du risédronate par HA dans toute
la gamme de concentration explorée (0 - 23 mM) :
milieu KCl (1 mM) de pHinitial ∼ 7,4.

Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²) P (mM) Ca (mM)

0,00 0,00 0,00 0,10 0,16
0,25 0,02 0,38 - -
0,52 0,03 0,84 - -

0,67 0,05 1,08 - -

0,71 0,02 1,16 0,91 0,03

0,82 0,07 1,27 - -

tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

1,03 0,16 1,48 - -

Domaine I

1,41 0,32 1,85 1,27 0,11

2,12 0,97 1,95 1,32 0,12

2,83 1,64 2,02 1,34 0,19

3,53 2,30 2,04 1,33 0,22

4,24 2,95 2,19 1,37 0,17

4,95 3,61 2,26 1,46 0,18

5,66 4,31 2,29 1,48 0,22

10,38 8,65 2,39 - -

11,59 9,86 2,41 - -

14,90 12,58 3,92 1,48 0,55

Domaine II

17,83 15,23 4,42 1,51 0,62

20,06 17,58 4,20 1,54 0,66
22,95 20,11 4,83 1,56 0,70

127
 6
Quantité adsorbée (µmol/m²)

2
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

0
0 5 10 15 20 25
Concentration à l'équilibre (mM)

Figure III-11: Isotherme d’adsorption à T ∼ 37°C du risédronate par HA dans la

gamme de concentration (0 à 23 mM): milieu KCl (1 mM) de
pHinitial ∼ 7,4.

128
 II-2-7-2- Influence de l'adsorption sur la composition du milieu.
Les résultats de l’analyse chimique des surnageants récoltés après adsorption
pour toute la gamme de concentration examinée sont regroupés dans tableau III-9. La
corrélation entre les ions minéraux en solution et la quantité adsorbée est illustrée sur
la figure III-12.
Un premier examen des résultats obtenus montre que les quantités en ions
phosphate mises en solution sont relativement importantes comparées aux ions
calcium. Lorsque la quantité fixée à la surface du minéral devient relativement
importante, l’évolution des espèces calcium et phosphate en solution diffère de celle
notée pour les faibles concentrations.
L’analyse globale des teneurs en ions phosphate en solution révèle qu’après
l’évolution graduelle relative au domaine de faibles concentrations, la mise en solution
de ces espèces devient moins importante et semble se stabiliser lorsque la quantité
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adsorbée est assez importante. Cependant, on assiste à une libération ascendante des
ions calcium. Ces observations suggèrent que les phénomènes physicochimiques qui
interviennent à la surface du matériau sont plus complexes qu’un simple processus
d’échange tel décrit dans le domaine des concentrations relativement faibles.

129
 2.0
P Ca
Calcium, Phosphate (mM)

1.5

1.0
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0.5

0 2 4 6
Quantité adsorbée (µmol/m²)

Figure III-12: Evolution des teneurs en ions phosphate et calcium en solution en

fonction de la quantité de risédronate adsorbée : milieu KCl (1 mM),
pHinitial ∼ 7,4 et T ∼ 37°C.

130
 II-3- Caractérisation du support après adsorption
L’analyse chimique des solutions d’adsorption tout au long des expériences
permet de déterminer la nature et les quantités des espèces échangées entre la solution
et les particules solides de l’apatite. Toutefois, même si ces mesures sont nécessaires,
elles ne sont pas suffisantes pour en déduire le mécanisme de fixation du risédronate
par le support HA.
Pour mieux comprendre l’évolution du système, déceler toute modification
structurale et examiner les altérations morphologiques des solides, les résultats
précédents issus des expériences de fixation doivent être associés à la caractérisation
physico-chimique des poudres. Pour cela, les solides récupérés après contact avec les
molécules de risédronate ont fait l’objet de caractérisation moyennant différentes
techniques: diffraction des rayons X, spectroscopie d’absorption infrarouge,
spectroscopie de diffusion Raman, résonance magnétique nucléaire de l’état solide,
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microscopie électronique à balayage et analyses chimiques.

II-3-1- Conditions expérimentales
Les échantillons ont été initialement mis en contact pendant 2 h en présence
d’une solution de risédronate de concentration désirée (pHinitial ∼ 7,4 et T ∼ 37°C).
Après centrifugation et filtration (0,4 mm), les poudres obtenues ont été lavées avec
des solutions de KCl (1 mM ; pHinitial ∼ 7,4) puis lyophilisées pendant 24 h. Des
suspensions de même rapport solide/solution mais sans adsorbat ont été traitées dans
des conditions similaires aux tests d’adsorption afin de servir de témoins.
II-3-2- Résultats
II-3-2-1- Diffraction des rayons X
Les spectres de DRX des solides obtenus après adsorption ne montrent aucune
différence par rapport à celui de l’apatite non traitée. Aucune phase étrangère autre que
l’apatite n’a été observée. Les dimensions apparentes des cristallites des échantillons
examinés, estimées à partir de la formule de Scherrer, ne font pas l’objet de
modification significative (Tableau III-10): il s’agit toujours de cristallites de forme
allongée et de taille comparable à celle de l’apatite de référence.

131
 Tableau III-10: Dimensions apparentes des cristaux de HA après traitement dans
une solution 2 mM de risédronate (HA/BP) et dans une solution
1mM de KCl (HA/KCl).

HA HA/KCl
HA/BP
(Référence) (Témoin)

L(310) (± 0,5 nm) 27,5 28,2 27,8

L(002) (± 0,5 nm) 57,4 56,8 58,2

801
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BP
715

CaBP(A)

CaBP(B)

Ca2BP

HA/BP (x 3)

HA

850 800 750 700

-1
Nombre d'ondes (cm )

Figure III-13: Spectres infrarouge de l’apatite avant (HA) et après adsorption du

risédronate (HA/BP), des sels de risédronate de calcium et du
risédronate monosodique seul (BP).

132
 II-3-2-2- Spectrométrie infrarouge par transformée de Fourier (IRTF)
La figure III-13 montre les spectres d’absorption IR dans le domaine 650-900
-1
cm pour l’apatite HA avant et après contact avec les molécules de risédronate dans
un milieu KCl (1 mM). Pour toute éventuelle comparaison, nous avons également
reporté sur cette figure le spectre de la molécule native ainsi que ceux des sels de
risédronate de calcium susceptibles de se former dans les conditions examinées:
CaBP(A), CaBP(B) et Ca2BP (voir chapitre II, partie B).
Le spectre de HA obtenue après adsorption (HA/BP) fait apparaître deux
bandes larges de faibles intensités situées vers 715 et 801 cm-1, attribuables aux modes
de vibration des liaisons C-P dans les molécules de risédronate. Des bandes similaires,
mais d’intensité plus importante, figurent également sur les spectres des sels de
risédronate de calcium précipités. Le spectre de la molécule native quant à lui fait
apparaître une bande très intense vers 800 cm-1 qui coïncide avec celle notée pour le
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support après adsorption; on observe également deux autres bandes dont les positions
(747 et 690 cm-1) diffèrent de celle vers 715 cm-1 du support après adsorption.
II-3-2-3- Spectrométrie par diffusion Raman
Le spectre Raman de l’échantillon HA après interaction avec le bisphosphonate
étudié révèle la présence de bandes de vibrations supplémentaires autres que celles
observées dans le support non traité (Figure III-14 (a)). Ces bandes présentent des
similitudes avec celles notées sur les spectres des sels de calcium préparés et leurs
positions sont légèrement déplacées par rapport au spectre de la molécule libre. Ces
observations sont nettement mises en évidence sur les spectres obtenus après
accumulation dans les domaines de vibration du noyau pyridine et des groupements
fonctionnels de la molécule de risédronate (Figure III-14 (b), (c) et (d)).
L’examen dans la région spectrale située entre 550 et 750 cm-1 (Figure III-14
(b)) indique que les positions des bandes de vibration caractéristiques des liaisons C-P
sur le spectre de HA/BP sont déplacées vers les nombres d’ondes élevés (Δν = 12 cm-
1
), comparé à la molécule native. Cette observation suggère l’existence d’interaction
notable impliquant les molécules de risédronate et la surface du support. Il est à noter
que ces bandes figurent également dans les spectres des sels de calcium préparés mais
sont plus intenses.
Le domaine de vibration situé entre 1150 et 1500 cm-1 du spectre de HA/BP
(Figure III-14 (c)), quant à lui, montre une bande assez intense vers 1319 cm-1
caractéristique du mode de déformation dans le plan des liaisons C-H du groupement
pyridine de la molécule de risédronate. On note également une bande large et de faible
intensité (1445 cm-1) attribuée aux modes de vibrations des liaisons C-C et C-N du

133
 noyau pyridine ainsi qu’une bande de vibration des liaisons P=O (1227 cm-1). Ces
bandes, légèrement déplacées par rapport à la molécule native, sont similaires à celles
observées sur le spectre du sel de calcium préparé Ca2BP.
Par ailleurs, le domaine de vibration 1520 - 1680 cm-1 (Figure III-14 (d)) met en
évidence un doublet avec une bande assez intense (1596 cm-1) et une autre bande de
faible intensité (1582 cm-1), assignés aux vibrations de la pyridine; ce doublet est
superposable à celui noté dans les sels de calcium de risédronate préparés, en
particuler le sel Ca2BP. Les sels CaBP (A et B) montrent à la fois les bandes du spectre
du risédronate monosodique seul (bande intense apparaît vers 1640 cm-1, l’épaulement
vers 1627 cm-1 et un pic moins intense à 1570 cm-1) et du sel Ca2BP.
II-3-2-4- Spectroscopie RMN de l'état solide
Le spectre 1H→31P CP MAS de l’échantillon HA après adsorption présente
(Figure III-15) un pic situé à 3 ppm relatif aux phosphates apatitiques ainsi qu’un
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massif large vers 18 ppm. Ce massif apparaît dans le domaine où la molécule de

risédronate présente deux raies fines et intenses (19,0 ppm et 17,1 ppm)
caractéristiques des noyaux du phosphore. La présence de ce massif traduit la présence
d’une forme dérivée du bisphosphonate étudié à la surface du support. Sur la base des
spectres RMN des sels de risédronate de calcium synthétisés (chapitre II, partie B),
seul le composé Ca2BP présente dans le même domaine un signal identique au massif
noté pour HA/BP mais d’intensité plus importante.
La comparaison des spectres RMN du proton 1H obtenus en impulsion unique et
rotation à l’angle magique, réalisés sur les supports avant (HA) et après traitement
(HA/BP), atteste également de la présence de risédronate à la surface de l’apatite
examinée (Figure III-16). Le spectre RMN 1H SPE-MAS du risédronate monosodique
montre quatre pics larges de faible intensité situés respectivement vers 5,2, 7,2, 13,8 et
16,4 ppm. Les pics larges vers 5,2 et 7,2 peuvent être attribués à l’eau de structure
et/ou adsorbée, tandis que les pics situés à 13,8 et 16,4 ppm sont caractéristiques des
protons des groupements phosphonate de la molécule de risédronate.
Sur le spectre de l’apatite après adsorption on assiste à l’apparition de deux
signaux de faible intensité vers 3,6 ppm et 8,2 ppm qui ne figuraient pas sur le spectre
du support HA. Le pic situé à 8,5 ppm est déplacé par rapport à celui noté sur le
spectre de la molécule libre, mais similaire à celui signalé sur le spectre du sel Ca2BP.
La raie vers 3,6 ppm quant à elle reste difficile à attribuer. On note également
l’élargissement significatif de la raie associée aux molécules d’eau situées à 5,5 ppm
qu’on retrouve aussi bien sur le spectre de HA que sur celui du précipité Ca2BP.

134
 II-3-2-5- Analyse chimique
L’influence de la quantité de risédronate adsorbée sur le rapport atomique Ca/P
du solide HA a été examinée à pH 7,4 et T ~ 37°C. La concentration initiale utilisée en
adsorbat est de 1,73 mM et la quantité correspondante retenue au plateau de saturation
de l’isotherme vaut 1,83 µmol/m².
Le rapport atomique entre ions calcium et phosphate inorganique (Ca/P) du
précipité HA est similaire à celui du témoin (HA/KCl) (Tableau III-11). Cependant,
une légère augmentation se manifeste pour le solide traité en présence du risédronate
(HA/BP). Cette évolution pourrait être liée à la libération d’ions phosphate, suite aux
échanges ioniques avec les molécules de risédronate. Ceci est compatible avec le
rapport atomique Ca/(P+BP) qui reste similaire à celui du témoin.
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135
 (a)
(b)

673

642
BP
BP

CaBP(A)
CaBP(B)

Ca2BP
νC-P

HA/BP
ν4PO4
CaBP(A) 750 700 650 600

(c)

1227
1319

1195
1445
BP
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CaBP(B)

CaBP(A)

CaBP(B)

Ca2BP
Ca2BP

ν P=O
νC-C; ν C-N δ (C-H) Pyr
(Pyr) HA/BP

1500 1400 1300 1200

δ(C-H) pyr

νC-C; νC-N (d)

1596

(Pyr)
1582
νP=O

νC-P BP

HA/BP

ν1PO4 CaBP(A)

CaBP(B)

ν3PO4 ν4PO4 ν2PO4 Ca2BP

HA νC-C; νC-N HA/BP
(Pyr)

1680 1600 1520

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 -1
-1
Nombre d'onde (cm )
Nombre d'onde (cm )

Figure III-14: Spectres de diffusion Raman de HA avant et après adsorption :

(a): domaine 200 - 1800 cm-1; (b): domaine 550 - 750 cm-1;
(c): domaine 1150 - 1500 cm-1; (d): domaine 1520 - 1680 cm-1.

136
 18,1
Ca2BP

x5
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HA/BP

HA

BP

30 20 10 0 -10
ppm/H3PO4

Figure III-15: Spectres RMN 1H→31P CP MAS de risédronate (BP), de l’apatite avant
(HA) et après adsorption (HA/BP) et du risédronate de calcium
(Ca2BP).

137
 3,6
8,2
Ca2BP

HA/BP
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

HA

BP

25 20 15 10 5 0 -5 -10 -15
ppm/TMS

Figure III-16: Spectres RMN 1H SPE-MAS du risédronate (BP), de l’apatite avant

(HA) et après adsorption (HA/BP) et du risédronate de calcium
(Ca2BP).

138
 Tableau III-11: Analyse chimique de HA traité en milieu KCl 1 mM (HA/KCl) et
dans le même milieu contenant 1,73 mM de risédronate (HA/BP).

BP (%) Ca (%) P (%) Ca/P Ca/(P+BP)

(± 0,5%) (± 0,5%) (± 0,5%) (± 1%) (± 2%)
HA - 37,20 17,57 1,64 -
HA/KCl - 35,80 16,87 1,64 -
HA/BP 3,79 35,30 16,32 1,68 1,64
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139
 III- DISCUSSION
L’adsorption des molécules de risédronate par le support HA dans les
conditions examinées se fait selon une cinétique rapide. L’équilibre est atteint après
environ 20 min d’incubation. Des observations similaires ont été rapportées dans la
littérature pour l’interaction de phosphates apatitiques avec différents bisphosphonates
(Roussière et al., 2005; Nancollas et al., 2006), avec la phosphoserine (Benaziz et al.,
2001) et avec les phosphocitrates (Johnson et al., 1991). Des cinétiques rapides ont
également été obtenues pour l’adsorption de molécules présentant différents
groupements fonctionnels par des phosphates de calcium apatitiques (Barroug et al.,
1989; Ouizat et al., 1999). Ceci témoigne de la grande réactivité de la surface des
cristaux apatitiques vis-à-vis de molécules d'intérêt biologique.
Les isothermes de fixation du risédronate à la surface de HA à partir de
solutions diluées sont de type Langmuir. Le plateau de saturation est généralement
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atteint pour des faibles concentrations en adsorbat, traduisant la grande réactivité de la

surface du matériau vis-à-vis de ces espèces. Des allures similaires ont été rapportées
dans la littérature (Claessens et Kolar, 2000; Vitha et al., 2008; Mukherjee et al., 2008)
pour l’interaction de HA avec divers bisphosphonates (zolédronate, alendronate,
ibandronate, étidronate, et clodronate). Par ailleurs, l’isotherme d’adsorption du
zolédronate par HA à 37°C dans une gamme de concentration relativement élevée (10
à 50 mM) montre aussi un plateau de saturation bien défini, caractéristique d’une
allure de type Langmuir, tandis que les auteurs Josse et al., 2005 l’attribuent à la loi de
Freundlich.
La comparaison des paramètres d’adsorption déduits de l’équation de Langmuir
montre que l’augmentation de la température d’incubation de 25 à 37°C se traduit par
une élévation de presque 35% de la capacité d’adsorption du minéral apatitique. Ces
observations indiquent que la densité superficielle des sites d’adsorption augmente
avec la température. Cela peut être probablement dû aux phénomènes de
déshydratation des molécules d'adsorbats et de la surface de l'apatite. Des résultats
similaires sont rapportés dans la littérature pour l’interaction de HA avec des
complexes de terbium (Rill et al., 2009) utilisés comme marqueurs de l’os tels le
DOTP (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetra(methylenephosphonic acid)), et
le BPPED (10-((diphosphonoethyl(hydroxy)phosphoryl)methyl)-1,4,7,10-
tetraazacyclododecane-1,4,7-tri(acetic acid)), les complexes de lanthanide de
bisphosphonates (Alves et al., 2003), les pyrophosphates (Jung et al., 1973),
l’albumine de sérum bovin (Yin et al,. 2002), et le cisplatin (Barroug et al., 2004).
L’évaluation du rôle des ions déterminant de la charge de surface (ions calcium,
phosphate et hydronium) sur la fixation des molécules d’adsorbat, d’une part, et la

140
 connaissance de la composition des surnageants ainsi que l’état de surface des cristaux
obtenus après adsorption, d’autre part, permettent de préciser l’aspect physico-
chimique de l’interaction adsorbant-adsorbat. Les résultats obtenus dans les diverses
conditions expérimentales examinées (composition de solution et concentration en
adsorbat variables) révèlent que la surface du minéral est le siège de processus réactifs
impliquant les ions minéraux du support et les molécules d’adsorbat (échange ionique
et/ou réactions chimiques...).
La modification de la teneur en ions actifs en solution affecte considérablement
le processus d’adsorption. La diminution des paramètres d’adsorption lors de
l’élévation du pH du milieu pourrait être la conséquence directe de l’évolution du
degré d’ionisation des groupements fonctionnels à la surface des cristaux et des
molécules d’adsorbat. La présence d’ions phosphate dans le milieu inhibe la fixation
des espèces risédronate, suite à leur compétition pour les sites actifs à la surface du
minéral; cependant on assiste à une élévation de l’affinité apparente lorsque les ions
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calcium sont présents dans le milieu. Des tendances similaires ont été rapportées dans
la littérature pour l’interaction de HA avec des protéines acides (Barroug et al., 1998;
Shimabayashi et al., 1991, Kondori et al., 1992; Ouizat, 2000), des acides aminés
(Moreno et al., 1984, Benaziz, 2002), des citrates et phosphocitrates (Johnson et al.,
1991; López-Macipe et al., 1998). Le mode d’interaction des espèces anioniques et
cationiques est généralement discuté, sur la base de données électrocinétiques, en
terme de forces électrostatiques attractives ou répulsives selon la nature des espèces
examinées et les conditions du milieu.
Cependant peu d’études systématiques ont été engagées sur la modification de
la composition du milieu suite à l’adsorption (Rawls et al., 1982; Barroug et al.,1989,
1998; Misra, 1996); en outre l’évolution de la teneur en ions minéraux a rarement été
reliée à la quantité adsorbée à la surface du minéral. Afin d’acquérir une meilleure
connaissance du mécanisme qui gouverne le processus d’adsorption, nous avons
procédé à l’analyse détaillée des surnageants recueillis après incubation. Les résultats
obtenus indiquent que la rétention des molécules de risédronate affecte
considérablement la teneur des espèces cationiques et anioniques présentes dans les
solutions. Ainsi, la quantité d’ions phosphate mise en solution est proportionnelle à la
quantité en bisphosphonate fixée à la surface du support. Cette observation traduit
l’existence d’un processus d’échange entre les molécules d’adsorbats de la solution et
les ions phosphate de la surface du minéral apatitique. Des phénomènes semblables
ont été notés lors de la fixation de zolédronate (Josse, 2003; Roussière et al., 2005), de
polyphosphonates (Rawls et Cabasso, 1984), de phosphoserine (Tanaka., 1991; Misra,
1997, Benaziz, 2002), de citrates (Misra, 1996), et de protéines à caractère acide
(Barroug et al., 2008) à la surface du support apatitique.

