TH2010 Deredjian Amelie

Les métaux lourds dans les écosystèmes anthropisés :
une pression favorisant la sélection de pathogènes

opportunistes résistants à des antibiotiques ?
Amélie Deredjian
To cite this version:

Amélie Deredjian. Les métaux lourds dans les écosystèmes anthropisés : une pression favorisant la
sélection de pathogènes opportunistes résistants à des antibiotiques ?. Sciences agricoles. Université
Claude Bernard - Lyon I, 2010. Français. �NNT : 2010LYO10347�. �tel-00834182�
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abroad, or from public or private research centers. publics ou privés.
N° Ordre 347-2010 Année 2010
THESE DE L‘UNIVERSITE DE LYON
Présentée devant
L’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1
Ecole Doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie et Modélisation
DIPLOME DE DOCTORAT
(arrêté du 7 août 2006)
Soutenue publiquement le 17 Décembre 2010
par
Amélie DEREDJIAN
Les métaux lourds dans les écosystèmes anthropisés :

une pression favorisant la sélection de pathogènes opportunistes
résistants à des antibiotiques ?
JURY :
Mme VALLAEYS Tatiana, Professeur, Université Montpellier II Rapporteur

M. SORENSEN Soren J, Professor, University of Copenhagen Rapporteur
Mme DIJOUX-FRANCA Marie-Geneviève, Professeur, ISPB, Université de Lyon Président du Jury
M. SIMONET Pascal, Directeur de recherche, CNRS Examinateur
Mme NAZARET Sylvie, Chargée de recherche, CNRS Directrice de thèse
Mme FAVRE-BONTE Sabine, Maitre de conférences, Université de Lyon Co-directrice de thèse
-1-
-2-
UNIVERSITE CLAUDE BERNARD - LYON 1
Président de l’Université M. le Professeur L. Collet
Vice-président du Conseil Scientifique M. le Professeur J-F. Mornex
Vice-président du Conseil d’Administration M. le Professeur G. Annat
Vice-président du Conseil des Etudes et de la Vie M. le Professeur D. Simon

Universitaire M. G. Gay
Secrétaire Général
COMPOSANTES SANTE
Faculté de Médecine Lyon Est – Claude Bernard Directeur : M. le Professeur J. Etienne
Faculté de Médecine Lyon Sud – Charles Mérieux Directeur : M. le Professeur F-N. Gilly
UFR d’Odontologie Directeur : M. le Professeur D. Bourgeois
Institut des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques Directeur : M. le Professeur F. Locher
Institut des Sciences et Techniques de Réadaptation Directeur : M. le Professeur Y. Matillon
Département de Biologie Humaine Directeur : M. le Professeur P. Farge
COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE
Faculté des Sciences et Technologies Directeur : M. le Professeur F. Gieres

Département Biologie Directeur : M. le Professeur C. Gautier
Département Chimie Biochimie Directeur : Mme le Professeur H. Parrot
Département GEP Directeur : M. N. Siauve
Département Informatique Directeur : M. le Professeur S. Akkouche
Département Mathématiques Directeur : M. le Professeur A. Goldman
Département Mécanique Directeur : M. le Professeur H. Ben Hadid
Département Physique Directeur : Mme S. Fleck
Département Sciences de la Terre Directeur : M. le Professeur P. Hantzpergue
UFR Sciences et Techniques des Activités Physiques et Directeur : M. C. Collignon
Sportives
Directeur : M. B. Guiderdoni
Observatoire de Lyon
Directeur : M. le Professeur J. Lieto
Ecole Polytechnique Universitaire de Lyon 1
Directeur : M. le Professeur C. Coulet
Institut Universitaire de Technologie de Lyon 1
Directeur : M. le Professeur J-C. Augros
Institut de Science Financière et d'Assurance
Directeur : M R. Bernard
Institut Universitaire de Formation des Maîtres
-3-
-4-
REMERCIEMENTS
Je souhaite tout d’abord adresser mes remerciements aux membres du jury qui ont
accepté d’évaluer mon travail de thèse.
Je remercie René Bally pour son accueil au sein du Laboratoire d’Ecologie

Microbienne.
Je souhaite remercier Sylvie et Sabine pour m’avoir choisi pour ce sujet et guidé
pendant ces trois années, je les remercie pour leurs conseils, leur encadrement, les
discussions et pour les opportunités qu’elles m’ont données de présenter mon travail
dans plusieurs congrès. Je remercie plus particulièrement Sylvie de s’être rendue
disponible pour moi malgré un emploi du temps surchargé, en particulier ces
derniers mois.
Je remercie également tous nos partenaires de Dijon, Paris, Tunisie et du Burkina

Faso pour m’avoir permis de découvrir le terrain ou de bénéficier d’échantillons
d’origine si variées qui ont contribués à l’originalité de mon étude.
Un grand merci à toute l’équipe 6, chercheurs, techniciens, thésards, post-docs, qui

ont contribué au bon déroulement de ma thèse. Je remercie Benoit Cournoyer pour
son accueil dans l’équipe BPOE. Je remercie en particulier Céline pour nos
discussions toujours constructives (qu’elles concernent le travail ou non…) et nos
expéditions à Tours et en Suède, Manuelle pour sa présence, son soutien dans les
moments difficiles et son amitié, Nolwenn, Stéphanie et Ina pour leur bonne humeur
et leurs attentions, Claire pour sa gentillesse et sa disponibilité et Bruno pour son
humour.
Un énorme merci à Babeth, pour tout ce qu’elle m’a appris au niveau technique, pour
sa bonne humeur, ses chants, ses petites colères souvent associées à la dispersion de
petits mots…, un grand merci pour son amitié sans faille et son soutien.
Je remercie également les stagiaires qui ont participé à l’obtention des résultats
présentés dans ce manuscrit. Tout d’abord, Laurine pour sa participation aux travaux
sur Steno et aussi pour sa bonne humeur. Je remercie également Charlotte et
Charlyne pour leur contribution et surtout leur gentillesse et les fous rires qui ont
parfois résulté de petits soucis de manipulation (je pense particulièrement à une
pipette pas assez solide pour la force de Charlyne…).
Un grand merci à l’ensemble de l’UMR pour avoir partagé de près ou de loin ces
trois années de thèse.
Enfin, je remercie ma famille : mes mamées, Josette, Louis, Fred et Chris pour leur
présence et leurs encouragements et surtout mes parents qui ont toujours été là pour
moi et m’ont toujours soutenu, je vous aime fort.
-5-
-6-
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION GENERALE...............................................................................................3
GENERAL INTRODUCTION (ENGLISH VERSION) ...........................................................11
PARTIE I : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ...........................................................................19

Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia : complémentarité des deux
modèles de bactéries pathogènes opportunistes ..........................................................................19
I- Ecologie des modèles ....................................................................................................................23

I-1- Bactéries environnementales ubiquistes..................................................................................23
I-1-a- Présence dans les milieux terrestres et aquatiques............................................................24
Distribution de P. aeruginosa dans les environnements naturels ...................................24
Distribution de S. maltophilia dans les environnements naturels ...................................25
I-1-b- Présence dans les milieux pollués et capacité de bioremédiation......................................26
Les eaux usées .............................................................................................................26
Les environnements contaminés en métaux lourds........................................................27
Les environnements contaminés en hydrocarbures........................................................28
Les environnements présentant d’autres types de contaminations .................................29
I-1-c- Présence dans les environnements hospitaliers ................................................................30
I-2- Interactions avec d’autres organismes.....................................................................................32
I-2-a- Interactions avec les plantes ............................................................................................32
I-2-b- Interactions avec les animaux .........................................................................................36
I-2-c- Interactions avec l’Homme .............................................................................................38
Portage ........................................................................................................................38
Infections causées par P. aeruginosa et S. maltophilia..................................................39
P. aeruginosa et S. maltophilia chez les personnes atteintes de mucoviscidose .............43
II- Génome et structure génétique des populations de P. aeruginosa et S. maltophilia........................44
II-1- Structure génétique des populations ......................................................................................45
II-2- Le génome de P. aeruginosa et S. maltophilia.......................................................................48
II-2-a- Structures des génomes..................................................................................................50
II-2-b- Composition des génomes cœur et accessoire ................................................................53
III- Mécanismes impliqués dans la réussite de l’interaction avec l’hôte et l’environnement : Virulence
et Résistances ...................................................................................................................................58
III-1- Le pouvoir pathogène ..........................................................................................................58
III-1-a- Facteurs de virulence....................................................................................................58
III-1-b- Formation de biofilm....................................................................................................61
III-1-c- Communication entre cellule et Quorum sensing ..........................................................64
III-2- Résistances..........................................................................................................................69
III-2-a- Résistance aux antibiotiques .........................................................................................69
Résistance due à la réduction de la perméabilité membranaire ......................................77
Résistance due à l’inactivation enzymatique de l’antibiotique.......................................80
Résistance due la modification de la cible....................................................................82
Résistance due à l’acquisition d’une nouvelle enzyme ..................................................83
Phénotype hypermutable des souches de P. aeruginosa ................................................83
III-2-b- Résistance aux métaux (ou éléments trace métalliques) ................................................84
III-2-c- Co-sélection de résistance aux antibiotiques et aux métaux ...........................................86
Conclusion........................................................................................................................................87
-i-
PARTIE II : PARTIE EXPERIMENTALE..........................................................................................89
PART II : EXPERIMENTAL PART ...................................................................................................89
Chapitre 1 : Distribution des modèles Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia dans

les sols, effets de l’anthropisation sur leur présence et leur abondance ...............................................91
Chapter 1: Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia distribution in soils, effects
of anthropization on their presence and abundance ............................................................................91
Introduction..................................................................................................................................92
Introduction (English version).......................................................................................................97
“Different occurrence of the opportunistic pathogens Pseudomonas aeruginosa and
Stenotrophomonas maltophilia in soils” ......................................................................................101
ABSTRACT...........................................................................................................................102
INTRODUCTION..................................................................................................................103
MATERIAL AND METHODS ..............................................................................................105
Agricultural and industrial soils from France ......................................................................105
Experimental sites with waste water irrigation ....................................................................105
Experimental sites with organic amendment .......................................................................107
Total bacterial counts .........................................................................................................109
Isolation and identification of P. aeruginosa.......................................................................109
Isolation and identification of S. maltophilia.......................................................................110
DNA extraction from soil samples and PCR amplification..................................................110
RESULTS ..............................................................................................................................111
Isolates identification and selectivity of the media ..............................................................111
Abundance of culturable P. aeruginosa and S. maltophilia in soil samples ..........................112
Prevalence of P. aeruginosa and S. maltophilia in irrigated soil ..........................................117
Prevalence of P. aeruginosa and S. maltophilia in soils amended with organic wastes ........117
Detection of P. aeruginosa and S. maltophilia in soil DNA extract .....................................121
DISCUSSION ........................................................................................................................122
Selectivity of the media ......................................................................................................122
Sporadic detection of P. aeruginosa in soil samples............................................................124
Widespread occurrence of S. maltophilia in soil and influence of agricultural practices on its
prevalence ..........................................................................................................................127
Concluding remarks ...........................................................................................................129
ACKNOWLEDGMENTS ......................................................................................................130
REFERENCES.......................................................................................................................130
Conclusions ................................................................................................................................139
Conclusions (English version).....................................................................................................141
Chapitre 2 : Evaluation des phénomènes de co-sélection de résistance aux métaux et aux antibiotiques
chez P. aeruginosa et S. maltophilia ...............................................................................................143
Chapter 2: Evaluation of heavy metal and antibiotic resistance co-selection in P. aeruginosa and S.
maltophilia .....................................................................................................................................143
Introduction................................................................................................................................145
Introduction (English version).....................................................................................................149
Partie 1 : Diversité de résistance aux métaux et aux antibiotiques chez P. aeruginosa et S.

maltophilia en fonction de l’origine des souches et des pressions de sélection .............................153
Part 1: Heavy metal and antibiotic resistance diversity in P. aeruginosa and S. maltophilia
depending on their origin and selective pressure..........................................................................153
“Antibiotic and heavy metal resistance among hospital and environmental strains of Pseudomonas
aeruginosa”................................................................................................................................155
ABSTRACT...........................................................................................................................155
INTRODUCTION..................................................................................................................157
MATERIALS AND METHODS ............................................................................................159
Strains................................................................................................................................159
- ii -
Antibiotic resistance test.....................................................................................................162
Heavy metal resistance profiles ..........................................................................................162
Data analysis ......................................................................................................................163
Heavy metal resistance gene amplification..........................................................................163
RESULTS ..............................................................................................................................165
Antibiotic resistance profiles ..............................................................................................165
Heavy metal resistance .......................................................................................................167
Strains similarity based on antibiotic and heavy metal resistance.........................................169
Presence of heavy metal resistance genes............................................................................169
DISCUSSION ........................................................................................................................171
REFERENCES.......................................................................................................................177
“High phenotypic and genetic diversity of antibiotic and metal susceptibilities among hospital and
environmental strains of Stenotrophomonas maltophilia”............................................................183
ABSTRACT...........................................................................................................................184
INTRODUCTION..................................................................................................................185
Strains................................................................................................................................187
Antibiotic resistance test.....................................................................................................187
Heavy metal resistance profiles ..........................................................................................190
Data analysis ......................................................................................................................190
Resistance genes amplification ...........................................................................................190
RESULTS ..............................................................................................................................191
Antibiotic resistance profile................................................................................................191
Heavy metal resistance .......................................................................................................194
Strains similarity based on antibiotic and heavy metal resistance.........................................196
Prevalence of resistance genes ............................................................................................196
DISCUSSION ........................................................................................................................199
REFERENCES.......................................................................................................................205
Conclusions ...............................................................................................................................211
Conclusion (English version) ....................................................................................................214
Partie 2 : Evaluation de la diversité du déterminant merA chez P. aeruginosa et S. maltophilia,

association avec les résistances aux antibitiotiques ......................................................................217
Part 2: merA genetic diversity in Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia and
relationship with antibiotic resistance..........................................................................................217
“merA genetic diversity in Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia and
relationship with antibiotic resistance” ........................................................................................219
ABSTRACT...........................................................................................................................220
INTRODUCTION..................................................................................................................221
MATERIALS AND METHODS ............................................................................................223
Strains................................................................................................................................223
Mercury resistance and antibiotic resistance tests................................................................223
PCR amplification ..............................................................................................................223
Plasmid profile and Southern hybridization ........................................................................225
Restriction profiles and sequencing ....................................................................................226
Phylogenetic analysis .........................................................................................................226
RESULTS ..............................................................................................................................226
merA gene restriction profiles and genomic localization......................................................226
merA gene sequence and phylogeny....................................................................................228
Detection of PAGI-2 sequences ..........................................................................................231
Relationship between merA profiles and resistance to antibiotics ........................................231
DISCUSSION ........................................................................................................................231
- iii -
REFERENCES.......................................................................................................................234
Conclusions ...............................................................................................................................239
Conclusions (English version) ..................................................................................................241
Chapter 3: Effect of metallic and organic contaminations on the selection and maintenance of
resistances in the indigenous microbial community of the site of Pierrelaye ..............................243
Introduction ..............................................................................................................................245
Introduction (English version) .................................................................................................246
“Detection of bacterial opportunistic pathogens among the antibiotic and heavy metal resistant
isolates from a chronically heavy metal contaminated soil” .........................................................247
ABSTRACT...........................................................................................................................248
INTRODUCTION..................................................................................................................249
Study site and sample collection .........................................................................................251
Enumeration and isolation of heterotrophic bacteria from soil samples................................252
Identification and antibiotic and heavy metal resistant phenotypes of resistant population ...252
Resistance genes amplification ...........................................................................................253
Cloning and sequencing amplified fragments......................................................................254
RESULTS ..............................................................................................................................254
Prevalence of antibiotic and mercury resistant bacteria in the total heterotrophic microflora254
Identification of resistant bacteria .......................................................................................257
Multi-resistant bacteria .......................................................................................................259
Presence of resistance genes ...............................................................................................260
DISCUSSION ........................................................................................................................260
REFERENCES.......................................................................................................................266
Conclusions ...............................................................................................................................271
Conclusions (English version) ..................................................................................................274
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .........................................................................................279

CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES (ENGLISH VERSION)................................................285
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................................................291
REFERENCES.............................................................................................................................. 291
ANNEXES .....................................................................................................................................315
- iv -
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Le résistome ...........................................................................................................4

Figure 2. Phénotype lié au résistome......................................................................................4
Figure 3. Rôle des pompes à efflux dans les environnements cliniques et non cliniques. ........6
Figure 4. Exemples de co-sélection de résistance. ..................................................................8
Figure 5. The antibiotic resistome. .......................................................................................12
Figure 6. Phenotype associated to the resistome. ..................................................................12
Figure 7. Role of efflux pumps in clinical and non clinical environments.............................13
Figure 8. Examples of resistance co-selection ......................................................................15
Figure 9. Phylogénie bactérienne. ........................................................................................22
Figure 10. Prévalence des infections bactériennes chez les patients atteints de mucoviscidose
en fonction de l’âge ..............................................................................................................42
Figure 11. Co-infections rapportées dans les poumons de patients CF..................................42
Figure 12. Comparaisons des génomes séquencés de P. aeruginosa.....................................51
Figure 13. Modèle schématique d’un ilot génomique bactérien ............................................52
Figure 14. Comparaison des génomes séquencés de S. maltophilia ......................................52
Figure 15. Les facteurs de virulence chez P. aeruginosa ......................................................59
Figure 16. Formation d’un biofilm chez P. aeruginosa. .......................................................62
Figure 17. Principe de l’expression du quorum sensing au cours de la croissance bactérienne.
.............................................................................................................................................65
Figure 18. L’architecture du biofilm formé par P. aeruginosa est influencée par les molécules
DSF (Diffusible Signal Factors) produites par S. maltophilia................................................68
Figure 19. La découverte des antibiotiques ..........................................................................70
Figure 20. Modes d’action des antibiotiques. .......................................................................72
Figure 21. Mécanismes de résistance aux antibiotiques. .......................................................73
Figure 22. Présentation des sites étudiés...............................................................................96
Figure 23. Studied sites in France, Burkina Faso and Tunisia.............................................106
Figure 24. S. maltophilia counts in soils of the Burgundy region (RMQS) (A) and percentage
in the total heterotrophic (B)...............................................................................................116
Figure 25. S. maltophilia counts in soils from the site of Pierrelaye (A) and percentage in the
total heterotrophic microflora (B). ......................................................................................118
Figure 26. S. maltophilia counts in soils and amendment from the site of Feucherolles (A, C,
E) and percentage of S. maltophilia in the total heterotrophic microflora (B, D, F), before
amendment (A, B) 1 month after amendments (C, D) and in the amendments (E, F)...........119
Figure 27. S. maltophilia counts in soils from the sites in Burkina Faso (A) and percentage in
the total heterotrophic microflora (B)..................................................................................120
Figure 28. Antibiotic multi-resistance in 76 environmental and 54 hospital strains of P.
aeruginosa (A), within environmental strain sub-groups (B) and hospital strain sub-groups
(C)......................................................................................................................................164
Figure 29. Antibiotic resistance profiles in environmental and hospital strains of P.
(C)......................................................................................................................................166
Figure 30. Heavy metal resistance in environmental and hospital strains of P. aeruginosa (A),
within environmental strain sub-groups (B) and strain hospital sub-groups (C)...................168
Figure 31. Dendrogram showing the relationships between P. aeruginosa strains based on
antibiotic and heavy metal resistance data...........................................................................170
Figure 32. Antibiotic multi-resistance in 52 environmental and 27 hospital strains of S.
maltophilia (A), within environmental and hospital strain sub-groups (B)...........................192
-v-
Figure 33. Antibiotic resistance profiles in 52 environmental and 27 hospital strains of S.
Figure 34. Heavy metal resistance in 52 environmental and 27 hospital strains of S.
Figure 35. Principal component analysis done with antibiotic and heavy metal resistance
phenotype. ..........................................................................................................................197
Figure 36. Prevalence of antibiotic (A) and heavy metal (B) resistance genes in S. maltophilia
strains.................................................................................................................................198
Figure 37. Positionning of merA determinants (profile) found among P. aeruginosa (Pa) and
S. maltophilia (Sm) in the phylogeny of the merA gene. .....................................................230
Figure 38. Numbers (colony forming unit g-1) of viable heterotrophic bacteria in soil
samples. .............................................................................................................................255
Figure 39. Numbers (colony forming unit g-1) of antibiotic (A) and Hg (C) heterotrophic
resistant bacteria in soil samples and proportion (%) of resistant bacteria in the total
heterotrophic microflora (B and D).....................................................................................256
Figure 40. Identification of selected resistant isolates.........................................................258
- vi -
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Source de P. aeruginosa et S. maltophilia dans l’environnement hospitalier (non

exhaustif)..............................................................................................................................31
Tableau 2. Infections causées par P. aeruginosa et S. maltophilia........................................40
Tableau 3. Caractéristiques générales des génomes séquencés de P. aeruginosa..................50
Tableau 4. Ilots génomiques de fonction connue présents chez S. maltophilia......................57
Tableau 5. Classification des antibiotiques par familles de molécules ..................................70
Tableau 6. Bilan des mécanismes de résistance aux antibiotiques chez P. aeruginosa..........74
Tableau 7. Bilan des mécanismes de résistance aux antibiotiques chez S. maltophilia..........75
Tableau 8. Substrats des pompes à efflux présentes chez P. aeruginosa...............................78
Tableau 9. Impact des mutations sur les gènes codant pour les pompes à efflux sur les
résistances aux antibiotiques chez P. aeruginosa ..................................................................78
Tableau 10. Mécanismes de résistances acquises chez P. aeruginosa...................................79
Table 1. Physicochemical characteristics of soils sampled from the control fields at different
sites en France, Tunisia and Burkina Faso……………………………………………….. 108
Table 2. Number of CFU (colony forming unit) of P. aeruginosa and S. maltophilia, in
agricultural and industrial soils sampled from various French regions.................................113
Table 3. Number of CFU (colony forming unit) of P. aeruginosa and S. maltophilia, in soils
exposed to irrigation with waste water in the French and Tunisian sites. .............................114
exposed to organic amendment in France, and Burkina Faso. .............................................115
Table 5. Strains of P. aeruginosa isolated from environment and hospital..........................160
Table 6. PCR primers used for screening heavy metal resistance genes. .............................163
Table 7. Mercury resistance phenotype and genotype.........................................................171
Table 8. Strains of S. maltophilia isolated from the hospital and the environment...............188
Table 9. Soil characteristics................................................................................................189
Table 10. Primers used in the study. ...................................................................................191
Table 11. Strains used in this study. ...................................................................................224
Table 12. List of primers. ...................................................................................................224
Table 13. Abundance (in percent) of the mercury resistance phenotype among P. aeruginosa
and S. maltophilia strains....................................................................................................227
Table 14. Abundance (in percent) of the merA-like gene among P. aeruginosa and S.
maltophilia strains and distribution of the various profiles depending on strain origin.........227
Table 15. Homology between the merA-like sequences detected among P. aeruginosa and S.
maltophilia strains and the merA sequences available in GenBank......................................229
Table 16. Screening of the PAGI-2 sequences among the P. aeruginosa and S. maltophilia
strains carrying merA-like sequence. ..................................................................................229
Table 17. Physicochemical characteristics of soil samples from the Pierrelaye-Bessancourt
plain. ..................................................................................................................................251
Table 18. Primers used in this study. ..................................................................................253
Table 19. Diversity of resistant bacteria. ............................................................................258
Table 20. Multi-resistance in the selected resistant isolates.................................................260
- vii -
- viii -
INTRODUCTION GENERALE
GENERAL INTRODUCTION
-1-
-2-
INTRODUCTION GENERALE
De nos jours, un nombre croissant d’espèces bactériennes connues pour leur distribution
ubiquiste dans l’environnement sont impliquées dans des infections nosocomiales (acquises à
l’hôpital) et intègre la liste des pathogènes opportunistes (Martinez & Baquero, 2002). Ces
bactéries profitent des faiblesses de leur hôte pour manifester leur pouvoir pathogène et
infectent des personnes fragilisées, population en augmentation du fait du vieillissement de la
population et de l’augmentation du nombre de personnes immunodéprimées (greffe, VIH,
cancer…). De plus, ces bactéries sont particulièrement difficiles à éradiquer du fait qu’elles
présentent fréquemment une multi-résistance aux antibiotiques. Elles constituent de ce fait un
problème majeur de santé publique. Ces résistances sont essentiellement permises par quatre
mécanismes : la réduction de la perméabilité membranaire, l’efflux, la modification de la cible
et l’inactivation de l’antibiotique (Levy & Marshall, 2004). Les déterminants génétiques
impliqués dans ces mécanismes sont soit présents dans le génome de la bactérie, on parle
alors de résistance intrinsèque ; soit acquis suite à un transfert horizontal ou une mutation
sélectionnés sous l’effet d’une pression de sélection, on parle alors de résistance acquise
(Livermore, 2003). Il est aujourd’hui admis que l’utilisation excessive et inadaptée des
antibiotiques en milieu hospitalier a exercé une pression favorisant l’acquisition de ces
résistances et a largement contribué à l’émergence et la dispersion des bactéries multi-
résistantes aux antibiotiques (Slama, 2008). Cette prise de conscience a mené à une utilisation
plus modérée et adéquate des antibiotiques en milieu clinique qui semble toutefois n’avoir
qu’un effet modéré sur la réduction de la fréquence d’isolement de ces bactéries (Cook, et al.,
2004).
De fait, la communauté scientifique a porté un intérêt croissant ces dernières années à l’étude
des résistances aux antibiotiques dans l’environnement. Ainsi, des bactéries résistantes aux
antibiotiques ont été identifiées dans différents écosystèmes tels que le sol ou le milieu
aquatique. Notamment, des travaux récents ont mis en évidence au sein des communautés
bactériennes indigènes des sols l’existence d’une importante diversité de gènes de résistance
aux antibiotiques appelée résistome et qui englobe les gènes réellement responsables de la
résistance, les gènes de résistance dits cryptiques qui ne conduisent pas au phénotype, et les
gènes précurseurs des déterminants de résistance (Figures 1 et 2) (D'Costa, et al., 2007,
Fajardo, et al., 2008).
-3-
Figure 1. Le résistome. Le résistome est l’ensemble des gènes de résistance aux antibiotiques.
Il inclus les éléments présents chez les bactéries pathogènes et chez les bactéries productrices
d’antibiotiques, ainsi que les gènes cryptiques (qui ne sont pas nécessairement exprimés)
présents sur les chromosomes bactériens (D’après Wright et al., 2007).
Figure 2. Phénotype lié au résistome. Profil de résistance de 480 bactéries du sol. A- Spectre
de résistance ; B- Niveau de résistance de chaque antibiotique d’intérêt (D’Costa et al., 2006).
-4-
De même, une analyse in silico menée sur près de 1000 génomes de bactéries aquatiques et
métagénomes d’origine marine a mis en évidence la présence de plusieurs déterminants qnr,
permettant la résistance aux quinolones, antibiotiques de synthèse (Sanchez, et al., 2008). Ces
déterminants ont été obtenus dans 22 génomes appartenant à 8 genres différents, suggérant
une large dispersion de ces gènes. Contrairement à ce que l’on peut observer en milieu
clinique, les gènes identifiés dans cette étude ont une position chromosomique (acquisition
ancienne), ce qui soulève la question de leur rôle dans l’environnement. Ainsi, malgré une
grande diversité des déterminants génétiques ainsi que leur large dispersion, l’origine,
l’importance et le rôle des résistances aux antibiotiques dans l’environnement font l’objet de
nombreux questionnements.
La présence d’antibiotiques dans l’environnement pourrait être à l’origine de l’acquisition de
ces résistances. Cette présence s’explique d’une part par une production des bactéries
indigènes. Plus de 80 % des antibiotiques utilisés en milieu clinique (utilisation directe ou
sous forme de dérivés semi-synthétiques) proviennent de bactéries du sol, en particulier des
Actinomycètes (Watve, et al., 2001). Il est aujourd’hui accepté que le rôle des antibiotiques
produits par ces bactéries soit d’inhiber la croissance des compétiteurs. De même, les
déterminants permettant la résistance aux antibiotiques sont sélectionnés en réponse à cette
production (Martinez, 2009). Toutefois un rôle alternatif est suggéré par différentes études.
Les antibiotiques pourraient notamment avoir un effet bénéfique à faible concentration (ou
concentration sub-inhibitrice) en jouant le rôle de molécule signal, induisant des
modifications de l’expression de certains gènes. Ces gènes sont notamment impliqués dans la
synthèse et le transport de certaines molécules ou dans le transfert de gènes, et façonneraient
ainsi la structure de la communauté (Davies, et al., 2006).
D’autre part, certaines activités anthropiques ont participé à la forte augmentation des
concentrations en antibiotiques dans les écosystèmes naturels. C’est le cas par exemple de
l’utilisation dans les élevages des antibiotiques comme facteur de croissance ou bien de leur
utilisation inadaptée en thérapie humaine et animale. Les antibiotiques consommés ne sont
que partiellement métabolisés et vont être dispersés par les déjections dans différents
écosystèmes tels que les stations d’épuration ou directement dans les eaux ou le sol. En plus
de l’acquisition de résistance par transfert horizontal, cette forte augmentation pourrait
entraîner dans les populations bactériennes indigènes le changement de fonction de certaines
protéines en faveur de la résistance et de la protection de la cellule. En effet, il a été observé
que certains éléments participant à la résistance à d’importantes concentrations en
antibiotiques ont des fonctions différentes chez leur hôte originel tel que la biosynthèse de
-5-
macromolécules, le maintien de l’homéostasie, ou la réponse au signal (Martinez, et al.,
2009). C’est le cas de certaines pompes à efflux (Figure 3) qui permettent la résistance aux
antibiotiques chez des bactéries pathogènes mais pas dans l’organisme d’origine (Martinez, et
al., 2009). Par exemple, le gène mefA, codant pour une protéine d’efflux, permet
exclusivement la résistance aux macrolides lorsqu’il est acquis par transfert horizontal par des
bactéries pathogènes alors que sa fonction est inconnue chez la bactérie dans laquelle il a été
mis en évidence (Clancy, et al., 1996).
Figure 3. Rôle des pompes à efflux dans les environnements cliniques et non cliniques
(Martinez et al., 2009).
Il apparait de plus en plus clairement que la présence d’autres composés entrainant des
conditions de stress pour les communautés bactériennes indigènes serait impliquée dans
l’acquisition de mécanismes de résistance aux antibiotiques dans l’environnement.
Notamment, des études suggèrent que la contamination par les métaux des écosystèmes
naturels, anthropisés ou créés par l’Homme, représenterait une force évolutive importante
pour la sélection de ces résistances.
-6-
La toxicité des métaux vis-à-vis des organismes peut entraîner en cas de pollution des
écosystèmes des modifications structurales et fonctionnelles des communautés présentes. Ces
modifications résultent de la mise en place de mécanismes d’adaptation intervenant soit à
l’échelle des cellules (expression de gènes, activité enzymatique,…) soit à l’échelle des
populations (transferts de gènes). Ainsi, diverses études ont pu mettre en évidence dans des
sols, des sédiments ou des milieux aquatiques contaminés aux métaux, une plus forte
proportion de bactéries résistantes (Roane & Kellogg, 1996, Nazaret, et al., 2003). Les
mécanismes cellulaires responsables de ces résistances font intervenir des systèmes
semblables à ceux impliqués dans la résistance aux antibiotiques tels que des systèmes
d’efflux, de séquestration, de réduction de la perméabilité membranaire ou de modification de
spéciation de l’élément (Nies, 1999). D’autre part, différentes études montrent une corrélation
positive entre la présence de métaux dans un écosystème et la résistance à la fois à ces métaux
et aux antibiotiques chez les bactéries indigènes, ceci indépendamment du métal ou de
l’antibiotique (Baker-Austin, et al., 2006). De telles observations ont été faites dans des
milieux aussi variés que le tube digestif ou les plaques dentaires (usage du mercure dans les
amalgames dentaires) (Summers, et al., 1993, Ready, et al., 2007), le milieu aquatique (Filali,
et al., 2000, Stepanauskas, et al., 2005), les sédiments (Rasmussen & Sorensen, 1998) et le
sol (Lighthart, 1979). Cette co-sélection peut se faire selon trois mécanismes : la co-
résistance, la résistance croisée et la co-régulation (Figure 4) (Baker-Austin, et al., 2006) :
 La co-résistance est observée lorsque les gènes de résistance aux métaux et aux
antibiotiques sont positionnés sur le même élément génétique mobile (plasmide, transposon,
ilot génomique), ainsi, la présence d’un métal pourra sélectionner les deux résistances. Par
exemple, les gènes de résistance au mercure (opéron merRTPA) sont fréquemment portés par
des éléments génétiques mobiles et associés à des gènes de résistance aux antibiotiques.
Notamment, le transposon Tn21 est connu pour porter à la fois l’opéron merRTPA et le gène
aad1 à l’origine de la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine. Des études ont
montré la présence de ce transposon à la fois chez des bactéries du sol, aquatiques et cliniques
(Liebert, et al., 1999).
 La résistance croisée est observée lorsque le même mécanisme de résistance permet à
la fois la résistance à un métal et à un antibiotique. C’est notamment le cas de certaines
pompes à efflux telle que MexGHI-OpmD présente chez P. aeruginosa, qui permet d’effluer
le vanadium ainsi que la tétracycline et la ticarcilline associée à l’acide clavulanique
(Aendekerk, et al., 2002).
-7-
- Vanadium
- Ticarcilline + Ac. Clavulanique
- Tétracycline
Hg2+ Hg0
MexGHI- Périplasme
OpmD
Hg2+ Hg0 Cytoplasme
opéron mer streptomycine

+ aadA1 spectinomycine
Zn2+, Co2+,
Cd2+
+ -
OprD
opéron czc Imipénème

+
Czc
Zn2+, Co2+, Cd2+
Figure 4. Exemples de co-sélection de résistance. D’après Baker-Austin et al., 2006.
 La co-régulation, quant à elle, s’observe lorsque la régulation d’un mécanisme, induite

par la présence d’un métal ou d’un antibiotique, régule également un autre mécanisme,
permettant ainsi les deux résistances. Par exemple, Perron et collaborateurs ont montré que la
présence de zinc sélectionne des souches de P. aeruginosa résistantes à la fois à différents
métaux : zinc, cadmium et cobalt et à l’imipénème, antibiotique de la famille des
carbapénèmes. Cette double résistance implique le système de régulation à deux composants
CzcR/CzcS qui en présence du métal va d’une part, induire l’expression de la pompe à efflux
CzcCBA permettant l’efflux du zinc, cadmium et cobalt et d’autre part réprimer l’expression
de la porine OprD, responsable notamment de l’entrée de l’imipénème dans la cellule (Perron,
et al., 2004).
-8-
Les sols, bien que réceptacle et accumulateur de métaux lourds du fait de certaines activités
anthropiques telles que l’apport de cuivre dans le traitement des vignobles, les apports
polymétalliques lors de l’épandage de boues de stations d’épuration ou les exploitations
minières et industrielles, ont fait l’objet d’une moindre attention que les environnements
aquatiques. Pourtant, certains travaux, notamment ceux de Berg et collaborateurs ont mis en
évidence une corrélation entre présence d’un métal et la double résistance métal/antibiotique.
Cette étude compare des communautés bactériennes isolées d’un sol témoin et d’un sol pollué
au cuivre, et démontre qu’il y a plus de bactéries résistantes au cuivre dans le sol contaminé
sans changer le nombre total de bactéries et plus de bactéries résistantes aux antibiotiques
dans ce milieu avec une plus forte tendance à la multi-résistance (résistance à au moins 3
antibiotiques) (Berg, et al., 2005).
De même, la majorité des études environnementales s’intéressant à ce phénomène prennent en
compte les communautés indigènes dans leur totalité sans apporter d’attention particulière aux
bactéries pathogènes opportunistes. Au vu de leur implication en santé publique, il semble
indispensable d’approfondir les connaissances sur l’impact des pressions anthropiques, en
particulier des pollutions métalliques sur la sélection de résistance aux antibiotiques chez ces
bactéries.
Dans ce contexte, le travail de thèse présenté dans ce manuscrit a pour objectif de mieux
appréhender le rôle des métaux dans les sols sur la co-sélection de résistance aux métaux et
aux antibiotiques chez les bactéries pathogènes opportunistes. Pour réaliser ce travail, nous
avons choisi deux modèles bactériens pour leur ubiquité dans l’environnement et leur fort
impact en santé publique : Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia. La
première partie de ce manuscrit est une étude bibliographique qui a pour but de présenter ces
modèles et de montrer leur complémentarité dans cette étude. L’accent est mis sur l’ubiquité
de ces bactéries, présentes à la fois dans des environnements variés (milieux aquatiques, sol,
environnements extrêmes ou pollués) et dans le milieu clinique (infections, pouvoir
pathogène, virulence). Nous verrons également que le séquençage récent des génomes de
plusieurs souches a permis de mieux appréhender le mode de vie de ces pathogènes
opportunistes. La diversité intra-spécifique des modèles est abordée grâce à différentes études
de génétique des populations. Une importance particulière est apportée à leur capacité de
résistance aux antibiotiques et aux métaux, quelles soient intrinsèques ou bien acquises par
transfert horizontal.
-9-
La partie expérimentale de cette thèse est divisée en trois chapitres. Dans le premier chapitre,
l’évaluation de la présence, la distribution et l’abondance des modèles a été réalisée par
méthode cultivable couplée à la vérification de l’identité des isolats par des outils de biologie
moléculaire sur un large panel de sols d’origines géographiques différentes (France, Tunisie,
Burkina Faso), soumis à des climats différents et présentant ainsi des caractéristiques physico-
chimiques et des couverts végétaux différents. Ces sols sont soumis à différentes activités
anthropiques, industrielles et agricoles, influençant la composition biochimique et
microbiologique du sol. Cette étude a également pour objectif d’identifier des conditions
ayant une influence sur la présence et l’abondance des modèles telles que la présence de
molécules organiques ou de métaux lourds liée aux activités agricoles ou industrielles menées
sur ces sols.
Dans le deuxième chapitre, les phénotypes et génotypes de résistance aux métaux et aux
antibiotiques des souches environnementales isolées des sites étudiés dans le chapitre
précédant ont été déterminés et comparés aux capacités de résistance de souches d’origine
hospitalière afin de mettre en évidence des pressions environnementales favorables à la
sélection et/ou au maintien de ces résistances ainsi que des phénomènes de co-sélection de
résistance aux métaux et aux antibiotiques.
Dans le troisième chapitre, une étude plus globale des capacités de résistance aux métaux et
aux antibiotiques de la communauté indigène du site de Pierrelaye, considéré dans notre étude
comme le plus contaminé en métaux lourds, a été réalisée par méthode phénotypique. Les
isolats considérés comme représentants de la communauté résistante aux métaux et aux
antibiotiques ont été identifiés. La présence de gènes potentiellement impliqués dans ces
résistances et fréquemment retrouvés sur des éléments génétiques mobiles chez des isolats
cliniques a été investiguée par PCR chez les représentants de la communauté résistante de
Pierrelaye ainsi que dans l’ADN total extrait des sols.
Enfin, une conclusion générale sur le travail réalisé permettra de faire le point sur les
avancées obtenues au cours de cette thèse et des perspectives seront proposées.
- 10 -
GENERAL INTRODUCTION (English version)
Nowadays, an increasing number of bacterial species broadly distributed in the environment

are in the causative agents of nosocomial infections (hospital acquired infections) and join the
already long list of opportunistic pathogens (Martinez & Baquero, 2002). These bacteria take
advantage of a failure in the immune system of fragilised people, as immunocompromised
people (graft, HIV, cancer…), to express their pathogenicity. Moreover, these bacteria are
particularly hard to eradicate due to their frequent antibiotic multi-resistance, constituting a
major problem in modern medicine. Four mechanisms are responsible of antibiotic resistance:
reduction of the membrane permeability, efflux, target modification and antibiotic
inactivation (Levy & Marshall, 2004). These mechanisms can be encoded by genetic
determinants present in the genome of the bacterium, also defined as intrinsic resistance or
can be acquired by horizontal transfer or mutation selected by a selective pressure and defined
as acquired resistance (Livermore, 2003). It is now accepted that excessive and inappropriate
use of antibiotics in the hospital has played the role of selective pressure, promoting the
acquisition of resistance and has largely contributed to the emergence and spread of antibiotic
multi-resistant bacteria (Slama, 2008). This conclusion has led to a moderate and more
appropriate antibiotic use in clinical settings which has just a slight effect on the reduction of
resistant bacteria isolation (Cook, et al., 2004).
Thus, antibiotic resistance in the environment is increasingly studied and antibiotic resistant
bacteria are found in various terrestrial and aquatic environments. Recent works highlighted a
highly diverse collection of antibiotic resistance genes in the soil microbial community, called
resistome. This resistome is composed of genes responsible of antibiotic resistance
phenotypes, cryptic genes and precursors present in both pathogenic and antibiotic producing
bacteria (Figures 5 and 6) (D'Costa, et al., 2007, Fajardo, et al., 2008). An in silico analysis,
conducted on near 1000 aquatic bacterial genomes and metagenomes revealed the presence of
several qnr determinants, allowing quinolone (synthetic antibiotics) resistance (Sanchez, et
al., 2008). These determinants were obtained from 22 genomes belonging to 8 genera,
suggesting a large spread of these genes. The genes identified in this study have a
chromosomal position (ancient acquisition), whereas resistance in clinical strains originated
from recent acquisition. This observation raises the question of the role of antibiotic resistance
genes in the environment. Despite a wide diversity of genetic determinants and their wide
dispersal, questions about the origin, the importance and the role of antibiotic resistance in the
environment still remain.
- 11 -
Figure 5. The antibiotic resistome. The resistome comprises all antibiotic resistance genes. It
includes resistance elements found in both pathogenic bacteria and antibiotic-producing
bacteria and cryptic resistance genes (which are not necessarily expressed) that are present in
bacterial chromosomes (Wright et al., 2007).
Figure 6. Phenotype associated to the resistome. Antibiotic resistance profiling of 480 soil-
derived bacterial isolates; A- Schematic diagram illustrating the phenotypic density and
diversity of resistance profiles; B- Resistance spectrum of soil isolates (D’Costa et al., 2006).
- 12 -
The presence of antibiotics in the environment could be responsible of the acquisition of
resistance. This presence can be partly explained by the production of indigenous bacteria.
More than 80 % of antibiotics used in the hospital (direct use or semi-synthetic derivatives)
are produced by soil bacteria, especially Actinomycetes (Watve, et al., 2001). It is now
admitted that antibiotics produced by bacteria have an inhibitor effect on the competitor
growth. Genetic determinants implicated in resistance are selected in response to this
production (Martinez, 2009). However, an alternative role is suggested by different studies.
Antibiotic could have a beneficial effect at low concentration (or sub-inhibitory
concentration) playing the role of signal molecules, inducing changes in gene expression.
Genes implicated in synthesis and transports or gene transfers are concerned by this
regulation, participating to shape the community structure (Davies et al., 2006).
Anthropogenic activities, such as antibiotic use as growth factor in livestock or in human and
animal therapy, could also contribute to the increase of antibiotic concentrations in natural
ecosystems. Consumed antibiotics are only partially metabolized and can be spread by
manure in different ecosystems such as wastewater treatment plant system or directly into
water or soil. This increase leads to acquisition of resistance by horizontal transfer but could
also lead to the modification of protein function in order to protect the bacterial cell. Indeed,
some cell components, involved in resistance in presence of high antibiotic concentrations,
have different function in the original host as the biosynthesis of macromolecules, the
maintenance of homeostasis or the response to the signal (Martinez, et al., 2009). As an
example, some efflux pumps (Figure 7) are involved in resistance in pathogenic bacteria but
not in the original organism (Martinez et al., 2009).
Figure 7. Role of efflux pumps in clinical and non clinical environments (Martinez et al.,
2009).
- 13 -
For instance the mefA gene, encoding an efflux protein, allows resistance to macrolides when
acquired by horizontal gene transfer but has an unknown function in the bacterium from
which it has been first highlighted (Clancy, et al., 1996).
Other compounds leading to stress conditions in indigenous bacterial community could be
implicated in the acquisition of antibiotic resistance mechanisms in the environment. Heavy
metal contamination in natural, anthropogenic or Man-made environments could represent an
important evolutionary force for resistance selection. Heavy metal toxicity in polluted
ecosystems can lead to structural and functional changes in indigenous communities. These
changes involved adaptation processes which occur at the cell level (gene expression,
enzymatic activities…) or at the population level (selection and enrichment in
tolerant/resistant population, gene transfer).
Several studies have already highlighted the presence of a higher proportion of resistant
bacteria in contaminated soils, sediments or water (Roane & Kellogg, 1996, Nazaret, et al.,
2003). Mechanisms involved in heavy metal resistance as efflux, sequestration, element
modification or reduction of the membrane permeability, are similar to mechanisms involved
in antibiotic resistance (Nies, 1999). Moreover, studies have shown a positive correlation
between heavy metal presence and antibiotic resistance in the indigenous bacterial
community, independently of the metal and the antibiotic (Baker-Austin, et al., 2006). Such
observations were done in a variety of environments as the gastrointestinal tract, the oral flora
(mercury use in dental amalgam) (Summers, et al., 1993, Ready, et al., 2007), soils
(Lighthart, 1979), sediments (Rasmussen & Sorensen, 1998) or aquatic ecosystems (Filali, et
al., 2000, Stepanauskas, et al., 2005). This co-selection can occur in 3 ways: co-resistance,
cross-resistance and co-regulation (Figure 8) (Baker-Austin, et al., 2006):
- 14 -
- Vanadium
- Ticarcillin + Clavulanic acid
- Tetracycline
Hg2+ Hg0
MexGHI- Periplasm
OpmD
Hg2+ Hg0 Cytoplasm
mer operon streptomycin

+ aadA1 spectinomycin
Zn2+, Co2+,
Cd2+
+ -
OprD
czc operon Imipenem

+
Czc
Zn2+, Co2+, Cd2+
Figure 8. Examples of resistance co-selection (from Baker-Austin et al., 2006).
 Co-resistance is observed when antibiotic and heavy metal resistance genes are present
on the same mobile genetic element (plasmid, transposon, integron, genomic island…), so
presence of the metal selects both resistances. For example, mercury resistance genes (operon
merRTPA) are frequently positioned on mobile element and associated to antibiotic resistance
genes. The Tn21 transposon is known to contain the mer operon and the aad1 gene allowing
resistance to streptomycin and spectinomycin. This transposon is present in bacteria from soil,
water and hospital (Liebert, et al., 1999).
 Cross-resistance is observed when the same mechanism allows both antibiotic and
heavy metal resistances. In particular, it can be the case of efflux pumps as MexGHI-OpmD
in P. aeruginosa responsible of the efflux of vanadium and tetracycline and ticarcillin
associated to clavulanic acid (Aendekerk, et al., 2002).
Co-regulation is observed when one regulatory system regulates both resistance mechanisms
in presence of a metal or an antibiotic. As an example, Perron and collaborators (2004)
showed that presence of zinc selected P. aeruginosa strains resistant to metals as zinc,
cadmium and cobalt and to the imipenem antibiotic (carbapenem). These resistances imply
the CzcR/CzcS two component regulatory system. In presence of a metal, this system induces
the expression of the CzcCBA efflux pump, permitting the efflux of zinc, cadmium and cobalt
and represses the expression of the OprD porin, responsible of the intake of imipenem.
- 15 -
Soils can be considered as receiver and accumulator of heavy metals due to anthropogenic
activities such as copper intake in the treatment of vineyards, poly-metallic intakes during
spreading of sludge from treatment plant system or industry and mining. Nevertheless, they
received less attention than aquatic environments. The study of Berg and collaborators
showed a positive correlation between presence of copper in soil and double resistance metal /
antibiotic. This study highlighted a higher prevalence of copper resistant bacteria in copper
contaminated soil than in non contaminated soil, associated to a higher tendency of multi-
resistance (resistance to at least 3 antibiotics) (Berg, et al., 2005). Similarly, most of the
environmental studies dealing with this phenomenon take into account the entire bacterial
communities without particular interest to opportunistic bacterial pathogen populations. Given
their implication in public health, it seems necessary to increase knowledge about the role of
anthropogenic pressure, especially heavy metal pollution, on the selection of antibiotic
resistance in these populations.
In this context, the objectives of this thesis were to explore the role of metals in soils on co-
selection of resistance to metals and antibiotics among opportunistic pathogen bacteria. To
achieve that, we focus on two bacterial models, Pseudomonas aeruginosa and
Stenotrophomonas maltophilia, chosen for their ubiquity in the environment and their high
impact in public health. The first part of this manuscript is a review of the literature which
aims at presenting these models and their complementarity. A particular interest is brought to
the ubiquity of these bacteria, present in various environments (aquatic environments, soils,
polluted and extreme environments) and in the hospital (infections, pathogenicity, virulence).
We also present data from the recent sequencing of the genome of several strains which
enables a better understanding of the way of life of these opportunistic pathogens. The intra-
specific diversity of the two models is addressed through different studies of population
genetic. Finally, their intrinsic and acquired antibiotic and heavy metal resistance capacities
are largely described.
The second part of this manuscript is dedicated to data derived from the experimental work I
conducted during the 3 years of my Ph.D. Data are then presented in three chapters. In the
first chapter, evaluation of the presence, the distribution and the abundance of the two models
was investigated in a wide range of soils from different geographical origins (France, Tunisia,
and Burkina Faso), submitted to different climates, presenting different physicochemical
- 16 -
properties and different plant cover. These soils are also exposed to different industrial and
agricultural activities that influence the biochemical and microbiological composition of the
soils. The methodology used to assess the prevalence of the pathogens involved cultivable
methods coupled to the verification of the identity of the isolates based on molecular tools as
well as a culture independent approach (semi-quantitative PCR). This study also aimed at
identifying environmental conditions that influence the presence and abundance of the models
as the presence of organic compounds or heavy metals, linked to agricultural or industrial
activities.
In the second chapter, heavy metal and antibiotic resistance phenotypes as well as presence of
resistance genes were determined among P. aeruginosa and S. maltophilia strains isolated
from the sites studied in the previous chapter. These phenotypes were compared to those
observed among strains isolated from the hospital in order to highlight environmental pressure
favourable to the selection or maintenance of resistances as well as antibiotic and heavy metal
resistance co-selection phenomenon.
In the third chapter, a global study on heavy metal and antibiotic resistance capacities of the
indigenous microbial community of Pierrelaye, considered as the most heavy metal
contaminated soil of our study, was realised. Isolates considered as representatives of the
antibiotic and heavy metal resistant community have been identified. Presence of genes
potentially implicated in these resistances and frequently found on genetic mobile elements
was investigated by PCR in the identified representative isolates as well as in total soil DNA.
Finally, a general conclusion on the work done during this thesis will enable to take stock on
the progress achieved and prospects will be proposed.
- 17 -
- 18 -
PARTIE I : Revue Bibliographique
Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia :
complémentarité des deux modèles de bactéries
pathogènes opportunistes
- 19 -
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- 21 -
Figure 9. Phylogénie bactérienne (non exhaustive), réalisée à partir de l’étude de Hugenholtz
et al., les bactéries reconnues comme agents infectieux sont représentées. P. aeruginosa et S.
maltophilia sont entourés en rouge (Ecker et al., 2005).
- 22 -
I- Ecologie des modèles
Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia, bactéries Gram négatif de

la classe des -protéobactéries (Figure 9), sont considérées dans la littérature comme des
bactéries versatiles et ubiquistes. Ces qualificatifs se justifient par leur large distribution dans
des environnements variés, naturels, anthropisés ou créés par l’Homme et leur grande capacité
d’adaptation à des environnements présentant des conditions extrêmes et variables. De plus,
ces bactéries sont également capables d’interagir avec d’autres organismes et d’établir des
relations de mutualisme, commensalisme ou parasitisme. Les études relatives à la distribution
des modèles utilisent dans la grande majorité des cas la méthode cultivable. Les milieux de
culture, pour la plupart mis au point dans le milieu clinique, reposent surtout sur les capacités
métaboliques et de résistance intrinsèque aux antibiotiques des deux modèles (Goto &
Enomoto, 1970, Kerr, et al., 1996). Les milieux utilisés pour l’isolement de P. aeruginosa
reposent également sur la capacité de cette bactérie à produire des pigments (Brown &
Lowbury, 1965). Ceux généralement utilisés pour l’isolement de S. maltophilia reposent
également sur certaines capacités métaboliques telles que celle de consommer le mannitol
sans produire d’acide (Kerr, et al., 1996).
I-1- Bactéries environnementales ubiquistes
Afin de mieux comprendre l’écologie de ces deux bactéries, nous allons nous
intéresser dans ce premier paragraphe à leur distribution dans un large panel
d’environnements. En effet, ces modèles sont fréquemment retrouvés dans des
environnements terrestres et aquatiques naturels mais également dans des milieux pollués
(métaux, hydrocarbures, pesticides…) du fait de certaines activités anthropiques. Cette
présence dans des environnements impactés est souvent corrélée avec certaines capacités
d’adaptation de ces bactéries, pouvant potentiellement être utilisées dans le cadre de
bioremédiation, dépollution ou biotechnologie. Enfin, nous verrons que ces bactéries sont
capables de survive et se multiplier dans l’environnement hospitalier, milieu créé par
l’Homme, rendu hostile pour les bactéries du fait des fortes concentrations en antibiotiques et
antiseptiques utilisées de façon courante.
- 23 -
I-1-a- Présence dans les milieux terrestres et aquatiques
 Distribution de P. aeruginosa dans les environnements naturels

P. aeruginosa est souvent considérée comme une bactérie associée aux
environnements aquatiques ou humides et sa détection dans de tels environnements à fait
l’objet de nombreuses études. En particulier, la prévalence de P. aerginosa dans les eaux de
rivière est connue depuis de nombreuses années. Une des plus anciennes études a été réalisée
par Pellet et collaborateurs en 1983 sur des échantillons d’eau du fleuve Mississipi (Pellett, et
al., 1983). Environ 34 % (26/77) de ces échantillons étaient positifs pour la détection de P.
aeruginosa, qui fut alors considérée comme population autochtone du fleuve. En plus de sa
forte prévalence dans l’écosystème rivière, il a été montré qu’il existait une forte diversité au
sein de la population indigène présente et que cette diversité reflétait la diversité globale de P.
aeruginosa, toute origine confondue (environnementale et clinique) (Pirnay, et al., 2005). Les
eaux de rivières seraient un habitat préférentiel de P. aeruginosa et constitueraient donc un
réservoir de souches potentiellement pathogènes.
La présence de P. aeruginosa dans l’eau de mer a également été investiguée et une forte
prévalence est retrouvée dans les zones côtières (Yoshpe-Purer & Golderman, 1987). Sa
présence dans les eaux océaniques a récemment été mise en évidence par Khan et
collaborateurs (Khan, et al., 2007). Cette étude a montré que la distribution de P. aeruginosa
est plus sporadique dans ces eaux et les populations moins diverses, certainement du fait de la
limitation des échanges avec d’autres environnements et le faible impact des activités
anthropiques.
P. aeruginosa a également été mise en évidence dans des eaux récréatives telles que les lacs,
les piscines, jacuzzis et spas (Esterman, et al., 1984, Moore, et al., 2002, Barben, et al., 2005).
Ces études sont particulièrement importantes d’un point de vue de santé publique du fait que
cette présence a parfois pu être corrélée à des infections chez les baigneurs (Reid & Porter,
1981, van Asperen, et al., 1995). La présence de P. aeruginosa dans l’eau de boisson (eau du
robinet) (Liguori, et al., 2010) et les eaux embouteillées a également été rapportée (Hunter,
1993).
En revanche, sa présence dans le sol en tant que bactérie indigène est plus
controversée. Peu d’études ont mis en évidence la présence de P. aeruginosa dans les sols. De
plus, ces études sont relativement anciennes. Une des plus anciennes est celle menée par
Ringen et Drake en 1952, dans laquelle P. aeruginosa n’a pu être isolée que dans 3 des 100
- 24 -
sols testés, suggérant une faible prévalence de cette bactérie dans les sols. Les tentatives de ré-
isolement à partir des mêmes sols se sont révélées infructueuses, mettant en question l’origine
des souches isolées (apport exogène) et la capacité de survie de P. aeruginosa dans les sols.
En 1974, Green et collaborateurs ont eu plus de succès dans l’isolement de P. aeruginosa
(Green, et al., 1974). En effet, cette bactérie a été détectée dans 14 des 58 sols agricoles
californiens testés (soit 23 %). Les auteurs justifient ces résultats par une méthode d’isolement
plus performante que celle utilisée par Ringen et Drake, notamment grâce à l’utilisation d’une
étape d’enrichissement. Les auteurs de cette étude sont donc en faveur de l’hypothèse selon
laquelle P. aeruginosa est un habitant indigène des sols. De plus, ils réfutent l’hypothèse
d’une origine exogène des souches isolées, et argumentent ce point de vue par le fait que l’eau
d’irrigation des sols testés est dépourvue de P. aeruginosa et que ces sols n’ont fait l’objet
d’aucun traitement par des pesticides ou apport organique via les animaux. Toutefois, la
survie de P. aeruginosa dans les sols a également été remise en question par l’étude de
Zechman et Casida en 1982, dans laquelle l’inoculation de P. aeruginosa dans un sol non
stérilisé conduit à une mortalité rapide de la bactérie
 Distribution de S. maltophilia dans les environnements naturels

Contrairement à P. aeruginosa, il est admis que S. maltophilia est très répendue dans
les sols, qui constituent un des principaux réservoirs de cette bactérie (Ryan, et al., 2009).
D’abord nommée Pseudomonas maltophilia, puis Xanthomonas maltophilia, S. maltophilia
est fréquemment isolée d’environnements terrestres, en particulier de la rhizosphère de
différentes plantes (Berg, et al., 1996). Toutefois, les études mettant en évidence la prévalence
et la densité des populations indigènes du sol de S. maltophilia sont rares et ce n’est souvent
pas l’objectif premier de ces études. Parmi ces études, on peut citer celle de Junkhe et Des
Jardin ayant pour objectif le développement d’un milieu de culture (XMSM Xanthophilia
maltophilia selective medium) permettant de détecter la présence de S. maltophilia dans les
sols (Juhnke & des Jardin, 1989). Afin de valider ce milieu de culture, 30 sols bruts ou de
rhizosphère ont été criblés (sols du Montana et de Floride : terrain de golf, pelouses
résidentielles, pâturage, rhizosphère de céréales, orangeraies, palme, canne à sucre). S.
maltophilia a été détectée dans 27 des 30 sols testés avec des densités variant de 101 à 103 ufc
(unité formant colonie)/g de sol, ce qui est en faveur de son endémicité dans les sols.
Peu d’études portent sur la distribution de S. maltophilia dans le milieu aquatique,
toutefois, cette espèce a été isolée d’échantillons d’eau de mer (Matyar, et al., 2008), d’eau de
nappe (Glucksman, et al., 2000), d’eau potable (Romano, et al., 1997) et d’eau minérale non
- 25 -
gazeuse embouteillée (Wilkinson & Kerr, 1998). Une étude récente a permis d’isoler S.
maltophilia dans des lacs de haute altitude, caractérisés par des conditions extrêmes telles
qu’un haut niveau de radiations aux UV-B, une forte salinité, une faible présence de
nutriments et des fluctuations de températures importantes, suggérant d’importantes capacités
d’adaptation chez cette bactérie (Flores, et al., 2009).
Les densités de population dans les environnements aquatiques sont souvent inconnues.
Toutefois, une étude menée par Piccini et collaborateurs a montré que les populations de S.
maltophilia pouvaient être majoritaires au sein des communautés planctoniques d’eau douce
et saumâtre de la lagune côtière peu profonde de l'océan Atlantique sud (Piccini, et al., 2006).
Une succession saisonnière des populations majoritaires est observée, avec une communauté
composée à plus de 90 % de S. maltophilia lorsque certains nutriments sont présents (en
particulier la leucine).
Ainsi, P. aeruginosa et S. maltophilia sont isolées à la fois d’environnements

aquatiques et terrestres et peuvent partager les mêmes niches écologiques. Il semble toutefois
que P. aeruginosa présente plus de facilité à survivre dans les milieux aquatiques et que sa
présence dans le sol soit plus sporadique. Au contraire, S. maltophilia peut être considérée
comme une bactérie indigène du sol mais elle est également assez fréquemment retrouvée
dans des milieux aquatiques. Même si la présence de cette bactérie a été décrite à plusieurs
reprises, sa mise en évidence dans les environnements naturels fait l’objet de peu d’études.
Des études supplémentaires seraient nécessaires à l’évaluation de la distribution de cette
bactérie dans de tels environnements. Les études présentées dans ce paragraphe permettent de
mieux appréhender la prévalence des modèles dans les environnements naturels. Toutefois,
peu d’informations sont à ce jour disponible en ce qui concerne leur abondance et les facteurs
impliqués dans leur répartition.
I-1-b- Présence dans les milieux pollués et capacité de bioremédiation
 Les eaux usées

Les eaux usées peuvent être considérées comme des eaux impactées par les activités
humaines domestiques (rejets des excréments, eaux de nettoyage…), industrielles (composés
chimiques, biologiques, métaux …) ou agricoles (rejet de pesticides, engrais, fèces
- 26 -
d’animaux…). Ces eaux contiennent potentiellement une communauté microbienne riche
(Lee, et al., 2006) et la recherche de la présence de P. aeruginosa et S. maltophilia dans ces
eaux à fait l’objet de nombreuses études. Il a également était rapporté à plusieurs reprises que
ces bactéries étaient capables de survivre aux différentes étapes de désinfection visant à
l’élimination des microorganismes lors du processus de traitement de ces eaux (Hoefel, et al.,
2005). Notamment, l’étude de Schwartz et collaborateur a mis en évidence la présence de P.
aeruginosa dans des eaux usées du milieu clinique, des eaux usées municipales, dans l’eau à
l’issu du processus de traitement et même dans l’eau de la rivière en aval, ceci dans
différentes villes d’Allemagne (Schwartz, et al., 2006). La plus forte densité de population a
été obtenue dans les eaux usées cliniques et des souches résistantes à la ciprofloxacine
(antibiotique de la famille des quinolones, utilisé dans le traitement des infections à P.
aeruginosa) ont été isolées des eaux usées cliniques et municipales ainsi que dans les eaux des
rivières en aval. Cette étude suggère que la dissémination de certaines résistances aux
antibiotiques dans le milieu aquatique serait liée à leur utilisation en thérapie. En plus des
résistances aux antibiotiques, les souches isolées des eaux usées présentent fréquemment des
résistances à d’autres composés. Notamment, l’étude de Filali et collaborateurs a mis en
évidence la présence d’une souche de P. aeruginosa dans les eaux usées de la ville de
Casablanca (Maroc) présentant d’importantes capacités de résistance aux antibiotiques, aux
métaux lourds et à des hydrocarbures aromatiques comme le naphtalène et l’anthracène
(Filali, et al., 2000).
 Les environnements contaminés en métaux lourds

Les métaux lourds, récemment requalifiés d’éléments trace métalliques, sont présents
naturellement dans l’environnement à l’état de trace et leur concentration peut être augmentée
par différentes activités humaines (industrielles, agricoles, minières…). Certains de ces
éléments comme le zinc, le cuivre ou le fer sont indispensables à la vie à de faible dose et
deviennent toxiques à forte concentration. D’autres présentent une forte toxicité même à
faible dose, c’est le cas notamment du mercure ou du cadmium. S. maltophilia et P.
aeruginosa ont également été fréquemment isolés d’environnements contaminés en métaux
lourds que ce soit de milieux aquatiques (Matyar, et al., 2008, Matyar, et al., 2009), de
sédiments ou de sols (Marques, et al., 1979). La présence de ces deux bactéries a même été
rapportée dans la même zone contaminée. En effet, deux études menées dans la baie
d’Iskenderun (côte sud de la Turquie), zone fortement contaminée en métaux, surtout fer et
plomb, du fait des nombreuses industries qui l’entourent, ont mis en évidence la présence de
- 27 -
ces deux modèles. En particuliers, S. maltophilia a été isolée de différents échantillons d’eau
de mer, de sédiments et de crevettes (Matyar et al., 2008). Ces études montrent également que
les souches isolées présentent une forte tendance à la multi-résistance à différents composés
(métaux lourds et antibiotiques). Ces souches, présentant une importante capacité à résister à
des fortes concentrations en différents métaux, sont des candidats potentiels pour la
remédiation de sites contaminés.
Récemment, différentes souches de S. maltophilia, isolées d’environnements contaminés, ont
fait l’objet d’une attention particulière du fait de leurs propriétés intéressantes d’un point de
vue industriel. C’est le cas par exemple de la souche AuRed02 isolée d’une mine d’or
(Nangia, et al., 2009). Cette souche est capable de synthétiser des nanoparticules d’or,
utilisables notamment en optique ou en thérapie, en présence d’une solution de chlorure d’or
(HAuCl4) dans le milieu de culture. Une étude menée par Dungan et collaborateurs à
également mis en évidence la présence d’une souche de S. maltophilia dans des sédiments
contaminés en sélénium, capable d’utiliser le sélénate (SeO42-), le sélénite (SeO32-), le sulfate
(SO42-) et le nitrate (NO3) comme accepteur terminal d’électrons (Dungan, et al., 2003). En 48
heures, cette souche retire 99,8 % du SeO42- et SeO32- présent dans le milieu et le transforme
en Se0 élémentaire, moins toxique. L’utilisation de ce procédé ouvre de nouvelles
perspectives dans la dépollution des sites contaminés, qui reste à ce jour très couteuse.
 Les environnements contaminés en hydrocarbures

