Méthodes Spectrales SM M1 BC .

Dr. BOUCHEKRIT M.
Spectrométrie
4. Spectrométrie de masse
Généralité
Les molécules biologiques sont composées essentiellement de carbone C, hydrogène H,

oxygène O, azote N, phosphore P, et souffre S. A chacun de ces atomes correspond une masse
atomique. Connaissant la formule brute d’une molécule, on peut donc calculer une masse
chimique.
La spectrométrie de masse est une technique d'analyse physico-chimique permettant de

détecter, d'identifier et de quantifier des molécules d’intérêt par mesure de leur masse. Son
principe réside dans la séparation en phase gazeuse de molécules chargées (ions) en fonction
de leur rapport masse/charge (m/z). De plus, la spectrométrie de masse permet de caractériser
la structure chimique des molécules en les fragmentant.
La spectrométrie de masse peut apporter donc les informations suivantes :
 La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire.

 Les pics de fragmentation permettent de reconstituer une partie de la structure.
 L’intensité des pics permet de faire de l’analyse quantitative.
4.1. Appareillage
Un spectromètre de masse mesure la masse de molécules isolées ionisées. Pour cela, le

spectromètre de masse doit assurer les opérations suivantes:
 Volatiliser : séparer les molécules les unes des autres dont on passe de l’état de
matière condensée à un état gazeux.
 Ioniser : transformer les molécules en ions, car un spectromètre de masse fonctionne grâce
à des champs électriques.
Dr. BOUCHEKRIT M. Spectrométrie
 Mesurer les rapports m/z : la masse moléculaire est calculée à partir du rapport masse
(m)/nb de charges (z).
Un spectromètre de masse est donc constitué de :
4.1.1. Système d’introduction de l’échantillon
Les échantillons peuvent être introduits de deux manières :
 directement dans la source d’ionisation : sous forme gazeuse, liquide (infusion), ou solide;
 par l’association à une méthode séparative : électrophorèse capillaire, chromatographie
en phase gazeuse ou liquide.
Le système d’introduction de l’échantillon dépend de sa nature :
 Gaz et liquides volatils : à partir d’un ballon chauffé mis en communication avec
source.
 Solides : tube avec filament et l’échantillon dissous dans un solvant organique et
chauffé pour être vaporisé.
4.1.2. Source d’ions
Il existe de nombreux types de sources d’ions et chacun de ces types de sources repose
sur un principe physique différent.
Le principe physique qui permet de volatiliser et d’ioniser un type de composé est choisi par
l’opérateur en fonction des caractéristiques de la molécule à analyser.
Les étapes de volatilisation et d’ionisation se font successivement ou simultanément selon

le type de source.
Les critères de choix principaux sont:
 la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser ;

 sa labilité chimique ;
 les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation ;

 la taille des molécules ;
 les quantités de produit disponibles ;
 et le type d’introduction souhaitée (directe ou en couplage chromatographique).
Les sources d’ions se classent en sources dures et en sources douces :
4.1.2.1. Sources dures
Les ionisations dures génèrent souvent des ions moléculaires, à nombre impair d’électrons,
qui se fragmentent beaucoup et parfois même totalement avant d’avoir eu le temps de sortir de
la source. Lorsque leur durée de vie est assez longue pour qu’il sortent de la source intacts,
mais qu’ils se décomposent avant d’avoir complètement traversé l’analyseur et d’arriver
au détecteur, on les appelle ions métastables. Leurs fragments peuvent être analysés et
donnent des informations de structures.
Cette source peut apporter les informations suivantes :
 La masse moléculaire d’un composé.

 La masse des fragments de ce composé.
 mesure de la quantité.
Exemple : la source de plasma induit couplé (Induced Coupled Plasmas : ICP-MS) (Très dure)
La source à impact électronique (EI) (Dure)
Nombre
d’ions Fragments
Pic moléculaire
m/z
4.1.2.2. Sources douces
Les ionisations douces génèrent des ions moléculaires à nombre pair d’électrons, qui sont
relativement stables et qui ont des durées de vie suffisantes pour traverser l’analyseur,
arriver jusqu’au détecteur, et donc être mesurés.
Cette source peut apporter les informations suivantes :

 La masse moléculaire d’un composé.