141
 D’autres phénomènes sont aussi à prendre en considération pour expliquer
l’évolution de la teneur des ions minéraux en solution, notamment l’équilibre de
dissolution de l’apatite et la formation de paires d’ions et/ou de sels de calcium
solubles en solution.
L’analyse des surnageants des suspensions d’adsorption dans les conditions
standards (Tableau III-12) indique qu’en absence des molécules d’adsorbat, la
dissolution de HA est congruente; ainsi le rapport Ca/P du solide (Ca/P = 1,64 ± 0,02)
et assez proche de celui de la solution (Ca/P = 1,60 ±0,02). Ceci est généralement le
cas lorsque l’échantillon est homogène ou lorsque les altérations de composition de
surface des cristaux sont négligées (Dorozhkin, 2002); la pureté minéralogique du
support utilisé ainsi que les conditions expérimentales adoptées (faible rapport
solide/liquide et pH d’adsorption proche du point de charge nulle de l’apatite)
confirment cette hypothèse.
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

142
 Table III-12: Données d’adsorption du risédronate monosodique par HA dans un
milieu KCl 1mM rapportées aux conditions standards (T = 37°C;
pHadsorption 7,7; rapport solide-solution 50 mg/5 mL): corrélation entre
processus adsorption - dissolution de l’apatite.

P déplacé par
Qa P libéréb
Ca libéréc P associé aud BP (b-d) (P/BP)
(b-d)/a
(µmol/5mL) (µmol/5mL) (µmol/5mL) Ca a (µmol/5mL) (µmol/5mL)
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

0 0,51 0,81 - - -
3,41 4,57 0,22 0,14 4,43 1,30
5,44 6,36 0,69 0,42 5,94 1,09
5,76 6,58 0,77 0,47 6,12 1,06
5,94 6,71 1,22 0,74 5,97 1,00
6,01 6,66 1,43 0,87 5,79 0,96
6,46 6,83 1,08 0,66 6,19 0,96
6,68 7,30 1,17 0,71 6,60 0,99
6,74 7,39 1,40 0,85 6,54 0,97

a Quantité de BP adsorbé dans 5 mL

b Quantité de phosphate libéré dans 5 mL
c Quantité de calcium libéré dans 5 mL
(b-d) Quantité de phosphate libéré par dissolution supposée congruente
(Ca/P = 1,64)
(b-d/a) Rapport entre phosphate déplacé et BP adsorbé.

143
 En présence des molécules de risédronate, la quantité en ions phosphate issue
de la dissolution de l’apatite peut être estimée à partir des teneurs en calcium présentes
en solution (Tableau III-12), et ce en considérant que la dissolution de l’apatite reste
congruente au cours de l’adsorption. Cependant, la quantité d’ions phosphate déplacés
par les molécules d’adsorbats peut être calculée pour tous les points de l’isotherme, ce
qui permet de déduire le rapport entre phosphates libérés (P) et risédronates adsorbés
(BP). Les résultats obtenus (Tableau III-12) indiquent que ce rapport P/BP est proche
de 1 pour la plupart des points de l’isotherme, excepté pour les faibles concentrations
de risédronate (P/BP = 1,30). Cette anomalie pourrait être en partie due aux erreurs
cumulatives dans ce domaine de concentrations, mais aussi probablement au
changement du rapport entre ions minéraux en solution (Ca/P) suite à l’altération de
l’équilibre de surface de l’apatite.
Néanmoins, il semble que l’adsorption de risédronate est décrite par un
processus d’échange ionique entre les ions PO43- de la surface de HA et les espèces
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

risédronate en solution. Si l’on considère le diagramme de spéciation réalisé sur la

base des constantes d’acidité du risédronate (Nancollas et al., 2006; Takami et al.,
2003; Hounslow et al., 2008), les espèces ioniques présentes en solution à pH ∼ 7,4
sont de type HBP3- (80%) et H2BP2- (20%), où «BP» représente l’ion risédronate. En
tenant compte de la forme ionique majoritaire (HBP3-), la réaction d’adsorption peut
être représentée par l’équation suivante:
[PO43-]surface + [HBP3-]solution ⇔ [HBP3-]surface + [PO43-]solution
L’hydrolyse des ions PO43- ainsi libérés dans le milieu peut expliquer la légère
augmentation du pH notée lors de l’adsorption (tout au plus 0,3 unité); afin de tenir
compte de la ré-équilibration de la solution, cette diminution de la teneur en protons
H+ serait compensée par la déprotonation des espèces H2BP2-.
L’équilibre d’adsorption pourrait ainsi être réinterprété en considérant la
réaction d’échange ionique proposée au lieu d’un simple processus d’adsorption de
Langmuir (Q = (KNCe)/(1+KCe)). L’expression de la constante d’équilibre
expérimentale (Kex) donnant lieu à une telle réaction d’échange serait:
Psol ⋅ Q
K ex =
Ce (N − Q)
où Psol représente la concentration des ions phosphate dans les solutions
d’adsorption, Q la quantité de risédronate adsorbée, N le nombre de sites d’adsorption
et Ce la concentration à l’équilibre. L’expression de la quantité adsorbée qui en résulte
s’écrit:

144
 N ⋅ K ex ⋅ (C e / Psol )
Q=
(1 + K ex ⋅ (Ce / Psol ))
La comparaison de cette relation avec l’équation initiale de Langmuir indique
que la concentration en adsorbat à l’équilibre a été remplacée par le rapport Ce/Psol et
la constante d’affinité K par la constante de la réaction d’échange ionique (Kex). La
réaction d’adsorption se trouve ainsi liée à la teneur en ions phosphate en solution; la
linéarisation de cette nouvelle équation permet de calculer les paramètres
caractéristiques de l’adsorption. La comparaison des résultats obtenus (Tableau III-13)
montre que le modèle proposé s’applique bien pour les observations expérimentales de
notre étude. La valeur de la quantité adsorbée à la saturation N reste inchangée, tandis
que la constante d’équilibre est légèrement différente.
L’identification de la réaction d’adsorption comme un équilibre d’échange
ionique impliquant les ions phosphate permet d’expliquer l’irréversibilité apparente du
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

processus notée dans notre travail. La dilution se traduit par une diminution des
concentrations respectives des molécules d’adsorbat et des ions phosphate en solution
(Ce et Psol), et ce dans le même rapport. Dans ces conditions, l’équilibre d’adsorption
reste inchangé et est par conséquent irréversible. Les mêmes arguments sont valables
pour commenter la non réversibilité observée pour l’interaction de phosphates de
calcium apatitique avec des protéines acides (Barroug et al., 2008; Ouizat, 2000), avec
des acides aminés (Benaziz et al., 2002; Moreno et al., 1984) et des complexes de
phosphonates (Rill et .al, 2009).
Bien qu’aucune désorption significative n’ait lieu lorsque la dilution est faite
avec des solutions de KCl pré-équilibrées en présence du solide (protocole adopté afin
de minimiser la dissolution des cristaux apatitiques), l’inverse se produit lorsque les
ions phosphate sont présents dans le milieu. En effet, on assiste à une libération
progressive des molécules de risédronate initialement fixées à la surface du minéral en
fonction de la teneur en ions phosphate ajoutés, en accord avec le mécanisme
d’échange ionique proposé. Une tendance similaire a été notée pour l’interaction de
HA avec le zolédronate (Roussière et al., 2005), les polyphosphonates (Rawls et
Cabasso, 1984) et la phosphoserine (Barroug et al., 2008). L’aptitude des ions
phosphate à déplacer les espèces adsorbées par les apatites a été attribuée à leur grande
affinité pour la surface de HA. Cet effet de déplacement d’espèces adsorbées suite à
l’ajout d’ions phosphate est généralement décrit comme une compétition pour
l’occupation des sites d’adsorption à la surface du minéral. Ce phénomène est
largement observé en chromatographie en phase liquide, et il est mis à profit pour la
séparation et la purification de bisphosphonates (Lawson et al., 2006) et de
macromolécules (Gorbunoff, 1984; Kawasaki, 1991).

145
 Tableau III-13: Paramètres caractéristiques de l’adsorption du risédronate
selon le modèle simple de Langmuir et de
Langmuir-échange ionique.

N ± ΔN K ± ΔK
Equation linéarisée R2 (%)
(µmol/m²) (L/mmol)
Ce Ce 1
Langmuir = + 99,9 2,3 ± 0,1 7,3 ± 3,7
Q N KN
Langmuir-échange Ce P Ce P 1
= + 99,4 2,3 ± 0,1 9,7 ± 5,0
ionique Q N KN
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Par ailleurs, il a été rapporté que les dilutions successives et les opérations de
re-suspension durant quelques jours, menées sur des cristaux de HA ayant adsorbé des
macromolécules en présence de teneurs élevées en phosphates ajoutées (2 à 8 mM),
ne se traduit par aucune libération significative. La non réversibilité du processus a été
attribuée à un changement structurale des molécules d’adsorbat : c’est le cas de
macromolécules de faible stabilité structurale où l’adsorption a lieu en présence de
répulsions électrostatiques et influe sur les propriétés structurales de la protéine (perte
d’activité enzymatique, modification de structure hélicoïdale (taux d’hélice)) (Barroug
et al., 1989; Norde et Haynes, 1995); la déformation structurale des molécules
adsorbées et leur éventuel étalement à la surface du support accroît le nombre de sites
d’attaches et rend difficile leur libération.
Par ailleurs, l’évolution observée de la quantité des ions calcium mise en
solution durant l’adsorption est assez différente de celle des ions phosphate. Les
concentrations sont plus faibles et restent relativement stables avec l’ajout de
risédronate en solution. Des observations similaires ont été rapportés pour l’interaction
de HA avec des polyphosphonates (Rawls et al., 1982), de l’étidronate et du clodronate
(Roberston et al., 1972; Jung et al., 1973), et de la phosphoserine (Tanaka et al., 1991).
Toutefois, une faible augmentation des ions calcium en solution est observée au
niveau du plateau d’adsorption (recouvrement totale de la surface minérale de
l’apatite) et donc aux fortes teneurs en phosphate. Cette observation reste difficile à
interpréter sur la base de l’équilibre de dissolution de la phase apatitique. En fait, la
teneur en ions calcium libre en solution est fortement liée à celle des ions phosphate
par le produit de solubilité de l’apatite. Ainsi, l’équilibre de dissolution devrait

146
 conduire à une diminution des ions calcium libre en solution à de fortes concentrations
de phosphate et non pas l’inverse. L’explication la plus plausible de ce phénomène est
la formation de complexes de calcium soluble ou de paires d’ions impliquant les
molécules de risédronate.
L’association des différentes méthodes complémentaires (DRX, IRTF, Raman
et RMN du solide) utilisées dans notre étude nous a permis une analyse détaillée et
plus fine des modifications morphologiques et microstructurale de l’apatite après
interaction avec les molécules de risédronate.
Bien que l’analyse par DRX des poudres issues des expériences de fixation ne
révèle aucune phase étrangère autre que celles caractéristiques d'une phase apatitique,
les résultats obtenus par spectroscopie infrarouge montrent la présence de molécules
de risédronate à la surface du minéral apatitique. Ainsi, nous avons noté sur les
spectres infrarouges des apatites obtenues après adsorption deux bandes de vibration
supplémentaires de faibles intensités, attribuables aux modes de vibration des liaisons
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

C-P de la molécule de risédronate. Des observations similaires ont été notées sur les
spectres infrarouges d’une hydroxyapatite synthétisée en présence de molécules
d’acide phenylphosphonique (El Hammari et al., 2006).
L’examen des spectres de diffusion Raman des échantillons obtenus après
contact avec les solutions de bisphosphonate confirme la fixation de ces espèces à la
surface de HA. En effet, on note l’apparition de plusieurs bandes caractéristiques de la
molécule de risédronate et spécialement les bandes de vibration relatives aux
groupements pyridine de BP. La position de ces bandes supplémentaires est déplacée
par rapport à la molécule libre, traduisant l’existence d’interaction notable entre
adsorbat et sites actifs de la surface du minéral apatitique. Cet effet est également
remarqué lors de l’interaction des molécules de risédronate avec les ions calcium (voir
chapitre II). De plus, une grande similitude a été notée entre les bandes
supplémentaires apparues sur les spectres Raman de l’apatite obtenue après adsorption
traité et celles des sels de risédronate de calcium préparés, en particulier le sel de
calcium noté Ca2BP. Ceci laisse penser que l’interaction des molécules d’adsorbat à la
surface de l’apatite est comparable à celle observée pour les sels de calcium de
risédronate. De ce fait, la possibilité de formation d’un complexe ou un sel insoluble
de risédronate de calcium à la surface de l’apatite ne doit être écartée et doit être
considérée comme une réaction compétitive de l’adsorption. De tels complexes ont été
identifiés par spectroscopie de diffusion Raman à la surface de l’hydroxyapatite traitée
par des solutions d’étidronate (Cukrowski et al., 2007). En effet, cette étude a mis en
évidence deux types de complexes d’étidronate de calcium à la surface de l’apatite
étudiée selon la gamme de concentration explorée. Cependant, il est à noter que ce

147
 travail a été réalisée dans des conditions expérimentales (pH très acide et température
ambiante) assez différentes de celles adoptées dans notre étude (pHInitial∼7,4 et T∼
37°C).
L’examen des spectres RMN du phosphore (RMN 31P MAS) des apatites
obtenues après contact avec les solutions d'adsorption montre, en plus du pic
spécifique au phosphore apatitique (3 ppm), un massif large situé vers 18 ppm attribué
au phosphore des groupements fonctionnels du risédronate. Cette raie est large et est
de très faible intensité, comparée aux deux pics fins et bien résolus (19 et 17 ppm)
enregistrés sur le spectre de la molécule avant adsorption. Des résultats similaires ont
été rapportés pour l’interaction des molécules de zolédronate avec des apatites
phosphocalciques déficientes en calcium (Josse et al., 2005; Roussière et al., 2005).
L’explication plausible proposée par ces auteurs est la précipitation d’un complexe de
zolédronate à la surface de l’apatite étudiée. Par ailleurs, le pic large noté lors de la
fixation de l’acide vinyl phosphonique par l’hydroxyapatite ainsi que le déplacement
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

enregistré (Δδ ≈ 5 ppm) par rapport à la molécule libre d’acide phosphonique (Haque
et al., 2007) ont été attribué aux liaisons chimiques que les groupements phosphonate
sont susceptibles de former avec les ions calcium de la surface de l’apatite.
L’allure large de la raie observée par RMN du solide sur le spectre de l’apatite
HA après adsorption du risédronate est analogue à celle du sel de calcium (Ca2BP),
dont l’état amorphe a été confirmé par DRX. L’observation d’un mauvais état de
cristallinité des espèces adsorbées par l’hydroxyapatite a été aussi notée pour divers
bisphosphonates (Grossman et al., 2000). L’interaction de l’acide risédronique avec
l’os humain montre des tendances similaires (Mukherjee et al., 2008); les auteurs ont
montré que la fixation des molécules de risédronate à pH acide se traduit, sur le spectre
RMN de l’os après traitement, par l’apparition d’une raie de résonance supplémentaire
(entre 15 et 16 ppm) comparable à celle du sel de risédronate de calcium
nanocristallin: ceci a été attribué à la formation d’une nouvelle phase mal cristallisée à
la surface du minéral osseux.
Sur la base de nos observations expérimentales, nous pouvons ainsi conclure
que la fixation des molécules de risédronate à la surface de HA induit des changements
notables de l’environnement électronique des noyaux de phosphore des groupements
phosphonate de la molécule étudiée. Les sites calcium situés à la surface du minéral
pourraient être le siège de la forte interaction des molécules de BP avec le support
apatitique.

148
 IV- CONCLUSION
La réactivité de l'hydroxyapatite, prototype minéral du tissu osseux, vis-à-vis
des molécules de risédronate en milieu aqueux a été étudiée. La rétention du
risédronate par HA se produit selon un processus rapide. De plus, l'allure des
isothermes d'adsorption obtenues dans tous les cas est de type Langmuir.
L'interaction du matériau avec le risédronate est gouvernée par un processus
d'échange ionique impliquant les groupements phosphonate de la molécule d'adsorbat
et les ions phosphate à la surface de HA. La formation de paires d’ions et/ou de sels de
calcium solubles en solution est également un phénomène qui intervient à l'interface
entre risédronate et la surface du minéral apatitique.
L'examen de la réversibilité d'adsorption vis-à-vis de la dilution ainsi que les
tests réalisés sur la libération du risédronate par HA montrent que le processus de
fixation s'effectue d'une manière non-réversible.
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

L'étude menée sur les solides obtenus après adsorption confirme la fixation de
molécules d'adsorbats à la surface de HA. En effet, différentes bandes et raies
supplémentaires ont été observé sur les spectres des solides traités en présence de BP
examinée. Ces bandes sont déplacées par rapport à la molécule native et s'apparentent
à celles du précipité du calcium de risédroante Ca2BP, attestant ainsi des fortes
interactions mises en jeu entre groupements fonctionnelles du risédronate et sites
calcium à la surface de l'apatite bien cristallisée (HA).