La contamination des écosystèmes naturels par les hydrocarbures est un problème
environnemental majeur. La dégradation de ces molécules organiques par les
microorganismes dans un but de dépollution est une piste largement investiguée ces dernières
années. Ainsi, différentes études mettent en évidence dans les milieux contaminés la présence
de consortiums bactériens capables de survivre et dégrader une ou plusieurs molécules. Parmi
les espèces bactériennes composant ces consortiums, P. aeruginosa et S. maltophilia sont
fréquemment retrouvées, parfois même simultanément (Hawle-Ambrosch, et al., 2007) et de
nombreuses études ont rapporté leur capacité à dégrader un grand nombre de molécules,
notamment parmi les hydrocarbures polycycliques (phénanthrène, fluoranthène, chrysène,
benzanthracène, benzo[a]pyrène, naphtalène, benzène, toluène, xylène…) (Civilini, et al.,
1999, Cavalca, et al., 2000, Kim, et al., 2009). Certains des mécanismes liés à la résistance
et/ou à la dégradation de ces molécules ont été identifiés et sont souvent associés à
l’acquisition de gènes ou d’opérons particuliers (Civilini, et al., 1999, Cavalca, et al., 2000,
Duarte, et al., 2001).
- 28 -
Ces deux bactéries ont été mises en évidence à la fois dans des environnements aquatiques
(Bhattacharya, et al., 2000, Luo, et al., 2009) et dans des sols contaminés (Cavalca, et al.,
2000, Duarte, et al., 2001). Ainsi, alors que la présence de P. aeruginosa dans les sols naturels
paraît sporadique, il semble que sa prévalence dans les sols impactés en hydrocarbures soit
élevée. Notamment, Kaszab et collaborateurs ont recherché sa présence dans des eaux de
nappes et des sols de 26 sites contaminés. Cette bactérie à été isolée dans 61, 5 % des sites,
plus précisément dans 57 % de ceux où des échantillons de sol ont été étudiés (Kaszab, et al.,
2009). Ainsi, ces bactéries peuvent être considérées comme un élément majeur des
communautés présentes dans les environnements contaminés au niveau de leur prévalence. De
plus, des études ont également montré qu’elles étaient impliquées majoritairement dans la
dégradation des molécules. L’étude de Kim et collaborateurs montre que lorsque les espèces
du consortium sont mises individuellement en présence de phénanthrène, leur activité de
dégradation est faible. Par contre, lorsque différentes associations sont testées, on remarque
que les plus performantes sont celles constituées avec S. maltophilia et Acinetobacter
baumannii. Mais dans tous les cas, S. maltophilia reste l’espèce la plus abondante pendant le
processus de dégradation (Kim, et al., 2009).
Il a également était observé que certaines bactéries présentes dans le consortium n’agissent
pas en participant à la dégradation des molécules mais peuvent la favoriser. Par exemple, il a
été mis en évidence que P. aeruginosa peut être considéré comme un assistant « helper » en
favorisant l’accès aux molécules par les autres bactéries composant le consortium par la
production de rhamnolipides agissant comme biosurfactants (Deziel, et al., 1996, Garcia-
Junco, et al., 2001).
 Les environnements présentant d’autres types de contaminations

La présence de P. aeruginosa et S. maltophilia a également était rapportée dans des
environnements contaminés en biocides tels que les pesticides ou fongicides. Les souches
mises en évidence présentent une fois de plus des capacités de dégradation de molécules
intéressantes en bioremédiation. Notamment, l’étude de Juhasz et collaborateur a permis
d’isoler une souche de S. maltophilia dans un sol contaminé en pentachlorophénol (fongicide)
capable de survivre en présence d’hydrocarbures polycycliques, de composés aromatiques
chlorés et nitrés et du pesticide DDT (Juhasz, et al., 2000).
De même, cinq souches de P. aeruginosa, isolées à partir d’échantillons de mer de la côte
Ouest de l’Inde contaminée en organotine présentent des résistances à des composés dérivés
de l’organotine mais également à différents métaux et antibiotiques. Les mécanismes à
- 29 -
l’origine de ces résistances restent indéterminés, toutefois l’acquisition des résistances aux
composés dérivés de l’organotine et aux métaux pourraient avoir été acquis simultanément du
fait que les peintures antifouling utilisées pour empêcher le développement de biofilm sur les
bateaux sont très souvent composées de ces molécules et de métaux tels que le zinc (Roy &
Nair, 2007).
Ainsi, les modèles bactériens P. aeruginosa et S. maltophilia sont fréquemment retrouvés

dans des environnements pollués du fait de différentes activités anthropiques, ce qui suggère
une grande adaptabilité. De plus, la capacité de survie en présence des contaminations
présentes est souvent associée à une capacité de résistance à un spectre plus large de
molécules. Toutefois, on remarque que les études mettant en évidence leur présence dans de
tels environnements sont soit descriptives, soit s’intéressent à mettre en évidence des
capacités de traitement des déchets, de biodégradation de certains composés dans un but de
bioremédiation. Une fois de plus, peu de données sont disponibles sur la prévalence de ces
deux bactéries et sur les facteurs qui influencent leur distribution, en terme de présence et
d’abondance.
I-1-c- Présence dans les environnements hospitaliers
La présence de P. aeruginosa et S. maltophilia dans l’environnement hospitalier a

fréquemment été décrite (Tableau 1). Contrairement aux études menées dans les
environnements naturels ou pollués, les études menées dans le milieu clinique sont plus
précises en ce qui concerne la distribution, la prévalence et la diversité des deux modèles,
certainement du fait de leur implication en santé publique.
Le milieu aquatique étant une niche privilégiée de P. aeruginosa, une attention particulière est
portée à la recherche de cette espèce au sein du réseau d’eau hospitalier (robinets, douches…)
(Trautmann, et al., 2005). En ce qui concerne S. maltophilia, des études ont également montré
qu’elle était préférentiellement isolée d’environnements humides et que sa capacité de survie
sur les surfaces sèches du milieu clinique telles que le sol ou les surfaces vitrées était faible
voire nulle (Denton & Kerr, 1998). Les environnements aquatiques ou humides semblent
donc être les sites les plus susceptibles d’abriter ces bactéries.
- 30 -
Tableau 1. Source de P. aeruginosa et S. maltophilia dans l’environnement hospitalier (non
exhaustif). D’après Denton & Kerr, 1998 ; Senol, 2004 et Kerr & Snelling, 2009.
Sources potentielles de S. maltophilia Sources potentielles de P. aeruginosa

Solutions de désinfectant Solution de désinfectant, antiseptiques
Douche, lavabo, robinet Douche, lavabo, robinet
Machine à dyalise Equipement de respiration artificielle
Nébuliseur Eau du bain, jouet pour le bain
Thermometre Savon
Mains du personnel soignant Brosse à dents
Fluides intraveineux Fleurs
Moniteur de pression artérielle Endoscope
Pompe intra-aortique Uromètre
Cathéter Cicuit de ventilation
Piscines d'hydrothérapie Piscines d'hydrothérapie
Machine à glace Machine à glace
Certaines de leurs capacités vont favoriser leur maintien dans ces niches. Parmi ces aptitudes,
on peut notamment citer leurs capacités de résistance à différents antiseptiques, biocides et
antibiotiques. Ces capacités sont soit innées soit elles ont été sélectionnées dans le milieu
hospitalier où la pression de sélection est forte. Une autre propriété favorisant le maintien de
ces bactéries dans ces environnements hostiles est leur capacité à former des biofilms sur des
surfaces inertes, ce qui renforce leur capacité de résistance aux désinfectants et empêche
également l’enlèvement physique (Liaw, et al., Kerr & Snelling, 2009).
Toutefois, établir le fait que les environnements hospitaliers sont des réservoirs potentiels de
P. aeruginosa et S. maltophilia ne suffit pas à montrer que ces bactéries constituent un risque
d’infection pour les personnes hospitalisées. De ce fait, un certain nombre d’études a eu pour
objectif de mieux appréhender la diversité de ces bactéries dans le milieu clinique, leur
capacité de survie à long terme et leur implication dans les infections nosocomiales
épidémiques (Doring, et al., 1993, Reuter, et al., 2002, Cholley, et al., 2008). Notamment, une
étude récente réalisée au sein de notre équipe de recherche a eu pour objectif d’étudier la
diversité intra-spécifique de P. aeruginosa dans le réseau d’eau du service de soins intensifs
de l’hôpital Henri Gabrielle (Lyon) sur une période de deux ans (Lavenir, et al., 2008). Cette
étude a mis en évidence une forte prévalence de cette bactérie puisque elle a été isolée dans 68
% des échantillons d’eau du robinet testés. Vingt deux complexes clonaux ont été identifiés
tout au long de l’étude, suggérant une importante diversité et une grande capacité à coloniser
le réseau d’eau. Parmi ces complexes clonaux, seulement certains ont été retrouvés tout au
- 31 -
long de l’étude, ce qui laisse à penser que les pressions fortes présentes dans cet
environnement entrainent l’émergence de certains clones mieux adaptés. La responsabilité
d’un de ces clones dans une infection nosocomiale a d’ailleurs été mise en évidence.
Une étude de Denton et collaborateurs a également montré une grande diversité des souches
de S. maltophilia isolées de patients atteints de mucoviscidose ainsi que des environnements
cliniques et fréquentés par ces patients (Denton, et al., 1998). Cette étude suggère notamment
que l’origine des infections de ces patients seraient plus probablement environnementale
(maison ou hôpital) que liée à la transmission entre patients.
Ainsi, l’environnement hospitalier, en particuliers les niches humides, semble constituer l’un
des réservoirs de P. aeruginosa et S. maltophilia. De plus, des études ont mis en évidence la
responsabilité de certaines souches dans des infections nosocomiales. Toutefois, malgré les
stratégies mises en œuvre pour les éradiquer, leur abondance et leur diversité restent
importantes.
I-2- Interactions avec d’autres organismes
En plus d’une grande capacité d’adaptation à un large panel d’environnements, P.

aeruginosa et S. maltophilia vont être capables d’interagir avec les végétaux, les animaux et
l’Homme. Ces interactions pourront être de différentes natures, mutualistes, parasitiques ou
commensales en fonction des bénéfices et/ou des dommages ressentis par les deux
partenaires.
I-2-a- Interactions avec les plantes
P. aeruginosa, est capable d’établir différents types d’association avec les plantes. D’une part,
certaines souches de P. aeruginosa vont être capables d’avoir un effet bénéfique sur la plante
hôte. Ainsi, différentes souches isolées de la rhizosphère ont montré des capacités à
promouvoir la croissance des plantes. Cette capacité est liée à des caractéristiques
particulières, souvent souche spécifique. La capacité à produire des antifongiques a par
exemple était mise en évidence chez certaines souches, à la fois environnementales et
cliniques (Mavrodi, et al., 2001). La production de l’hormone de croissance acide indole 3-
- 32 -
acétique (AIA), de sidérophores et de phosphatases permettant d’améliorer la disponibilité en
fer et en phosphore, respectivement, ont également été mises en évidence chez différentes
souches et sont souvent corrélées avec l’induction de la croissance des plantes. La souche
PUPa3 en particulier a retenu notre attention (Kumar, et al., 2005). Cette souche est capable
de produire un antifongique à large spectre : le phenazine-1-carboxamide (PCN), agissant
notamment contre des champignons responsables d’infection chez des plantes d’intérêt
économique majeur telles que le riz, la cane à sucre, le thé, le coton ou le tabac. Ce fongicide
est 10 fois plus actif que le HCN (acide cyanhydrique), produit par d’autres souches de P.
aeruginosa promotrices de croissance. En plus de la synthèse de cette molécule, PUPa3
produit également de l’AIA, des sidérophores et des phosphatases, ce qui fait de cette souche
un excellent candidat pour l’amélioration du rendement des cultures. Toutefois, il a été montré
que malgré des capacités à promouvoir la croissance des plantes par certaines souches de P.
aeruginosa en laboratoire, aucun effet bénéfique n’était observable aux champs. Cette
observation serait due à l’incapacité de certaines souches à survivre ou rester active dans les
sols. Devliegher et collaborateurs suggèrent que l’ajout d’une source de carbone dans les sols
pourrait diminuer la compétition bactérienne, entrainant un effet positif de P. aeruginosa sur
la croissance des plantes (Devliegher, et al., 1995). La capacité à survivre en présence de
pesticides et de les dégrader semble également être une caractéristique intéressante de
certaines souches de P. aeruginosa entraînant un effet sur la plante (Chapalmadugu &
Chaudhry, 1993). C’est le cas par exemple de la souche PS1 (Ahemad & Khan, 2010). Cette
souche, isolée de la rhizosphère de la moutarde, est capable d’induire la croissance du haricot
vert, en particulier en présence d’herbicide. Cette augmentation s’explique d’une part par la
production de substances qui stimulent la croissance de la plante telles que l’AIA, mais
également par la réduction de la disponibilité de l’herbicide due à la sécrétion
d’exopolysaccharides par la souche dans les sols.
D’autre part, différentes souches de P. aeruginosa ont montré des capacités à créer des
dommages chez les plantes (Rahme, et al., 1995). La plupart de ces études ont été réalisées en
laboratoire en testant l’effet de souches isolées principalement du milieu clinique sur
différentes plantes (Elrod & Braun, 1942). Ces études ont notamment pour vocation la mise
en évidence des facteurs de virulence qui pourront être utilisés de la même façon chez les
hôtes animaux et végétaux (Starkey & Rahme, 2009). Parmi les souches les plus virulentes, la
souche PA14 a fait l’objet d’études approfondies. Son effet sur la plante Arabidopsis thaliana
a été investigué en détail. Il a été montré qu’elle était capable d’envahir la plante au niveau
- 33 -
des feuilles par les blessures et les stomates et de causer des infections locales ou systémiques
entraînant la mort de la plante au bout de quelques jours (Plotnikova, et al., 2000). Il a
également été montré que PA14 était capable d’infecter les racines d’Arabidopsis et du basilic
in vitro et dans le sol. Cette infection entraîne une réponse immunitaire de la plante qui
produit alors des molécules antibactériennes telles que l’acide rosmarinique. Ces molécules ne
permettent toutefois pas l’élimination de P. aeruginosa organisée en biofilm (Walker, et al.,
2004). Enfin, le séquençage de cette souche a permis de mettre en évidence la présence de
deux ilots de pathogénicité impliqués dans la réussite de l’infection à la fois chez les animaux
et les plantes (He, et al., 2004).
Enfin, P. aeruginosa est également fréquemment trouvé sur certains fruits et plantes
vertes sans causer de dommages (Cho, et al., 1974). Cette mise en évidence est
particulièrement intéressante d’un point de vue de santé publique puisque sa présence sur des
plantes ornementales pourrait constituer une source de contamination pour les personnes
hospitalisées.
De nombreuses études ont mis en évidence la présence de S. maltophilia dans la

rhizosphère de différentes plantes (Juhnke & des Jardin, 1989, Berg, et al., 1996), toutefois,
elle peut également être isolée de la surface ainsi que des tissus internes de la plante en
particulier dans les tissus vasculaires des racines et de la tige (Garbeva, et al., 2001, Ryan, et
al., 2009). Dans tous les cas, les interactions établies entre S. maltophilia et les plantes sont
toujours à bénéfices réciproques et aucune espèce du genre Stenotrophomonas n’est connue
pour être phytopathogène. Les associations entre S. maltophilia et les plantes ont fait l’objet
de nombreuses études étant donné les capacités d’induction de la croissance des plantes par
les espèces du genre Stenotrophomonas (Berg, 2009). Cet effet présente un intérêt
particulièrement important en biotechnologie. Notamment, l’utilisation de ces bactéries
permettrait de diminuer l’utilisation de produits chimiques pour l’amélioration des
rendements agricoles.
Différents facteurs seraient impliqués dans la réussite de l’association S. maltophilia-plante
hôte. Notamment, la colonisation de la plante serait favorisée par la mobilité et les capacités
d’adhésion de S. maltophilia. Ces propriétés sont dues à la présence de fimbriae et de pili,
impliqués à la fois dans l’adhésion et la formation de biofilms (de Oliveira-Garcia, et al.,
2003), contribuant certainement à la rendre plus compétitive vis-à-vis des autres bactéries
présentes dans la rhizosphère. Il a également été montré qu’une espèce de S. maltophilia
- 34 -
épiphyte pouvait altérer les tissus de la plante pour favoriser les échanges. En effet, la souche
SaO5sm est capable d’augmenter la perméabilité de la feuille de la plante hôte, ce qui a pour
conséquence d’augmenter la disponibilité en eau et en composés dissouts à la fois pour la
plante et pour la bactérie (Schreiber, et al., 2005). Toutefois, le mécanisme à l’origine de ces
modifications est à ce jour inconnu.
La stimulation de la croissance des plantes ne serait pas une particularité réservée aux souches
environnementales. En effet, l’étude de Suckstorff et Berg a montré que différentes souches
de S. maltophilia étaient capables de stimuler la croissance des racines et des poils racinaires
de plantes quelles soient d’origine environnementale ou clinique (Suckstorff & Berg, 2003).
L’effet semble toutefois inférieur chez les souches d’origine clinique mais reste significatif.
Cette étude montre également que l’effet observé serait dose-dépendant et impliquerait la
synthèse par la bactérie de l’hormone de croissance AIA.
De plus, S. maltophilia semble avoir différentes propriétés lui permettant d’agir comme agent
de bio-contrôle sur les compétiteurs ou pathogènes de plantes présents dans la rhizosphère.
Elle est notamment capable de produire différentes molécules qui vont avoir un rôle fongicide
ou bactéricide (Juhnke, et al., 1987). En particulier, la souche R3089 est capable de
synthétiser un fongicide nommé maltophiline (Jakobi, et al., 1996). Il a été montré que cette
molécule était capable d’inhiber la croissance de différents champignons saprophytes mais
également pathogènes des plantes et de l’Homme, par contre aucune activité contre les
bactéries n’a été observée. S. maltophilia présente également des propriétés hydrolytiques
importantes et produit différentes protéases. Certaines d’entres elles, notamment les chitinases
peuvent intervenir dans le contrôle des champignons pathogènes de plantes en lysant leur
paroi cellulaire (Zhang, et al., 2001). S. maltophilia serait même une des espèces dominantes
dans la dégradation de chitine au sein de la communauté microbienne du sol (Krsek &
Wellington, 2001).
La compétition pour le fer semble un facteur important pour la survie et la croissance des
bactéries dans la rhizosphère (Jurkevitch, et al., 1992). La présence dans les génomes
séquencés de S. maltophilia de plusieurs gènes impliqués dans la formation de sidérophores
augmenterait les capacités de compétition de cette bactérie et favoriserait sa survie dans la
rhizosphère (Ryan, et al., 2009).
- 35 -
Les capacités à promouvoir la croissance des plantes de P. aeruginosa et S. maltophilia font
l’objet de nombreuses études. Toutefois, leur utilisation aux champs peut poser un problème
d’éthique. Il est important de ne pas perdre de vue que ces modèles bactériens sont également
des pathogènes opportunistes majeurs, d’une grande importance d’un point de vue de santé
publique. Leur utilisation en agriculture ou dans d’autres domaines de biotechnologie doivent
être parfaitement contrôlée et maitrisée. De plus, d’autres espèces appartenant aux genres
Stenotrophomonas (en particulier S. rhizophila) et Pseudomonas (autres Pseudomonas
fluorescents) offrent également de bonnes perspectives tout en s’affranchissant du problème
lié au caractère pathogène de P. aeruginosa et S. maltophilia, notamment dans la promotion
de croissance des plantes.
I-2-b- Interactions avec les animaux
S. maltophilia et P. aeruginosa ont également été mises en évidence chez différents

animaux, notamment chez des animaux domestiques et d’élevage. Chez ces animaux, ces
bactéries vont soit appartenir à la flore commensale de façon transitoire soit elles vont être
responsables de pathologies (Mushin & Ziv, 1973). Dans tous les cas, les animaux porteurs
constituent un réservoir potentiel de ces bactéries qui pourraient potentiellement être à
l’origine de transmission aux personnes fragilisées lors de contacts. D’autre part, l’implication
de P. aeruginosa et S. maltophilia dans des épidémies au sein d’animaux d’élevage peut
entrainer des pertes économiques. Les pathologies liées à ces bactéries sont variées, elles vont
notamment être responsables d’otites, de conjonctivites, de kératites ou encore d’infections
pulmonaires (Hammer, et al., 2003, Johnson, et al., 2003, Ledbetter, et al., 2009).
A ce jour, peu d’études rapportent la responsabilité des deux modèles dans des épidémies au
sein de troupeaux d’élevage. Ainsi, l’implication de ces bactéries en santé animale semble
limitée. Toutefois, les pathologies associées sont graves et les traitements sont souvent lourds
et inefficaces. Plusieurs études ont mis en évidence l’implication de P. aeruginosa dans des
mammites chez des troupeaux de vaches, chèvres et brebis (Leitner & Krifucks, 2007).
Différentes origines possibles ont été identifiées notamment la contamination d’une solution
contenant un antibiotique utilisé pour le traitement des vaches (Osborne, et al., 1981).
D’autres hypothèses ont également été avancées telles que la contamination par des souches
environnementales présentes notamment dans l’eau de boisson des animaux ou les
contaminations entre animaux du fait d’un haut taux de portage fécal (Mushin & Ziv, 1973).
- 36 -
Des épidémies de pneumonies hémorragiques ont également été mises en évidence dans des
troupeaux de visons et P. aeruginosa semble particulièrement virulente chez ces mammifères
(Hammer, et al., 2003). Toutefois, les raisons de cette virulence ainsi que l’origine des
infections sont inconnues. S. maltophilia est plutôt considérée comme un colonisateur
secondaire lors d’une infection animale, profitant des faiblesses de l’hôte pour se développer.
Toutefois, une étude menée par Johnson et collaborateur suggère que cette bactérie pourrait
être responsable de lymphadénites chez plusieurs chèvres d’un même troupeau du fait qu’elle
ait été la seule isolée des abcès présents chez ces chèvres (Johnson, et al., 2003).
En revanche, de nombreuses études mettent en évidence la présence de P. aeruginosa et S.
maltophilia chez des animaux fréquemment en contact avec l’Homme. Elles ont notamment
été isolées d’animaux domestiques tels que les chiens, les chats ou les chevaux (Hariharan, et
al., 2006, Albini, et al., 2009, Winther, et al., 2009), mais également de nouveaux animaux
domestiques (NAC) tels que les tortues (Diaz, et al., 2006), les serpents (Colinon, et al., 2009,
Hejnar, et al., 2010) ou les chinchillas (Wideman, 2006). Elles sont également impliquées
dans des infections chez des animaux de zoo, en particulier les reptiles (serpents, crocodiles)
(Harris & Rogers, 2001, Miller, et al., 2004, Colinon, et al., 2009) ou d’oiseaux marins
recueillis dans des centres de soins animaliers (Steele, et al., 2005). Ces études permettent de
mettre en évidence des réservoirs potentiels de ces bactéries qui pourraient être transmises à
des personnes fragilisées. En particulier, la présence de souches particulièrement résistantes
aux antibiotiques constitue un risque supplémentaire pour les personnes fragilisées en contact
avec les animaux infectés ou porteurs. L’acquisition de ces résistances peut être attribuée à
certaines pratiques de l’Homme. Notamment, la présence de résistance aux aminoglycosides
chez des souches isolées de tortues domestiques serait liée à l’utilisation de sulfate de
gentamycine pour éradiquer les Salmonelles fréquemment présentes chez ces animaux (Diaz,
et al., 2006).
Il est aussi intéressant de noter que P. aeruginosa et S. maltophilia peuvent être présentes
chez des vecteurs potentiels tels que la tique Ixodes ridinus, vecteur notamment de Borrelia
burgdorfi (à l’origine de la maladie de Lyme) (Stojek & Dutkiewicz, 2004). Toutefois, aucune
preuve de transmission de P. aeruginosa et S. maltophilia par vecteur n’est à ce jour rapportée
dans la littérature.
- 37 -
I-2-c- Interactions avec l’Homme
 Portage
P. aeruginosa et S. maltophilia peuvent être présentes chez l’Homme sans engendrer
de pathologie. Même si ces bactéries ne sont pas reconnues comme indigènes de la microflore
de l’Homme, elles peuvent être retrouvées dans le tube digestif ou dans l’oropharynx. Leur
prévalence semble toutefois plus importante chez les personnes hospitalisées que chez les
personnes en bonne santé (Thuong, et al., 2003). En effet, l’étude de Kerr et collaborateurs,
menée à la fois sur des patients et sur des personnes en bonne santé montrent la présence de S.
maltophilia dans les fèces de 33 % des patients et seulement 2,9 % des personnes saines
(Kerr, et al., 1991). De même, une étude de Stoodley et Thom a montré que P. aeruginosa
était présente dans les fèces de 36 % de patients, ce chiffre augmente à 52,6 % chez les
patients qui ont subi une intervention chirurgicale gastro-intestinale (Stoodley & Thom,
1970). En revanche, cette bactérie n’a été isolée que dans 4 % des fèces de personnes en
bonne santé. Leur présence au niveau des voies respiratoires a fait l’objet d’un plus grand
nombre d’études en particulier chez les patients hospitalisés nécessitant l’utilisation
d’appareils respiratoires. Il semblerait notamment que la présence de P. aeruginosa dans la
flore du patient à son entrée à l’hôpital favoriserait la colonisation et le développement
d’infection suite à une trachéotomie (Morar, et al., 2002). D’autre part, l’utilisation
d’antibiotiques inefficaces sur P. aeruginosa pourrait participer à la sélection de souches
résistantes causant ces infections respiratoires (Thuong, et al., 2003). En revanche, peu
d’études mettent en évidence la présence de S. maltophilia dans les voies respiratoires sans
lien avec une pathologie. Toutefois, bien que fréquemment présente chez des personnes
malades, il est parfois difficile d’établir de façon définitive la responsabilité de S. maltophilia
dans les infections (Denton & Kerr, 1998).
La présence de P. aeruginosa et S. maltophilia a également été rapportée à de nombreuses
reprises sur les mains et peut être à l’origine d’une transmission manu-portée (Adams &
Marrie, 1982). En effet, le portage de ces bactéries par les mains du personnel soignant des
hôpitaux peut constituer une source d’infection potentielle (Villarino, et al., 1992, Lasheras, et
al., 2006). L’hygiène des mains et le port de gants sont ainsi indispensables afin d’éviter la
transmission.
- 38 -
 Infections causées par P. aeruginosa et S. maltophilia
P. aeruginosa et S. maltophilia sont capables de causer différentes pathologies chez
l’Homme (Tableau 2). Toutefois, la majorité des infections causées par ces pathogènes est
recensée au sein des personnes présentant une défaillance de leur système immunitaire,
personnes hospitalisées, immunodéprimées (greffe, VIH…), personnes atteintes de cancer ou
diabétiques… Elles infectent rarement les tissus sains et envahissent aisément les tissus où les
défenses sont compromises et sont de ce fait fréquemment responsables d’infections
nosocomiales. Ces bactéries sont considérées comme invasives et toxigènes du fait de la
présence de facteurs de virulence qui vont leur permettre de s’attacher, coloniser et envahir les
tissus ainsi que de sécréter des composés toxiques. Ces facteurs de virulence seront détaillés
dans le paragraphe III-1-a.
En ce qui concerne P. aeruginosa, les mortalités les plus élevées sont observées en cas de
bactériémie (30-50 %) et en cas de pneumonie nosocomiale (45-70 %) (Mesaros, et al., 2007).
Les bactériémies les plus fréquentes sont observées chez les patients neutropéniques
(diminution des leucocytes), les patients en état d’immunodéficience en relation avec une
infection par le virus HIV, chez les diabétiques ou chez les brûlés. Cette bactérie est un
colonisateur fréquent des voies respiratoires et causent des infections chez les patients
souffrant de bronchectasies et de broncho-pneumopathie obstructive, les patients soumis à une
chimiothérapie anticancéreuse et présentant une neutropénie, chez les patients nécessitant le
placement en soins intensifs ou chez les patients sous assistance respiratoire (ventilation
assistée). Elle est également fréquemment retrouvée chez les personnes atteintes de
mucoviscidose (cf. paragraphe suivant). De plus, P. aeruginosa est de plus en plus impliquée
dans les pneumonies communautaires, c'est-à-dire acquises en dehors de l’hôpital. Toutefois,
ces infections communautaires touchent préférentiellement des personnes fragilisées,
immunodéprimées ou présentant des troubles respiratoires (Garau & Gomez, 2003).
P. aeruginosa est la troisième cause d’infections urinaires acquises à l’hôpital (12 %), le plus
souvent consécutives à des cathéterisations, des instrumentations ou une chirurgie (Obritsch,
et al., 2005). Ce pathogène opportuniste cause rarement de vraies infections du système
digestif. Toutefois, des infections péri-rectales, des gastro-entérites typiques, et des
entérocolites nécrosantes ont été rapportées. Les infections cutanées et osseuses sont rares
mais peuvent survenir suite à des blessures pénétrantes.
- 39 -
Tableau 2. Infections causées par P. aeruginosa et S. maltophilia. D’après Mésaros et al.,
2007 ; Denton et Kerr, 1998.
Site d'infection Pathologie spécifique Fréquence

Tractus respiratoire Pneumonie aigue Fréquent
Infections chroniques
Sang Bactériémie Fréquent
Septicémie
Tractus urinaire Infections aigues Relativement fréquent
Infections chroniques
Oreille Otite externe Fréquent
Otite moyenne chronique
Peau et tissu mou Dermatite Relativement fréquent
Infection de plaies
Infections de brûlure
Pyodermite
Folliculite
acne vulgaris résistant
Œil Kératite Rare
Enophtalmie
Ophtalmie néonatale
Conjonctivite
Système nerveux central Méningite Rare
Abcès cérébral
Cœur Endocardite Rare
Os et articulations Pyoarthrose sténoarticulaire Rare
Ostéomyélite vertébrale
Infection de la symphise
pubienne
Ostéochondrite du pied
Ostéomyélite
Tractus gastro-intestinal Entérocolite nécrosante Rare
Infections périrectales
Péritonite
- 40 -
P. aeruginosa peut causer des infections ophtalmiques dévastatrices telles que des kératites
bactériennes chez les porteurs de lentilles de contact par exemple (Mesaros, et al., 2007).
Cette bactérie est également l’agent causal prédominant dans les otites malignes des patients
diabétiques et les «otites du nageur» (une forme particulière d’otite externe) (van Asperen, et
al., 1995).
Des méningites et des abcès cérébraux se propageant depuis des structures voisines ou
consécutifs à des traumatismes ou des procédures diagnostiques invasives, ainsi que des
endocardites notamment chez les utilisateurs de drogues intraveineuses ont également été
rapportés (Veber, 2003).
En ce qui concerne S. maltophilia, les bactériémies sont également fréquentes et semblent en

augmentation ces dernières années. Le taux de mortalité lié à ces bactériémies peut être élevé
(environ 25 %) (Senol, et al., 2002). Elles peuvent être contractées à la suite d’infections
pulmonaires, urinaires ou gastro-intestinales mais de plus en plus d’études mettent en cause
l’utilisation d’intraveineuse comme source primaire de l’infection (Muder, et al., 1996). S.
maltophilia est responsable de 5 % des pneumonies nosocomiales et les voies respiratoires
constituent le site le plus commun d’isolement de cette bactérie (plus de 50 % des isolats
cliniques de S. maltophilia) (Denton & Kerr, 1998, Schaumann, et al., 2001). Ces infections
sont favorisées par l’utilisation de matériel d’assistance respiratoire, par la pratique de
trachéotomies, par l’exposition à des antibiotiques à large spectre et sont associées à un fort
taux de mortalité avec ou sans traitement anti-S. maltophilia (Pathmanathan & Waterer,
2005).
La responsabilité de S. maltophilia dans des endocardites a été mentionnée à de nombreuses
reprises. Dans la plupart des cas, ces endocardites sont survenues chez des utilisateurs de
drogues en intraveineuse ou à la suite d’une chirurgie cardiaque. Les méningites causées par
S. maltophilia sont rares et sont toujours liées à une neurochirurgie ou à la présence de
matériel clinique étranger. Elle est également rarement responsable d’infections gastro-
intestinales. De même, les infections urinaires dues à S. maltophilia sont rares et sont
généralement contractées à la suite d’une intervention chirurgicale ou une cathéterisation.
Cette bactérie est responsable d’infections oculaires telles que des conjonctivites, des kératites
et des ulcères de la cornée chez les porteurs de lentilles de contact ou contractées suite à
l’extraction d’une cataracte. Cette bactérie est fréquemment isolée de lésions de la peau,
toutefois le lien avec la pathologie est difficile à établir (Denton & Kerr, 1998).
- 41 -
Figure 10. Prévalence des infections bactériennes chez les patients atteints de mucoviscidose
en fonction de l’âge (Harrison et al., 2007).
Figure 11. Co-infections rapportées dans les poumons de patients CF. A, Aspergillus spp.;
AV, adenovirus; AX, A. xylosoxidans; BP, bacteriophage; C, Candida spp.; Ent,
Enterobacteria; IPV, influenza and/or parainfluenza virus; K, Klebsiella spp.; M,
mycoplasma; MA, Mycobacterium abscessus; N, Neisseria spp.; OF, oropharyngeal flora;
RSV, respiratory syncytial virus; SM, S. maltophilia (Harrison et al., 2007).
- 42 -
Un certain nombre de points communs entre les deux modèles a pu être mis en évidence dans
cette section. Ces bactéries sont des pathogènes opportunistes majeurs de part leur implication
dans un grand nombre d’infections nosocomiales. En particulier, elles sont fréquemment
impliquées dans des bactériémies et semblent avoir des capacités importantes à coloniser et
établir des pathologies dans les voies respiratoires des patients fragilisés. Elles semblent
moins souvent à l’origine d’infections touchant d’autres systèmes ou organes mais les
pathologies associées restent graves.
 P. aeruginosa et S. maltophilia chez les personnes atteintes de

mucoviscidose
La mucoviscidose est la maladie génétique grave la plus fréquente en France et le
nombre de nouveaux cas par an est compris entre 160 et 200. C’est une maladie létale,
toutefois grâce au progrès de la médecine, l'espérance de vie est aujourd'hui de 40 ans alors
qu'elle n'était que de 5 ans dans les années soixante. Cette affection est liée à des mutations du
gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator), situé sur le chromosome 7 et qui
code pour une protéine nommée Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Une
anomalie dans cette protéine entraîne un dysfonctionnement généralisé des glandes exocrines
ce qui provoque un épaississement des sécrétions muqueuses et une richesse de la sueur en
chlore et en sodium. Les manifestations cliniques les plus souvent rencontrées sont
respiratoires et digestives. Toutefois, des manifestations pancréatiques, hépatiques et génitales
(stérilité) peuvent être observées.
Au niveau du système respiratoire, l’épaississement du mucus va empêcher le fonctionnement

normal des cils vibratoires empêchant l’élimination des particules étrangères aboutissant
progressivement à une obstruction des voies respiratoires. L’élimination des microorganismes
(bactéries, virus, champignons) n’est également pas réalisée, ce qui entraîne le développement
dans un premier temps d’infections aigues auxquelles succèdent bien souvent des infections
chroniques, pouvant dans les deux cas entraîner la mort du malade. Différentes bactéries sont
impliquées dans ces infections et leur prévalence varie en fonction de l’âge du patient (Figure
10). De plus, les co-infections sont communes avec en moyenne 2,9 espèces bactériennes
pathogènes par patient (Figure 11) (Harrison, 2007).
- 43 -
La bactérie la plus fréquemment isolée d’expectorations de patients atteints de mucoviscidose
est P. aeruginosa. Soixante dix à 80 % des patients atteints de mucoviscidose sont colonisés
par cette bactérie. L’origine des souches restent dans la plupart des cas inconnue. Les sources
probables sont l’environnement du malade, la transmission de patient à patient ou via des
objets contaminés. P. aeruginosa peut apparaître très tôt et est isolée de façon intermittente au
cours de l’enfance. Une infection chronique peut se développer conduisant rapidement à une
détérioration des poumons. Toutefois, l’utilisation d’un traitement antibiotique adapté dès le
premier isolement peut conduire à retarder la mise en place de l’infection chronique. Ce type
de traitement n’est cependant pas efficace sur toutes les souches, en particulier, il n’a pas
d’effet sur les clones épidémiques présentant des multi-résistances tels que les clones
épidémiques de Liverpool (souches LES) (Foweraker, 2009). Il semble également que les
souches isolées de patients atteints de mucoviscidose ont une grande capacité d’adaptation à
leur environnement. Certaines sont notamment qualifiées d’hypermutables du fait de
mutations sur les gènes impliqués dans la réparation de l’ADN. Des mutations induisant des
résistances aux antibiotiques vont alors être sélectionnées sous la pression antibiotique forte
(Oliver, et al., 2000). S. maltophilia, quant à elle est de plus en plus fréquemment isolée des
expectorations de personnes atteintes de mucoviscidose (Emerson, et al., 2010). Cette
présence est plutôt intermittente et n’est que rarement associée avec une détérioration des
poumons. Il est également intéressant de noter que les co-infections avec P. aeruginosa sont
fréquentes (Goss, et al., 2004).
II- Génome et structure génétique des populations de P. aeruginosa et S.

maltophilia
Le génome de différentes souches de P. aeruginosa et S. maltophilia a été récemment

séquencé. L’analyse et la comparaison de ces génomes a permis de mieux comprendre les
capacités d’adaptation de ces bactéries. De plus, différentes études de diversité ont montré
d’une part, une grande diversité dans les populations au sein d’un même écosystème et d’autre
part, la capacité de certains clones à coloniser un grand nombre d’écosystèmes différents.
- 44 -
II-1- Structure génétique des populations
Les méthodes et techniques de génétique des populations, appliquées depuis les années
90 aux bactéries ont permis de définir trois types de structure génétique des populations
bactériennes. Les premières études ont montré que les populations de la plupart des espèces
bactériennes étaient structurées de façon clonale, présentant peu de génotypes différents parmi
les nombreux possibles. Ce type de structure repose sur un faible taux de recombinaison de
larges segments chromosomiques qui est insuffisant pour que les associations d’allèles soient
faites au hasard et que l’association clonale soit ainsi supprimée. L’étude de Maynard Smith
et collaborateurs a montré que certaines populations bactériennes pouvaient également être
panmictiques, avec des associations d’allèles faites au hasard, conduisant à la présence de
nombreux génotypes différents au sein d’une même population ; ou bien épidémiques, dans
lesquelles l’association des allèles se fait majoritairement au hasard dans une population avec
certaines associations qui dominent, entrainant l’émergence de clones majoritaires (Smith, et
al., 1993).
La structure génétique des populations de P. aeruginosa a fait l’objet de nombreuses études
dont les conclusions ont évolué au cours du temps. En 2000, Kiewitz et Tummler ont
investigué la structure génétique de P. aeruginosa par multilocus sequence typing (MLST).
Pour cela, 6 gènes choisis selon 3 critères : une position chromosomique, des fonctions de
ménage et accessoires, des localisations différentes de leur produit, ont été amplifiés et
séquencés chez 19 souches de P. aeruginosa d’origine environnementale (aquatique) et
clinique. Cette étude a mis en évidence un faible taux de substitution de nucléotides ainsi
qu’un fort taux de recombinaison entre les différents génotypes de P. aeruginosa, entrainant
une association au hasard des allèles et suggérant ainsi une structure panmictique de la
population (Kiewitz & Tummler, 2000). Il est intéressant de noter que les différents génotypes
sont présents dans les différents environnements colonisés par P. aeruginosa. Autrement dit,
il ne semble pas y avoir de spéciation ou adaptation des différents clones au milieu clinique
ou à l’environnement. Les différents clones seraient ainsi tous capables de coloniser
différentes niches.
En revanche, les études plus récentes seraient plutôt en faveur de l’hypothèse d’une structure
épidémique des populations de P. aeruginosa. En 2002, une étude de Pirnay et collaborateurs
menée sur 73 souches d’origine variée et utilisant quatre méthodes de typage différentes, est
l’une des premières à suggérer une structure épidémique. Les résultats obtenus ont montré une
organisation en mosaïque du génome de P. aeruginosa constitué de régions fortement
- 45 -
conservées et de régions variables, suggérant une structure panmictique de la population.
Toutefois, certains complexes clonaux définis par des caractéristiques communes malgré des
origines différentes, ont été majoritairement trouvés (Pirnay, et al., 2002). Des études utilisant
des techniques de PFGE après digestion avec l’enzyme de restriction SpeI, d’analyse de single
nucleotide polymorphism (SNP) ainsi que le séquençage de génome complet par shotgun ont
étayé cette hypothèse (Spencer, et al., 2003, Morales, et al., 2004). Ces études ont également
mis en évidence l’implication de la structure du génome de P. aeruginosa dans la variabilité
des différents génotypes observés. En particulier, les échanges d’éléments génétiques mobiles
par transferts horizontaux seraient à l’origine du fort taux de recombinaison, induisant une
structure non clonale.
Parmi les clones retrouvés à plusieurs reprises dans des environnements très différents, le
clone C a fait l’objet de nombreuses études. Notamment, l’étude menée par Romling et
collaborateurs a mis en évidence la présence de ce clone chez des patients atteints ou non de
mucoviscidose, dans l’environnement clinique et dans différents environnements aquatiques
séparés d’environ 300 km des hôpitaux (Romling, et al., 1994). De plus, ce clone est
dominant dans les différents écosystèmes étudiés, représentant entre 7 et 28 % de la
population présente. Les raisons du succès de ce clone dans la colonisation de différents
écosystèmes restent à ce jour à élucider, il ne serait toutefois pas lié à une meilleure capacité à
former des biofilms ou bien à des résistances aux antibiotiques particulières (Romling, et al.,
2005).
Enfin, en 2007, les travaux de Wiehlmann et collaborateurs menée sur 240 souches cliniques
et environnementales de P. aeruginosa par analyse de séquences amplifiées hybridées sur
puce à ADN suggèrent que ces souches se divisent en deux grands groupes et 45 complexes
clonaux constitués de quelques souches indépendamment de leur origine, chaque complexe
préférant une association particulière du génome conservé et du génome accessoire
(Wiehlmann, et al., 2007). Cette étude suggère également que les zones de fort taux de
recombinaison sont présentes dans le génome accessoire mais également dans le génome
conservé.
Un consensus semble toutefois avoir été trouvé. La structure génétique de la population de P.
aeruginosa serait non clonale et épidémique. Les isolats cliniques et environnementaux
seraient indifférenciables et il n’y aurait pas de clone adapté à des environnements particuliers
tels que le milieu clinique. La structure de son génome, organisé en génome « cœur »
fortement conservé, ponctué d’éléments génétiques mobiles tels que les ilots génomiques
échangés entre souches par transfert horizontal, serait à l’origine de la diversité observée.
- 46 -
Toutefois, certaines interrogations demeurent. En particulier, cette hypothèse semble difficile
à vérifier si on s’intéresse à certains clones isolés de patients atteints de mucoviscidose, qui
semblent présenter des adaptations particulières à l’environnement constitué par les poumons
et qui sont transmis et se répandent au sein des populations de malades. De même, certaines
souches multi-résistantes aux antibiotiques émergent et persistent dans le milieu clinique en
particulier dans les unités de soins intensifs où une forte pression antibiotique est appliquée.
Une étude récente de Pirnay et collaborateurs a eu pour objectif de compléter leur étude
réalisée en 2002 et de reconsidérer la structure génétique de la population de P. aeruginosa en
intégrant ces clones particuliers (Pirnay, et al., 2009). Pour cela, leurs travaux ont été menés
sur 328 isolats collectés au cours des 125 dernières années, de différents habitats cliniques et
environnementaux dans 69 localités de 30 pays sur les 5 continents. Différentes analyses ont
été réalisées sur ces souches telles que l’analyse du sérotype, une analyse génotypique par
fluorescent amplified-fragment length polymorphism (FAFLP) ou encore le séquençage de
gènes codant pour des protéines membranaires. L’ensemble des résultats obtenus confirme
une structure génétique épidémique non clonale de la population de P. aeruginosa dans
laquelle les recombinaisons sont fréquentes, avec des souches d’origines différentes pouvant
présenter le même génotype et dans laquelle certains clones épidémiques particulièrement
performants émergent. De plus, aucune preuve en faveur de clone sélectionné, transmis au
sein des populations de patients atteints de mucoviscidose n’a pu être mise en évidence.
En ce qui concerne S. maltophilia, le niveau de connaissance n’est pas le même que pour P.
aeruginosa. Toutefois, différentes études de diversité ont été réalisées. Notamment, l’étude de
Berg et collaborateurs, menée sur 40 souches de S. maltophilia isolées de patients ou de
l’environnement (milieu aquatique ou associées aux plantes) a été réalisée par des méthodes
phénotypiques telles que l’évaluation de la résistance aux antibiotiques et de différentes
activités métaboliques, ainsi que des méthodes génotypiques telles que la PFGE après
digestion avec l’enzyme de restriction DraI (Berg, et al., 1999). Les résultats obtenus
suggèrent une grande diversité entre les souches testées. Aucune différence au niveau des
résistances aux antibiotiques ne semble exister entre souches d’origine clinique et souches
d’origine environnementale. De même, l’analyse de l’ensemble des résultats phénotypiques et
génotypiques ne révèle pas de groupement de souches en fonction de leur origine. Ainsi, tout
comme il l’a été envisagé pour P. aeruginosa, les différents clones de S. maltophilia seraient
capables de coloniser différentes niches écologiques et ne seraient pas inféodés à des milieux
particuliers tel que le milieu clinique.
- 47 -
De plus, une étude plus récente a montré que la diversité au sein de la population de S.
maltophilia d’un même hôpital était très élevée (Valdezate, et al., 2004). L’analyse génétique
par PFGE après restriction avec l’enzyme XbaI de 139 souches issues de patients atteints de
mucoviscidose, des services de soins intensifs, de chirurgie et de l’environnement d’un même
hôpital a permis d’identifier 99 profils différents. Ces profils sont répartis dans cinq grands
clusters dont deux majoritaires, indépendamment de l’origine des souches. Toutefois, la
présence de certains clones retrouvés à la fois chez différents patients ainsi que sur du
matériel médical suggère une origine commune à différentes infections. Ainsi, une importante
diversité est observée au sein de la population de S. maltophilia issue d’un même hôpital
certainement du fait de la versatilité et de la grande adaptabilité de cette bactérie avec la
possibilité de transmission de quelques clones pouvant conduire à des épidémies.
Même si aucune hypothèse sur la structure génétique de S. maltophilia n’est émise dans ces
études, les résultats obtenus seraient plutôt en faveur d’une structure panmictique ou
épidémique du fait de l’importante diversité obtenue et de l’émergence parfois de certains
clones dans le milieu clinique.
II-2- Le génome de P. aeruginosa et S. maltophilia
Les génomes de 4 souches de P. aeruginosa sont à ce jour disponible. Ces souches,

toutes d’origine clinique, ont été choisies pour leur différent niveau de virulence et les types
de pathologies qu’elles entrainent. La première souche à avoir été séquencée est la souche
PAO1 (Stover, et al., 2000). Cette souche, isolée d’une blessure, est la plus utilisée en
laboratoire et est de ce fait considérée comme la souche de référence de P. aeruginosa. La
deuxième souche à avoir été séquencée est la souche PA14, également isolée d’un patient,
présentant une plus forte virulence que PAO1 à la fois chez l’Homme et dans différents
modèles d’hôtes notamment le modèle murin et les plantes (He, et al., 2004). La souche
LESB58 appartenant au groupe des LES (pour Liverpool Epidemic Strains) a également été
séquencée (Winstanley, et al., 2009). Ces souches ont la particularité d’être les plus souvent
isolées des patients atteints de mucoviscidose au Royaume Unis et en Australie. De plus, elles
sont fréquemment responsables de surinfections, sont associées à une plus forte mortalité que
les autres souches de P. aeruginosa et présentent des capacités élevées de survie sur les
surfaces sèches. Ces souches présentent également un phénotype inhabituel, produisant des
facteurs de virulence très tôt dans la courbe de croissance, ce sont également des souches
- 48 -
hyper-productrices de biofilm et qui mutent assez facilement pour acquérir des résistances aux
antibiotiques les plus utilisés en thérapie tels que les carbapénèmes (méropénème), les
monobactames (aztréonam), les aminoglycosides (tobramycine) et les quinolones
(ciprofloxacine). Enfin, la dernière souche à avoir été séquencée est la souche PA7 (Roy, et
al., 2010). Cette souche est un isolat clinique non pulmonaire d’Argentine. Elle est
particulièrement intéressante du fait qu’elle présente un profil de résistance aux antibiotiques
inhabituel avec une importante capacité de résistance aux céphalosporines de 3ème génération
(ceftazidime), aux monobactames et quinolones. De plus, le séquençage d’un certain nombre
de gènes de ménage ou codant pour des résistances montrent que cette souche forme un clade
à part au sein de la phylogénie de P. aeruginosa. Plusieurs autres génomes ont été séquencés
dans un but de comparaison de génomes. Toutes ces souches ont une origine clinique et aucun
génome de souches environnementales n’est à ce jour disponible.
En ce qui concerne S. maltophilia, 2 génomes ont été récemment séquencés. Le premier est
celui de la souche d’origine clinique K279a (Crossman, et al., 2008). Cette souche a été isolée
du sang d’un patient sous chimiothérapie qui a développé une bactériémie pour laquelle la
thérapie avec différents antibiotiques tels que la pipéracilline associée au tazobactam, le
ceftazidime et l’imipénème n’a eu aucun effet. Cette souche, phylogénétiquement rattachée à
S. maltophila et présentant un phénotype de résistance aux antibiotiques classique a été
considérée comme un bon représentant de l’espèce pour le séquençage du génome. Le
deuxième génome disponible est celui d’une souche environnementale endophyte du peuplier
(Taghavi, et al., 2009). Cette souche a été séquencée dans le but de mieux appréhender les
mécanismes induisant une stimulation de la croissance des plantes. Pour cela, plusieurs
génomes de bactéries endophytes du peuplier et du saule appartenant à la classe des -
protéobactéries ont été séquencés et comparés, parmi lesquels celui de la souche de S.
maltophilia R551-3.
La comparaison des différents génomes séquencés a permis de mieux comprendre

l’organisation des génomes et d’identifier les gènes indispensables aux deux modèles pour
leur survie et les gènes qui vont améliorer leur adaptation aux différents environnements
rencontrés et la réussite des interactions établies avec les autres organismes vivants.
- 49 -
II-2-a- Structures des génomes
Les génomes bactériens sont constitués d’une partie fortement conservée au sein de
l’espèce, cette part du génome est appelé génome cœur. Les gènes présents dans le génome
cœur sont considérés comme indispensables à la survie et à la multiplication de la bactérie
dans son habitat. Au sein de ce génome cœur, s’intègre des parties non conservées, souches
spécifiques qui peuvent avoir été acquises par transfert horizontal. Cette partie du génome est
appelée génome accessoire, elle regroupe des gènes non essentiels à la survie de la bactérie
mais qui lui permettrait une meilleure adaptation à son environnement.
Le génome de P. aeruginosa est constitué par un chromosome circulaire, il est caractérisé par
un haut taux en GC (environ 66 %), une grande taille, variant de 5,2 à 7 Mbp et possède entre
5500 et 6200 cadres ouverts de lecture (ORF pour Open Reading Frames) (Tableau 3).
Tableau 3. Caractéristiques générales des génomes séquencés de P. aeruginosa (Roy et al,

2010).
Les études de comparaison de génomes suggèrent que son génome est organisé en mosaïque,
constitué de blocs de gènes conservés entre les souches, interrompus par des blocs de gènes
spécifiques de chaque souche (Mathee, et al., 2008, Roy, et al., 2010). Ces derniers sont
- 50 -
insérés dans des zones précises, souvent au niveau des ARN de transfert. Le génome cœur
représente environ 90 % du génome de P. aeruginosa. Le génome accessoire de P.
aeruginosa est constitué de zones où sont insérés les segments d’ADN accessoires, appelés
régions de plasticité génomique (Figure 12). Selon Mathee et collaborateurs (Mathee, et al.,
2008), ces zones sont caractérisées par la présence de séquences souches spécifiques d’au
moins 4 ORFs, flanquées de séquences d’ancrage conservées et sont absentes chez au moins
une souche. Ces zones englobent les séquences issues de phages, les ilots génomiques ou des
séquences perdues par une ou plusieurs souches. La taille du génome accessoire est variable
d’une souche à l’autre, allant d’une dizaine de régions de plasticité génomique chez PAO1 à
51 chez PA7.
Figure 12. Comparaisons des génomes séquencés de P. aeruginosa. Le génome cœur est
constitué de 4890 gènes, commun aux 4 souches séquencées. La taille du génome accessoire
varie en fonction de la souche avec un minimum de 110 ORFs chez PAO1 et un maximum de
1008 ORFs chez PA7 (Roy et al., 2010).
Dans la suite de cette partie nous apporterons un intérêt particulier aux ilots génomiques. Ces
ilots sont fréquemment acquis par transfert horizontal, leur pourcentage en GC diffère de celui
du reste du génome, de même que l’usage des codons (toutefois, ces différences peuvent être
moins évidentes si l’acquisition est ancienne). Ces ilots sont fréquemment encadrés par des
hotspots de recombinaison ou insertion type ARNt ou séquences répétées inversées (Figure
13).
- 51 -
Figure 13. Modèle schématique d’un ilot génomique bactérien (Hacker & Carniel, 2001).
Le génome de S. maltophilia est également constitué d’un seul chromosome circulaire et est
caractérisé par un haut pourcentage en GC (environ 67 %). Les génomes des souches K279a
et R551-3 ont un pourcentage en GC similaire mais présentent des longueurs variables, celui
de K279a étant plus long (4,8 Mbp) que celui de R551-3 (4,5 Mbp). Malgré cette différence,
l’organisation des génomes est semblable, la synthénie est élevée et les séquences s’alignent
parfaitement sur toute leur longueur (Figure 14). De plus, on observe que 85 % des gènes sont
communs entre les deux souches. La variabilité entre les souches s’explique surtout par la
présence de nombreux ilots génomiques. En effet, 41 ilots ont été identifiés chez la souche
K279a et 36 chez la souche R551-3 (Rocco, et al., 2009).
Figure 14. Comparaison des génomes séquencés de S. maltophilia (Ryan et al., 2009).
- 52 -
II-2-b- Composition des génomes cœur et accessoire
Le séquençage des différentes souches de P. aeruginosa a permis de mettre en

évidence la présence de certains gènes codant pour des fonctions particulièrement importantes
pour la survie et la multiplication de P. aeruginosa ainsi que pour son adaptation à différents
environnements et différents hôtes.
Le séquençage du génome de la souche PAO1 a notamment révélé la présence d’un grand
nombre de gènes impliqués dans la régulation (Stover, et al., 2000). En effet, 468 ORFs
présentent des motifs caractéristiques de régulateurs transcriptionnels ou de senseurs de
l’environnement. La forte prévalence de ces gènes s’expliquent d’une part par la taille
importante du génome de cette bactérie et d’autre part, par le besoin de s’adapter à différents
environnements ou modifications environnementales. Ainsi, à taille de génome équivalent,
certaines espèces inféodées à des niches écologiques étroites telles que Mycobacterium
tuberculosis (pathogène strict) ne présente pas plus de 3 % de gènes impliqués dans la
régulation alors que chez P. aeruginosa, cette proportion atteint 8,4 % des gènes. De plus,
différentes études sont en faveur de l’hypothèse selon laquelle la versatilité et la grande
capacité d’adaptation de P. aeruginosa seraient liée à ses capacités de régulation plutôt qu’à
l’acquisition d’éléments génétiques mobiles de type plasmide ou transposon (Rodrigue, et al.,
2000, Gooderham & Hancock, 2009). On remarque également la présence d’un grand nombre
de gènes codant pour des protéines membranaires. Ces dernières sont impliquées dans
différentes fonctions indispensables à tout organisme telles que l’apport de nutriments mais
également à des fonctions liées au mode de vie d’une bactérie pathogène opportuniste telle
que P. aeruginosa comme par exemple, l’efflux de molécules toxiques, en particulier
d’antibiotiques, l’exportation de facteurs de virulence ou la reconnaissance par l’hôte. Ces
gènes, appartenant au génome cœur de P. aeruginosa sont fortement conservés au sein des
génomes séquencés. Toutefois, certains gènes codant pour des fonctions majeures présents
dans le génome cœur sont absents ou altérés chez certaines souches séquencées. L’absence de
fonction peut parfois être corrélée au mode de vie de la bactérie. Par exemple, l’absence de
flagelles chez la souche LESB58, liée à des variations sur le gène codant pour les protéines
impliquées dans leur synthèse, est associée à une faible agressivité (Winstanley, et al., 2009).
En effet, la perte des flagelles, responsable de la réponse inflammatoire des cellules
épithéliales, lui permet de passer inaperçu aux yeux du système immunitaire de l’hôte. Elle est
de ce fait plus compétitive par rapport à des souches plus agressives telles que PAO1 ou
PA14.
- 53 -
En ce qui concerne le génome accessoire de P. aeruginosa, les séquençages ont mis en
évidence un grand nombre d’ilots génomiques. Une grande proportion des gènes présents sur
ces ilots ont une fonction inconnue. Toutefois, l’implication de certains d’entre eux dans la
virulence ou la résistance à des composés toxiques pour la bactérie tels que les antibiotiques
ou les métaux a pu être mise en évidence. Notamment, le séquençage de la souche PA14 a
permis d’identifier deux ilots génomiques impliqués dans la pathogénicité de cette souche, ces
ilots ont été nommés PAPI-1 et PAPI-2 pour Pseudomonas aeruginosa pathogenicity island 1
et 2 (He, et al., 2004). Des mutations dans ces ilots n’altèrent pas les capacités de survie et de
multiplication de la bactérie mais diminuent sa virulence dans le modèle murin et la plante. La
plupart des gènes présents sur ces ilots n’ont pas de fonction connue. Toutefois, certaines
ORFs semblent impliquées dans l’adhésion ou la sécrétion de facteurs de virulence. De plus,
la mise en évidence d’homologies avec des séquences présentes dans les génomes d’autres
bactéries pathogènes telles que Yersina pestis ou Salmonella enterica en particulier en ce qui
concerne PAPI-1, est en faveur de l’implication de cet ilot dans la virulence. Ceci suggère
également une organisation en mosaïque et l’acquisition en plusieurs fois des éléments
composant cet ilot. Différents ilots semblent également impliqués dans la résistance à
différents composés toxiques. En particuliers, plusieurs gènes impliqués dans la résistance à
des antimicrobiens sont retrouvés sur des ilots de la souche PA7, tels que les gènes permettant
la résistance au sulfonamide, aux aminoglycosides (streptomycine, kanamycine) et au
chloramphénicol (Roy, et al., 2010). La présence de ces gènes sur des ilots potentiellement
acquis par transfert horizontal peut expliquer le phénotype de résistance particulier de cette
souche par rapport aux autres souches de P. aeruginosa. Des gènes de résistance aux métaux
ont également été mis en évidence sur des ilots. Notamment, l’opéron mer, responsable de la
résistance au mercure est présent chez les souches PA14, PA7 et LESB58. D’autres ilots
semblent impliqués dans l’interaction avec l’hôte tel que celui codant pour la synthèse d’un
système de sécrétion de type II présent chez PA7 ou dans l’amélioration de la compétitivité tel
que celui responsable de la synthèse d’un antifongique : la pyolutéroïne chez LESB58.
D’autres ilots génomiques ont été identifiés chez d’autres souches de P. aeruginosa et ont fait
l’objet d’études plus approfondies. Ainsi, 11 ilots, nommé PAGI-1 à PAGI-11 (PAGI pour
Pseudomonas aeruginosa genomic island) ont été mis en évidence (Liang, et al., 2001,
Larbig, et al., 2002, Klockgether, et al., 2004, Battle, et al., 2008). Parmi ces ilots, PAGI-2,
mis en évidence dans le clone C, est certainement le plus connu. Cet ilot serait impliqué dans
- 54 -
différentes fonctions métaboliques et de transport telles que la biosynthèse du cytochrome c
ainsi que dans la résistance au cuivre et au mercure (Klockgether, et al., 2004). La présence
de gènes codant pour la synthèse du cytochrome c chez une souche isolée de patients atteints
de mucoviscidose peut s’expliquer par l’utilité pour la bactérie de faciliter sa prise en fer et
d’inactiver le peroxyde d’hydrogène dans les poumons où les bactéries sont soumises à un
stress oxydatif et une limitation en fer. En revanche, la présence de gènes de résistance aux
métaux ne semble pas représenter un avantage dans ces conditions. La présence de cet ilot et
de ces gènes en particulier chez des souches environnementales de P. aeruginosa mais
également chez d’autres espèces semblent plus pertinente. Notamment, cet ilot est également
retrouvé chez Cupriavidus metallidurans CH34, bactérie isolée d’une citerne de décantation
contenant de fortes concentrations en métaux lourds et connue pour ses grandes capacités de
résistance. La présence de l’ilot dans des espèces différentes est en faveur de sa mobilité et de
son acquisition par transfert horizontal. Toutefois, Klockgether et collaborateurs ont montré
que le taux d’excision de cet ilot est faible, de ce fait les échanges semblent peu fréquents
(Klockgether, et al., 2007). L’ilot PAGI-5, isolé de la souche clinique PSE9, a montré quant à
lui une implication dans la virulence. Cet ilot est formé de deux parties, l’une fortement
homologue à PAPI-1 et la deuxième, constituée de nouvelles séquences. L’absence de cette
dernière partie diminue fortement la virulence de la souche (Battle, et al., 2008).
Ainsi, le génome de P. aeruginosa est constitué d’un génome cœur fortement conservé,
correspondant à environ 90 % du génome total. Parmi les gènes identifiés dans ce génome
cœur, on retrouve, en plus des gènes indispensables à la bactérie, des gènes impliqués dans la
réussite des interactions à la fois avec son environnement et différents hôtes, tels que les
gènes de résistance et de virulence. Le génome accessoire de P. aeruginosa, majoritairement
constitué d’ilots génomiques, semble lui conféré des capacités particulières permettant à la
bactérie d’améliorer ses conditions de survie en lui conférant des résistances ou des facteurs
de virulence supplémentaires.
Chez S. maltophilia, on remarque que le génome cœur représente également une forte
proportion du génome total (85 %). Il comprend les gènes essentiels à la multiplication et au
métabolisme de la bactérie mais également des gènes de résistance à différents composés
toxiques, ainsi que des gènes potentiellement impliqués dans la colonisation de l’hôte et dans
le succès de l’interaction (Ryan, et al., 2009). Trente sept gènes ou opérons ont été identifiés
comme potentiellement impliqués dans la résistance à des composés toxiques au sein des deux
génomes séquencés. Parmi ces gènes, 24 sont conservés dans les deux génomes et seulement
- 55 -
13 sont présents chez l’une ou l’autre des souches. On remarque qu’un grand nombre de ces
gènes code pour des pompes à efflux non spécifiques, en particuliers des pompes de type
RND (Resistance Nodulation cell Division). Des gènes codant pour des systèmes plus
spécifiques seraient également présents, permettant notamment la résistance à des
antibiotiques de la famille des aminoglycosides, quinolones, macrolides ou encore -
lactamines. D’autres gènes semblent impliqués plus particulièrement dans la résistance aux
métaux lourds tels que le zinc, cadmium, cobalt, cuivre ou arsenic. Plusieurs gènes
potentiellement impliqués dans la formation de pili, notamment des pili de type I et IV sont
également présents chez les deux souches. Des systèmes homologues présents chez d’autres
espèces bactériennes pathogènes de plantes ou de l’Homme, interviennent dans la formation
de biofilms, dans l’adhérence, la motilité ou la pathogénicité, suggérant un rôle important de
ces gènes dans l’interaction de S. maltophilia avec ses différents hôtes. Ainsi, l’absence de
réarrangement majeur au sein des génomes des deux souches ainsi que la forte proportion de
gènes conservés entre K279a et R551-3 suggèrent que toutes les souches de S. maltophilia
sont capables de s’adapter à un large panel d’environnements et d’établir des interactions avec
différents organismes. De plus, la présence de gènes potentiellement impliqués dans la
résistance et la colonisation, à l’origine du succès de S. maltophilia en tant que pathogène
opportuniste, à la fois chez une souche clinique et une souche environnementale suggère une
polyvalence des souches quelle que soit leur origine. Ainsi, toutes les souches de S.
maltophilia seraient intrinsèquement capables de survivre dans le milieu hospitalier et le fort
niveau de résistance observé chez les souches d’origine clinique n’aurait pas été acquis sous
la pression antibiotique présente mais serait une propriété intrinsèque de l’espèce.
La source majeure de variation des génomes de S. maltophilia est représentée par la présence
ou l’absence d’ilots génomiques. En effet, chaque génome est ponctué d’environ 40 ilots,
aucun n’est commun aux deux souches mais certains peuvent porter les mêmes fonctions
(Rocco, et al., 2009). On remarque que certaines fonctions sont redondantes de celles du
génome cœur, suggérant une importance particulière de ces fonctions (Tableau 4).
- 56 -
Tableau 4. Ilots génomiques de fonction connue présents chez S. maltophilia (Rocco et al.,
2009).
En particulier, plusieurs ilots seraient impliqués dans la résistance aux métaux. Ces ilots sont
essentiellement présents chez la souche K279a. On peut citer notamment les opérons czc ou
cop (qui permettraient la résistance au cobalt, cadmium et zinc et au cuivre, respectivement)
présents chez les deux souches ainsi que sur des ilots génomiques chez la souche K279a.
L’exception concerne l’opéron mer, permettant la résistance au mercure, qui est présent
uniquement sur un ilot génomique de la souche clinique K279a. Certains ilots sont également
impliqués dans la synthèse de pilis de type I et IV supplémentaires chez la souche K279a.
Chez les deux souches, on trouve également des ilots codant pour la biosynthèse de
l’hémagglutinine filamenteuse et la modification des lipopolysaccharides (LPS), impliqués
dans la colonisation et les interactions avec l’hôte ainsi que dans la résistance à certains
antibiotiques. Ainsi, l’acquisition et le maintien de certains ilots pourraient être expliqués par
un besoin d’adaptation à des environnements particuliers et par le besoin d’assurer les
interactions avec l’hôte.
- 57 -
III- Mécanismes impliqués dans la réussite de l’interaction avec l’hôte et
l’environnement : Virulence et Résistances
De nombreuses études ont été menées dans le but d’élucider les mécanismes à
l’origine de la grande capacité d’adaptation et d’interactions avec d’autres organismes de P.
aeruginosa et S. maltophilia. Dans cette partie, nous nous intéresserons en particulier aux
mécanismes qui permettent à ces deux pathogènes opportunistes de coloniser et créer des
dommages chez un hôte, ainsi que de résister aux antibiotiques. Ces capacités particulières,
bien que essentiellement étudiées chez des isolats cliniques, peuvent également intervenir
dans l’adaptation à différents environnements. Les mécanismes de résistance aux métaux
seront également abordés du fait de leur rôle dans la survie dans des environnements
contaminés et de leur possible association aux mécanismes de résistance aux antibiotiques.
III-1- Le pouvoir pathogène
La mise en évidence des capacités qui permettent à P. aeruginosa et S. maltophilia de