 Pas de fragmentation.
 Une mesure de la quantité.
Exemple : La source à ionisation chimique (CI) (Assez douce)
L’ionisation laser assistée par matrice (MALDI) : Utilisées en protéomique (Douce)
Nombre
d’ions
Pic moléculaire
m/z
4.1.3. Analyseur
Il existe différents types d’analyseurs. Ils sont tous basés sur des principes physiques différents,
mais tous les analyseurs mesurent des valeurs m/z. C’est une partie de l’appareil où règne un
vide suffisant pour que le libre parcours moyen des ions soit supérieur à la distance à parcourir
dans l’appareil pour atteindre le détecteur.
B: Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus ancien)
Q: Déflexion par un champ quadrupolaire
IT: Confinement dans un piège à ion (Ion Trap)
TOF: Mesure d’un temps de vol (Time Of Flight)
FT-ICR: Résonnance Cyclotronique d’Ions à Transformée de Fourrier
Les ions formés dans la source sont dirigés (extraction et focalisation) vers l’analyseur
par des champs électrostatiques qui peuvent être de quelques volts (Q, IT, FT-ICR) ou
de plusieurs dizaines de kilovolts (TOF, B). La vitesse de déplacement des ions dans l’analyseur
dépend de l’intensité du champ d’extraction.
Les caractéristiques principales d'un analyseur sont :
 La résolution R.
 La gamme m/z qu'il peut analyser.

 La rapidité de balayage en m/z.
 La sensibilité.
 La vitesse avec laquelle les ions le traversent.
Souvent, avec un même analyseur, on peut augmenter l'une de ces caractéristiques aux
dépends des autres, mais seulement dans certaines limites.
Analyseurs Résolution Gamme m/z
Quadripôle (Q) 2 000 8 000
Trappe ionique (IT) 5 000 6 000
Magnétique (EB) 20 000 20 000
Temps de vol (TOF) 20 000 500 000
Cyclotron à résonance des ions (FT-ICR) 1 000 000 4 000
4.1.4. Détecteur
Le faisceau d’ions ayant traversé l’analyseur de masse, doit être détecté et transformé en un
signal électrique utilisable. Plus les ions sont nombreux, plus le courant est important. De plus,
le détecteur amplifie le signal obtenu pour qu’il puisse être traité informatiquement. Cette
détection fait appel à la charge, à la masse et à la vitesse des ions. Il existe différents types de
détecteurs capables de transformer un courant ionique faible en un signal mesurable.
La plaque photographique et le cylindre de Faraday permettaient une mesure directe des charges
arrivant au détecteur, tandis que les détecteurs multiplicateurs d’électrons ou de photons
permettent l’amplification de l’intensité du signal détecté. Les détecteurs à induction et les
détecteurs cryogéniques sont actuellement en cours de développement. Ils sont basés sur des
principes physiques différents de ceux utilisés pour les détecteurs communément utilisés et
présentent une efficacité indépendante de la masse et de la vitesse des ions détectés.
4.1.5. Système de traitement des données
Les spectromètres de masse sont pilotés par un ordinateur. Les opérations assurées par ce
système sont :
 Réglage et calibrage du spectromètre.

 Acquisition et stockage des données.

 Traitement des données et recherche dans les banques de spectres.
4.2. Applications
La spectrométrie de masse présente un spectre très vaste d'applications, qui s'étend de la

recherche fondamentale au contrôle des processus industriels. On s’intéresse aux applications
aux peptides, aux protéines et au protéome.
4.2.1. Caractérisation physico-chimique par la masse globale
4.2.1.1. Contrôle de l’intégrité de protéine
Exemple : TorA (95 kDa) est une protéine périplasmique d’Escherichia coli. TorD (22 kDa)
est la chaperone stricte de TorA. On mesure la masse de TorA produite par deux souches de
bactéries E. Coli.
En absence de sa protéine chaperone, TorA subit une dégradation, perte de 2875 Da
4.2.1.2. Interactions protéine-ligand
Exemple : AFEST est une carboxylester hydrolase de l’Archaeoglobus fulgidus. Le composé

7600 (284 Da) est un puissant inhibiteur de plusieurs sérine carboxylester hydrolases.
4.2.1.3. Modifications post-traductionnelles
Tout incrément de masse ∆m (modification chimique ou mutation d’AA) peut être mesuré par
spectrométrie de masse.
4.2.1.4. Interactions protéine-protéine: oligomérisation /stoechiométrie