149
 Chapitre IV
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ADSORPTION DU RISEDRONATE
MONOSODIQUE PAR LES APATITES
DE BASSE CRISTALLINITE ET
CONSEQUENCES BIOLOGIQUES
 I- INTRODUCTION
Les phosphates de calcium apatitiques bien cristallisées, en particulier
l’hydroxyapatite, ont fait l’objet de nombreuses études qui visaient à mieux
appréhender les phénomènes d’adsorption/désorption se produisant à l’interface entre
apatites biologiques et milieux physiologiques (Barroug, 1989; Shimabayashi et al.,
1991; Misra, 1997; Ouizat, 2000; Benaziz, 2002; Al-Katan et al., 2010). Le choix de
l’hydroxyapatite, considérée comme prototype structural du minéral osseux, résulte en
fait de sa stabilité thermique et de sa faible solubilité. Cependant ces matériaux bien
cristallisés restent très éloignés de la composition et la nature réelle du minéral des
tissus calcifiés et de leurs propriétés (Rey, 1990). En effet, le minéral osseux est
généralement décrit comme une apatite nanocristalline carbonatée d’une surface
spécifique considérable (~ 200 m²/g). Ces nanocristaux sont en outre dotés d’une
couche hydratée très réactive et riche en ions labiles "environnements non apatitiques;
ces facteurs gouvernent les processus de dissolution, de maturation et également les
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

propriétés d'échange et d'adsorption de ces matériaux (Rey et al., 1989 a et 1989b;

Hina, 1996; Cazalbou et al., 2004a).
Les études d’adsorption effectuées ces dernières années sur les apatites
synthétiques mal cristallisées concernent principalement des protéines (Ouizat et al.,
1999, des acides aminés (Benaziz et al., 2001), des facteurs de croissance (Midy et al.,
2001) ou des agents anticancéreux (Barroug et al., 2004; Lebugle et al., 2002 ).
Toutefois, les investigations engagées sur l'interaction des bisphosphonates vis-à-vis
d'apatites nanocristallines ou sur le minéral osseux sont rares (Palazzo et al., 2007;
Ong et al., 2008) et ne semblent fournir des données précises sur la nature physico-
chimique du processus d'adsorption de ces molécules. Dans cette perspective, nous
nous proposons d'étudier le processus d'adsorption du risédronate par des apatites
nanocristallines biomimétiques. L'influence de la rétention des molécules de
risédronate sur l'évolution des apatites a en outre été examinée.

150
 II- ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR LES APATITES
NANOCRISTALLINES CARBONATEES

II-1- Matériaux et méthodes

Les adsorbants examinés dans cette partie sont des apatites nanocristallines
carbonatées (ANC) analogues au minéral osseux; l’élaboration et la caractérisation de
ces matériaux ont fait l’objet du deuxième chapitre. Il s’agit d’apatites de basse
cristallinité obtenues à différents temps de maturation (ANC-1j, ANC-6j, et ANC-30j);
elles sont riches en environnements non apatitiques, déficientes en calcium et leur
surface spécifique couvre la gamme de 95 à 200 m²/g.
II-1-1- Adsorption
Le protocole expérimental d’adsorption que nous avons adopté est identique à
celui décrit dans le chapitre II mais avec des solutions de risédronate couvrant la
gamme de concentration de 0 à 12 mM. Les solutions d’adsorption, fraîchement
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

préparées, ont été obtenues en dissolvant la quantité appropriée de BP dans une

solution de KCl (1 mM). Toutes les expériences ont été réalisées à pH ∼ 7,4 et T ∼
37°C.
II-1-2- Réversibilité
L’étude de la réversibilité du processus d’adsorption a été réalisée selon un
protocole expérimental similaire à celui décrit dans la littérature (Barroug et al., 1998;
Shimabayashi et al., 1991; Misra, 1997).
Les tests d’adsorption (50 mg dans 5 ml) ont été menés sur une apatite maturée
30 jours (ANC-30j) avec des concentrations en risédronate de 0,12 à 4,24 mM. Ces
concentrations se situent respectivement avant et sur le palier de saturation. Après
centrifugation des suspensions obtenues à l’équilibre, les surnageants ont été retirés et
les poudres, non séchés, ont été remises en suspension pendant 20 minutes dans le
même volume d'une solution de KCl (1mM, pH ∼ 7,4). Ensuite les nouvelles
suspensions obtenues ont été centrifugées et les surnageants ont été retirés puis
analysés. Cette opération a été répétée trois fois sur le même culot.
II-1-3- Analyses chimiques
La caractérisation des solutions d’adsorbats avant et après interaction a été
réalisée conformément au protocole expérimental adopté dans le chapitre II de ce
manuscrit. Les teneurs en ions phosphate, calcium et risédronate ont été déterminées
respectivement par colorimétrie utilisant le complexe phospho-vanado-molybdique,
par spectroscopie d’émission optique sur plasma inductif (ICP/OES), et par
spectrophotométrie UV à 262 nm.

151
 II-1-4- Caractérisation du support après adsorption
Le protocole expérimental adopté pour la préparation des échantillons examinés
dans cette partie est identique à celui utilisé est décrit dans le paragraphe I-2 du
troisième chapitre. Après mise en contact (1 heure à pH ∼ 7,4 et à 37°C) des apatites
étudiées en présence d’une solution de risédronate de concentration désirée, les
poudres récupérées après centrifugation et filtration (0,4 mm) ont été lavées avec
environ 250 ml de solutions de KCl (1 mM, pHinitial ∼ 7,4) puis lyophilisées pendant
une nuit. Les échantillons témoins ont été traités dans des conditions semblables à
celles des tests d’adsorption mais sans adsorbat.
II-1-5- Evolution des supports ANC en présence de risédronate
Les échantillons d’apatites (100 mg) ont été mis en suspension dans des tubes
en polyéthylène (contenance 15 ml) avec 10 ml de solution désirée. Ces solutions sont
constituées de chlorure de potassium 1mM (KCl) qui servira de témoin ou du même
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milieu contenant le risédronate de concentration 11,42 mM (BP); cette concentration

correspond à la fin du palier d’adsorption. Le pH initial de ces solutions a été ajusté à
une valeur de 7,4. Après incubation à 37°C durant des périodes variables (1 heure à 20
jours), les suspensions obtenues ont été centrifugées et filtrées. Les poudres récupérées
après traitement sont lavées sur millipore (0,4 mm) par des solutions de KCl (1 mM,
pHinitial 7,4) puis mises au lyophilisateur pendant une nuit.

II-2- Résultats
II-2-1- Cinétique d’adsorption
Les cinétiques de rétention du risédronate par les apatites examinées (ANC) ont
été réalisées avec des solutions d’adsorbat de concentration 1,43 mM. L’évolution de
la quantité de BP retenue par ces matériaux en fonction de la durée d’incubation est
représentée sur la figure IV-1.
L’examen des courbes obtenues montre l’apparition d’un plateau de saturation
après environ 10 min de mise en contact des supports ANC avec la solution de
risédronate; ceci atteste de la grande réactivité de la surface des apatites examinées
vis-à-vis des molécules du risédronate. Afin de limiter le phénomène d’évolution de
ces solides lors du processus d’adsorption, nous avons fixé la durée de contact
adsorbant-adsorbat à 1 heure pour le reste de notre étude. Cette durée reste inférieure à
celle adoptée dans le cas du support de référence, l'apatite bien cristallisée HA (2
heures).

152
 II-2-2- Isotherme d’adsorption
Les données d’adsorption du risédronate par les supports ANC dans les
conditions examinées (pHinitial ∼ 7,4 et à T ∼ 37°C) sont regroupées dans le tableau IV-
1. Dans la gamme de concentration examinée (0 à 12 mM), le taux de rétention varie
de 46 à 100 %; pourcentage relativement supérieur à celui noté pour l’hydroxyapatite
bien cristallisée (15 à 91 %).
L’évolution de la quantité de risédronate adsorbée par les apatites
nanocristallines carbonatées examinées, en fonction de sa concentration à l’équilibre
(Figure IV-2), montre des allures de type Langmuir. Les paramètres caractéristiques
d’adsorption sont consignés dans le tableau IV-2. Comme on peut le voir, l’apatite
maturée durant un jour (ANC-1j) fixe la plus grande quantité de molécules de
risédronate, comparée aux apatites laissées dans leurs solutions mères pendant 6 et 30
jours. La surface occupée par molécule a été estimée à partir des quantités adsorbées
par unité de surface des nanocritaux; elle est comprise entre 0,3 et 0,5 nm²/molécule.
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Cette valeur reste légèrement inférieure à celle observée pour l'apatite de référence HA
(0,7 nm²/molécule).
II-2-3- Réversibilité
Nous avons suivi l'évolution des quantités de risédronate mises en solution au
cours des lavages successifs des solides obtenus après centrifugation afin d’évaluer la
réversibilité du processus d'adsorption. Les résultats obtenus (Tableau IV-3) indiquent
que les quantités de risédronate désorbées lors du premier lavage sont très faibles et
correspondent au plus à un taux de libération de 1,5 % pour les faibles concentrations
et 5 % pour les concentrations se situant dans le domaine de saturation. Les taux
cumulés libérés après les 3 lavages ne dépassent guère la fourchette 1,7 % - 6,3 % dans
les conditions examinées. Ces observations laissent penser que la fixation de
risédronate par l’apatite de basse cristallinité se fait de manière non réversible ou que
le processus de désorption est extrêmement lent. Il est à noter par ailleurs que le faible
taux de désorption obtenu pourrait être dû pour une bonne part à la dilution de la
quantité interstitielle de solution retenue dans les premiers culots.

153
 Tableau IV-1: Données d’adsorption de BP par ANC à T ∼ 37°C et pHinitial ∼ 7,4:
Concentration initiale (Co), concentration à l’équilibre (Ce), quantité
fixée (Q) et pourcentage d’adsorption.
ANC-1j
Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²) Q (mmol/g) Ads (%)
0 0 0 0 0
0,91 0,00 0,94 0,09 100,00
1,81 0,09 1,79 0,17 94,80
4,41 0,87 3,70 0,35 80,31
5,57 1,58 4,15 0,40 71,54
8,41 3,64 4,98 0,48 56,73
11,81 5,96 6,10 0,58 49,54
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ANC-6j
Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²) Q (mmol/g) Ads (%)
0 0 0 0 0
0,91 0,02 0,44 0,09 98,19
1,81 0,12 0,84 0,17 93,29
4,41 0,83 1,78 0,36 81,17
5,57 1,47 2,03 0,41 73,53
8,41 3,22 2,58 0,52 61,75
11,81 5,70 3,04 0,61 51,73

ANC-30j
Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²) Q (mmol/g) Ads (%)
0 0 0 0 0
0,91 0,00 0,51 0,09 99,64
1,81 0,12 0,96 0,17 93,53
4,41 0,97 1,95 0,34 77,96
5,57 1,81 2,13 0,38 67,42
8,41 3,91 2,55 0,45 53,48
11,81 6,43 3,05 0,54 45,50

154
 2.0
ANC-1j ANC-6j ANC-30j

Quantité adsorbée (µmol/m²) 1.5

1.0

0.5

0.0
0 20 40 60 80 100 120 140
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Durée d'incubation (min)

Figure IV-1: Cinétique d’adsorption du risédronate par les supports ANC à T ∼ 37°C
en milieu KCl (1 mM) de pHinitial ∼ 7,4.

ANC-1j ANC-6j ANC-30j

Quantité adsorbée (µmol/m²)

0
0 2 4 6
Concentration à l'équilibre (mM)

Figure IV-2: Isothermes d’adsorption à T ∼ 37°C du risédronate par les apatites

obtenues à différents temps de maturation : milieu KCl (1mM)
de pHinitial ∼ 7,4.

155
 Tableau IV-2: Paramètres d’adsorption à T ∼37°C du risédronate par ANC en milieu
KCl (1 mM) de pHinitial ∼ 7, 4.

Adsorbant N ± ΔN (µmol/m²) N ± ΔN (mmol/g) K ± ΔK (L/mmol) δ (nm²)

ANC-1j 5,9 ± 1,2 0,6 ± 0,1 2,7 ± 1,0 0,30

ANC-6j 3,2 ± 0,6 0,6 ± 0,1 2,1 ± 0,7 0,50

ANC-30j 3,1 ± 0,7 0,5 ± 0,1 2,4 ± 1,0 0,50

HA* 2,3 ± 0,1 0,13 ±0.01 7,3 ± 3,6 0,70

* Apatite sotechiométrique: support considéré comme référence (chapitre III)

Tableau IV-3: Evolution de la quantité de risédronate désorbée après lavages

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successifs des culots obtenus après adsorption.

Equilibre d’adsorption Désorption (Qdésorbée: µmol/m²)

Ce Qads 1er lavage 2ème lavage 3ème lavage Qdésorbée

(mM) (µmol/m²) totale (%)

0,12 0,96 0,014 < 0,001 < 0,001 1,7

1,95 2,14 0,024 0,009 0,006 1,8

4,24 2,61 0,134 0,019 0,0113 6,3

156
 II-2-4- Influence de l'adsorption sur la composition du milieu
Les résultats d’analyses chimiques des surnageants obtenus après adsorption par
les supports étudiés sont reportés dans le tableau IV-4. La fixation des molécules de
risédronate à la surface des apatites ne semble pas induire une modification du pH du
milieu dans les conditions examinées. Cependant, la comparaison de composition des
filtrats des suspensions avec et sans adsorbat met en évidence une augmentation assez
importante des teneurs en ions phosphate en solution lors de l’adsorption par rapport
aux ions calcium.
L’évolution des teneurs en ions minéraux en fonction des quantités adsorbées
dans la gamme de concentration examinée (0 – 12 mM) indique une mise en solution
progressive des ions phosphate (Figure IV-3); cependant la libération des ions calcium
est non monotone et varie légèrement au cours de l’adsorption. Les pentes des droites
obtenues ainsi que les coefficients correspondants sont consignés dans le tableau IV-5.
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157
 9
ANC-1j ( - ) ; ANC-6j ( - ) ; ANC-30j ( - )

Phosphore
Calcium, Phosphate (mM)

6
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Calcium

0
0 2 4 6
Quantité adsorbée (mM)

Figure IV-3: Evolution des teneurs en ions phosphate (symboles fermés) et calcium
(symboles ouverts) libérés en fonction des quantités de risédronate
adsorbées par les supports ANC à différents temps de maturation.

158
 Tableau IV-4: Composition des solutions après adsorption du risédronate (BP) par
ANC dans un milieu KCl à pHinitial ~ 7,4 et 37°C.
ANC- 1j
Q (mM) P (mM) Ca (mM) pHInitial- pHfinal
0,00 1,22 0,43 7,4 – 6.9
0,91 2,17 0,35 7,4 – 7,4
1,72 3,27 0,38 7,5 – 7,4
3,54 5,22 0,45 7,3 – 7,4
3,98 5,91 0,42 7,4 – 7,4
4,77 6,66 0,80 7,4 – 7,4
5,64 6,86 1,01 7,4 – 7,4

ANC- 6j
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Q (mM) P (mM) Ca (mM) pHInitial- pHfinal

0,00 0,54 0,32 7,5 – 7,2
0,89 1,43 0,45 7,4 – 7,4
1,69 2,10 0,77 7,5 – 7,5
3,58 4,12 0,90 7,3 – 7,4
4,09 4,85 0,86 7,4 – 7,5
5,19 5,90 0,90 7,4 – 7,6
6,11 6,31 1,24 7,4 – 7,5

ANC- 30j
Q (mM) P (mM) Ca (mM) pHInitial- pHfinal
0,00 0,67 0,21 7,4 – 7,1
0,90 1,53 0,18 7,4 – 7,4
1,70 2,59 0,13 7,5 – 7,5
3,44 4,75 0,90 7,3 – 7,4
3,75 4,75 0,78 7,4 – 7,5
4,50 5,67 1,14 7,4 – 7,5
5,37 6,25 1,57 7,4 – 7,5

159
 Tableau IV-5: Coefficients de proportionnalité entre phosphates libérés et
risédronates adsorbés.

Pente Ordonnée à Coefficient

(± erreur absolue) l’origine de corrélation (r²)
(± erreur absolue)
ANC-1j 1,07 ± 0,21 1,34 ± 0,21 0,98
ANC-6j 0,99 ± 0,03 0,55 ± 0,14 0,99
ANC-30j 1,08 ± 0,04 0,71 ± 0,14 0,99

II-3- Caractérisation du support après adsorption

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II-3-1- Diffraction des rayons X

Les diagrammes de diffraction des rayons X obtenus après adsorption
présentent tous des raies larges et mal résolues caractéristiques d’apatites de basse
cristallinité et ne montrent aucune phase étrangère. L’évolution de la taille des
cristallites a été estimée, en utilisant la formule de Scherrer, sur les échantillons mis en
contact avec différentes concentrations de risédronate correspondant à la partie
ascendante de l’isotherme d’adsorption (1,81 mM), au début (5,57 mM) et à la fin du
palier d’adsorption (11,81 mM). L’examen des résultats obtenus (Tableau IV-6) ne
montre aucune variation significative de la taille des cristallites suite à l’interaction
avec les molécules de risédronate. Il s’agit toujours de cristallites de forme allongée et
de taille comparable à l’apatite de référence.
II-3-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier (IRTF)
Les spectres infrarouges des apatites examinées avant et après adsorption des
molécules de risédronate sont présentés sur la figure IV-4. Les spectres des sels de
calcium du risédronate préparés sont également reproduits pour comparaison.
Les bandes de vibration caractéristiques des échantillons de départ restent
inchangées après adsorption. Cependant des bandes supplémentaires se manifestent
dans la région 650-850 cm-1 et ce pour les trois supports (ANC) étudiés. Un
agrandissement de l’échelle dans cette zone montre clairement trois bandes de faible
intensité situées à 676,7, 713,8 et 801,2 cm-1; ces bandes sont similaires à celles notées
sur les spectres des sels de calcium élaborés.

160
 Tableau IV-6: Dimensions apparentes des cristallites d'apatites examinées avant et
après adsorption de risédronate en fonction du temps de maturation.

L(002) ± 5 Å L(310) ± 5 Å L (002)/L (310)

ANC-1j 242 86 2,8
ANC-1j/KCl 248 71 3,5
ANC-1j/BP
1,81 mM 256 78 3,3
ANC-1j/BP
5,57 mM 245 78 3,2
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ANC-1j/BP
11,81 mM 257 77 3,3

ANC-6j 295 90 3,3

ANC-6j/KCl 292 81 3,6
ANC-6j/BP
1,81mM 313 95 3,3
ANC-6j/BP
5,57 mM 298 90 3,3
ANC-6j/BP
11,81 mM 291 78 3,8

ANC-30j 349 98 3,6

ANC-30j/KCl 347 97 3,6
ANC-30j/BP
1,81mM 347 104 3,3
ANC-30j/BP
5,57 mM 350 94 3,7
ANC-30j/BP
11,81 mM 351 93 3,8

161
 (A) (B)

679
802

714
CaBP (A)

CaBP (B)
Ca2BP

ANC-30j/BP

ANC-30j
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ANC-6j/BP

ANC-6j

ANC-1j/BP
ANC-1j

4000 2000 1500 1000 500 900 850 800 750 700 650
-1 -1
Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm )

Figure IV-4: Spectres d’absorption infrarouge des apatites nanocristallines carbonatés

obtenues avant et après interaction avec les molécules de risédronate:
milieu KCl , pHinitial ∼7,4 et T ∼ 37°C: comparaison avec les spectres
des sels de calcium.