coloniser l’hôte et entraîner des pathologies a fait l’objet de nombreuses études. De nombreux
facteurs de virulence ont été décrits. Ces facteurs permettent à ces pathogènes opportunistes
de coloniser l’hôte dont les barrières immunitaires sont défaillantes, de s’installer dans
différents organes ou tissus et de causer diverses lésions. Leur capacité à former des biofilms,
structures formées d’une association de cellule dans une matrice extracellulaire, constitue un
avantage à ces bactéries en les protégeant contre les antimicrobiens et les défenses de l’hôte.
Enfin, une attention particulière sera apportée à la capacité de ces bactéries à communiquer
entre elles par quorum sensing, système permettant également la régulation d’un certain
nombre de facteurs de virulence.
III-1-a- Facteurs de virulence
La pathogénie de P. aeruginosa et S. maltophilia est attribuée à la production de nombreux

facteurs de virulence membranaires et extracellulaires (Figure 15). Les facteurs membranaires
vont intervenir dans les étapes précoces de l’infection et vont essentiellement permettre la
mobilité, la reconnaissance et l’adhésion aux cellules de l’hôte.
- 58 -
Figure 15. Les facteurs de virulence chez P. aeruginosa (Van Delden et al., 1998).
Notamment, un certain nombre de facteurs impliqués dans la mobilité de ces deux bactéries
semble indispensable à la réussite de l’infection. En particulier, la présence d’un flagelle chez
P. aeruginosa est indispensable pour assurer la mobilité de la bactérie (Feldman, et al., 1998).
Il favorise également la prise de nutriments et jouerait un rôle dans l’adhésion aux cellules de
l’hôte. P. aeruginosa est également capable de se déplacer par « twitching motility », surtout
impliqué dans les déplacements sur les surfaces abiotiques, grâce à la présence de pili de type
IV (Wall & Kaiser, 1999). Ces pili rétractables sont également impliqués dans l’adhésion aux
cellules épithéliales des muqueuses de l’hôte. En ce qui concerne S. maltophilia, le
séquençage du génome de la souche K279a a révélé la présence de gènes codant pour ce type
de pili mais leur rôle dans la virulence reste à établir (Crossman, et al., 2008). On retrouve
également chez les deux modèles des fimbriae, facteurs impliqués dans l’adhésion aux
surfaces abiotiques et dans la formation de biofilm (Vallet, et al., 2001, de Oliveira-Garcia, et
al., 2003). Enfin, le lipopolysaccharide ou LPS intervient de plusieurs façons dans la réussite
de l’infection (Lynn & Golenbock, 1992, Crossman, et al., 2008). Localisé dans la membrane
externe des bactéries à Gram négatif, le LPS est un lipide complexe auquel est attaché un
polysaccharide : l'antigène O. Il est impliqué dans la stimulation de la réponse inflammatoire
et possède une activité endotoxique responsable d’une stimulation excessive du système
immunitaire de l’hôte pouvant provoquer différents symptômes tels que fièvre, leucopénie,
bradycardie, hypotension et choc septique.
- 59 -
Les facteurs extracellulaires vont intervenir lors de l’installation de la bactérie dans l’hôte et
vont favoriser sa survie et sa multiplication, notamment en luttant contre le système
immunitaire de l’hôte. P. aeruginosa est capable de produire et excréter plusieurs exotoxines.
Elles sont directement injectées dans la cellule hôte grâce à la présence d’un système de
sécrétion de type III, seringue macromoléculaire faisant le lien entre la bactérie et la cellule
hôte. A ce jour, quatre toxines excrétées par ce système ont été identifiées : ExoS, ExoT,
ExoU et ExoY (Engel & Balachandran, 2009). ExoS et ExoT ayant respectivement une
activité d’activateur de protéine Rho GTPase et une activité ADP ribosyltransférase, sont
fonctionnellement étroitement liées. Ces toxines fonctionnent de concert pour interrompre le
cytosquelette d’actine de la cellule hôte, bloquer la phagocytose par le macrophage et causer
la mort de la cellule. Alors que le gène exoT est présent chez toutes les souches de P.
aeruginosa, exoS est trouvé dans environ 70 % des isolats cliniques. ExoU est le produit le
plus toxique injecté par P. aeruginosa. Le gène codant pour cette toxine est retrouvé chez
environ 30 % des isolats cliniques et serait positionné sur un ilot de pathogénicité (Sato &
Frank, 2004). Il code pour une phospholipase A2, active seulement après interaction avec un
co-facteur présent chez l’hôte, tel que la superoxyde dismutase 1. ExoU est à l’origine d’une
réponse inflammatoire excessive et cause des dommages tissulaires favorisant la
dissémination des bactéries. Enfin, ExoY est une adénylate cyclase dépendante d’un co-
facteur présent chez l’hôte. Ce co-facteur reste à ce jour non identifié et le rôle de cette
enzyme dans la virulence est incertain (Veesenmeyer, et al., 2009).
Les deux modèles sont également capables de produire différentes protéases dont la plus
connue est l’élastase (Morihara, 1964, Denton & Kerr, 1998, Windhorst, et al., 2002). Chez P.
aeruginosa, l’activité élastolytique est due à deux enzymes, LasA et LasB codées par les
gènes du même nom. Ces protéases sont capables de dégrader de nombreuses protéines de
l’hôte telles que les composants des lames basales des structures épithéliales (l’élastine, la
laminine, le collagène, les protéoglycanes), les composants du complément et certaines
immunoglobulines (Toder, et al., 1994). Ainsi, la participation des élastases à la détérioration
de certaines molécules de défense de l’hôte reflète l’importance de ces enzymes dans la
réussite de l’infection.
La présence de phospholipases C, enzymes extracellulaires, chez les deux modèles serait à
l’origine de dommage des tissus pulmonaires suite à la dissolution par ces enzymes des
surfactants, composés en grande partie de phospholipides, recouvrant ces tissus (Berka, et al.,
1981, Figueiredo, et al., 2006, Crossman, et al., 2008). La présence de rhamnolipides chez P.
- 60 -
aeruginosa favorise également les infections pulmonaires en perturbant le transport
mucociliaire et les mouvements ciliaires de l’épithélium respiratoire, en émulsionnant les
phosphates membranaires par leur activité détergente (Read, et al., 1992).
P. aeruginosa et S. maltophilia doivent également faire face au problème de l’insolubilité du
fer sous sa forme Fe3+, et doivent de ce fait excréter des molécules chélatant le fer : les
sidérophores. Ces molécules vont leur permettre d’obtenir le fer des transferrines, des
ferritines, de l’hémoglobine et d’autres protéines de l’hôte contenant du fer. Ces molécules
sont ensuite captées par des protéines membranaires spécifiques présentes à la surface de la
bactérie. Chez P. aeruginosa, on trouve trois types de sidérophores : la pyoverdine, la
pyochéline et la pyocyanine qui vont être captées par la protéine membranaire FpvA (Schalk,
et al., 2002). En plus de leur rôle dans la captation du fer, différentes études ont monté que
ces sidérophores interviennent directement dans la virulence notamment en causant des
dommages tissulaires (Hassett, et al., 1992). S. maltophilia produit un type de sidérophore
appelé enterobactine mais possède également plusieurs récepteurs lui permettant de capter des
sidérophores produits par d’autres bactéries (Ryan, et al., 2009).
III-1-b- Formation de biofilm
P. aeruginosa et S. maltophilia sont capables de s’organiser en biofilm c'est-à-dire de

former des structures résultant d’une association de cellules dans une matrice extracellulaire
constituée de protéines sécrétées, de polysaccharides, d’acides nucléiques et de débris
cellulaires, attachées à une surface biotique ou abiotique. Cette organisation constitue une
barrière physique conférant à ces bactéries des avantages importants tels qu’une meilleure
résistance à différents antibactériens, aux prédateurs et au système immunitaire de l’hôte. De
ce fait, la formation de biofilm joue un rôle important dans la colonisation et l’installation de
la bactérie chez l’hôte. De plus, leur capacité à former des biofilms sur des surfaces inertes,
notamment sur le matériel médical augmente les risques de contaminations et les difficultés à
éradiquer ces bactéries du milieu hospitalier.
La formation d’un biofilm nécessite plusieurs étapes, incluant l’attachement réversible de la
bactérie à un substrat puis son adhésion irréversible, la formation de micro-colonies, la
maturation du biofilm se manifestant par la formation de larges structures en forme de tiges
ou de champignons, et enfin la dispersion de certaines bactéries du biofilm soit par le
détachement d’une partie du biofilm soit par le départ de bactéries devenues mobiles (Figure
- 61 -
16). Un biofilm est constitué de microenvironnements dans lesquels les quantités de
nutriments et d’oxygène vont être limitées et décroitre en fonction de la profondeur dans le
biofilm. Ceci conduit à un ralentissement de la croissance des bactéries présentes ainsi qu’à
l’observation d’une hétérogénéité physiologique en fonction des concentrations en nutriments
et en oxygène rencontrées.
Figure 16. Formation d’un biofilm chez P. aeruginosa. I. Attachement réversible à la surface,
II. Adhésion irréversible, III. Formation de micro-colonies, IV. Mise en place de structures
complexes en forme de tiges ou de champignons, V. Détachement du biofilm. (Wagner &
Iglewski, 2008).
Bien que la capacité de S. maltophilia à former des biofilms à la fois sur des surfaces
biotiques et abiotiques soit connue depuis plusieurs années, les mécanismes à l’origine de sa
formation sont peu étudiés. La présence d’un fimbriae SMF-1 (Stenotrophomonas maltophilia
Fimbriae 1), présentant des homologies avec ceux présents chez des pathogènes comme
Escherichia coli, serait impliqué dans l’adhésion des bactéries aux cellules eucaryotes et aux
surfaces inertes. De plus, l’ajout d’anti-corps anti SMF-1 empêche la formation de biofilm,
suggérant un rôle essentiel de ce fimbriae dans la mise en place d’une structure en biofilm (de
Oliveira-Garcia, et al., 2003). Le séquençage des génomes a également mis en évidence la
présence de différents gènes potentiellement impliqués dans la mobilité et l’adhésion, tels que
ceux codant pour le pili de type IV, ainsi que dans la synthèse de polysaccharides, composants
essentiels de la matrice (Crossman, et al., 2008).
- 62 -
Contrairement à S. maltophilia, de nombreuses études ont eu pour objet l’étude des
mécanismes impliqués dans la formation du biofilm chez P. aeruginosa. La réussite de la
formation et du maintien du biofilm formé par P. aeruginosa dans l’hôte ou sur des surfaces
abiotiques va dépendre de différents facteurs intervenant à chaque étape de l’installation du
biofilm. Tout d’abord, la présence du flagelle et la capacité de se déplacer par « twitching
motility » sont notamment impliquées dans l’attachement de P. aeruginosa à différentes
surfaces, ainsi que dans les étapes suivantes de la formation du biofilm (O'Toole & Kolter,
1998). Les souches présentant des mutations sur différents gènes impliqués dans la synthèse
des pili sont incapables de former des biofilms caractéristiques de P. aeruginosa en forme de
champignon. Parmi ces gènes, le gène pilA, codant pour la piline (protéine formant les pili) et
le gène lecB, gène codant pour une lectine de type II (participant également à la formation des
pili) semblent indispensables à la formation de biofilm et des mutations sur ces gènes
entraînent la formation de biofilm fin et fragile. De plus, LecB intervient également dans la
virulence de façon directe par sa capacité à entrainer un ralentissement des battements
ciliaires de l’épithélium des poumons (Mewe, et al., 2005, Tielker, et al., 2005). De même,
une mutation sur le gène lecA codant pour un autre type de lectines présentes à la surface de
P. aeruginosa, semble également impliquée dans la structure du biofilm et conduit à la
formation d’un biofilm plus fin que celui de la souche sauvage (Diggle, et al., 2006).
La capacité à former les différents composés de la matrice est indispensable à la formation du

biofilm. Notamment, la surproduction d’un exopolysaccharide, l’alginate par certaines
souches de patients atteints de mucoviscidose entraine un changement de phénotype de ces
souches, alors qualifiées de mucoïdes (Hentzer, et al., 2001). Chez ces souches, l’alginate est
un des principaux composants de la matrice et est à l’origine de la formation d’un biofilm
particulièrement résistant aux antimicrobiens tel que la tobramycine. L’alginate intervient
dans l’élimination des radicaux libres relargués par les macrophages activés, prévient de la
phagocytose et protège contre les défensines. Chez les souches non mucoïdes, l’alginate ne
constitue pas le composant principal de la matrice et deux loci impliqués dans la synthèse
d’autres polysaccharides : psl et pel ont été mis en évidence chez PAO1 et PA14,
respectivement (Ryder, et al., 2007). Toutefois, la synthèse d’alginate par ces souches serait
possible en conditions hypoxiques, conditions notamment rencontrées dans les poumons de
patients atteints de mucoviscidose et participerait à la défense du biofilm contre le système
immunitaire de l’hôte (Ramsey & Wozniak, 2005). L’ADN extracellulaire est aussi un
- 63 -
composant majeur de la matrice. La présence de DNAse I empêche la formation du biofilm et
dissout les jeunes biofilms (Whitchurch, et al., 2002). Il a été mis en évidence que la quantité
d’ADN ainsi que sa localisation dans le biofilm variaient au cours du temps. Dans les biofilms
précoces, l’ADN est en grande quantité et se trouve principalement contre la surface et
recouvre les micro-colonies alors que dans les biofilms matures, l’ADN se trouve dans les
tiges des structures en champignon. Cet ADN aurait pour origine la lyse cellulaire induite par
les prophages ou la libération de vésicules membranaires (Yang, et al., 2007). Différentes
études ont également révélé l’importance des rhamnolipides, glycolipides extracellulaires au
pouvoir détergent, à toutes les étapes de la formation du biofilm, de la formation de micro-
colonies à la dispersion des bactéries (Davey, et al., 2003).
La capacité à survivre en présence de faibles quantités d’oxygène voire même en absence
totale d’oxygène est également essentiel à la survie de P. aeruginosa dans le biofilm. En
particulier, l’utilisation de la dénitrification, c'est-à-dire à l’utilisation des nitrates, nitrites et
de l’oxyde nitreux comme accepteur terminal d’électrons constitue une alternative permettant
le développement de la bactérie (Grasemann, 1999).
La régulation de la formation d’un biofilm est sous le contrôle de différents systèmes de
régulation dont Crc régulateur du métabolisme global du carbone, RpoS régulateur de la
phase stationnaire, AlgR régulateur de la production d’alginate, le système à trois composants
GacA/GacS/rsmZ, mais elle implique surtout une coordination entre les cellules impliquées
nécessitant une communication entre ces cellules rendue possible par le quorum sensing
(Wagner & Iglewski, 2008).
III-1-c- Communication entre cellule et Quorum sensing
Le quorum sensing (QS) est un mécanisme de communication cellulaire permettant

aux bactéries d’adapter leur comportement en fonction de la densité de population et de
l’environnement et d’agir de façon coordonnée comme le ferait un organisme multicellulaire
(Figure 17). Ce système implique la synthèse de petites molécules appelées auto-inducteurs
qui sont libérées dans l’environnement. La concentration en auto-inducteurs va être perçue par
les bactéries voisines qui vont en déduire la densité de population et réguler l’expression de
gènes en conséquence.
- 64 -
Figure 17. Principe de l’expression du quorum sensing au cours de la croissance bactérienne.
La croissance bactérienne dans un milieu de culture (A, C, E) est suivie au cours du temps en
fonction de la densité optique (B, D, F). Au cours de la phase de latence (A, B), la synthèse de
petites molécules appelées acyl-homosérine lactones (AHL) représentées par de petits cercles
gris augmente. Cette synthèse dépend d’une synthase auto-inductrice. Les AHL diffusent
facilement de bactéries à bactéries. Lorsque la quantité d’AHL atteint un seuil critique à la
jonction entre la phase de croissance exponentielle (C, D) et la phase stationnaire (E, F), les
AHL déclenchent la production de facteurs de virulence (éclair noir). Cette production est
coordonnée à toute la population bactérienne. (Ruimy et al., 2004).
- 65 -
Chez P. aeruginosa, le QS est responsable de la régulation d’environ 350 gènes, soit 6 % de
son génome, et est impliqué dans différents processus tels que la formation de biofilm ou la
synthèse de toxines (Veesenmeyer, et al., 2009). Trois systèmes de QS ont été mis en
évidence. Le premier à avoir été décrit est le système las (Gambello & Iglewski, 1991). Ce
système est constitué du gène lasR codant pour la protéine régulatrice LasR et du gène lasI
codant pour l’auto-inducteur synthase LasI qui est indispensable à la synthèse de l’auto-
inducteur N-(3-oxododecanoyl)-L-homosérine lactone (3-oxo-C12-HSL). Les N-acyl
homosérine lactone sont des molécules qui ont la propriété de traverser facilement les
membranes bactériennes et constituent un vrai moyen de communication entre les cellules.
Lorsque la concentration en 3-oxo-C12-HSL atteint un seuil critique, témoin d’une densité
bactérienne élevée, une de ces molécules se lie à deux régulateurs LasR pour constituer un
complexe activateur de la transcription de plusieurs gènes. Cette activation est déclenchée de
manière synchrone dans toute la population bactérienne à la jonction entre la phase de
croissance exponentielle et le début de la phase stationnaire. Parmi les gènes régulés par ce
système, plusieurs sont impliqués dans la virulence, tels que lasB, lasA, aprA codant
respectivement pour deux élastases et pour une protéase alcaline, toxA codant pour une
exotoxine ADP-ribosylante, xcpR et xcpP codant pour des protéines du système de sécrétion
de type II nécessaire à l’exportation de ces facteurs hors de la cellule et lasI permettant une
augmentation rapide de la synthèse de 3-oxo-C12-HSL et donc une amplification du signal
par auto-induction.
Le deuxième système est le système rhl (Latifi, et al., 1995). Ce système est également
constitué d’une protéine régulatrice RhlR codée par le gène rhlR et une auto-inducteur
synthase RhlI, codée par le gène du même nom. Cette enzyme est nécessaire à la synthèse
d’un second type de N-acyl homosérine lactone : la N-butyryl-L-homosérine lactone (C4-
HSL). Le complexe RhlR-C4-HSL contrôle l’expression de l’opéron rhlAB nécessaire à la
production de rhamnolipides, et l’expression d’une série de gènes dont lasA, aprA et rhlI.
Des interactions existent entre ces deux systèmes. Notamment, le complexe LasR-3-oxo-C12-
HSL active la transcription de rhlR et rhlI. De plus, les 3-oxo-C12-HSL peuvent entrer en
compétition avec les C4-HSL pour le site de liaison à RhlI et pourraient ainsi agir comme un
antagonisme du système rhl. Il existe donc une hiérarchie entre ces deux systèmes avec le
système las qui régule positivement le système rhl (Latifi, et al., 1995).
Les mécanismes régulant positivement l’expression des gènes lasR et rhlR sont encore mal
connus. Ils semblent toutefois faire intervenir des signaux extérieurs, notamment par
l’intermédiaire de systèmes de régulation. La régulation négative du système las est
- 66 -
actuellement attribuée à deux gènes rsaL et qscR. Le gène rsaL est situé immédiatement en
aval de lasR et inhibe la synthèse de LasI. De plus, l’analyse du génome complet de P.
aeruginosa a révélé l’existence d’un gène homologue à lasR nommé qscR. La protéine codée
par ce gène inhibe également la transcription de lasI et pourrait ainsi assurer le contrôle du QS
empêchant son déclenchement dans des environnements ne nécessitant pas sa mise en œuvre
(Chugani, et al., 2001).
Récemment, un troisième système appelé Pseudomonas Quinolone signal (PQS) a été mis en
évidence (Diggle, et al., 2003). Ce système implique la formation d’une molécule signal
appelée 2-heptyl-3-hydroxy-4(1H)-quinolone. La synthèse de cette molécule est sous le
contrôle de LasR et active notamment la transcription des gènes lasB (codant pour l’élastase),
lecA (codant pour une PA-IL lectine) et rhl2, constituant ainsi un lien supplémentaire entre les
systèmes las et rhl. Plusieurs autres molécules régulant le QS, notamment d’autres acyl-
homosérine lactones ont pu être détectées en faible quantité dans le surnageant de culture. Des
molécules de dipeptides cycliques (diketopiperazines) ont également été retrouvées chez P.
aeruginosa (Holden, et al., 1999). Leur rôle reste encore hypothétique mais pourrait inhiber
ou activer le QS selon l’environnement rencontré par les bactéries.
Le QS n’intervient pas dans la virulence de P. aeruginosa uniquement en stimulant
l’expression de différents gènes codant pour des facteurs de virulence. Les N-acyl homosérine
lactones interviennent directement dans la virulence par leur activité immuno-modulatrice. La
3-oxo-C12-HSL joue un rôle dans l’infection en inhibant la prolifération lymphocytaire, en
réduisant la réponse inflammatoire (production de TNF ) induite par le LPS de P.
aeruginosa. Cette molécule est également responsable de l’apoptose des macrophages et des
polynucleaires neutrophiles (Telford, et al., 1998).
Le QS est également impliqué dans la formation du biofilm, en intervenant dans l’étape de
structuration. En effet, une souche mutée sur le gène lasI forme un biofilm fin, peu structuré
et sensible à un détergent (le SDS). L’ajout de 3-oxo-C12-HSL restaure la structure du
biofilm, confirmant le rôle essentiel du QS dans la formation du biofilm. Par contre, une
mutation sur le gène rhlI n’entraine pas de modification significative du biofilm (Davies, et
al., 1998). Il est aussi intéressant de noter que les molécules du QS produites par P.
aeruginosa peuvent avoir un effet sur d’autres microorganismes présents. Il a notamment était
montré que la 3-oxo-C12-HSL à un effet inhibiteur de la croissance de Staphylococcus aureus
et de Candida albicans, parfois retrouvées simultanément avec P. aeruginosa lors de co-
infection (Hogan, et al., 2004, Hoffman, et al., 2006).
- 67 -
Chez S. maltophilia, la communication entre cellules n’implique pas le même type de
molécules que chez P. aeruginosa. En effet, l’analyse du protéome de S. maltophilia a révélé
l’absence de N-acyl-homosérine lactone synthase. La communication est alors rendue
possible par la synthèse de molécules appelées diffusible signal factors (DSF) (Fouhy, et al.,
2007, Crossman, et al., 2008). La synthèse et la perception de ces molécules se fait grâce à la
présence d’un opéron rpf, identifié premièrement chez le pathogène de plante Xanthomonas
campestris pv. Campestris, phylogénétiquement proche de S. maltophilia (Fouhy, et al.,
2007). La synthèse des DSF est dépendante de la protéine RpfF, présentant des similarités de
séquence avec une enoyl coA hydratase, alors que la perception implique la présence d’un
système de régulation à deux composants : RpfC et RpfG, sensor kinase et régulateur,
respectivement. Il a été montré que ces molécules interviennent dans le contrôle de la
résistance à certains antibiotiques, dans la formation de structures type agrégat et biofilm et
dans la virulence notamment en induisant la synthèse de protéases extracellulaires.
Malgré des systèmes de communications impliquant différentes molécules chez les deux
modèles bactériens P. aeruginosa et S. maltophilia, une étude récente a montré que les DSF
produits par S. maltophilia pouvaient influencer le comportement de P. aeruginosa dans un
biofilm constitué par les deux espèces (Figure 18) (Ryan, et al., 2008).
Figure 18. L’architecture du biofilm

formé par P. aeruginosa est influencée par
les molécules DSF (Diffusible Signal
Factors) produites par S. maltophilia. A. P.
aeruginosa PAO1, B. S. maltophilia
K279a, C. Co-culture de PAO1 et K279a,
D. Co-culture de PAO1 et K279a mutée
sur un gène impliqué dans la synthèse
(arpfF) de DSF, E. PAO1 en présence de
DSF exogène (50 mM), F. Co-culture
PAO1 et K279a mutée sur arpfF et
complémentée. (Ryan et al., 2008).
- 68 -
En effet, la présence de DSF entraine une modification de l’architecture du biofilm constitué
par P. aeruginosa qui forme alors des filaments étendus. La réponse de P. aeruginosa dépend
de la présence d’une sensor kinase présentant un domaine senseur proche de celui de RpfC
codée par le gène PA1396. Une mutation dans ce gène ou l’ajout de DSF entraine une
augmentation de l’expression de gènes impliqués dans la tolérance au stress, notamment ceux
impliqués dans la résistance aux peptides antimicrobiens, entrainant une augmentation de la
tolérance aux polymixines. L’origine de ces observations est inconnue. Toutefois, les auteurs
suggèrent que la protéine codée par le gène PA1396 régulerait négativement les gènes de
tolérance au stress et que la liaison avec des molécules DSF pourrait en partie inverser cet
effet.
III-2- Résistances
L’adaptation des bactéries à la présence de composés toxiques tels que les

antibiotiques et les métaux, à la fois dans l’environnement et dans le milieu clinique permet
leur survie et leur multiplication. La présence intrinsèque de nombreux mécanismes de
résistance chez les bactéries pathogènes opportunistes, notamment chez P. aeruginosa et S.
maltophilia constitue un avantage sélectif pour ces bactéries et accroit leur capacité
d’adaptation à un large panel d’environnements. De plus, leur capacité à acquérir de nouvelles
résistances par mutation ou transfert horizontal favorise l’émergence de nouveaux clones, leur
survie et leur dispersion lors de changements environnementaux. La résistance aux
antibiotiques et aux métaux pouvant être co-sélectionnées simultanément (Figure 4) (Baker-
Austin, et al., 2006) à la fois dans les environnements contaminés et hospitaliers, une
attention particulière sera apportée aux mécanismes permettant ces deux types de résistance.
III-2-a- Résistance aux antibiotiques
L’utilisation des antibiotiques en santé humaine est sans doute une des thérapies les plus
performantes développées par l’Homme. Depuis leur découverte au milieu du 20ème siècle
(Figure 19), ces molécules ont permis d’éviter des millions de morts et de placer sous contrôle
les nombreuses maladies infectieuses qui ont décimé la population humaine tout au long de
son histoire.
- 69 -
Figure 19. La découverte des antibiotiques (Wright, 2007).
Tableau 5. Classification des antibiotiques par familles de molécules (non exhaustif).
Famille d'antibiotiques Sous-famille Nom

-lactamines Pénicillines Pénicilline G
Oxacilline
Ampicilline
Ampicilline/sulbactam
Amoxicilline
Amoxicilline/acide clavulanique
Mécillinam
Ticarcilline
Ticarcilline/acide clavulanique
Mezlocilline
Azlocilline
Pipéracilline
Pipéracilline/tazobactam
Sulbactam
Carbapénèmes Imipénème
Méropénème
Ertapénème
Doripénème
Monobactame Aztréonam
Céphalosporines 1ère génération Céfalotine
Céphalosporines 2ère génération Céfamandole
Céfuroxime
Céfoxitine
Céphalosporines 3ère génération Céfopérazone
Céfotaxime
Ceftizoxime
Ceftriaxone
- 70 -
Céfotétan
Céfotiam
Ceftazidime
Cefpirome
Latamoxef
Cefsulodine
Céphalosporines 4ère génération Céfépime
Aminosides Streptomycine
Gentamicine
Nétilmicine
Kanamycine
Tobramycine
Amikacine
Isépamicine
Spectinomycine
Néomycine
Quinolones Quinolones de 1ère génération Acide oxolinique
Fluméquine
Acide nalidixique
Acide pipémidique
Acide piromidique
Quinolones de 2ème génération Ciprofloxacine
Enoxacine
Lévofloxacine
Loméfloxacine
Moxifloxacine
Norfloxacine
Ofloxacine
Péfloxacine
Sparfloxacine
Phénicolés Chloramphénicol
Thiamphénicol
Tétracyclines Minocycline
Chlortetracycline
Doxycycline
Oxytetracycline
Polypeptides Vancomycine
Teicoplanine
Polymyxine
Bacitracin
Colistine
Macrolides Erythromycine
Dirithromycine
Azithromycine
Spiramycine
Nitrofuranes Nifuroxazide
Nitrifurzide
Sulfamides-
Triméthoprime Sulfanilamide
Sulfacetamide
Sulfasalazine
Triméthoprime
Triméthoprime/sulfaméthoxazole
- 71 -
Un antibiotique est une molécule qui peut être d’origine biologique, produite par des micro-
organismes (bactéries, champignons) ou de synthèse chimique. Il pourra soit inhiber la
multiplication bactérienne, on parle alors d’activité bactériostatique, soit entrainer la mort de
la cellule bactérienne, on parle alors d’activité bactéricide. Les antibiotiques sont classés par
famille de molécules (Tableau 5) et leurs modes d’action sont variés (Figure 20). Ils vont
principalement intervenir en détériorant la paroi ou la membrane cytoplasmique de la bactérie,
en empêchant la synthèse des protéines ou la réplication de l’ADN.
Inhibition de la synthèse de la Inhibition de la synthèse de la

paroi bactérienne membrane cytoplasmique
Ex : les -lactamines Ex : Les polypeptides
Inhibition de la synthèse protéique

Ex : Les aminoglycosides Inhibition de la synthèse de l’ADN
Ex : Les fluoroquinolones
Autres mécanismes
(Inhibition de voies métaboliques
Ex : les sulfonamides)
Figure 20. Modes d’action des antibiotiques.
La majorité des molécules utilisées dans le milieu clinique sont produites par des bactéries de
l’environnement, en particulier par les Actinomycètes, bactéries indigènes du sol (Watve, et
al., 2001). Dans l’environnement, la production d’antibiotiques confère aux bactéries
productrices un avantage sélectif, les rendant plus compétitives vis-à-vis des bactéries
présentes dans la communauté. Ces bactéries productrices possèdent également des
déterminants leur permettant de résister aux molécules qu’elles produisent. De même, la
pression exercée par la présence d’antibiotiques a entraîné la sélection de mécanisme de
résistance chez les bactéries de la communauté (Martinez, et al., 2009). Cette résistance est
- 72 -
permise par quatre mécanismes généraux (Figure 21): la réduction de la perméabilité
membranaire qui va permettre de réduire l’entrée des molécules, l’efflux actif des molécules
grâce à des pompes à efflux, la modification de la cible ou de l’antibiotique (Levy &
Marshall, 2004). Dans le milieu clinique, l’utilisation excessive et parfois inadaptée des
antibiotiques a exercé le rôle de pression favorisant la sélection de résistance. Alors que l’on
croyait le problème des maladies infectieuses maitrisé, ces dernières années ont vu émerger et
se répandre dans le milieu clinique des pathogènes présentant des multi-résistances aux
antibiotiques, entrainant des difficultés à trouver des traitements adaptés (Slama, 2008).
Figure 21. Mécanismes de résistance aux antibiotiques.
En ce qui concerne les bactéries pathogènes opportunistes P. aeruginosa et S. maltophilia,

leur niveau de résistance ainsi que les mécanismes impliqués font l’objet de nombreuses
études, en particulier chez les souches cliniques (tableaux 6 et 7).
- 73 -
Tableau 6. Bilan des mécanismes de résistance aux antibiotiques chez P. aeruginosa.
Résistance
Résistance
intrinsèque
acquise
Mécanisme de résistance Nom Antibiotiques ciblés Remarques
Réduction de Mutation oprD Carbapénèmes La mutation du gène codant pour la porine OprD
l'entrée dans la X entraine une diminution de son expression et de
cellule l'entrée des carbapénèmes dans la cellule
Efflux actif, MexAB-OprM Quinolones, macrolides, Exprimée faiblement de façon constitutive, une
pompes à efflux tétracyclines, mutation sur le régulateur entraine une
lincomycine, surexpression de la pompe et un niveau de
X X chloramphénicol, résistance élevé
Réduction de la perméabilité membranaire
novobiocine, -
lactamines (sauf
imipénème)
MexXY-OprM Quinolones, macrolides, Exprimée faiblement de façon constitutive, une
tétracyclines, lincomycin, mutation sur le régulateur entraine une
chloramphénicol, surexpression de la pompe et un niveau de
aminoglycosides, résistance élevé
X X
pénicillines (sauf
carbénicilline and
sulbénicilline), céfépime,
cefpirome, méropénème
MexCD-OprJ Quinolones, macrolides, Cette pompe n'est pas exprimée de façon
tétracyclines, lincomycin, constitutive, une mutation sur le régulateur
chloramphénicol, entraîne sa surexpression et la résistance aux
aminoglycosides, antibiotiques ciblés
X
pénicillines (sauf
carbénicilline and
sulbénicilline), céfépime,
cefpirome, méropénème
MexEF-OprN Quinolones, Cette pompe n'est pas exprimée de façon
carbapénèmes constitutive, une mutation sur le régulateur
X
entraîne sa surexpression et la résistance aux
antibiotiques ciblés
Enzymes AmpC Aminopénicillines, Son expression peut être augmentée en présence
inactivant les - pénicillines G, de -lactamines, l'activité de cette enzyme n'est
X
lactamines céphalosporines de 1ère pas inhibée par des inhibiteurs des -lactamases
les -lactamases et 2ème génération
ESBL (Extended ESBL de classe A Carboxipénicillines, Acquises par transfert horizontal, sensibles aux
Inactivation enzymatique de l'antibiotique
Spectrum - uréidopéicillines, inhibiteur des -lactamases (acide clavulanique et

lactamases) X céphalosporines de tazobactame), les plus fréquemment trouvées
3ème et 4ème chez P. aeruginosa sont les types TEM, SHV,
génération, aztréonam PER, VEB, GES/IBC et BEL
ESBL de classe D Carboxipénicillines, Acquises par transfert horizontal, également
uréidopéicillines nommées enzymes de types OXA, insensibles aux
X
inhibiteurs des -lactamases (acide clavulanique et
tazobactame), (sauf OXA-18)
MBL (Metallo- - Toutes les -lactamines Acquises par transfert horizontal, sensibles aux
lactamases) de surtout carbapénèmes et inhibiteur des -lactamases (acide clavulanique et
X
classe B à l'exception de tazobactame), les plus fréquemment trouvées
l'aztréonam chez P. aeruginosa sont les types VIM et IMP
Enzymes Aminoglycoside Gentamicine, Acquise par transfert horizontal, *dépend de
inactivant les adenyly- tobramycine, netilmicine, l'enzyme, les plus fréquemment trouvées chez P.
amino-glycosides transférase (AAD) X amikacine* aeruginosa sont l’AAC(6’)-II,l’AAC(3)-I, l’ACC(3)-II,
ou nucléotidyl- l’AAC(6’)-I
transférases (ANT)
Aminoglycoside Gentamicine, Acquise par transfert horizontal, *dépend de
acétyltransférase X tobramycine, netilmicine, l'enzyme, la plus fréquemment trouvée chez P.
(AAC) amikacine* aeruginosa est l’ANT(2’)-I
Modification de la Mutation sur les Quinolones Ces mutations entrainent une diminution de
l'antibiotique
Modification
gènes gyrA ou
de la cible
topoisomérase II X l'affinité de l'antibiotique pour l'enzyme cible

ou DNA gyrase gyrB
de
Modification de la Mutation sur les Quinolones Ces mutations entrainent une diminution de
topoisomérase IV gènes parC ou X l'affinité de l'antibiotique pour l'enzyme cible
parE
Déficience dans la Mutation sur les Potentiellement tous les Fréquent chez les souches isolées de personnes
mutation
Hyper-
réparation de gènes mutS et antibiotiques atteintes de mucoviscidose, la non-réparation de

l'ADN mutY X l'ADN entraine la sélection de mutation permettant
la résistance aux antibiotiques
- 74 -
Tableau 7. Bilan des mécanismes de résistance aux antibiotiques chez S. maltophilia.
Résistance
Résistance
intrinsèque
acquise
Mécanisme de résistance Nom Antibiotiques ciblés Remarques
Efflux actif, SmeDEF Tétracycline, chloramphénicol, Exprimée chez 33 % des souches,

pompes à efflux érythromycine, norfloxacine, une mutation sur le répresseur
Réduction de la
membranaire
perméabilité
X X ofloxacine entraine une surexpression et une

augmentation de la résistance aux
quinolones
SmeABC Ciprofloxacine, * aminoglycosides, * une mutation sur le répresseur
-lactamines, quinolones entraine une surexpression de la
X X
pompe et la résistance à ces
antibiotiques
Enzymes inactivant La -lactamase L1 Toutes les -lactamines (sauf les Pas exprimée chez toutes les
les -lactamines : (MBL) monobactames) souches, insensible à l'inhibiteur
Inactivation enzymatique de l'antibiotique
X
les -lactamases des -lactamases acide
clavulanique
La -lactamase L2 Céphalosporines et monobactames Pas exprimée chez toutes les
X souches, sensibles aux inhibiteurs
des -lactamases
ESBL de classe A Ampicilline et pipéracilline Type TEM présente sur un
X transposon de la souche J675Ia
Enzymes inactivant Aminoglycoside Gentamycine, tobramycine Résistance due à une AAC(6’)-Iz
les acétyltransférases X chromosomique
aminoglycosides (AAC)
Aminoglycoside Tous les aminoglycosides sauf la Résistance due à une APH(3’)-IIa
phosphoryltransférases X gentamicine chromosomique
(APH)
Enzymes inactivant Acetyltransférase Chloramphénicol Résistance chromosomique
X
le chloramphénicol
Protection de la Présence du gène qnr Quinolones L’association Qnr-ADN gyrase
de la cible de
l'antibiotique
Modification
gyrase par le codant pour le peptide diminue l’affinité de l’enzyme pour

peptide Qnr SmQnr l’antibiotique
X
Enzyme ayant Présence du gène sul1 Triméthoprime/Sulfaméthoxazole Acquise par transfert horizontal
Acquisition
moins d'affinité
nouvelle
enzyme
d'une
avec l'antibiotique X
- 75 -
P. aeruginosa et S. maltophilia sont intrinsèquement résistants à de nombreux antibiotiques
appartenant à des familles de molécules différentes. Cette résistance est principalement due à
la faible perméabilité de leur membrane, à la présence de pompes à efflux et à la production
d’enzymes inactivant certains antibiotiques. Ces mécanismes sont essentiellement codés par
des déterminants chromosomiques. Toutefois, ces bactéries possèdent également une grande
capacité à acquérir de nouveaux mécanismes de résistance par transferts horizontaux ou
mutations. Ces mécanismes seront présentés dans la suite de cette partie.
Le phénotype de résistance sauvage de P. aeruginosa traduit toutefois une sensibilité à
certains antibiotiques tels que certaines pénicillines (ticarcilline, pipéracilline…) certaines
céphalosporines de 3ème génération et toutes les céphalosporines de 4ème génération, le
monabactame aztréonam et les carbapénèmes, imipénème et méropénème (Strateva &
Yordanov, 2009). Certains phénotypes de résistance sont retrouvés de façon récurrente dans le
milieu hospitalier. Le premier, fréquemment appelé « résistance intrinsèque aux
carbénicillines », est caractérisé par une augmentation (x 4 à x 8) de la concentration
minimale inhibitrice (CMI) de la plupart des -lactamines dont le méropénème (mais pas
l’imipénème). Ce phénotype inclue également des résistances aux quinolones, au
triméthoprime, à la tétracycline et au chloramphénicol. Ce phénotype résulte de la faible
perméabilité de la membrane et de la dérépression de systèmes d’efflux. Le deuxième
phénotype est associé à une résistance à toutes les -lactamines à l’exception des céphèmes
(céfépime et cefpirome) et des carbapénèmes, résultant de la dérépression d’une AmpC -
lactamase. Le troisième phénotype est associé à la résistance aux pénicillines (ticarcilline,
azlocilline et pipéracilline ainsi qu’aux céphalosporines liée à la production d’une OXA -
lactamase ( -lactamase de spectre étendue ou ESBL). Enfin, le quatrième phénotype est
associé à l’augmentation de la CMI des carbapénèmes, suite à une diminution du nombre de
porines OprD. La thérapie la plus fréquemment utilisée pour traiter une infection à P.
aeruginosa est constituée d’une association entre une -lactamine (pénicilline, céphalosporine
ou carbapénème) et un aminoglycoside ou une quinolone (de préférence la ciprofloxacine).
Ces antibiotiques agissent de façon synergique et leur utilisation simultanée permet de réduire
la durée du traitement.
En ce qui concerne S. maltophilia, sa résistance intrinsèque à la plupart des antibiotiques
fréquemment utilisés en milieu clinique diminue le champ de possibilités pour le traitement
des infections (Nicodemo & Paez, 2007). Ainsi, l’association triméthoprime et
sulfaméthoxazole est à ce jour la thérapie la plus efficace et la plus utilisée (Muder, 2007).
Quatre-vingt pourcent des souches sont sensibles à cette association, toutefois ces dernières
- 76 -
années ont vu émerger de plus en plus de souches résistantes. Du fait de son importante
résistance intrinsèque, les aminoglycosides sont inefficaces, de même que la plupart des -
lactamines (carbapénèmes, céphalosporines…). Toutefois, l’utilisation d’inhibiteurs de -
lactamases comme l’acide clavulanique peut augmenter la sensibilité de S. maltophilia. Ainsi,
la ticarcilline associée à l’acide clavulanique a montré une bonne efficacité et peut être
utilisée lorsque le traitement triméthoprime/sulfaméthoxazole est inefficace. Par contre,
d’autres associations telles que la ticarcilline/ampicilline + le sulbactam ou
ceftazidime/céfépime + acide clavulanique n’ont pas montré une bonne efficacité. Les
nouvelles quinolones (levofloxacine, clinafloxacine…) et les polypeptides (polymixine et
colistine) ont montré une bonne efficacité in vitro avec 95 % et 75 % de souches testées
sensibles, respectivement, mais sont peu utilisés du fait du manque d’études cliniques et de
leur potentiel effet toxique (pour la polymixine).
 Résistance due à la réduction de la perméabilité membranaire

La résistance aux antibiotiques du fait de la réduction de la perméabilité membranaire de P.
aeruginosa résulte de deux types de phénomènes : d’une part, la réduction de l’entrée des
antibiotiques et d’autre part l’efflux actif des molécules entrées dans la cellule. Notamment, la
plupart des souches résistantes à l’imipénème sont caractérisées par une réduction du nombre
de porines OprD, formant un pont permettant l’entrée dans la cellule des carbapénèmes
(Pirnay, et al., 2002). Une mutation sur le gène oprD est à l’origine de cette réduction et
limite ainsi l’entrée des carbapénèmes.
L’efflux actif contribue également à la multi-résistance de P. aeruginosa. Ce mécanisme de
résistance est généralement considéré comme conférant une résistance aux antibiotiques faible
à modérée mais il joue un rôle majeur chez les isolats cliniques pour trois raisons (Mesaros, et
al., 2007). Tout d’abord, il limite le choix du traitement antibiotique du fait que les systèmes
impliqués sont souvent généralistes. Ensuite, il peut agir en complément d’autres mécanismes,
entrainant un niveau plus élevé de résistance. Enfin, il peut favoriser la sélection de mutations
en diminuant la concentration en antibiotiques dans la cellule bactérienne.
P. aeruginosa possède quatre systèmes à trois composants impliqués dans l’efflux
d’antibiotiques. Ces systèmes appartiennent à la famille RND (Resistance Nodulation
Division) et sont nommés : MexA–MexB–OprM, MexC–MexD–OprJ, MexE–MexF–OprN et
MexX–MexY–OprM. Ces pompes à efflux sont constituées d’une protéine située dans la
membrane cytoplasmique ((MexB, MexD, MexF et MexY) agissant comme une pompe dont
- 77 -
l’activité dépend de la production d’énergie (force protons motrice) et possédant une
spécificité de substrat large. Le deuxième composant est une protéine située dans la
membrane externe (OprM, OprJ, OprN et OprM) et le troisième est localisée dans l’espace
périplasmique et lie les deux autres composants (MexA, MexC, MexE et MexX) (Livermore,
2002). MexA–MexB–OprM et MexX–MexY–OprM participent à la fois à la résistance
intrinsèque et à la résistance acquise de P. aeruginosa alors que MexC–MexD–OprJ et
MexE–MexF–OprN ne participe qu’à la résistance acquise (Tableaux 8, 9 et 10) (Poole &
Srikumar, 2001).
Tableau 8. Substrats des pompes à efflux présentes chez P. aeruginosa (Strateva &
Yordanov, 2009).
Tableau 9. Impact des mutations sur les gènes codant pour les pompes à efflux sur les
résistances aux antibiotiques chez P. aeruginosa (Strateva & Yordanov, 2009).
- 78 -
Tableau 10. Mécanismes de résistances acquises chez P. aeruginosa (Rossolini &
Mantengoli, 2005).
MexA–MexB–OprM est naturellement exprimé à un faible niveau. Une mutation sur le gène
mexR codant pour une protéine qui réprime l’expression de cette pompe peut entrainer sa
surexpression. Les souches mutées sur ce gène présentent une résistance à la plupart des -
lactamines (pénicillines, céphalosporines, monobactames, méropénème mais pas imipénème)
(Livermore, 2001). La pompe MexC–MexD–OprJ, quand à elle, n’est pas exprimée de façon
constitutive et est surexprimée suite à une mutation sur le gène codant pour le répresseur
NfxB (Poole, et al., 1996). Cette pompe est alors à l’origine de l’efflux des céphèmes ( -
lactamines), des quinolones, des macrolides, de la tetracycline et du chloramphénicol. En ce
qui concerne la pompe MexE–MexF–OprN, impliquée principalement dans l’efflux des
quinolones, du chloramphénicol et du triméthoprime, une mutation sur le gène codant pour le
régulateur MexT entraine une surexpression de la pompe corrélée à une augmentation de la
résistance aux carbapénèmes (Kohler, et al., 1999). Enfin, la pompe MexX–MexY–OprM est
à l’origine de l’efflux des aminoglycosides, de la tetracycline et de l’érythromycine (Masuda,
- 79 -
et al., 2000). Une mutation sur le gène codant pour le répresseur MexZ entraine une
surproduction de la pompe, augmentant la résistance aux aminoglycosides et fluoroquinolones
(Mao, et al., 2001).
Plusieurs pompes à efflux ont été mises en évidence chez S. maltophilia. Ces pompes sont
également constituées d’une protéine membranaire, d’un transporteur énergie-dépendant et
d’une protéine située dans la membrane externe. Notamment, la pompe SmeDEF participe à
la résistance à la tétracycline, au chloramphénicol, à l’érythromycine, à la norfloxacine et à
l’ofloxacine et est exprimée chez 33 % des souches (Alonso & Martinez, 2001). Une
surexpression de cette pompe suite notamment à une mutation sur le gène codant pour le
répresseur SmeT augmente la résistance aux quinolones (Sanchez, et al., 2004). La pompe
SmeABC, quant à elle, est responsable de la résistance la ciprofloxacine (Chang, et al., 2004).
Une surexpression de cette pompe, suite à la perte du répresseur SmeR, serait à l’origine
d’une résistance accrue aux aminoglycosides, aux -lactamines et aux quinolones (Li, et al.,
2002). Une délétion de smeC mais pas smeD supprime cette résistance, suggérant que smeC
serait impliqué dans la résistance indépendamment de smeAB. L’expression de ce gène serait
corrélée à l’activité de la -lactamase L2, responsable de l’augmentation de la résistance aux
-lactamines observées chez les souches hyperproductrices de la pompe SmeABC. Toutefois,
les mécanismes permettant cette co-régulation restent inconnus à ce jour. Le séquençage du
génome de S. maltophilia a mis en évidence un grand nombre de pompes à efflux mais leur
implication dans la résistance n’est pas encore connue (Crossman, et al., 2008).
 Résistance due à l’inactivation enzymatique de l’antibiotique

La présence d’enzymes inactivant les antibiotiques va être impliquée dans la résistance aux -
lactamines et aux aminoglycosides chez P. aeruginosa et S. maltophilia. P. aeruginosa
possède une AmpC -lactamase chromosomique (ou céphalosporinase) permettant
notamment la résistance à la pénicilline G et aux céphalosporines de 1ère et 2ème génération
(Bagge, et al., 2002). Parmi les différentes familles de -lactamases, les ESBL (Extended
Spectrum Beta-Lactamase), notamment les métallo- -lactamases (MBL ou carbapénèmases)
se sont répandues chez les souches cliniques de P. aeruginosa ces dernières années (Tableau
8). Ces enzymes confèrent la résistance à toutes les -lactamines à l’exception des
carbapénèmes et des monobactames, respectivement. Différentes classes d’ESBLs ont été
retrouvées chez différentes souches de P. aeruginosa. Les ESBL de classe A sont à l’origine
de résistance à certaines pénicillines, aux céphalosporines et à l’aztréonam (Weldhagen, et al.,
2003). Ces enzymes sont inhibées par l’acide clavulanique et le tazobactam (Nordmann &
- 80 -
Guibert, 1998). Différents types d’ESBL de classe A sont connues et les plus fréquemment
retrouvées chez P. aeruginosa sont les types TEM, SHV mais également PER, VEB,
GES/IBC et BEL (Strateva & Yordanov, 2009). Malgré une faible identité de séquences
nucléotidiques entre ces enzymes, leur profil hydrolytique est semblable. Les ESBL de classe
D ou oxacillinases (enzymes de type OXA) permettent également la résistance à certaines
pénicillines mais pas à la ceftazidime (Bert, et al., 2002). De plus, leur activité n’est pas
supprimée par les inhibiteurs de -lactamases (acide clavulanique et tazobactam). Enfin, les
ESBL de classe B ou métallo- -lactamases du fait de la présence de Zn2+ dans leur centre
actif (MBL ou carbapénèmases) sont à l’origine de la résistance à toutes les -lactamines, en
particulier les carbapénèmes et à l’exception de l’aztréonam. Ces enzymes ne sont pas
inhibées par l’acide clavulanique ou le tazobactam, mais par des chélateurs ioniques divalents
(Nordmann & Poirel, 2002). Les MBL de types VIM et IMP sont les plus fréquemment
rencontrées chez P. aeruginosa alors que la présence des types SPM et GIM n’a été rapportée
qu’occasionnellement (Strateva & Yordanov, 2009). Les ESBL sont souvent retrouvées dans
des zones géographiques particulières. Notamment, des souches de P. aeruginosa portant des
MBL sont fréquemment isolées en Asie mais des épidémies ont été décrites en Europe
(Aubron, et al., 2005, Walsh, 2005). De plus, les gènes codant pour ces enzymes sont
généralement présents sur des éléments génétiques mobiles, de type plasmides ou intégrons,
pouvant porter d’autres gènes de résistance. L’acquisition de tels éléments mobiles,
sélectionnés sous la pression antibiotique, participe à la multi-résistance de P. aeruginosa.
S. maltophilia quant à elle possède deux -lactamases chromosomiques inductibles appelées
L1 et L2. Ces enzymes ne sont toutefois pas exprimées chez toutes les souches cliniques
même après induction par une -lactamine. L’enzyme L1 est une métallo- -lactamase
dépendante de la présence de Zn2+, virtuellement capable d’hydrolyser toutes les -
lactamines, notamment les pénicillines, les céphalosporines, les carbapénèmes mais pas les
monobactames (Crowder, et al., 1998). De plus, cette enzyme n’est pas inhibée par
l’utilisation d’acide clavulanique comme inhibiteur des -lactamases. L’enzyme L2 est une
céphalosporinase qui hydrolyse l’aztréonam (Walsh, et al., 1997). Son activité est inhibée par
l’utilisation d’inhibiteurs des -lactamases. S. maltophilia serait également capable d’acquérir
des gènes par transfert horizontal, comme le montre la présence d’un gène codant pour une -
lactamase de type TEM sur un transposon chez une souche clinique (Avison, et al., 2000).
Les enzymes inactivant les aminoglycosides ou AME (Aminoglycoside Modifying Enzymes)
sont retrouvées dans 20 % des isolats cliniques de P. aeruginosa d’Europe et d’Amérique de
Sud (Poole, 2005). Ces enzymes se lient aux radicaux phosphate, adenyl ou acetyl de la
- 81 -
molécule antibiotique, ce qui diminue l’affinité de liaison de l’antibiotique modifié à sa cible
dans la cellule bactérienne (sous-unité 30S du ribosome). Ces enzymes sont portées par des
éléments génétiques mobiles (type plasmides, intégrons, transposons…) et se divisent en trois
classes : les aminoglycoside phosphoryltransférases (APH), les aminoglycoside
adenylytransférases (AAD) ou nucléotidyltransférases (ANT) et les aminoglycoside
acétyltransférases (AAC) (Vakulenko & Mobashery, 2003). Les plus fréquemment exprimées
chez P. aeruginosa sont l’AAC(6’)-II permettant la résistance à la gentamicine, la
tobramycine et la netilmicine, l’AAC(3)-I permettant la résistance à la gentamicine,
l’ACC(3)-II à l’origine de la résistance à la gentamicine, la tobramycine et la netilmycine,
l’AAC(6’)-I à l’origine de la résistance à la tobramycine, la netilmicine et l’amikacine et
l’ANT(2’)-I permettant la résistance à la gentamicine et la tobramycine (Miller, et al., 1997).
Différentes enzymes sont également retrouvées chez S. maltophilia, notamment l’AAC(6’)-Iz
permettant la résistance à la gentamycine et à la tobramycine (Li, et al., 2003), l’APH(3’)-IIa
à l’origine de la résistance à tous les aminoglycosides à l’exception de la gentamicine
(Okazaki & Avison, 2007). Le gène codant pour une acetyltransferase, potentiellement à
l’origine de la résistance au chloramphénicol, a été mis en évidence lors du séquençage de la
souche K279a (Crossman, et al., 2008).
 Résistance due la modification de la cible

La modification de la cible de l’antibiotique est un mécanisme fréquemment impliqué dans la
résistance aux fluoroquinolones. Ces antibiotiques inhibent la synthèse de l’ADN de la
bactérie en se fixant sur le complexe « ADN-ADN gyrase » en empêchant la réplication et la
transcription du génome bactérien (Hooper, 2000). Chez P. aeruginosa, la modification de la
cible préférentielle de ces antibiotiques, la DNA gyrase, aussi appelée topoisomérase II,
résulte de mutations ponctuelles sur les gènes gyrA et gyrB dans le motif QRDR (Quinolone
Resistant Determinative Region), considéré comme le site actif de l’enzyme (Mouneimne, et
al., 1999). De ce fait, les séquences en acides aminés des sous unités A et B sont altérées, ce
qui conduit à la synthèse d’une topoisomérase II présentant une faible affinité pour les
molécules de quinolones. Des modifications de la deuxième cible des quinolones : la
topoisomérase IV peuvent se produire également suite à des mutations ponctuelles dans les
gènes parC et parE codant pour les sous-unités ParC et ParE de l’enzyme (Lee, et al., 2005).
Chez S. maltophilia, la résistance aux quinolones n’implique pas la modification de l’enzyme.
Cette bactérie possède un gène qnr chromosomique codant pour un peptide nommé SmQnr
qui va se lier à la gyrase pour la protéger contre les quinolones. L’association Qnr-ADN
- 82 -
gyrase diminue ainsi l’affinité de l’enzyme pour l’antibiotique. Ce phénomène de résistance
est d’autant plus important que la quantité de SmQnr est importante, suggérant que
l’hyperproduction de ce peptide pourrait jouer un rôle principal dans la résistance (Sanchez &
Martinez, 2009).
 Résistance due à l’acquisition d’une nouvelle enzyme

La production d’une nouvelle enzyme pour améliorer l’affinité entre l’enzyme et le substrat
modifié par un antibiotique est un mécanisme que l’on retrouve chez S. maltophilia. En effet,
la résistance au triméthoprime associé au sulfaméthoxazole peut être due à l’acquisition d’un
intégron de classe 1 portant le gène sul1 (Barbolla, et al., 2004, Toleman, et al., 2007). Cette
association d’antibiotiques à pour cible la voie de synthèse des acides nucléiques. En
particulier, le sulfaméthoxazole est responsable de la modification du substrat, entrainant une
diminution de l’affinité pour l’une des enzymes impliquées. Le gène sul1 code pour une
nouvelle enzyme ayant moins d’affinité pour le substrat, ce qui permet une meilleure liaison
avec le substrat modifié. Même si l’acquisition de tels éléments mobiles est rare et
qu’actuellement plus de 80 % des souches isolées du milieu clinique sont sensibles à ces
antibiotiques, elle est en constante augmentation depuis sa mise en évidence (Barbolla, et al.,
2004). Une telle acquisition pose un réel problème dans le traitement des infections à S.
maltophilia du fait que cette association d’antibiotiques est à ce jour la thérapie privilégiée.
 Phénotype hypermutable des souches de P. aeruginosa

On observe chez les souches de P. aeruginosa isolées de patients atteints de mucoviscidose
des phénotypes de multi-résistance aux antibiotiques suite à des mutations. Ces souches sont
qualifiées d’hypermutables. Elles sont présentent dans 37 % des patients atteints de
mucoviscidose et représentent 20 % des isolats de ces patients. Ce phénotype est lié à une
mutation sur les gènes impliqués dans la réparation de l’ADN mutS et mutY (Oliver, et al.,
2000). Les mécanismes de réparation sont alors déficients et la pression antibiotique élevée
chez ces patients sélectionne des souches résistantes à tous les antibiotiques potentiellement
utilisables contre P. aeruginosa. En effet, comme nous l’avons vu dans les paragraphes
précédents, des mutations ponctuelles peuvent être à l’origine d’une augmentation de la
résistance aux -lactamines, aminoglycosides ou encore fluoroquinolones.
- 83 -
III-2-b- Résistance aux métaux (ou éléments trace métalliques)
Les métaux sont naturellement présents dans l’environnement et largement distribués sur la
planète. La présence de métaux dans les sols résulte de processus naturels et est notamment
liée à l’évolution de la roche mère contenant initialement des métaux. Certaines activités
humaines, agricoles ou industrielles, contribuent à mobiliser ces métaux modifiant leur teneur
et spéciation dans l’environnement. Les sources de contamination par l’Homme sont
diverses : apports par épandage de boues de stations d’épuration, apports d’engrais, de
produits phytosanitaires, de lisiers, de composts urbains, irrigation avec des eaux résiduelles
agro-industrielles, rejets atmosphériques (poussières et aérosols) à proximité d'axes routiers
ou de sites industriels anciens, ou encore apports massifs suite à des accidents ponctuels ou
encore des transferts latéraux par ruissellement en bordure de route.
Certains de ces métaux, comme le zinc ou le cuivre, sont indispensables aux processus
biologiques et deviennent toxiques à partir d’une concentration seuil alors que d’autres sont
toxiques même à faible concentration (cas du mercure et du cadmium). Différents paramètres
influencent la biodisponibilité des métaux dans les sols et donc leur toxicité. Parmi ces
paramètres, le pH joue un rôle essentiel dans la solubilité des métaux. Ainsi, un pH acide
entraine une solubilisation des métaux, les rendant plus disponibles et donc potentiellement
plus toxiques. La composition du sol est également impliquée. L’argile et la matière
organique adsorbent les éléments et les séquestrent sous forme de complexes stables
faiblement mobiles alors que les particules plus grossières comme le sable ou le gravier
retiennent moins les métaux, augmentant leur biodisponibilité.
Les bactéries ont été soumises à la présence de métaux depuis leur émergence sur Terre. Il est
de ce fait peu probable que les mécanismes à l’origine de résistance aient été sélectionnés
suite à des pollutions anthropiques récentes mais qu’elles soient plutôt apparues au cours de
leur évolution suite à une pression métallique naturelle (Silver & Phung le, 2005). Plusieurs
mécanismes généraux ont été mis en évidence tels que la réduction de la perméabilité
membranaire par l’efflux actif nécessitant la présence de pompes à efflux, la séquestration du
métal ou la modification de la forme chimique du métal. De la même façon que pour les
résistances aux antibiotiques, les déterminants génétiques à l’origine des résistances aux
métaux lourds peuvent être portés par le chromosome entrainant une résistance intrinsèque ou
bien par un élément génétique mobile entrainant une résistance acquise.
- 84 -
Bien que S. maltophilia et P. aeruginosa aient été fréquemment isolées d’environnements
contaminés en métaux, peu d’études sont menées afin d’identifier les mécanismes impliqués
dans la résistance.
Chez P. aeruginosa, plusieurs mécanismes de résistance aux métaux ont été décrits.
Notamment, Hassan et collaborateurs ont mis en évidence l’implication de la pompe à efflux
CzcCBA dans la résistance au cadmium, zinc et cobalt chez P. aeruginosa (Hassan, et al.,
1999). Malgré une position chromosomique des gènes impliqués, toutes les souches de P.
aeruginosa ne semblent pas capables de tolérer les mêmes concentrations en métaux. Les
auteurs de cette étude ont alors émis l’hypothèse de variations au niveau de la régulation des
gènes codant pour la pompe à efflux. L’effet de la présence du cuivre sur l’expression des
gènes de P. aeruginosa a été récemment évalué (Teitzel, et al., 2006). Cette étude a mis en
évidence l’importance des pompes à efflux dans la tolérance au cuivre, notamment de la
pompe CzcCBA, d’une protéine de liaison au cuivre homologue à celle codée par les gènes
copAB chez P. syringae, d’une putative cuivre oxidase codée par les gènes cpoAB et d’un
système de régulation à deux composants nommé CopR/CopS présentant une homologie au
système également présent chez P. syringae, impliqué chez cette espèce dans la régulation des
gènes copAB et cpoAB. En ce qui concerne la résistance au mercure, elle est permise par un
mécanisme enzymatique permettant de réduire le Hg2+ en Hg0 volatile. Cette réduction est
possible grace à la mercurique réductase codée par le gène merA, présent dans l’opéron
merRTPA, codant pour des protéines de transport (merT et merP) et un régulateur (merR). Ces
gènes sont fréquemment retrouvés sur des éléments génétiques mobiles, notamment sur des
ilots génomiques chez P. aeruginosa. Au sein des génomes séquencés, on remarque que
l’opéron mer est présent chez PA14 avec une homologie de 99 % avec l’opéron présent sur le
transposon Tn501. Le génome de PA7 quant à lui contient 3 opérons mer dont un homologue
à celui du Tn501, un homologue à celui de l’ilot génomique PAGI-5 et un partiel homologue
à celui trouvé chez P. stutzeri. Enfin, le génome de LESB58 contient un opéron mer
homologue à celui présent sur l’ilot génomique PAGI-2. Des études ont également mis en
évidence la présence de plasmides portant l’opéron mer chez certaines souches de P.
aeruginosa (Clark, et al., 1977).
En ce qui concerne S. maltophilia, une étude menée sur la souche sm777 présentant des multi-
résistances aux métaux a mis en évidence certains mécanismes impliqués dans la résistance au
sélénite, tellurite et cadmium (Pages, et al., 2008). Chez cette souche, la résistance au sélénite
et au tellurite serait due à la transformation en Se0 et Te0 et à leur accumulation dans des
granules et sous forme de cristaux, respectivement. La résistance au cadmium, quant à elle,
- 85 -
serait due à la chélation du cadmium et à son accumulation sous forme non toxique. Le
séquençage des génomes a mis en évidence plusieurs opérons potentiellement impliqués dans
la résistance aux métaux tels que les opérons mer, potentiellement impliqué dans la résistance
au mercure, cop potentiellement impliqué dans la résistance au cuivre, ou encore czc
potentiellement impliqué dans la résistance au zinc, cadmium et cobalt. Toutefois, des études
sont nécessaires afin de corréler la présence de ces gènes et les capacités de tolérance aux
métaux (Rocco, et al., 2009).
III-2-c- Co-sélection de résistance aux antibiotiques et aux métaux
Des phénomènes de co-sélection de résistance aux antibiotiques et aux métaux ont été mis en
évidence chez nos deux modèles. Notamment, Alonso et collaborateurs ont mis en évidence
chez une souche de S. maltophilia d’origine clinique isolée de l’expectoration d’une personne
atteinte de mucoviscidose, la présence d’un groupe de gènes potentiellement impliqués dans
la résistance à l’érythromycine et au cadmium (Alonso, et al., 2000). Cette région présente
des homologies de séquence importantes avec une région présente sur un plasmide de
Staphylococcus aureus, bactérie à gram positif, suggérant une acquisition secondaire de cette
région (Tenover, et al., 1994). De plus, le pourcentage en GC, très différent de celui du reste
du génome de S. maltophilia (35,1 % au lieu d’environ 65 %) est également en faveur d’une
acquisition secondaire de ce fragment. Des échanges de gènes entre bactéries Gram négatif et
Gram positif ont déjà été mis en évidence et nécessitent que les bactéries partagent la même
niche écologique. Dans le cas de S. maltophilia et S. aureus, de telles situations sont
observables dans le cas de co-infection, en particulier lors d’infections chroniques telles que
celles observées chez les personnes atteintes de mucoviscidose (Harrison, 2007). Il n’est pas à
exclure que ce type d’échange puisse également avoir lieu dans l’environnement entre S.
maltophilia et des bactéries Gram positif partageant la même niche telles que Bacillus spp..
Un phénomène de co-régulation a récemment été décrit chez P. aeruginosa. Il a tout d’abord

