FT 6 Dénombrement Coliformes BLBVB

Mme Abdellaziz épouse Zemmal Akila : M.A.A. FSB/USTHB.
FICHE TECHNIQUE N°6 : Dénombrement des coliformes sur milieu
liquide (BLBVB) par la technique du NPP.
BLBVB : Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant.
Utilisation : Milieu sélectif pour le dénombrement des coliformes totaux et fécaux dans
l’eau et les produits alimentaires.
Composition : Pour 1 litre de milieu :
o Tryptone.................................................................................................. 10,0 g
o Bile de bœuf bactériologique (agent sélectif).................................... 20,0 g
o Vert brillant (agent sélectif)............................................................... 13,3 mg
o Lactose.................................................................................................... 10,0 g
o pH du milieu prêt-à-l ’emploi à 25 °C : 7,2 ± 0,2.
Principe : La présence simultanée de deux agents sélectifs (la bile de boeuf et le

vert brillant) assure l’inhibition des bactéries Gram positif et sélectionne les bactéries
Gram négatif les coliformes. La fermentation du lactose avec production de gaz se
manifeste par une turbidité et la présence de gaz dans la cloche de Durham. Le test
se réalise en deux étapes : le test présomptif pour le dénombrement des coliformes
totaux suivi par le test confirmatif pour le dénombrement des coliformes fécaux ou
thermo tolérants (E. coli).
Technique : voir schéma
 Test présomptif :
1) Préparation des dilutions décimales : voir fiche technique 1.
2) Ensemencement :
 Transférer 1 ml de la solution mère et de ses dilutions dans un tube
contenant 10 ml du milieu BLBVB avec cloche de Durham.
 Bien homogénéiser le tube et s’assurer que la solution est bien répartie y
compris sous la cloche.
 Evacuer les bulles d’air de la cloche pour éviter d’avoir de faux négatifs.
 Pour chaque dilution une répétition de 2, 3, 4 ou 5 tubes est effectuée.
1
3) Incubation : les tubes sont incubés pendant 24 – 48 h à 30 – 37 °C.

4) Lecture : un test positif se manifeste par un trouble ET la production de gaz
visible grâce à la présence d’air sous la cloche de Durham.
5) Dénombrement : le dénombrement se fait par la technique du nombre le plus
probable (NPP) :
 Annoter tous les tubes positifs par (+). Pour chaque dilution, affecter un
chiffre égal à la somme des tubes positifs.
 Déterminer le nombre caractéristique : Pour une répétition de trois tubes,
choisir le plus grand nombre inférieur à 330, pour une répétition de quatre
tubes choisir le plus grand nombre inférieur à 440………
 Déterminer le nombre le plus probable (npp) correspondant au nombre
caractéristique par lecture directe sur la table de Mac Grady.
 En déduire la concentration en coliformes : N = npp x 1/V x 1/D. le résultat
est exprimé en nombre de coliformes totaux/ml (ou gr).
N : le nombre de coliformes totaux. npp : nombre le plus probable. V : le volume ensemencé. D : la plus grande
dilution de la série choisie pour le nombre caractéristique.
 Test confirmatif :
1) A partir de chaque tube positif, ensemencer deux tubes : un tube contenant
du BLBVB ET un tube contenant de l’eau peptonée exempte d’indole.
2) Incubation : les tubes sont incubés pendant 24 – 48 h à 44 °C.
3) Lecture : un test positif se manifeste par le trouble et la production de gaz au
niveau du tube de BLBVB ET l’apparition de l’anneau rouge après l’ajout du
réactif de Kovacs au niveau du tube contenant l’eau peptonée exempte
d’indole.
4) Dénombrement : le dénombrement se fait comme précédemment par la
technique du nombre le plus probable.
5) Le résultat est exprimé en nombre de coliformes fécaux ou
thermotolérants/ml (ou gr).
2
Test
présomptif
1 ml 1 ml 1 ml Préparation des
dilutions décimales
9 ml
Solution mère
Dilution Dilution Dilution Dilution
10 -1 10 -2 10 -3 10 -4
1 ml
Ensemencement
Incubation
24h 37 °C
+ + + + + + + + - + - - - - -
3 3 22 1 0
3 1
Nombre caractéristique = 321 : npp = 15.
N = 15 x 1/1 x 1/10-1 .
Test
N = 150 coliformes totaux/ml (ou gr).
confirmatif
Incubation
24h 44 °C
- + + - + -
Nombre caractéristique = 210 : npp = 1,5.
2 1 0 N = 1,5 x 1/1 x 1/10-1 .
N = 15 coliformes fécaux/ml (ou gr).

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Composition : Pour 1 litre de milieu :

Principe : La présence simultanée de deux agents sélectifs (la bile de boeuf et le

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3) Incubation : les tubes sont incubés pendant 24 – 48 h à 30 – 37 °C.

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