162
 II-3-4- Spectrométrie par diffusion Raman
Les analyses par diffusion Raman réalisées sur les poudres obtenues après
interaction avec les molécules de BP (Figure IV-5) révèlent plusieurs différences par
rapport aux spectres des échantillons de référence. Il est à noter que seul le spectre de
l’apatite ANC-1j avant adsorption a été reporté sur la figure. Dans tous les cas on
assiste à l’apparition de plusieurs bandes supplémentaires relatives aux modes de
vibration des molécules de risédronate: la région spectrale située entre 1000 et 1700
cm-1 met en évidence la présence de bandes de vibrations caractéristiques de la
pyridine alors que les bandes de vibration associées aux liaisons C – P de la molécule
de risédronate se manifestent vers 646 et 677 cm-1. Les bandes de vibrations
supplémentaires ainsi notées sur les apatites après adsorption présentent une grande
similitude avec celles notées sur les spectres des sels de calcium, en particulier le
précipité Ca2BP.
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II-3-5- Spectroscopie RMN de l'état solide

Les spectres RMN 1H SPE-MAS des poudres d’apatites examinées après
adsorption (Figure IV-6) montrent une augmentation des largeurs à mi-hauteur des
pics attribués aux molécules d’eau (5,6 ppm), également visible sur les spectres des
apatites de départ. On assiste en outre à l’apparition de deux pics de faible intensité
vers 3,8 et 8,25 ppm. Le signal positionné vers 8,25 ppm parait mieux résolu lorsque le
temps de maturation augmente; par ailleurs, ce pic additionnel se superpose avec
l’épaulement noté entre 8,1 et 9,4 ppm dans le spectre du précipité Ca2BP.
Les spectres RMN 31P SPE-MAS et 1H→31P CP MAS (temps de contact = 5ms)
des trois supports étudiés après adsorption, du risédronate seul et de son sel de calcium
(Ca2BP) sont reportés sur la figure IV-7. L’usage de ces deux techniques permet de
déceler la présence des molécules de risédronate à la surface des apatites examinées.
En effet, on remarque en plus du pic dissymétrique entre 3,3 et 3,4 ppm attribué aux
groupements phosphate apatitique des solides avant adsorption, l'apparition d'un pic
large supplémentaire centré à environ 18 ppm similaire à celui qu'on trouve dans le sel
de calcium de risédronate noté Ca2BP. L’intensité de ce pic additionnel est plus grande
dans le cas des spectres obtenus par 1H→31P CP MAS que par RMN 31P MAS; ceci
peut être attribué à la contribution des protons présents dans l’environnement des
groupements phosphonate de la molécule étudiée. Notons par ailleurs que les spectres
RMN des autres sels de risédronate de calcium élaborés (CaBP(A) et CaBP (B)),
présentent différents pics plus au moins fins avec des positions variables (Chapitre II,
partie B); ceci laisse penser que les molécules de risédronate adsorbées à la surface des
apatites possèdent le même environnement chimique que celui du sel de calcium
Ca2BP.

163
 II-3-6- Analyse thermogravimétrique et différentielle
Les courbes obtenues par analyse thermogravimétrique et différentielle
effectuées à l’air et température variable entre 25°C et 900°C sur les apatites (ANC)
avant et après adsorption sont présentées sur la figure IV-8. Les thermogrammes des
supports avant adsorption donnent dans l’intervalle de température explorée une perte
massique totale qui varie entre 13 à 16 %; celle-ci peut être subdivisée en trois étapes.
On assiste d’abord à une perte de poids du produit initial d’environ 13 % entre la
température ambiante et 250°C, qui correspond à l’eau adsorbée sur les nanocristaux et
à l’eau associée aux environnements labiles. Le palier de la deuxième perte de masse
(0,5 %) qui est très faible et mal défini (en particulier sur les spectres réduits), se
manifeste entre 250°C et 550°C; cette perte peut être attribuée à de l’eau fortement liée
ou intracristalline (Heughebaert, 1977) et/ou à la condensation des ions
hydrogénophosphate (HPO42-) en ions pyrophosphate (P2O74-). La troisième perte de
masse estimée à environ 1,5 % se produit entre 650°C et 800°C; elle correspond à la
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réaction d’une partie des ions P2O74- avec les ions OH- de la structure apatitique
(Mihai, 2005) et/ou à la décomposition partielle des ions carbonate (Tadic et al.,
2002).
L’examen des courbes thermogravimétriques des supports après adsorption du
risédronate révèle trois pertes bien distinctes. Par comparaison avec les
thermogrammes enregistrés avant adsorption, on note une similarité entre la première
et la troisième perte. Tandis que la deuxième perte, enregistrée entre 250 et 550°C,
apparaît plus importante : une perte très nette de 6 % est clairement visible sur les
thermogrammes. Cette perte correspond sensiblement à la partie décomposable
volatile des molécules de biphosphonate. En effet si on considère que la
décomposition thermique des ions bisphosphonate dans cette gamme de température
donne lieu à des ions pyrophosphate, on peut évaluer la masse de la partie susceptible
d’être volatile:
Mvolatile ≈ Mrisédronate monosodique – 2,5MH2O – MNa – MP2O7
≈ 350,14 – 2,5. (18) – 23 – 174 ≈ 108 g.mol-1.
Connaissant la quantité de risédronate adsorbée à la saturation qui est de 0,6
mmol/g d’apatite, on peut déduire le pourcentage en masse correspondant à la masse
évaluée précédemment:
% massique correspondant à la masse volatile = 0,6.10-3 x 108 x 100 = 6,48
Soit environ 6,5 % ce qui correspond bien à la perte de masse notée sur les
thermogrammes obtenus.

164
 La courbe ATD correspondant à la seconde perte de poids donne lieu à deux
maxima sur la courbe thermique dérivée; l’un important apparaît à 330°C et le second
plus faible se manifeste vers 440°C. Ces évènements exothermiques correspondent très
probablement à deux étapes de décomposition distinctes de l’ion bisphosphonate.
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165
 1053
1040

677
1603

1234

808
1444

1193

858
1588

646
1321
CaBP (A)

CaBP (B)

Ca2BP
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δ C-H (Pyr)
νC-C; νC-N
(Pyr) νC-P

ANC-30j/BP

ν3PO4 ν1PO4
+ ν1CO3
ANC-6j/BP

ν4PO4 ν2PO4
ANC-1j/BP

ANC-1j

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

-1
Nombre d'onde (cm )

Figure IV-5: Spectres Raman obtenus après adsorption de BP à T∼37°C par les
apatites examinées: milieu KCl (1 mM), pHinitial ∼ 7,4.

166
 8,2 - 8,4

3,8
Ca2BP

ANC-30j/BP

ANC-30j
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ANC-6j/BP

ANC-6j

ANC-1j/BP

ANC-1j

BP

20 15 10 5 0 -5 -10

ppm/TMS

Figure IV-6: Spectres RMN 1H SPE-MAS des apatites obtenues après

adsorption à T∼37°C de BP: milieu KCl, pHinitial ∼ 7,4.

167
 18,14
18,24
(A) (B)

Ca2BP

ANC- 30j/BP
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ANC- 6j/BP

ANC-1j/BP

BP

40 30 20 10 0 -10 -20 40 30 20 10 0 -10 -20

ppm/H3PO4 ppm/H3PO4

Figure IV-7: Spectres RMN de 31P SPE-MAS (A) et1H→31P CP MAS (B) (temps de
contact = 5ms) du risédronate seul, des supports après adsorption du
risédronate, et du risédronate de calcium Ca2BP.

168
 Avant adsorption Après adsorption
0 20 0 30
ANC-1j ANC-1j/BP
15 20
Exo
Exo
10 -8
-6 10

ATG (%)

ATD (µV)
ATG (%)

ATD (µV)
5
0

0 -16
-10
-12
-5
-20
150 300 450 600 750 900 150 300 450 600 750 900
0 30 0 50
ANC-6j ANC-6j/BP
40
20
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Exo 30
Exo
ATG (%)

20
ATD (µV)

-8
ATG (%)

ATD (µV)
10 -10
10

0 0

-16 -10

-10 -20 -20

150 300 450 600 750 900 150 300 450 600 750 900
0 30 0 40
ANC-30j ANC-30j/BP

30
20 Exo
-5
Exo
20
10
ATD (µV)

-6
ATG (%)

ATD (µV)
ATG (%)

-10 10
0
0

-10 -15
-10
-12

-20 -20
150 300 450 600 750 900 150 300 450 600 750 900
Température (°C) Température (°C)

Figure IV-8: Thermogrammes (sous air et température de 25 à 900°C) des apatites

nanocristallines carbonatées (ANC) avant et après adsorption du
risédronate (Q = 0,6 mmol/g).

169
 II-3-7- Microscopie électronique à transmission (MET)
L’examen des clichés MET obtenus sur les apatites de références (avant
adsorption) de maturation variable permet de constater que la morphologie des
cristaux reste globalement la même au cours de la maturation avec toutefois une
longueur qui a légèrement tendance à augmenter (Figure IV-9). De plus on observe des
amas cristallins qui se présentent généralement sous forme de plaquettes de très faibles
épaisseurs et ayant une forme allongée.
Les images prises sur les poudres ANC obtenues après adsorption des
molécules de risédronate indiquent que les cristaux s’agrègent un peu moins par
rapport aux clichés des poudres de référence et se dispersent mieux avec une sensible
augmentation de la longueur des cristaux.
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170
 ANC-1j ANC-6j ANC-30j

ANC avant adsorption

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ANC après adsorption

Figure IV-9 : Photos MET des apatites nanocristallines obtenues avant et après adsorption du risédronate.
171
 II-4- Evolution des supports ANC en présence de risédronate
Comme il a été décrit précédemment, l’une des principales caractéristiques des
apatites nanocristallines est leur capacité à évoluer en milieu aqueux. Cette maturation
se traduit par des variations au cours du temps de la composition chimique, de l’état de
cristallinité et de l’environnement des ions minéraux dans la phase solide. Ces
modifications ont été clairement mises en évidence dans le cas de phosphates de
calcium synthétiques (Hina, 1996; Cazalbou et al., 2004b). Cependant dans les milieux
biologiques, d’autres facteurs interviennent et compliquent les processus de
maturation : les phénomènes d’adsorption sont l’un des facteurs qui gouvernent la
maturation de ces matériaux phosphocalciques.
Dans ce cadre, nous nous intéressons à évaluer l’influence de l’adsorption des
molécules de risédronate sur l’évolution des apatites nanocristallines en solution. Pour
cela, nous avons fait appel à deux techniques spectroscopiques complémentaires, FTIR
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et Raman, pour mettre en évidence toute éventuelle modification des caractéristiques

physico-chimiques du précipité en présence des solutions de traitement. Le support
utilisé dans cette étude est une apatite nanocristalline carbonatée maturée dans sa
solution mère durant 1 jour. Pour une simplification d’écriture, le solide traité dans un
milieu donné sera désigné par: ANC/milieu de traitement.
II-4-1- Résultats
II-4-1-1- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier
Les spectres d’absorption infrarouge de l’échantillon ANC traité pour des
durées variables dans les solutions étudiées (ANC/BP et ANC/KCl) sont
caractéristiques d’apatites mal cristallisées (Figure IV-10). L’examen de ces spectres
montre une évolution significative des principaux domaines d’absorption des ions
phosphate entre 400 et 700 (ν4 PO4) et entre 800 et 1300 cm-1 (ν1 et ν3 PO4) ainsi que
ceux des ions carbonate entre 1360 et 1560 cm-1 (ν3 CO3). Les spectres des supports
traités en présence d’adsorbat (ANC/BP) indiquent, en plus des bandes notées dans les
témoins, la présence de bandes supplémentaires entre 650 et 850 cm-1 caractéristiques
des molécules de bisphosphonate; celles-ci sont similaires à celles observées dans les
sels de risédronate de calcium synthétisées.
L’agrandissement dans les régions spectrales spécifiques aux modes de
vibrations des ions phosphate, carbonate et hydroxyle a été effectué afin de visualiser
au mieux l’évolution du support ANC dans les milieux étudiés (Figure IV-11).
L’examen des spectres obtenus dans la région spectrale située entre 800 et 1300
-1
cm indique (Figure IV-11) que le traitement de l’apatite en présence du chlorure de
potassium (ANC/KCl) se traduit par une meilleure résolution avec le temps des bandes

172
 d’absorption infrarouge spécifiques aux modes de vibration ν1 et ν3 des groupements
PO4. Par ailleurs, ces bandes restent larges et mal résolues lorsque l’apatite est incubée
en présence de bisphosphonate (ANC/BP).
Le domaine de vibration spécifique au mode de vibration ν3 des carbonates
(1300 et 1600 cm-1) de l’apatite traitée en présence de l’électrolyte KCl révèle la
présence de bandes de vibrations relatives aux ions carbonate de type A vers 1550 cm-1
et de type B vers 1419 et 1460 cm-1. Ces bandes apparaissent dès le premier jour de
traitement et deviennent de plus en plus définies au cours du temps d’incubation. Ces
observations suggèrent une évolution sensible de l’apatite vers des composés de mieux
en mieux cristallisés. Cependant, l’incubation de l’apatite en présence de
bisphosphonates montre une tendance différente. Les spectres montrent deux bandes
de même intensité situées vers 1433 et 1480 cm-1; celles-ci peuvent éventuellement
être associées à des groupements carbonate non-apatitiques (Heughebaert, 1977). En
outre, on note après 7 jours d’incubation l’apparition de deux bandes de faible intensité
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

vers 1545 et 1566 cm-1 caractéristiques respectivement d’ions carbonate de type A et

du risédronate.
Les spectres enregistrés dans la région spectrale entre 3200 et 3700 cm-1
indiquent pour l’apatite évoluant dans un milieu KCl l’apparition d’un épaulement
vers 3570 cm -1 caractéristique du mode de vibration νs des groupements OH dans le
réseau apatitique. Cette observation traduit l'amélioration de la cristallinité de l’apatite
maturée comparée à l’apatite de référence. Par contre, cette évolution ne se manifeste
pas dans le cas de l’apatite en présence des molécules de risédronate. Cela laisse
penser que l’adsorption des groupements bisphosphonate à la surface des cristaux
apatitiques inhibe l'évolution des apatites vers un meilleur état de cristallinité.
Afin de mieux mettre en évidence l’évolution de l’apatite maturée en présence
et en l’absence des molécules de risédronate, nous avons procédé à la décomposition
de la bande d’absorption d’ions phosphate entre 480 et 660 cm-1 (ν4 PO4). Ce
traitement mathématique de décomposition à été réalisé, comme nous l’avons décrit
antérieurement (Chap II, paragraphe III-2-2), en utilisant le logiciel GRAMS/AI
version 8.0. Les attributions des bandes correspondant au domaine ν4 PO4 sont
illustrées sur la figure IV-12. Dans le cas des spectres relatifs aux échantillons traités
en présence de risédronate (ANC/BP) une soustraction des bandes dues aux
bisphosphonates doit être réalisés afin de tenir en compte d'éventuelles perturbations
des bandes phosphates apatitiques par celle de bisphosphonates. Vu les faibles
quantités adsorbées par unité de masse, la soustraction n'a pu être réalisée avec
précision sans déformation de la bande ν4 PO4 de l'apatite. Cependant, nous avons

173
 ajoutés dans notre modèle de décomposition d'autres bandes relatives à celle du
risédronate.
Le rapport des aires des bandes des espèces phosphate (PO4 non-apatitique,
HPO4 apatitique et HPO4 non-apatitique) par rapport à l’aire de l'ensemble de la bande
phosphate a été calculé. L'évolution de l'environnement des ions phosphate au cours du
traitement de ANC dans les deux milieux étudiés (ANC/BP, ANC/KCl) est reportée
sur la figure IV-13. Dans le cas de l’apatite traitée dans un milieu KCl on assiste d’une
manière générale à une diminution des proportions de groupements HPO4 et PO4 non-
apatitiques, tandis que la quantité relative aux ions HPO42- apatitiques reste
relativement stable au cours du temps de traitement.. Cependant on assiste à
l’apparition des groupements hydroxyle apatitiques après un jour et leur intensité
augmente sensiblement avec la durée de traitement.
Dans le cas de l’apatite évoluée en présence du risédronate, on remarque que la
proportion des groupements phosphate labiles évolue faiblement et reste stable au
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

cours du temps. Néanmoins, une légère diminution de ceux-ci est observée à partir du
7ème jour de traitement. Une évolution identique est également notée pour la proportion
des groupements HPO4 apatitique avec une augmentation sensible pour l’échantillon
traité 20 jours. La décomposition permet, en outre, de mettre en évidence l’apparition
de très faibles quantités d’ions hydroxyle après un jour d’incubation.

174
 ν3 PO4
ANC/BP ANC/KCl
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

ν4 PO4

ν1 PO4

ν2 CO3
ν3 CO3

20j

7j

2j

1j

1h
4000 3500 3000 2000 1500 1000 500 4000 3500 3000 2000 1500 1000 500
-1 -1
Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm )
Figure
IV-10 : Spectres FTIR de l’apatite nanocristalline carbonatée traitée : ANC/KCl et ANC/BP.

175
 ANC/BP ANC/KCl
ν3PO4 ν3PO4
ν1PO4
ν1PO4

20j
7j
2j
1j
1h
1300 1200 1100 1000 900 800 1300 1200 1100 1000 900 800

1460
1550 CO (A)
1480

1433

CO3 (B)

1419
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1566

20j
1545

7j

20j 2j

7j 1j
ν3 CO3 ν3 CO3
2j
1j 1h
1h

1600 1550 1500 1450 1400 1350 1300 1600 1550 1500 1450 1400 1350 1300
3570

νsOH
20j 20j
3570

νsOH
7j 7j
2j 2j
1j
1j
1h
1h

3700 3600 3500 3400 3300 3200 3700 3600 3500 3400 3300 3200
-1 -1
Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm )

Figure IV-11: Spectres FTIR de l’apatite nanocristalline carbonatée (ANC) traitée en

présence de KCl (ANC/KCl) et de risédronate (ANC/BP).

176
 BP 20j KCl 20j
PO4 apatitique
PO4
OH non apatitique HPO4 apatitique

OH
HPO4
non apatitique
BP

BP 7j KCl 7j
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

BP 2j KCl 2j

BP 1j KCl 1j

BP 1h KCl 1h

700 680 660 640 620 600 580 560 540 520 500 680 660 640 620 600 580 560 540 520 500 480

Figure IV-12: Décomposition de la bande phosphate entre 480 et 660 cm-1 de ANC
maturée dans les milieux KCl (ANC/KCl) et BP (ANC/BP) pour des
durées variables (1h à 20j).

177
 ANC/KCl

25

20
% P labiles
15
% HPO4 apatitique
% HPO4labiles
10
OH
5

0
1h 1j 2j 7j 20j
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

ANC/BP

20
18
16
% P labiles
14
12 % HPO4 apatitique
10 % HPO4labiles
8 BP
6
OH
4
2
0
1h 1j 2j 7j 20j

Figure IV-13: Quantités relatives des différentes espèces calculées à partir du rapport
des aires des bandes infrarouge pour l’apatite carbonatée traitée
dans les milieux KCl (ANC/KCl) et BP (ANC/BP). La teneur en
espèces OH et BP représente l'aire totale des bandes
correspondantes.