été mis en évidence que la présence de zinc dans les éluats de cathéter urinaire en latex
siliconé entrainait une augmentation de la résistance aux carbapénèmes liée à la répression de
la porine OprD, qui permet l’entrée de l’antibiotique dans la cellule bactérienne (Conejo, et
al., 2003). L’implication du système de régulation à deux composants CzcR/CzcS dans ce
phénomène a ensuite été décrite. En effet, en présence de zinc (ou de cadmium), ce système
- 86 -
augmente l’expression de la pompe à efflux CzcCBA à l’origine de l’efflux du zinc, cadmium
et cobalt et va également réprimer l’expression de la porine OprD, diminuant l’entrée de
l’imipénème dans la bactérie (Perron, et al., 2004). De plus, une mutation sur le gène czcS,
sélectionnée suite à une exposition à une forte concentration de zinc (20 mM), peut entrainer
une activité continue du système de régulation qui réprime de façon permanente l’expression
de la porine OprD et entraine de ce fait une résistance permanente aux carbapénèmes.
Il a également été montré que la présence de cuivre avait le même effet sur la résistance à
l’imipénème (Caille, et al., 2007). Ce phénomène implique un deuxième système de
régulation à deux composants appelé CopR/CopS qui va induire l’expression de la pompe à
efflux permettant la résistance au cuivre et va également réprimer l’expression de la porine
OprD. L’induction de ce système permettrait également la résistance au zinc et cadmium en
activant le système CzcR/CzcS. Ces observations sont très importantes d’un point de vue
clinique car l’imipénème est fréquemment utilisé comme antibiotique de dernier recours
contre les infections à P. aeruginosa. L’utilisation de ce type de traitement chez les personnes
développant une infection urinaire à P. aeruginosa nécessitant la mise en place d’un cathéter
risque donc d’avoir un effet limité.
Conclusion
Ainsi, cette revue bibliographique se rapportant aux deux bactéries pathogènes opportunistes
P. aerugionsa et S. maltophilia a permis de mettre en évidence la complémentarité de ces
deux modèles dans mon étude. Tout d’abord, nous avons pu constater que ces bactéries
étaient largement répandues dans l’environnement et de nombreuses études ont rapporté leur
présence dans une grande variété d’environnements. Ces deux modèles sont retrouvés à la fois
dans des environnements naturels et des environnements fortement anthropisés. Toutefois,
leur prévalence dans de tels écosystèmes est souvent inconnue. En particulier, un manque
d’informations concernant la quantité et la diversité des isolats des deux modèles présents
dans les sols ainsi que l’aptitude de P. aeruginosa à y survivre, a été mis en évidence dans la
première partie de ce chapitre.
L’implication en santé humaine de ces bactéries pathogènes opportunistes a également fait
l’objet de nombreuses études. Elles sont responsables d’infections chez des personnes
fragilisées dont les défenses immunitaires sont altérées et entraînent des pathologies aux
- 87 -
symptômes variés en fonction de la localisation de l’infection. Leur présence dans
l’environnement hospitalier cause un réel problème de santé publique et les moyens mis en
œuvre pour réduire leur dispersion n’ont qu’un effet limité.
La réussite de l’interaction avec l’hôte résulte notamment de l’aptitude de ces deux modèles à
être mobiles, à adhérer aux cellules de l’hôte, à échapper à son système immunitaire, à former
des biofilms, à communiquer par quorum sensing et également à résister aux antibiotiques.
Toutes ces capacités pourraient également intervenir dans la grande capacité de ces bactéries à
survivre dans une grande variété d’environnements. Toutefois, peu d’études sont menées dans
un but de mieux appréhender le rôle de ces fonctions dans l’environnement, notamment en ce
qui concerne les capacités de résistance aux antibiotiques de ces deux modèles bactériens.
Pourtant, la présence de déterminants génétiques impliqués dans la résistance aux
antibiotiques dans l’environnement a été rapportée. Il est donc essentiel d’évaluer la capacité
de résistance des isolats environnementaux ainsi que la prévalence de ces souches dans les
populations indigènes et de comparer les comportements de ces souches par rapport aux
souches d’origine clinique. Il semble également nécessaire de mettre en évidence les
paramètres qui favorisent la présence de souches résistantes et les déterminants impliqués
dans ces résistances, tels que les contaminations métalliques qui pourraient être à l’origine de
l’émergence et du maintien de résistance aux antibiotiques par des phénomènes de co-
sélection de résistance aux métaux et aux antibiotiques.
- 88 -
PARTIE II : Partie Expérimentale
PART II : Experimental part
- 89 -
- 90 -
Chapitre 1 : Distribution des modèles Pseudomonas aeruginosa et
Stenotrophomonas maltophilia dans les sols, effets de l’anthropisation sur
leur présence et leur abondance
Chapter 1: Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia

distribution in soils, effects of anthropization on their presence and
abundance
- 91 -
- 92 -
Introduction
P. aeruginosa et S. maltophilia sont des bactéries Gram négatif de la classe des -

protéobactéries fréquemment qualifiées d’ubiquistes et présentant des capacités d’adaptation à
un grand nombre d’environnements terrestres et aquatiques naturels, anthropisés ou créés par
l’Homme. Toutefois, ces bactéries sont surtout connues pour leur fréquente implication dans
des infections nosocomiales faisant de ces espèces des pathogènes opportunistes d’importance
majeure en santé publique (Berthelot, et al., 2005). Nous avons pu constater tout au long de la
revue bibliographique présentée dans le premier chapitre de cette thèse que ces modèles font
l’objet de nombreuses études dans le milieu clinique. Ces bactéries sont impliquées dans une
grande variété d’infections chez les personnes dont les barrières immunitaires sont fragilisées
(personnes immunodéprimées, brulées, diabétiques…) (Mesaros, et al., 2007). Elles sont
également capables de coloniser les poumons des personnes atteintes de mucoviscidose et
peuvent créer des dommages irréversibles dans les tissus (Foweraker, 2009). Dans ce
contexte, de nombreuses études sont menées dans le but d’évaluer la prévalence, la
distribution et la diversité de ces bactéries dans l’environnement hospitalier afin de mettre en
évidence l’origine des infections. Des réservoirs potentiels pouvant être à l’origine de la
transmission aux patients, tels que le matériel médical (cathéter, appareil respiratoire,
sondes…) ou le réseau d’eau (robinet, lavabo, douche…) ont été mis en évidence (Denton &
Kerr, 1998, Trautmann, et al., 2005). Les études de diversité menées sur les souches
hospitalières montrent généralement une grande diversité, certains clones présentant des
capacités plus importantes à coloniser de façon durable le milieu hospitalier et pouvant être
responsables d’infections (Lavenir, et al., 2008). Les mécanismes impliqués dans la réussite
de l’interaction avec l’hôte sont largement investigués chez les isolats responsables
d’infections. Les facteurs de virulence tels que les capacités d’adhésion (Feldman, et al.,
1998, de Oliveira-Garcia, et al., 2003), la formation de biofilms (Wagner & Iglewski, 2008)
ou la sécrétion de toxines entrainant des dommages chez l’hôte (Windhorst, et al., 2002,
Veesenmeyer, et al., 2009) ainsi que les capacités de résistance aux antibiotiques et
antiseptiques (Nicodemo & Paez, 2007, Strateva & Yordanov, 2009) sont essentiels à la
réussite de l’infection et à leur survie et leur dispersion dans le milieu clinique. Ces capacités,
en particulier celles de résister aux antibiotiques, pourraient également participer à la grande
capacité d’adaptation des modèles dans l’environnement. Toutefois, l’étude des capacités de
- 93 -
résistance des souches environnementales de P. aeruginosa et S. maltophilia font l’objet de
peu d’études.
Bien que leur présence ait été rapportée à de nombreuses reprises dans une grande variété
d’environnements terrestres et aquatiques, peu d’informations sont actuellement disponibles
sur leur distribution et leur abondance ainsi que sur les facteurs favorisant leur présence et
leur dispersion dans les sols. La présence de P. aeruginosa en tant qu’habitant indigène du sol
est d’ailleurs controversée. Les études menées sur les sols, pour la plupart relativement
anciennes, sont rares et les résultats obtenus contradictoires (Ringen & Drake, 1952, Green, et
al., 1974). Sa capacité de survie a également été remise en question suite à l’observation de la
mort rapide de souches de P. aeruginosa inoculées dans des microcosmes de sol (Zechman &
Casida, 1982). En revanche, le présence de S. maltophilia a été rapportée à de nombreuses
reprises dans la rhizosphère de différentes plantes (Berg, et al., 1996). Toutefois, dans la
majorité des cas, l’abondance et les facteurs favorisant sa présence et sa distribution sont
inconnus. Différentes études ont montré la présence de ces modèles dans des environnements
terrestres et aquatiques fortement anthropisés, ayant subi des contaminations en hydrocarbures
(Cavalca, et al., 2000, Hawle-Ambrosch, et al., 2007) ou en métaux lourd (Matyar, et al.,
2008, Matyar, et al., 2009). De plus, les isolats présents dans de tels environnements sont
généralement capables de résister à un spectre de molécules plus large incluant les
antibiotiques (Filali, et al., 2000, Matyar, et al., 2008).
Les sols peuvent être considérés comme un réservoir de déterminants génétiques impliqués
dans la résistance aux antibiotiques (D'Costa, et al., 2007). De plus, les activités anthropiques
entrainant des modifications des écosystèmes et de ce fait des changements dans les
communautés indigènes favoriseraient la sélection de mécanismes de résistance (Nazaret, et
al., 2003). Un travail préliminaire à l’évaluation de l’effet des pressions anthropiques
présentes dans les sols sur la sélection de résistance aux antibiotiques chez les modèles P.
aeruginosa et S. maltophilia sera d’accroitre les connaissances sur la prévalence des modèles
dans les sols et les facteurs qui vont influencer leur présence, leur maintien et leur dispersion.
L’objectif de ce premier chapitre est d’évaluer la présence et l’abondance de P. aeruginosa et

S. maltophilia dans les sols ainsi que l’influence de certaines activités humaines notamment
industrielles et agricoles sur cette distribution. Pour cela, la présence des modèles a été
recherchée par méthode cultivable à l’aide de milieux sélectifs : CAB (Cetrimide Agar Base)
additionné d’acide nalidixique et VIA (Vancomycine Imipénème Amphotéricyne B)
permettant respectivement l’isolement de P. aeruginosa et S. maltophilia, dans des sols de
- 94 -
France (Centre, Lorraine, Bourgogne, Limousin, Ile de France, Rhône Alpes) et d’Afrique
(Tunisie, Burkina Faso). L’identification des isolats a ensuite été confirmée par méthode
génétique (recherche de gènes spécifiques d’espèce et séquençage du gène codant pour
l’ARNr 16S) et méthode biochimique (galerie API ou vitek2 (Biomérieux)). Parallèlement à
l’approche cultivable, une approche indépendante de la culture a été utilisée afin de
contourner une sous-estimation des effectifs du fait de la présence de cellules viables mais
potentiellement non cultivables par l’approche cultivable ou de rendre seulement compte de la
présence passée de ces deux espèces (persistance de l’ADN) par l’approche indépendante de
la culture. Ainsi, des tests de PCR semi-quantitative avec des amorces spécifiques des
modèles (ecfX pour P. aeruginosa (Lavenir, et al., 2007) et smeD pour S. maltophilia
(Ribbeck-Busch, et al., 2005)) ont été réalisés sur ADN total extrait de sol contenant une
concentration en cible connue. Du fait de leur origine géographique très variée, les sols
échantillonnés présentent des caractéristiques physico-chimiques et des couverts végétaux
différents et sont également soumis à des climats différents. Des pratiques agricoles
communes telles que l’irrigation et l’apport d’amendements organiques sont appliquées sur
certains de ces sols. Toutefois, les législations concernant la composition des eaux
d’irrigations et des amendements étant différentes entre les pays échantillonnés, la
composition physico-chimique et microbiologique des apports est variable en fonction des
sites. Cette étude a également eu pour objectif de constituer une collection de souches
d’origine environnementale indispensable à la suite de mes travaux de thèse. En effet, une
étude comparative des capacités de résistance aux antibiotiques et aux métaux sera réalisée
sur une collection de souches d’origine hospitalière et environnementale de façon à évaluer
l’effet de différentes activités anthropiques sur la sélection et le maintien des résistances. Pour
cela, il est nécessaire de disposer d’un pool conséquent de chaque type de souches. La
constitution d’une collection de souche d’origine hospitalière peut être facilement réalisée,
surtout en ce qui concerne P. aeruginosa, du fait de la disponibilité de nombreuses souches de
collections internationales. La disponibilité des informations concernant le contexte
d’isolement de ces souches, le type d’infection, le traitement suivi par le patient peuvent
également être faciles d’accès. En revanche, il est beaucoup plus difficile de constituer une
collection de souches d’origine environnementale car peu de souches sont disponibles dans
les collections internationales. De plus, les informations concernant le contexte d’isolement de
ces souches et les caractéristiques des environnements d’origine sont rares. La constitution
d’une collection de souches d’origine environnementale est donc une étape indispensable,
représentant une activité importante de l’équipe et passe par l’isolement, l’identification et la
- 95 -
caractérisation d’isolats provenant d’environnements variés et mieux caractérisés. C’est
pourquoi les résultats présentés dans ce chapitre résultent de travaux effectués sur plusieurs
années, certains initiés avant le début de ma thèse. Ainsi, j’ai participé aux études menées sur
les sols de Tunisie, du Burkina Faso et de la région Ile de France (Feucherolles et Pierrelaye)
(Figure 22).
Figure 22. Présentation des sites étudiés.
- 96 -
Introduction (English version)
P. aeruginosa and S. maltophilia are Gram negative bacteria belonging to the -proteobacteria
class. These ubiquitous bacteria present a high adaptability to a wide range of natural, as well
as to anthropogenic terrestrial and aquatic environments. However, these bacteria are also
known for their frequent implication in nosocomial infections enabling to qualify them of
opportunistic pathogens of major public health concern (Berthelot, et al., 2005). We have seen
throughout the first part of this thesis that these models are widely studied in the clinical
setting. These bacteria are involved in a variety of infections in people whose immune barriers
are weakened (immunocompromised people, burnt, diabetics...) (Mesaros, et al., 2007). They
are also able to colonize lungs of cystic fibrosis individuals and can create irreversible
damage to the tissues (Foweraker, 2009). In this context, numerous studies aimed at
evaluating the prevalence, the distribution and the diversity of these bacteria in the hospital in
order to highlight the origin of the infection. Potential reservoirs that can be responsible of the
transmission to patients as medical equipments (catheters, respiratory equipment, probes…)
or water network (faucet, sink, shower...) have been highlighted (Denton & Kerr, 1998,
Trautmann, et al., 2005). The diversity studies conducted on hospital strains generally show a
great diversity, some clones presenting higher capacity to colonize hospitals for long time and
being responsible of infections (Lavenir, et al., 2008). Mechanisms involved in the successful
interaction with the host are widely investigated in isolates responsible of infections.
Virulence factors as adhesion capacity (Feldman, et al., 1998, de Oliveira-Garcia, et al.,
2003), biofilm formation (Wagner & Iglewski, 2008) or toxin secretion leading to damage in
the host (Windhorst, et al., 2002, Veesenmeyer, et al., 2009) as well as antibiotic and
antiseptic resistance capacities (Nicodemo & Paez, 2007, Strateva & Yordanov, 2009) are
essential to their success of infection and their survival and dispersal in the hospital. These
capacities, especially antibiotic resistance, could also participate to the important adaptability
of the two models in the environment. However, resistance capacities of environmental
isolates of P. aeruginosa and S. maltophilia are poorly studied.
While their presence was reported in a wide range of terrestrial and aquatic environments,
little information is currently available on their distribution and abundance, as well as factors
that promote their presence and their dispersion in soils. The presence of P. aeruginosa as an
- 97 -
indigenous resident of soil is controversial. Most of the studies conducted on soil samples are
ancient and rare, leading to contradictory results (Ringen & Drake, 1952, Green, et al., 1974).
Its ability to survive in soil has been questioned following the observation of the rapid death
of strains of P. aeruginosa inoculated into soil microcosms (Zechman & Casida, 1982). On
the opposite, the presence of S. maltophilia has been reported numerous times in the
rhizosphere of different plants (Berg, et al., 1996). However, in most case, abundance and
factors favouring its presence and its distribution are unknown. Different studies also showed
the presence of the two models in terrestrial and aquatic environments highly impacted by
anthropogenic acivities, having undergone contamination to hydrocarbons (Cavalca, et al.,
2000, Hawle-Ambrosch, et al., 2007) or heavy metals (Matyar, et al., 2008, Matyar, et al.,
2009). Moreover, isolates present in such environments are generally able to resist to a wide
spectrum of molecules, including antibiotics (Filali, et al., 2000, Matyar, et al., 2008). Soil
can be considered as a reservoir of genetic determinants implicated in antibiotic resistance
(D'Costa, et al., 2007). Moreover, anthropogenic activities leading to modifications in
ecosystems could favour resistance mechanism selection in the indigenous communities. A
preliminary work to the evaluation of the role of anthropogenic activities in soils on antibiotic
resistance selection in P. aeruginosa and S. maltophilia is to increase knowledge on the
prevalence of the two models in soils and on the factors that could influence their presence,
maintenance and spread.
The aim of this chapter is i) to evaluate the presence and abundance of P. aeruginosa and S.
maltophilia in soils from various geographical origins in soils (Center, Lorraine, Burgundy,
Limousin, Ile de France, Rhône-Alpes regions in France as well as Tunisia and Burkina Faso
in Africa) and various physico-chemical characteristics, and ii) to evaluate how human
activities associated to agricultural practices i.e. irrigation and organic amendments, modify
pathogen distribution. The detection and quantification of the models was investigated by
culturable method using selective media (CAB (Cetrimide Agar Base) + nalidixic acid and
VIA (Imipenem Vancomycin Amphotéricyne B) for the isolation of P. aeruginosa and S.
maltophilia, respectively). Identification of the isolates was then confirmed by molecular
methods (search for species specific genes and sequencing of the 16S rRNA gene) and
biochemical methods (VITEK2 gallery (Biomerieux)). A culture-independent method was
also used in order to bypass an underestimation of the effectives due to the presence of viable
but not culturable cells with culture dependant method or to highlight the presence of past
presence of the models (DNA persistence). Semi-quantitative PCR tests with species specific
- 98 -
primers (ecfX (Lavenir, et al., 2007) and smeD (Ribbeck-Busch, et al., 2005)) were performed
on total DNA extracted from soil containing a known concentration of target as previously
evaluated by the culture based approach.
This study also aimed at constituting a collection of strains of environmental origin, essential
to pursue the work. Indeed, a comparative study of heavy metal and antibiotic resistance will
be performed on a collection of hospital and environmental strains in order to evaluate the
effect of different human activities on the selection and maintenance of the resistances. To
optimize the reliability of the results we have to compare a representative pool of each group
(hospital origin versus environmental origin) of strains. Constituting a collection of strains
originating from the hospital can be easily performed, especially for P. aeruginosa, since
numerous strains are available in international collections. Moreover, information about the
isolation context, the type of infection and the therapy can be easily obtained. On the
opposite, it is more difficult to constitute a collection of strains from the environment since
few strains are available in international collections and information concerning these strains
is often scarce. Constituting a collection of strains from the environment is a necessary step,
representing an important activity of the research team and requiring the isolation,
identification and characterization of isolates from various and well characterized
environments. That is why results presented in this chapter originated from works done during
many years some of them starting several years before my Ph. D. So, I have participated to
the studies conducted on the soils sampled in Tunisia, Burkina Faso and the Ile de France
region (Feucherolles and Pierrelaye) (Figure 22, page 90).
- 99 -
- 100 -
“Different occurrence of the opportunistic pathogens Pseudomonas aeruginosa and
Stenotrophomonas maltophilia in soils”
Amélie Deredjian1*, Elisabeth Brothier1, Dominique Jocktane1, Edmond Hien2, Sabine

Houot3, Makram Amane4, Lamia Bouziri Kemayel4, Claudy Jolivet5, Sabine Favre-Bonté1,
Sylvie Nazaret1
1
Université de Lyon, France; Research Group on « Bacterial Opportunistic Pathogens and
Environment », UMR 5557 Ecologie Microbienne, CNRS, Ecole Nationale Vétérinaire de
Lyon, and Université Lyon 1, France.
2
Université de Ouagadougou, UFR /SVT 03 BP 7021 Ouagadougou 03, Burkina Faso
3
INRA, UMR 1091 Environnement et Grandes Cultures, F-78850 Thiverval-Grignon, France
4
Laboratoire de Traitement et Recyclage des Eaux, Centre de Recherches et Technologies
Des Eaux, BP. 273, Borj Cédria, Soliman, 8020, Tunisia
5
INRA, Unité INFOSOL, 2163 Avenue de la Pomme de Pin, 45075 Orléans, France
Short running title: Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia in soils
Keywords: P. aeruginosa, S. maltophilia, selective media, PCR identification, detection,

soil, irrigation, organic amendment.
* Corresponding author. Mailing address: UMR 5557 Ecologie Microbienne, Université Lyon
1, Mendel Bldg., 5th Floor, F-69622 Villeurbanne Cedex, France. Phone: 33 (0) 4 72 43 13
24. Fax: 33 (0) 4 26 23 44 68. E-mail: [email protected].
- 101 -
ABSTRACT
The occurrence of the human opportunistic pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa and
Stenotrophomonas maltophilia was monitored in soils exposed to different anthropogenic
constraints (industrial sites and agricultural soils associated to different irrigation and
amendment practices) and from various geographical regions (France, Tunisia, and Burkina
Faso). A strategy based on culture using selective media, cetrimide agar base supplemented
with nalidixic acid for P. aeruginosa isolation, and VIA (vancomycine, imipenem,
amphotericin B) agar media for S. maltophilia isolation, coupled to the confirmation of the
isolate identity using validated molecular tools was used. These media enable to quantify
from 101 CFU / g of dry soil, whereas PCR tests with species specific primers on soil DNA
containing known concentration of added cells of P. aeruginosa or S. maltophilia showed a
sensitivity of 104 CFU / g of dry soil. However, the media used enable the growth of other
species, sometimes reducing their selectivity. Results showed that P. aeruginosa was rarely
isolated from soils except from French industrial sites contaminated with hydrocarbons and a
vineyard soil amended with mushroom manure in Burgundy, suggesting a sporadic presence
of this bacterium in soil. On the opposite successful isolation of S. maltophilia was obtained
for most of the tested soils irrespective of their geographical origin. Differences among
sampling sites were observed with regard to S. maltophilia population abundance, which
represented from 0.001 to 1.2 % of the total heterotrophic microflora. Intra-site variations
were also observed and agricultural practices as irrigation with wastewater or organic
amendments were associated to the increase of S. maltophilia abundance.
- 102 -
INTRODUCTION
Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia are Gram negative rods of the -
subclass of Proteobacteria both considered to be of significance as opportunistic human
pathogens being of major concern in nosocomial infections (i.e. hospital-acquired diseases)
(Denton & Kerr, 1998, Kerr & Snelling, 2009). They are characterized by their ability to
cause diseases in patients with a strong pre-disposition to illness, particularly in those who are
severely debilitated, immuno-compromised or suffering from cystic fibrosis or HIV-
infections. Increasing worldwide population and of at risk population consecutive to advances
in medical therapy might then favour the incidence of infections by these opportunistic
pathogens. Knowledge about their ecology and natural reservoirs is therefore important to
avoid infections and outbreak. These two species are ubiquitous in a wide variety of aquatic
and terrestrial environments including those generated by human activities and can colonize
human, animals and plants (Ringen & Drake, 1952, Denton & Kerr, 1998, Goldberg, 2000,
Berg, et al., 2005). They can be found together in polymicrobial communities of diverse
niches including the rhizosphere of plants (Berg, et al., 2005) and the cystic fibrosis lungs
(Foweraker, 2009). They share in common potential for biotechnological applications i.e.
plant growth promotion, biological control of plant pathogens (Berg, et al., 2005), and
bioremediation activities (Hickey & Focht, 1990, Binks, et al., 1995). They also have a
considerable capacity of antibiotic-resistance and metabolic versatility (Pirnay, et al., 2002,
Crossman, et al., 2008) and show ability to form biofilm and to synthesize signaling
molecules and antibacterial metabolites (Dietrich, et al., 2006, Ryan, et al., 2008).
Regarding distribution in the environment P. aeruginosa is described as preferentially living
in aquatic habitats and colonizing moist niches. It has been isolated from a wide range of
water sources including rivers (Pellett, et al., 1983, Pirnay, et al., 2005), seawater (Yoshpe-
Purer & Golderman, 1987), open ocean (Khan, et al., 2007), distilled water (Favero, et al.,
1971), bottled mineral waters (Hunter, 1993), hydrotherapy facilities (Moore, et al., 2002) and
can be recovered in high numbers from recreative waters (Barben, et al., 2005) or wastewater
(Filali, et al., 2000, Lavenir, et al., 2007). Within hospital it has been isolated from sinks and
tubs (Romling, et al., 1994), tap water outlets (Reuter, et al., 2002), water pipes (Lavenir, et
al., 2008), and even antiseptics (Anaissie, et al., 2002). Its isolation from ornamental plants
(Cho, et al., 1974) or vegetables (Wright, et al., 1976) as well as its detection in agricultural
soils (Green, et al., 1974, Marques, et al., 1979) have also been reported. However the
potential for terrestrial environments to constitute its natural habitat is still controversial since
- 103 -
the frequency of detection is low and its occurrence seems sporadic. For instance Ringen et al.
(1952) isolated this bacteria from 3 out of 100 soils tested but could not re-isolated it later
raising the question of its survival. Further studies on the hydrocarbon contaminated
environments showed that P. aeruginosa is often present within contaminated soils from
various geographical regions and participates to the degradation of the hydrocarbons
(Sagardia, et al., 1975, Deziel, et al., 1996, Norman, et al., 2002, Das & Mukherjee, 2007,
Kaszab, et al., 2009). On the opposite S. maltophilia, previously referred to as P. maltophilia
and then Xanthomonas maltophilia, is usually reported as a telluric bacteria being
preferentially recovered from the rhizosphere of diverse plants all over the world (Berg, et al.,
2005). Recently it has also been recovered from marine environments (Matyar, et al., 2008)
and from diverse deep-sea invertebrates of Pacific areas (Romanenko, et al., 2008).
Most studies conducted on non hospital environments neither provided data on the cell
abundance and the proportion of P. aeruginosa and S. maltophilia populations within the
global bacterial community, or they evaluate the influence of environmental characteristics
and anthropogenic constraints on the colonization of these environments. This paper is then
dedicated to fill this lack of knowledge especially concerning the soil environment. Soils are
characterized by their important complexity in term of the variety of habitats, offering wide
range of physicochemical characteristics. Then soils harbour an immense bacterial diversity.
Impacting soils with human activities can alter this diversity, selecting for new population or
being sources of new microbial colonisers. Our strategy was to screen soils from various
geographical areas in France and in Africa (Tunisia and Burkina Faso) allowing having soils
with diverse physicochemical characteristics, under different vegetation covers and different
climates. Furthermore we aimed at investigating the influence of some agricultural practices,
i.e. irrigation and organic amendment on the distribution of these pathogens. Despite being
common practices in France and in Africa, irrigation and organic amendment might impact
differently the distribution of these two bacterial species since the chemical and
microbiological quality of the water and waste used in these practices might differ due to
differences in the legislation of each country. A strategy based on culture using selective
media coupled to the confirmation of the isolate identity using validated molecular tools
(Lavenir et al., 2007; Pinot et al., submitted) was used to detect P. aeruginosa and S.
maltophilia. As a complementary work, the search for non culturable cells was performed by
a culture-independent method i.e. DNA extraction coupled to PCR amplification targeting
species specific markers.
- 104 -
MATERIAL AND METHODS
Agricultural and industrial soils from France

Soils were sampled from different locations in various agricultural areas in France including
Centre, Limousin, Dombes, Burgundy, Rhône-Alpes regions and from industrial sites
contaminated with hydrocarbons in Ile de France (soils kindly provided by Biogénie Europe
SAS, Echarcon, France) and Lorraine region (Figure 23). Agricultural soils were planted with
maize, wheat or vineyard. Samples i.e. ten sampling per field composed one sample, were
collected from the upper layer (0-5, 0-10 cm or 0-20 cm), sieved (2 mm) and stored at room
temperature for no longer than 2 weeks. They were collected during various campaigns
between 2005 and 2008.
Experimental sites with waste water irrigation

The influence of irrigation with waste water on opportunistic pathogen prevalence was
evaluated in one experimental site in France (Pierrelaye in Ile de France), and two
Mediteranean sites in Tunisia (Figure 23). Physico-chemical characteristics are shown in
Table 1. The Pierrelaye study area, one irrigation plot in the plain of Pierrelaye–Bessancourt,
is located about 24 km northwest of Paris, covering a surface of 15 ha. According to Baize
(Baize, 2002), this site was amended for 102 years with the municipal wastewater of Paris and
used for monoculture of grain maize over the 30 last years. In the middle of 1960 this area
was also amended with urban sludge and smut compost. Since the past 20 years soil has been
irrigated from wastewater from a treatment plant system. The soil is a sandy neoluvisoil
typical from the Seine alluvial valley. Eighteen samples were collected in two different areas
chosen according to their level of heavy metal contamination [low (LP) and heavy (HP)]
polluted. Pierrelaye soils were contaminated with heavy metals (Zn, Cd Cu and Pb). Three
plots were considered as control, i.e. three nearby fields never irrigated with wastewater.
Samples i.e. five sampling per plot composed one sample, were collected from the upper layer
(0-10 cm). Irrigation had lowered pH (values comprised between 7.23 to 7.83) and increased
organic carbon content (values comprised between 2.8% to 5.22%) comparing to the control
fields. The two sites Beni Khiar and Souhil, in Tunisia, were planted with orange trees and
citrus and irrigated with treated wastewater (TWW) from the local treatment plants or from
groundwater (GW) over 25 and 19 years, respectively. These experimental sites are
administered by the national INRGREF (Institut National de Recherche en Génie Rural Eaux
- 105 -
TUNISIA
Souhil
N
#
Y #
##Y
Y
Y #
# Y
Beni Khiar #
Y
Y
# Y
Y #
#
Y
#
Y
#
Y
# Y
Y #
#
#Y
Y
# Y
Y #
BURKINA FASO #
Y
#
Y Samples
Irrigated areas
0 1 2 Kilometers
Figure 23. Studied sites in France, Burkina Faso and Tunisia.
- 106 -
et Forêts, Nabeul) institute. Sampling was performed by collecting 20 soil samples (10
sampling per plots composed one sample) from the upper layer on April 2009.
Experimental sites with organic amendment

The influence on opportunistic pathogen prevalence of organic amendment was evaluated in
two vineyard experimental sites (Mâcon and Chinon in Burgundy) and one agricultural site
(Feucherolles in Ile de France) in France, and in four sahelian sites (Tabtenga, Zagtouli,
Yagma and Toudoubweogo) in the sub-urban area of Ouagadougou, Burkina Faso (Figure
23). Physico-chemical characteristics are shown in Table 1.
The experimental sites in Mâcon and near Chinon consist of seven and six organic matter
treatments, respectively, each lay out with four replicates as previously described (Lejon, et
al., 2007). Pathogen analysis was performed on a composite sample made of the four
replicates of the following treatment: plot amended with mulching with straw, plot with
conifer compost and a control plot without any organic matter input in Mâcon, and plot
amended with mushroom manure, farmyard manure, vine shoot). Amendments induced an
increase in organic carbon content and pH remained stable (Lejon et al., 2007). Sampling was
made in November 2003 and april 2004 for Mâcon and Chinon, respectively. Soils were
sampled from the upper layer (0-5 cm or 0-10 cm), sieved 4 mm and stored at room
temperature for no longer than two weeks.
The site of Feucherolles was managed by INRA over 8 years to evaluate the positive effects
of urban composts on soil fertility and their environmental impacts (Houot et al., 2002). The
field experiment has been cropped with a wheat-maize succession since the beginning of the
experiment. The organic amendments include (1) a municipal solid waste compost (MSW)
made from residual municipal wastes after selective collection of dry and clean packaging, (2)
a biowaste compost (BW) made from selectively collected fermentescible fraction of
municipal wastes co-composted with green wastes, (3) a compost issued from the co-
composting of sewage sludge, green wastes and wood ships (GWS), and (4) a farmyard
manure (FYM) issued from cow breeding. These four organic treatments are compared to a
control treatment, without organic input. Amendment induced an increase in organic carbon
content (Houot, et al., 2002). The experiment is a randomized complete-block designed with
four replicates. Samples were collected from the upper layer (0-10cm) in September 2006
(before amendment) and October 2006 (1 month after amendment). Each treatment was
performed on four plots repetitions and samples were made of a composite sampling (10
samplings per plot repetition).
- 107 -
Table 1. Physicochemical characteristics of soils sampled from the control fields at different
sites en France, Tunisia and Burkina Faso.
Sites Depth cm Clay g kg-1 Silt g kg-1 Sand g kg-1 pH water organic carbon %
France
Feucherolles 0-10 190 750 60 6.9 1.1
Mâcon 0-5 317 565 118 6.6 1.3
Chinon 0-10 94 49 857 7.9 0.65
Pierrelaye 0-10 79 127 794 8.22 1.9
Tunisia
Souhil TWW 0-20 100 121 749 7.7 1.2
0-20 63 61 873 8.0 1.0
0-20 86 94 820 7.8 2.0
0-20 64 24 912 7.7 1.6
0-20 147 99 754 8.0 1.5
Souhil GW 0-20 216 145 639 8.3 1.1
0-20 102 88 810 8.1 1.4
0-20 185 191 624 8.1 1.2
0-20 48 14 917 8.1 1
0-20 51 26 923 8.3 0.5
Beni Khiar TWW 0-20 78 33 889 7.9 2.2
0-20 52 8 940 7.7 0.84
0-20 102 61 837 8.3 1.4
0-20 87 42 871 8.2 0.75
0-20 22 10 968 7.7 0.28
Beni Khiar GW 0-20 130 121 749 8.3 1.5
0-20 103 99 798 8.0 1.8
0-20 67 24 909 8.2 1.14
0-20 38 14 948 8.1 0.58
0-20 57 21 922 8.3 0.61
Burkina Faso
Tabtenga 0-10 nd nd nd 5.63 0.35
Zagtouli 0-10 nd nd nd 6.17 0.35
Toudoubweogo 0-10 nd nd nd 5.63 0.35
Yagma 0-10 110 200 690 5.59 0.35
nd: not determined
- 108 -
The sites in Burkina Faso were planted or not with sorghum and impacted by untreated solid
and liquid urban wastes (UW) due to long term practices (from 4 to 15 years) by local
farmers. Amendment induced an increase in organic carbon content (Hien, personal
communication), and pH (values comprised between 7.24 and 8.02). Soils were sampled from
the upper layer (0-5 cm) and samples were made of a composite sampling (10 samplings over
a 20 m transect). One or three repetitions per field were performed during two campaigns
conducted in March 2007 and June 2008. In each site, we benefited of samples from fields
with and without amendments (control).
Total bacterial counts

The total heterotrophic microflora was enumerated on Tryptic Soy Agar diluted ten fold
(TSA1/10) (Oxoïd, Dardilly, France) medium supplemented with cycloheximide (200 mg l−1)
to impair the growth of fungi. Bacterial cells from soils were extracted by blending 5 g of soil
with 50 ml of a saline solution (NaCl 0.8%) for 90 s in a Waring Blender (Eberbach
Corporation, New Hampshire, USA). Extractions were performed in triplicates. Homogenized
soil suspensions were serially diluted in sterile saline solution, and 100 μl of the 10-3 to 10−5
dilutions were spread on the agar plates. In all cases, three plates were inoculated per dilution.
Bacterial colonies were counted after 5 days of incubation at 28°C.
Isolation and identification of P. aeruginosa

Bacterial cells were extracted from soil samples and soil suspensions were serially diluted
(100 to 10−2 dilutions) as described above. P. aeruginosa isolation was performed using the
Cetrimide Agar Base (CAB) medium (Oxoïd) supplemented with nalidixic acid (15 mg l−1)
and cycloheximide (200 mg l−1). One hundred μl were usually spread on agar plate. To
improve detection sensitivity attempts were made with 1 ml of soil suspension when working
with soil samples from Burkina Faso and Tunisia since theses soils were rich in sand and poor
in organic matter. Enrichment assays were performed by transferring 2 g of soil into 20 ml of
a salt solution supplemented with acetamide, as described previously (Green, et al., 1974).
Inoculated enrichment broths were incubated for 3 days at 28°C with shaking at 180 rpm.
Serial dilutions were performed and plated. Plates were incubated at 28°C for up to 72 h.
All the greenish and clearly yellowish colonies were picked up on plate for further
identification. From 5 to 10 slightly fluorescent colonies under UV and 5 to 10 truly non
fluorescent colonies were randomly chosen from the selective plates for each soil samples.
Colonies were confirmed as P. aeruginosa by PCR screening with the ecfX gene which
- 109 -
encodes a sigma factor involved in extracytoplasmic functions, as previously described
(Lavenir, et al., 2007) and oxydase assay. All the ecfX and oxydase positive isolates were
subjected to 16S rDNA sequencing (up to 1400 bp) to confirm their identification. When PCR
screening failed to confirm isolates as P. aeruginosa isolates were analyzed using biochemical
tests (VITEK 2, Biomérieux, France) for taxonomic identification. One representative of each
well identified species as identified by VITEK 2 was subjected to 16S rDNA sequencing.
When biochemical tests did not lead to excellent identification based on VITEK 2 criteria,
16S rDNA sequencing was performed for all isolates.
Isolation and identification of S. maltophilia

Bacterial cells were extracted from soil samples and soil suspensions were serially diluted
(100 to 10−2 dilutions) as described above. S. maltophilia isolation was performed using the
VIA (vancomycin, imipenem, amphotericine B) selective agar medium (Kerr, et al., 1996)
supplemented with cycloheximide (200 mg l−1). Plates were incubated at 28°C for up to 48 h.
For each soil all the green colonies were collected and further confirmed as being S.
maltophilia using the PCR targeting the smeD gene, which is part of the genes encoding for
the multidrug efflux pump SmeDEF (Ribbeck-Busch, et al., 2005). Partial 16S rDNA
sequencing was done to identify isolates which were negative with the PCR screening.
DNA extraction from soil samples and PCR amplification

PCR assays with primers specific to P. aeruginosa and S. maltophilia were performed on soil
DNA with known concentrations of the 2 models to compare the detection threshold of a
culture-independent method with the one of the culturable method. Concerning P. aeruginosa,
PCR were monitored on soil DNA extracted from soil microcosms inoculated with known
concentration of P. aeruginosa from 103 to 106 cells/g of dry soil with the ecfX marker
(Lavenir, et al., 2007). Soil microcosms were set up for 3 soils from the RMQS (Réseau de
Mesure de la Qualité des Sols; (Dequiedt, et al., 2009)) and selected for their contrasting
structure and physicochemical properties expected to influence DNA recovery and quality.
For each soil, 5 g of dry sieved soil was artificially contaminated with 101, 102, 103, 104, 105,
106 CFU of P. aeruginosa PAO1 per g of dry soil. Extraction of the soil DNA was performed
according to the procedure optimized by Ranjard et al. (2003). Regarding S. maltophilia, PCR
were monitored with the smeD marker (Ribbeck-Busch, et al., 2005) on DNA extracted from
1 soil from the RMQS inoculated with 103, 104, 105, 106 CFU of S. maltophilia K279a per g
of dry soil. DNA was extracted with the FastDNASPIN® Kit (For Soil) (BIO 101, Inc.,
- 110 -
Carlsbad, CA), according to the manufacturer recommendations. Presence of P. aeruginosa
and S. maltophilia was tested in DNA extracted from soils amended with GWS (4 samples)
and OMR (1 sample) and from manure (3 samples) from the site of Feucherolles in which P.
aeruginosa and/ or S. maltophilia were detected by the culture method.
PCR were performed in 50 μl reaction mixtures containing 1 X buffer, 2 mM MgCl2, 200 μM
dNTP, 10 μM of each primer. Different Taq polymerases were tested according to the
manufacturer advice (Taq DNA polymerase, Invitrogen; Taq DNA polymerase Q-biogen; Hot
start Taq DNA polymerase, Fermentas; Phire Hot start DNA polymerase, Finnzymes;
AmpliTaq Gold, Applied Biosystems). The Taq DNA polymerase (Invitrogen) was the most
effective and was used for the experiment. In order to limit the inhibitor effect of soil, 0.5 μg
of T4 gene 32 protein (Roche) was added per reaction. Different DNA soil quantities (5 and
50 ng) were also tested to evaluate the inhibitor effect of soil. PCR running cycles were done
as previously described (Ribbeck-Busch, et al., 2005, Lavenir, et al., 2007).
RESULTS
Isolates identification and selectivity of the media

All the greenish fluorescent colonies recovered from the plates with the selective medium,
cetrimide agar base supplemented with nalidixic acid, were identified as P. aeruginosa-like
isolates based on ecfX specific amplification and oxydase assay. Sequencing of 16S rDNA
always confirmed these isolates as belonging to P. aeruginosa species (100% homology). We
checked for the identity of yellowish fluorescent colonies, slightly fluorescent colonies i.e.
slight fluorescence under UV light, and non fluorescent colonies since it has been previously
reported that natural isolates may be unpigmented (Pellett, et al., 1983, Pirnay, et al., 2005).
Except a few yellowish fluorescent colonies identified as P. aeruginosa all colonies led to
negative amplification with the ecfX marker. Biochemical tests on 168 isolates with an
excellent identification score based on VITEK2 and 45 isolates that had not an excellent
VITEK2 identification, coupled to the 16S rDNA sequencing led to the identification of P.
putida, P. fluorescens and Pseudomonas sp. for the non P. aeruginosa yellowish colonies.
These colonies were usually mucoid. The 62 non fluorescent colonies were mostly confirmed
as belonging to the Pseudomonas genera (P. putida, P. chlororaphis, P. mendocina, P.
oryzihabitans and Pseudomonas sp.). A few colonies were identified as Burkholderia cepacia
complex species, Ralstonia sp. or Achromobacter xylosoxidans. All the poorly or non
- 111 -
fluorescent colonies were sometimes very abundant on plates and could have hampered the
isolation of P. aeruginosa. From 0 (Burkina Faso soils) up to 2.09 x 105 CFU/g dry weight
(amended Feucherolles soils) were enumerated on the selective medium without the
identification of any P. aeruginosa isolates.
The VIA (Vancomycin Imipenem Amphotericin B) selective medium, was developed to
isolate S. maltophilia. About 95% of the colonies obtained from the various soil samples that
showed the morphotype of S. maltophilia isolates (green colonies with a blue surrounding)
were identified as S. maltophilia by specific PCR and confirmed by sequencing of 16S rDNA.
The isolates with a S. maltophilia morphotype that gave a negative result to the smeD PCR
belonged to Stenotrophomonas rhizophila, Variovorax sp., or Janthinobacterium sp..
Depending on soil samples, the proportion of colonies with a non S. maltophilia morphotype
varied between 10 and 30%. These colonies were not identified.
Abundance of culturable P. aeruginosa and S. maltophilia in soil samples

Our screening of soil samples for the presence of P. aeruginosa was mostly unsuccessful
whatever the geographical origin (various regions in France, Tunisia, and Burkina Faso) of
the soils (Tables 2, 3 and 4). The only samples collected in France that enabled direct
isolation from soil suspension originated from the industrial sites contaminated with
hydrocarbons, two located in Ile de France and one located in Lorraine (soil from Neuves-
Maisons). The numbers of P. aeruginosa per g of equivalent dry soil were 1.1 x 103, 3.37 x
103 and 0.325 x 103 in the three soils, respectively. These levels are in the range of the
estimated detection limits of 10 to 100 CFU per g of dry soil i.e. 1 or 10 colonies per plate
when spreading 1 μl or 1 ml of soil suspension from the undiluted soil solution, respectively.
This sensitivity corresponds to optimal conditions meaning that the amount of non P.
aeruginosa cells able to grow on the selective media does not hampered growth and
visualization of P. aeruginosa cells. Compared to the total heterotrophic microflora we
estimated that P. aeruginosa populations represented 0.14% of the microflora from the
Neuves-Maisons soil. The enrichment step with acetamide allowed the isolation of P.
aeruginosa in the third sample from Ile de France but not from the Homécourt soil in
Lorraine.
Enumeration on the VIA selective agar medium coupled to the PCR amplification with the
specific gene marker showed the presence of S. maltophilia in 9 out of the 12 tested soils from
the Burgundy region, with densities from 0.803 x 103 to 7.16 x 103 CFU per g of dry soil
(Table 2) representing 0,005 % of the total heterotrophic microflora (Figure 24).
- 112 -
Table 2. Number of CFU (colony forming unit) of P. aeruginosa and S. maltophilia, in
agricultural and industrial soils sampled from various French regions.
Site Description at time of sampling P. aeruginosa CFU S. maltophilia

(amendment or treatment in the x 103 (standard CFU x 103 (standard
year) deviation) deviation)
Limousin
St Iriex maize 0 nd
St Iriex grassland 0 nd
Champnétery wheat 0 nd
Champnétery grassland 0 nd
St Genest maize 0 nd
St Genest grassland 0 nd
Sussac wheat 0 nd
Sussac grassland 0 nd
Rhône-Alpes
Versailleux1 soil from a pheasant aviary 0 (-) nd
Versaileux2 maize 0 (-) nd
Versailleux3 feces and straw inside pheasant 0 (-)
building nd
La Côte Saint André maize 0 (-) nd
Montrond grassland 0 (-) nd
Ile de France
Site 1 Hydrocarbon polluted soil 0(+) nd
Site 2 Hydrocarbon polluted soil 1.1 (± 0.23 ) nd
Site 3 Hydrocarbon polluted soil 3.37(± 0.139) nd
Lorraine
Homécourt Hydrocarbon polluted soil 0 (-) nd
Neuves-Maisons Hydrocarbon polluted soil 0.325(± 0.057 ) nd
Burgundy
Balot barley 0 0
Venarey les laumes grassland 0 0
Is sur Tille rape, (farmyard manure) 0 2.60 (± 0.284)
Bourberain bulk soil, rape field 0 2.85 (± 1.39)
Dompierre en Morvan grassland 0 0
Ruffey les Echirey rape, (vegetal compost) 0 7.16 (± 0.538)
Marcilly Ogny triticale, (farmyard manure) 0 6.67 (± 0.353)
Commarin bulk soil, rape field 0 4 (0)
Echevronne cereal 0 5.88 (± 1.02)
Morey St Denis vineyard 0 1.19 (± 0.11)
St Aubin vineyard 0 0.803 (± 0.069)
Enesad bulk soil, cereal field 0 3.21 (± 0.139)
Epoisse1 vineyard (70 ppm Cu) 0 (-) nd
Epoisse1 vineyard (200 ppm Cu) 0 (-) nd
nd: not done.
- 113 -
exposed to irrigation with waste water in the French and Tunisian sites.
P aeruginosa CFU S. maltophilia CFU 103

Site (standard deviation)
Pierrelaye
Control 1 0 3.33 (± 2.49)
Control 2 0 0.67 (± 0.47)
Control 3 0 0.33 (± 0.47)
4 0 27.67 (± 7.36)
5 0 0.67 (± 0.94)
6 0 47.67 (± 14.82)
7 0 4.33 (± 1.25)
8 0 2 (± 2.16)
9 0 4 (± 5.66)
10 0 0.67 (± 0.94)
11 0 4 (± 2.16)
12 0 1.33 (± 0.94)
13 0 0.33 (± 0.47)
14 0 16 (± 2.16)
15 0 4.67 (± 2.05)
16 0 11.33 (± 1.25)
17 0 0
18 0 0.33 (± 0.47)
19 0 0
20 0 0
21 0 0
Tunisie
Souhil TWW 0 37.3 (± 1.52)
0 9.33 (± 1.52)
0 0.33 (± 0.572)
0 8.33 (± 2.31)
0 1.67 (± 1.53)
Souhil (EN) 0 8 (± 1)
0 1.77 (± 0.577)
0 21 (± 6.04)
0 0.667 (± 0.567)
0 7.33 (± 2.08)
Beni Khiar TWW 0 31.3 (± 2.08)
0 3.67 (± 2.08)
0 1.67 (± 0.577)
0 1 (0)
0 89.7 (± 9.02)
Beni Khiar EN 0 4.67 (± 2.31)
0 2 (± 1)
0 2.67 (± 3.79)
0 4.67 (± 2.52)
0 0
- 114 -
exposed to organic amendment in France, and Burkina Faso.
P aeruginosa S. maltophilia
CFU x 103 g soil dry weight CFU x 103 g soil dry weight
Site (standard deviation)
Mâcon
Control 0 (-) nd
mulching straw 0 (-) nd
conifer compost 0 (-) nd
Chinon
Control 0 (-) nd
mushroom manure 0 (+ ; 5 colonies) nd
vine shoot 0 (-) nd
farmyard manure 0 (-) nd
Feucherolles
soil before Amendment
Control 0 (-) 186.7 (± 84.9)
BW 0 (-) 130.5 (± 95.1)
FYM 0 (-) 232.5 (± 109.1)
GWS 0 (-) 367.1 (± 51.8)
MSW 0 (-) 210.4 (± 233.0)
soil 1 month after Amendment
Control 0 (-) 1.59 (± 0.6)
BW 0 (-) 13.5 (± 2.8)
FYM 0 (-) 7.79 (± 3.3)
GWS 0 (-) 17.2 (± 3.9)
MSW 0 (-) 414.4 (± 52.3)
Amendment
BW 0 (-) 0
FYM 38 (± 5.03) 13.90 (± 7.08)
GWS 0 (-) 0
MSW 0 (-) 0
Burkina Faso
Tabtenga, 2008, Control 0 0
Tabtenga, 2008, UW 0 (-) 1.81 (± 3.13)
Toudoubwéogo, 2008, Control 0 0
Toudoubwéogo, 2008, UW 0 (-) 0.453 (± 0.78)
Zagtouli, 2008, Control 0 0.45 (± 0.38)
Zagtouli, 2008, UW 0 (-) 1.920 (± 3.32)
Toudoubwéogo, 2007, Control 0 0
Toudoubwéogo, 2007, UW 0 0.067 (± 0.048)
Yagma NZ, 2007, Control 0 0
Yagma NZ, 2007, UW 0 0.182 (± 0.685)
Yagma, EAPIT, 2007 Control 0 0
Yagma, EAPIT, 2007, UW 0 (+, 1 colony) 0.1 (± 0.052)
nd: not done.
- 115 -
in the total heterotrophic (B).
Figure 24. S. maltophilia counts in soils of the Burgundy region (RMQS) (A) and percentage
A
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
Ve Ve
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
na Ba na Ba
r lo r lo
S. maltophilia (% of THM)
S. maltophilia x 103
ey t ey t
le le
s s
la la
um um
es es
Is Is
su su
r Ti Tir
lle lle
Bo Bo
Do ur Do ur
m be m be
pi ra pi ra
er in er in
re re
en en
Ru M Ru M
ffe or or
va ffe va
y n y n
le le
s s
Ec Ec
- 116 -
hi hi
M re M re
ar y ar y
ci ci
lly lly
O O
gn gn
y y
Co Co
m m
m m
ar ar
in in
Ec Ec
he he
vr vr
M on M on
or ne or ne
ey ey
St St
De De
ni ni
s s
St St
Au Au
bi bi
n n
En En
es es
ad ad
S. maltophilia was also detected in the soils from the Pierrelaye and Feucherolles sites in
France and in the soils from Tunisia and Burkina Faso. However, variability was observed
between the sites and within sites both considering the density of S. maltophilia and the
proportion of that species in the total heterotrophic community. For instance S. maltophilia
was detected at 7.16 x 103 CFU per g of dry soil in the control soil of Feucherolles, from
0.667 x 103 to 21 x 103 CFU per g of dry soil in the 5 soil samples of the Souhil area irrigated
with groundwater and 0 CFU in 5 out of the 6 control soil samples from the Burkina Faso
sites. Similarly S. maltophilia population represented from 0,001 % to 1,2 % of the total
heterotrophic microflora (S. maltophilia count: 1.6 x 103 to 1.7 x 105; total heterotrophic
microflora count: 0.9 x 107 and 1.7 x 107 colonies forming unit per g of equivalent dry soil,
respectively) (Figures 25, 26 and 27).
Prevalence of P. aeruginosa and S. maltophilia in irrigated soil

Effect of irrigation with wastewater on the presence of P. aeruginosa in soil was investigated
in the sites of Pierrelaye and Tunisia. No P. aeruginosa were detected whether soils were
irrigated or not. On the opposite, S. maltophilia was present in both sites. In the site of
Pierrelaye, the abundance of this bacterium varied between 0.333 x 103 and 47.7 x 103 CFU
per g of equivalent dry soil (Table 3) (Figure 25). The highest densities and proportion of S.
maltophilia were observed in soils 4, 6, 14 and 16, which are characterized by high level of
heavy metal contamination. In the Tunisian site, despite intra-site variability, the highest
densities were observed in soils irrigated with wastewater. The observed densities were in the
range of those observed in the Pierrelaye site, varying between 0.33 x 103 to 89.7 x 103 CFU
per g of equivalent dry soil (Table 3).
Prevalence of P. aeruginosa and S. maltophilia in soils amended with organic wastes

As observed in the control soil direct isolation of P. aeruginosa from the organic amended
soils of Mâcon and Chinon was unsuccessful whatever the type of amendment. However the
enrichment procedure enabled the isolation of P. aeruginosa from a vineyard soil amended
with mushroom manure in Chinon.
The four organic amendments applied in September 2006 on the agricultural soils of the
experimental site of Feucherolles (France) were screened for the presence of P. aeruginosa
and S. maltophilia (Figure 26). We were able to isolate both pathogens from the manure
samples and both were absent in the other amendments.
- 117 -
A 70,00
S.maltophilia x 103
60,00
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
0,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
B
0,3
S. maltophilia (in % of THM)
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
Figure 25. S. maltophilia counts in soils from the site of Pierrelaye (A) and percentage in the
total heterotrophic microflora (B).
- 118 -
A B
500 1,4
S. maltophilia x 103 S. maltophilia (% of THM)
450
1,2
400
350 1
300 0,8
250
200 0,6
150 0,4
100
0,2
50
0 0
Control BW FYM GWS MSW Control BW FYM GWS MSW
C 500 D 0,8
3 S. maltophilia (% of THM)
450 S. maltophilia x 10 0,7
400 0,6
350
0,5
300
250 0,4
200 0,3
150
0,2
100
50 0,1
0 0
Control BW FYM GWS MSW Control BW FYM GWS MSW
E F 0,012
25
S. maltophilia x 103 S. maltophilia (in % of THM)
0,01
20
0,008
15
0,006
10
0,004
5 0,002
0 0
BW FYM GWS MSW BW FYM GWS MSW
Figure 26. S. maltophilia counts in soils and amendments from the site of Feucherolles (A, C,
E) and percentage of S. maltophilia in the total heterotrophic microflora (B, D, F), before
amendment (A, B) 1 month after amendment (C, D) and in the amendments (E, F).
- 119 -
the total heterotrophic microflora (B).
Figure 27. S. maltophilia counts in soils from the sites in Burkina Faso (A) and percentage in
A
Ta Ta
bt bt
en en
ga ga
,20 ,20
0,002
0,004
0,006
0,008
0,012
0,014
0,016
0,018
0,01
0,02
08 08
, ,
6
Ta C Ta C
bt on bt on
S. maltophilia x 103
e tro e tro
S. maltophilia (% of THM)
To ng l To ng l
ud a, ud a,
bw 20 bw 20
éo 08 éo 08
go ,U go ,U
,2 W ,2 W
00 00
To 8, To 8,
ud Co ud Co
bw bw
éo nt éo nt
ro ro
go l go l
,2 ,2
Za 00 Za 00
gt 8, gt 8,
ou U ou U
li, W li, W
20 20
08 08
,C ,C
Za on Za on
To gt tro To gt tro
ou l ou l
ud li, ud li,
bw 20 bw 20
- 120 -
éo 08 éo 08
go ,U go ,U
,2 W ,2 W
00 00
To 7, To 7,
ud Co ud Co
bw nt bw nt
éo ro éo ro
go l go l
Ya ,2 Ya ,2
gm 00 gm 00
a 7, a 7,
N UW N U
Z, Z, W
20 20
07 07
Ya ,C Ya ,C
gm on gm on
Ya a tro Ya a tro
N l N l
gm Z ,2 gm Z ,2
a, 00 a, 00
EA 7, EA 7,
PI U PI U
T, W T, W
Ya 20 Ya 20
gm 07 gm 07
a, C a, C
EA on EA on
tro tro
PI l PI l
T, T,
20 20
07 07
,U ,U
W W
The manure samples showed 38 x 103 and 13.9 x 103 CFU per g of equivalent dry weight of P
aeruginosa and S. maltophilia, respectively. In this sample the total heterotrophic bacteria was
1.07 x 108 CFU per g of equivalent dry weight in 2006. Then P. aeruginosa represented
0.01% of the total heterotrophic bacteria. No P. aeruginosa were found in the soil amended
with manure one month and 3 months after the treatment as well as in other investigated soils.
In this site, S. maltophilia population represented up to 1.2% of the total heterorophic
microflora in soil before amendment with GWS, which correspond to the highest density
observed comparing to the other tested sites. Little differences were obtained between the
plots before treatments concerning both the prevalence of heterotrophic microflora and S.
maltophilia population, with about 107 and 105 CFU per g of equivalent dry soil, respectively.
One month after amendment, we observed a difference between non treated and treated plots
considering both the total heterotrophic microflora and S. maltophilia population. The total
heterotrophic microflora was higher in all amended soils comparing to non treated soils with a
maximal difference of x 6.1, when the MSW compost was used. For S. maltophilia
population, we observed a higher difference than for the total heterotrophic microflora in all
amended soils and the effective was 260 times higher in soils treated with MSW than in non
treated plots.
The presence of P. aeruginosa and S. maltophilia was also investigated in soils amended with
urban rough waste from 6 agricultural sites in the vicinity of Ouagadougou, Burkina Faso. No
P. aeruginosa were detected in the amended soils. Enrichment assay performed on 4 samples
from 4 sites led to the isolation of a unique P. aeruginosa isolate from the soil of Yagma
EAPIT site. On the opposite, an effect of the use of urban rough waste was observed on the
prevalence of S. maltophilia. Five out of the 6 control plots were devoid in S. maltophilia
while in amended plots the number of CFU per g of equivalent dry soil reached 2 x 103 in
Tabtenga and Zagtouli soils (Table 4). A maximal x 4.3 increase was observed in the site of
Zagtouli. In comparison the total heterotrophic microflora was maximally multiplied by 2.6
(Figure 27). However, we did not have the opportunity to test the amendment for the presence
of S. maltophilia.
Detection of P. aeruginosa and S. maltophilia in soil DNA extract

Detection of P. aeruginosa and S. maltophilia using a culture-independent method was
essayed. PCR amplification with species specific primers on DNA extracted from soils with
known concentration of the bacteria was done. With 5 ng of soil DNA per reaction, a positive
amplification was obtained in the inoculated soils containing 105 CFU per g of dry soil for
- 121 -
both models. With 50 ng of soil DNA, amplification was obtained for 2 of the 3 inoculated
soils containing 104 CFU of P. aeruginosa per g of dry soil, no amplification was observed
with the third soil, whatever the number of inoculated cells. No amplification was obtained
from DNA extracted from manure that naturally contained P. aeruginosa (104 CFU per g of
dry weight detected by the culture method) whatever the quantity of DNA used (5 and 50 ng).
With 50 ng of soil DNA, a positive amplification was also obtained in the soil containing 104
CFU of S. maltophilia per g of dry soil. No amplification was obtained in inoculated soils
containing lower amount of cells whatever the quantity of DNA per reaction. With 50 ng of
DNA, a positive amplification was also obtained with DNA extracted from manure (1.4 x 104
CFU per g of dry weight detected by the culture method) and from 1 soil amended with GWS
(106 CFU per g of dry soil detected by culture method). No positive amplification was
obtained for the other tested soils whatever the quantity of DNA used (5 and 50 ng) despite
the detection of around 105 CFU per g of dry soil with the culture method.
DISCUSSION
Culture based approach involving the use of selective media combined to a fast biochemical
and/or genotypic analysis is classically used for the detection of bacterial pathogens in the
context of clinical studies. We used a similar strategy and evaluated its relevance to determine
the prevalence of two opportunistic pathogen species, P. aeruginosa and S. maltophilia, in
soils and evaluated the influence of anthropogenic activities expected to modify such
prevalence either through the impact on the indigenous bacterial populations (selection and
enrichment of these pathogenic species) or by adding allochtonous bacteria (presence of the
pathogens in the irrigation water and the organic amendment). Some soil samples were further
selected to evaluate whether a culture-independent approach based on direct DNA extraction
from soil samples and amplification with species specific markers would improve the
detection sensitivity and reliability. Since DNA might persist in soil after cell death this
approach would also give indication of past presence of the pathogen species but non survival
for instance when pathogen are added from external sources.
Selectivity of the media