4.2.2. Identification de protéines (protéomique descriptive)
Protéome : ensemble des protéines exprimées par le génome ou par un type cellulaire ou une
cellule.
Protéomique descriptive : identification et caractérisation des protéines d’une cellule dans un

environnement donné.
L’analyse "rapide" et à grande échelle des protéomes est devenue possible grâce à: la
connaissance des Génomes, méthodes de séparation des protéines, la spectrométrie de masse et
la bioinformatique.
Identifier une protéine, connaissant son origine (génome), revient à lui attribuer une séquence
en acides aminés.
4.2.3. Quantification de protéines (protéomique quantitative)

Elle vise à comparer et quantifier des variations d’expression de protéines dans des situations
biologiques variées : conditions de contrôle vs conditions de stress, pathologiques, avec stimuli
chimiques…
4.2.3.1. Quantification relative après marquage
4.2.3.2. Quantification absolue


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Les molécules biologiques sont composées essentiellement de carbone C, hydrogène H,

La spectrométrie de masse est une technique d'analyse physico-chimique permettant de

La spectrométrie de masse peut apporter donc les informations suivantes :

 La valeur m/z du pic moléculaire permet de calculer la masse moléculaire.

Un spectromètre de masse mesure la masse de molécules isolées ionisées. Pour cela, le

Un spectromètre de masse est donc constitué de :

4.1.1. Système d’introduction de l’échantillon

Les échantillons peuvent être introduits de deux manières :

Le système d’introduction de l’échantillon dépend de sa nature :

4.1.2. Source d’ions

Les étapes de volatilisation et d’ionisation se font successivement ou simultanément selon

Les critères de choix principaux sont:

 la volatilité et la stabilité thermique du composé à analyser ;

 les fonctions chimiques présentes et leur aptitude à induire une ionisation ;

Les sources d’ions se classent en sources dures et en sources douces :

4.1.2.1. Sources dures

Cette source peut apporter les informations suivantes :

 La masse moléculaire d’un composé.

La source à impact électronique (EI) (Dure)

4.1.2.2. Sources douces

Cette source peut apporter les informations suivantes :

 La masse moléculaire d’un composé.

Exemple : La source à ionisation chimique (CI) (Assez douce)

L’ionisation laser assistée par matrice (MALDI) : Utilisées en protéomique (Douce)

B: Déflexion par un champ magnétique (c'est l'analyseur le plus ancien)

Q: Déflexion par un champ quadrupolaire

IT: Confinement dans un piège à ion (Ion Trap)

TOF: Mesure d’un temps de vol (Time Of Flight)

FT-ICR: Résonnance Cyclotronique d’Ions à Transformée de Fourrier

Les caractéristiques principales d'un analyseur sont :

 La gamme m/z qu'il peut analyser.

Analyseurs Résolution Gamme m/z

Quadripôle (Q) 2 000 8 000

Trappe ionique (IT) 5 000 6 000

Magnétique (EB) 20 000 20 000

Temps de vol (TOF) 20 000 500 000

Cyclotron à résonance des ions (FT-ICR) 1 000 000 4 000

4.1.5. Système de traitement des données

 Réglage et calibrage du spectromètre.

 Acquisition et stockage des données.

La spectrométrie de masse présente un spectre très vaste d'applications, qui s'étend de la

4.2.1. Caractérisation physico-chimique par la masse globale

4.2.1.1. Contrôle de l’intégrité de protéine

En absence de sa protéine chaperone, TorA subit une dégradation, perte de 2875 Da

4.2.1.2. Interactions protéine-ligand

Exemple : AFEST est une carboxylester hydrolase de l’Archaeoglobus fulgidus. Le composé

4.2.1.3. Modifications post-traductionnelles

4.2.1.4. Interactions protéine-protéine: oligomérisation /stoechiométrie

4.2.2. Identification de protéines (protéomique descriptive)

Protéomique descriptive : identification et caractérisation des protéines d’une cellule dans un

4.2.3. Quantification de protéines (protéomique quantitative)

4.2.3.1. Quantification relative après marquage

4.2.3.2. Quantification absolue

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