178
 II-4-1-2- Spectrométrie par diffusion Raman
La figure IV-14 regroupe les spectres Raman, obtenus dans la région spectrale
située entre 250 et 1750 cm-1, de l’apatite nanocristalline carbonatée (ANC-1j) traitée
dans les milieux étudiés (KCl et BP). Aucune modification sensible des bandes
d’absorption caractéristiques de l’apatite étudiée ne se manifeste dans le milieu KCl.
Par contre, en présence de molécules de risédronate, plusieurs bandes supplémentaires
caractéristiques du mode de vibration de groupement pyridine et des liaisons C – P de
la molécule se rajoutent sur les spectres Raman obtenus. Ces bandes restent
inchangées au cours du traitement (1h à 20j).
Par ailleurs, l’acquisition des spectres Raman dans la région spectrale située
entre 3200 et 3600 cm-1 pour le support ANC incubé dans KCl (Figure IV-15 a), met
clairement en évidence l’apparition de la bande spécifique aux ions hydroxyle ( 3570
cm-1); l’intensité de cette bande croît avec le durée de traitement. Ceci atteste de
l’évolution des cristaux vers une phase apatitique mieux cristallisée, en accord avec les
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observations révélées par spectrométrie infrarouge. Cependant, les spectres Raman

obtenus en présence de risédronate ne subissent aucune altération et confirment
l’absence de la bande hydroxyde (Figure IV-15 b). Ces observations corroborent les
résultats obtenus par spectrométrie infrarouge et attestent encore une fois de l’effet
inhibiteur des molécules fixées à la surface des cristaux sur le processus d’évolution de
l’apatite étudiée.

179
 ν1 PO4 (a) (b)
ANC/KCl ANC/BP
δ C-H (Pyr)
ν3 PO4

ν4 PO4

ν2 PO4
νC-C; νC-N

ν4 PO4

ν2 PO4
+ ν1 CO3 (B) (Pyr)
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

20j

7j

2j

1j

νC-P

1h
1750 1500 1250 1000 750 500 250 1750 1500 1250 1000 750 500 250
-1 -1
Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm )

Figure IV-14: Etude par spectroscopie Raman entre 250 et 1750 cm-1 de l’évolution à 37°C de ANC (a) dans KCl
(b) dans BP: pHinitial ∼ 7,4.

180
 (a) (b)
ANC/KCl ANC/BP
20j 20j
OH
7j 7j
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

2j 2j

1j 1j

1h 1h

3600 3500 3400 3300 3200 3600 3500 3400 3300 3200
-1 -1
Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm )

Figure IV-15: Etude par spectroscopie Raman de l’évolution de ANC à 37°C et pHinitial ∼ 7 dans: (a) milieu KCl (1 mM)
et (b) milieu BP.

181
 III- ADSORPTION DU RISEDRONATE PAR LES APATITES
OCTOCALCIQUES

III-1- Matériaux et méthodes

Les solides examinés dans cette étude sont également des phosphates de
calcium de synthèse. Il s’agit de phosphate octocalcique apatitique OCPa et du même
support carbonaté noté OCPa-c. La préparation ainsi que la caractérisation de ces
solides a fait l’objet du second chapitre. Ces adsorbants sont mal cristallisés et
présentent des surfaces spécifiques de 49 m²/g et 90 m²/g respectivement pour l’OCPa
et l’OCPa-c; ces valeurs sont relativement faibles comparées à celles notées pour les
apatites nanocristallines carbonatées obtenues à différents temps de maturation et dont
la surface spécifique couvre la gamme 95 - 200 m²/g).
III-1-1- Adsorption
Le protocole expérimental utilisé pour les tests d’adsorption est identique à
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

celui décrit dans le troisième chapitre III. La gamme de concentration explorée varie
de 0 à 11,5 mM. Les solutions d’adsorbat ont été fraîchement préparées en dissolvant
la quantité appropriée de risédronate (BP) dans une solution de KCl (1 mM). Toutes
les expériences ont été réalisées à pH proche de 7,4 et à température voisine de 37°C.

III-2- Résultats
III-2-1- Cinétique d’adsorption
Cette étude a été réalisée avec des solutions d’adsorbat de concentration 1,70
mM. Les cinétiques de rétention du risédronate par les apatites octocalciques
examinées montrent que le plateau d’adsorption est atteint durant les premières
minutes (20 min) de mise en contact de l’adsorbant et l’adsorbat (Figure IV-16). Des
observations similaires ont été notées pour les apatites nanocristallines carbonatées
(ANC). Pour la suite de notre étude, nous avons opté pour une durée de contact entre
apatite et la solution de risédronate d’environ une heure, temps largement suffisant
pour atteindre l’équilibre.

182
 3
Quantité adsorbée (µmol/m²)

1
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OCPa OCPa-c
0
0 60 120
Durée d'incubation (min)

Figure IV-16: Cinétique d’adsorption du risédronate par les supports OCPa et

OCPa-c: milieu KCl de pHinitial ∼ 7,4 et T ∼ 37°C.

183
 III-2-2- Isothermes d’adsorption
Les résultats d’adsorption sur les deux solides examinés (OCPa et OCPa-c) sont
représentés dans le tableau IV-7. Un premier examen de ces données montre que, dans
les mêmes conditions expérimentales (gamme de concentrations et température), le
taux de risédronate fixé par l’OCP apatitique (23 à 93%) est supérieur à celui noté (13
à 91%) pour le solide carbonaté (OCPa-c).
L’évolution de la quantité de risédronate adsorbée en fonction de sa
concentration à l’équilibre (Figure IV-17) indique que l’allure des isothermes obtenues
est de type Langmuir et que le support carbonaté présente la plus faible affinité
adsorbant-adsorbat. En effet, la valeur de la constante d’affinité déduite de l’équation
de Langmuir linéarisée pour l’OCPa est environ trois fois plus importante comparée à
celle notée pour le support carbonaté (OCPa-c). Cependant, la quantité de molécules
de risédronate retenue à la saturation par la surface des phosphates de calcium
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examinés est pratiquement la même pour les deux supports (Tableau IV-8). Ainsi, les
surfaces occupées par les molécules de risédronate sont comparables pour les deux
solides examinés et restent proches de celles notées pour les apatites carbonatées de
basse cristallinité (ANC).
III-2-3- Influence de l'adsorption sur la composition du milieu
Les résultats d’analyse des solutions obtenues après adsorption du risédronate
par les deux supports OCPa et OCPa-c (Tableau IV-9) montrent que la fixation des
molécules de risédronate s’accompagne d’une mise en solution d’ions phosphate de
manière progressive et en quantité relativement important, alors que les teneurs
libérées en ions calcium sont très faibles et ne semblent pas évoluer lors de
l’adsorption. Par ailleurs, on note que les quantités en ions minéraux libérées dans le
cas de l’OCPa sont plus élevées comparées au support carbonaté (OCPa-c).
L’évolution des ions phosphate en fonction des quantités de risédronate
retenues par la surface des phosphates de calcium apatitiques étudiées reste
pratiquement linéaire (Figure IV-18). Les pentes de droites ainsi obtenues après
linéarisation sont de 1,8 ± 0,10 et 1,1 ± 0,1 pour les solides OCPa et OCPa-c,
respectivement. Cette linéarité atteste d’un processus d’échange ionique impliquant les
molécules adsorbées et phosphates libérés; cet échange est plus prononcé dans le cas
du phosphate octocalcique apatitique non carbonaté. L’évolution des ions calcium
quand à elle reste toujours stable et non monotone en fonction des quantités adsorbées.

184
 Tableau IV-7: Données d’adsorption de risédronate par l’OCPa et l’OCPa-c à T∼37°C
et pH∼ 7,4: Concentration initiale (C0), concentration à l’équilibre
(Ce), quantité fixée (Q) et pourcentage d’adsorption.

OCPa
Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²) Ads (%)
0 0 0 0
0,86 0,08 1,59 90,8
1,71 0,54 2,39 68,5
4,28 2,80 3,01 34,5
5,70 4,21 3,05 26,2
8,55 7,03 3,11 17,8
11,40 9,85 3,18 13,7
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OCPa-c
Co (mM) Ce (mM) Q (µmol/m²) Ads (%)
0 0 0 0
0,86 0,06 0,89 93,3
1,71 0,38 1,48 78,0
4,28 2,30 2,19 46,1
5,70 3,48 2,47 39,0
8,55 6,00 2,84 29,9
11,40 8,76 2,94 23,2

185
 4
Quantité adsorbée (µmol/m²)

1
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

OCPa OCPa-c
0
0 5 10
Concentration à l'équilibre (mM)
Figure IV-17: Isothermes d’adsorption à 37°C du risédronate par OCPa et OCPa-c:
milieu KCl de pHinitial∼7,4.

Tableau IV-8: Paramètres d’adsorption du risédronate par les phosphates

octocalciques.

Echantillon N ± ΔN (µmol/m²) K ±ΔK (L/mmol) δ (nm²)

OCPa 3,2 ± 0,1 6,2 ± 0,6 0,5
OCPa-c 3,1 ± 0,6 2,0 ± 0,6 0,5

186
 Tableau IV-9: Composition des solutions après adsorption du risédronate à 37°C par
l’OCPa et l’OCPa-c: milieu KCl de pHinitial ∼ 7,4 et.

OCPa
Q (mM) P (mM) Ca (mM)
0 6,22 0,9
0,78 7,50 0,19
1,17 8,06 0,15
1,48 8,55 0,17
1,49 8,83 0,20
1,53 8,91 0,24
1,56 9,07 0,29
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

OCPa-c
Q (mM) P (mM) Ca (mM)
0 0,06 0,04
0,80 0,44 0,02
1,33 1,22 0,04
1,97 2,29 0,09
2,23 2,18 0,06
2,56 2,85 0,11
2,65 2,87 0,12

187
 12
OCPa (P ; Ca ) ; OCPa-c (P ; Ca )

9
Calcium, Phosphate (mM)

6
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0 1 2 3
Quantité adsorbée (mM)

Figure IV-18: Evolution des teneurs en ions phosphate et calcium libérés en fonction
des quantités de risédronate adsorbée dans un milieu KCl (1 mM):
pH ∼ 7,4 et T ∼ 37°C.

188
 III-3- Caractérisation du support après adsorption
III-3-1- Conditions expérimentales
Le protocole expérimental adopté est identique à celui utilisé dans le cas des
apatites nanocristallines carbonatées examinées dans le présent chapitre (paragraphe
II-1). Les échantillons ont été incubés dans des conditions physiologiques (pHinitial ~
7,4 et T ~ 37°C) pendant une heure en présence de solutions de risédronate. Les
suspensions ont ensuite été centrifugées puis filtrées; les solides ainsi obtenus ont été
lavés avec des solutions de KCl (1 mM, pHinitial ∼ 7,4) puis lyophilisés durant une nuit.
Les échantillons utilisés comme témoins ont été traités dans les mêmes conditions
mais sans adsorbat.
III-3-2- Spectrométrie Infrarouge par Transformée de Fourier
L’étude par spectroscopie d’absorption infrarouge des solides obtenus après
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adsorption montre, outre les bandes caractéristiques des phosphates de calcium

octocalciques de départ (OCPa et OCPa-c), des épaulements dans la région spectrale
située entre 650 et 900 cm-1 caractéristiques des molécules d’adsorbat (Figure IV-19).
Les positions de ces bandes s’identifient à celles notées sur les spectres des sels de
calcium de risédronate précipités et sont par contre déplacées par rapport à la molécule
native, en particulier celle qui apparaît vers 714 cm-1. Il est à noter par ailleurs que ces
bandes sont de faible intensité comparées à celles observées dans le cas des supports
ANC examinés antérieurement.
III-3-3- Spectrométrie par diffusion Raman
L’analyse par spectroscopie de diffusion Raman des solides obtenus après
adsorption confirme la fixation des molécules de risédronate à la surface des
phosphates octocalciques apatitiques examinés (Figure IV-20). En effet, on observe
sur les spectres des supports OCPa/BP et OCPa-c/BP des bandes d’absorption
caractéristiques des liaisons C-P, de groupements phosphonate et pyridine. Les
positions de ces bandes, sont également déplacées par rapport à la molécule native et
sont identiques à celles notées sur les sels de calcium élaborés.

189
 (A) (B)

679
802

714
CaBP (A)

CaBP (B)
Ca2BP

OCPa-c/BP

OCPa-c
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OCPa/BP
OCPa

4000 2000 1500 1000 500 900 850 800 750 700 650
-1 -1
Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm )

Figure IV-19: Spectres infrarouge de l’OCPa et l’OCPa-c avant adsorption et après

contact avec le risédronate (OCPa/BP et OCPa-c/BP) et des sels de
risédronate de calcium.

190
 ν1PO4

ν3 PO4

δ P-OH
+

ν C-C-O
ν (C−H) Pyr ν1CO3 (B)

ν C-P
OHapatite

x3

OCPa-c /BP

OCPa-c
δ C-H (pyr)
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

ν P=O

ν C-C; νC-N
δ C-H

(pyr)
x3
OCPa/BP
ν3PO4 ν4PO4 ν2PO4 OCPa

3600 3400 3200 1600 1400 1200 1000 800 600 400
-1
Nombre d'onde (cm )
807
1229
1596

674
1322

641
858

CaBP(A)

CaBP(B)

Ca2BP
OCPa-c/BP
OCPa/BP

1600 1500 1400 1300 1200 900 850 800 750 700 650
-1 -1
Nombre d'onde (cm ) Nombre d'onde (cm )

Figure IV-20: Spectres Raman obtenus après adsorption à T∼37°C de BP par les
supports OCPa et OCPa-c: milieu KCl (1 mM) de pHinitial ∼ 7,4.

191
 IV- DISCUSSION
L'adsorption du risédronate par les apatites nanocristallines carbonatées (ANC)
ainsi que les phosphates octocalciques apatitiques (OCPa et OCPa-c) étudiées se
produit selon une cinétique rapide. Dans tous les cas, le plateau d'adsorption est atteint
durant les premières minutes de mise en contact de l'adsorbant avec l'adsorbat. Cela
témoigne de la grande réactivité de surface des solides examinés vis-à-vis des
molécules de risédronate. Des observations similaires sont notées pour la réaction de
molécules anioniques présentant divers groupement fonctionnels (phosphoserine et
BSA) avec la surface de matériaux apatitiques de basse cristallinité (Ouizat et al.,
1999; Benaziz et al., 2001). Un processus rapide est également observé pour
l'interaction de divers bisphosphonates avec des échantillons de l'os humain (Leu et al.,
2006; Mukherjee et al., 2008). Cependant, l’équilibre d’adsorption de l'alendronate
(bisphosphonate de troisième génération) par des apatites nanocristallines requiert une
durée d’incubation de 24 h (Palazzo et al., 2007). Une vitesse d'adsorption
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relativement lente (6 h) a également été notée pour l'adsorption de la glycine par des
phosphates octocalciques apatitiques (Bennani, 1998). Des cinétiques de quelques
heures ou de quelques jours d’incubations sont par ailleurs observées pour l’adsorption
de macromolécules anioniques par l’hydroxyapatite (Barroug et al., 1997 et 1998); la
lenteur du processus a été attribuée par les auteurs à l’existence de barrière de potentiel
que les molécules doivent franchir pour accéder à la surface du matériau, étant donné
que les partenaires sont de même signe de charge dans les conditions examinées.
Bien que les caractéristiques des supports examinés (ANC, OCPa et OCPa-c)
ainsi que les compositions des solutions utilisées soient différentes, l’adsorption des
molécules de risédronate est décrite par des isothermes de type Langmuir. Des allures
similaires ont été notées pour l'interaction de phosphates de calcium de basse
cristallinité avec des acides aminés (Benaziz, 2002; Bihi et al., 2002) et pour la
tetracycline (Bennani, 1998) ainsi que pour la rétention de divers bisphosphonates par
des échantillons de l'os humain (Kubícek et al., 2005; Mukherjee et al., 2008).
L’étude comparée de la réactivité des molécules de risédronate vis-à-vis de la
surface des phosphates de calcium apatitiques examinés indique que les conditions de
synthèse influent considérablement sur les caractéristiques physico-chimiques de ces
matériaux et affectent par conséquent leur processus d’adsorption. Les quantités
adsorbées ont été rapportées selon le cas à l’unité de masse ou de surface. Cette double
présentation offre la possibilité d’exploitation des isothermes d’adsorption. Elle
permet, d’une part, de mettre en évidence le rôle des caractéristiques texturales du
support et de spécifier, d’autre part, l’importance des sites actifs dans les propriétés de
surface de ces matériaux. Il est à noter par ailleurs que la reproductibilité des valeurs

192
 de surfaces spécifiques des supports examinées a été vérifiée moyennant diverses
mesures expérimentales.
L’analyse globale des résultats obtenus suggère que divers facteurs sont à
prendre en considération pour expliquer la différence de comportement de ces
matériaux vis-à-vis des molécules d’adsorbat: composition chimique, état de la
surface, taille et morphologie des cristallites…. Si l’on focalise sur la capacité de
rétention de ces matériaux en termes de sites actifs on observe que, dans les mêmes
conditions expérimentales (pH, température, gamme de concentration, rapport solide-
solution…), les apatites nanocristallines (ANC, OCPa et OCPa-c) présentent la plus
grande capacité de rétention par unité de surface (Tableau, IV-10) comparées à,
l'hydroxyapatite de référence (HA).
Nous avons montré sur la base des techniques spectroscopiques utilisées
(chapitre II) que l'une des caractéristiques essentielles des nanocristaux d'apatites
synthétisées est la présence à leur surface d'environnements ioniques spécifiques des
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

ions minéraux, appelés "environnements non apatitiques". Ces environnements sont

associés à des couches hydratées de surface constituées essentiellement d'ions
bivalents très labiles (Ca2+, HPO42- et CO32-); la teneur de ces espèces dans les apatites
de basses cristallinité est d'autant plus importante que la durée de maturation est plus
petite. Il a été bien établi que ces environnements sont très instables et disparaissent
progressivement sous l'effet de la maturation ou par réaction (Hina, 1996, Cazalbou et
al., 2004b; Barroug et al., 2008).
Ainsi, la différence de comportement des apatites de basse cristallinité (ANC)
vis-à-vis des molécules d’adsorbat lors de la maturation pourrait être le résultat d'une
éventuelle modification de l'état de surface de l’adsorbant. L'évolution de la quantité
de risédronate fixée à la saturation par les apatites dans la séquence ANC-1j > ANC-6j
≥ ANC-30j suggère que le processus d'adsorption des molécules de risédronate est
étroitement lié à la composition de ces domaines non apatitiques et à leur évolution en
fonction de la maturation. L'étude d’adsorption menée sur la BSA avec des supports à
différents temps de maturation montre des tendances similaires (Ouizat et al., 1999);
les auteurs ont montré que les solides fraîchement précipités et non maturés, riches en
environnements non-apatitiques labiles, sont les plus actifs et que la capacité de
rétention du matériau est réduite avec la maturation. Ce changement en fonction de la
durée de maturation se traduit, d’une part, par la formation d’une apatite de moins en
moins lacunaire et mieux cristallisée et, d’autre part, par une diminution progressive de
la teneur en groupements hydrogénophosphate et phosphate non apatitiques, associée à
une augmentation concomitante de phosphates apatitiques et à l’incorporation d’ions

193
 hydroxyle dans le réseau. Ces modifications traduisent une évolution du solide vers la
stœchiométrie.

Tableau IV-10: Paramètres d’adsorption à T ∼ 37°C du risédronate et caractéristiques

physico-chimiques des phosphates de calcium examinés : milieu KCl
de pH initial ∼ 7,4.