Most selective media for the isolation of P. aeruginosa rely on its ability to synthesize
pigments, pyocyanin and fluorescein (Brown & Lowbury, 1965, Brodsky & Nixon, 1973,
- 122 -
Green, et al., 1974). The addition of antibiotics to which P. aeruginosa presents intrinsic
resistance enables increased selectivity of the media. We used cetrimide agar base medium,
containing cetrimide, a quaternary ammonium compound which inhibits the growth of other
microorganisms, and magnesium chloride and potassium sulfate which stimulate the synthesis
of pigments. We supplemented this medium with nalidixic acid to facilitate P. aeruginosa
recovery and identification from soil samples (Ringen & Drake, 1952). This medium
generally shows a high selectivity when used to screen clinical samples. Kodaka and
collaborators screened around 1000 urine, pus and spunctum samples and 98 % of the
colonies obtained on this medium were confirmed as P. aeruginosa (Kodaka, et al., 2003). On
the opposite, our results highlighted a lower effectiveness of this medium in the isolation of P.
aeruginosa from soil samples. The presence of numerous non fluorescent colonies, due to the
presence in the microflora of species able to grow on the medium, increases the difficulty to
isolate P. aeruginosa. The microflora of soil samples is characterized by a high diversity and
the widespread of closely related species as fluorescent Pseudomonas (P. fluorescens, P.
syringae…) and other proteobacterial genera as Acinetobacter sp., Rhizobium sp., or
Burkholderia sp. (Kaszab, et al., Cho & Tiedje, 2000, Khan, et al., 2007, Atzel, et al., 2008,
Casanovas-Massana, et al., 2010) whom we demonstrated the ability to grow on this medium.
This increases the difficulty of P. aeruginosa isolation and identification from
microbiologically complex environments. Such limited effectiveness to isolate P. aeruginosa
from environmental samples was previously reported for water samples. As an extreme
example, Khan and collaborators screened 1670 colonies on cetrimide-nalidixic acid agar
from 17 water samples (open ocean, bay…) and only 62 were confirmed as P. aeruginosa
(Khan, et al., 2007). In our study, other conditions of growth such as incubation of the plates
at 37°C or 42°C were tested and we observed that they enhanced the specificity of the
medium since less non fluorescent colonies grew on the plates (data not shown). However we
did not used such stringent conditions since these temperatures might not be appropriate for
indigenous populations expected to be rarely exposed to these high temperatures and might
select for adapted isolates. In order to enhance the probability of P. aeruginosa isolation, an
enrichment step was done for several soil samples. The enrichment solution contains
acetamide, which highlights the capacity of P. aeruginosa to produce ammonia from
acetamide (Green, et al., 1974). However, adding the enrichment step only enables to
determine if the selected bacteria are present but not to quantify it. This step was tested for 24
samples and enabled to isolate P. aeruginosa only in 2 samples for which isolation without
enrichment step was negative.
- 123 -
The VIA (Vancomycin Imipenem Amphotericin B) selective medium, was developed to
isolate S. maltophilia from clinical samples and replaced the Xanthomonas maltophilia
selective medium XMSM (Kerr, et al., 1996). The specificity of the VIA medium relies on the
capacity of S. maltophilia to resist intrinsically to imipenem due to chromosomically encoding
-lactamases (Gould, et al., 2006). Mannitol and bromothymol blue give a particular
morphotype to S. maltophilia isolates. The colonies become green and the agar surrounding
becomes blue due to the alkalinization of the media by S. maltophilia since this species does
not produce acid by mannitol fermentation. In the present study the isolation of S. maltophilia
from environmental samples was not as difficult as the isolation of P. aeruginosa. Even if the
VIA medium was first developed for clinical use, it showed a high selectivity because of the
addition of several antibiotics and the presence of the colour indicator (which gives the
particular morphotype of S. maltophilia colonies), enabling its use for screening
environmental samples. Only 10 to 30 % of the colonies presenting the S. maltophilia
morphotype were not confirmed to belong to this species. Pinot and collaborators (submitted)
showed that some environmental species were able to grow with the S. maltophilia
morphotype on VIA as S. rhizophila, Dyella sp or Variovorax sp..
Evaluation of the prevalence and abundance with culturable method and genotyping
confirmation were fastidious and time consuming for both models. However this approach
was more effective than the culture-independent one (PCR with specific primers) and
presented a better detection threshold (101 and 104 CFU per g of dry soil, respectively).
Moreover, culturable method allowed the conservation of the isolated strains for supplemental
analysis (metabolic diversity, resistance phenotypes…). More accurate PCR-based techniques
such as the quantitative real time PCR are under investigation in our research team to improve
sensitivity and facilitate the handling of a high number of samples.
Sporadic detection of P. aeruginosa in soil samples

The screening for the presence of P. aeruginosa of various soil samples from agricultural
lands in France, Tunisia or Burkina Faso was mostly unsuccessful despite different
environmental conditions in term of climate, physicochemical properties and vegetation cover
of these lands. The only samples that led to the detection of P. aeruginosa were collected
from a mushroom manure amended vineyard site (Chinon, France) and from an urban waste
amended field (Yagma, Burkina Faso). Furthermore the abundance of P. aeruginosa was very
low since only 5 and 1 isolates were successfully obtained from the Chinon and the Tabtenga
sites, respectively, despite the enrichment procedure. These results raise the question of the
- 124 -
agricultural soil as a natural habitat of P. aeruginosa. Few studies investigated the soil as a
potential reservoir of this opportunistic pathogen. The oldest study on the occurrence of P.
aeruginosa in soil was conducted by Ringen and Drake (Ringen & Drake, 1952). They found
P. aeruginosa in only 3 out of 100 soil samples. Later, Green and collaborators (Green, et al.,
1974) recovered that species from 24% of the California soils tested and suggested that their
isolation rate was better than the one from Ringen and Drake due to the use of a more
efficient isolation technique. They used an enrichment step with acetamide and could not
isolate P. aeruginosa without that enrichment. These observations led to conclude on
agricultural soil as a natural habitat for the bacterium since these soils had no known history
of organic fertilizer use, or pasturing of animals and irrigation water was free of the
bacterium. In our work, with or without enrichment, we mostly failed to recover P.
aeruginosa isolates from agricultural samples which had not received amendment or irrigation
with waste water suggesting that if soil is a natural habitat for that species then this species is
a minor population whose abundance is below the detection limit of our experimental
procedure (10 to 100 cells per one gram equivalent dry soil).
As mentioned above, isolation of P. aeruginosa was successful in an amended vineyard site
(Chinon, France). This soil had the particularity of being amended with mushroom manure.
At the time we sampled that soil we had not the opportunity to obtain mushroom manure
samples to check whether the manure was the source of P. aeruginosa in soil or whether P.
aeruginosa was an autochtonous member of the soil microflora. However P. aeruginosa
could have been present in that amendment since mushroom manure contains equine manure
and we previously detected P. aeruginosa in three months old horse manure (Lavenir, et al.,
2007). The capacity of P. aeruginosa to persist in manure and then in amended soil was not
reported yet, but such persistence had already been demonstrated for other pathogenic
bacteria. For instance, the presence of pathogens implicated in illness outbreaks i.e.
Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp., Salmonella spp.
(Pell, 1997, Gerba & Smith, 2005), in manure or composts is well documented. Most of these
bacteria are eliminated by the composting process, but some of them can persist at the end of
this process (Lemunier, et al., 2005). These bacteria are often able to persist in the amended
soil and can be transferred to the plants (Gagliardi & Karns, 2002, Solomon, et al., 2002). In
our study the experimental site of Feucherolles (France) gave us the opportunity to investigate
the survival of P. aeruginosa in soil. Despite the presence of P. aeruginosa in the manure we
failed to recover this bacterium in the manure amended soil as we failed to recover it from the
plots amended with the various composts. The latter result was more expected since P.
- 125 -
aeruginosa was not detected in these composts. The presence of P. aeruginosa was also
investigated in soils amended with urban rough waste from the 6 sites in Burkina Faso. Again,
we failed to detect P. aeruginosa in both amended and non amended soils except for the
isolation of one colony from the Yagma amended field. We expected to detect it given that
untreated waste can contain potential pathogenic bacteria as Salmonella or E. coli in a higher
density than in treated amendment and the fecal coliforms and streptococci, indicators of fecal
contamination, frequently reach a density of 107/108 CFU per g of dry weight (around 103 in
treated composts) (Deportes, et al., 1998, Hassen, et al., 2001). Moreover, P. aeruginosa has
already been found in Nigerian soil which had been amended with urban waste (Achudume &
Olawale, 2009).
Effect of irrigation with wastewater on the presence of P. aeruginosa in soil was also
investigated in the sites of Pierrelaye and Tunisia. As P. aeruginosa is frequently present in
wastewater (Schwartz, et al., 2006, Lavenir, et al., 2007), the presence of this bacterium was
also expected in the irrigated soils. However, no detection was observed in soils irrigated with
wastewater as well as in soils not irrigated with wastewater. Moreover, the site of Pierrelaye
had been irrigated with sewage sludge during many years and is highly contaminated with
organic compounds and heavy metals. The absence of P. aeruginosa in this site was rather
unexpected as P. aeruginosa is known for its capacities to degrade different organic
compounds (Roy & Nair, 2007) and to resist to heavy metals (Hassan, et al., 2008). A
diversity study of the resistant microflora present in the wastewater of Casablanca even
showed that P. aeruginosa isolates were among the most resistant isolates considering metals,
antibiotics and hydrocarbons (Filali, et al., 2000). These observations suggested that P.
aeruginosa is not indigenous to the bacterial community of this soil i.e. no P. aeruginosa
detection in the control soil neither in the field amended with urban waste compost and P.
aeruginosa is not able to survive after introduction through an external organic source
probably due to antagonistic interaction with the indigenous microflora (predation, substrate
competition) or non favourable physicochemical soil properties. However we can not exclude
that P. aeruginosa survived but become non-culturable, as in aquatic environments (Kimata,
et al., 2004) or that our experimental approach failed to detect its presence because of a lack
of sensitivity.
P. aeruginosa was also present in 4 of the 5 industrial sites impacted with hydrocarbons. This
result was expected since this species is frequently isolated from various aquatic (Bartha,
1977, Bhattacharya, et al., 2000) and terrestrial (Sagardia, et al., 1975, Cavalca, et al., 2000,
Norman, et al., 2002, Kaszab, et al., 2009) hydrocarbon-impacted environments. In those
- 126 -
environments P. aeruginosa is either capable to degrade the hydrocarbons and/or act as an
‘helper” population which facilitates the accessibility to the hydrocarbons due to the synthesis
of biosurfactant (i.e. rhamnolipid) (Sagardia, et al., 1975, Garcia-Junco, et al., 2001).
Similarly its ability to synthesize pyocyanin, an inhibitor of other bacterial species, might
enhance its competitiveness and survival in petroleum contaminated sites (Norman et al.,
2004). In such environment, intake of hydrocarbons or organic amendment could favor the
emergence of this population. As we only isolated P. aeruginosa from soils impacted by
anthropogenic activities, we can hypothesize that P. aeruginosa is more probably brought by
amendments as manure than an endemic population of the soil. Zechman and Casida (1982)
showed that inoculation of P. aeruginosa in an unsterilized soil conducted to the rapid death
of the inoculum. These observations suggest that P. aeruginosa can be sporadically found in
soil, but may not multiply and disseminate in this environment unless particular conditions
such as the presence of specific organic compounds favor its growth. Further studies would
need to be done in order to clarify how environmental parameters influence its development
and colonization of soil habitat.
Widespread occurrence of S. maltophilia in soil and influence of agricultural practices

on its prevalence
S. maltophilia was isolated from most soils whatever their geographical origin (soils from
Feucherolles, Pierrelaye, and Burgundy in France as well as soils from Tunisia and Burkina
Faso) (Tables 2, 3 and 4). This result was expected since soil was considered as a reservoir of
S. maltophilia (Ryan, et al., 2009). Its presence in the rhizosphere is well known and its
capacities to promote plant growth (Juhnke & des Jardin, 1989, Berg, et al., 1996, Park, et al.,
2005) or to inhibit several pathogenic fungi (Juhnke, et al., 1987, Jakobi, et al., 1996) were
reported. Several properties were mentioned to explain the success of S. maltophilia to
survive in the rhizosphere, such as metabolic properties or presence of genes (rebA-C) which
could protect the bacterium against predators (Ryan, et al., 2009). In our study the success of
isolation and the proportion of S. maltophilia isolates varied between and within the sites.
Agricultural soils of the Burgundy region, which did not undergo particular treatments, were
less colonized by S. maltophilia, (< 0.005 % of the total heterotrophic microflora) compare to
the others (Figure 24). The site of Feucherolles was the most colonized site (presence of the
species in all tested samples) and population of S. maltophilia represented up to 1.2 % of the
total heterotrophic microflora (Figure 26). Sampling 3 months and a year after amendment
still enabled its detection (data not shown) evidencing the persistence of the species and the
- 127 -
role of soil environment as a reservoir of S. maltophilia. The impact of the amendment on its
prevalence in soil was clearly evidenced by the experimentation on the site of Feucherolles.
The maximal effect was obtained with the MSW amendment with an x 260 increase of the S.
maltophilia population and an x 6.1 increase of the total heterotrophic microflora comparing
to the control plot that was not amended. The increase of S. maltophilia population was
always higher than the increase of the heterotrophic microflora for all tested amendments. In
order to know if such increase was due to the spread of intrinsic population or to the intake of
S. maltophilia present in composts, we tested the different amendments for the presence of S.
maltophilia. As P. aeruginosa, S. maltophilia was only present in the manure (13.9 x 103 CFU
per g of equivalent dry weight), indicating that the increase of S. maltophilia population was
rather due to the increase of the indigenous population.
The effect of the use of urban rough waste as compost in soils in Burkina Faso also showed
that amendment led to an increase of both the total heterotrophic microflora and S.
maltophilia population (Figure 27). This effect was higher for S. maltophilia population than
for the total heterotrophic microflora. However, we did not have the opportunity to test the
amendment for the presence of S. maltophilia. Regarding the impact of irrigation, the
investigation performed in the site of Pierrelaye showed that S. maltophilia prevalence was
variable, but the highest densities were observed in soils which were contaminated with heavy
metals (Figure 25). Similarly, Tunisian soils irrigated with wastewater were more colonized
by S. maltophilia than soils irrigated with groundwater.
In three out of the four tested experimental sites, we observed that the prevalence of S.
maltophilia was higher in soils that had been amended with organic amendments or irrigated
with wastewater. Amendments or wastewater can bring different carbon sources, nutrients or
indispensable elements for the growth of the indigenous microflora, but it can also bring
different compounds like heavy metals, hydrocarbons compounds, antibiotics, pesticides…,
associated to different anthropogenic activities. A higher prevalence of S. maltophilia in such
contaminated soils could be related to its capacities to use different organic compounds. S.
maltophilia strains that show such activities were often isolated from the rhizosphere of plants
or contaminated soils (Binks, et al., 1995, Duineveld, et al., 2001, Vallini, et al., 2005,
Antonioli, et al., 2007, Marecik, et al., 2008). Some of them can survive in presence of
several toxic compounds as Juhasz and Naidu showed with a strain of S. maltophilia isolated
from a soil contaminated by pentachlorophenol. This strain was able to grow in presence of
polycyclic aromatic hydrocarbons, chlorinated- and nitro-aromatic compounds and DDT
pesticide (Juhasz & Naidu, 2000). High level of resistance to heavy metals as Cd, Pb, Co, Zn,
- 128 -
Hg, Ag, has also been observed in a strain isolated in contaminated soils (Pages, et al., 2008).
Moreover, sequencing of two S. maltophilia genomes highlights the presence of
chromosomically encoding genes, especially encoding efflux pumps, potentially implicated in
resistance to several toxicants as antibiotics ( -lactams, aminoglycosides…) or heavy metals
(As, Hg, Cu…). These genes could enable S. maltophilia to adapt to a wide range of
environments (Crossman, et al., 2008, Taghavi, et al., 2009). Then, the presence of S.
maltophilia in extreme or polluted environments had already been reported (Matyar, et al.,
2008, Romanenko, et al., 2008, Kuddus & Ramteke, 2009), which corroborates the idea of S.
maltophilia as a highly adaptable organism. This adaptability could make S. maltophilia more
competitive in presence of compounds brought by organic amendments or wastewater that
generally impact the microbial community and could explain the spread of the indigenous soil
population in amended soils of the different experimental sites. Our results highlight the
impact of human activities, especially agricultural practices, on the selection and spread of
pathogens of major public health interest like S. maltophilia. Actually, the genetic and
phenotypic characteristics of these soil isolates are determined and compared to clinical
isolates. Preliminary data evidenced biochemical variability as well as differences in
antibiotic resistance profiles in relation to soil origin and multidrug resistance similar to
clinical isolates (data not shown).
Concluding remarks
Sequencing of genomes of both models enable to make hypothesis that could explain the
differences in P. aeruginosa and S. maltophilia distribution in soils observed in this study.
Widespread of these bacteria in a large panel of environments could be explained by a large
genome and a high proportion of regulatory determinants (Stover, et al., 2000, Mathee, et al.,
2008, Rocco, et al., 2009). Moreover, a large part of their genome is conserved among strains,
suggesting a high adaptability of the strains, whatever their origin. Differences highlighted in
this study in their distribution could be explained by the fact that S. maltophilia seems to
possess more genetic determinants implicated in multi-drug resistance in their conserved
genome than P. aeruginosa, making it more competitive against microbial producers present
in the rhizosphere. Moreover, S. maltophilia genomes possess a large number of genomic
islands (around 40) in both sequenced genomes whereas P. aeruginosa possess a more
variable number of genomic islands (between 10 and 50), suggesting that S. maltophilia is
more likely able to acquire genetic mobile elements that could participate to increase its
- 129 -
capacity of adaptation. Finally, many ORFs have no known function and could participate to
the differences observed between P. aeruginosa and S. maltophilia.
In most investigated sites, sampling has been done only one time, given a fixed image of the
distribution of the models. A more detailed spatial and a seasonal variation analysis would
need to be done in order to identify the factors that control the pathogen distribution, as well
as to determine their survival capacity especially for P. aeruginosa.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by a CORUS project of the French “Ministère des Affaires
étrangères” and a EC2CO project supported by the INSU and INEE departments of CNRS. A.
Deredjian was funded by a grant from the CNRS. We thank participants of the CORUS and
EC2CO projects for soil sampling. We thank the PARMIC technical platform and Rhône-
Alpes Region Cluster “Environnement”. We thank Veolia for providing the amendments used
in the site of Feucherolles.
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Conclusions
La présence et l’abondance de P. aeruginosa et S. maltophilia dans les sols ont été évaluées
par méthode cultivable et indépendante de la culture. La méthode cultivable, bien que plus
contraignante, a montré une meilleure efficacité que la méthode de PCR semi-quantitative. En
effet, les tests de PCR semi-quantitative n’ont montré une amplification qu’à partir de 104
cellules / g de sol sec pour les deux modèles. La méthode cultivable, quant à elle, permet de
dénombrer à partir de 101 cellules / g de sol sec. Toutefois, on peut considérer que cette
méthode sous-estime la quantité de cellules réellement présentes puisqu’elle ne permet pas de
dénombrer les bactéries viables non cultivables, contrairement à des méthodes indépendantes
de la culture. De plus, malgré l’utilisation de milieux dits spécifiques pour l’isolement des
modèles, nous avons pu observer au cours de notre étude la croissance d’autres espèces
bactériennes sur ces milieux, en particulier sur celui spécifique de P. aeruginosa. Ces résultats
peuvent s’expliquer par le fait que ces milieux sont surtout mis au point et utilisés en milieu
clinique et que la microflore présente dans l’environnement, en particulier dans les sols est
plus diverse qu’à l’hôpital. La présence d’espèces phylogénétiquement proches de P.
aeruginosa telles que P. fluorescens ou P. syringae ainsi que d’autres espèces capables de se
développer sur le milieu utilisé telles que Rhizobium sp. ou Burkholderia sp., qui sont
considérées comme des habitants indigènes du sol, a participé à la difficulté d’isolement de P.
aeruginosa.
En ce qui concerne la distribution des modèles, nous avons pu constater que la présence de P.
aeruginosa dans ces sols n’est que sporadique et associée à la présence de contaminants
(hydrocarbures) ou d’apports organiques (fumier). De ce fait, l’endémicité de P. aeruginosa
dans les sols semble peu probable et l’hypothèse d’un apport exogène par des activités
humaines telles que l’amendement ou l’irrigation est l’hypothèse privilégiée à l’issue de cette
étude.
Certains facteurs comme la présence d’hydrocarbures sur des sites industrialisés pourraient
être responsables du maintien de cette espèce, amenée dans les sols par différentes activités
anthropiques (contamination par l’Homme lui-même, utilisation de canalisations, de machines
pouvant introduire cette espèce dans les sols), en modifiant l’équilibre de la communauté
microbienne et en favorisant le développement de P. aeruginosa, connue pour ses capacités à
dégrader un grand nombre de molécules organiques. En revanche, la présence de S.
maltophilia dans tous les sols testés semble confirmer que cette espèce est bien un habitant
- 139 -
indigène du sol, pouvant constituer une part importante de la microflore hétérotrophe totale
(jusqu’à 1,2 %). De plus, l’apport d’amendements ou l’irrigation avec des eaux usées,
semblent favoriser le développement des populations de S. maltophilia (jusqu’à x 260).
L’augmentation des effectifs des populations de S. maltophilia observée suite à ces
traitements peut s’expliquer d’une part par un apport exogène de nouvelles cellules (présence
dans le fumier), d’autre part par l’apport de nutriments ou d’éléments essentiels à la survie et
à la multiplication de la communauté indigène incluant la population de S. maltophilia. Enfin,
ces pratiques peuvent également être à l’origine de l’apport de contaminants tels que les
métaux lourds ou les molécules organiques, qui vont favoriser la sélection et la propagation de
populations présentant de grandes capacités d’adaptation comme S. maltophilia.
- 140 -
Conclusions (English version)
The presence and abundance of P. aeruginosa and S. maltophilia in soils were investigated by
culture dependent and culture independent methods. The culture dependent method showed a
higher sensitivity allowing the detection of 100 to 101 cells / g of dry soil whereas semi-
quantitative PCR enabled amplification from 104 cells / g of dry soil. However, culture
dependent detection might underestimate the amount of cells present since it does not count
the viable but non-culturable bacteria. Moreover, despite the use of specific media for the
isolation of the models, we observed the growth of other bacterial species, especially on P.
aeruginosa specific medium, that might hamper the growth of P. aeruginosa cells. These
results could be explained by the fact that these media are primarily developed and used in
clinical settings and that the microflora in the environment, especially in soils, is more diverse
than in hospital. The presence of species phylogenetically close to P. aeruginosa such as P.
fluorescens or P. putida as well as other genera i.e. Burkholderia, Ralstonia, able to grow on
the medium used, which are considered as indigenous inhabitants of the soil, have contributed
to the difficulty of isolation of P. aeruginosa.
Concerning the distribution of the models, we found that the presence of P. aeruginosa in
these soils is sporadic and associated to the presence of contaminants (hydrocarbons) or
organic intakes (manure). Thus, P. aeruginosa endemicity in soil seems unlikely and the
hypothesis of an exogenous intake by human activities such as amendments or irrigation is the
preferred hypothesis in our study. Some factors like the presence of hydrocarbons on
industrial sites could be responsible of the maintenance of this species, brought in soil by
various human activities (contamination by man himself, using pipes, machines introducing
this species in soils), by altering the equilibrium of the microbial community and promoting
the development of P. aeruginosa, known for its ability to degrade several organic molecules.
On the opposite, the presence of S. maltophilia in all investigated soils seems to confirm that
this species is an indigenous inhabitant of the soil, and can constitute a significant part of the
total heterotrophic microflora (until 1.2 %). Moreover, intake of organic amendments and
irrigation with wastewater seems to favour the increase of S. maltophilia populations (until x
240). Such increases could be explained first due to an exogenous intake of new cells
(presence in manure) or by intake of nutrients or elements essential to the survival and
multiplication of the indigenous microbial community including S. maltophilia population.
Finally, these practices could also lead to the intake of contaminants as heavy metals or
- 141 -
organic compounds that favour the spread of population presenting high adaptation capacities
such as S. maltophilia.
- 142 -
Chapitre 2 : Evaluation des phénomènes de co-sélection de résistance aux
métaux et aux antibiotiques chez P. aeruginosa et S. maltophilia
Chapter 2: Evaluation of heavy metal and antibiotic resistance co-selection

in P. aeruginosa and S. maltophilia
- 143 -
- 144 -
Introduction
P. aeruginosa et S. maltophilia sont décrites comme des bactéries ubiquistes largement

répandues dans un large panel d’environnements naturels et anthropisés, ce qui suggère
qu’elles pourraient partager les mêmes niches écologiques. Or, nous avons pu constater dans
le premier chapitre expérimental une répartition différente des modèles P. aeruginosa et S.
maltophilia dans les sols. Ainsi, la prévalence de P. aeruginosa dans les sols est faible et sa
présence dans le fumier laisse à penser que sa présence dans les sols serait plutôt liée à un
apport secondaire par l’amendement ou l’eau d’irrigation plutôt qu’à son endémicité dans les
sols. A l’opposé, S. maltophilia a été mise en évidence dans tous les sols investigués, étayant
l’hypothèse de son endémicité dans les sols.
Malgré des différences de prévalence et d’abondance des deux modèles dans les sols, nous
avons pu constater que certaines activités anthropiques pouvaient influencer positivement leur
distribution et leurs effectifs. Cet effet peut être direct par l’introduction de bactéries présentes
dans l’eau d’irrigation ou dans les amendements tels que le fumier. Dans ce dernier cas, les
bactéries introduites peuvent présenter des résistances particulières aux antibiotiques du fait
que les animaux dont elles proviennent peuvent avoir été traités. L’effet peut également être
indirect et dû à la présence de contaminants tels que les molécules organiques ou les métaux
lourds, sélectionnant des espèces ou des souches présentant de meilleures capacités
d’adaptation. L’effet de ces contaminants dans les environnements anthropisés sur la sélection
et le maintien de résistance aux antibiotiques a en effet été suggéré dans différentes études
(Filali, et al., 2000, Berg, et al., 2005, Matyar, et al., 2008). En particulier, la présence de
métaux lourds dans les sols, qui sont à la fois réceptacles et accumulateurs de ces composés
toxiques et réservoirs de déterminants génétiques de résistance aux antibiotiques, pourrait
favoriser la sélection et la dispersion de populations de bactéries résistantes aux antibiotiques
par des phénomènes de co-sélection de résistance. Toutefois, la plupart des études
s’intéressant à ces phénomènes sont menées à l’échelle des communautés et ne tiennent pas
compte de la présence de populations pouvant présenter un intérêt en santé publique telles que
les bactéries pathogènes opportunistes.
Les capacités de résistance aux antibiotiques chez les souches d’origine environnementale des
deux modèles P. aeruginosa et S. maltophilia font l’objet de peu d’études. Ces études sont
menées sur peu de souches, souvent isolées d’environnements particuliers entrainant des
résultats contradictoires. En revanche, la capacité de résistance aux antibiotiques est
- 145 -
considérée comme un facteur majeur impliqué dans la survie dans l’hôpital et fait l’objet de
nombreuses études chez les souches d’origine clinique. Ces bactéries sont intrinsèquement
résistantes à un large panel de molécules antibiotiques grâce à la faible perméabilité de leur
membrane, la présence de pompes à efflux et d’enzymes modifiant les antibiotiques,
mécanismes codés par des déterminants génétiques chromosomiques (Sanchez, et al., 2009,
Strateva & Yordanov, 2009). Ces bactéries présentent également une capacité importante à
l’acquisition de résistance soit par mutation soit par acquisition de plasmides, transposons ou
intégrons par transfert horizontal, entrainant l’émergence de clones multi-résistants (Toleman,
et al., 2007, Gould, 2008).
Ce chapitre se divise en deux parties. L’objectif de la première partie est d’identifier dans
l’environnement des facteurs agissant comme pressions de sélection favorables à l’émergence
et au maintien de résistance aux antibiotiques chez les modèles P. aeruginosa et S.
maltophilia. La présence de métaux pouvant être à l’origine de la co-sélection de résistance
aux métaux et aux antibiotiques que ce soit à faible ou forte concentration, une attention
particulière a également été apportée aux capacités de résistance aux métaux des deux
modèles. Ainsi, nous avons évalué les capacités de résistance aux métaux et aux antibiotiques
chez des souches des deux modèles isolées des environnements étudiés dans le chapitre
précédant et les avons comparées à celles de souches isolées du milieu hospitalier
(environnement hospitalier, patients, personnes atteintes de mucoviscidose) et nous avons
recherché par PCR la présence de gènes impliqués dans la résistance. Les travaux réalisés sur
P. aeruginosa ont été menés sur une collection de souches environnementales constituée de
souches isolées des sols contaminés en hydrocarbures, des vignobles et de fumier. La
prévalence de P. aeruginosa étant faible dans les sols, nous avons complété notre collection
avec des souches d’origine aquatique et isolées d’élevages de serpents caractérisées par notre
équipe, ainsi que des souches terrestres et aquatiques de collections internationales. Les
profils de résistance aux métaux et aux antibiotiques ont été établis pour chaque souche et les
gènes impliqués dans la résistance aux métaux : czcA participant à l’efflux du Zn, Cd, et Co,
copA et copB participant à l’efflux du Cu et merA codant pour la mercurique réductase
permettant la résistance au Hg, ont été recherchés par PCR. En ce qui concerne S. maltophilia,
l’étude a été réalisée sur des souches isolées des sites de Feucherolles et Pierrelaye (France),
de Nabeul (Tunisie) et de 3 sites péri-urbains autour de Ouagadougou. Ces sols sont
caractérisés par différentes activités agricoles comme l’irrigation avec des eaux usées ou
l’utilisation d’amendements organiques, pouvant entrainer diverses contaminations
- 146 -
potentiellement à l’origine de la sélection de résistances. Le site de Feucherolles est
caractérisé par l’absence de contaminations. En ce qui concerne le site de Nabeul, les niveaux
de contaminations sont également faibles dans les sols toutefois on peut envisager que les
eaux usées utilisées pour l’irrigation sont potentiellement contaminées en métaux lourds et
que de ce fait la communauté microbienne peut se retrouver en contact avec des métaux
lourds. Les sites de Ouagadougou sont caractérisés par une contamination en zinc
certainement du fait de l’amendement avec des déchets urbains bruts. Enfin, le site de
Pierrelaye (France) se caractérise par une contamination polymétallique importante du fait de
l’utilisation des eaux usées de la ville de Paris pendant près d’un siècle. De même que pour P.
aeruginosa, nous avons testé les capacités de résistance aux antibiotiques et aux métaux de la
collection de souches de S. malltophilia et recherché la présence de gènes potentiellement
impliqués dans la résistance aux métaux (copB, czcA, czcC et merA). Par ailleurs, S.
maltophilia est caractérisée par un plus grand nombre de résistance intrinsèque aux
antibiotiques que P. aeruginosa, nous nous sommes donc également intéressés à la présence
de gènes potentiellement à l’origine de ces résistances et impliqués dans différents types de
mécanismes (efflux : smeV ; modification de l’antibiotique : smlt3652, blaL2 ; protection de la
cible : qnr) de façon à mettre en évidence le rôle de la présence de ces gènes sur les
phénotypes de résistances observés.
Dans la deuxième partie de ce chapitre, nous nous sommes intéressés de façon plus
approfondie au phénomène de co-résistance au mercure et aux antibiotiques et avons cherché
à mettre en évidence ce phénomène chez les deux modèles. Les gènes permettant la résistance
au mercure sont très souvent positionnés sur des éléments génétiques mobiles de type
plasmide, transposon ou ilot génomique sur lesquels ils peuvent être associés à des gènes de
résistance aux antibiotiques (Liebert, et al., 1999). L’acquisition de ce type d’élément mobile
par transfert horizontal sous la pression mercurique ou antibiotique entraine alors la double
résistance au mercure et aux antibiotiques. Les phénomènes de co-résistance mercure /
antibiotiques sont certainement les plus décrits dans la littérature et ont été mis en évidence
chez de nombreuses espèces bactériennes à la fois dans le milieu hospitalier et dans les
environnements contaminés, ce qui fait de cette association un bon modèle pour l’étude de la
co-résistance métaux / antibiotiques chez des pathogènes opportunistes tels que P. aeruginosa
et S. maltophilia. La présence de différents déterminants positionnés sur des ilots génomiques
dans les génomes des souches séquencées de P. aeruginosa laisse supposée une diversité
intra-spécifique, pouvant s’expliquer par des acquisitions par transfert horizontal. En effet,
seule la souche PAO1 ne possède pas d’opéron merRTPA, responsable de la résistance au
- 147 -
mercure. Le génome de la souche PA14 contient un opéron homologue à celui présent sur le
transposon Tn501. Le génome de PA7 contient 3 opérons mer dont un homologue à celui du
Tn501, un homologue à celui de l’ilot génomique PAGI-5 (Pseudomonas aeruginosa
Genomic island) et un partiel homologue à celui trouvé chez P. stutzeri. Enfin, le génome de
la souche LESB58 contient un opéron mer homologue à celui présent sur l’ilot génomique
PAGI-2. Le séquençage de la souche clinique K279a de S. maltophilia a également révélé la
présence d’un opéron mer positionné sur un ilot génomique. L’objectif de la deuxième partie
de ce chapitre est donc de mettre en évidence des phénomènes de co-résistance mercure /
antibiotiques chez P. aeruginosa et S. maltophilia. Pour cela, la diversité intra-spécifique des
déterminants merA présents chez les deux modèles a été évaluée. Des profils de restriction ont
été établis par digestion des produits PCR obtenus et un représentant de chaque profil a été
séquencé. Un arbre phylogénétique a ensuite été réalisé à l’aide du logiciel Seaview 4.2 (pbil,
Lyon) à partir des séquences obtenues dans cette étude ainsi que des séquences du gène merA
présent chez différentes espèces bactériennes (obtenues sur le site NCBI). Enfin, des
associations entre déterminants merA et les profils de résistances aux antibiotiques ont été
recherchées.
- 148 -
P. aeruginosa and S. maltophilia are described as ubiquitous bacteria widespread in a large

panel of natural and environments impacted by anthropogenic activities, suggesting that they
could share the same ecological niches. However, we observed in the previous chapter that
the two models were not distributed in the same way in soils. The prevalence of P. aeruginosa
in soil is low and its presence in the manure suggests that its presence in soil could be more
likely the consequence of a secondary intake with amendments or water for irrigation than
due to its endemicity in soils. On the opposite, S. maltophilia has been highlighted in all
investigated soils, supporting the hypothesis of its endemicity in soils.
Despite differences in the prevalence and abundance of the two models in soils, we found that
some human activities could positively influence their distribution and numbers. This effect
may be direct through the introduction of bacteria present in irrigation water or amendments
as manure. In this case, introduced bacteria can present specific antibiotic resistance because
animals they come from may have been submitted to antibiotic therapy. The effect can also be
indirect and due to the presence of contaminants such as organic molecules or heavy metals,
selecting species or strains presenting higher adaptation capacities. The effect of these
contaminants in environments impacted by anthropogenic activities on the selection and
maintenance of antibiotic resistance has been suggested in various studies (Filali, et al., 2000,
Berg, et al., 2005, Matyar, et al., 2008). For instance presence of heavy metal in soils,
receivers and accumulators of these toxic compounds and reservoirs of antibiotic resistance
genetic determinants, could favour the selection and spread of resistant bacterial population
by resistance co-selection phenomena. However, most of the studies investigating these
phenomena are conducted at the community level and do not take in account the presence of
populations that could present a public health interest as opportunistic bacterial pathogens.
Antibiotic resistance capacities in environmental strains of the two models P. aeruginosa and
S. maltophilia are poorly studied. Such studies are conducted on few strains, often isolated
from particular environments leading to contradictory results. However, antibiotic resistance
is considered as a major factor involved in the survival in the hospital and is the subject of
numerous studies in clinical strains. These bacteria are intrinsically resistant to a large panel
of antibiotic molecules due to its low membrane permeability, the presence of efflux pumps
and antibiotic modifying enzymes that are encoded by chromosomic determinants (Sanchez,
et al., 2009, Strateva & Yordanov, 2009). These bacteria also have a significant capacity to
- 149 -
acquire resistance either by mutation or by acquisition of plasmids, transposons or integrons
by horizontal transfer, leading to the emergence of multidrug-resistant clones (Toleman, et al.,
2007, Gould, 2008).
This chapter is divided in two parts. The objective of the first part is to identify environmental
factors acting as selective pressure that favour the emergence and maintenance of antibiotic
resistance in P. aeruginosa and S. maltophilia. As presence of heavy metals, even at low or
high concentration, could be responsible of heavy metal and antibiotic resistance co-selection,
a particular attention has been brought to heavy metal resistance capacity of the models. We
evaluated the metal and antibiotic resistance capacity of strains of the two models isolated
from environments studied in the previous chapter and compared to those of strains isolated
from the hospital (hospital environment, patients and cystic fibrosis indivuduals) and we
investigated the presence of genes involved in resistance by PCR. Work on P. aeruginosa was
conducted on a collection of environmental strains isolated from soil contaminated by
hydrocarbons, copper (vineyard soil) and manure. As the prevalence of P. aeruginosa is low
in soils, we added to the collection i) strains from aquatic environments, ii) strains isolated
from healthy captive snakes characterized by our research group (Colinon et al., 2010), and
iii) terrestrial and aquatic strains from international collections. Heavy metal and antibiotic
resistance profiles were determined for each strain and genes implicated in heavy metal
resistance, czcA involved in the efflux of Zn, Cd and Co, copA and copB involved in the
efflux of Cu, and merA encoding a mercuric reductase enabling resistance to Hg, have been
searched by PCR.
Regarding S. maltophilia, the study was realized on strains isolated from the sites of
Feucherolles and Pierrelaye (France), Nabeul (Tunisia) and 3 peri-urban sites near
Ouagadougou (Burkina Faso). These soils were characterized by different agricultural
practices as irrigation with wastewater or organic amendments that could lead to different
contaminations, potentially selecting resistances. As for P. aeruginosa, we tested the capacity
of metal and antibiotic resistance among the collection of S. malltophilia strains and
investigated heavy metal resistance encoding genes (copB, czcA, czcC and merA). Genes
potentially involved in resistance to metals and antibiotics have also been investigated by
PCR. As S. maltophilia is characterized by a higher number of antibiotic resistance
determinants than P. aeruginosa, we also investigated the presence of antibiotic resistance
genes that are implicated in different mechanisms (efflux: smeV; antibiotic modification:
- 150 -
smlt3652, blaL2; target protection: qnr), in order to highlight the role of the presence of these
genes on the resistance phenotypes observed.
In the second part of this chapter, we focused on mercury and antibiotic co-resistance and
tried to highlight such phenomenon in both models. Mercury resistance genes are often
carried on mobile elements like plasmid, transposon or genomic island on which they may be
associated with antibiotic resistance genes (Liebert et al., 1999). Acquisition of such element
by horizontal transfer under mercury or antibiotic selective pressure leads to both mercury and
antibiotic resistance. Mercury and antibiotic co-resistance are probably the most often
reported in the literature and were demonstrated in many bacterial species in both the hospital
and in contaminated environments, which makes this association a good model for the study
of metal and antibiotic co-resistance among opportunistic pathogens. Presence of several
determinants on genomic islands in sequenced strains of P. aeruginosa suggests a high intra-
specific diversity that could be explained by acquisition of these mobile elements by
horizontal transfer. The PAO1 strain is the only strain that do not harbour any merRTPA
operon, responsible of mercury resistance. PA14 genome possesses an operon homologous to
the one present on the Tn501 transposon. PA7 genome contains 3 mer operons, one
homologous to the one present on the Tn501, one homologous to the one present on PAGI-5
(Pseudomonas aeruginosa genomic island), and one partial operon presenting homology with
the one found in P. stutzeri. Finally, the LESB58 genome contains an operon homologous to
the one present on PAGI-2. Sequencing of the K279a clinical strain of S. maltophilia revealed
the presence of one mer operon on a genomic island and no mer operon was found in the
genome of the environmental strain R551-3. The aim of this second part is to look for
mercury and antibiotic co-resistance in P. aeruginosa and S. maltophilia. Intra-specific
diversity of merA determinants present in both models has been studied. Restriction profiles
were established by digesting merA PCR products and one to seven representative of each
profile was sequenced. A phylogenetic tree was then realised with the Seaview 4.2 software
(pbil, Lyon) with merA sequences obtained in this study and merA sequences from different
bacterial species (obtained from the NCBI website). Association between merA determinants
and antibiotic resistance profiles were also investigated, especially the ones that concern
PAGI-2 genomic island of P. aeruginosa.
- 151 -
- 152 -
Partie 1 : Diversité de résistance aux métaux et aux antibiotiques chez P.
aeruginosa et S. maltophilia en fonction de l’origine des souches et des
pressions de sélection
Part 1: Heavy metal and antibiotic resistance diversity in P. aeruginosa and S.

maltophilia depending on their origin and selective pressure
- 153 -
- 154 -
“Antibiotic and heavy metal resistance among hospital and environmental strains of
Pseudomonas aeruginosa”
Amélie Deredjian, Céline Colinon, Elisabeth Brothier, Sabine Favre-Bonté, Benoit
Cournoyer, and Sylvie Nazaret*
Environment », UMR 5557 Ecologie Microbienne, CNRS, Ecole Nationale Vétérinaire de
Lyon, and Université Lyon 1, France.
Short running title: Pseudomonas aeruginosa, antibiotic, heavy metal, resistance, selective
pressure
* Corresponding author. Mailing address: UMR 5557 Ecologie Microbienne, Université Lyon
1, Mendel Bldg., 5th Floor, F-69622 Villeurbanne Cedex, France. Phone: 33 (0) 4 72 43 13
24. Fax: 33 (0) 4 26 23 44 68. E-mail: [email protected].
ABSTRACT
- 155 -
Antibiotic resistance capacity of Pseudomonas aeruginosa is a major factor implicated in its
success as an opportunistic pathogen. The intensive use of antimicrobial compounds in
hospital acts as a selective pressure for the emergence of resistant strains. Whether the non
hospital environment offers such favourable conditions, irrespective of antibiotic presence, is
not well documented. Here we investigated the antibiotic and heavy metal resistance
capacities of a collection of 130 strains of P. aeruginosa from various environmental (soils,
water, animals) and hospital (environment, patients, CF individuals) origin in order to
evaluate niches and selective pressures that favour antibiotic resistance acquisition and
maintenance. Most of the 76 environmental strains showed the wild type antibiotic resistance
phenotype, i.e. resistance to minocycline and trimethoprim-sulfamethoxazole. On the
opposite, 60 % of hospital strains presented a multi-resistance phenotype (3 to 16 antibiotics),
suggesting that presence of high antibiotic concentrations is the major selective pressure
responsible of the selection and maintenance of antibiotic resistance in P. aeruginosa.
However, 12 % of environmental strains submitted to antiseptics and hydrocarbons in their
original niches possessed particular resistance phenotypes, suggesting that contaminations due
to anthropogenic activities could lead to antibiotic resistance selection. Regarding heavy
metal resistance, environmental strains were more frequently resistant to zinc and cadmium,
despite the presence of implicated genes in all the strains, since hospital strains were more
frequently resistant to mercury and copper. No association between antibiotic and heavy metal
resistances were seen. On the opposite the most resistant strains to antibiotics were the least
resistant to heavy metals and inversely.
- 156 -
INTRODUCTION
Pseudomonas aeruginosa, a metabolically versatile Gram-negative bacterium, is capable to

adapt to and colonize a wide range of environments. It is present in aquatic and wet
ecosystems such as river (Pellett, et al., 1983), bottled mineral water (Hunter, 1993), open
ocean (Khan, et al., 2007), wastewater (Schwartz, et al., 2006), and can be isolated from
various terrestrial environments including soils from agricultural lands, hydrocarbon impacted
sites (Green, et al., 1974, Deziel, et al., 1996), and plant roots (De Meyer & Hofte, 1997).
P. aeruginosa also emerged as a major opportunistic human pathogen and is a common cause
of nosocomially-acquired infections partly due to its resistance to antibiotics (Kerr &
Snelling, 2009). It is associated to infections among burnt victims, artificially ventilated
individuals (McManus, et al., 1985, Richard, et al., 1994), catheterized-patients and cystic
fibrosis patients (Foweraker, 2009). Infections in healthy individuals can occur as keratitis,
dermatitis (Dart, 1988) and otitis (Reid & Porter, 1981). This bacterium can be detected in
human and animal fecal samples (Lavenir, et al., 2008, Colinon, et al., 2009) and has been
identified as an animal pathogen responsible of ocular infections in dogs (Ledbetter, et al.,
2009), and as an occasional cause of bovine mastitis (Osborne, et al., 1981).
P. aeruginosa is characterized by an innate resistance to a wide variety of antimicrobial
agents. Its low outer membrane permeability and expression of a number of broadly-specific
multidrug efflux (Mex) systems (Morita, et al., 2001, Lambert, 2002, Fajardo, et al., 2008,
Strateva & Yordanov, 2009) contribute to the resistance. The strains can also acquire multi-
resistance to antibiotics through horizontal gene transfer (Alonso, et al., 1999). Plasmids,
transposons and integrons mediated antibiotic resistance genes are increasingly found in P.
aeruginosa clinical isolates (Gould, 2008, Strateva & Yordanov, 2009). The intensive use of
antibiotics in the hospital influences the development and spread of resistance among clinical
strains (Alonso et al., 1999; Gould, 2008). Other selective pressures might also favour the
acquisition of antibiotic resistance such as the use of antiseptics or quaternary ammonium.
Resistance to these compounds is often present on mobile elements with other antibiotic
resistance genes (Heuer, et al., 2004, Colinon, et al., 2007) and their use may select both
resistances (Bischoff, et al., 2005). Similarly, antibiotic resistance can be co-selected with
resistance to heavy metals. Exposure to low concentration of zinc eluted from siliconized
latex urinary catheters was shown to induce resistance to the carbapenem-class antibiotic
imipenem in P. aeruginosa through the repression of the OprD porine and then the influx of
this antibiotic (Conejo, et al., 2003, Perron, et al., 2004). The CzcR/CzcS two-component
- 157 -
system was found to co-regulate resistance to both zinc and imipenem. It was further shown
that copper is able to induce imipenem resistance through a similar co-regulation mechanism
involving the CopR-CopS two-component system (Caille, et al., 2007). These observations
suggested that various chemicals in the hospital might contribute to maintain a selective
pressure for antibiotic resistance.
In the environment (i.e. outside the hospital), the presence of antibiotics, consecutive to the
release from microbial antibiotic producers or from human activity (i.e. agricultural use, waste
water treatment plant system), can act as a selective pressure leading to the occurrence of
resistance within indigenous bacterial populations (Martinez, 2009). It is also known that
selection of antibiotic resistance determinants might occur by means of chemical or heavy
metal pollution. For instance, antibiotic resistant bacteria are often found in polluted
ecosystems, such as wastewater or hydrocarbon impacted environments (Filali, et al., 2000,
Berg, et al., 2005, Matyar, et al., 2008). In these environments, high antibiotic resistance level
is often associated to heavy metal resistance. In a recent survey of the occurrence of P.
aeruginosa in hydrocarbon-contaminated sites, Kaszab et al. (2010) showed that multidrug-
resistant isolates were widespread in these ecosystems. However, the molecular mechanisms
and the selective pressure responsible of antibiotic resistance in the isolates were not
investigated. Since heavy metals are often associated to hydrocarbons, one could expect that
their presence may act as a selective pressure in hydrocarbon-contaminated environments.
Our objectives were to conduct an exploratory study to identify niches and selective pressures
that could favour the emergence of antibiotic resistance in environmental isolates of P.
aeruginosa. Our strategy was based on the antibiotic susceptibility testing of environmental
and clinical strains which were chosen on their expected past exposure to selective pressure
(from low to high antibiotic or antiseptic use, hydrocarbons, heavy metals). A set of 76
environmental P. aeruginosa strains from manure, water, snakes and soil, 29 hospital strains
and 25 strains from CF patients selected in international collections and our own collection
were analysed. As antibiotic resistance is often linked with heavy metal resistance and as
heavy metals could act as selective pressure at low or high concentration both inside and
outside the hospital, we evaluated heavy metal susceptibility and searched for the presence of
heavy metal resistance genes (czcA copA, and merA involved in cadmium and zinc, copper,
and mercury resistance, respectively).
- 158 -
MATERIALS AND METHODS
Strains
A collection of 130 strains of P. aeruginosa was used in this study (Table 5). These strains
were chosen taking into account their origin and the putative anthropogenic selective pressure
(i.e. antibiotics, antiseptics, hydrocarbons, heavy metals) present in their original niche.
Environmental strains (76 isolates from outside the hospital) formed 3 groups. The first group
was composed of strains isolated from water: 3 strains from natural water (international
collections) and 14 strains from a wastewater treatment plant system, Montracol France
(BPOE collection). The second group was composed of strains isolated from soil related
samples: 12 strains from plants (international collections), 3 strains from vineyard soils
(BPOE collection), 16 strains from hydrocarbon impacted sites (international and BPOE
collections), 5 strains from manure (BPOE collection) and 2 strains from animal feces
(international and BPOE collections). The third group was composed of 13 strains isolated
from snake breedings (healthy snake feces, cages, feeding…) (BPOE collection) (Colinon et
al., 2010). The 54 strains from the hospital were also divided in 3 groups. The first group was
composed of strains isolated from the hospital environment: 10 strains from the water system
and 6 strains from aeration grids (Long stay care unit of the Hospices Civils de Lyon (HCL),
Lyon France, BPOE collection) (Lavenir et al., 2008). The second group was composed of
strains isolated from patients: 5 strains from carrier patients (HCL, Lyon France, BPOE
collection) and 8 strains from infected patients (HCL, Lyon France, BPOE collection and
international collections). The third group was composed of 25 strains isolated from French
cystic fibrosis individuals (BPOE collection). Strains originating from the wastewater
treatment plant, the snake breedings, and the HCL hospital were chosen based on their
belonging to different clonal complexes as previously defined by PFGE (Pulse Field Gel
Electrophoresis) SpeI typing method (Lavenir, ph thesis, unpublished data; Lavenir et al.,
2008; Colinon et al., 2009, unpublished data). Other strains were chosen taking into account
their different origins, increasing the diversity of the studied collection, based on literature
data.
- 159 -
Table 5. Strains of P. aeruginosa isolated from environment and hospital.
Origin Name Details Supposed selective References

pressure *
Environment
Water Natural water LMD2527 (Ew1),LMG2107 (Ew2), International collections Low concentration of
LMG9009 (Ew3) antibiotics, disinfectants,
Waste water poe1033 (Ew4), poe1108 (Ew5), Waste water treatment heavy metals Lavenir et al.,
poe1028 (Ew6), poe1314 (Ew7), plant, Montracol (France) 2007
poe1091 (Ew8), poe1062 (Ew9),
poe1312 (Ew10), poe1045 (Ew11),
poe1026 (Ew12), poe1372 (Ew13),
poe1436 Ew14), poe1150 (Ew15),
poe1081 (EW16), poe1302 (Ew17)
Soil related Plant related ATCC14425 (Es1), CFBP5031 International collections Antibacterial compouds
(Es2), CFBP5032 (Es3), CFBP5033 due to plant and
(Es4), CFBP5034 (Es5), LMG5031 microorganism
(Es6), LMG5032 (Es7), LMG5033 production
(Es8), LMG1272 (Es9), LMG6855
(Es10), CFBP2466 (Es11),
CFBP5035 (Es12)
Soil ATCC21776 (Es13), ATCC31479 International collections Antibiotics due to
(Es14), CIP104590 (Es15), producer microorganisms
LMD5034 (Es16), LMD68.7 (Es17),
LMG15153 (Es18), 7NSK2 (Es19),
DSMZ6195 (Es20)
Vineyard bpoe1457 (Es21), bpoe1459 (Es22), Vineyard amended with Copper contamination
bpoe1460 (Es23) mushroom manure,
Burgundy (France)
Hydrocarbon bpoe1428 (Es24), bpoe1429 (Es25), Hydrocarbon impacted, Hydrocarbons, heavy

impacted soil bpoe1430 (Es26), bpoe1431 (Es27), Lorraine and Ile de metal contamination
bpoe1432 (Es28), bpoe1433 (Es29), France (France)
bpoe1444 (Es30), bpoe1445 (Es31),
bpoe1447 (Es32), bpoe1454 (Es33),
bpoe1464 (Es34), bpoe1465 (Es35),
bpoe1466 (Es36)
CFBP5036 (Es37), CFBP5037 Hydrocarbon impacted
(Es38), ATCC33988 (Es39) sitesInternational
collections
Manure bpoe1461 (Es40), bpoe1462 (Es41), Horse manure Antibiotic treatment

bpoe1474 (Es42), bpoe1475 (Es43),
bpoe1479 (Es44)
Animals ATCC27014 (Es45) International collections No known exposure
bpoe1463 (Es46) Elk, Park of Bandia

(Senegal)
- 160 -
Snake bpoe602 (Esb1), bpoe626 (Esb2), Healthy captive snakes, Disinfectants Colinon et
breedings bpoe636 (Esb3), bpoe639 (Esb4), (France) al.,2009
bpoe688 (Esb5), bpoe690 (Esb6),
bpoe600 (Esb13)
Hospital
Environment Water poe9 (He1), poe92 (He2), poe110 Water system, H. Indirect antibiotic Lavenir et al.,
(He3), poe101 (He4), poe22 (He5), Hospices civils de Lyon pressure 2008
poe45 (He6), poe59 (He7), poe17 (France)
(He8), poe1 (He9), poe2 (He10)
Aeration grids poe81 (He11), poe30 (He12), poe103 Aeration grids, Hospices Lavenir et al.,
(He13), poe77 (He14), poe64 Civils de Lyon, Lyon 2008
(He15), poe131 (He16) (France)
Patients Human poe73 (Hp1), poe8 (Hp2), poe19 Rectal swabs, Hospices Direct antibiotic pressure Lavenir et al.,
carriage (Hp3), poe54 (Hp5), poe51 (Hp6) Civils de Lyon, Lyon 2008
(France)
Infections poe126 (Hp7) Patients, Hospices Civils Lavenir et al.,
de Lyon, Lyon (France) 2008
ATCC15691 (Hp8), ATCC27853 International collections

(Hp9), PA5 (Hp10), PA6 (Hp11),
PA12 (Hp12), PA14 (Hp13), PAO1
(Hp14)
Cystic Cystic fibrosis bpoe977 (Hcf1), bpoe979 (Hcf2), France Heavy and long-term
fibrosis bpoe980 (Hcf3), bpoe981 (Hcf4), direct antibiotic pressure
individuals bpoe982 (Hcf5), bpoe983 (Hcf6),
bpoe984 (Hcf7), bpoe5000 (Hcf8),
bpoe5001 (Hcf9), bpoe5002 (Hcf10),
bpoe5003 (Hcf11), bpoe5004
(Hcf12), bpoe5005 (Hcf13),
(Hcf15), bpoe5008 (Hcf16),
(Hcf18), bpoe5011 (Hcf19),
(Hcf21), bpoe5014 (Hcf22),
(Hcf24), bpoe5017 (Hcf25)
Names in brackets are used in the dendrogram

* Supposed selective pressures were determined according to the literature.
- 161 -
Antibiotic resistance test
The in vitro antimicrobial susceptibilities of P. aeruginosa were routinely determined using
the VITEK 2 system with a card (NO93) permitting to establish antibiotic resistance profile of
non fermenting gram negative bacteria (Biomérieux, Marcy l'Etoile, France) following
recommendations of the manufacturer. Briefly, a suspension was prepared from a 24h pure
culture realised on TSA (Tryptic Soy Agar) in a saline solution (NaCl2 0.4 %) in order to
reach an optical density between 0.50 and 0.63 McFarland. Then, 145 μL of this suspension
was added to a new 3 ml saline solution (NaCl2 0.4 %). This suspension was adsorbed by
capillarity on the card. Minimal inhibitory concentrations were then determined by measuring
growth at different points during the incubation and comparing it in control and antibiotic
supplemented wells. Minimal inhibitory concentrations of 18 antibiotics [ticarcillin (TIC 16,
32, 64 μg/ml), ticarcillin-clavulanic acid (TIM 8/2, 32/2, 64/2 μg/ml), piperacillin (PIP 4, 16,
64 μg/ml), piperacillin-tazobactam (TZP 4/4, 16/4, 128/4 μg/ml), ceftazidim (CAZ 1, 2, 8, 32
μg/ml), cefepim (FEP 2, 8, 16, 32 μg/ml), aztreonam (ATM 2, 8, 32 μg/ml), imipenem (IPM
2, 4, 16 μg/ml), mereopenem (MEM 0.5, 4, 16 μg/ml), amikacin (AMK 8, 16, 64 μg/ml),
gentamicin (GEN 4, 16,32 μg/ml), isepamicin (ISP 4, 8, 32 μg/ml), tobramicin (TOB 8, 16,
64 μg/ml), ciprofloxacin (CIP 0.5, 2, 4 μg/ml), pefloxacin (PEF 0.5, 2, 8 μg/ml), colistin (CS
4, 16, 32 μg/ml), minocyclin (MIN 2, 4, 8 μg/ml), trimethoprim-sulfamethoxazol (SXT
0.5/9.5, 2/38, 16/304 μg/ml)] were determined.
Heavy metal resistance profiles

Heavy metal resistance of P. aeruginosa strains were established using TSA medium diluted
10 fold (TSA 1/10) supplemented with 5, 10, 20, 50 mM of Zn2+ (ZnCl2), 0.5, 1, 2, 5 mM of
Cu2+ (CuCl2), 0.6, 1.25, and 2.5 mM of Cd2+ (CdCl2), 10 and 50 μM of Hg2+ (HgCl2).
Preliminary tests were done in order to define the suitable concentrations. Two strains PAO1
and ATCC15691 were used as control for each manipulation. A suspension was realised from
a 24h pure culture on TSA 1/10 in a saline suspension (NaCl2 0.8 %). One hundred μL of the
suspension was inoculated on the supplemented and non supplemented TSA1/10 plates.
Cultures were incubated at 28°C up to seven days. A strain was considered as resistant when
growth on medium supplemented with metal was equivalent of growth on medium without
metal. When growth was lower, the resistance was intermediate. When no growth was
obtained, the strain was considered as sensitive. Experiments were repeated twice.
- 162 -
Data analysis
The phenotypic data from antibiotic and heavy metal resistance testing were encoded either as
0 (sensitivity), 1 (intermediate) or 2 (resistance). Euclidian distance between strains were
computed and subjected to hierarchical cluster analysis using the agglomerative second order
moment algorithm known as Ward’s method (Thioulouse & Lobry, 1995) to produce the
dendrograms.
Heavy metal resistance gene amplification

The primers used in this study are summarized in Table 6. The copA, copB and czcA primers
specific to P. aeruginosa were designed by Bouskil and colleagues (Bouskill, et al., 2007) and
PCR conditions were as discussed by the authors. Degenerated primers were designed in
order to amplify a broad range of merA genes (encoding mercuric reductase) from Gram
negative bacteria (Ranjard, ph thesis, unpublished data). These primers were obtained by
sequence alignment of merA genes of Gram negative bacteria available. The following PCR
cycle was used to amplify a 933 bp segment of merA (total size 1686 pb): an initial
denaturation step is done at 94°C during 4 min. This first step is followed by 30 cycles of 1
min denaturation at 94°C, 1 min of primer annealing at 57°C, 1 min of primer extension at
72°C. Finally, a final extension was done during 8 min at 72°C.
Table 6. PCR primers used for screening heavy metal resistance genes.
Annealing
Product temperature
ORF Function Forward primer 5'-3' Reverse primer 5'-3' size bp °C References
copper-
Bouskill
copA transporting P- GAAATAGCTCATTGCCGAGGCGTT CGGTCTCTACGAATACCGCTTCAA 475 55
et al., 2007
type ATPase
copper-linking Bouskill
copB GGTTGGTCAACAGGATGTCGTACT TTCCTGCTCGACCAGTTGGAATAC 364 58
protein et al., 2007
divalent metal
Bouskill
czcA cation efflux ACAGGTTGCGGATGAAGGAGATCA GTTCACCTTGCTCTTCGCCATGTT 206 56
et al., 2007
transporter
Mercuric
merA GTGCCGTCCAAGATCATGAT TAGCCYACRGTSGCSACYTG 933 57 This study
reductase
- 163 -
A 100
90 67 Hospital (n = 54)
80 Environment (n = 76)
70
Strains (%)
60
50
22 21
40
30
20 7
9
10 4
0
WT [=2] [3-5] [6-8] [> 8]
B 100
17 40
90 Water (n = 17)
80 10 Soil related (n = 46)
Strains (%)
70 Snake breedings (n = 13)

60
50
40
30 3
20 6
10
0
WT [=2] [3-5] [6-8] [> 8]
C 70
8 Hospital environment (n = 16)
60 9
Patients (n = 13)
50 Cystic fibrosis individuals (n = 25)
Strains (%)
10
40 9
30
4 3
20
3
3 3
10 1 1
0
WT [=2] [3-5] [6-8] [> 8]
Figure 28. Antibiotic multi-resistance in 76 environmental and 54 hospital strains of P.

(C).
Effectives are indicated above bars; n = number of strains in each category; WT = Wild Type;
[ ] = number of antibiotics.
- 164 -
RESULTS
Antibiotic resistance profiles

The antimicrobial susceptibility of the 130 P. aeruginosa strains was tested. Like the wild-
type (WT), all the strains (100%) were resistant to minocycline and trimethoprim-
sulfamethoxazole and sensitive to colistin. Eighty-nine percent of the 76 strains with an
environmental origin presented the WT antibiotic resistance phenotype of P. aeruginosa
whereas 41 % of the 54 strains with a hospital origin showed the WT phenotype. The non-WT
environmental strains had 1 to 3 additional resistances whereas hospital ones could resist to
more than 8 antibiotics (Figure 28A). Whereas environmental strains presented resistance to
only 6 out of the 15 antibiotics (Figure 29B) resistance to all antibiotics was observed within
the hospital group (Figure 29C).
Within each group differences in antibiotic resistance levels with regard to the number of
antibiotics (Figure 28A) and the type of antibiotics (Figure 29A) were observed. Within the
environmental group (Figure 28B), all the strains from water showed the WT phenotype, with
no additional resistance. Strains from snake (23 %) and soil related (14 %) origin showed
resistance up to 5 antibiotics (Figure 28B). Resistances to ticarcillin, ticarcillin-clavulanic acid
(penam), imipenem (carbapenem), and pefloxacine (quinolone) were observed among soil
related strains (Figure 29B). Resistance to ticarcillin and ticarcillin-clavulanic acid was
observed in 2 strains from hydrocarbon impacted site, 2 from plants and 2 from soil.
Imipenem resistance was observed in one strain from hydrocarbon impacted site and
pefloxacin resistance was observed in 1 strain from soil. Resistance to gentamicin and
tobramycin was only observed in 3 strains isolated from the snake breeding group (Figure
29B).
Within the hospital group, 25%, 62% and 40% of the strains from the hospital environment,
the patients and the CF individuals, respectively had the WT resistance phenotype (Figure
28C). Eight % and 12 % of strains from patients and from CF individuals were resistant to
more than 8 antibiotics (Figure 28C), respectively and one CF strain had the particularity of
being resistant to all tested antibiotics (Figure 29C). Among strains from patients, no
resistance was observed for 5 antibiotics, i.e.ceftazidim, cefepim, aztreonam, meropenem and
amikacin and no dominant resistance phenotype was observed. Among strains from the
hospital environment, no resistance was observed for 6 antibiotics i.e. piperacillin-
tazobactam, ceftazidim, cefepim, aztreonam, meropenem and tobramycin and resistances to
imipenem and pefloxacin were the most frequent i.e. 37 % of resistant in this group (Figure
- 165 -
29C). Resistances to gentamicin and pefloxacin were the most frequent among strains isolated
from CF individuals, representing 36 % and 48 % of the strains of this group, respectively
(Figure 29C).
40
Hospital (n = 54) 1
35 9
Resistant strains (%)
Environment (n = 76)
30
25 13 1
3
20
9 9 9
15 7 7
6
10 6 6 4
3 3 3 3
5 2 3 3
1 1
0
TIC TIM PIP TZP CAZ FEP ATM IPM MEM AMK GEN ISP TOB CIP PEF
25
3 3
Water (n = 17)
20 Soil related (n = 46)

( )
Snake breedings (n = 13)
15
6 6
10
5
1 1
0
50
1
Hos pital environm ent (n = 16)
2
Patients (n = 13)
40 6 6
9
Cys tic fibrosis individuals (n = 25)
30
6
5 5
20 3 3
24 24 2 2 2 2 4
3 3 3 3 2 2 2 2
10 12 2 1 2 1 1
1
0
Figure 29. Antibiotic resistance profiles in environmental and hospital strains of P.