Echantillon SBET L(002)-L(310) N ± ΔN N ± ΔN Ca/P Ca/(P+C)

(m²/g) (nm) (µmol/m²) (µmol/g)
ANC-1j 96 24 - 9 5,9 ± 1,2 0,60 ± 0,10 1,53 1,38
ANC-6j 201 30 - 9 3,2 ± 0,6 0,60 ± 0,10 1,59 1,39
ANC-30j 176 35 - 10 3,1 ± 0,7 0,50 ± 0,10 1,61 1,39
OCPa 49 19 - 6 3,2 ± 0,1 0,16 ± 0,01 1,33 -
OCPa-c 90 12 - 4 3,0 ± 0,6 0,27 ± 0,01 1,65 1,38
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HA 59 57 - 27 2,3 ± 0,1 0,13 ± 0,01 1,65 1,65

Il est à noter par ailleurs que les phosphates octocalciques apatitiques

nanocristallins sont également riches en environnements labiles et présentent des
quantités adsorbées à la saturation comparables à celles notées pour les échantillons
ANC-6j et ANC-30j. Cette similitude de réactivité entre phosphate octocalcique
apatitique et apatites nanocristallines a été également observée pour l'interaction de la
phosphoserine avec ces supports (Benaziz, 2002).
L’analyse de la composition de la solution après adsorption révèle que la
fixation de molécules de risédronate se traduit par une modification de la teneur en
ions minéraux en solution: on assiste à la mise graduelle en solution d’ions phosphate
avec la quantité de risédronate fixée. Par ailleurs, la capacité d’adsorption des supports
est accrue par la présence d’environnements labiles à la surface des nanocristaux
apatitiques. L'évolution linéaire des ions phosphate libérés en solution au cours de
l'adsorption montre que la fixation des molécules d'adsorbat se fait principalement
selon un processus d’échange ionique impliquant les espèces phosphates et
risédronates, qui pourraient partager les mêmes sites d’adsorption à la surface du
solide. Des résultats similaires ont été notés pour l’interaction de divers acides
bisphosphoniques avec l'os humain (Mukherjee et al., 2008 et 2009) et avec des
apatites déficientes en calcium (Roussière et al., 2005). La présence d'ions carbonate
labiles à la surface des apatites préparées et la corrélation avec la quantité adsorbée
suggère que ces espèces pourraient bien contribuer à ce processus d'échange ionique à

194
 l’interface du matériau et son milieu environnant; toutefois nous n'avons pas procédé
dans le cadre de ce travail à l’analyse de ces espèces en solution afin d’illustrer ce
phénomène. En effet le contenu en ions carbonate de solutions à pH neutre peut
facilement être altéré au cours de la filtration en raison des équilibres acide-base de ces
ions en solution :
CO32- + H2O ⇔ HCO3- + OH-
HCO3- + H2O ⇔ CO2(H2O) + OH-
CO2(H2O) ⇔ CO2 (gaz) + H2O
Sur la base des données d’adsorption obtenues avec les apatites nanocristallines,
il semblerait que la mobilité des espèces ioniques non apatitiques à la surface des
nanocristaux affecte considérablement le processus d'échange ionique ainsi décrit. La
corrélation établie entre les teneurs en environnements labiles et quantités adsorbées à
la saturation par les apatites examinées illustre bien ce phénomène (Figure IV-22). Il
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

apparaît clairement que l'évolution des quantités de risédronates adsorbées est

étroitement liée à la teneur en ions hydrogénophosphate et carbonate non apatitiques.
En effet, l'apatite maturée un jour et dont la surface est riche en espèces labiles, offre
une capacité d'échange ionique plus importante comparée aux supports vieillis durant
6 et 30 jours dans leurs solutions mères.

195
 Quantité adsorbée à la saturation (µmol/m²)
(A) HPO4 labiles
6 N (µmol/m²)
0.4

HPO4 non apatitique

5

4
0.2

2 0.0
ANC-1j ANC-6j ANC-30 OCPa OCPa-c HAP
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Echantillon
0.8
Quantité adsorbée à la saturation (µmol/m²)

(B)
CO3 Labiles
6
N (µmol/m²)
0.7

CO3 Labiles
0.6

0.5

0.4
ANC-1j ANC-6j ANC-30 OCPa-c
Echantillon

Figure IV-22: Corrélation entre risédronates adsorbés et teneurs en groupements

phosphate (A) et carbonate labiles non apatitiques (B).

196
 Nous avons montré que la présence d’environnements labiles riches en espèces
ioniques à la surface des analogues du minéral osseux leur confère une grande
réactivité. Toutefois, ces espèces non présentes dans le cas des solides bien cristallisés,
ne peuvent être seules responsables du phénomène d’adsorption. D’autres facteurs sont
également à prendre en considération dans la réactivité de ces matériaux, en particulier
les propriétés microstructurales des supports examinés. Ainsi, l'apatite de référence
(HA), bien cristallisée et formée de cristallites de dimensions relativement importantes
(Tableau IV-10), présente la plus faible capacité de rétention de risédronate par unité
de surface, tandis qu’une quantité plus importante est notée pour les échantillons
présentant des cristallites d'une dizaine de nanomètres. Ces observations indiquent que
l'état finement divisé ainsi que les irrégularités de surface des phosphates de calcium
mal cristallisés (ANC-1j, ANC-6j, ANC-30j, OCPa et OCPa-c) sont également des
facteurs déterminant dans leur réactivité. Les mêmes constatations ont été rapportées
pour divers adsorbats avec des apatites de miscrostructures différentes (Ouizat, 2000;
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Benaziz, 2002; Matsumoto et al., 2003, Barroug et al., 2004).

L'analyse systématique de surface des solides issues des expériences
d’adsorption par l’intermédiaire de différentes techniques de caractérisation physico-
chimiques constitue le second volet de notre approche expérimentale. Les spectres de
DRX réalisés sur les poudres obtenues après contact avec les molécules de risédronate
(ANC/BP) ne montrent aucune phase étrangère outre que l'apatite. Toutefois, la
formation d'une telle phase à la surface des nanocritaux ne peut être écartée dans la
mesure où elle serait de nature amorphe. Les études cristallographiques menées sur des
apatites synthétisées en présence d’un autre bisphosphonate (alendronate) appuient
cette hypothèse (Bonanini et al., 2007); en effet, le produit issu de la réaction est un
phosphate de calcium apatitique (hydroxyapatite) associé à une phase amorphe
d'alendronate de calcium.
Les résultats dégagés de l’étude menée par spectrométries FTIR et Raman
confirment l'immobilisation des molécules de risédronate à la surface des solides
examinés. En effet, les spectres obtenus montrent, en plus des raies caractéristiques
des supports apatitiques examinés, des raies spécifiques des modes de vibration des
groupements fonctionnels des molécules de risédronate adsorbées. Les positions de ces
bandes sont déplacées par rapport à la molécule native et s’apparentent par ailleurs à
celles observées dans les sels de calcium de risédronate précipités (Tableau IV-11).
Les déplacements ainsi notés au niveau des positions de bandes pour les molécules
fixées traduisent l’existence d’interactions relativement fortes impliquant les
groupements fonctionnels de ces espèces et les sites actifs à la surface du support
apatitique. Des observations similaires ont été notées pour la fixation du clodronate

197
 (BP) à la surface de biocéramiques d'apatite (Luo et al., 2008), du phénylphosphonate
à la surface de l'hydroxyapatite (Aissa et al., 2007), de la phosphoserine par divers
phosphates de calcium (Benaziz, 2002). Les mêmes tendances ont été rapportées pour
l’adsorption de l'acide octadecylphosphonique par l'émail dentaire (D'andrea et al.,
2003) et le zolédronate par des échantillons de fémur de rats (Juillard et al., 2010).
Par ailleurs, la similitude entre les positions des bandes de molécules adsorbées
avec celles des sels de risédronate de calcium précipités laisse penser qu’il s’agit du
même type d’interaction. Le déplacement observé par Raman au niveau des fréquences
des bandes de vibrations des molécules de risédronate adsorbées, et plus spécialement
celles du noyau de pyridine (Δν ∼ 41 cm-1) et des groupements phosphonate (Δν ∼ 7
cm-1) ainsi que des liaisons C-P (Δν ∼ 17 cm-1), traduit l’altération de l'environnement
moléculaire de l'adsorbat. Ces modifications chimiques pourraient être la conséquence
d’interactions mettant en jeu les groupements fonctionnels des bisphosphonates
(phosphonates) et les sites actifs à la surface des solides (ions calcium).
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Nous avons en outre mentionné que dans certaines conditions expérimentales

(domaine de concentrations relativement élevées) les phénomènes physico-chimiques
qui interviennent à la surface du matériau apatitique sont plus complexes qu’un simple
processus d’échange. La mise en solution des ions minéraux suite à la dissolution des
cristaux apatitiques et leur évolution avec la quantité de risédronate fixée appuient
l’hypothèse de la formation de complexes de calcium soluble ou de paires d’ions
impliquant les molécules de risédronate. De ce fait, la possibilité de formation de sels
insolubles de risédronate de calcium à la surface de l’apatite ne peut être écartée et doit
être considérée comme une réaction compétitive de l’adsorption. Il est à noter
cependant que de telles réactions de déplacement avec la formation d'un risédronate de
calcium sous forme de phase séparée doivent être exclue. En effet dans ce cas la
réaction ne serait pas limitée et se poursuivrait avec l'addition de risédronate.

198
 Tableau IV-11: Attributions des principales bandes de vibrations observées dans les spectres Raman du risédronate monosodique
(BP), des sels de risédronate de calcium précipités (CaBP(A), CaBP (B) et Ca2BP) et des apatites obtenues après
adsorption (HA/BP, ANC/BP, OCPa/BP et OCPa-c/BP).

F: Forte, tF: très forte, m: moyenne, f; faible, tf: très faible, ép: épaulement).
a: Socrates, 2004; b: Cukrowski et al., 2007; c: Juillard et al., 2010
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Attributions BP a,b,c Ca2BP CaBP(A) CaBP(B) HA/ BP ANC/BP OCPa/BP OCPa-c /BP

276 tf - -
δC–C 320 tf 324 ép -
642 tf 642 f
629 m 642 m 642 tf 646 f 634 tf 641 tf
νC–P
633 m 633 f
661 m 677 m 673 m 677 m 673 tf 677 f 672 f 674 f
νC–C–O 823 tf 807 m 807m 807 m 808 f 807 f 807
δ (P – OH) 862 m 849 f - 855 m 858 f 858 f
νs P – OH 932 tf, 970 m, 1033 ép 914 ép, 967 m 959 f - 923 f, 965 m
δ (C – H) pyr 1024F, 1054 F 1034 t F, 1048 F 1033 F, 1050 tF 1031 tF, 1048 tF 1040 m, 1053 m 1032 m, 1045m 1034 m, 1046m
νP=O/δΠPOH 1222 m 1229 m 1223 m 1229 m 1227 tf 1234 f 1229 f 1229 f
δ (C – H) 1315 m 1325 m 1323 ép - 1319 f 1321 tf 1320 f 1322 f
ν (C=N), 1445 tf 1439 tf 1445 tf 1439 tf 1445 tf 1444 tf 1440 f 1440 f
1569 f - - -
ν (C=C) 1625 ép 1582 tf 1581 tf 1581 tf 1582 tf 1588 f 1578 tf
pyridine 1637 m 1596 m 1596 f 1596 m 1596 m 1603 m 1596 m 1596 m

199
 L’étude par RMN de l’état solide des adsorbants examinés (ANC/BP et HA/BP)
confirme les observations faites par les techniques spectroscopiques (FTIR et Raman)
et par analyse chimique en solution quant au mode d’interaction se produisant à
l’interface de l’apatite et son milieu environnant. En effet, la présence de massif large
et intense vers 18 ppm dans le spectre 31P CP MAS (Figure IV-23) de l’apatite
nanocristalline traitée en présence de risédronate (ANC/BP) est indicative non
seulement d’interactions fortes survenant à l’interface ANC-risédronate, mais atteste
aussi d’un changement significatif de l’environnement local des noyaux de phosphore
des groupements phosphonate. En outre, l’analyse par RMN dans les mêmes
conditions expérimentales (température, gamme de concentration, pH) corrobore la
grande réactivité notée pour les supports nanocristallins comparés à l’apatite de
référence (HA/BP).
Par ailleurs, l’allure large et dissymétrique du pic additionnel noté pour
ANC/BP traduit l’état de mauvaise cristallinité des espèces adsorbées. Les mêmes
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phénomènes ont été rapportés pour diverses molécules de bisphosphonates adsorbées

par des apatites phosphocalciques (Grossmann et al., 2000; Roussière et al., 2005),
apatites déficientes en calcium (Roussière et al., 2005) et par des échantillons de l’os
humain (Mukherjee et al., 2008). La similitude du pic additionnel avec celui du
composé amorphe précipité (Ca2BP) suggère la présence de ce sel dans la monocouche
formée à la surface de l’apatite nanocristalline. Dans notre cas, la précipitation de sels
insolubles de risédronate de calcium à la surface de l’apatite n’a pu être observée par
diffraction des rayons X, étant donné leur caractère amorphe. Cependant, Cukrowski et
al. (2007) affirment sur la base de résultats issus de la combinaison de différentes
techniques (Raman, RMN, DRX et MEB) la formation de complexes à la surface de
l’hydroxyapatite et de l’os bovin traités par des solutions d’étidronate. La formation
d'un précipité cristallin à la surface de l'hydroxyapatite et de l'os de rat a également été
rapportée dans l’étude menée par Raman et MEB (Juillard et al., 2010) sur la réactivité
de ces matériaux avec le zolédronate. La précipitation de telles phases a aussi été
observée par RMN du solide et MEB lors d'interaction de zolédronate et de tiludronate
avec des phosphates tricalciques β (Josse, 2003; Roussière et al., 2008).

200
 CaBP (A)

CaBP (B)
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Ca2BP

ANC-1j/BP

x5
HA/BP

BP

30 25 20 15 10 5 0 -5 -10

ppm/H3PO4

Figure IV-23: Spectres RMN 1H→31P CP MAS (temps de contact = 5ms) du

risédronate seul (BP), des supports après adsorption
(HA/BP, ANC-1j/BP), et des sels de calcium synthétisés (CaBP(A),
CaBP (B) et Ca2BP).

201
 L’étude menée sur l’incubation des nanoapatites carbonatées (ANC) en absence
et en présence de molécules de risédronate visait à spécifier le rôle de ces espèces sur
l’évolution des caractéristiques physico-chimiques de ces matériaux. L’analyse des
spectres infrarouges et Raman des cristaux apatitiques traités en présence de
l’électrolyte chlorure de potassium (ANC/KCl) révèle une amélioration accrue de la
cristallinité en fonction du temps d’incubation; l’apparition des ions hydroxyle en
proportion relativement importante et la diminution de la teneur des ions phosphate
non apatitiques attestent du phénomène observé. Cependant, une tendance inverse se
manifeste lors de l’incubation des cristaux dans le même milieu additionné de
molécule de risédronates (ANC/BP). En effet, la spectroscopie FTIR ne révèle aucune
évolution significative dans les proportions des différentes espèces phosphate dans les
conditions expérimentales adoptées. En outre, aucune bande de vibrations relatives aux
groupements hydroxyle ne figure sur les spectres Raman (ANC/BP) des supports
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

traités. Ces observations laissent penser que la fixation des molécules de risédronate à
la surface de l’apatite nanocristalline inhibe l’évolution des cristaux vers un état de
cristallinité meilleure.
La différence de comportement notée en présence et en absence des molécules
BP peut être essentiellement liée au mode de fixation de ces espèces à la surface des
nanocristaux. En fait, l'adsorption semble altérer et/ou ralentir le processus de
restructuration de la couche hydratée et son évolution vers des formes plus stables. Cet
effet inhibiteur a été observé lors du traitement d'apatites nanocristallines en présence
d'ions magnésium (Mg2+ ) et carbonate CO32- (Hina, 1996; Cazalbou, 2000; Eichert,
2002). La localisation de ces ions dans la couche hydratée conduit à une stabilisation
des environnements non apatitiques, gênant ainsi la progression vers des domaines
apatitiques stables.
L’absence d’évolution dans notre cas pourrait être la conséquence de
l’adsorption des espèces BP à la surface des nanocristaux. Ainsi la fixation du
risédronate est étroitement liée à la composition des domaines non apatitiques à la
surface de ces matériaux. Cette surface instable est éventuellement le siège de divers
phénomènes dépendant les uns des autres: échange ionique, dissolution, complexation
et/ou précipitation de sel de risédronate de calcium. Ces observations une fois de plus
semblent indiquer une interaction étroite entre molécules adsorbées et la surface de la
phase apatitique et semblent exclure, dans notre cas, la formation d'une phase séparée.
Ces processus complexes peuvent altérer considérablement la redistribution des
groupements labiles, bloquant ainsi les sites actifs à la surface des nanocristaux, ce qui
ralentit leur évolution vers des phases apatitiques plus stables. Ces observations

202
 corroborent les recherches menées in vitro sur la nucléation et la croissance cristalline
de phosphate de calcium en présence de molécules organiques. Il a été rapporté que
l'effet inhibiteur des pyrophosphates, bisphosphonates et polyphosphonates sur le taux
de croissance cristalline de l'hydroxyapatite est principalement dû à leur complexation
avec les ions calcium situés au niveau des nœuds et des zones de dislocation de la
surface des cristaux (Fleisch et al., 1970; Russell et al., 1970; Meyer et Nancollas,
1973). En outre, le rôle inhibiteur ou promoteur sur la nucléation et la croissance
cristalline de phosphate de calcium en présence d'ostéopontine (Boskey et al., 1993),
de protéoglycanes et phosphoprotéines (Termine et al., 1980; Linde et al., 1989;), et de
l'albumine de sérum bovin (Combes et Rey, 2002) a été principalement attribué, selon
la concentration, aux phénomènes d'adsorption.
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203
 V- INTERACTION PHOSPHATES DE CALCIUM-BISPHOSPHONATES ET
CONSEQUENCES BIOLOGIQUES
La nature physico-chimique de l'interaction entre bisphosphonate et phosphate
de calcium analogues au minéral osseux, établie dans le cadre de ce travail, peut avoir
des conséquences sur le plan biologique. Toutefois, l'extrapolation des résultats issus
d'une étude in vitro menée sur un système relativement simple dans un milieu vivant
dans lequel les phénomènes qui se produisent sont complexes doit être faite avec
précaution.
Nous avons mentionné précédemment que le mécanisme d'inhibition des
minéralisations normales ou ectopiques par les bisphosphonates est principalement dû
à un mécanisme physico-chimique (Fleisch, 1998). En effet, il existe une relation
étroite entre la capacité d'une molécule de bisphosphonate à inhiber la croissance
cristalline des phosphates de calcium in vitro et de son efficacité sur la calcification in
vivo (Trechsel et al., 1977; Van Beek et al., 1994).
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

Les effets physico-chimiques de la plupart des bisphosphonates sont très

semblables à ceux de pyrophosphate. Ainsi, ils inhibent la formation, l'agrégation des
cristaux de phosphate de calcium, bloquent la transformation de phosphate de calcium
amorphe en hydroxyapatite, et retardent l'agrégation des cristaux d'apatite (Fleisch,
1998).
Tous ces effets semblent être liés à l'affinité marquée de ces composés pour la
surface de la phase phosphocalcique, à la surface duquel ils se fixent fortement (Jung
et al., 1973). Cette affinité est due aux fortes interactions entre groupements
fonctionnels des BPs et sites calcium. Il a été suggéré que les BPs peuvent former des
liaisons bidentales ou tridentales avec les ions calcium à la surface des cristaux
d'apatites (Nanacollas et al., 2006). La coordination bidentale implique un atome
d'oxygène de chaque groupement phosphonate. C'est le cas de la molécule de
Clodronate. Tandis que la plupart de bisphosphonates utilisés actuellement dans le
traitement des pathologies osseuses se fixent au calcium d'une manière tridentale,
faisant ainsi intervenir l'atome d'oxygène du groupement hydroxyle (R1) lié au
carbone centrale. Ainsi il semble que la présence d'un groupement hydroxyle en
position R1 augmente l'affinité des bisphosphonates pour le calcium; ils se comportent
alors comme ligands tridentales (Nancollas et al., 2006). Dans le cas du risédronate
nous avons pu confirmer par les différentes techniques utilisées la forte implication des
groupements phosphonate dans l’interaction avec les ions calcium à la surface des
apatites examinées.
Il a été rapporté par ailleurs, sur la base de mesures éléctrocinétiques, que
l'adsorption de plusieurs bisphosphonates par l'hydroxyapatite induit un changement

204
 significatif de leur charge globale de surface (Nancollas et al., 2006). Cette charge peut
affecter in vivo plusieurs propriétés du minéral osseux, tels l'habilité à attirer d'autres
ions, molécules chargées et macromolécules ou éventuellement des cellules osseuses
telles les ostéoclastes ou les ostéoblastes. Cette charge peut aussi affecter la fixation
locale d'autres bisphosphonates ajoutés, par attraction ou répulsion selon leur signe de
charge.
La tension interfaciale est également un facteur à prendre en considération pour
expliquer l'effet inhibiteur des bisphosphonates sur la croissance cristalline du minéral
osseux. Ce paramètre joue un rôle important non seulement dans la stabilité des
suspensions colloïdales et l'adsorption de molécules à l'interface solide/solution mais
aussi dans la description classique de la nature et la cinétique de la croissance
cristalline (Wu et Nancollas, 1999). Ainsi, l'adsorption de bisphosphonates par
l'hydroxyapatite provoque une nette diminution de la tension interfaciale, ce qui
affecte considérablement le processus de nucléation et de croissance cristalline du
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minéral apatitique.
Les bisphosphonates peuvent aussi altérer le processus de vieillissement du
minéral osseux. Cette propriété de maturation, liée essentiellement à la présence d'une
couche hydratée très instable à la surface, est très affectée par les phénomènes
d'adsorption. Nous avons montré par l’intermédiaire des techniques spectroscopiques
(FTIR et le Raman) que la fixation des molécules de risédronate à la surface des
nanocristaux apatitiques bloque leur évolution vers un meilleur état de cristallinité. La
localisation de ces molécules dans la couche hydratée semble gêner sa restructuration
en apatite et donc préserver sa réactivité de surface. Dans les milieux vivants la
fixation préférentielle des bisphosphonates au niveau de l'os spongieux, qui est le
mieux irrigué par le sang, pourrait participer en plus du remodelage osseux au
processus de régénération de la couche hydratée.
Un autre aspect des bisphosphonates est leur effet à long terme même après
l'interruption du traitement. Par la réaction d'échange ionique proposé dans cette étude,
nous avons illustré la grande habilité du risédronate à s'échanger avec les groupements
phosphate de la surface de l'apatite. La capacité des ions phosphate à déplacer les
molécules de risédronate adsorbées a été aussi prouvée. Cependant, in vivo les
molécules de BPs adsorbées sur l'os ne peuvent être détachées par l'action inverse des
ions phosphate et/ou d'autres espèces compétitives aux sites d'adsorption. Vues les
faibles variations circadiennes des ions phosphate dans les fluides biologiques, les
bisphosphonates adsorbées ne peuvent pas se libérer d'une façon importante et
demeurent attachés fermement à la surface du minéral osseux. Dans ce cas, le tissus
osseux peut être considéré comme réservoir de molécules de bisphosphonates et

205
 capable de maintenir l'action des bisphosphonates pour de longues périodes.
Cependant, la conservation à long terme des bisphosphonates peut avoir des
inconvénients sur certaines populations tels les enfants et les femmes en age de
procréer, ou lorsque l'association à d'autres traitements est nécessaire (l'hormone
parathyroïde humain par exemple) (Black et al., 2003).
Les bisphosphonates inhibent aussi la dissolution des cristaux phosphocalciques
(Fleisch, 1998). Cette observation était à la base des différents modèles proposés pour
élucider l'effet inhibiteur de la résorption osseuse induit par ces composés (Russell et
al., 1970). Cependant, et avec le développement et l'étude d'autres bisphosphonates
plus puissants, il apparaît assez clair que l'effet physico-chimique ne peut à lui seul
expliquer le mode d'action des BPs sur la résorption osseuse et que des mécanismes
biologiques sont fortement impliqués.
Bien que les effets des bisphosphonates sur la calcification soient
principalement dûs à des mécanismes physico-chimiques, ce n'est pas le cas pour la
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

résorption osseuse. En effet, l'inhibition de la résorption osseuse peut s'expliquer en

grande partie, sinon pas entièrement, par des mécanismes cellulaires. Ceux-ci peuvent
être considérés à trois niveaux fortement liés les uns aux autres: tissulaire, cellulaire et
moléculaire.
Les concentrations de bisphosphonates nécessaires pour inhiber la résorption
osseuse in vivo sont si faibles qu'elles sont peu efficaces pour avoir un impact
significatif sur la dissolution des minéraux (Fleisch, 1998). De plus, les études
réalisées sur une large gamme de BPs n'ont montré aucune corrélation entre
l'inhibition de la dissolution des minéraux in vitro et l'activité pharmacologique sur la
résorption osseuse in vitro (Van Beek al., 2003) ou in vivo (Shinoda et al., 1983). Il a
été donc admis par la plupart des chercheurs que le mode d'action des BPs sur la
résorption osseuse est essentiellement de nature cellulaire.
La principale cellule cible des bisphosphonates est l’ostéoclaste mature, même
si certains effets sur leurs précurseurs (Russell et al., 2008) ou sur les ostéoblastes
(Yoshida et al., 2005) ont été décrits. Après leur administration, les bisphosphonates
sont adsorbés à la surface du minéral osseux par liaison au calcium de la phase
minérale osseuse. Lors du phénomène de résorption, les bisphosphonates sont libérés
de la phase minérale osseuse sous l’effet de l’acidité produite dans la chambre de
résorption par les ostéoclastes. Les bisphosphonates pénètrent alors par endocytose
dans l’ostéoclaste (Russell, 2007c) où ils vont agir sur différentes voies métaboliques
pour aboutir à l’inhibition, voire à l'apoptose de la cellule (Russell et al., 2007a). C’est
à ce niveau que se différencient les deux catégories de bisphosphonates. Les non-
amino-bisphosphonates, comme le tiludronate, l’étidronate et le clodronate, sont

206
 métabolisés dans l’ostéoclaste et aboutissent à la formation de métabolites toxiques de
l’adénosine triphosphate (ATP) (Van Beek et al., 2003), non hydrolysables, qui
s’accumulent dans la cellule, l’inhibent puis la tuent (Russell, 2007b).
Par contre, les bisphosphonates contenant de l’azote dans leur chaîne latérale
(aminobisphosphonates; exemples : le pamidronate, l’alendronate, l’ibandronate, le
risédronate et le zolédronate) ne sont pas métabolisés (incorporés) dans l’ostéoclaste
mais agissent principalement en inhibant une enzyme de la biosynthèse du mévalonate,
la farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) (Van Beek et al., 2003). Cette inhibition
enzymatique empêche la prénylation et inhibe la fonction de petites protéines
régulatrices responsables de l’hydrolyse de la guanosine triphosphate (GTP) (GTPases
Ras, Rab, Rho et Rac) indispensables au processus de signalisation intracellulaire.
Ceci perturbe la fonction cellulaire et désorganise notamment le cytosquelette, fait
disparaître la bordure en brosse, et aboutit à l’inactivation puis à l’apoptose de
l’ostéoclaste (Russell, 2007b). Au sein de cette classe, le pamidronate semble
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

néanmoins se démarquer par un mécanisme d’action visant aussi une autre cible que la
voie du mévalonate, encore indéterminée (Van Beek et al., 2003), tandis que le
zolédronate, outre son action inhibitrice sur la voie du mévalonate, bloquerait aussi
une translocase mitochondriale (Russell et Rogers, 1999). La distance entre l’atome
d’azote et le groupe P-C-P ainsi que la configuration spatiale de la chaîne latérale R2
semble constituer les principaux déterminants de la puissance d’un amino-
bisphosphonate (Fleisch, 1998). Les plus puissants connus actuellement sont ceux
contenant un atome d’azote dans un anneau hétérocyclique comme le risédronate et le
zolédronate (Russell et al, 2007a).

207
 VI- CONCLUSION
La réactivité des apatites nanocristallines vis-à-vis du risédronate monosodique
en milieu aqueux a été étudiée. L'adsorption des molécules de risédronate est un
processus rapide. Cela est vraisemblablement dû à la grande affinité de ces molécules
pour la surface des nanocristaux étudiés. Dans tous les cas examinés, l'allure des
isothermes d'adsorption du risédronate est de type Langmuir. Les paramètres
caractéristiques de l'adsorption dépendent étroitement des propriétés du solide. Le
processus d'adsorption du risédronate semble être gouverné par un phénomène
d'échange ionique impliquant les ions phosphate de la surface des apatites
nanocristallines étudiées. Les tests de réversibilité vis-à-vis de lavages successifs des
poudres de ANC montre que l'adsorption des molécules de risédronates est un
phénomène non réversible.
La capacité de rétention des solides ANC diminue avec la durée de maturation.
Cette évolution est associée à l'appauvrissement de la couche hydratée en ions labiles
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

après maturation. Ces environnements instables à la surface des nanocristaux d'apatite

constituent des sites privilégiés pour l'adsorption des molécules d'adsorbat. La fixation
des molécules de risédronate inhibe la restructuration de la couche hydratée gênant
ainsi l'évolution de ces solides nanocristallins vers un état de cristallinité meilleure.
L'étude comparée des propriétés d'adsorption des phosphates de calcium vis-à-
vis du risédronate montre que la réactivité des apatites nanocristallines similaires au
tissu osseux est plus importante que celle de l'hydroxyapatite, support de référence. Il
apparaît que la présence des groupements labiles à la surface des nanocristaux
constitue des sites privilégiés pour les molécules de risédronate.
La caractérisation des solides obtenus après adsorption permet de préciser la
nature des molécules de risédronate fixées par l'apatite. La forte interaction entre
groupements phosphonate et sites calcium de la surface a été bien établie. Cette étude
semble exclure dans les conditions expérimentales adoptées la formation d'une phase
séparée à la surface des matériaux examinés.

208
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CONCLUSION GENERALE
 L’étude des phénomènes physico-chimiques intervenant à l'interface entre
phosphates de calcium d'intérêt biologique et molécules de bisphosphonate nous a
amené dans une première étape à élaborer et caractériser deux catégories de supports :
(i) l’hydroxyapatite, un support bien cristallisé et utilisé en chromatographie en phase
liquide et dans la composition de matériau orthopédique et (ii) des apatites
nanocristallines analogues à la phase minérale des tissus calcifiés.
Les conditions de synthèse affectent considérablement les caractéristiques
physico-chimiques des solides préparés et influent par conséquent sur leurs propriétés
d’adsorption. Les cristaux obtenus à pH basique et à température proche de 90°C sont
caractéristiques d’hydroxyapatite bien cristallisée, légèrement sous stoechiométrique
(Ca/P = 1,64) et présentant une surface spécifique voisine de 59 m²/g. Les solides
préparés à pH physiologique (7,4) et à température ambiante (20 ± 2°C) sont des
apatites nanocristallines carbonatées (ANC) analogues au minéral osseux. Ces apatites
se caractérisent par des surfaces spécifiques élevées (96 – 201 m²/g), d'une importance
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prépondérante dans la réactivité du matériau. Les phosphates octocalciques apatitiques

(OCPa et OCPa-c) formés en milieu eau éthanol s’apparentent à une phase apatitique
mal cristallisée et présentent des surfaces spécifiques relativement faibles (49 – 90
m²/g), comparées aux apatites nanocristallines ANC.
Les supports nanocristallins sont dotés à leur surface d'une couche hydratée,
riche en environnements non-apatitiques labiles (en particulier des ions phosphate et
carbonate). La maturation (vieillissement) des cristaux dans leurs solutions mères se
traduit par une diminution des teneurs en espèces labiles. Cette évolution affecte
également les propriétés microstructurales des nanocristaux : augmentation de la taille
apparente des cristallites, amélioration de la cristallinité et évolution vers des solides
moins lacunaires.
Afin de spécifier la nature de l’interaction lors de l’adsorption du
bisphosphonate par les supports apatitiques examinés, nous avons procédé dans une
seconde étape à l’élaboration des sels du risédronate de calcium susceptibles de se
former en présence d’ions calcium en solution. Pour cela nous avons fait appel à
différentes techniques spectroscopiques complémentaires. Ainsi, deux familles
distinctes de précipités ont été identifiés selon le rapport molaire en solution (Ca/BP)
et le pH du milieu: il s’agit de sels de risédronate de calcium amorphe (noté Ca2BP) et
de composés cristallins (noté CaBP). Par ailleurs, l'étude menée par conductimétrie
confirme la nature des fortes interactions mises en jeu entre les espèces
bisphosphoniques et les ions calcium en solution.
La réactivité des apatites préparées vis-à-vis des molécules de risédronate
dépend des propriétés physico-chimiques du matériau et des caractéristiques de la

209
 solution. Bien que les apatites préparées soient de nature différente (HA, ANC, OCPa
et OCPa-c), les isothermes d'adsorption obtenues ont une allure de type Langmuir.
Toutefois, les facteurs qui gouvernent les phénomènes qui interviennent à l’interface
entre risédronate et apatites phosphocalciques sont divers.
L’étude menée avec les apatites nanocristallines atteste de l’implication des
environnements non apatitiques dans le processus de fixation des molécules de
risédronate à la surface des matériaux. En effet, les cristaux fraîchement précipités est
dont les surfaces sont riches en ions phosphate et carbonate non apatitiques, fixent la
plus grande quantité de molécules de risédronate par unité de surface, comparés au
solides maturés. Ces espèces labiles et facilement échangeables constituent ainsi des
sites privilégiés pour les molécules d’adsorbat. De ce fait une corrélation a été établie
entre les quantités de risédronate adsorbé, d’une part, et la teneur en environnements
non-apatitiques localisés dans la couche hydratée à la surface des nanocristaux
apatitiques, d’autre part. Il est à noter par ailleurs que l’évolution des propriétés
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microstructurales et la stoechiométrie lors du vieillissement pourrait être en partie

responsable de la diminution de la capacité de rétention des cristaux maturés.
L’analyse globale des résultats obtenus indique que la modification des
conditions expérimentales (pH, teneur en ions minéraux actifs, température…) influe
sur le nombre de sites spécifiques à l’adsorption des molécules de risédronate.
Inversement, l’adsorption du risédronate à la surface des cristaux apatitiques affecte
considérablement la composition de la solution. L’analyse détaillée des surnageants
recueillis après incubation met en évidence la mise en solution d’ions minéraux
(dissolution du minéral): la teneur en ions phosphate libérée est proportionnelle à la
quantité en bisphosphonate fixée à la surface du support. Par ailleurs, la présence
(ajout) d’ions phosphate dans le milieu d’incubation inhibe la rétention des molécules
suite à leur compétition pour les sites actifs à la surface du minéral. Ces observations
traduisent l’existence d’un équilibre d'échange ionique entre les molécules d’adsorbats
de la solution et les ions phosphate de la surface du minéral apatitique. En outre, le lien
établi entre la composition de la couche hydratée à la surface des apatites
nanocristallines et leur capacité d’adsorption, d’une part, et l’irréversibilité du
processus vis-à-vis de la dilution ainsi que le déplacement des espèces initialement
fixées en présence d’ions phosphate, d’autre part, attestent de l’existence d’une
réaction d'échange ionique.
Cependant, l'évolution complexe des teneurs en ions calcium mis en solution
selon la gamme de concentration en adsorbat explorée (évolution non monotone et
libération ascendante, respectivement pour gammes de concentrations faible et élevée)

210
 suggère que les phénomènes physico-chimiques qui interviennent à la surface du
matériau ne se limitent pas à un simple processus d’échange tel décrit précédemment.
Les observations expérimentales issues de la combinaison des différentes
méthodes d'analyses spectroscopiques (FTIR, Raman, et RMN de l'état solide) mettent
en évidence des modifications et déplacements significatifs des bandes et pics
caractéristiques des espèces adsorbées; ces modifications chimiques sont indicatives
non seulement d’interactions fortes survenant à l’interface apatite-risédronate, mais
attestent aussi d’un changement de l’environnement local des noyaux de phosphore
des groupements phosphonate.
L’ensemble des résultas obtenus dans les diverses conditions examinées indique
que la surface du minéral est éventuellement le siège de divers phénomènes dépendant
les uns des autres: échange ionique, dissolution, complexation et/ou précipitation de
sel de risédronate de calcium. Ces processus complexes semblent altérer et/ou ralentir
la restructuration de la couche hydratée (blocage de sites actifs) et inhibent son
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évolution vers des formes plus stables.

Ce travail constitue une base de données pour la compréhension des
phénomènes gouvernant la réactivité des phosphates de calcium apatitiques vis-à-vis
du milieu environnant et complète l'ensemble de travaux engagés dans la littérature.
Les connaissances ainsi acquises dans le domaine seront éventuellement mises à
profit pour la mise au point de biomatériaux (en particulier des ciments) pour
délivrer de façon locale, lente et progressive le principe actif de choix
(médicaments). Cette recherche engloberait la partie in vitro et in vivo sur les
biomatériaux et impliquerait une collaboration pluridisciplinaire fédérant des
chimistes, chirurgiens orthopédistes, pharmaciens, biologistes, …

211
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231
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

ANNEXES
 DESCRITPION DES TECHNIQUES D'ANALYSES UTILISEES

I- ANALYSES CHIMIQUES

I-1- Dosages du calcium, phosphate et carbonate dans les solides

La solution mère pour le dosage du calcium et du phosphore dans les solides a
été préparée comme suit: 100 mg de solide à analyser sont introduits dans une fiole de
100 ml puis additionnés de 5 ml d'une solution d'acide perchlorique (6 M). Après
dissolution complète, le volume est ajusté à 100 ml avec de l'eau désionisée.
I-1-1- Dosage du calcium
Le calcium a été dosé par volumétrie en retour (Charlot, 1966). L'agent
complexant est le sel disodique de l'éthylène diamine tétra acétique (EDTA) en
présence d'ammoniaque. L'excès de l'EDTA est ensuite dosé par une solution titrée de
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chlorure de zinc. L'indicateur de virage est le noir d'ériochrome T (virage de la

coloration bleu au rose). L'erreur relative sur la teneur en calcium est de l'ordre de 0,5
%.
I-1-2- Dosage des ions orthophosphate
Les ions orthophosphate ont été dosés par colorimétrie (Charlot, 1966). Le
principe de cette méthode consiste à mesurer la densité optique (absorbance) de la
coloration jaune du complexe phosphovanadomolybdique VO3[P(Mo3O10)4], en milieu
acide, à une longueur d’onde λ = 460 nm. Le réactif colorimétrique est préparé en
mélangeant dans la proportion 50/50 % en volume, une solution de molybdate
d'ammonium (80 g/l) et une solution de monovanadate d'ammonium (4 g/l). Les
absorbances des différentes solutions ont été mesurées, dans des cuves en quartz, à
l'aide d'un spectrophotomètre UV-visible BECKMAN type 24 à double faisceau. La
précision du dosage du phosphore est de l'ordre de 0,5 %.