(C). Effectives are indicated above bars; n = number of strains in each category; TIC =
Ticarcillin, TIM = ticarcillin-clavulanic acid, PIP = piperacillin, TZP = piperacillin-
tazobactam, CAZ = ceftazidim, FEP = cefepim, AZT = aztreonam, IPM = imipenem, MEM =
mereopenem, AMK = amikacin, GEN = gentamicin, ISP = isepamicin, TOB = tobramicin,
CIP = ciprofloxacin, PEF = pefloxacin.
- 166 -
Heavy metal resistance
Differences in heavy metal resistance were observed between and within the 2 groups of
strains both toward the type of the heavy metal and the concentrations of the heavy metal
(Figure 30). In environmental strains, we found strains able to grow in the presence of heavy
metal at concentrations up to 20 mM of Zn2+, 0.5 mM of Cu2+, 1.25 mM of Cd2+ and 10 μM of
Hg2+. Within the hospital group strains were able to grow on the same concentrations of Zn2+,
Cd2+ and Hg2+ but some strains were found resistant to higher concentrations of Cu since they
grow on 1 or 2 mM of Cu2+ (Figure 30A). None of the strains irrespective of their origin were
able to grow in the presence of the highest concentrations tested i.e. 50 mM of Zn2+, 5 mM of
Cu2+, 2.5 mM of Cd2+ and 50 μM of Hg2+. Regarding the hospital strains, within each sub-
group, a fewer number of strains were resistant to heavy metals, especially Zn2+ and Cd2+,
compare to environmental sub-group (Figure 30B and C). On the opposite a higher number of
strains were able to grow on 10 μM of Hg2+. Among environmental strains, those isolated
from snake breedings were the least resistant since no resistance was observed for Zn2+ and
Hg2+ and only 30 % of them showed resistance to the lowest concentrations of Cd2+ and Cu2+
(0.5 and 0.6 mM, respectively) (Figure 30B). On the opposite strains from water and soil
related samples were resistant to all the tested metals. Resistance to Cu2+ was only observed at
the lowest concentration (0.5 mM) but most of these strains were able to grow in presence of
this concentration, 94 % and 100 % of strains from water and soil related samples,
respectively. Concerning Zn2+, 65 % and 29 % of the strains isolated from water were
resistant to 5 and 10 mM of Zn2+, respectively. About 83 %, 76 % and 30 % of strains from
soil related samples were resistant to 5, 10 mM and 20 mM of Zn2+. Concerning Cd2+, 71 %
and 53 % of the strains from water and 72 % and 33 % of the strains from soil related samples
were able to grow in the presence of 0.6 and 1.25 mM of Cd2+, respectively. Resistance to
Hg2+ was the least distributed among environmental samples with less than 20 % of the strains
from water and soil related samples resistant to 10 μM of Hg2+ (6 % and 17 %, respectively).
Among hospital strains those isolated from the CF individuals were the least resistant to
heavy metals (Figure 30C). Whatever the metal and the concentration, a few of them were
able to grow. On the opposite the highest proportion of resistant strains were mostly observed
among those isolated from patients. Notably, the percentage of resistant strains isolated from
CF patients did not reach up to 25 % while the percentage of resistant strains from the hospital
environment and patients frequently reached up 50 %.
- 167 -
A 100
90 66 Hospital (n = 54)
80 Environment (n = 76)
70 49 49
60 40 27
50
40 20
16 24
30 15 14
12
20 14
9
10 2 2 2
0
5 mM 10 mM 20 mM 0,5 mM 1 mM 2 mM 0,6 mM 1,25 mM 10 μM
Zn Cu Cd Hg
B 100
16 46 Water (n = 17)
90
38 Soil related (n = 46)
80 35 Snake breedings (n = 13)

12
70 11 33
60 9
50
40
5 14 4 4 15
30
20 8
10 1
0
Zn Cu Cd Hg
C 90
13 11 Hospital environment (n = 16)
80
9 Patients (n = 13)
70
Cystic fibrosis individuals (n = 25)
60 7 9
7
50 6
5
40
5 5
30 4 4
6
20 4
3 3 2
10 1
1
2 11 1
0
Zn Cu Cd Hg
Figure 30. Heavy metal resistance in environmental and hospital strains of P. aeruginosa (A),
within environmental strain sub-groups (B) and strain hospital sub-groups (C).
Effectives are indicated above bars; n = number of strains in each category.
- 168 -
Concerning Zn2+, 31 %, 69 % and 24 % of strains from the hospital environment, from
patients and from CF individuals were able to resist to 5 mM of Zn2+; 25 %, 54 % and 16 %
were resistant to 10 mM of Zn2+, respectively. Only strains from patients and CF individuals
were resistant to 20 mM (8 % and 4 %, respectively). Concerning Cd2+, 25 %, 54 % and 12 %
of strains isolated from the hospital environment, from patients and from CF individuals were
resistant to 0.6 mM of Cd2+. Only 15 % of strains from patients showed resistance to 1.25
mM. Mercury resistance was more frequent in strains from the hospital environment and from
patients (31 % and 46 %, respectively) than in strains from CF individuals.
Strains similarity based on antibiotic and heavy metal resistance

The dendrogram differentiated 3 major groups (Figure 31). One group was composed of
strains presenting multi-resistance to antibiotics. This group was composed of 32 strains
including 28 from the hospital (14 from CF individuals, 5 from patients, 9 from the hospital
environment) and 4 from the environment (3 from snake breedings presenting aminoside
resistance and 1 from soil). A second group was composed of strains presenting low
resistance to antibiotics but high heavy metal resistance. This group contained 42 strains.
Among these strains, only one was isolated from the hospital (PAO1). Other strains were
isolated from water (11) and from soil related samples (30). A third group was composed of
56 strains with intermediate level of resistance, 25 from the hospital (11 from CF isolates, 7
from patients, 7 from the hospital environment), 31 from the environment (10 from snake
breedings, 15 from soil related samples, 6 from water). Among the group of strains exhibiting
resistance toward antibiotics and heavy metals no systematic association between antibiotic
resistance and heavy metal resistance were seen.
Presence of heavy metal resistance genes

The presence of the heavy metal resistance encoding genes copA, copB, czcA and merA was
determined by PCR using specific primers. These genes are present in the 4 sequenced
genomes of P. aeruginosa strains PAO1, PA14, PA7 and LESB58, except merA which is
absent in the genome of PAO1. On the genomes the complete resistance operons were
present. Positive amplification signals were obtained for czcA, copA and copB for all the
tested strains (whatever their origin and their resistance phenotype). On the opposite, merA
gene was only detected in 33 % of strains (Table 7).
- 169 -
Es28,Es33,Es32,Es27,Es2
5,Es24,Es36,Es34,Es46,Es
2
Heavy metal resistance +

Antibiotic resistance - Ew7,Ew5,Es8,Ew4,Es5,
Ew13,Ew12,Ew2,Es9,
Es4,Es7,Es38
- 41 strains from the environment (11
from water (Ew), 30 from soil related
samples (Es)) Ew15,Ew8,Es12,Ew6,
- 1 strain from the hospital (from a Es45,Es6,Ew9,Es1,Es37
patient (Hp12* = PAO1))
Es44,Es41,Es22,Es26,
Es40,Es31,Es21,Ew14,
Es18,Es13,Hp12*
Hcf17,Es43,Es42,Es35,Hp
11,Es23,Hcf24
Hp13,Hp9,Es3,Hcf23,
Ew3,Es14,Hp4,Es20,
Heavy metal resistance +/- Es17,He5
Antibiotic resistance +/-
Es29,Es30,Es16,Hcf16,
Hp3,Hcf10,He9,Hp2,
- 25 strains from the hospital (11 from CF He16,He10,He8
isolates (Hcf), 7 from patients (Hp), 7 from
the hospital environment (He)) Esb13,Esb12,Esb4,
- 31 strains from the environment (10 Es10,Es19,Hp7
from snake breedings (Esb), 15 from soil
related samples (Es), 6 from water (Ew)) Esb8,Esb10,Ecf21,Ew
10,Hcf6,Hcf18
Ew11,Esb6,Esb11,Esb7,
Esb1,Es11,Es39,Ew1,
Ew16,Esb2,He11,Hcf25,
Hcf22,Ew17,Hcf12,He6
Hcf19,Hcf13,Hcf2,Hcf9,Hcf1
4,Hcf8,He12,He5,
Antibiotic resistance + Hp10,Hp6,He4
Heavy metal resistance -
Esb9,Esb5,Esb3,Es15
- 28 strains from the hospital (14 from Hp5,Hp1
CF individuals (Hcf), 5 from patients (Hp), Hcf1,Hcf4,Hcf20,Hcf15,
9 from the hospital environment (He)) He13,Hcf11,He7
- 4 strains from the environment (3
from snake breedings (Esb), 1 from soil Hp8,He2,He3
(Es))
Hcf3, Hcf5,Hcf7,
He14,He1
Figure 31. Dendrogram showing the relationships between P. aeruginosa strains based on
antibiotic and heavy metal resistance data. The 130 strains analysed are presented in Table 5.
- 170 -
We showed that merA was more frequently detected among strains from the hospital
environment (100 %) and from patients (77 %) than in other strains; 29 % of strains isolated
from water, 28 % from CF patients, 21% from snake breedings, and 15 % from soil related
samples (Table 7). Whereas all strains from the hospital that showed a mercury resistant
phenotype had a merA-like gene, 6 strains from soil related samples had the resistant
phenotype but no detectable merA-like gene. Similarly several strains from both
environmental and hospital origin showed a positive merA amplification signal but were not
able to grow on 10 μM of Hg2+.
Table 7. Mercury resistance phenotype and genotype.
Hospital Environment
CF Snake
Environment Patients Water Soil related
individuals breedings
Strains
growing in
presence of
10 μM Hg2+ 31,25 % (5/16) 46,15 % (6/13) 4 % (1/25) 5,88 % (1/17) 17,39 % (8/46) 0 % (0/13)
Strains with
a merA-like
gene 100 % (16/16) 76,92 % (10/13) 28 % (7/25) 29,41 % (5/17) 15,38 % (2/13) 21,43% (3/14)
DISCUSSION
Understanding the role of environmental factors on the selection of antibiotic resistance

among P. aeruginosa is an important issue to better control and to define the risk associated to
the dissemination of resistant strains. In the current work, we explored the relationship
between antibiotic resistance of P. aeruginosa strains and selective pressure in their original
niche. The analysis of antibiotic susceptibility profile clearly showed that antibiotic resistant
phenotype (i.e. different to the WT profile) was more frequently encountered among strains
from the hospital, than among strains from the environment (Figure 28). Furthermore hospital
strains were more frequently multi-resistant to more than 6 antibiotics (Figures 28C and 29C)
and resistance to all type of antibiotics was found. These differences between the two groups
of strains were expected since exposition to a wide range of antibiotics and to high antibiotic
- 171 -
concentrations are more likely to occur in the hospital than in the environment. Studies aiming
at comparing the widespread of antibiotic resistance among hospital and environmental P.
aeruginosa strains are usually conducted on a large set of hospital strains and a small set of
environmental strains and gave rise to various conclusions. For instance, Khan et al. explored
the antibiotic resistance capacities of strains from open ocean. These strains were only able to
resist to 6 of the 22 tested antibiotics (Khan, et al., 2007) whereas strain from their clinical set
resist to all tested antibiotic. In the same way, Lambert et al. showed that environmental
strains from industrial sites were less resistant to antibiotics and biocides than clinical strains
(Lambert, et al., 2001). On the opposite, the study of Alonso et al. showed that environmental
strains presented similar antibiotic resistance properties than clinical ones (Alonso, et al.,
1999). However, in the former, only 7 environmental strains were used and most of them
(6/7) were isolated from oil impacted sites, a particular ecosystem where microbial
community frequently showed antibiotic resistance. Otherwise, a recent study recently
highlighted the multi-resistance capacity of strains isolated from hydrocarbon impacted sites,
presenting similar resistance capacity than clinical strains (Kaszab, et al., 2009).
These comparative studies are difficult to handle first due to the design of the strain set.
Collecting strain from hospital origin is easy due to important existing collections worldwide.
Furthermore data describing the context of the isolation i.e. type of infection, patient,
antibiotic treatment, can be easily obtained. Addition of strains from various niches within the
hospital can also be easily performed. However, completing the set with a collection of strains
originating from various niches outside the hospital is more complicated first due to the lower
number of such strains in the international collections as well as from the less widespread and
abundance of this species in some ecosystems i.e. terrestrial ones for instance (Deredjian et
al., submitted).
Although antibiotic resistance was greater among the hospital strains than among the
environmental ones differences within each group were also observed. Surprisingly,
prevalence of resistance was higher in the hospital environmental strains and a higher number
of multi-resistance strains were observed among these strains than among the patient ones
(Figures 28C and 29C). These results were unexpected since different studies showed that
strains isolated from the hospital environment were less resistant to antibiotics than strains
isolated from patients even in the same hospital (Orsi, et al., 1994, Ruiz, et al., 2004).
Nevertheless, Orsi et al. showed that some strains from the hospital environment could resist
to some antibiotic families, especially aminoglycosides, as well as clinical ones, due to their
extensive use in medical practice (not only in anti-pseudomonal therapy) (Orsi, et al., 1994).
- 172 -
Strains isolated from CF individuals presented the highest level of resistance regarding both
the multi-resistance and the capacity to resist to all tested antibiotic families (Figures 28C and
29C). The antibiotic selective pressure undergone by strains isolated from the hospital
environment may be considered as indirect compared to the antibiotic selective pressure
sustained by strains isolated from patients and CF individuals. Moreover, treatments of CF
individuals can be considered stronger and longer than treatments of patients. This difference
could explain the high antibiotic resistance patterns seen among strains isolated from CF
individuals. Earlier studies that compared antibiotic resistance among clinical strains and
strains isolated from CF individuals showed that strains from the later were the most sensitive
to antibiotics (Chow, et al., 1989). This trend dramatically changed these past 20 years and
CF isolates are now considered highly resistant to antibiotic (Lambert, 2002).
In our study most of the P. aeruginosa strains from the environment (water, soil related
samples and snake breedings), presented the WT resistance phenotype as expected if
regarding their low supposed exposition to antibiotics (Figure 28B and 29B). Surprisingly, no
resistance was observed in strains isolated from water samples, even in strains from the
wastewater treatment plant system (Figure 28B). This result was rather unexpected as
different studies revealed the presence of antibiotic resistant strains of P. aeruginosa in
wastewater (Filali, et al., 2000). Schwartz et al. (2006) recently reported the presence of
ciprofloxacin resistant strains of P. aeruginosa in clinical and municipal wastewater as well as
in the effluent of the wastewater treatment plant system. Moreover, presence of detergent
could have played the role of selective pressure by a co-resistance phenomenon. However we
reported on resistance phenotypes among some strains isolated from snakes and among six
strains from soil related samples. We previously reported that resistance to gentamycin and
tobramycin in strains from healthy snakes resulted from the presence of an integron composed
with qacH, aadB, aadA2 and cmlA10 cassettes and a tetA(C)-carrying transposon (Colinon, et
al., 2009). These elements permit resistance to quaternary ammonium, aminoglycosides,
chloramphenicol and tetracycline, respectively. We then hypothesized that their acquisition
resulted from the use of antiseptics for animal care. Strains from soil related samples were
resistant to ticarcillin, ticarcillin + clavulanic acid ( -lactam, penam), imipenem ( -lactam,
carbapenem) and/or pefloxacin (Figure 29B). Two of these strains were from hydrocarbon
impacted sites and were resistant to ticarcillin, ticarcillin + clavulanic acid and imipenem. P.
aeruginosa is frequently found in hydrocarbon sites and its antibiotic resistance profile has
already been investigated. The recent study of Kaszab et al. (2009) showed that 33 % of the
strains isolated from hydrocarbon impacted sites were resistant to at least two antibiotic
- 173 -
families, suggesting that particular conditions exist that favour the selection of antibiotic
resistance mechanisms. Imipenem resistance, rarely described in the environment, has been
found in strains from hydrocarbon impacted sites in both our study and the study of Kaszab et
al. However the precise nature of the environmental pressure i.e., hydrocarbon compounds,
heavy metals… is unknown. Since heavy-metal resistance and antibiotic resistance might be
genetically linked and share a common origin (Baker-Austin et al., 2006), we looked at the
heavy metal resistance phenotype and genotype of P. aeruginosa strains as well as at the
potential relationships between heavy metal resistance and antibiotic one. Environmental
strains were found more resistant to heavy metal than hospital ones (Figure 30A) and the
highest resistance was observed among the strains originating from soil related samples
whereas the lowest was found among strains from the CF individuals or healthy captive
snakes (Figure 30B and C). Environmental strains isolated from water and soil related
samples had similar resistance profiles and represented most of the heavy metal resistant
strains, regarding zinc, cadmium and low concentration of copper (Figure 30B).
Environmental strains were isolated from ecosystems where antibiotic selective pressure may
be low but other pressures as presence of pollutants, as heavy metals and organic compounds
in hydrocarbon impacted sites or various organic compounds such as detergents and heavy
metals in wastewater treatment plant system, could be favourable to the selection or the
maintenance of heavy metal resistance. On the opposite, only 30 % of the strains isolated
from snakes were able to resist to the lowest concentration of only two metals (copper and
cadmium) (Figure 30B). No more than 25 % of strains from CF individuals showed resistance
to the 4 tested metals (Figure 30C). These observations suggested that strains isolated from
niches with low microbial community diversity and limited exchange, as CF lungs or healthy
captive snakes, were less likely to resist to heavy metals due to more restricted and
“specialized” environmental conditions. Despite very different antibiotic selective pressure in
their original niches, few of these strains were able to resist to heavy metals. This resistance
seemed not to be linked to antibiotic selective pressure in these ecosystems and the low level
of resistance may be more likely due to the absence of direct pressure as heavy metals and to
the adaptation to the niche.
Resistance to cadmium, zinc and copper in P. aeruginosa is mediated by active efflux pumps.
These pumps are chromosomically encoded by two operons, the cop operon for copper
resistance (Vargas et al., 1995) and the czc operon for zinc, cadmium and cobalt resistance
(Hassan et al., 1999; Perron et al., 2004). Amplification of copA, copB and czcA genes was
done to evaluate the distribution of the genes and the implication of their prevalence in the
- 174 -
diversity of the resistance phenotypes observed among the strains. Despite different heavy
metal resistance phenotypes, the czcA, copA and copB genes were always present. Hassan et
al. has already observed that different phenotypes of zinc and cadmium resistance can
occurred despite the presence of the czc operon (Hassan, et al., 1999). Absence of resistance,
especially in strains isolated from snakes, can not be explained by the absence of implicated
genes. However, the variable resistance phenotype observed among the strains could be
explained by a regulatory failure or the ineffectiveness of the pump due to discrete mutation.
In particular, we observed that variations in the sequence of these genes occurred in the
sequenced genomes and could be responsible to the phenotype diversity observed.
Differences have also been observed between sequences from the clinical strain PAO1 and the
environmental strain CMG103, characterized by a higher capacity of resistance (Perron et al.,
2004). Thus, all the strains could potentially resist to these metals due to the presence in the
chromosome of resistance genes as the presence in all sequenced strains; however, function
and regulation of the pumps could depend on the presence or absence of selective pressure in
the ecological niche and may be lost when pressure is absent.
Several studies suggested that presence of zinc or copper could increase resistance to
imipenem in P. aeruginosa by a co-regulation phenomenon (Caille et al., 2007; Perron et al.,
2004). However, in our study, imipenem resistance seemed independent to zinc or copper
resistance, since the most highly copper or zinc resistant strains were not resistant to
imipenem. Regarding resistance to mercury and high concentration of copper, clinical strains
were dominant among the resistant strains (Figure 30A). These results suggested that
conditions in the hospital were favourable to the acquisition and/or maintenance of these
resistances. To our knowledge, it is the first time that clinical strains highly resistant to copper
were observed. This observation is of particular interest as copper could potentially be used as
biocide in hospital (Harrison, et al., 2008, Huang, et al., 2008). As mercury had been used in
hospital during many years as disinfectant or in thermometer, it could have selected the
resistance (Hammond, et al., 1987). However, its use is now prohibited. Other compounds
such as antibiotics may act in selecting and/or maintaining mercury resistance, as mercury and
antibiotic resistance genetic determinants may be present on the same mobile element as
plasmid or genomic island and can be acquired simultaneously (Liebert, et al., 1999, Levings,
et al., 2007). Enzymatic mechanism implicated in mercury resistance is encoding by the
merRTPA operon (Nascimento & Chartone-Souza, 2003). The presence of merA
determinants, encoding a mercuric reductase which reduces Hg2+ to volatile Hg0, was
investigated. MerA was often found among the tested strains, especially in clinical ones
- 175 -
(Table 7). We observed that strains possessing merA were not always able to grow in presence
of mercury. Several hypotheses could explain the presence of the gene without the resistance
phenotype. We can hypothesise that mercury is present at very low but sufficient
concentration to maintain mer operon. Then, merA gene (mer operon) could play other
functions, which explain its maintenance, as in Nitrosomonas europea, in which merA is
expressed in presence of other metal as cadmium or zinc (Radniecki, et al., 2009, Radniecki,
et al., 2009). Finally, mercury resistance genes could be present on mobile element with
antibiotic resistance genes and antibiotic pressure selects both resistance traits, especially in
hospital strains; the function of mercury resistance may have been lost by mutation or deletion
phenomenon.
This study showed variability in resistance capacities of P. aeruginosa strains, depending on
the origin of the strains. This diversity could be explained by a deep adaption to the original
niche, independently of a common genetic background. The lack of relationship between
antibiotic resistance and heavy metal resistance (Figure 31) could be explained by the
characteristics of the environments from which the strains originated. The rare studies
highlighting antibiotic and heavy metal resistance in P. aeruginosa are generally conducted
on highly contaminated sites. For instance, Oyetibo et al. (2009) showed the presence of P.
aeruginosa like-isolates which were resistant to 18 antibiotics and to high level of metal
including cadmium and mercury in sediments but the samples were collected from an
industrial area in Nigeria known to be heavily polluted with heavy metals (chromium, lead,
cadmium and nickel) (Oyetibo, et al., 2009). Similarly a study conducted on sewage water in
Morocco evidenced the presence of P. aeruginosa isolates among various species resistant to
heavy metals. The P. aeruginosa isolates were the most resistant to antibiotics (Filali et al.,
2000). However, the fact that none of the environments investigated here, except the soil
contaminated with hydrocarbons, showed high levels of toxicants could explain the lack of
association between heavy metal and antibiotic resistance in strains of our study.
ACKNOWLEDGMENTS
- 176 -
Alpes Region Cluster “Environnement”.
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“High phenotypic and genetic diversity of antibiotic and metal susceptibilities among
hospital and environmental strains of Stenotrophomonas maltophilia”
Amélie Deredjian*, Laurine Blanchard, Elisabeth Brothier, Sylvie Nazaret and Sabine Favre-
Bonté.

Environment », CNRS, Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon, and Université Lyon 1, UMR
5557 Ecologie Microbienne, France.
Short running title: Antibiotic and metal susceptibilities in Stenotrophomonas maltophilia
Key-words: antibiotic resistance, metal, hospital, soil, genes, Stenotrophomonas maltophilia
*
Corresponding author. Mailing address: Université de Lyon, France; Research Group on
« Bacterial Opportunistic Pathogens and Environment », CNRS, Ecole Nationale Vétérinaire
de Lyon, and Université Lyon 1, UMR 5557 Ecologie Microbienne, France.
- 183 -
ABSTRACT
Stenotrophomonas maltophilia has recently emerged as an important opportunistic pathogen

responsible of nosocomial infection and able to colonize lungs of CF individuals. This species
is also a ubiquitous microorganism widespread in the environment, especially in soil. We
previously recovered S. maltophilia in a variety of soils from different geographical origin
and impacted by different anthropogenic activities. The aim of the present study was to
evaluate antibiotic and heavy metal resistance susceptibilities of the strains previously isolated
and to compare them to the ones of hospital strains. We observed that hospital strains
presented high resistance capacities concerning both antibiotics and heavy metals (copper,
cadmium, zinc and mercury). Environmental isolates presented a high diversity of resistance
properties, some of them presenting low levels of resistance, the others presenting resistance
capacities similar to the ones of hospital isolates. This diversity depended on their origin and
suggested a high adaptation to the environmental conditions encountered in the original niche.
A high variability was also observed in the prevalence of antibiotic resistance genes (blaL2,
smeV, qnrB, smlt3652) and heavy metal resistance genes (copA, czcA, czcC and merA) in both
environmental and hospital isolates suggesting that S. maltophilia strains were also
characterized by a high genotypic diversity.
- 184 -
INTRODUCTION
Stenotrophomonas maltophilia previously known as Pseudomonas maltophilia then

Xanthomonas maltophilia is considered as an emerging opportunistic pathogen, representing
the third non fermenting gram negative bacteria implicated in nosocomial infections (Jones, et
al., 2003) and increasingly isolated from cystic fibrosis patients (Razvi, et al., 2009). Its
capacity to colonize and durably survive in hospital and patients is partly due to its high
antibiotic resistance capacities. Intrinsic resistance of S. maltophilia is due to the presence of
broadly specific efflux pumps such as SmeABC and SmeDEF, the L1 and L2 metallo- -
lactamases, the AAC(6’)-Iz and APH(3’)-IIa aminoglycoside modifying enzymes and the Qnr
peptide allowing resistance to quinolones (Sanchez, et al., 2009). Different studies highlighted
the capacities of clinical strains to develop antibiotic resistance mechanisms by mutation or
acquisition of mobile elements (Avison, et al., 2000, Chang, et al., 2004, Toleman, et al.,
2007). Resistance to trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT), the therapy of choice for
treating S. maltophilia infections, is mediated by sul genes acquired by horizontal transfer
(Toleman, et al., 2007). Inappropriate and extensive use of antibiotics in the hospital has
largely participated to the emergence and propagation of multi-resistance in pathogenic
bacteria (Slama, 2008). However, it is now admitted that high concentration of antibiotics
could not completely explain this phenomenon as a reduction of antibiotic use has only a
limited effect on the reduction of antibiotic multi-resistance (Cook, et al., 2004). Other
chemicals used in the hospital as antiseptics or disinfectants can also play the role of selective
pressure leading to acquisition of antibiotic resistance mechanisms. For instance, Sanchez et
al. (2005) showed that triclosan, an antibacterial and antifungal molecule (targeting fatty acid
synthesis) used in cleaning solution or in the coatings of hospital devices, selected S.
maltophilia mutants that overproduced the SmeDEF efflux pump leading to the reduction of
their antibiotic susceptibility.
S. maltophilia is also known for a long time as a ubiquitous microorganism found in a variety
of natural environments like soil (Juhnke & des Jardin, 1989), water (Romano, et al., 1997) or
sediments (Dungan, et al., 2003). Soil (Deredjian et al., submitted) and rhizosphere (Berg et
al., 1996) are considered as reservoirs of S. maltophilia which is largely studied for its plant
promoting growth capacities and its potential use as a biological control of plant pathogens
(Ryan, et al., 2009). This bacterium is also frequently found in extreme ecosystems as deep
sea or high altitudes (Romanenko, et al., 2008, Flores, et al., 2009) or polluted sites (Matyar,
et al., 2008), revealing high capacities of adaptation as well as particular properties potentially
- 185 -
used in biotechnologies especially for bioremediation of polluted sites (Juhasz, et al., 2000,
Dungan, et al., 2003). However, antibiotic resistance capacity of environmental isolates of S.
maltophilia is poorly investigated as well as factors implicated in the selection of this
resistance. For instance, only one study aimed at comparing antibiotic resistance capacity of
environmental and clinical strains of S. maltophilia. This study suggested that antibiotic
resistance capacity was not dependant of the origin of the strains (Berg, et al., 1999).
Moreover, the sequencing of the genomes of the poplar associated strain R551-3 (Taghavi, et
al., 2009) and of the clinical strain K279a (Crossman, et al., 2008) of S. maltophilia revealed
the presence of a large number of multidrug resistance determinants, despite their different
origins, suggesting that antimicrobial resistance could also be acquired out of the hospital
(Ryan, et al., 2009). Comparison analysis of the two genomes has shown a high synteny and a
core genome composed of 85 % of common genes between the two strains, enabling
adaptation to a wide range of habitats (Rocco, et al., 2009).
Environment, especially soil, is considered as a reservoir of antibiotic resistance determinants
(D'Costa, et al., 2006) and environmental conditions susceptible to play the role of selective
pressure for the acquisition of these determinants are now investigated (Alonso, et al., 2001).
Presence of antibiotics due to antibiotic producing microorganisms or anthropogenic activities
(farming, Human and animal consumption) can act as pressure leading to the selection of
antibiotic resistance in the indigenous bacterial populations (Martinez, 2009). Other
conditions that modify the equilibrium of the community could participate to the selection of
resistance mechanisms. Among these conditions, presence of heavy metals or organic
compounds has already been reported to lead to the selection of antibiotic resistance linked to
heavy metal resistance in the bacterial community (Filali, et al., 2000, Berg, et al., 2005,
Stepanauskas, et al., 2005, Wright, et al., 2006, Matyar, et al., 2008).
We previously isolated strains of S. maltophilia from soil sampled in different sites submitted
to different agricultural practices leading to different levels and nature of contaminations that
could influence resistance capacities of the indigenous communities (Deredjian et al.,
submitted). Here we aimed at evaluating the antibiotic resistance capacity of these strains and
highlighting anthropogenic activities that could favour antibiotic resistance selection and
maintenance in environmental strains of S. maltophilia. Antibiotic resistance capacities were
determined in a collection of 52 environmental strains isolated from soils sampled in
agricultural sites submitted to different anthropogenic pressures and compared to the ones of
27 clinical strains from CF individuals and infected patients. As antibiotic resistance could be
linked to heavy metal resistance, heavy metal resistance capacities were also determined. The
- 186 -
presence of resistance genes were investigated by Polymerase Chain Reaction (PCR).targeting
heavy metal resistance genes (copA, czcA, czcC and merA) and antibiotic resistance genes
(blaL2, smeV, qnrB, smlt3652).
Strains
A collection of 79 strains of S. maltophilia was used in this study (Table 8). These strains
were chosen taking into account their origin and the putative anthropogenic selective pressure
present in their original niche. Environmental strains (52 strains) were isolated from soil
samples from 4 agricultural sites chosen depending on the nature and level of the supposed
selective pressure (Table 9). Detailed information of these sites can be found in Deredjian et
al. (submitted). Clinical strains (27 strains) provided by “l’Observatoire National de
Toulouse”, were used for comparison. These strains were isolated from CF individuals (12
strains) and from infected patients (15 strains). The two sequenced strains K279a and R551-3
were included in this study as reference. The identity of the isolates was confirmed using first,
the smeD/ggpS PCR duplex PCR (Ribbeck-Busch, et al., 2005). Then, the complete 16S
rRNA gene was amplified and sequenced. Clones were differentiated using a REP-PCR
method (Lin, et al., 2008), in order to keep only different isolates in our study.
Antibiotic resistance test

The in vitro antimicrobial susceptibilities of S. maltophilia were routinely determined using
the VITEK 2 system with a card (NO93) permitting to establish antibiotic resistance profile of
non fermenting Gram negative bacteria (Biomérieux, Marcy l'Etoile, France) following
recommendations of the manufacturer. Briefly, a suspension was prepared from a 24h pure
culture realised on TSA (Tryptic Soy Agar) in a saline solution (NaCl2 0.4 %) in order to
reach an optical density between 0.50 and 0.63 McFarland. Then, 145 μL of this suspension
was added to a new 3 ml saline solution (NaCl2 0.4 %). This suspension was adsorbed by
capillarity on the card. Minimal inhibitory concentrations were then determined by measuring
growth at different points during the incubation and comparing it in control and antibiotic
supplemented wells.
- 187 -
Table 8. Strains of S. maltophilia isolated from the hospital and the environment.
Origin Strains Name Putative anthropogenic pressure

Environment
Feucherolles V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9,
organic amendments -
(Versailles, France) V10, V11, V12, V13
N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, N9,

Nabeul (Tunisia) wastewater irrigation +
N10, N11, N12, N13, N14, N15, N16, N17
Ouagadougou urban rough waste amendments

O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8
(Burkina Faso) ++
P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, wastewater (from Paris) irrigation
Pierrelaye (France)
P11, P12, P13, P14 during a century +++++
Hospital
CF1, CF2, CF3, CF4, CF5, CF6, CF7, antibiotic treatments, antiseptics
CF individuals
CF8, CF9, CF10, CF11, CF12 used for desinfection +++++
I1, I2, I3, I4, I5, I6, I7, I8, I9, I10, I11, I12, antibiotic treatments, antiseptics
Infected patients
I13, I14, I15 used for desinfection +++++
Sequenced strains
K279a, R551-3
- 188 -
Table 9. Soil characteristics.
organic
Depth Clay Silt Sand pH carbon Cd Zn Cu Pb
cm g kg-1 g kg-1 g kg-1 water % mg kg-1 mg kg-1 mg kg-1 mg kg-1
France
Feucherolles 0-10 190 750 60 6.9 1.1 0.23 49 12 25
Pierrelaye
Control 0-10 11.8 12.3 75.9 8.33 1.98 0.34 57 16 37
Control 0-10 7.5 10.9 81.6 8.23 1.39 0.25 65 17 34
Control 0-10 9.8 14.8 75.4 8.09 2.29 0.94 178 47 95
4 0-10 10.7 16.9 72.5 7.23 2.78 1.7 464 123 188
5 0-10 6.2 14.2 79.6 7.43 3.51 3.9 979 281 447
6 0-10 9.1 17.9 73 7.41 5.22 7.2 1326 357 521
7 0-10 5.8 11.1 83.2 7.39 2.93 2.4 1336 352 506
8 0-10 6.3 12.3 81.2 7.4 3.01 3.0 491 138 202
9 0-10 7 11.4 81.6 7.65 1.97 1.8 715 189 283
10 0-10 6.1 10.6 83.3 7.42 2.12 1.7 465 123 224
11 0-10 6.9 12.3 80.8 7.33 2.59 34 814 188 295
12 0-10 9.6 17 73.4 7.47 2.76 5.9 697 180 274
13 0-10 8.9 12 79.2 7.73 1.71 2.2 327 94 129
14 0-10 7.2 10.1 82.7 7.49 1.45 1.3 240 76 130
15 0-10 5.6 6.3 88.1 7.19 1.73 2.1 401 108 158
19 0-10 12.2 13.1 74.7 7.86 3.18 1.2 220 57 141
21 0-10 11.1 10.8 78.1 7.73 2.54 1.3 271 112 117
Tunisia
Nabeul WW 0-20 93 96 811 8.42 2.4 0.54 68 30 41
Nabeul GW 0-20 110 82 808 8.23 1.1 0.7 64 29 25
Burkina Faso
Tabtenga
control 0-10 nd nd nd 5.63 0.3 bdl 17 4 nd
Tabtenga
amended 6.09 bdl 241 5 nd
Zagtouli
Zagtouli
Toudoubweogo
Toudoubweogo
Yagma control 0-10 110 200 690 5.59 0.3 bdl 15 8 nd
Yagma
nd : not done
bld : below detection limit
- 189 -
Minimal inhibitory concentrations of 16 antibiotics [ticarcillin (TIC 16, 32, 64 μg/ml),
ticarcillin-clavulanic acid (TIM 8/2, 32/2, 64/2 μg/ml), piperacillin (PIP 4, 16, 64 μg/ml),
piperacillin-tazobactam (TZP 4/4, 16/4, 128/4 μg/ml), ceftazidim (CAZ 1, 2, 8, 32 μg/ml),
cefepim (FEP 2, 8, 16, 32 μg/ml), imipenem (IPM 2, 4, 16 μg/ml), meropenem (MEM 0.5, 4,
16 μg/ml), amikacin (AMK 8, 16, 64 μg/ml), gentamicin (GEN 4, 16,32 μg/ml), isepamicin
(ISP 4, 8, 32 μg/ml), tobramycin (TOB 8, 16, 64 μg/ml), ciprofloxacin (CIP 0.5, 2, 4 μg/ml),
pefloxacin (PEF 0.5, 2, 8 μg/ml), colistin (CS 4, 16, 32 μg/ml), trimethoprim-sulfamethoxazol
(SXT 0.5/9.5, 2/38, 16/304 μg/ml)] were determined. Interpretations were established
following the recommendations of the antibiogram committee of the French society of
Microbiology.
Heavy metal resistance profiles

Heavy metal resistance of S. maltophilia strains were established using TSA medium diluted
10 fold (TSA 1/10) supplemented with 5, 10, 20, 50 mM of Zn2+ (ZnCl2), 0.5, 1, 2, 5 mM of
Cu2+ (CuCl2), 0.6, 1.25, and 2.5 mM of Cd2+ (CdCl2), 10 and 50 μM of Hg2+ (HgCl2).
Preliminary tests were done in order to define the suitable concentrations. Pseudomonas
aeruginosa PAO1 strain and the 979 clinical strain were used as control for each
manipulation. A suspension was realised from a 24h pure culture on TSA 1/10 in a saline
suspension (NaCl2 0.8 %). One hundred μL of the suspension was inoculated on the
supplemented and non supplemented TSA1/10 plates. Cultures were incubated at 28°C during
seven days. A strain was considered as resistant when growth on medium supplemented with
metal was equivalent of growth on medium without metal. When growth was lower, the
resistance was intermediate. When no growth was obtained, the strain was considered as
sensitive. Experiments were repeated twice.
Data analysis
A principal component analysis was done using all the phenotypic results obtained with the
ADE-4 software (Thioulouse & Lobry, 1995). The phenotypic data from antibiotic and heavy
metal resistance testing were encoded either as 0 (sensitivity), 1 (intermediate) or 2
(resistance).
Resistance genes amplification

The primers used in this study are summarized in Table 10. Primers were designed by
searching conserved sequences after alignments of the sequences of the genes from the 2
- 190 -
sequenced genomes, using the Oligo6 software, except for the design of merA. Primers
specific of merA gene, encoding the mercuric reductase, were previously defined after
sequence alignment of merA genes of Gram negative bacteria available in GenBank (Ranjard
et al., pH thesis). Primers specific to the czcC gene were only designed from the K279a czcC
gene due to the absence of this gene in R551-3. Presence of the qnrB, blaL2, smlt3652, smeV,
copB, czcA, czcC, merA was investigated by PCR in all the collection strains. The following
PCR cycle was used to amplify qnrB, blaL2, smlt3652, smeV, copB, czcA, czcC genes: an
initial denaturation step is done at 94°C during 5 min. This first step is followed by 35 cycles
of 30 sec denaturation at 94°C, 30 sec of primer annealing at variable temperature (see Table
10), 30 sec of primer extension at 72°C. Finally, a final extension was done during 7 min at
72°C. Each amplification product was sequenced in order to verify their affiliation to the
expected gene.
Table 10. Primers used in the study.

Annealing
Product temperature
ORF Function Forward primer 5'-3' Reverse primer 5'-3' size bp °C
qnrB quinolone resistance GCCTGGAGATCAGCGAGTG CAGGTCGCAGTCGGTGAAG 281 52
peptide
blaL2 -lactamase GTGCCGTGCCACGATCA CCATTGCTGCCGGTCTTGT 351 54
smlt3652 putative -lactamase AGCCTGCGTCGTCCGATCC GCACGCGCTCGCCATAGGT 134 58
smeV putative multidrug CGGTGCAGAGCGTTGA GTACTCGGCCTGGTAGCTG 265 54
efflux protein
copB putative Cu resistance CCACCGAACCGCGCGAACC CCGACCAGCACGTCCCACCA 388 62
protein
czcA putative Cd, Zn, Co CAGGTCACCGCGATCTTCAC GATGCACGCCGTATTCCTTG 310 60
efflux protein
czcC putative Cd, Zn, Co GCGGCGGCTTCGACTTCC GCACCCATCCCAGCGTCCAG 1072 65
efflux protein
merA mercuric reductase GTGCCGTCCAAGATCATGAT TAGCCYACRGTSGCSACYTG 933 57
RESULTS
Antibiotic resistance profile

The antimicrobial susceptibility of the 79 S. maltophilia strains was tested. A high diversity of
antibiotic resistance profiles was observed considering both the number of antibiotics, i.e.
multi-resistance (Figure 32) and the type of antibiotics (Figure 33) independently of the origin
of the strains (i.e. hospital versus environmental). Resistance to 1 to 15 antibiotics was
obtained in both hospital and environmental strains (Figure 32A). Only 7 % of hospital strains
did not resist to more than 3 antibiotics. Thirty % were resistant to 4 to 6 antibiotics, 15 % to
7 to 9 antibiotics, 26 % to 10 to 12 antibiotics and 22 % to more than 13 antibiotics (Figure
32A). Strains isolated from infected patients were dominant among hospital strains resistant to
4 to 6 antibiotics and to 10 to 12 antibiotics (Figure 32B).
- 191 -
60
Hopital (n=27)
26
50 Environment (n=52)
Strains (%) 40
30
8
7
6
20
8 4 8 9
10 2
1
0
≤3 [4-6] [7-9] [10-12] [13-15]
100
13 13 Patients
Patien ts (n(n==1515)
)
90 7
CF
CF individuals
indiv iduals ( n(n= = 12)
1 2)
80 Feu c her olles
Versailles (n (n = 1 3)
= 13)
Na beu l ((n
Nabeul n == 117)
7)
70
Strains (%)
Oua gado ugo u (n = 8)

60 Ouagadougou (n = 8)
Pier relay e (n = 14)
Pierrelaye (n = 14)
50 8
6 7 5
40 5
30
20 2 2 2
2 2 1
10 1 1 1 1
0
≤3 [4-6] [7-9] [10-12] [13-15]
Figure 32. Antibiotic multi-resistance in 52 environmental and 27 hospital strains of S.

maltophilia (A), within environmental and hospital strain sub-groups (B). Effectives are
indicated above bars; n = number of strains in each category; [ ] = number of antibiotics.
Strains isolated from CF individuals were dominant among hospital strains resistant to 13 to
15 antibiotics. Half of the environmental strains did not present resistance to more than 3
antibiotics (Figure 32A). All these strains were isolated from the French sites of Feucherolles
and Pierrelaye (100 % and 93 %, respectively) (Figure 32B). The last 7 % of strains (1 strain)
isolated from the site of Pierrelaye did not resist to more than 6 antibiotics. Fifteen % of
environmental strains were able to resist to 4 to 6 antibiotics, these strains were represented
by strains from Pierrelaye (7 %) and strains from Nabeul (Tunisia) (41 %) (Figure 32A and
B). All the strains that resisted to 7 to 9 antibiotics (15 % of environmental strains) were
isolated from the site of Nabeul (47 %). Environmental strains able to resist to 10 to 12
antibiotics (17 %) were isolated from Nabeul (12 %) and Ouagadougou (Burkina Faso) (88
%). All the environmental strains able to resist to more than 13 antibiotics (2 %) were isolated
from Ouagadougou (12 %). Resistance to all tested antibiotics was observed in hospital and
environmental strains, except for the association trimethoprim + sulfamethoxazole that was
active against all environmental strains (Figure 33A).
- 192 -
100
Hopital (n=27)
90
Environment (n=52)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TIC TIM PIP TZP CAZ FEP IPM MEM AMK GEN ISP TOB CIP PEF CS SXT
100
90
80 Patients (n = 15)
70 CF individuals (n = 12)
60 Feucherolles (n = 13)
Nabeul (n = 17)
50
Ouagadougou (n = 8)
40
Pierrelaye (n = 14)
30
20
10
0
TIC TIM PIP TZP CAZ FEP IPM MEM AMK GEN ISP TOB CIP PEF CS SXT
Figure 33. Antibiotic resistance profiles in 52 environmental and 27 hospital strains of S.

maltophilia (A), within environmental and hospital strain sub-groups (B).
n = number of strains in each category; TIC = Ticarcillin, TIM = ticarcillin-clavulanic acid,
PIP = piperacillin, TZP = piperacillin-tazobactam, CAZ = ceftazidim, FEP = cefepim, IPM =
imipenem, MEM = mereopenem, AMK = amikacin, GEN = gentamicin, ISP = isepamicin,
TOB = tobramicin, CIP = ciprofloxacin, PEF = pefloxacin, CS = colistin, SXT =
trimethoprim / sulfamethoxazole.
Resistance to all tested antibiotics were observed among strains isolated from CF individuals
and infected patients, except trimethoprim + sulfamethoxazole for which resistance was only
observed in strains isolated from CF individuals (Figure 33B). Strains isolated from
Feucherolles and Pierrelaye presented resistance to the -lactams ticarcillin (23 % and 7 % of
strains isolated from Feucherolles and Pierrelaye respectively), imipenem (62 % and 100 % of
strains isolated from Feucherolles and Pierrelaye respectively) and meropenem (8 % and 7 %
of strains isolated from Feucherolles and Pierrelaye respectively) (Figure 33B). Resistance to
the quinolones ciprofloxacin and pefloxacin was also observed in strains from Feucherolles
(15 % and 8 % respectively) and resistance to the -lactams piperacillin and cefepim was also
observed in strains from Pierrelaye (14 % and 7 %, respectively). Concerning strains isolated
from Nabeul and Ouagadougou, resistance was observed for all tested antibiotics except
- 193 -
trimethoprim + sulfamethoxazole and the quinolones (ciprofloxacin and pefloxacin) (Figure
33B). Prevalence of resistance was higher in strains from Ouagadougou than in strains from
Nabeul. Concerning strains from the site of Nabeul, more than 70 % were resistant to
ticarcillin, piperacillin, imipenem, meropenem, amikacin, between 50 % and 70 % of the
strains were resistant to cefepim, gentamicin, isepamicin, tobramycin, less than 50 % were
resistant to ticarcillin + clavulanic acid, piperacillin + tazobactam, ceftazidim, colistin. All the
strains from the site of Ouagadougou were resistant to ticarcillin, ceftazidim, cefepim,
imipenem, meropenem, amikacin, gentamicin, isepamicin, tobramycin and colistin, 75 %
were resistant to piperacillin, 37 % were resistant to piperacillin + tazobactam and 25 % were
resistant to ticarcillin + clavulanic acid.
Heavy metal resistance

Both environmental and hospital strains were able to resist to the 4 tested heavy metals, Zn,
Cu, Cd and Hg (Figure 34A). We found environmental strains able to grow at the maximal
concentration of 5 mM of Zn, 1 mM of Cu, 0.6 mM of Cd and 10 μM of Hg. Hospital strains
were able to grow at the same concentrations of Cu, Cd and Hg but some of them were also
able to grow in presence of 10 mM of Zn. None of the strains irrespective of their origin were
able to grow in the presence of the highest concentrations tested i.e. 20 and 50 mM of Zn, 2
and 5 mM of Cu, 1.25 and 2.5 mM of Cd and 50 μM of Hg. We observed that frequency of
resistance was higher in the hospital strain group than in the global environmental strain
group with 96 % and 33 % of strains resistant to 5 mM of Zn, respectively, 93 % and 52 %,
19 % and 2 % of strains resistant to 0.5 mM and 1 mM of Cu respectively and 44 % and 13 %
of strains resistant to 0.6 mM of Cd, respectively. The exception was for Hg, for which
resistance was equivalent in environmental strains and in hospital strains (6 % and 4 %,
respectively).
Differences within hospital and environmental groups were observed (Figure 34B).
Concerning hospital strains, we observed that strains isolated from CF individuals and
infected patients presented similar resistance capacity to Zn with 92 % and 100% of strains
resistant to 5 mM of Zn, 25 % and 33 % to 10 mM of Zn, respectively and low concentration
of Cu with 92 % and 93 % of strains resistant to 0.5 mM of Cu, respectively. Strains isolated
from CF individuals were more frequently resistant to 1 mM of Cu and to Cd than strains
isolated from infected patients (33 % and 7 %, 58 % and 33 %, respectively). Finally, only
one hospital strain was able to grow in presence of 10 μM of Hg. This strain was isolated
from CF individual lungs.
- 194 -
100
26 25 Hospital (n = 27)
90
Environment (n = 54)
80
70
60
28
50
12
40
18
8
30
20 5
7
10 3
1 1
0
5 mM 10 mM 0,5 mM 1 mM 0,6 mM 10 μM
Zn Cu Cd Hg
100
15 14 11 16 8
90
CF individuals (n = 12)
80
70 Nabeul (n = 17)
7
50 Pierrelaye (n = 14)
3 7
40 5 4 5
30 3 3 3
3
20
1 1 1
10 1
0
5 mM 10 mM 0,5 mM 1 mM 0,6 mM 10 μM
Zn Cu Cd Hg
Figure 34. Heavy metal resistance in 52 environmental and 27 hospital strains of S.

maltophilia (A), within environmental and hospital strain sub-groups (B).
Effectives are indicated above bars; n = number of strains in each category.
- 195 -
Concerning environmental strains, heavy metal resistance profiles were very different
depending of the origin of the strains. Strains isolated from Pierrelaye (France) were the least
resistant since no resistance was observed for Zn, Cd and Hg and only 21 % and 7 % of the
strains were able to resist to 0.5 mM and 1 mM of Cu, respectively. Twenty three % and 8 %
of strains isolated from Feucherolles (France) and 37 % and 100 % of the strains from
Ouagadougou (Burkina Faso) were able to resist to Zn and Cd, respectively. Finally, strains
isolated from the site of Nabeul (Tunisia) were able to resist to the 4 tested heavy metals,
presenting 71 %, 94 %, 41 % and 18 % of strains able to resist to Zn, Cu, Cd and Hg,
respectively, and showing in some case similar level of resistance to hospital strains.
Strains similarity based on antibiotic and heavy metal resistance

The principal component analysis enabled to differentiate 3 groups. The first group was
composed of strains isolated from the French sites of Feucherolles and Pierrelaye, the second
group was composed of hospital strains and strains from Nabeul (Tunisia) and the third group
was composed of hospital strains and strains from Nabeul and Ouagadougou (Burkina Faso)
(Figure 35A). These 3 groups were mainly discriminated from each other on the first axis
which explained 48 % of the variability. The strains were grouped depending on their
resistance capacities toward heavy metals and/or antibiotics (Figure 35B). The first group
(strains from Feucherolles and Pierrelaye) were characterized by low antibiotic and heavy
metal resistance capacity. The second group (hospital strains and strains from Nabeul) was
characterized by high antibiotic and heavy metal resistance. The third group (hospital strains
and strains from Nabeul and Ouagadougou) was characterized by high antibiotic multi-
resistance capacity, especially resistance to aminoglycosides and polypeptides.
Prevalence of resistance genes

Presence of antibiotic and heavy metal resistance genes was investigated by PCR with
specific primers in both hospital and environmental strains. Concerning antibiotic resistance
genes, a positive amplification with primers specific to the smeV gene, participating to the
formation of a putative multidrug efflux pump, was obtained for all hospital strains (from CF
individuals and infected patients), for most of the strains isolated from Nabeul (Tunisia),
Ouagadougou (Burkina Faso) and Pierrelaye (France) (88 %, 87 % and 86 %, respectively)
and none of the strains isolated from Feucherolles (France) (Figure 36A).
- 196 -
A
Figure 35. Principal component analysis done with antibiotic and heavy metal resistance
phenotype. Repartition of the strains (A), repartition of the variables (heavy metals and
antibiotics). = strains from CF individuals, = strains from Infected patients, = strains
from Ouagadougou, = strains from Tunisia, = strains from Pierrelaye, = strains from
Feucherolles.
- 197 -
100
90
80
Patients (n = 15)
70
CF individuals (n = 12)
60
Feucherolles (n = 13)
50
Nabeul (n = 17)
40
Ouagadougou (n = 8)
30
Pierrelaye (n = 14)
20
10
0
smeV qnrB blaL2 sml3652
100
90
70 CF individuals (n = 12)
50 Nabeul (n = 17)
30 Pierrelaye (n = 14)
20
10
0
copB czcA czcC merA
Figure 36. Prevalence of antibiotic (A) and heavy metal (B) resistance genes in S. maltophilia
strains.
- 198 -
A positive amplification with primers specific to the qnrB gene, potentially allowing
resistance to quinolones, was obtained for all the strains isolated from Ouagadougou, most of
the strains isolated from Nabeul (76 %) and hospital strains (strains from CF individuals: 83
%, from patients: 80 %). Only 21 % of strains isolated from Pierrelaye had this gene. qnrB
was absent in all the strains from Feucherolles. A positive amplification with primers specific
to blaL2, encoding a -lactamase, was observed for all strains from Ouagadougou and most of
the strains from Pierrelaye (79 %) and the hospital strains (CF individuals: 92 %, patients: 93
%). Few strains from Nabeul and Feucherolles were positive for the presence of this gene (23
% and 8 %, respectively). A positive amplification with primers specific to the gene smlt3652,
encoding a putative -lactamase, was observed for most of the strains, i.e. all the hospital
strains and strains from Pierrelaye, 87 % of strains from Ouagadougou, 82 % of strains from
Nabeul and 77 % of strains from Feucherolles.
Concerning heavy metal resistance genes, a positive amplification with primers specific to the
copB gene implicated in efflux pumps formation, potentially allowing copper resistance was
obtained for most of the strains, i.e. all the strains isolated from infected patients and
Ouagadougou, 93 % of strains from Pierrelaye, 92 % of strains from CF individuals, 88 % of
strains from Nabeul and 77 % of strains isolated from Feucherolles (Figure 36B). A positive
amplification with primers specific to the czcA gene implicated in efflux pump formation,
potentially allowing cadmium, zinc and cobalt resistance, was obtained for all the strains
isolated from CF individuals and Ouagadougou, for 93 % of strains from infected patients, 85
% of strains from Feucherolles, 82 % of strains from Nabeul and 50 % of strains from
Pierrelaye. Few strains were positive for the amplification of the czcC gene, also implicated in
efflux pump formation (6 % of strains from Nabeul and 7 % of clinical strains). Concerning
merA gene, encoding a mercuric reductase which allows mercury resistance, its detection was
more frequent in hospital strains (53 % and 33 % of strains isolated from infected patients and
CF individuals, respectively) than in environmental strains (18 % of strains from Nabeul and
8 % of strains from Feucherolles). Surprisingly, several hospital strains possessing merA gene
were not able to grow in presence of 10 μM of Hg2+.
DISCUSSION
S. maltophilia is known for a long time as an environmental species and has recently emerged
as an opportunistic pathogen. Its success of adaptation in the hospital is mainly due to a high
- 199 -
multi-drug resistance capacity. Resistance capacity of environmental isolates is supposed to
be as high as the one of clinical strains is. However few studies investigated multi-drug
resistance capacity of environmental S. maltophilia isolates and explored the environmental
conditions that could favor the selection and maintenance of this resistance. In the present
work we observed a high diversity in antibiotic resistance profiles of both environmental and
hospital strains (Figure 32A). Both environmental and hospital strains were able to resist from
1 to 15 antibiotics and strains resistant to all tested antibiotics (except trimethoprim +
sulfamethoxazole) were found within each category (Figure 33A). However, strains from the
hospital were more frequently antibiotic multi-resistant than environmental strains were since
half of the environmental strains were not able to resist to more than 3 antibiotics and only 7
% of the hospital strains had this characteristic. Only one previous study aimed at evaluating
differences in antibiotic resistance in both hospital and environmental isolates of S.
maltophilia (Berg, et al., 1999). The authors identified a high diversity of antibiotic resistance
profiles, 34 profiles derived from the analysis of 40 strains, and failed to relate antibiotic
profile to strain origin. Unlike in our study, clinical strains did not present higher antibiotic
multi-resistance capacities than environmental ones. These contradictory results could be
influenced by the composition of the strain collection. Studies aiming at comparing strains
from the hospital and the environment are difficult to handle due to the difficulty to constitute
a collection of representative strains from various environments inside and outside the
hospital. Moreover, using strains from only one origin or specific niche could lead to biased
results. As S. maltophilia is increasingly found in CF individuals, it seemed essential to
include strains from CF individuals in our collection. As previously demonstrated (Canton, et
al., 2003), we observed that strains isolated from CF individuals were more frequently
antibiotic resistant than strains from infected patients. Almost half of the strains isolated from
infected patients did not resist to more than 6 antibiotics, since only one fourth of the strains
isolated from CF patients presented this property (Figure 32B). It has also been reported for
Pseudomonas aeruginosa, another opportunistic pathogen of major concern in CF individuals
(Lambert, 2002) (Deredjian et al., submitted) that strains isolated from CF individuals
presented higher multi-resistance capacity. Selective pressure in CF lungs could be heavier in
the CF patients since antibiotic therapy is often longer and heavier than in non-CF patients
explaining that strains isolated from CF individuals were more frequently multi-resistant. This
could also partly explain that hospital strains from our study were more frequently antibiotic
multi-resistant, since hospital strains used in the study of Berg et al. (1999), were all isolated
from non-CF patients. The composition of the environmental isolate collection can then
- 200 -
influence the final conclusions of the studies. In the study of Berg et al. (1999), most of the
environmental strains (14/20) were isolated from the rhizosphere. This ecological niche is
generally considered as an antibiotic rich environment due to microbial competition which
could explain that these strains were as resistant to antibiotics as clinical ones are (Berg, et al.,
2005). However, soil microbial community could be very variable depending on the plants or
the physicochemical characteristics of the soils and no additional information concerning the
origin of these strains were available (i.e. from the same rhizosphere, from the rhizosphere of
different plants…). The originality of our study was to include in our collection
environmental strains isolated from well characterized soils (Table 9) presenting very
different characteristics due to their different geographical origin (France, Tunisia and
Burkina Faso) and to anthropogenic practices (irrigation or organic amendments) influencing
physicochemical and microbiological characteristics of the soils. Among environmental
strains, antibiotic resistance capacities were very heterogeneous. Strains isolated from the
French sites of Feucherolles and Pierrelaye represented all the environmental strains that were
not able to resist to more than 3 antibiotics. Strains isolated from the Tunisian site of Nabeul
presented intermediate antibiotic resistance capacities (from 4 to 12 antibiotics). Finally,
strains from Ouagadougou (Burkina Faso) presented high antibiotic resistance capacities and
were able to resist to more than 10 antibiotics. Differences observed between strains from the
different sites could be explained by the adaptation to the different biotic and abiotic
properties of the soils as pH, moisture concentration, presence of nutrients and type of crop.
These differences could also be related to the different agricultural practices that lead to the
intake of various contaminants which could act as pressure for antibiotic resistance selection.
Antibiotics, antiseptics, heavy metals or organic compounds are suggested to be implicated in
antibiotic resistance acquisition or maintenance in the environment by direct selection
(antibiotics) or co-selection of resistance mechanisms (Filali, et al., 2000, Berg, et al., 2005,
Achudume & Olawale, 2009). Absence of antibiotic resistance in strains isolated from the site
of Feucherolles suggested that no selective pressure were present to the acquisition or
maintenance of antibiotic resistance. This result could be expected since this site is an
experimental site highly controlled with no known contamination. Irrigation with wastewater
in the site of Nabeul or amendments with urban rough waste in the site of Ouagadougou could
be responsible of the intake of molecules that create a stress in the indigenous microbial
community and lead to strategy such as resistance mechanisms acquisition to survive. On the
opposite, absence of resistance in the site of Pierrelaye was rather unexpected because this site
had been irrigated with wastewater during near a century and is highly contaminated with
- 201 -
heavy metals (Bourennane, et al., 2006). Our results contrast with a recent study conducted in
a highly heavy metal contaminated site near an industrial area in Yskenderun Bay (Turkey).
The authors showed the presence of antibiotic multi-resistant S. maltophilia (Matyar, et al.,
2008) which were also characterized by a high heavy metal resistance capacity, suggesting
that heavy metal and antibiotic resistance could be co-selected in this species. Two
hypotheses could explain our results. Either indigenous S. maltophilia population did not
acquire antibiotic resistance by co-selection and only acquired resistance to heavy metals
under heavy metal pressure or heavy metals in this particular soil are not available for the
microbial community.
In order to test the effect of different anthropogenic pressures on heavy metal and antibiotic
resistance co-selection in S. maltophilia, heavy metal resistance capacity has also been
investigated in the strain collection. As we observed for antibiotic resistance, hospital strains
were more resistant to heavy metals than environmental strains if we consider the whole
groups (Figure 34A). However, if we consider environmental sub-groups, we observed that
some environmental sub-groups were as resistant to heavy metals as hospital strains were
(Figure 34B). A principal component analysis realized with antibiotic and heavy metal
resistance phenotypes revealed that strains grouped depending on their origin and that heavy
metal resistance was always associated to antibiotic resistance (Figure 35). A first group was
defined by strains presenting little resistance to both antibiotics and heavy metals. These
strains were all isolated from the French sites of Feucherolles and Pierrelaye. Less than one
fourth of the strains from the experimental site of Feucherolles were resistant to Zn and Cd
(figure 34B), confirming the absence of selective pressure in this site. Less than one fourth of
the strains from Pierrelaye was resistant to only one metal (Cu) (Figure 34B), favoring the
hypothesis of the non-availability of the heavy metals present in high concentration in this site
for the microbial community. This non-availability could be explained by the interaction of
the heavy metals with organic molecules which are also in high concentration in this site
(Calace & Petronio, 2004, Kumpiene, et al., 2008). A second group was composed of strains
highly resistant to antibiotics, especially aminoglycosides and polypeptides, but not to heavy
metals. These strains were isolated from the hospital (CF individuals and infected patients)
and from the sites of Nabeul and Ouagadougou. Finally a third group was composed of strains
resistant to both antibiotics and heavy metals, isolated from the hospital and the site of
Nabeul. In the hospital, presence of Cu or Hg in disinfectants could act as selective pressure
leading to heavy metal resistance acquisition. Presence of Zn in eluates of siliconized latex
catheter has been found to increase zinc, cadmium and cobalt resistance in the opportunistic
- 202 -
pathogen Pseudomonas aeruginosa (Conejo, et al., 2003). Increase of resistance to the
imipenem antibiotic was also observed and resulted from a co-regulation phenomenon
(Perron, et al., 2004). Effect of zinc on imipenem resistance has also been observed in S.
maltophilia (Cooke, et al., 1996). However, this result could be essentially explained by the
activation of metallo- -lactamases. Heavy metal resistance could also be selected indirectly
under antibiotic selective pressure. For instance mercury resistance determinants are
frequently found on mobile genetic elements and could be associated to antibiotic resistance
determinants (Liebert, et al., 1999). Acquisition of mobile element bearing both mercury and
antibiotic resistance determinants could be acquired in response to antibiotic pressure. This
hypothesis could explain the fact that mercury resistance genes are frequently found in
hospital strains of our study despite their incapacity of growing in presence of 10 μM of Hg.
Mercury resistance determinants could be maintained despite their ineffectiveness due to their
association with effective antibiotic determinants. Concerning environmental strains, their
grouping depending on their original niche supported the hypothesis of a high adaptation of
the strains to their environment. S. maltophilia is considered as an indigenous population of
soils (Deredjian et al., submitted). Durable installation in soils presenting very different
characteristics could lead to adaptation of the population to the encountered conditions. These
different characteristics was first due to the different geographical origins of the soils since
strains from French sites were characterized by low resistance capacity and the strains from
the African sites presented high resistance capacity especially for antibiotics. Secondly,
anthropogenic activities could also participate to the different phenotypes observed due to the
intake of contaminants that could favor both antibiotic and heavy metal resistance acquisition,
independently or by a co-selection phenomenon. S. maltophilia genome is characterized by
numerous determinants encoding non specific efflux pumps that could participate to
resistance co-selection by a cross-resistance phenomenon (Crossman, et al., 2008). We also
observed that antibiotic and heavy metal resistance phenotypes enable to separate the two
sequenced strains, i.e. the clinical K279a strain and the environmental R551-3 strain, in two
different groups, despite a high synteny, a core genome composed of 85 % of common genes
between the two strains and a high number of drug resistance determinants (Rocco, et al.,
2009). The K279a strain belonged to the group of strains characterized by an elevated multi-
resistance capacity whereas the R551-3 strain belonged to the group defined by heavy metal
and antibiotic resistance capacity. This observation suggested that adaptation to the niche
could lead to different phenotypes despite a high degree of genome conservation. The
difference observed between the two strains could be due to the presence of resistance
- 203 -
determinants in the accessory genome, i.e. acquired by horizontal transfer, or by regulation
phenomenon.
Presence of antibiotic and heavy metal resistance genes was investigated in the strain
collection in order to evaluate their implication in the observed phenotypes. Our objective was
not to evaluate the presence of all resistance genes but to evaluate the prevalence of genes
implicated in different resistance mechanisms as genes encoding efflux pumps (smeV, copB,
czcA, czcC), enzymes which modify antibiotics or metals (smlt3652, blaL2, merA), peptide
which protects antibiotic targets (qnr). Indeed, resistance to each antibiotic family involves
several mechanisms. Our choice was also based on the potential mobility of some genes as for
example czc, cop and mer operon are present on genomic islands in the sequenced strains
(Crossman, et al., 2008, Rocco, et al., 2009). The distribution of these genes was variable
(Figure 36). Presence of antibiotic resistance genes was frequent in hospital strains and strains
from Ouagadougou. In strains from Nabeul and Pierrelaye, the prevalence of the genes was
high except for blaL2 and qnr, respectively. The lowest prevalences were observed in strains
isolated from Feucherolles. Concerning heavy metal resistance genes, presence of copB and
czcA was frequent in all the strains and presence of czcC and merA was less frequent. Absence
of amplification could be explained by the absence of the genes, but we can not exclude a
problem during the PCR amplification, probably due to a poor effectiveness of the primers
during the hybridizing step (due to mutation in the hybridizing zone). It seems difficult to
conclude that presence or absence of these genes could be responsible to the diversity of
resistance phenotype observed. Variation in resistance phenotype could more probably be the
result of mutation or regulation phenomenon, as it has been suggested in clinical isolates
(Sanchez, et al., 2004, Sanchez & Martinez, 2009). Evaluation of the expression of resistance
genes would be necessary to better understand resistance mechanism functioning in S.
maltophilia. Nevertheless, this genotypic variability also reflected a high diversity among S.
maltophilia strains. We previously investigated heavy metal resistance capacity and presence
of implicated genes in the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa (Deredjian et al.,
submitted). We observed that P. aeruginosa showed variable heavy metal resistance
phenotypes despite the presence of potentially implicated genes (copA, copB, czcA) in all the
hospital and environmental strains of the collection. These results suggested that all the strains
have potentially the capacity to resist to heavy metals and that the variability in resistance
capacity was preferentially due to regulation and level of expression of the genes. In S.
maltophilia, the phenotypic diversity observed could also be due to a genotypic diversity
(presence / absence of researched genes) that could be related to adaptation of S. maltophilia
- 204 -
populations to conditions present in their original niches. Molecular methods as pulse field gel
electrophoresis (PFGE) after digestion with DraI revealed a high diversity among S.
maltophilia strains. Some of them enable to differentiate clinical strains from environmental
strains (Minkwitz & Berg, 2001), others grouped strains independently of their origin (Berg,
et al., 1999). To our opinion, it is more important to take into account the conditions that
characterized the original niche of the strains than to differentiate strains from the
environment and from the hospital. Work on strains from well characterized environments is
indispensable to evaluate S. maltophilia population diversity as this species seems highly
adapted to its original niche.
ACKNOWLEDGMENTS
Alpes Region Cluster “Environnement”. We thank Gerard Chabanon and Christine Segonds
for providing clinical strains of S. maltophilia.
REFERENCES