I-1-3- Dosage de carbonates

Les ions carbonate contenus dans le solide ont été dosés avec un coulomètre
UIC Coulometrics. L'attaque de l'échantillon (50 mg) par l'acide perchlorique (2 M)
produit un dégagement de CO2 entraîné par un flux d'air, préalablement débarrassé du
dioxyde de carbone par bullage dans une solution de KOH à 70 %.
Le dioxyde de carbone provenant de l'échantillon bulle dans la cellule
coulométrique de pH. Le CO2 réagit avec l'éthanolamine pour former un acide fort qui
provoque l'atténuation de la couleur bleue de l'indicateur. Une cellule photoélectrique
détecte la diminution de la densité optique et commande la régénération

232
 électrochimique de la solution cathodique afin de la ramener à sa coloration d'origine
(100 % en transmission). La quantité de courant nécessaire à cette opération
coulométrique est intégrée et transformée en mg de carbone. Le pourcentage massique
en carbone est donné par la relation :
% CO3 = 0,5.X/m
où X désigne la quantité de carbone (mg) donnée par l’appareil et m la masse de
l'échantillon utilisée (mg). L'erreur relative sur la mesure est de l'ordre de 1%.

I-2- Dosage du calcium et de phosphate dans les solutions d'adsorption

I-2-1- Dosage du calcium
Le calcium présent dans les surnageants avant et après adsorption a été dosé par
spectrométrie d'émission optique par plasma à couplage inductif (ICP/OES). C'est une
technique d'analyse multiélémentaire qui sert à la détermination et au dosage de plus
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de 50 éléments. L'échantillon liquide est nébulisé puis transmis vers le plasma d'argon
(6000°C). Il subit différentes étapes de décomposition, d'atomisation et d'ionisation
conduisant à une excitation des atomes et des ions. Après excitation, les atomes
contenus dans l'échantillon émettent de la lumière dont la longueur d'onde leur est
caractéristique. La lumière est transmise par l'intermédiaire du système optique (réseau
+ prisme) vers un détecteur, qui permet le dosage. Cette technique est très sensible et
permet d'atteindre des teneurs de l'ordre de quelques parties par billion (ppb).
I-2-2- Dosage des ions phosphate
La teneur en ions phosphate dans les filtrats obtenus avant et après adsorption a
été dosée par colorimétrie (Charlot, 1966) selon le même protocole expérimental
adopté pour les solides. Ces dosages ont été réalisés à l'aide d'un spectrophotmètre
UV-visible Hewlett Packard 8452A Diode Array.

I-3- Dosage du risédronate

La spectroscopie UV-visible a été utilisée pour déterminer la quantité en
risédronate dans les solutions d'adsorption ; elle est également mise à profit pour
estimer les teneurs de risédronate contenues dans les sels de risédronate de calcium
précipités, et après dissolution en milieu acide nitrique.
Les molécules de risédronate présentent un maximum d'absorption (λmax) du
rayonnement UV à 262 nm. Cette longueur d'onde correspond aux groupements
pyridine de la molécule d'adsorbat. La concentration du risédronate a été déterminée
en utilisant la loi de Beer-Lambert:

233
 A=ε.C.l
A: absorbance,
ε: coefficient d'extinction molaire (cm²/mol),
l: distance (cm) parcourue par le faisceau lumineux dans l'échantillon,
C: concentration de l'adsorbat (mol/l)
Une courbe d'étalonnage a été établie, pour chaque cas étudié, après dissolution
du sel monosodique du risédronate dans un milieu correspondant à l'adsorption et
couvrant la gamme de 0 à 0,3 mM. Le coefficient d’extinction molaire du risédronate
(ε) déterminé à partir de l’ensemble des droites obtenues est de (3,77 ± 0,01).103
L.mol-1.cm-1. Il est proche de 3,90x103 L.mol-1.cm-1, valeur rapportée dans la littérature
(Vallano et al., 2003).
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I-4- Diagramme de spéciation du risédronate

Pour la réalisation du diagramme de spéciation (fraction des espèces ioniques
en fonction du pH) nous avons tenu en compte les différents équilibres de dissociation
du risédronate en solution et des constantes d'acidité correspondantes (pKa) à 37°C:
⎛ (H O + )(H H BP) ⎞
+ + ⎜ 3 3 p ⎟
H4HpBP + H2O ⇔ H3HpBP + H3O pKa1 = − log⎜ ⎟ = 1,6
⎜ (H 4H p BP + ) ⎟
⎝ ⎠
⎛ (H O + )(H H BP − ) ⎞
- + ⎜ 3 2 p ⎟
H3HpBP + H2O ⇔ H2HpBP + H3O pKa 2 = − log⎜ ⎟ = 2,77
⎜ (H3H p BP) ⎟
⎝ ⎠
⎛ + 2− ⎞
- 2- + ⎜ (H3O )(H 2 BP ) ⎟
H2HpBP + H2O ⇔ H2BP + H3O pKa 3 = − log⎜ ⎟ = 5,25
⎜ (H 2 H p BP − ) ⎟
⎝ ⎠
⎛ (H O + )(HBP3− ) ⎞
H2BP2- + H2O ⇔ HBP3- + H3O+ pKa 4 = − log⎜ 3 ⎟ = 6,79
⎜ 2
(H 2 BP )− ⎟
⎝ ⎠
⎛ ( H O + )(BP 4− ) ⎞
3-
HBP + H2O ⇔ BP + H3O 4- +
pKa 5 = − log⎜ 3 ⎟ = 10,45
⎜ (HBP )3− ⎟
⎝ ⎠
La méthode consiste à exprimer les différentes fractions des espèces ioniques
du risédronate en fonction des constantes d'acidité (Kai) et des concentrations en ions

234
 hydronium (H3O+). Pour cela, l'équation de la conservation de masse doit être prise en
compte pour résoudre le système :
(BP) total = (BP4-) + (HBP3-) + (H2BP2-) + (H2HpBP-) + (H3HpBP) + (H4HpBP+)
Ainsi le pourcentage des espèces ioniques du risédronate peut être exprimé de la façon
suivante après résolution du système:
100 100 100
%( BP 4 − ) = ; %( HBP 3− ) = . ; %( H 2 BP 2 − ) = ;
A1 A2 A3
100 100 100
%( H 2 H p BP − ) = ; %( H 3 H p BP) = ; %( H 4 H p BP + ) =
A4 A5 A6

Avec
( H 3O + ) ( H 3O + ) 2 ( H 3O + )3 ( H 3O + ) 4 ( H 3O + )5
A1 = 1 + + + + +
Ka5 Ka4 Ka5 Ka3 Ka4 Ka5 Ka2 Ka3 Ka4 Ka5 Ka1Ka2 Ka3 Ka4 Ka5
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Ka5 ( H 3O + ) ( H 3O + ) 2 ( H 3O + )3 ( H 3O + ) 4
A2 = 1 + + + + +
( H 3O + ) Ka4 Ka3 Ka4 Ka2 Ka3 Ka4 Ka1Ka2 Ka3 Ka4

Ka4 Ka5 Ka4 ( H 3O + ) ( H 3O + ) 2 ( H 3O + )3

A3 = 1 + + + + +
( H 3O + ) 2 ( H 3O + ) Ka3 Ka2 Ka3 Ka1Ka2 Ka3

Ka3 Ka4 Ka5 Ka3 Ka4 Ka3 ( H 3O + ) ( H 3O + ) 2

A4 = 1 + + + + +
( H 3O + )3 ( H 3O + ) 2 ( H 3O + ) Ka2 Ka1Ka2

Ka2 Ka3 Ka4 Ka5 Ka2 Ka3 Ka4 Ka2 Ka3 Ka2 ( H 3O + )
A5 = 1 + + + + +
( H 3O + ) 4 ( H 3O + )3 ( H 3O + ) 2 ( H 3O + ) Ka1
Ka1Ka2 Ka3 Ka4 Ka5 Ka1Ka2 Ka3 Ka4 Ka1Ka2 Ka3 Ka1Ka2 Ka1
A6 = 1 + + 5
+ + 4
+ + 3
+ + 2
+
( H 3O ) ( H 3O ) ( H 3O ) ( H 3O ) ( H 3O + )

II- Diagrammes des rayons X (DRX)

Les diagrammes de diffraction des rayon X ont été obtenues à l'aide d'un
difractomètre à compteur courbe CPS 120 INEL couplé à une interface et à un
ordinateur, utilisant le rayonnement Kα1 émis par une anticathode au coblat (λ=
1,78892 Å).
Les dimensions apparentes des cristallites ont été déterminées à l'aide à la formule de
Sherrer (1918) en utilisant les raies (002) et (310).
0,94λ
L( hkl ) =
cosθ Δ2r − Δ2o

Avec:
0,94: Constante de Sherrer

235
 L: Taille des cristallites en Angstrom (Å)
λ: Longueur d'onde (1,78892 Å)
θ: Angle de diffraction correspondant à la raie hkl considérée
Δr: Largeur d'une raie de diffraction de l'échantillon
Δo: Largeur de la même raie de diffraction d'une hydroxyapatite calcinée à 900°C.
Elle vaut 0,00128 rd pour la raie (002).
L’erreur absolue sur les dimensions des cristallites est estimée à environ 5 Å.
III- Spectroscopie infrarouge à transformée de Fourrier (FTIR)
L'analyse par spectroscopie d'adsorption infrarouge a été réalisée dans
l'intervalle 400-4000 cm-1 à l'aide d'un spectromètre Nicolet 5700 sur des pastilles
transparentes. Ces dernières ont été obtenues en dispersant 1 mg de produit dans 300
mg de bromure de potassium KBr (Prolabo, pour spectroscopie IR). Le mélange a été
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ensuite compacté sous vide (∼1 torr) en appliquant une pression de 14 tonnes.cm-2.
L'avantage de cette technique repose sur l'utilisation de procédés de transformé
de fourrier qui permet l'arrivée au détecteur de tous les éléments spectraux transmis
par l'échantillon. Ceux-ci doivent être traités un par un dans les systèmes dispersifs. Il
en résulte une grande rapidité d'acquisition des données et une amélioration du rapport
(Signal/Bruit) par unité de temps. Ainsi les signaux peuvent être traités
mathématiquement (déconvolution, interpolation, décomposition, dérivés…).
III-1- Décomposition
La décomposition (ou curve fitting) permet de reconstituer le massif original en
retrouvant ses différentes composantes ; c'est une technique qui peut permettre en
principe une qualification des spectres. Dans notre étude, la décomposition a été
réalisée à l'aide d'un logiciel de décomposition des bandes IR (Galactics Gram 32).
Ces décompositions ont été réalisées en considérant une forme lorenzienne des bandes
infrarouge. La position des bandes a été déterminée d'après les différentes études
effectuées dans ce domaine.
VI- Spectroscopie de diffusion RAMAN
La spectroscopie Raman est une technique complémentaire à l'infrarouge. La
nature différente des deux processus d'interaction à l'origine de l'effet Raman et de
l'infrarouge (absorption, réflexion ou émission) fait que certaines vibrations seront
seulement actives en infrarouge et d'autres seulement actives en Raman (règle
d'exclusion mutuelle), alors que d'autres le seront pour les deux ou pour aucune.

236
 La spectroscopie Raman fournit en effet des informations de natures différentes.
Elle permet de caractériser aussi bien l’ordre structural (à courte, moyenne ou grande
distance) ainsi que le type de liaison d’un composé et sa structure cristalline. Il s’agit
de la méthode spectroscopique dotée de la meilleure résolution (un micron) pour
l’identification et la caractérisation de composés ou de phases. Sa capacité à identifier
les systèmes amorphes est également inégalée.
En spectrométrie Raman, l’analyse se fait par excitation du matériau. Porté à un
niveau énergétique virtuel par une puissante source lumineuse monochromatique de
type laser, le matériau réémet ensuite une radiation qui est collectée puis analysée par
un détecteur adéquat. Cette radiation comporte deux types de signaux. Le premier très
majoritaire correspond à la diffusion Rayleigh : la radiation incidente étant diffusée
élastiquement sans changement d’énergie. Le second correspond à des photons en
nombre très limité pouvant interagir avec la matière. Celle-ci absorbe (ou cède) de
l’énergie aux photons incidents produisant ainsi les radiations Stokes (ou anti-Stokes).
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La variation d’énergie observée sur le photon nous renseigne alors sur les niveaux
énergétiques de rotation et de vibration de la molécule concernée.
L’acquisition des spectres Raman a été réalisée à l’aide d’un spectromètre de
type Jobin Yvon LabRam HR, équipé d’un objectif de 100X. Le spot à la surface de
l’échantillon est focalisé sur un diamètre d'environ 2 µm, ce qui améliore le pouvoir de
résolution. La source laser (Hélium/Néon) utilisée est à 632,8 nm.
V- Résonance Magnétique Nucléaire
V-1- RMN de l'état solide
La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) de l'état solide est un moyen
d'investigation particulièrement puissant pour déterminer l'environnement local des
atomes dotés d'un moment magnétique nucléaire. Dans le cas des apatites, les noyaux
les plus observés sont ceux de l’hydrogène (1H), du carbone (13C), du fluor (19F) et du
phosphore (31P). Tous ces noyaux sont dotés d'un moment cinétique de spin demi-
entier (I = ½).
Nous nous sommes intéressés dans le cadre de ce travail uniquement à la RMN
du proton (1H) et du phosphore (31P). Toutes les mesures ont été réalisées sur un
spectromètre Bruker ASX 500 opérant dans un champ magnétique de 11,7 T (Teslas).
Les fréquences de résonance du 1H et du 31P correspondant à cette valeur du champ
sont de 500,13 et 202,47 MHz. Une rotation à l'angle magique (MAS) a été effectuée
pour tous les échantillons. Il est à noter que le MAS permet de moyenner à zéro
l'anisotropie de déplacement chimique, ce qui donne lieu à une haute résolution. Les
expériences de polarisation croisée (CP) 1H→31P ont été réalisées à un temps de

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 contact de 5 ms. Cette technique est utilisée pour distinguer les groupements
phosphore proche des protons, et plus particulièrement les ions hydrogénophosphate
(HPO42-).
Les déplacements chimiques du proton et du phosphore ont été étalonnés avec
un mélange de tétraméthyl silane (TMS) et d'acide phosphorique (85 %). Les
échantillons sont placés dans un rotor de zirconium tournant à vitesse comprise entre
12 et 14 kHz.
V-2- RMN en solution
Nous avons utilisé le Bruker Spectrospin DPX de 200 MHz équipé d’une sonde
QNP de 5 mm pouvant réaliser des spectres proton carbone, phosphore et fluor. Pour
cela un volume de solution d’adsorption (100 µl) a été ajouté à 0,4 ml d'une solution
de KCl (1 mM) puis introduit dans un tube à RMN. Les spectres RMN 31P ont été
réalisés en utilisant comme étalon interne une solution di-hydrogénophosphate de
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

sodium (NaH2PO4) à 2 %.
VI- Mesure de Surface spécifique
La surface spécifique des poudres lyophilisées a été mesurée par la méthode de
Brunauer-Emmet-Teller (BET) multipoint avec un appareil Quantachrome Nova 1000.
Cette méthode est basée sur l’adsorption et la désorption d’azote ultra pur. Avant
d’effectuer les mesures, nous avons procédé au dégazage (au moins 12 h) à
température ambiante pour les apatites nanocristallines et à environ 100°C pour
l'apatite bien cristallisée. Les tests expérimentaux ont été effectués en plusieurs points
afin d’obtenir des résultats précis. L’appareil donne la valeur de la surface mesurée ; la
surface spécifique de l’échantillon est ensuite calculée d’après l’équation suivante :
Surface spécifique (m²/g) = surface mesurée (m²) / masse de l’échantillon
introduite pesée (g)
L’erreur relative sur la mesure est de l'ordre de 5%.
VII- Microscopie Electronique
VII-1- Microscopie Electronique à Transmission
La microscopie électronique à transmission (MET) est un outil de
caractérisation des matériaux solides à l’échelle (sub-)nanométrique. Le MET offre la
possibilité de réaliser des images de hautes résolution et de recueillir des diagrammes
de diffraction pour des petits grains ou cristaux.
Pour notre travail, les cristaux sont dispersés dans une solution d’éthanol dans
un bain à ultrasons. Une goutte de cette suspension est ensuite déposée sur une grille
de cuivre surmontée d’un film de colodium contenant du carbone pour rendre les

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 échantillons conducteurs. L’appareil utilisé est un Jeol Jem 2100F. La tension
d’accélération des électrons appliquée est comprise entre 480 et 3200 kV.

VII-2- Microscopie Electronique à Balayage

La microscopie électronique à balayage (MEB) est un outil de caractérisation en
haute résolution de la surface d’objets dont la taille est comprise entre une dizaine de
nanomètres et quelques millimètres. Son principe repose principalement sur la
détection d'électrons rétrodiffusés par l'échantillon.
Une faible quantité de poudre est déposée sur une bande de scotch double face
collée sur un porte-échantillon en aluminium. Les échantillons sont ensuite métallisés
à l’argent afin d'éviter le phénomène de charge de surface dû au faisceau d'électrons.
L'ensemble est placé dans un microscope Leo 435 VP monté avec un détecteur à
scintillation (détection des électrons secondaires).
tel-00667418, version 1 - 7 Feb 2012

VIII- Analyse Thermique Gravimétrique (ATG) et Différentielle (ATD)

Les analyses thermogravimétriques en température croissante ont été réalisées à
l'aide d'une thermobalance SETSYS Evolution couplant l’ATG et l’ATD.
L’échantillon ((environ 30,00 ± 0,01 mg) est placé dans une nacelle en platine.
Les analyses thermiques sont enregistrées entre 20 et 1000 °C, sous air, avec une
vitesse de montée en température de 3°C.min-1.
IX- Conductimétrie
Les mesures sont effectuées à l'aide d'un conductimètre digital de type LF
340/SET disposant d'une cellule de mesure de conductivité de type Tetracon 325. Ce
conductimètre dispose de quatre gammes de sensibilité permettant des mesures entre
0 et 200 ms.cm-1 avec une précision de 0,05 % du maximum de la gamme utilisée
(gammes disponibles : 200 μS , 2000 μS , 200 mS et 2000 mS).
Les mesures ont été effectuées à 37°C avec un bain thermostaté, muni d’un
agitateur magnétique non chauffant. Le suivi du pH du milieu est réalisé à l'aide d'un
pH mètre digital disposant d'une électrode de mesure de type Sentix-4. L'ajout
(manuellement ou par débit pré-difini) des solution titrantes (nitrates de calcium) a été
effectué via une microburette automatique de type schott T80/20 possédant une
télécommande. La précision d'un ajout est de l’ordre de 1 μl.

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