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Berg G, Roskot N & Smalla K (1999). Genotypic and phenotypic relationships between
clinical and environmental isolates of Stenotrophomonas maltophilia. J Clin Microbiol 37:
3594-3600.
- 205 -
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Conclusions
Dans la première partie de ce chapitre, nous avons évalué le rôle de différentes activités
anthropiques sur la sélection de résistance aux antibiotiques chez P. aeruginosa et S.
maltophilia.
Nous avons observé que la majorité des souches d’origine environnementale de P. aeruginosa
présentait le phénotype sauvage de résistance aux antibiotiques (résistance à la minocycline et
au triméthoprime + sulfaméthoxazole, sensibilité à la colistine). A l’opposé, 60 % des souches
d’origine hospitalière présentent un phénotype résistant, présentant des résistances de 3 à 17
antibiotiques (sur 18 testés), ce qui confirme que la forte concentration en antibiotiques
présente dans le milieu hospitalier constitue la pression majeure pour l’acquisition et le
maintien de résistance aux antibiotiques. Toutefois, 12 % des souches d’origine
environnementale présentent un phénotype résistant, présentant de 3 à 5 résistances. Les
souches présentant ces résistances ont été soumises à la présence dans leur niche d’origine
d’hydrocarbures ou d’antiseptiques qui pourraient avoir agi comme pression favorisant la
sélection et / ou le maintien de ces résistances. Toutefois, nous ne bénéficions pas d’une
caractérisation assez fine de ces environnements pour confirmer cette hypothèse. En ce qui
concerne la résistance aux métaux, les souches environnementales présentent plus
fréquemment des résistances au zinc, cadmium et faible concentration en cuivre alors que les
souches d’origine hospitalière présentent plus fréquemment des résistances au mercure et aux
fortes concentrations en cuivre. Pourtant, nous avons pu observé la présence des gènes
impliqués dans la résistance au Zn, Cd et Cu chez toutes les souches étudiées qu’elles soient
d’origine environnementale ou hospitalière, ce qui suggère que les différents phénotypes
observés s’expliqueraient plutôt par des différences dans l’expression et la régulation de ces
gènes. Cette étude ne nous a pas permis de mettre en évidence d’association de résistance aux
métaux et aux antibiotiques. Toutefois, les environnements étudiés n’étaient pas caractérisés
par de fortes concentrations en métaux comme c’est le cas dans les rares études montrant ce
type d’association chez des souches environnementales de P. aeruginosa (Filali, et al., 2000,
Oyetibo, et al., 2009).
Les souches de S. maltophilia présentent également des capacités de résistance différentes en
fonction de leur origine, contrairement à ce qui est suggéré dans la littérature (Berg, et al.,
1999). Les souches hospitalières présentent fréquemment des multi-résistances aux
antibiotiques mais contrairement aux souches cliniques de P. aeruginosa, ces résistances sont
- 211 -
parfois associées à une forte capacité de résistance aux métaux. La présence de fortes
concentrations en antibiotiques dans le milieu hospitalier est très certainement à l’origine de la
sélection et du maintien de ces résistances. Des différences ont également été mises en
évidence entre les deux modèles en ce qui concerne les souches d’origine environnementale.
En effet, chez les souches d’origine environnementale de S. maltophilia, nous avons pu
observer une grande diversité des profils de résistance aux métaux et aux antibiotiques en
fonction des sites d’origine des souches. D’une part, les souches isolées des sites de Nabeul
(Tunisie) présentent des capacités similaires à celles des souches d’origine hospitalière, se
répartissant en 2 groupes : le premier caractérisé par des résistances fréquentes aux métaux et
aux antibiotiques ; le deuxième caractérisé par des résistances à un grand nombre
d’antibiotiques (en particulier aminosides et polypeptides) mais pas aux métaux. Les souches
isolées du site de Ouagadougou font également partie de ce dernier groupe de souches.
D’autre part, un troisième groupe, uniquement constitué de souches environnementales
isolées des sites de Feucherolles et Pierrelaye (France), se caractérise par de faibles capacités
de résistance à la fois aux antibiotiques et aux métaux. Ces résultats suggèrent une adaptation
particulière des populations de chaque site aux conditions environnementales rencontrées. Ces
conditions sont en effet très différentes d’un site à l’autre soit de part leurs origines
géographiques différentes (France et Afrique) soit du fait des pratiques agricoles conduites sur
ces sites. En effet, l’utilisation d’eaux usées pour l’irrigation sur le site de Nabeul et de
déchets urbains bruts pour amender les sols de Ouagadougou pourraient apporter différents
contaminants comme des métaux lourds, des molécules organiques complexes mais
également des antibiotiques ou des antiseptiques pouvant exercer une pression sélective même
à faible concentration. Cependant, il est à noter que ces sols ne renferment pas de
concentrations élevées en métaux. Par conséquent, un lien direct entre concentration totale en
métaux et niveau de résistance n’a pas pu être mis en évidence. La double résistance métaux /
antibiotiques est soit une capacité développée au cours de l’exposition aux métaux présents
dans les eaux d’irrigation ou dans les déchets urbains, soit une caractéristique intrinsèque des
populations indigènes de S. maltophilia liée à l’adaptation à leur niche. La présence dans les
génomes séquencés de nombreux gènes impliqués dans la formation de pompes à efflux non
spécifiques pourraient entrainer des phénomènes de résistance croisée en permettant l’efflux
de métaux et d’antibiotiques. L’absence de résistance aux métaux et aux antibiotiques des
souches isolées du site de Pierrelaye est plutôt inattendue étant donné que ce site est
caractérisé par des concentrations en métaux très élevées du fait de l’utilisation des eaux usées
de la ville de Paris pendant près d’un siècle pour l’irrigation des champs. Toutefois, les
- 212 -
propriétés de ce sol pourraient être à l’origine de la non-disponibilité des métaux (surtout du
fait de la présence de molécules organiques) les rendant moins toxiques pour les organismes
présents, ce qui expliquerait l’absence de résistances chez les souches isolées de ce site.
Cette diversité de résistance est plutôt inattendue si on considère les résultats de comparaison
des génomes. En effet, une importante capacité de résistance aux composés toxiques a été
mise en évidence à la fois chez la souche d’origine clinique K279a et la souche d’origine
environnementale R551-3. Ce trait commun permettrait aux souches de S. maltophilia de
coloniser différentes niches, à la fois dans le milieu clinique et dans l’environnement quelle
que soit l’origine de la souche. Toutefois, la souche R551-3 est endophyte du peuplier, elle
établit donc une interaction particulière avec cet organisme et ne peut donc pas être
considérée comme le meilleur représentant des souches d’origine environnementale. De plus,
nous avons pu constater que l’analyse en composantes principale établie avec les phénotypes
de résistance aux métaux et aux antibiotiques permettait de séparer ces souches dans deux
groupes différents, la souche K279a appartenant au groupe caractérisé par une forte capacité
de multi- résistance aux antibiotiques et la souche R551-3 appartenant au groupe caractérisé
par une résistance importante aux métaux et aux antibiotiques. Ainsi, malgré une conservation
importante entre les deux génomes (85 %), des phénotypes différents sont observés. Des
différences d’expression et de régulation des gènes communs de même que le génome
accessoire, c'est-à-dire spécifique à chaque souche et acquis par transfert horizontal,
pourraient expliquer les différences observées entre les deux souches.
Nous avons également observé que la prévalence des gènes de résistance aux métaux et aux
antibiotiques est variable indépendamment de l’origine des souches, ce qui ne permet pas de
conclure sur le rôle de la présence de ces gènes sur les phénotypes obtenus. Ce résultat traduit
toutefois une diversité génotypique que nous n’avons pas observée chez P. aeruginosa. En
effet, les gènes de résistance aux métaux recherchés chez P. aeruginosa sont présents chez
toutes les souches. Ceci suggère que toutes ces souches auraient potentiellement la capacité de
résister aux métaux et que les différences observées seraient plutôt liées à des différences de
régulation et des niveaux d’expression différents de ces gènes en fonction des conditions
environnementales rencontrées dans la niche d’origine. Chez S. maltophilia, l’adaptation aux
conditions rencontrées par les différentes populations étudiées pourrait également être à
l’origine d’une diversité intra-spécifique au niveau des génotypes.
- 213 -
Conclusion (English version)
In the first part of this chapter, we evaluated the role of different human activities on
antibiotic resistance selection in P. aeruginosa and S. maltophilia. We observed that most of
environmental P. aeruginosa strains presented the wild type resistance phenotype
(minocycline resistance, trimethoprim + sulfamethoxazole resistance and colistin sensitivity).
On the opposite, 60 % of hospital strains presented a resistant phenotype, exhibiting resistance
from 3 to 17 antibiotics (of 18 tested), confirming that the high antibiotic concentrations in the
hospital is the major pressure for the acquisition and maintenance of antibiotic resistance.
However, 12 % of environmental strains presented a resistant phenotype, exhibiting from 3 to
5 resistances. Strains presenting these resistances were submitted in their original niche to the
presence of hydrocarbons or antiseptics that could act as selective pressure favouring this
resistance selection and / or maintenance. However, the characterization of these
environments is not good enough to confirm this hypothesis. Concerning heavy metal
resistance, environmental strains were frequently resistant to zinc, cadmium and low
concentration of copper since hospital strains were frequently resistant to mercury and high
concentration of copper. Nevertheless, we observed the presence of zinc, cadmium and copper
resistance genes in all the strains from environmental and hospital origin, suggesting that
phenotypic differences could be explained by difference in the level of expression of these
genes or in their regulation. This study did not enable to evidence association between
antibiotic and heavy metal resistance. However, the studied environments were not
characterized by high heavy metal concentration as it has been seen in the scarce study
showing such associations in environmental strains of P. aeruginosa (Filali, et al., 2000,
Oyetibo, et al., 2009).
S. maltophilia strains also present different capacity of resistance depending on their origin,
unlike it has been suggested in the literature (Berg et al., 1999). Hospital strains presented
frequently antibiotic multi-resistance. Unlike P. aeruginosa, antibiotic resistance is sometimes
associated to high heavy metal resistance capacity. The presence of high antibiotic
concentrations in the hospital must be responsible for selecting and maintaining resistance.
Differences among the two models were shown within environmental strains. We observed a
high diversity in antibiotic and heavy metal resistance profiles among environmental strains
of S. maltophilia. In one hand, strains isolated from the site of Nabeul (Tunisia) presented
resistance capacities similar to hospital strains, forming two groups. The first one is
- 214 -
characterized by frequent antibiotic and heavy metal resistances and the second one is
characterized by resistance to a higher number of antibiotics (especially, aminosides and
polypeptides) but low heavy metal resistance. Strains isolated from Ouagadougou were also
grouped in the last group. Finally a third group, only composed with environmental strains
from the French sites of Feucherolles and Pierrelaye, is characterized by low antibiotic and
heavy metal resistance capacities. These results suggest a particular adaptation to
environmental conditions of S. maltophilia populations within in each site. These conditions
are indeed very different from one site to another due to their different geographical origin
(France and Africa), climate, and physicochemical characteristics or to agricultural practices
conducted on these sites. The use of wastewater to irrigate the site of Nabeul or urban rough
waste to amend the site of Ouagadougou could lead to the intake of contaminants as heavy
metals or organic compounds but also antibiotics or antiseptics that can act as selective
pressure even at low concentration. However, it should be noted that these soils do not contain
high concentrations of metals. Therefore, a direct link between total metal concentration and
level of resistance has not been demonstrated. The double resistance to metals / antibiotics
could be a capacity developed during the exposition to heavy metals in wastewater or urban
rough waste or could be an intrinsic characteristic of indigenous S. maltophilia populations
linked to the adaptation to the niche. Presence in the genome of numerous genes implicated in
the formation of non specific efflux pumps could lead to cross-resistance enabling the efflux
of both metals and antibiotics. Absence of metal and antibiotic resistance in strains from the
site of Pierrelaye was rather unexpected since this site is characterized by high heavy metal
concentrations due to the use of the untreated wastewater from Paris over a century for the
irrigation of the crops. However, properties of the soil could lead to the non-availability of
heavy metals (due to the presence of organic molecules) making them less toxic for the
present organisms, and could explain absence of resistance in strains from this site.
This diversity was rather unexpected if we consider the results of comparison of the genomes.
A high capacity of resistance to toxic compounds has been highlighted in both the clinical
strain K279a and the environmental strain R551-3. This common characteristic would enable
strains of S. maltophilia to colonize different niches in both the hospital and the environment,
independently of the origin of their origin. However, R551-3 is a poplar endophyte and
establishes particular interactions with this organism. So, this strain can not be considered as
the best representative of environmental strains. Moreover, we observed that the principal
component analysis established with antibiotic and heavy metal resistance profiles enable to
separate these strains in two different groups, K279a belonging to the group characterized by
- 215 -
high antibiotic multi-resistance capacity and R551-3 belonging to the group characterized by
high heavy metal and antibiotic resistance capacity. Despite a high conservation between the
two genomes (85 %), different phenotypes were obtained. Differences in expression and
regulation of implicated genes, as well as the accessory genome, specific to each strain and
acquired by horizontal transfer, could explain the differences observed between the two
strains.
We also observed that the prevalence of antibiotic and heavy metal resistance genes was
variable, independently of the origin of S. maltophilia strains. This result does not enable to
conclude on the role of the presence of these genes in the observed phenotypes. However, this
result reflects a genotypic diversity that we did not observed in P. aeruginosa. Heavy metal
resistance genes in P. aeruginosa are present in all the strains. This suggests that these strains
would be potentially able to resist to metals and that the observed differences are rather
related to differences in regulation and different levels of expression of these genes due to
environmental conditions encountered in the original niche. In S. maltophilia, adaptation to
conditions encountered by the different studied populations could also be responsible of intra-
specific diversity at the genotype level.
- 216 -
Partie 2 : Evaluation de la diversité du déterminant merA chez P. aeruginosa et
S. maltophilia, association avec les résistances aux antibitiotiques
Part 2: merA genetic diversity in Pseudomonas aeruginosa and

Stenotrophomonas maltophilia and relationship with antibiotic resistance
- 217 -
- 218 -
“merA genetic diversity in Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia
and relationship with antibiotic resistance”
Amélie Deredjian*, Elisabeth Brothier, Sabine Favre-Bonté, and Sylvie Nazaret

Short running title: merA diversity and antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa
and Stenotrophomonas maltophilia
Key-words: merA, antibiotic resistance, Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas

maltophilia, hospital origin, environment
*
- 219 -
ABSTRACT
The frequent presence of mer operon within bacterial isolates from the hospital raise the
question of the selective pressure acting on the persistence of merA gene since mercury is
forbidden for several years in hospital. The frequent association of antibiotic resistance genes
and mer operon on mobile genetic elements suggests that antibiotic favor the dissemination of
both classes of genes. To investigate this further we conducted a study on strains of two
human opportunistic pathogens P. aeruginosa and S. maltophilia originating either from the
hospital environment, patients from the hospital, cystic fibrosis patients, waste water and soil.
Prevalence and diversity of merA gene were evaluated and compare to antibiotic susceptibility
profiles. Common merA determinants showing 100% homology with merA carried by the
Tn501 or PAGI-2 genomic island were found among P. aeruginosa and S. maltophilia.
Within each species these determinants were found the most frequent among both hospital
and environmental strains of each species but were more widespread among hospital
environment and hospital patients. Two of the most prevalent merA determinants were
associated to particular antibiotic resistance profiles in P. aeruginosa strains from the
hospital.
- 220 -
INTRODUCTION
The mercury resistance (mer) operon is widely distributed among many bacterial taxa
belonging to Proteobacteria, Gram-positive bacteria and Archaebacteria. The mer operon, is
composed at least by four genes: merR which activates its transcription in presence of
mercury and represses it in absence of mercury; merT and merP, two transporters of Hg2+
from the periplasm to the mercuric reductase encoding by merA, which reduces Hg2+ to
volatile Hg0. Other genes can be present like the down-regulator merD and the transporters
merC and merF (Nascimento & Chartone-Souza, 2003). This operon is frequently found on
mobile elements like plasmid, transposon or genomic island (Mindlin, et al., 2001). Many
studies focused on its role in the biogeochemical cycle of mercury as well as its role in the
adaptation of bacterial communities exposed to mercury pollution. Natural events like
volcanic eruptions or anthropogenic activities like gold mining, chlor-alkali production and
sewage treatment were found to impact bacterial communities whose adaptation process led
to an increase in the abundance of mercury resistant populations and an increase in mer gene
containing bacteria. The long time use of mercury as disinfectant, in thermometers or in
dental amalgams was also found responsible of such an enrichment in the hospital
environment (Summers, et al., 1993, Ready, et al., 2007). These enrichments might result
from selection and multiplication of mer-gene containing populations as well as from
acquisition of mercury resistance by horizontal gene transfer (HGT). These HGT can be
associated to acquisition of other genes present on the mobile element, especially genes
encoding antibiotic resistance (Liebert, et al., 1999). Links between mercury and antibiotics
resistance have already been demonstrated in studying bacterial communities living in
polluted environments and in the oral or fecal flora after amalgam installation (Wireman, et
al., 1997).
Exposure to mercury is a driving force for the carriage of mer genes. Its frequent association
to antibiotic resistance gene on mobile elements suggests that antibiotic pressure contribute to
the acquisition and dissemination of mer gene. The simultaneous acquisition of mercury and
antibiotic resistance genes can play a significant role in antibiotic multi-resistance especially
in opportunistic pathogens, which can be found in both clinical and environmental
ecosystems. Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia are two
opportunistic pathogens, known as versatile micro-organisms. These ubiquitous bacteria are
characterized by high capabilities to adapt to a variety of environments; S.maltophilia is often
present in soils (Juhnke & des Jardin, 1989), but can be found in water (Matyar, et al., 2008)
- 221 -
while P. aeruginosa has been found in soils only in particular cases in highly polluted sites
(Kaszab, et al., 2009) and is predominantly found in water and wet environments (Pellett, et
al., 1983). Some of their metabolic activities have been studies for bioremediation
applications (Hickey & Focht, 1990, Binks, et al., 1995). They can also establish beneficial or
pathogenic interactions with plants or animals (Denton, et al., 1998, Berg, et al., 2005).
Finally, they are implicated in nosocomial infections in fragilised people and can infect
respiratory tract of patients with cystic fibrosis (Denton, et al., 1998). They present frequently
multi-resistance to antibiotics, making them difficult to eradicate (Mesaros, et al., 2007,
Nicodemo & Paez, 2007).
Acquisition of mobile genetic elements seems to play an important role in the versatility of
these two bacteria. P. aeruginosa genome size can vary from 5.2 to 7 Mbp. Variability in size
can be explained by loss or acquisition of genetic elements by horizontal gene transfers. These
blocks of genes are known as the accessory genome, positioned in specific points of the core
genome and represent regions of plasticity (Morales, et al., 2004). Among these elements,
several genomic islands have been described: PAGI-1 to 11 (Pseudomonas aeruginosa
genomic islands) (Larbig, et al., 2002, Battle, et al., 2009) or PAPI-1 and PAPI-2
(Pseudomonas aeruginosa pathogenic island) (He, et al., 2004). Concerning S. maltophilia,
40 genomic islands have been identified in the genome of the two sequenced strains: the
clinical K279a (Crossman, et al., 2008) and the environmental R551-3 (Taghavi, et al., 2009).
These islands are implicated in the high effectiveness of S. maltophilia in interactions and
protection in several environments, encoding type I and IV secretion systems, genes
implicated in LPS biosynthesis and in metal resistance like mercuric resistance genes.
In previous works, P. aeruginosa and S. maltophilia strains originating from the hospital or
the environment were characterized for their mercury resistance phenotype and their carriage
of a merA-like gene. Here we aimed at evaluating the extent of the diversity of merA-like
genes based on restriction analysis and sequencing and its localization on the bacterial
genome i.e. chromosome or plasmid carriage. The results were analyzed and discussed in
comparison with data on antibiotic susceptibilities and selective pressure existing in the
original niche of the various strains.
- 222 -
MATERIALS AND METHODS
Strains
A collection of 127 strains of Pseudomonas aeruginosa and 79 strains of Stenotrophomonas
maltophilia was used in this study (Table 11). These strains were chosen taking into account
their origin and the putative anthropogenic selective pressure (i.e. antibiotics, antiseptics,
hydrocarbons, heavy metals) present in their original niche. Strains of P. aeruginosa were
isolated from the hospital environment (16), faecal carrier patients (5), infected patients (8) or
cystic fibrosis patients (25). A set of environmental strains (73) from water samples (14),
from soil related samples (46) and from snake breeding (13) were also included. Similarly
strains of S. maltophilia were either from human origin (28) including infected patients (16)
and CF patients (12) or environmental origin (39). The later were isolated from soil samples
from France (27) and Africa [Tunisia (18) and Burkina Faso (8)].
Mercury resistance and antibiotic resistance tests

Mercury resistance was established using Tryptic Soy Agar media diluted 10 fold (TSA 1/10)
supplemented with different concentrations (10, 50, 200, 500 μM) of Hg(II), adding as
mercury salt (HgCl2). Cultures were incubated at 28°C during seven days. A strain was
considered as resistant when growth on medium supplemented with 10 μM of Hg(II) was
equivalent to growth on medium without mercury. When growth was lower, the resistance
was intermediate. When no growth was obtained, the strain was sensitive. In order to make a
link between mercury resistance and antibiotic resistance, antibiotic resistance profiles were
established. Minimal inhibitory concentrations of 18 antibiotics were obtained using the
VITEK®2 system (Biomérieux, France) with AST-N032 card (specific of non fermenting
gram negative bacteria) were performed and results analysed as previously reported
(Deredjian et al., submitted).
PCR amplification
The degenerated primers merA1GN (5’-GTG CCG TCC AAG ATC ATG AT-3’) and
merdA2 (5’-TAG CC(C/T) AC(G/A) GT(C/G) GC(C/G) AC(T/C) TG-3’) were used to
amplify merA gene (Table 12). These primers were designed after alignment of several merA
sequences picked up from GenBank database including the mer determinants detected on the
sequenced genomes of P. aeruginosa (strains PA7, PA14, LESB58) and S. maltophilia
(K279).
- 223 -
Table 11. Strains used in this study.
Origin P. aeruginosa S. maltophilia
Environment
Treatment plant poe1033, poe1108, poe1028, poe1314,

system poe1091, poe1062, poe1312, poe1045,
poe1026, poe1372, poe1436, poe1150,
poe1081, poe1302
Soil related ATCC14425, CFBP5031, CFBP5032, V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10,
CFBP5033, CFBP5034, LMG5031, V11, V12, V13, P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8,
LMG5032, LMG5033, LMG1272, LMG6855, P9, P10, P11, P12, P13, P14, N1, N2, N3, N4,
CFBP2466, CFBP5035,ATCC21776, N5, N6, N7, N8, N9, N10, N11, N12, N13,
ATCC31479, CIP104590, LMD5034, N14, N15, N16, N17, O1, O2, O3, O4, O5, O6,
LMD68.7, LMG15153, 7NSK2, DSMZ6195, O7, O8
bpoe1457, bpoe1459, bpoe1460, bpoe1428,
bpoe1429, bpoe1430 , bpoe1431, bpoe1432,
bpoe1433, bpoe1444 , bpoe1445, bpoe1447,
CFBP5036, CFBP5037, ATCC33988,
bpoe1461 (Es40), bpoe1462 (Es41), bpoe1474,
bpoe1475, bpoe1479, ATCC27014, bpoe1463
Snake breedings bpoe602, bpoe626, bpoe636, bpoe639,

bpoe688, bpoe690, bpoe674, bpoe700 ,
bpoe600
Hospital
Environment poe9, poe92, poe110, poe101, poe22, poe45,
poe59, poe17, poe1, poe2, poe81, poe30,
poe103, poe77, poe64, poe131
Patients poe73, poe8, poe19, poe54, poe51, poe126, I1, I2, I3, I4, I5, I6, I7, I8, I9, I10, I11, I12,
ATCC15691, ATCC27853, PA5, PA6, PA12 , I13, I14, I15
PA14, PAO1
Cystic fibrosis bpoe977, bpoe979, bpoe980, bpoe981, CF1, CF2, CF3, CF4, CF5, CF6, CF7, CF8,
individuals bpoe982, bpoe983, bpoe984, bpoe5000, CF9, CF10, CF11, CF12
bpoe5017
Concerning S. maltophilia from soils, N = strains from Tunisian site (Nabeul), O = strains
from Burkina Faso site (Ouagadougou) and V and P = strains from French sites (Feucherolles
(Versailles) and Pierrelaye).
Table 12. List of primers.

Annealing
Product
ORF Function Forward primer 5'-3' Reverse primer 5'-3' temperature
size bp
°C
merA Mercuric reductase GTGCCGTCCAAGATCATGAT TAGCCYACRGTSGCSACYTG 933 57

Putative metal transporter
C22 ATPase CCTTCGTCCATTACCTGTGGAAC AACTTGCGAGCCAACTCACG 943 63
C81 Hypothetical protein XF1761 TCGCCTTATCAACCCACCGC TGTGGACCAGCGTCGATTCC 805 58

Probable transcriptional
C98 regulator (PA3689) ATGCGGATCGGTGAACTGGG GTTGAGAATGCCGCACTCGC 375 58
C105 Hypothetical protein XF1781 GATTGATGCTCAACGACGATGG GCTGTTCCGCCTTCAGTTCC 681 59

Chromosome partitioning-
C108 related protein ACTACGAACTGACCCAGCGC CCATTGCGGGAACAACTCGC 659 58
- 224 -
They were further tested on the determinants: Tn501, Tn21, pDU1358, pKLH2, pMERPH,
pMER419, R831. Successful amplification was obtained with all targets tested excepted
pMERPH with the merA primers (data not shown). The following PCR cycles was used to
amplify a 930 bp segment of merA (total size 1686 pb): an initial denaturation step is done at
94°C during 4 min, followed by 30 cycles of 1 min denaturation at 94°C, 1 min of primer
annealing at 57°C (merA), 1 min of primer extension at 72°C. Finally, a final extension was
done during 8 min at 72 °C. The presence of PAGI-2-like genomic islands was done by PCR
with 5 pairs of primers amplifying specific genes of these islands. These primers were
previously designed by Klockgether et al. and Finnan et al. (Table 12) (Finnan, et al., 2004,
Klockgether, et al., 2008). PCR was done as follow: an initial cycle of denaturation during 4
min at 96°C, 30 cycles of a 30 s denaturation at 94°C, a 30 s annealing primers at variable
temperature, a 1 min primer extension at 72°C, final extension was done at 72°C during 8
min. The PCR were carried out in 25 μl reaction mixture containing 1,25 U of Taq
polymerase (Q-biogen), 1X reaction buffer containing MgCl2 (Q-biogen), 20 mM dNTP, 0,5
μM of each primers, 1 μl of cell lysate. Amplification was verified by 2 % agarose gel
electrophoresis.
Plasmid profile and Southern hybridization

Plasmid profiles were performed according to the procedure previously described (Moulton,
et al., 1993). The strain P. aeruginosa PAO1 and the strain Pseudomonas syringae p. pisi 203
were use as negative control and PA025 as a positive control for the absence and presence of
merA gene, respectively, on all the gel electrophoresis. Profiles were separated on 0.6% w/vol
agarose gels and the DNA was electro-transferred to nylon membranes (Genescreen Plus, Life
Science Products, Boston, MA) using a Trans Blot SD (Bio-Rad), according to Muyzer et al.
(1998). A 930 bp fragment of the Tn501-merA gene covering the sequence encoding the
active site of the mercuric reductase enzyme was amplified using primers merA1GN and
merdA2. PCR products were labelled with [ -32P]-dCTP by random priming as
recommended by the supplier (Kit Random Primed Boehringer, Mannheim, Germany).
Hybridization was carried out at 65°C (in Denhardt 5X, SSPE 5X, SDS 0.1% w/v) and
washes at 65°C (in SSC 1X). Hybridization signals were detected and analyzed with the Bio-
Rad GS-525 Molecular Imager and the Molecular Analyst software (Bio-Rad).
- 225 -
Restriction profiles and sequencing
Amplified fragments of merA gene were digested to obtained restriction profiles using two
enzymes: AluI (Fermentas) and MaeIII (Roche). A 10 μl reaction mixture was composed of: 1
U of restriction enzyme, 0,4X of buffer: Tango (Fermentas) or MaeIII incubation buffer
(Roche) for AluI and MaeIII respectively, 5 to 10 μl of PCR product. Incubation was done
during 2 hours, at 37°C for AluI and 55°C for MaeIII. Restriction fragments were visualised
in a 3 % low melting agarose (Metaphor®, Tebu-Bio) gel electrophoresis. Amplification
product of one of each profile was sequenced (Cogenics, France).
Phylogenetic analysis
Sequences obtained from our study and sequences of merA genes from various species
obtained in NCBI were used to establish a merA phylogeny. Alignment of sequences and
phylogenetic tree were done using Seaview 4.2 software (pbil, Lyon, France). The pair-wise
evolutionary distances were calculated using Kimura2-parameter model. The phylogenetic
tree was constructed by Neighbor-Joining (bioNJ) method with 500 replicates using bootstrap.
RESULTS
merA gene restriction profiles and genomic localization

In a previous study we detected merA gene among 42 over 127 strains (33%) of P. aeruginosa
from hospital and environmental origin (data summarized in Table 13). A comparable
prevalence: 27%, was observed among a collection of 67 S. maltophilia strains. Whatever the
species, strains originating from the hospital had a higher frequency of merA gene (61 and
46% for P. aeruginosa and S. maltophilia, respectively) than strains from the environment (12
and 13% for P. aeruginosa and S. maltophilia, respectively). No relationships between merA
detection and mercury resistance were observed since most of the merA-carrying isolates had
a sensitive phenotype [no growth in the presence of 10 μM of Hg(II)]. Detailed results of the
prevalence of mercury resistance phenotype and merA carriage among strains of various
origins are provided in Table 13. The diversity of the genes was further analyzed by
enzymatic restriction. Eleven profiles named A to J were obtained (Table 14). Nine profiles
were observed among P. aeruginosa strains and 3 among S. maltophilia strains. The profiles
A and D were common to both species and the A profile was found dominant in each species
representing 44% and 60% of the merA gene pool among P. aeruginosa and S. maltophilia,
respectively.
- 226 -
Table 13. Abundance (in percent) of the mercury resistance phenotype among P. aeruginosa
and S. maltophilia strains.
healthy
hospital hospital soil related
CF patients captive lagoon
environment patients samples
snakes
P. aeruginosa
mercury
5/16 (31%) 6/13 (46%) 1/25 (4%) 0/13 (0%) 0/14 (0%) 8/46 (17%)
resistant
containing 16/16 4/14
10/13 (78%) 7/25 (28%) 3/13 (23%) 2/46 (4 %)
merA (100%) (29%)
hospital soil from soil from soil from
CF patients
patients Burkina Tunisia France
S. maltophilia
mercury
1/16 (6%) 1/12 (8%) 0/8 (0%) 4/18 (22%) 0/27 (0%)
resistant
containing
9/16 (56%) 4/12 (33%) 0/8 (0%) 4/18 (22%) 1/27 (4%)
merA
Table 14. Abundance (in percent) of the merA-like gene among P. aeruginosa and S.
maltophilia strains and distribution of the various profiles depending on strain origin.
Profiles present healthy

hospital hospital Frequency of
among P. CF patients captive lagoon soil related
environment patients the profile
aeruginosa (7) snakes (4) (3)
(16) (10) (%)
strains (3)
A profile 8 5 1 3 2 0 19/43 (44)
B profile 4 2 0 0 0 0 6 (14)
C profile 1 0 3 0 2 0 6 (14)
D profile 3 1 0 0 0 2 6 (14)
E profile 0 0 1 0 0 0 1 (2)
F profile 0 0 1 0 0 0 1 (2)
G profile 0 0 1 0 0 0 1 (2)
H profile 0 1 0 0 0 1 2 (4)
I profile 0 1 0 0 0 0 1 (2)
Profiles present
hospital CF soil from soil from Frequency of
among S.
patients patients Tunisia France the profile
maltophilia
(9) (4) (4) (1) (%)
strains
A profile 5 3 3 0 11/18 (60)
D profile 4 1 1 0 6 (34)
J profile 0 0 0 1 1 (6)
- 227 -
The determinants observed among P. aeruginosa were all found among the hospital strains
(Table 14) whereas only 4 profiles, A, C, D and H, were found among environmental strains.
Differences were also seen between the hospital strains and the CF strains both considering
the prevalence which was lower among CF strains and the diversity. The profiles A, B, C, D,
H and I were found within the former group and the profiles E, F, and G within the latter
group. Of the 18 S. maltophilia carrying merA gene, profiles A, D and J were obtained.
Profiles A and D were common to hospital and environmental strains.
Hybridization with a merA probe of plasmid profiles from 35 P. aeruginosa strains and 16 S.
maltophilia strains evidenced that except P. aeruginosa ATCC15691, merA genes were
always located in the chromosome.
merA gene sequence and phylogeny

From 1 to 7 merA PCR products per restriction profile were sequenced. BLAST analysis
showed that the sequences from profile A presented a 100% homology with the merA gene
present on the Tn501 (Table 15). Sequences from profile B showed 89 % with the TN501,
those from profile C 100% homology with the one present on the PAGI-5 genomic island and
sequences from profile D showed 100% homology with the merA gene present on the PAGI-2
genomic island or the merA gene of a genomic island of P. aeruginosa LESB58 related to
PAGI-2. Sequences from the remaining profiles showed 100% homology with Tn21 (profile
E), 89% homology with Tn21 (profile F), 99% homology with Tn5041 (profile G), 100%
homology with Tn512 (profile H), and 95% homology with Tn1696 (profile I). None of the
profiles detected among S. maltophilia strains presented sequence homology with the merA
gene present in the genome of the clinical strain K279a. The J profile presented only a
maximal homology score of 80 % with PAGI-2.
BLAST analysis of the mer sequences found on the sequenced genomes of P. aeruginosa
showed that the mer operon of PA14 is homologous to the one present on the Tn501 and the
one present in LESB58 is homologous to the one present on the PAGI-2 genomic island
(Table 15). Strain PA7 possessed two complete mer operons homologous to the operons
present on PAGI-5 genomic island and on the Tn501 and a partial mer operon (without merA)
homologous to the one present in P. stutzeri A1501. BLAST analysis of the mer sequence
found in the genome of the K279a S. maltophilia strain presents a 82 % homology to the one
present on P. aeruginosa LESB58 genome. The P. aeruginosa strain PAO1 and the S.
maltophilia strain R551-3 possess any mer operon.
- 228 -
Table 15. Homology between the merA-like sequences detected among P. aeruginosa and S.
maltophilia strains and the merA sequences available in GenBank.
Closest relative
Species Strain name merA profile (sequence homology %)
S. maltophilia
V4 J LESB58, PAGI2 (80)
I3 D LESB58, PAGI-2 (100)
I2 A Tn501 (100)
I11 A Tn501 (100)
P. aeruginosa
bpoe 639 A Tn501 (100)
bpoe 692 A Tn501 (100)
poe 1081 A Tn501 (100)
poe 22 A Tn501 (100)
ATCC 15691 A Tn501 (100)
poe 131 B Tn501 (89)
poe 19 B Tn501 (89)
poe 1312 C PAGI-5, PA7 (100)
poe 1045 C PAGI-5, PA7 (100)
poe 103 C PAGI-5, PA7 (100)
833 C PAGI-5, PA7 (100)
ATCC 31479 D LESB58, PAGI-2 (100)
DB3046 E Tn21 (91)
373 F Tn21 (100)
186 G Tn5041 (99)
ATCC 27853 H Tn512 (100)
LMG 9009 H Tn512 (100)
PA6 I Tn1696 (95)
Table 16. Screening of the PAGI-2 sequences among the P. aeruginosa and S. maltophilia
strains carrying merA-like sequence.
Species Name Restriction

Origin profile
C22 C81 C98 C105 C108
P. aeruginosa
Hospital poe9 D - + + + +
poe73 D - + + + +
poe73 D - + + + +
poe81 D - + + + +
Environment ATCC31379 D + + + + +
DSMZ6195 D - + + + +
S. maltophilia
Hospital I7 D - + + + +
I3 D - + + + +
I6 D - + + + +
CF4 D - + + + +
Environment N7 D + + + + +
- 229 -
The phylogenetic tree obtained with merA sequenced obtained in our study and merA
sequences from NCBI enabled to observed a wide distribution of merA determinants present
in P. aeruginosa and S. maltophilia (Figure 37). The closest sequences were found in species
belonging to Proteobacteria as P. aeruginosa, P. fluorescens (Gammaproteobacteria),
Ralstonia metallidurans (betaproteobacteria) or Enterobacteriacae as Shigella flexneri,
Escherichia coli, Salmonella enterica.
BioNJ 227 sites Kimura 500 repl. Ochrobactrum anthropi 0.1

100
Xanthobacter autotrophicus
Sphingopyxis alaskensis
99 Sulfitobacter sp
88 Roseovarius sp
Octadecabacter antarcticus
Oceanicola batsensis
Mycobacteriu m abscessus
100 Nocardioides sp
99 Co rynebacterium urealyticum
Staphylococcus epidermidis
100 Geobacillus sp
Streptococcus agalactiae
84 Bacillus cereus
Thermus thermophilus
Marinobacter sp
N it r osococcus oceani
100 Shewanella sp
Acidithiobacillus ferrooxidans
Delftia acidovorans
Sten otrophomonas maltophila K279a
95 Methylococcus capsulatus
100 Acidovorax sp
100 D profile Pa
100
D profile Sm
Pseudomonas aeruginosa LESB58
Ralstonia pickettii
J profile Sm
E profile Pa
98 G profile Pa
Pseudomonas fluor escens
97 100C profile Pa
100 Pseudo monas aeruginosa PA7.2
Polaromonas sp
Halo thiobacillus neap olitanus
98 100Salmonella enterica
100D iaphorobacter sp
87 100Escherichia co li
100 Yersinia pesti s
F profile Pa
Danio r erio
Acidithiobacillus ferr ooxidans
H profile Pa
B profile Pa
Nitrosomonas europea
Nitrosomonas eutropha
95 Janthinobacterium sp
Burkholderia xenovorans
Salmonella ente rica
I profile Pa
Salmonella ente rica
Pseudo monas aeruginosa PA7.1
A profile Pa
99 S higella flexneri
Ralstonia metallidurans CH34
Pseudomonas aeruginosa PA 14
A profile Sm
Figure 37. Positionning of merA determinants (profile) found among P. aeruginosa (Pa) and
S. maltophilia (Sm) in the phylogeny of the merA gene.
- 230 -
Detection of PAGI-2 sequences
Amplification with the 5 pairs of primers designed for the detection of C22, C81, C98, C105
and C108 sequences gave positive results at least with C81, C98, C105 and C108 sequences
for 5 out of the 6 S. maltophilia strains with a D profile/PAGI-2 like merA sequence and the 6
P. aeruginosa with a D profile (Table 16).
Relationship between merA profiles and resistance to antibiotics

No clear relationship was observed between the merA profiles and the antibiotic resistance
patterns except for the P. aeruginosa strains that had the B profile. These strains were all
found resistance to imipenem. A partial relationship was observed for the hospital strain
showing a PAGI-2 like profile (Profile D) since they showed a resistant or intermediate
resistance to amikacyn, gentamicin and isepamicin. As observed for the strains showing the B
profile and resistance to imipenem these D profile strains were all isolated from the same
hospital. The D profile strains from the environment were sensitive to these antibiotics.
None of the S. maltophilia strain showed any relationships between antibiotic patterns and
merA profiles.
DISCUSSION
Our previous work (data summarized in Table 13) evidenced the higher prevalence of
mercury resistant phenotype and merA-like gene among strains originating either from
hospital (environment and patients) than among environmental strains. We attributed this
observation to a higher selective pressure due to the past mercury use and/or to the presence
of antimicrobial agents that select both heavy metal resistance and antibiotic resistance.
Association between antibiotic and mercury resistance genes on mobile elements as plasmids
or transposons has been frequently described in both strains from the environment and the
hospital. Genes encoding -lactamases (blaVIM), enabling resistance to -lactams,
aminoglycoside modifying enzyme (aad), tetracycline resistance (tetA, tetR) or sulphonamide
resistance (sul) have already been found associated to mer operon (Vezina & Levesque, 1991,
Schluter, et al., 2003, Li, et al., 2008). We then investigated a potential association between
merA determinants and antibiotic resistance that could explain maintenance of merA gene
despite absence of mercury resistance phenotype. We first investigated merA diversity in
- 231 -
order to determine if some determinants were dominant among hospital or environmental
strains and if the same determinants were present in both ecosystems. The highest diversity
was found among P. aeruginosa hospital strains, with all determinants found in P. aeruginosa
(9) represented among them. Only 4 out of the 9 determinants were found among
environmental strains of P. aeruginosa (Table 14 and 15).
Two out of the 3 determinants found among S. maltophilia strains were common to the P.
aeruginosa ones i.e. profiles A and D. Interestingly we observed that strains possessing one
particular merA determinant, i.e. D profile, were able to grow in presence of mercury when
they originated from the environment and did not when they originated from the hospital, in
both models. This observation suggested that resistance co-selection could favour the
maintenance of the merA gene in the hospital. We then searched for links between merA
determinants and antibiotic resistance profiles in order to evaluate the presence of dominant
associations. No particular association was observed in environmental strains for both models.
It was rather surprising since environmental mercury resistant bacterium frequently presented
resistance to other compounds as antibiotics (Rasmussen & Sorensen, 1998, Ball, et al.,
2007). However, these bacteria are usually isolated from mercury contaminated sites unlike
environmental P. aeruginosa strains of our study. Concerning strains from the hospital,
particular associations were observed only among P. aeruginosa strains. Two different
associations were found and all the strains implicated originated from the same hospital
(Lavenir, et al., 2008). However, these strains had different origins within the hospital
(aeration grids, water system, rectal swabs). Moreover, these strains belonged to different
clonal complexes as defined by pulse field gel electrophoresis. The first association was
observed in all the strains that had a merA B profile (89 % homologous to merA of the
Tn501). This profile was only found among hospital strains that were characterized by their
resistance to imipenem. Imipenem resistance in P. aeruginosa could be acquired by the
inactivation of the OprD porine or by acquisition of -lactamases. Such enzymes have already
been found on mobile elements (plasmid ant transposon) with part or complete Tn501 (Vezina
& Levesque, 1991, Li, et al., 2008). Huang et al. also reported that the Tn501 could insert in
a sequence supposed to regulate oprD expression leading to imipenem resistance in P.
aeruginosa (Huang, et al., 1992). The second example of association between antibiotic
resistance phenotype and merA profile association was observed among the 4 hospital strains
showing a merA D profile (which present a 100 % homology with the one present on the
PAGI-2 genomic island). However, this phenotype was not recovered from environmental
strains which presented a D profile. These 4 clinical strains were resistant (R)/intermediate (I)
- 232 -
to ticarcillin and ticarcilline + clavulanic acid ( -lactams), I/sensitive (S) to cefepim and
aztreonam -lactams) and R/I to amikacin, gentamicin and isepamcin (aminoglycosides). To
confirm the presence of PAGI-2 like genomic island in these strains, presence of specific
genes was investigated by PCR with specific primers previously defined by Klockgether et al.
(2008) and Finnan et al. (2004), allowing the amplification of the C22, C81, C98, C105, C108
genes. In the 4 strains, C22 was absent and C81, C98, C105, C108 were present (Table 16).
The absence of one gene was not surprising since PAGI-2 genomic island is composed of
cargo genes which could be present or absent in P. aeruginosa strains leading to a high
diversity of PAGI-2 like genomic island (Klockgether, et al., 2007). A high diversity of
PAGI-2 like genomic islands, corresponding to PAGI-2 genomic islands which have lost one
or more gene cargos, is observed among both clinical and environmental P. aeruginosa strains
(Klockgether, et al., 2007). We could hypothesize that strains from the Hospices Civils de
Lyon has acquired a PAGI-2 like genomic island which has received antibiotic resistance
determinants. These strains did not present a mercury resistance phenotype, suggesting that
the maintenance of mercury resistance genetic determinants could be associated to the
maintenance of the total mobile element which could potentially contain antibiotic resistance
genes. High antibiotic pressure in the hospital could select this element composed of both
antibiotic and mercury resistance determinants. However, PAGI-2 like genomic islands are
known to encode mercury resistance mechanism, heavy metal ions transport and metabolic
functions but not antibiotic resistance mechanisms (Larbig, et al., 2002) and we were not able
to confirm the association of antibiotic and mercury resistance genes on the same mobile
element; so we could not refute the hypothesis of two distinct acquisitions of resistance
mechanisms. As a bacteriophage P4-type integrase is present on PAGI-2, research of integron
encoding antibiotic resistance in the 4 clinical strains could be investigated in order to identify
the genotype responsible of the particular antibiotic resistance phenotype.
PAGI-2 has been partially found in other gamma-proteobacteria (clc element of Pseudomonas
putida) and completely in the Cupriavidus metallidurans CH34 -proteobacteria, suggesting
that it can be mobilized from the chromosome to insert in the chromosome of other
strains/species (Gaillard, et al., 2006, Van Houdt, et al., 2009). In order to evaluate the
presence of a PAGI-2-like genomic island in S. maltophilia strains possessing a merA
determinant belonging to the D profile (i.e. merA gene homologous to the one present on
PAGI-2), presence of the C22, C81, C98, C105, C108 genes was investigated. Among the 4
clinical strains with a merA determinant belonging to the B profile, 3 possessed 4 of the 5
PAGI-2 specific genes (C22 was absent) and the last one possessed none of these genes
- 233 -
(Table 16). The environmental strain possessing a merA determinant belonging to the D
profile presented the 5 PAGI-2 specific genes. The environmental strain possessing a merA
determinant belonging to the C profile (homologous with merA present on PAGI-2 at 82 %)
was also tested and none of the genes were present. Different studies revealed the capacity of
S. maltophilia clinical strains to acquire mobile elements (Avison, et al., 2000, Chang, et al.,
2004, Toleman, et al., 2007). Especially, the clinical strain D457R possessed a cluster of gene
potentially allowing macrolide and cadmium resistance which present a high homology with a
sequence present in Gram positive bacteria (Alonso, et al., 2000). To our knowledge, this is
the first demonstration of a putative acquisition of a mobile element in both clinical and
environmental strains of S. maltophilia. Our results suggested that PAGI-2 like genomic
island could have been acquired in both clinical and environmental strains of S. maltophilia,
involving that these two species shared the same habitat. P. aeruginosa and S. maltophilia can
be found simultaneously in the same ecological niche. In the hospital, they are both major
nosocomial pathogens and can be both isolated from CF lungs. In the environment, such
exchanges seem to be less frequent. Despite their ubiquity in a large panel of environments,
few studies investigated and showed their presence simultaneously. In a previous work, we
failed to highlight the presence of these two species simultaneously in soils, whatever their
origin (France, Tunisia, Burkina Faso) (Deredjian et al., submitted).
ACKNOWLEDGMENTS
EC2CO projects for soil sampling.
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Conclusions
Dans la deuxième partie de ce chapitre, nous avons mis en évidence une grande diversité
intra-spécifique des déterminants merA. En effet, 9 déterminants différents ont été obtenus au
sein de la collection de souches de P. aeruginosa et 3 au sein de la collection de souches de S.
maltophilia. Parmi les 9 déterminants présents chez les souches de P. aeruginosa, tous sont
représentés parmi les souches hospitalières alors que seulement 4 sont présents chez les
souches d’origine environnementale, suggérant une diversité plus grande dans
l’environnement hospitalier. En ce qui concerne S. maltophilia, 2 des déterminants sont
présents à la fois chez des souches d’origine clinique et environnementale. Le 3ème
déterminant n’est représenté que par une souche d’origine environnementale.
Nous avons également observé la présence de 2 déterminants communs chez les deux
modèles. Le premier est homologue à celui présent sur le transposon Tn501, largement
distribué dans les communautés bactériennes. Le deuxième présente une homologie avec celui
porté par l’ilot génomique PAGI-2 (Pseudomonas aeruginosa Genomic Island-2), répandu
chez P. aeruginosa. La présence d’ilots de type PAGI-2 a été confirmée par PCR avec des
amorces spécifiques chez des souches d’origine clinique et environnementale de S.
maltophilia, suggérant un échange entre les deux modèles. Cet échange n’est possible qu’à la
condition que les souches partagent la même niche écologique, comme ce peut être le cas
dans les poumons de patients atteints de mucoviscidose. En revanche, la recherche simultanée
des 2 modèles dans des échantillons environnementaux est rare et nous avons pu constater
lorsque nous avons recherché les 2 espèces dans les mêmes échantillons de sols que seule S.
maltophilia était détectable. De ce fait, il est plus difficile d’envisager un échange génétique
entre ces 2 espèces dans l’environnement, en particulier dans les sols.
Enfin, une association entre la présence d’un déterminant merA homologue à celui présent sur
PAGI-2 et un profil particulier de résistance aux antibiotiques a été mise en évidence chez les
souches d’origine hospitalière de P. aeruginosa. Nous avons pu confirmer la présence d’un
ilot génomique de type PAGI-2. Toutefois, cet ilot n’est pas connu dans la littérature pour être
responsable de résistance aux antibiotiques (Larbig, et al., 2002, Klockgether, et al., 2007) et
l’hypothèse de co-résistance reste à confirmer.
Nous sommes bien conscient que les travaux présentés dans cette section ne sont pas
suffisants à démontrer des phénomènes de co-résistance mercure / antibiotiques, ni même les
échanges d’éléments génétiques mobiles entre les deux modèles. De plus la méthodologie
- 239 -
utilisée ne permet pas d’écarter de façon définitive l’absence de co-résistance, en particulier
chez les souches de S. maltophilia qui présentent fréquemment des résistances aux
antibiotiques. Cependant, les résultats obtenus ont permis d’identifier certaines pistes qui
nécessiteront des travaux ultérieurs tels que la recherche des déterminants génétiques à
l’origine des phénotypes de résistance aux antibiotiques particuliers retrouvés chez les
souches hospitalières de P. aeruginosa ainsi que la mise en évidence de lien avec l’ilot
génomique et les déterminants codant pour la résistance au mercure.
- 240 -
In the second part of this chapter, we highlighted a high intra-specific diversity of merA
determinants. Nine different determinants were obtained among P. aeruginosa strains and 3
among S. maltophilia strains. Among the 9 determinants present in P. aeruginosa strains, all
were represented among hospital strains since only 4 were also present in environmental
strains, suggesting a higher diversity in the hospital environment. Concerning S. maltophilia,
2 determinants were present in both hospital and environmental strains. The third determinant
was only present in one environmental strain.
We also observed two common determinants among strains of the two models. The first one
was homologous to the one present on the Tn501, widely distributed in microbial
communities. The second one presented homology to the determinant present on the PAGI-2
genomic island, widespread in P. aeruginosa strains. Presence of PAGI-2 like genomic island
was confirmed by PCR with specific primers in both environmental and hospital strains of S.
maltophilia, suggesting an exchange between the two species. This exchange is only possible
if strains share the same ecological niche as it can be the case in the lungs of CF patients.
However, the simultaneous search of the two models in environmental samples is rare and we
observed when we looked for both species in the same soil samples that only S. maltophilia
was present. Thus, it is more difficult to consider a genetic exchange between these two
species in the environment, especially in soils.
Finally, one association between a merA determinant homologous to the one present on
PAGI-2 and a particular antibiotic resistance profile was highlighted in hospital strains of P.
aeruginosa. We confirmed the presence of a PAGI-2 like genomic island (Larbig, et al., 2002,
Klockgether, et al., 2007). However, this island is not known as responsible to antibiotic
resistance and the hypothesis of co-resistance remains to be confirmed.
We are aware that the results presented in this section are not sufficient to demonstrate
antibiotic and mercury co-resistance phenomena as well as genetic exchange between the two
models. Moreover, the methodology used here does not enable to confirm the absence of co-
resistance especially in S. maltophilia strains that present high antibiotic resistance capacity.
However, these results enable to identify tracks that will require further works such as the
research on genetic determinants implicated in the particular antibiotic resistance phenotypes
observed in P. aeruginosa hospital strains as well as their links with genomic island and
mercury resistance determinants.
- 241 -
- 242 -
Chapitre 3 : Effet des contaminations métalliques et organiques sur la
sélection et le maintien de résistances dans la communauté microbienne
indigène du site de Pierrelaye
Chapter 3: Effect of metallic and organic contaminations on the selection

and maintenance of resistances in the indigenous microbial community of
the site of Pierrelaye
- 243 -
- 244 -
Introduction
Dans la première partie du chapitre précédant, nous avons constaté que les populations de S.
maltophilia présentes dans les sols français présentaient peu de résistance aux antibiotiques et
aux métaux et cela malgré la présence de pression sélective telles que de fortes concentrations
en métaux dans le site de Pierrelaye. Ainsi, la pression métallique ne favoriserait pas
l’émergence de résistance aux antibiotiques chez cette espèce. On peut alors se demander si
cette observation est une particularité de cette espèce ou bien si c’est le fait d’une faible
disponibilité des métaux qui se retrouvent piégés dans la matière organique également
présente en grande quantité dans les sols de ce site. Pour répondre à ces interrogations, nous
avons choisi de nous intéresser à la résistance aux métaux et aux antibiotiques de façon plus
globale en étudiant l’ensemble de la communauté bactérienne indigène du site de Pierrelaye.
Cette étude a eu pour objectifs i) d’évaluer l’effet de contaminations anthropiques sur la
sélection et le maintien des résistances aux antibiotiques et aux métaux au sein de la
communauté bactérienne, ii) d’identifier les espèces présentant des capacités de résistance
importantes iii) et enfin de rechercher la présence de déterminants génétiques impliqués dans
la résistance aux antibiotiques largement répandus dans le milieu hospitalier. Pour cela, nous
avons évalué la proportion de la microflore hétérotrophe totale résistante d’une part à des
antibiotiques utilisés de façon courante dans le milieu hospitalier : la gentamicine appartenant
à la famille des aminoglycosides, l’imipénème appartenant à la famille des -lactamines et la
ciprofloxacine appartenant à la famille des quinolones ; et d’autre part résistante aux métaux :
zinc, cadmium et mercure. Les isolats représentant les différents morphotypes présents dans
les communautés résistantes ont été identifiés après séquençage du gène codant pour l’ARNr
16S par recherche d’homologie avec l’outil informatique GenBank BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). La présence de gènes de résistance aux antibiotiques portés
par des éléments génétiques mobiles tels que ant(2’’)-I (ou aadB) et aac(6’)-II/Ib (ou aacA4)
à l’origine de la résistance aux aminoglycosides et blaIMP et blaVIM à l’origine de la résistance
aux carbapénèmes ( -lactamines), fréquemment identifiés dans des isolats cliniques a été
recherchée par PCR au sein des isolats résistants ainsi que dans l’ADN total extrait des sols.
De même, les gènes responsables de la résistance au mercure étant également souvent
positionnés sur des éléments génétiques mobiles, nous avons recherché la présence du gène
merA, codant pour la mercurique réductase, avec des amorces spécifiques des bactéries à
Gram négatif, chez les isolats Gram négatif ainsi que dans l’ADN total extrait des sols.
- 245 -
In the first part of the previous chapter, we observed that S. maltophilia strains isolated from
French sites showed little antibiotic and heavy metal resistance despite the presence of
selective pressure as high heavy metal concentration in the site of Pierrelaye. Heavy metal
pressure would not favour the emergence of antibiotic resistance in this species. We can
wonder if it is a particularity of this species or if it is due to a low availability of the heavy
metals that could be linked to exogenous organic matter, present in high quantity in this site.
To answer these questions, we focused on heavy metal and antibiotic resistance capacities in
the indigenous community of the site of Pierrelaye.
This study aimed at i) evaluating the impact of anthropogenic contaminations on the selection
and maintenance of heavy metal and antibiotic resistance in the microbial community, ii)
identifying species that present elevated resistance capacities and finally iii) evaluating the
prevalence in the community of genetic determinants implicated in antibiotic resistance
widespread in the hospital. To do that, we evaluated the proportion of the total heterotrophic
microflora resistant to antibiotics routinely used in hospitals, i) gentamicin belonging to the
aminoglycoside family, ii) imipenem belonging to the -lactam family and iii) ciprofloxacin
belonging to the quinolone family. We also looked at the proportion of the total heterotrophic
microflora resistant to the heavy metals zinc, cadmium and mercury. Isolates representative of
the different morphotypes present in the resistant communities were identified by sequencing
the 16S rRNA encoding gene and further search for homology with GenBank BLAST
software (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). The presence of antibiotic resistance genes carried
by mobile genetic elements as ant(2’’)-I (or aadB) and aac(6’)-II/Ib (or aacA4) implicated in
aminoglycoside resistance and blaIMP and blaVIM implicated in carbapenem ( -lactams)
resistance and frequently found in clinical isolates was investigated by PCR in the resistant
isolates as well as in the total soil DNA. Similarly, merA gene, encoding the mercuric
reductase was also looked for, as mercury resistance genes are often present on mobile
elements, using primers specific of Gram negative bacteria in Gram negative isolates and in
soil DNA.
- 246 -
“Detection of bacterial opportunistic pathogens among the antibiotic and heavy metal
resistant isolates from a chronically heavy metal contaminated soil”
Amélie Deredjian*, Céline Colinon, Elisabeth Brothier, Sabine Favre-Bonté, and Sylvie
Nazaret

Short running title: Antibiotic and heavy metal resistance in soil bacterial communities
Key-words: antibiotic and heavy metal resistance, heavy metal contamination, bacterial
communities, soil, opportunistic pathogens
*
- 247 -
ABSTRACT
Toxic compound contaminations due to anthropogenic activities are suspected to play a role
in the selection, the maintenance and the spread of antibiotic resistant bacteria and antibiotic
resistance genetic determinants in the environment. Here we aimed at evaluating the role of
heavy metal contamination on the selection of antibiotic resistant populations in soils from the
Pierrelaye Bessancourt Plain (Val d’Oise, France) which had been irrigated with the non-
treated wastewater from Paris during a century. Even if the highest antibiotic resistant bacteria
effectives were found in highly contaminated sites, we failed to find an association between
heavy metal contamination and antibiotic resistant bacteria prevalence. Low heavy metal
resistance capacity of the total heterotrophic microflora suggested that the heavy metals were
non available for the bacterial community, probably due to the presence of high concentration
of organic matter that links to heavy metals. Identification of imipenem, gentamicin and
ciprofloxacin resistant bacteria showed a low diversity in the antibiotic resistant community
and the belonging of these bacteria to genera and species that are qualified as opportunistic
pathogens frequently implicated in nosocomial infections as S. maltophilia, Bacillus spp. or
Streptomyces spp. Moreover, research of antibiotic resistance genes essentially found in
clinical isolates showed the presence in a highly contaminated soil of a blaIMP variant,
implicated in carbapemen resistance, suggesting that environmental conditions present in this
soil could maintain this gene. The results presented here suggested that opportunistic
pathogens are widespread in the environment and contaminations due to anthropogenic
activities could lead to their spread. Moreover, presence of antibiotic resistance determinants
could favor the emergence of multi-resistant isolates of public health concern.
- 248 -
INTRODUCTION
Since their discovery, antibiotics have been used to limit bacterial infections and have been
considered as the most effective therapy used by Human beings. However, the last decades
have seen the emergence and dispersion of resistant bacteria increasing, leading to difficulties
to find effective treatments (Wright, 2007). The mechanisms and genetic determinants
implicated in these resistances are the subject of numerous studies (Levy & Marshall, 2004,
Walsh, 2005) and it is now accepted that excessive and inadequate antibiotic use in hospital
has played the role of pressure favoring the selection, the maintenance and the dispersion of
antibiotic resistant isolates (Slama, 2008). However, efforts to reduce antibiotic use have only
a slight effect in the limitation of resistance expansion (Cook, et al., 2004). This observation
leads to an increasing interest in antibiotic resistance in the environment and the putative
selective pressures involved in antibiotic resistance emergence and maintenance. Antibiotic
resistance has been found in a variety of environments from soil (Riesenfeld, et al., 2004) to
water and sediments (Kummerer, 2009). Especially, soil is considered as a reservoir of
determinants which can potentially be mobilized into the microbial community and the
resistome corresponding to all the genetic determinants implicated in antibiotic resistance in
soils, has recently been described (D'Costa, et al., 2006). Moreover, bacteria known as
environmental isolates are increasingly found being responsible for nosocomial infection and
join the already long list of opportunistic pathogens (Martinez & Baquero, 2002). The success
of the adaptation of these bacteria in the hospital environment could be partly related to their
antibiotic resistance capacities (McGowan, 2006).
The presence of antibiotic resistance in the environment, especially in pristine environments,
could be explained by the presence of antibiotics due to the presence of antibiotic producers in
the microbial community. These producers also have the capacity to resist to the produced
molecules and such mechanisms could be acquired and selected by other bacteria of the
community to compete with the producers. Antibiotic contamination due to anthropogenic
activities as well as the presence of bacterial toxicants may participate to the selection of
resistance (Martinez, 2009). For instance several studies highlighted that microbial
communities were more resistant to antibiotics in environments contaminated with heavy
metals or organic compounds (Filali, et al., 2000, Matyar, et al., 2008, Kaszab, et al., 2009).
In presence of heavy metals, antibiotic resistance may be co-selected with heavy metal
resistance in three ways (Baker-Austin, et al., 2006): i) co-resistance occurred when resistance
determinants are present on the same mobile element as plasmid or transposon, ii) cross
- 249 -
resistance occurred when the same mechanism enables both resistance and iii) co-regulation
occurred when the same regulation system is involved in the regulation of both resistance
mechanisms. Since contaminated environments can be enriched in antibiotic resistance
determinants and since opportunistic bacterial pathogens are widespread in the environment
and performed well in the colonisation of the hospital due to their resistance to antibiotics,
these species are good candidates for the acquisition and dissemination of antibiotic resistance
from contaminated environments.
In previous works we demonstrated the extensive distribution of the opportunistic bacterial
pathogen Stenotrophomonas maltophilia (Deredjian et al., submitted) in soils from various
geographical origins and exposed to various anthropogenic constraints. Surprisingly, isolates
from a highly heavy metal contaminated soil showed low antibiotic and heavy metal
resistance capacities in comparison with clinical strains or environmental strains from
uncontaminated sites in Tunisia and Burkina Faso. To explain these observations we
hypothesized that heavy metals were unavailable to the indigenous bacteria due to intrinsic
soil characteristics (i.e., high content of organic matter that traps heavy metals, leading to the
lack of pressure for the selection of heavy metal and/or antibiotic resistance). Then in the
absence of selective pressure resistance to heavy metals and/or antibiotic, was not stimulated
within the whole bacterial community. To address that point we undertook a study on the
indigenous soil bacterial communities of this site (Pierrelaye Bessancourt Plain, Val d’Oise,
France), an agricultural plain which had been irrigated with the non-treated wastewater of
Paris during a century). We evaluated the prevalence of heavy metal resistant bacteria as well
as the prevalence of bacteria resistant to different wide spectrum antibiotics frequently used to
treat clinical infections i.e. gentamicin (aminoglycoside), imipenem ( -lactam), ciprofloxacin
(quinolone). The site of Pierrelaye is contaminated with several heavy metals including
mercury, cadmium, zinc, and lead. We focussed our attention on mercury resistance since
mercury resistance determinants are frequently present on mobile genetic element, potentially
associated with antibiotic resistance determinants (Liebert, et al., 1999), as well as on
cadmium and zinc resistance since genetic determinants as the czc operon encoded efflux
pump has been shown to co-regulate heavy metal and antibiotic resistance in the opportunistic
pathogen Pseudomonas aeruginosa (Perron et al., 2004).
- 250 -
Study site and sample collection

The Pierrelaye study area, one irrigation plot in the plain of Pierrelaye–Bessancourt, is located
about 24 km northwest of Paris, covering a surface of 15 ha. According to Baize et al. (2002),
this site was amended for 102 years with the municipal wastewater of Paris and used for
monoculture of grain maize over the 30 last years. In the middle of 1960 this area was also
amended with urban sludge and smut compost. Since the past 20 years soil has been irrigated
from wastewater from a treatment plant system. The soil is a sandy neoluvisoil typical from
the Seine alluvial valley presenting a high percentage of sand and a neutral pH (Table 17).
Twenty-four samples were collected in three areas chosen according to their level of heavy
metal contamination. Three plots were considered as control, i.e. nearby field never irrigated
with wastewater. Five sampling per plots composed one sample. At the time of sampling, soil
was either uncovered or planted with corn.
Table 17. Physicochemical characteristics of soil samples from the Pierrelaye-Bessancourt

plain.
Soil Cd Pb Zn clay Silt Sand pH water Organic
samples mg kg-1 mg kg-1 mg kg-1 % % % carbon %
Control 0.34 37 57 11.8 12.3 75.9 8.33 1.98

Control 0.25 34 65 7.5 10.9 81.6 8.23 1.39
Control 0.94 95 178 9.8 14.8 75.4 8.09 2.29
4 1.7 188 464 10.7 16.9 72.5 7.23 2.78
5 3.9 447 979 6.2 14.2 79.6 7.43 3.51
6 7.2 521 1326 9.1 17.9 73 7.41 5.22
7 2.4 506 1336 5.8 11.1 83.2 7.39 2.93
8 3.0 202 491 6.3 12.3 81.2 7.4 3.01
9 1.8 283 715 7 11.4 81.6 7.65 1.97
10 1.7 224 465 6.1 10.6 83.3 7.42 2.12
11 34 295 814 6.9 12.3 80.8 7.33 2.59
12 5.9 274 697 9.6 17 73.4 7.47 2.76
13 2.2 129 327 8.9 12 79.2 7.73 1.71
14 1.3 130 240 7.2 10.1 82.7 7.49 1.45
15 2.1 158 401 5.6 6.3 88.1 7.19 1.73
19 1.2 141 220 12.2 13.1 74.7 7.86 3.18
21 1.3 117 271 11.1 10.8 78.1 7.73 2.54
22 2.5 410 574 nd nd nd 7.62 8.2
23 2.8 383 622 nd nd nd 7.63 9.8
24 2.9 406 592 nd nd nd 7.59 7.41
nd: not determine
- 251 -
Enumeration and isolation of heterotrophic bacteria from soil samples
The total heterotrophic microflora was enumerated on TSA1/10 (Tryptic Soy Agar diluted ten
fold) (Oxoïd, Dardilly, France) media supplemented with an anti-fungal agent (cycloheximide
200 mg l−1 final concentration). The resistant heterotrophic microflora was enumered on
TSA1/10 supplemented with cycloheximide (200 mg l−1) and antibiotic, or heavy metal. The
following antibiotics were tested: the -lactamine imipenem at the final concentration of 32
mg l−1, the aminoglycoside gentamicin at the final concentration of 32 mg l−1and the
quinolone ciprofloxacin at the final concentration of 4 mg l−1. High concentrations were
chosen in order to select resistance and not tolerance to the tested antibiotics. Mercury
resistance was determined by adding HgCl2 at the final concentration of 10 μM, cadmium by
adding CdCl2 at the final concentrations of 0.1, 0.5, and 1.25 mM and zinc by adding ZnCl2 at
the final concentrations of 0.5, 3 and 10 mM. Bacterial cells were extracted by blending 5 g of
soil with 50 ml of a saline solution (NaCl 0.8%) for 90 s in a Waring Blender (Eberbach
Corporation, New Hampshire, USA). Extractions were performed in triplicates. Homogenized
soil suspensions were serially diluted in sterile saline solution, and 100 μl of the 10-3 to 10−5
dilutions were spread on the agar plates for the total heterotrophic microflora and the 10-1 or
10-2 dilutions on the agar plates for the resistant heterotrophic microflora. In all cases, three
plates were inoculated per dilution. Bacterial colonies were counted after 3 and 5 days of
incubation at 28°C.
Identification and antibiotic and heavy metal resistant phenotypes of resistant

population
Eleven or twelve isolates obtained from the 3 soil samples collected in the plots 22, 23 and 24,
were chosen for each condition of growth with agar media supplemented with antibiotic or
mercury (TSA1/10 + Hg2+, TSA1/10 + imipenem, TSA1/10 + gentamicin, TSA1/10 +
ciprofloxacin). Isolates were selected to represent different colony morphotypes. Due to the
low colony diversity each morphotype is represented twice to four times. Forty five isolates
were identified by phylogenetic analysis of their complete 16S rRNA gene sequences using
GenBank BLAST. The isolates were tested for their resistance to other compounds by plating
them on TSA1/10 agar supplemented with the different antibiotics or mercury at the same
concentration used to identify resistant heterotrophic bacteria (i.e.: imipenem 32 mg/l,
gentamicin 32 mg/l, ciprofloxacin 4 mg/l and mercury 10 μM). Plates were incubated at 28°C
during 3 to 5 days. Isolates presenting the capacity of growing on the supplemented medium
as well as the medium without supplement were considered as resistant, isolates presenting a
- 252 -
lower growth was considered to present an intermediate capacity of resistance and isolates
presenting no capacity of growing on the supplemented medium was considered as sensitive.
Resistance genes amplification

We looked for the presence of antibiotic and mercury resistance encoding genes by PCR
amplification with specific primers (Table 18). Two primer pairs were used to amplify some
of the most found aminoglycoside modifying enzymes (AME) in clinical isolates, enabling
resistance to gentamicin: ant(2’’)-I (or aadB) and aac(6’)-II/Ib (or aacA4). Two primer pairs
were used to amplify the metallo- -lactamase (MBL) encoding genes blaIMP and blaVIM
variants, which enabling resistance to imipenem. These genes were screened because of their
high prevalence in bacteria implicated in infection in the hospital and their frequent position
on mobile element as integrons, transposons or plasmids, facilitating their dispersal among
(opportunistic) pathogenic bacteria of different species or genera. The presence of the gene
encoding the mercuric reductase named merA specific of Gram negative bacteria was also
search by PCR amplification. PCR amplification was tested on both isolates and soil DNA.
The total DNA from soil samples was extracted using the fast DNA® SPIN for soil kit (MP
Biomedicals), according to the manufacturer instructions. The following PCR cycles was
used: an initial denaturation step is done at 94°C during 4 min. This first step is followed by
30-35 cycles of 30 sec-1 min denaturation at 94°C, 30 sec-1 min of primer annealing at
variable temperature (see table 18), 30 sec-1 min of primer extension at 72°C. Finally, a final
extension was done during 8 min at 72 °C. The PCR were carried out in a 50 μl reaction
mixture containing 2,5 U of Taq polymerase (Q-biogen), 1X reaction buffer containing MgCl2
(Q-biogen), 20 mM dNTP, 0,5 μM of each primers, 1 μl of cell lysate or 50 ng of soil DNA;
1,25 μg of T4 gene 32 protein was added when soil DNA was tested. Amplification was
verified by 2 % agarose gel electrophoresis.
Table 18. Primers used in this study.
Amplified Product Tm
genes Primer Name Primer Sequence 5' 3' Size (°C) Reference
ant(2’’)-I Fant TGGGCGATCGATGCACGGCTRG 428 58 Heuer et al., 2002
Rant AAAGCGGCACGCAAGACCTCMAC
aac(6’)-II/Ib Faac6 CACAGTCGTACGTTGCKCTBGG 235 58 Heuer et al., 2002
Raac6 CCTGCCTTCTCGTAGCAKCGDAT
blaimp IMP-DIA/f GGAATAGAGTGGCTTAATTCTC 361 52 Miggliavacca, et al., 2002
IMP-DIA/r GTGATGCGTCYCCAAYTTCACT
blavim VIM-DIA/f CAGATTGCCGATGGTGTTTGG 523 52 Lombardi et al., 2002
VIM-DIA/r AGGTGGGCCATTCAGCCAGA
- 253 -
Cloning and sequencing amplified fragments
Amplified fragments corresponding to one single band on gel electrophoresis were purified
using the Minielute PCR purification kit (Qiagen) and amplified fragments associated to
several bands on gel electrophoresis were purified using the QiaexII gel extraction kit
(Qiagen). The purified PCR products were ligated in a pGEM-T easy vector (Promega) and
transformed in Escherichia coli DH5 (Invitrogen), according to the manufacturer
instructions. Correct insertion in the plasmid was verified by PCR amplification using the
M13 primers specific to the vector. The amplified fragments were sequenced and the
sequences were phylogenetically analysed using GenBank BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
RESULTS
Prevalence of antibiotic and mercury resistant bacteria in the total heterotrophic

microflora
Total heterotrophic microflora counts varied between 0.4 +/- 0.04 x 107 colonies forming unit
(cfu) g-1 of soil in the soil 17 and 8.2 +/- 1.1 x 107cfu g-1 of soil in the soil 4 (Figure 38).
These variations were independent of the level of contamination of the soils. Spreading soil
suspensions on agar media with cadmium at 1.25 mM or 0.5 mM did not lead to the isolation
of resistant bacteria. Similarly no colonies were obtained with zinc added at a final
concentration of 3 or 10 mM. Enumeration on the lowest concentrations of cadmium (0.1
mM) or zinc (0.5mM) evidenced almost no difference with the enumeration on agar media
without metal since colonies represent at least 10% of the total heterotrophic bacteria in the
contaminated and non contaminated soil samples.
The level of antibiotic and mercury resistant heterotrophic microflora varied between soils
(Figure 39). The highest prevalences of resistance were observed in the most contaminated
soils. In control plots, i.e. non contaminated soils, gentamicin resistant heterotrophic
bacterium counts varied from 0.3 +/- 0.5 to 18.7 +/- 6 x 103 cfu g-1 of soil in soils 3 and 1
respectively, representing from 0.002 to 0.16 % of the total heterotrophic microflora. In
contaminated plots, resistant heterotrophic bacterium counts varied from 3.4 +/- 0.5 to 95.7
+/- 19.8 x 103 cfu g-1 of soil in soils 24 and 6 respectively, representing from 0.005 to 0.5 % of
the total heterotrophic microflora. Half of the contaminated plots presented a proportion of
resistant heterotrophic bacteria lower than the one present in control plots.
- 254 -
10
Total Heterotrophic Microf lora
9
8
cfu x 10 7/g of dry soil
7
6
5
4
3
2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Soils
Figure 38. Numbers (colony forming unit g-1) of viable heterotrophic bacteria in soil
samples.
- 255 -
A Gentam ic in res is tant
500
Im ipenem res is tant
cfu x 103/g of dry soil
400 Ciproflox ac in res is tant
300
200
100
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
B 4 S oils
Gentamicin resistant
3,5
Imipenem resistant
3 Ciprofloxacin resistant
2,5
2
1,5
1
0,5
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
C 400 Soils
Mercury resistant
350
cfu x 103/g of dry soil
300
250
200
150
100
50
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
D 1,8 Soils
M erc ury resistant
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
S oils
Figure 39. Numbers (colony forming unit g-1) of antibiotic (A) and Hg (C) heterotrophic
resistant bacteria in soil samples and proportion (%) of resistant bacteria in the total
heterotrophic microflora (B and D).
- 256 -
In control plots, imipenem resistant heterotrophic bacterium counts varied from 0.7 +/- 0.5 to
23.7 +/- 4.6 x 103 cfu g-1 of soil in plots 3 and 1 respectively, representing from 0.004 to 0.2 %
of the total heterotrophic microflora. In contaminated plots, resistant heterotrophic bacterium
counts varied from 11.3 +/- 1 to 170.3 +/- 14.7 x 103 cfu g-1 of soil in soils 23 and 4
respectively, representing 0.01 to 0.9 % of the total heterotrophic microflora. Heigt plots
presented a proportion of resistant heterotrophic bacteria lower than the one present in control
plots. Two control plots (2 and 3) were devoid in ciprofloxacin resistant heterotrophic
microflora. Soil 1 contained 7 +/- 0.8 x 103 cfu g-1 of soil. In contaminated plots, resistant
heterotrophic bacterium counts varied from 1.2 +/- 0.4 to 500 x 103 cfu g-1 of soil in soils 24
and 8, respectively, representing from 0.002 to 3.5 % of the total heterotrophic microflora.
Only 4 soils presented a proportion of resistant heterotrophic bacteria lower than the one
present in control plots. We also observed that contaminated soil 20 was devoid of
gentamicin, imipenem and ciprofloxacin resistant heterotrophic bacteria and soil 17 was
devoid of gentamicin and imipenem resistant heterotrophic bacteria.
Regarding mercury resistance, we observed in control soils that mercury resistant
heterotrophic bacterium counts varied from 0 to 6.7 +/- 0.5 x 103 cfu g-1 of soil in soil 1 and 3,
respectively, representing from 0 to 0.05 % of the total heterotrophic microflora. In
contaminated plots, mercury resistant heterotrophic bacterium counts varied from 1.7 +/- 0.5
to 341.1+/- 1 x 103 cfu g-1 of soil in plots 16 and 22, respectively, representing 0.02 and 0.4 %
of the total heterotrophic microflora. The highest proportion of mercury resistant
heterotrophic bacteria (1.6 %) was found in soil 14. Only 4 soils presented a proportion of
resistant heterotrophic bacteria lower than the one present in control plots.
Identification of resistant bacteria

Among the 45 selected isolates, 24 were Gram positive bacteria and 21 were Gram negative
bacteria (Figure 40). The homology with the closest relatives in GenBank ranged from 95 to
100 %. Twelve bacterial genera were found, representing the total diversity of resistant
bacteria. Gram positive bacteria were represented by 4 genera: Arthrobacter (A.
nitroguajacolicus (2 isolates), A. aurescens (1), Arthrobacter sp. (6)), Bacillus (B.
megaterium (8), Bacillus sp.(1)), Streptomyces (Streptomyces sp. (5)) and Microbacterium
(Microbacterium sp.(1)).
- 257 -
1 1
1
2 Arthobacter (A. nitroguajacolicus (2), A. aurescens (1),
9 Arthrobacter sp. (6))
Bacillus (Bacillus sp.(1), B. megaterium (8))
3 Gram positive
Streptomyces sp.
Microbacterium sp.
3 Stenotrophomonas (S. rhizophila (3), S. maltophilia (2),

Stenotrophomonas sp.(1))
Variovorax paradoxus
Flavobacterium sp.
4 Pedobacter sp.
9 Gram negative
Pseudomonas (Pseudomonas sp., P. putida)
Chryseobacterium sp.
Ralstonia eutropha
6
Sphingobacterium sp.
1 5
Figure 40. Identification of selected resistant isolates.
Table 19. Diversity of resistant bacteria.
Ciprofloxacin Gentamicin Imipenem Mercury

resistant resistant resistant resistant
Arthrobacter 9 - - -
Bacillus - - - 9
Streptomyces - - 5 -
Microbacterium 1 - - -
Stenotrophomonas - - 6 -
Variovorax - 4 - -
Flavobacterium - 3 - -
Pedobacter 2 1 - -
Pseudomonas - - - 2
Chryseobacterium - 1 - -
Ralstonia - 1 - -
Sphingobacterium - 1 - -
- 258 -
Gram negative bacteria were represented by 8 genera: Stenotrophomonas (S. rhizophila (3
isolates), S. maltophilia (2), Stenotrophomonas sp. (1)), Variovorax (V. paradoxus (4)),
Flavobacterium (Flavobacterium sp. (3)), Pedobacter (Pedobacter sp. (3)), Pseudomonas (P.
putida (1), Pseudomonas sp. (1)), Chryseobacterium (Chryseobacterium sp. (1)), Ralstonia
(R. eutropha (1)), and Sphingobacterium (Sphingobacterium sp. (1)). However, this diversity
did not reflect the diversity obtained for each condition (Table 19). The diversity of
gentamicin resistant bacteria was the highest with 6 genera: Variovorax (6 isolates),
Flavobacterium (4), Pedobacter (1), Chryseobacterium (1), Ralstonia (1), and
Sphingobacterium (1). Ciprofloxacin resistant bacteria were represented by 3 genera:
Arthrobacter (9 isolates), Pedobacter (2), Microbacterium (1). Imipenem resistant bacteria
were represented by 2 genera: Streptomyces (5 isolates) and Stenotrophomonas (6). Mercury
resistant bacteria were also represented by 2 genera: Bacillus (9 isolates) and Pseudomonas
(2) (Table 19).
Multi-resistant bacteria
Most of the isolates (99.4 %) were able to grow in presence of several toxicants (i.e.
antibiotics: imipenem, gentamicin, ciprofloxacin and mercury). Only 3 isolates (0.6 %) grew
only on their original medium: TSA1/10 + 10 μM Hg2+. Five isolates (11 %) were able to
grow in presence of 2 toxicants, 18 isolates (40 %) were able to grow in presence of 3
toxicants and 19 isolates (42.2 %) were able to grow in presence of the 4 tested toxicants.
However, full multi-resistance, was less frequent. Nine isolates were resistant to 2 toxicants
(Table 20). These isolates belonged to the Arthrobacter (3 isolates), Variovorax (2),
Pedobacter (2) and Streptomyces (2) genera. The most frequent association was resistance to
gentamicin and ciprofloxacin (in 4 isolates) but resistance to ciprofloxacin and mercury,
ciprofloxacin and imipenem, gentamicin and imipenem, imipenem and mercury were also
observed. Seven isolates were resistant to 3 toxicants and belonged to the Arthrobacter (1
isolate), Pedobacter (1), Variovorax (1) and Stenotrophomonas (4). All the possible
associations were observed. One Isolate was resistant to the 4 tested toxicants and was
identified as Stenotrophomonas sp.
- 259 -
Table 20. Multi-resistance in the selected resistant isolates.
Number of multi-
Multi-resistance Type of resistances Identification
resistant bacteria
2 resistances CIP/Hg2+ 1 A. nitroguajacolicus
CIP/IPM 1 Pedobacter sp.
A. aurescens, V. paradoxus, Pedobacter
CIP/GEN 4 sp., Arthrobacter sp.
GEN/IPM 2 V. paradoxus, Streptomyces sp.
2+
IPM/Hg 1 Streptomyces sp.
2+
3 resistances CIP/GEN/Hg 2 A. nitroguajacolicus, Pedobacter sp.
2+
GEN/IPM/Hg 2 S. rhizophila, S. maltophilia
2+
CIP/IPM/Hg 1 S. rhizophila
CIP/IPM/GEN 2 V. paradoxus, S. maltophilia
2+
4 resistances CIP/IPM/GEN/Hg 1 Stenotrophomonas sp.
Presence of resistance genes

Presence of gentamicin, imipenem and mercury resistance genes was investigated by PCR
with specific primers in both the isolates and total soil DNA. MerA gene specific to Gram
negative bacterium was found in all the tested soils and in 3 isolates, Ralstonia eutropha,
Stenotrophomonas rhizophila and Pseudomonas putida, which presented the capacity of
growing in presence of mercury salts. No amplification was observed with primers allowing
the amplification of aac(6’)-II/Ib gentamicin resistance and the blaVIM imipenem resistance
genes in both the isolates and the soil DNA. Positive amplification was obtained with primers
allowing amplification of the ant(2’’)-I gentamicin resistance genes in several isolates (6
Arthrobacter and 1 Stenotrophomonas). However, the sequence of amplified fragments did
not correspond to gentamicin resistance gene. Finally, a positive amplification with primers
specific to the blaIMP imipenem resistance gene was obtained in the soil 14. Sequencing and
comparing the amplified sequence to the GenBank database using BLAST tool revealed the
presence in this soil of the blaIMP8 variant (sequence homology = 97 %).
DISCUSSION
Antibiotic resistances are widespread in the environment in response to the presence of

antibiotics due to microbial competition, or anthropogenic activities (Martinez, 2009). Several
- 260 -
studies have already suggested that antibiotic resistance capacities could be elevated in heavy
metal contaminated terrestrial and aquatic environments (Stepanauskas, et al., 2005, Wright,
et al., 2006, Matyar, et al., 2008, Oyetibo, et al., 2009). Here we investigated the prevalence
of antibiotic and heavy metal resistance bacteria among the total heterotrophic microflora in
soil samples of the Pierrelaye-Bessancourt plain (Val d’Oise, France) a chronically
contaminated site. Non-contaminated fields (i.e. not submitted to irrigation with wastewater),
possessing the same geo-chemical characteristics, were sampled and served as control. We
showed that the proportion of antibiotic resistant bacteria within the total heterotrophic
community was variable between the plots, independently of the level of contamination but
the highest prevalence was observed in the most heavy metal contaminated samples (Figure
39A and B). Gentamicin, imipenem and ciprofloxacin resistant heterotrophic bacteria
represented until 0.58 %, 0.9 % and 3.5 % of the total heterotrophic microflora present in
contaminated plots, respectively. However, the results presented here are not sufficient to
affirm that presence of heavy metals in this site was responsible for the selection of antibiotic
resistance. Indeed, several contaminated soils were characterized by proportion of antibiotic
resistant heterotrophic bacteria lower than the one present in control soils. Especially, half of
the soils did not present a proportion of gentamicin resistant heterotrophic bacteria higher than
the one in control plots (0.16 %). Moreover, we failed to find antibiotic resistant heterotrophic
bacteria in the contaminated soil 20 and only ciprofloxacin resistant heterotrophic bacteria
were found in the contaminated soil 17. Absence or low level of antibiotic resistance in these
heavy metal contaminated soils could be due to absence of co-selection to antibiotic and
heavy metal in the indigenous bacterial community, only enabling heavy metal resistance
selection in presence of high heavy metal concentrations. In this case, heavy metal resistant
bacteria would represent a high proportion of the community. Concerning mercury, we
observed that most of the contaminated soils presented higher proportion of resistant
heterotrophic bacteria than control soils, representing until 1.6 % of the total heterotrophic
microflora (Figure 39C and D). However, we were not able to detect zinc and cadmium
resistant heterotrophic bacteria when the highest concentrations of zinc (3 and 10 mM) and
cadmium (0.5 and 1.25 mM) were added to the culture medium. This result was rather
surprising since isolates from heavy metal contaminated sites frequently presented resistance
to higher concentrations (Matyar et al., 2008, Oyetibo et al., 2009). Our results suggested that
heavy metals present in the site of Pierrelaye might not be available for the microbial
community and then did not lead to resistance mechanism selection to survive in presence of
these toxicants. Since organic matter is present in high concentration (Table 17) due to
- 261 -
exogenous sources (added waste contained dioxine, hydrocarbons,...) we hypothesize that
organic compounds entrapped heavy metals making them non available for the microbial
community (Calace & Petronio, 2004, Kumpiene, et al., 2008). Presence of other selective
pressures that could act even at low concentrations, especially antibiotics due to the presence
of producers or anthropogenic intake due to the use of wastewater to irrigate the plots could
participate to the variability observed considering the proportion of antibiotic resistant
bacteria in the different soils of Pierrelaye. Anthropogenic activities could also be responsible
for the increase of resistant bacteria in this site especially by direct intake of resistant isolates
present in non-treated wastewater (Schwartz, et al., 2006, Martinez, 2009).
Forty five resistant isolates were selected from the different supplement agar media and
identified by sequencing their almost complete 16S rRNA gene (i.e. 1400 bp). These isolates
belonged to 12 different genera (Figure 40). Diversity for each toxicant resistant bacteria
group was low (Table 19): only 2 genera represented mercury and imipenem resistant
bacteria, 3 genera represented ciprofloxacin resistant bacteria and 6 genera represented
gentamicin resistant bacteria. Most of the identified genera (or species) are known to be
widespread in the environment for a long time, especially in soil, as Stenotrophomonas spp.,
Arthrobacter spp., Bacillus spp., Streptomyces spp. Within each genus some species are also
known to cause infection in fragilised people and are qualified as opportunistic pathogens.
Among the identified isolates of our study, the Gram positive Arthrobacter and Bacillus
genera were the most represented. Species of the Arthrobacter genus are considered as the
most frequent coryneform bacteria in soil and have been recently identified (in the 1990s) in
clinical samples (Mages, et al., 2008). The most frequently involved in infections are A.
cumminsii, A. oxydans and A. aurescens. The former was detected in our study. It is
interesting to note that the clinical Arthrobacter spp. generally showed little resistance to
antibiotics, except quinolone. No information is available concerning antibiotic resistance
capacity of environmental Arthrobacter. However, all the Arthrobacter sp. we isolated in our
study were selected for their ciprofloxacin (quinolone) resistance. We could hypothesize that
an intrinsic resistance mechanism could be responsible for the quinolone resistance
phenotype. However, to our knowledge, no antibiotic resistance mechanism has been
identified in Arthrobacter spp. All the isolates identified as Bacillus spp., most of them
identified as B. megaterium, were recovered from mercury supplemented agar, suggesting
their high capacity to resist to mercury. This observation was not surprising since the
widespread of the Gram positive specific mer operon among Bacillus species has already been
reported (Bogdanova, et al., 1998). Furthermore, a new mer operon, TnmerRI1 transposon,
- 262 -
has been recently described in a B. megaterium strain (Chen, et al., 2008). Bacillus spp., as B.
megaterium has also been reported as responsible for infection as endocarditis, sepsis or
meningitis, in the hospital (Citron & Appleman, 2006). Therapy of choice to treat these
infections consists of vancomycin, imipenem, gentamicin or ciprofloxacin therapy. The
sensitivity to these antibiotics observed in clinical strains could explain the fact that in our
study, Bacillus spp. were not able to resist to the tested antibiotics (gentamicin, imipenem,
ciprofloxacin). Regarding Streptomyces spp., these species are saprophytic bacteria,
frequently found in soils and well known for their antibiotic production. These bacteria are
also capable of causing infection called mycetomas (tumefaction of soft tissue and bone).
Other invasive infections, as pulmonary or bloodstream infections are rare but occur in
immunocompromised patients (Kapadia, et al., 2007). Little information is available
concerning antibiotic resistance in clinical Streptomyces. Reports of the literature generally
show a high antibiotic sensitivity, but also some resistance to imipenem, clarithromycin,
erythromycin, amoxicillin-clavulanate, trimethoprim /sulfamethoxazole and frequent resistant
to ceftriaxone, ciprofloxacin, and ampicillin are observed. In our study, Streptomyces bacteria
were all recovered from imipenem supplemented agar, suggesting the high capacity of
imipenem resistance of environmental strains. No information is available concerning
imipenem resistance mechanisms in this genus. However species within that genus were the
first to be described as carbapenem producers (Demain, 1991). Stenotrophomonas spp. were
the most frequent resistant gram negative species identified in our study. These species are
known for their versatility and their high capacity of adaptation (Ryan, et al., 2009). Soil,
especially rhizosphere, is considered as a reservoir of Stenotrophomonas species and some of
them are known for their capacity to promote plant growth or their potential use in
bioremediation (Berg, 2009). Within the Stenotrophomonas genus, the species S. maltophilia
is also known as an important opportunistic pathogen, representing the third non fermenting
Gram negative bacterium implicated in nosocomial infections (Jones, et al., 2003) and
increasingly found in cystic fibrosis patients (Razvi, et al., 2009). Sequencing of the genome
of the clinical K279a strain and the environmental R551-3 strain revealed a high intrinsic
resistance capacity due to the presence of a high number of gene implicated in drug resistance
(Crossman, et al., 2008, Taghavi, et al., 2009). Intrinsic resistance in S. maltophilia is due to
the presence of broadly specific efflux pumps such as SmeABC and SmeDEF, two metallo- -
lactamases allowing resistance to imipenem, two aminoglycoside modifying enzymes (AME)
allowing resistance to aminoglycosides and Qnr allowing resistance to quinolones (Sanchez,
et al., 2009). This intrinsic resistance could explain that Gram negative resistant isolates were
- 263 -
identified as Stenotrophomonas spp. However, little information is available on species of this
genus other that S. maltophilia, but our results suggested that some of them, as S. rhizophila
could also have a high capacity of resistance (Table 20). Arthrobacter was also frequently
found as multi-resistant in our study. This result was rather surprising since clinical isolates
seem not highly resistant (Mages, et al., 2008). However, we only tested 3 currently used
antibiotics and a more complete antibiotic susceptibility test need to be done.
The results presented here suggested that anthropogenic activities as irrigation with
wastewater that participate to increase the concentrations of different toxicants as antibiotics,
heavy metals or organic compounds, could favor the emergence, dispersion and / or
maintenance of antibiotic resistant bacteria. Identification of resistant bacteria led to the
conclusion that potentially human opportunistic pathogens species and genera widespread in
soil (i.e. even in non contaminated soil) dominates also resistant bacterial community. The
selective pressure undergone by these isolates could be responsible for their tolerance to
several toxicants. However, “full” resistance and multi-resistance were rare. We observed that
several genera were specifically isolated from one toxicant supplemented agar medium, as
Arthrobacter, Stenotrophomonas or Bacillus, which have been respectively isolated from
ciprofloxacin, imipenem and mercury supplemented agar medium. We can wonder if these
particular resistance capacities were due to intrinsic resistance capacity or to the spread of
mobile genetic element bearing antibiotic resistance determinants. In order to provide some
answer, we searched for the presence of resistance genes by PCR using primers specific of
determinants often present on mobile elements in both the 45 selected isolates and the soil
DNAs. merA encoding mercuric reductase was investigated in Gram negative isolates and in
soils (with primers specific to Gram negative bacteria). This gene was recovered from 3
isolates and all tested soils, in both contaminated and non contaminated soil. This result
confirmed that the mer operon is widespread in the environment, whether mercury is present
or not in high concentrations as previously demonstrated through mer operon diversity studies
(Bruce, et al., 1995, Bruce, 1997, Osborn, et al., 1997). The presence of aminoglycoside
modifying enzyme (AME) and metallo- -lactamase (MBL) encoding genes was also
investigated. Neither ant(2’’)-I or aac(6’)-II/Ib AME types was found in the resistant isolates
as well as in soil DNA. This result was surprising as we chose to research these determinants
because of their occurrence in soil (Heuer, et al., 2002). Other antibiotic resistance
mechanisms could enable aminoglycoside resistance as efflux or membrane impermeability
(Poole, 2004). Moreover, we could not conclude that no AME were present in the investigated
site, as other variants exist as aac(3) types and could also been found in soil, even at a lower
- 264 -
rate. We also observed the absence of the blaVIM encoding metallo- -lactamase (MBL) type
and the presence of a blaIMP8 variant in the contaminated soil 14, in which imipenem resistant
microflora was one of the highest (Figure 39). Acquired MBL, permitting resistance to
carbapemens, are increasingly found in clinical isolates (Walsh, 2005, Gould, 2008). blaIMP
types are predominantly found in Asia, but several strains possessing blaIMP have also been
found in Europe (Walsh, et al., 2005). Only one report presented the recovered of a blaIMP19
variant in a clinical isolate in France (Neuwirth, et al., 2007). This determinant is generally
found in Gram negative bacteria like Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp. and in
Enterobacteriaceae like Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii,
Escherichia coli and Enterobacter spp. (Walsh, et al., 2005). In the environment, presence of
MBL is poorly documented and only one study reports the presence of blaIMP variants in a
highly polluted estuary (Henriques, et al., 2006). To our knowledge, our study is the first
report of the presence of a blaIMP variant in soil, especially in a highly polluted French site.
However, we observed the absence of this variant in all tested isolates, suggesting that
observed imipenem resistance was due to other mechanisms. Among S. maltophilia isolates,
the presence of chromosomically encoded MBL could be responsible for intrinsic imipenem
resistance (Sanchez, et al., 2009).
Presence of such determinants in soil could participate to the emergence of highly resistant
bacteria under selective pressure resulting from anthropogenic activities. As resistant isolates
belonged to genera widespread in soils and some species belonging to these genera were
qualified as opportunistic pathogens, we can wonder if any environmental isolates could
emerge as nosocomial pathogens and if anthropogenic pressure in the environment selecting
both intrinsic and acquired antibiotic resistant isolates could increase the probability of such
isolates to become an opportunistic pathogen.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by the ANR-CES-RESACOR project of the French “Ministère de la
Recherche” and a ADEME/SIAPP project from the Val d’Oise department. A. Deredjian was
funded by a grant from the CNRS. We thank Christian Dron for soil sampling and
physicochemical analysis and Charlyne Lespré for technical assistance in molecular biology.
- 265 -
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negative bacteria. Clin Microbiol Infect 11 Suppl 6: 2-9.
Walsh TR, Toleman MA, Poirel L & Nordmann P (2005). Metallo-beta-lactamases: the
quiet before the storm? Clin Microbiol Rev 18: 306-325.
Wright GD (2007) The antibiotic resistome: the nexus of chemical and genetic diversity. Nat
Rev Microbiol 5: 175-186.
- 269 -
- 270 -
Conclusions
L’originalité de cette étude repose d’une part, sur un échantillonnage des sols réalisé selon un
transect de contamination, avec sur le même site des parcelles présentant des niveaux de
contamination variables en fonction des métaux du fait de l’utilisation des eaux usées non
traitées de la ville de Paris pendant près d’un siècle ; ainsi que des parcelles non contaminées
n’ayant pas subi l’irrigation avec les eaux usées et présentant des caractéristiques
géochimiques identiques à celles des parcelles contaminées. D’autre part, nous avons
recherché la présence de gènes de résistance préférentiellement retrouvés chez des isolats
cliniques tels que Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium ou encore Vibrio cholerae et
faisant l’objet de peu d’études dans l’environnement.
Les résultats obtenus après dénombrement de la communauté résistante aux antibiotiques des
différents sols n’ont pas suffi à mettre en évidence un rôle des contaminations métalliques
dans la sélection de résistance aux antibiotiques dans les sols contaminés du site de Pierrelaye,
en tout cas pour les antibiotiques testés, i. e. gentamicine, imipénème et ciprofloxacine. En
effet, même si les effectifs les plus élevés ont été obtenus à partir d’échantillons de sols des
parcelles les plus contaminées, nous avons observé dans un certain nombre de parcelles
l’absence de résistance ou des effectifs inférieurs à ceux présents dans les sols témoin (jusqu’à
la moitié des sols en ce qui concerne la gentamicine). De plus, il apparait de plus en plus
probable que les métaux présents dans ces sols ne seraient pas disponibles pour la
communauté bactérienne étant donné que nous n’avons pas détecté de résistants au zinc et au
cadmium lorsque des concentrations pour lesquelles les isolats issus d’environnements
contaminés sont fréquemment résistants étaient ajoutées au milieu de culture. La non
disponibilité des métaux dans ce site serait liée à leur piégeage par la matière organique
présente en grande quantité. Ces composés organiques ont une source exogène (apportés par
l’irrigation aves les eaux usées) et sont caractérisés par un niveau d’humification élevé
entrainant une faible dégradation. L’exception concerne le mercure pour lequel nous avons
observé que la proportion de résistant à 10 μM de Hg2+ pouvait représenter jusqu’à 1,6 % de
la microflore hétérotrophe totale. Les pressions favorisant la sélection de résistance aux
antibiotiques dans ce site sont donc à ce jour, inconnues. Toutefois, la présence
d’antibiotiques, d’une part liée à la production bactérienne et d’autre part, à l’apport lié aux
activités anthropiques menées sur ce site pourrait avoir largement participé à la sélection de
- 271 -
ces résistances. Il serait donc intéressant de mesurer les concentrations en antibiotiques
présentes dans ces sols pour évaluer cette pression. Il est également probable que les activités
menées sur ce site aient été responsables de l’enrichissement des sols en bactéries résistantes
par un apport direct par les eaux usées.
Le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S a conduit à l’identification des isolats
résistants et à l’évaluation de la diversité de ces résistants. Deux à 6 genres bactériens
représentent les communautés résistantes, reflétant une faible diversité. Ces communautés
sont représentées par des genres et des espèces bactériens tels que S. maltophilia,
Streptomyces spp., Bacillus spp., connus pour leur large distribution dans l’environnement, en
particulier dans les sols. De plus, tous les genres et les espèces identifiés sont connus pour
leur implication dans des infections nosocomiales et peuvent être qualifiés de bactéries
pathogènes opportunistes. Chez ces isolats, la tolérance à plusieurs composés toxiques
(antibiotiques et mercure) est fréquente, en revanche, la résistance à plusieurs de ces
composés est plutôt rare. Les isolats les plus fréquemment multi-résistants appartiennent aux
genres Stenotrophomonas et Arthrobacter. Peu d’informations sont disponibles en ce qui
concerne les capacités de résistance de ce dernier de même que concernant les mécanismes
qui pourraient être à l’origine de ces résistances. En ce qui concerne le genre
Stenotrophomonas, seule l’espèce S. maltophilia fait l’objet de nombreuses études. Comme
nous avons pu le constater précédemment, elle est d’ailleurs caractérisée par un grand nombre
de déterminants génétiques permettant une résistance intrinsèque aux composés toxiques.
Toutefois, nous n’avons testé que 3 antibiotiques et ne sommes pas en mesure de parler
réellement de multi-résistances. Il s’agit plutôt d’un moyen de comparer les isolats du site de
Pierrelaye entre eux. Pour évaluer réellement les capacités de multi-résistance de ces isolats, il
faudrait tester un plus grand nombre de molécules. Les antibiogrammes de certains isolats
appartenant au genre Stenotrophomonas ont été établis (VITEK2) et ont montré une
sensibilité à la plupart des molécules, confirmant les faibles capacités de résistance des
souches isolées de ce site par rapport aux souches isolées des autres sites étudiés (résultats
non montrés).
La recherche des gènes de résistance aux aminoglycosides et aux carbapénèmes,
généralement portés par des éléments génétiques mobiles, a été infructueuse chez tous les
isolats. Même si nous n’avons pas recherché tous les déterminants pouvant être à l’origine de
ces résistances, ces résultats suggèrent que les résistances observées seraient plutôt dues à des
mécanismes intrinsèques de résistance. Cette hypothèse pourrait également expliquer
pourquoi on observe si peut de diversité au sein des communautés résistantes. Si les
- 272 -
résistances étaient dues à la présence d’éléments génétiques mobiles, une plus grande
diversité aurait été observée. La recherche de ces gènes dans l’ADN extrait des sols a conduit
à mettre en évidence la présence du gène blaIMP codant pour une métallo- -lactamase présent
dans un sol fortement contaminé. La présence de ce gène, mis en évidence à différentes
reprises dans des clones multi-résistants impliqués dans des épidémies, en particulier en Asie
(Walsh, et al., 2005), n’a fait l’objet que de peu d’études dans l’environnement et n’a été mis
en évidence que dans un site estuarien contaminé (Henriques, et al., 2006). Ainsi, ce gène
pourrait être retrouvé dans des environnements impactés par différentes activités
anthropiques, pouvant être responsables de son introduction et/ou de son maintien, et sa
présence dans les sols pourrait contribuer à augmenter les risques de transmission et
d’acquisition par des souches indigènes du sol, représentant potentiellement un risque de santé
publique.
- 273 -
The originality of this study is based in one hand on a soil sampling conducted according to a
transect of contamination, with in the same site, plots presenting variable level of
contaminations depending on the metals due to the use of non treated wastewater from Paris
during a century, as well as non contaminated soils with geochemical characteristics similar to
the contaminated plots; in the other hand on the search for resistance genes rarely studied in
the environment and preferentially found among clinical isolates as Acinetobacter baumannii,
Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella typhimurium or Vibrio cholerae.
The results obtained after enumeration of the antibiotic resistant community did not enable to
highlight a role of heavy metal contaminations in the selection of antibiotic resistance in the
contaminated soils of Pierrelaye, at least for the tested antibiotics, i. e. gentamicin, imipenem
and ciprofloxacin. Indeed, even if the highest effectives were obtained from samples from the
most contaminated plots, we observed in several contaminated plots, the absence of resistant
bacteria or lower effectives than the ones present in non contaminated plots (half of the plots
for gentamicin). We hypothesize that most of the metals present in these soils is not available
for the bacteria since we failed to detect zinc and cadmium resistant bacteria when
concentrations for which isolates from contaminated sites are frequently resistant were added
to the culture medium. The non-availability of the metals of this site could be due to their
strong adsorption to organic compounds present in high quantity. These organic compounds
are of exogenous sources (brought by irrigation with waste) and are characterized by their
high level of “humification” resulting in a low degradation. The exception concerns mercury
for which we observed that bacteria resistant to 10 μM de Hg2+ could represent up to 1,6 % of
the total heterotrophic microflora. Pressures favoring antibiotic resistance selection in this site
are actually unknown. However, antibiotic presence due to bacterial production and linked to
anthropogenic activities could largely contribute to resistance selection. It would be
interesting to measure antibiotic concentrations present in these soils to evaluate this pressure.
It is also likely that activities on this site could be responsible for the enrichment of resistant
bacteria in soil by direct intake with wastewater.
Sequencing of the 16S rRNA gene led to the identification of the resistant isolates and to the
evaluation of their diversity. From 2 to 6 bacterial genera represented resistant populations,
- 274 -
suggesting a low diversity. These populations were represented by bacterial genera and
species like S. maltophilia, Streptomyces spp., Bacillus spp., known for their wide distribution
in the environment, especially in soils. Moreover, all genera and species identified are also
known for their implication in nosocomial infections and can be qualified as opportunistic
pathogens. In these isolates, tolerance to several toxic compounds (antibiotics and mercury) is
common; however, full resistance to several compounds is rather rare. Multi-resistant isolates
belonged to Stenotrophomonas and Arthrobacter genera. Little information is available
regarding the resistance of the latter as well as on mechanisms that could be responsible to
this resistance. Considering the Stenotrophomonas genus, only S. maltophilia is the subject of
numerous studies. As we previously observed, this species is characterized by high number of
genetic determinants implicated in intrinsic resistance to several toxic compounds. However,
we only tested 3 antibiotics and cannot really talk about multi-resistance. It is just a way to
compare isolates from Pierrelaye to each other. In order to evaluate multi-resistance capacities
of these isolates, a higher number of antibiotic molecules should be tested. Antibiotic
susceptibility tests were done for several isolates belonging to the Stenotrophomonas genus
and showed a sensitive phenotype for most of the tested molecules, confirming the low
resistance capacities of strains isolated from this site comparing to strains from other sites
(data not shown).
We investigated the genes implicated in resistance to aminoglycosides and carbapenems,
known to be frequently found on mobile elements. These genes were absent whatever the
isolates. Even if we do not search all determinants found on mobile elements, this result
suggests that observed resistance could be due to intrinsic resistance. This hypothesis could
also explain the low diversity observed among the resistant populations. If these resistances
were due to the presence of mobile elements, a higher diversity would have been observed.
Search for these genes in DNA extracted from soils led to detection of the blaIMP gene
encoding a metallo- -lactamase, in a highly contaminated soil. This gene is often found in
multi-resistant clones responsible of epidemy, especially in Asia (Walsh et al., 2005), but its
presence is poorly studied in the environment and was only reported in a contaminated
estuary (Henriques et al., 2006). This gene could be found in environments impacted by
anthropogenic activities that could be responsible of its intake and / or maintenance. Its
presence in soils could contribute to increase the risk of acquisition by indigenous strains that
represent a risk in public health.
- 275 -
- 276 -
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
COCLUSIONS AND PERSPECTIVES
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- 278 -
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
L’origine, l’importance et le rôle des résistances aux antibiotiques dans l’environnement ainsi
que les facteurs influençant l’acquisition de ces résistances par les bactéries font actuellement
l’objet de nombreux questionnements. La présence de métaux lourds pourrait notamment
participer à l’acquisition de résistance aux antibiotiques par des phénomènes de co-sélection
de résistance aux métaux et aux antibiotiques (Baker-Austin et al., 2006, Berg et al., 2004).
Les études relatives au rôle des métaux dans cette co-sélection sont majoritairement conduites
à l’échelle des communautés sans tenir compte de la présence de populations particulières
pouvant présenter un intérêt en santé publique. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse était
de mieux appréhender le rôle des contaminations métalliques liées à diverses activités
anthropiques dans les sols sur la co-sélection de résistance aux métaux et aux antibiotiques
chez les bactéries pathogènes opportunistes P. aeruginosa et S. maltophilia.
Une étude préliminaire a été de combler un manque d’informations relatives à la présence, la

distribution et l’abondance de ces modèles dans les sols. En effet, bien que ces bactéries
soient considérées comme ubiquistes et présentes dans un large panel d’environnements, de
telles données sont peu nombreuses et relativement anciennes. Pour mener à bien ce travail,
nous avons choisi d’utiliser deux approches complémentaires : l’une largement utilisée pour
des études épidémiologiques qui implique l’isolement des populations de P. aeruginosa et S.
maltophilia après ensemencement sur des milieux sélectifs, associée à la confirmation de
l’identité des isolats selon des critères phénotypiques et/ou génétiques, et l’autre indépendante
de la culture et reposant sur une détection au niveau de l’ADN extrait directement à partir des
échantillons à analyser. Si l’approche indépendante de la culture est un bon complément à
l’approche cultivable puisqu’elle permet la détection de cellules viables non cultivables et
peut refléter la persistance de l’ADN indépendamment de la survie de cellules intègres, cette
approche telle qu’utilisée dans cette étude s’est révélée peu sensible. L’utilisation de la PCR
quantitative en temps réel serait à envisager car elle montre généralement une plus grande
sensibilité que la PCR classique. Cet outil non disponible au moment de la réalisation de mes
travaux est aujourd’hui disponible au sein de l’équipe BPOE et a fait l’objet d’optimisation et
de calibration pour être utilisé à partir d’échantillons de sols. Son utilisation est en cours sur
les environnements étudiés.
- 279 -
Nos travaux nous ont amené à constater une distribution différente des modèles dans les sols,
confirmant que S. maltophilia serait indigène des sols puisqu’elle a été mise en évidence dans
les sols de tous les sites étudiés alors que P. aeruginosa, présente de façon sporadique dans
les sols étudiés, devrait sa présence à un apport externe par l’eau d’irrigation ou les
amendements organiques (fumier). La présence de contaminants tels que les composés
organiques ou les métaux lourds pourrait favoriser le maintien ou la multiplication de ces
espèces connues pour leur capacité de résistance et de dégradation de molécules organiques.
Nous nous sommes ensuite intéressés aux capacités de résistance aux métaux et aux
antibiotiques des souches environnementales isolées des différents sites étudiés
précédemment et les avons comparées avec celles de souches d’origine hospitalière afin de
mettre en évidence des pressions sélectives favorables à l’acquisition et au maintien de ces
résistances. Nous avons dû pallier à l’absence de P. aeruginosa dans les sols choisis pour leur
niveau supposé de contaminations [Nabeul (Tunisie), Ouagadougou (Burkina Faso) et
Pierrelaye (France)] et avons pour cela élargi notre étude à l’impact d’autres types de
pressions sélectives telles que les hydrocarbures dans les sols, les contaminations multiples
(détergent, molécules organiques) dans les eaux de lagune d’épuration, ou la présence
d’antiseptiques utilisés pour le soin de serpents captifs. La collection de souches
environnementales de S. maltophilia était, quant à elle, constituée des souches provenant de
sites présentant des niveaux de contaminations croissants, déterminés en fonction de la nature
des apports (présence de métaux, molécules organiques) et de la durée d’exposition : le site de
Feucherolles (sols non contaminés en France), le site de Nabeul (sols non contaminés en
métaux lourds irrigués par des eaux potentiellement contaminées en métaux en Tunisie), les
sites de la périphérie de Ouagadougou (sols amendés par des déchets et contaminés en zinc au
Burkina Faso) et le site de Pierrelaye (sols fortement contaminés en métaux et en composés
organiques en France).
Les résultats obtenus ont confirmé que la présence de fortes concentrations en antibiotiques
dans l’environnement hospitalier était la pression majeure responsable de la sélection et du
maintien des résistances aux antibiotiques chez les deux espèces étudiées. A l’exception de ce
point commun, de nombreuses différences ont été mises en évidence entre les deux modèles.
D’une part les souches hospitalières de P. aeruginosa présentent peu de résistance aux métaux
alors que celle de S. maltophilia présentent fréquemment des résistances aux quatre métaux
testés. D’autre part, les souches d’origine environnementale de P. aeruginosa sont pour la
plupart caractérisées par une faible capacité de résistance aux antibiotiques (phénotype
sauvage de résistance) et une importante capacité de résistance aux métaux (surtout Zn et Cd).
- 280 -
Cependant, quelques souches isolées d’environnements particuliers, contaminés en
hydrocarbures ou de serpents captifs ont montré une capacité de résistance à 5 antibiotiques.
Dans tous les cas, nous n’avons pas pu mettre en évidence de co-sélection de résistance aux
métaux et aux antibiotiques. A l’opposé, les souches d’origine environnementale de S.
maltophilia ont montré des capacités de résistance aux métaux et aux antibiotiques variables
en fonction des sites d’isolement. Les souches isolées des sites français de Feucherolles et
Pierrelaye sont peu résistantes, alors que les souches isolées des sites de Nabeul (Tunisie) et
Ouagadougou (Burkina Faso) présentent des capacités de résistance similaires à celles des
souches d’origine hospitalière. La présence de souches présentant des capacités de résistance
aux antibiotiques aussi importantes que celles de souches hospitalières dans l’environnement
peut avoir un impact en santé publique. Toutefois, la réussite de la colonisation du milieu
hospitalier et en particulier de l’infection fait également intervenir d’autres propriétés.
Notamment, il semble indispensable d’évaluer les capacités de virulence de ces souches telles
que la formation de biofilm, la mobilité ou la capacité à excréter des toxines afin d’évaluer le
risque de la présence de tels isolats dans l’environnement. Ces résultats suggèrent une
adaptation importante des populations de S. maltophilia aux conditions qui caractérisent leur
niche d’origine, liées à la fois à l’origine géographique des sites et aux activités anthropiques
menées sur ces sites, entrainant une diversité infra-spécifique importante. Il semble toutefois
difficile d’attribuer l’importante capacité de résistance de certaines souches
environnementales de S. maltophilia à la pression métallique présente dans les sols du fait des
activités anthropiques telles que l’irrigation avec des eaux usées ou l’amendement avec des
déchets urbains bruts. En effet, les activités anthropiques à l’origine des contaminations
métalliques sont souvent responsables de l’apport d’autres contaminants tels que les
molécules organiques et peuvent également participer à l’augmentation les concentrations en
antibiotiques. C’est pourquoi nous avons plutôt envisagé les effets de l’anthropisation et des
contaminations qui en résultent de façon globale sur la sélection et le maintien des résistances.
L’adaptation aux conditions environnementales rencontrées par S. maltophilia dans sa niche
écologique serait également à l’origine de variations génotypiques participant à la diversité
infra-spécifique. Ainsi, les variations phénotypiques ne seraient pas seulement liées à des
niveaux d’expressions et des phénomènes de régulation mais pourraient également
s’expliquer par des différences génotypiques (présence / absence des gènes recherchés). A
l’opposé, la présence des gènes de résistance aux métaux chez toutes les souches de P.
aeruginosa suggère que les variations phénotypiques observées seraient préférentiellement
- 281 -
liées à des phénomènes de régulation. Pour vérifier ces hypothèses, il serait nécessaire de
mesurer l’expression de ces gènes en présence d’une pression métallique ou antibiotique.
Certaines caractéristiques des génomes des deux modèles pourraient expliquer les différences
observées à la fois dans leur distribution et leur capacité de résistance aux métaux et aux
antibiotiques. Un grand nombre de déterminants génétiques impliqués dans la résistance à des
composés toxiques a été mis en évidence dans la partie conservée des génomes séquencés des
souches K279a d’origine clinique et R551-3 d’origine environnementale de S. maltophilia
(Crossman et al., 2008, Taghavi et al., 2009, Rocco et al., 2009). La présence de déterminants
participant à la formation de mécanismes généraux comme les pompes à efflux, pourrait être à
l’origine de la résistance à différentes molécules, par exemple antibiotiques et métaux et
entraîner des phénomènes de résistance croisée. Le génome de P. aeruginosa est quant à lui
caractérisé par un grand nombre de gènes impliqués dans la régulation (Stover et al., 2000,
Rodrigue et al., 2000), propriété importante pour le mode de vie d’un pathogène opportuniste
et permettant de s’adapter rapidement à des variations des conditions environnementales. Des
phénomènes de co-régulation de résistance aux métaux et aux antibiotiques ont d’ailleurs été
mis en évidence chez cette espèce (Perron et al., 2004). Toutefois, notre étude ne nous a pas
permis d’identifier ce type de co-sélection de résistance. Il semble d’ailleurs indispensable de
mesurer les niveaux d’expression des gènes potentiellement impliqués pour mettre en
évidence de tels phénomènes. Les différences observées entre les deux modèles peuvent
également s’expliquer par la composition de leur génome accessoire et leur capacité à
acquérir des résistances par transfert horizontal. Chez les deux modèles, le génome accessoire
est caractérisé par la présence de gènes impliqués dans la résistance aux antibiotiques ou aux
métaux, pouvant entrainer une diversité phénotypique infra-spécifique. L’acquisition
d’éléments génétiques mobiles portant à la fois des gènes de résistance aux métaux et aux
antibiotiques peut entrainer des phénomènes de co-résistance sous la pression métallique ou
antibiotique dans l’environnement ou le milieu hospitalier. Dans notre étude, l’acquisition
simultanée de gènes de résistance à un antibiotique et au mercure chez des souches d’origine
hospitalière sous la pression antibiotique pourrait expliquer la présence du gène merA
associée à l’absence de phénotype chez les deux modèles. De plus, nous avons montré que
certains déterminants merA pouvaient être associés à des profils de résistance aux
antibiotiques particuliers chez des souches hospitalières de P. aeruginosa, peut être du fait de
phénomènes de co-résistance.
- 282 -
L’étude réalisée sur la communauté indigène des sols du site de Pierrelaye suggère que les
métaux lourds présents en grande quantité dans ces sols ne seraient pas disponibles pour les
bactéries. En effet, bien que les plus forts effectifs de bactéries résistantes aux antibiotiques
aient été mis en évidence dans des sols contaminés, nous avons observé que d’une part,
plusieurs sols contaminés étaient caractérisés par une plus faible prévalence de bactéries
résistantes aux antibiotiques que les sols non contaminés ; et d’autre part que les capacités de
résistance aux métaux (zinc et cadmium) de la microflore hétérotrophe totale étaient faibles.
Ainsi, les concentrations en métaux mesurées dans les sols ne reflètent pas forcément les
concentrations disponibles pour les populations. Il est donc difficile d’évaluer spécifiquement
le rôle des métaux sur la co-sélection de résistance. Pour évaluer précisément le rôle
attribuable aux métaux, des travaux impliquant la réalisation de microcosmes et un meilleur
contrôle des apports pourraient être envisagés. Notamment, l’apport progressif ou direct d’un
métal dans un sol non-contaminé comme par exemple celui du site de Feucherolles ou dans
les sols témoins non amendés des différents sites étudiés pourrait permettre d’évaluer l’effet
précis d’une pollution mono- ou polymétallique sur l’augmentation des capacités de résistance
de la communauté indigène ou celles de populations particulières.
Dans cette étude nous nous sommes également intéressés aux espèces bactériennes résistantes
à l’imipénème, la gentamicine et la ciprofloxacine, trois antibiotiques fréquemment utilisés en
milieu clinique. Cette identification a révélé une faible diversité au sein de ces communautés,
suggérant que les pressions anthropiques présentes sur ce site pourraient ne favoriser le
maintien et la dispersion que d’espèces / genres bactériens présentant des capacités de
résistance particulières. Ainsi, ces pressions favoriseraient la sélection de deux types de
populations, d’une part, les populations présentant des capacités de résistance intrinsèques
telles que S. maltophilia qui est préférentiellement isolées à partir d’un milieu supplémenté en
imipénème pour lequel cette espèce présente une capacité intrinsèque de résistance grâce à la
présence dans son génome de gènes codant pour deux métallo- -lactamases ; d’autre part
d’espèces ou genres bactériens présentant des capacités à acquérir des éléments génétiques
mobiles. Dans ce dernier cas, la présence de déterminants génétiques responsables de
résistance aux antibiotiques présents sur des éléments génétiques mobiles peut réellement
influencer la composition de la communauté indigène en présence d’une pression sélective.
Ces déterminants peuvent être considérés comme des contaminants dont la présence peut être
liée à différentes activités anthropiques, responsables de leur apport, de leur maintien et de
leur dispersion dans l’environnement (Martinez et al., 2009). Dans notre étude, la recherche
de gènes de résistance aux antibiotiques généralement portés par des éléments génétiques
- 283 -
mobiles a montré la présence du gène blaIMP, codant pour une métallo- -lactamase, dans un
sol contaminé du site de Pierrelaye. Ce gène est fréquemment retrouvé chez des isolats
cliniques multi-résistants de différentes espèces de pathogènes opportunistes telles que
Acinetobacter baumanii ou Pseudomonas aeruginosa (Walsh et al., 2005). La présence de ce
gène dans l’environnement est peu étudiée et il n’a été mis en évidence à ce jour que dans des
eaux usées (Pellegrini et al., 2009). Sa présence dans les sols étudiés pose également la
question de l’importance des phénomènes d’acquisition et de dispersion de ce gène par des
souches environnementales qui peuvent potentiellement entrainer des infections chez des
personnes fragilisées et être par la suite dispersées dans le milieu hospitalier. En effet, nous
avons pu constater que l’identification des isolats représentant la microflore hétérotrophe
résistante aux antibiotiques testés a mis en évidence la présence majoritaire d’espèces ou de
genres bactériens également connus pour leur implication dans des infections nosocomiales
telles que S. maltophilia, Streptomyces spp. ou Bacillus spp. Du fait que ce gène est peu
recherché, on peut se demander s’il est fréquemment répandu ou si ce sont les pressions
sélectives présentes dans ce site qui le maintienne. Il serait donc intéressant d’évaluer la
prévalence de ce gène sur d’autres sites, contaminés ou non. Une étude complémentaire serait
également d’identifier les espèces portant le gène blaIMP dans le sol de Pierrelaye et d’évaluer
le rôle de ce gène sur leur capacité de résistance aux -lactamines, voire de mettre en évidence
un rôle indépendant de la résistance aux antibiotiques, qui pourrait expliquer la présence de ce
gène sans pression sélective directe apparente (antibiotiques). L’étude de l’environnement
génétique de ce gène chez les espèces porteuses pourrait également mettre en évidence des
phénomènes possibles de co-résistance s’il est positionné sur un élément génétique mobile
portant d’autres gènes de résistance.
- 284 -
CONCLUSIONS AND PERSPECTIVES (English version)
The origin, significance and role of antibiotic resistance in the environment and the factors
influencing the acquisition of resistance in bacteria are currently matter of debate. The
presence of heavy metals could contribute to the acquisition of antibiotic resistance by
antibiotic and heavy metal resistance co-selection (Baker-Austin et al., 2006, Berg et al.,
2004). Studies aiming at evaluating the role of metals in resistance co-selection are mostly
conducted at the community scale without interest to specific populations that could be
relevant in public health. In this context, the aim of this thesis was to better understand the
role of metal contaminations related to various anthropogenic activities in soils on antibiotic
and heavy metal resistance co-selection in the opportunistic bacterial pathogens P. aeruginosa
and S. maltophilia.
A preliminary study was to address a lack of information concerning the presence,

distribution and abundance of these models in soils. Although these species are considered
ubiquitous bacteria, present in a wide range of environments, such data are scarce and
relatively old. To carry out this work, we chose to use two complementary approaches: the
first one is widely used for epidemiological studies and involves the isolation and
quantification of populations of P. aeruginosa and S. maltophilia after plating on selective
media, combined with confirmation of the isolate identity by phenotypic and / or genetic
criteria; the second one is a culture-independent method, based on a detection from DNA
directly extracted from soil samples. The culture-independent approach was less sensitive
despite it is a good complement to the culture-dependent approach because it enables the
detection of viable but non-culturable cells, but may reflect the persistence of DNA after the
death of cells. Real time quantitative PCR would be to consider because it generally shows a
higher sensitivity than classic PCR. This molecular tool was not available at the time I
realized the study, but can be used now as it has been optimized and calibrated to be used with
soil DNA extracts by the BPOE team.
Nevertheless, we observed a different distribution of the 2 species in soils, confirming that S.
maltophilia could be indigenous in soils as it has been recovered from all tested soils, whereas
P. aeruginosa, is sporadically present in tested soils, probably due to an external intake by
irrigation water or organic amendments (manure). The presence of contaminants such as
- 285 -
organic compounds or heavy metals could contribute to the maintenance or spread of these
species, known for their resistance and degradation of organic molecules capacities.
Then we evaluated antibiotic and heavy metal resistance capacities of environmental strains
isolated from the different sites previously studied and compared them to the ones of hospital
strains in order to identify selective pressure that favor acquisition and maintenance of these
resistances. We had to overcome the absence of P. aeruginosa in soils chosen for their
supposed exposure and/or level of contamination [Feucherolles (uncontaminated and
unexposed agricultural soil, France), Nabeul (lack of heavy metal contamination in soil but
potential exposure to heavy metal through irrigation with wastewater, Tunisia), sub-urban
area of Ouagadougou (exposure to multi-contaminant through urban waste amendment and
zinc contamination of soil, Burkina Faso) and Pierrelaye (high level of heavy metal in soil and
exposure to multi-contaminant through waste water irrigation, France)]. We then expanded
our study to the impact of other types of selective pressures such as oil in soils, multiple
contaminations (detergent, organic molecules) in water from treatment plants systems, and
antiseptics used for the care of healthy captive snakes. The environmental strain collection of
S. maltophilia was composed of strains from sites presenting increasing level of
contamination, depending on the nature of the intake (heavy metal, organic compound
presence) and the time of exposure as mentioned above (Feucherolles, Nabeul,, Ouagadougou
and Pierrelaye).
The results confirmed that the presence of high antibiotic concentrations in the hospital was
the major driving force for the selection and maintenance of antibiotic resistance in both
species. Nevertheless, many differences were found between the two models. In one hand,
hospital strains of P. aeruginosa present little resistance to metals, whereas strains of S.
maltophilia often exhibit resistance to the four tested metals. In the other hand, most of
environmental strains of P. aeruginosa are characterized by low antibiotic resistance capacity
and high heavy metal resistance capacity (especially Zn and Cd). Some strains isolated from
particular environments as hydrocarbon contaminated soils or healthy captive snakes, were
resistance up to 5 antibiotics. In all cases, we failed to evidence antibiotic and heavy metal
resistance co-selection. On the opposite, environmental strains of S. maltophilia showed
variable capacity of resistance depending on their original site. Strains isolated from French
sites of Feucherolles and Pierrelaye presented low resistance whereas strains from Nabeul
(Tunisia) and Ouagadougou (Burkina Faso) presented resistance capacities similar to the ones
of strains from the hospital. Presence of strains presenting antibiotic resistance capacity
similar to the one of clinical strains in the environment could have major consequences in
- 286 -
public health. However, the success of colonizing the hospital and causing infection also
involves other properties. For instance, it seems essential to evaluate the virulence capacities
of these strains as biofilm formation, mobility or ability to excrete toxins, to evaluate the risk
of the presence of such isolates in the environment. These results suggest an important
adaptation of S. maltophilia populations to conditions that characterize their original niche
and that are due to both their geographical origin and human activities conducted at these
sites, leading to a significant intra-specific diversity. It is difficult to attribute to heavy metals
the selection of antibiotic resistance in environmental strains of our study. Indeed, human
activities that cause metal contaminations are often responsible for the intake of other
contaminants such as organic molecules which may also participate to the increase of
antibiotic concentrations. Consequently, it was rather difficult to differentiate the effect of
heavy metals from the effect of other toxicants. That is why we rather considered the effects
of the global human activities on the selection and maintenance of resistance.
This intra-specific diversity was also suggested by the variability in the prevalence of
antibiotic and metal resistance gene. Adaptation to environmental conditions encountered by
S. maltophilia in its original niche could also be implicated in genotypic variations that
contribute to the intra-specific diversity. Phenotypic differences could not only be related to
gene expression levels and regulation but could also be explained by genotypic differences
(presence / absence of genes). On the opposite, presence of heavy metal resistance genes in all
strains of P. aeruginosa suggests that phenotypic variations could preferentially be linked to
regulation phenomena. In order to test this hypothesis, it would be necessary to measure
expression of these genes under metal or antibiotic pressure in well controlled experiments.
Some genome characteristics within each species could explain their different behaviour
considering their distribution in soils and antibiotic and heavy metal resistance. A high
number of genetic determinants implicated in resistance to toxic compounds was evidenced in
the conserved part of the sequenced genomes of the clinical K279a strain and the
environmental R551-3 strain of S. maltophilia (Crossman et al., 2008, Taghavi et al., 2009,
Rocco et al., 2009). Presence of determinants encoding general mechanisms as efflux pumps
could be responsible to the resistance to different molecules as antibiotics and metals and lead
to cross-resistance phenomena. P. aeruginosa genome is characterized by a high number of
genes implicated in regulation (Stover et al., 2000, Rodrigue et al., 2000), a major property
for the way of life of opportunistic pathogens enabling to adapt quickly to change in
environmental conditions. Phenomena of antibiotic and heavy metal resistance co-regulation
have already been demonstrated in this species (Perron et al., 2004). However, our study did
- 287 -
not enable to identify such resistance co-selection. It also seems necessary to measure the
expression levels of genes potentially involved to demonstrate such phenomena. Differences
between the two models could also be explained by the composition of their accessory
genome and their ability to acquire resistance by horizontal transfer. In both models,
accessory genome is characterized by the presence of heavy metal and antibiotic resistance
genes that could lead to intra-specific diversity. Acquisition of mobile elements bearing both
antibiotic and heavy metal resistance genes could lead to co-resistance phenomena in both the
hospital and the environment. In our study, simultaneous acquisition of antibiotic and mercury
resistance genes in hospital strains under antibiotic selective pressure could explain the
presence of merA gene despite the resistance phenotype in both models. Moreover, we
showed that merA determinants could be associated to particular antibiotic resistance profiles
in hospital strains of P. aeruginosa due to co-resistance phenomena.
The study conducted on the indigenous community of Pierrelaye suggests that heavy metals,
presents in high concentrations, might not be available for bacteria. Indeed, despite the
presence of the highest prevalence of antibiotic resistant bacteria in highly contaminated soils,
we observed in one hand that several contaminated soils were characterized by a lower
prevalence of antibiotic resistant bacteria than non contaminated soils. On the other hand
heavy metal resistance capacities of the indigenous microflora were low. So metal
concentrations measured in soils do not necessarily reflect the available concentrations for the
indigenous bacterial community. In order to precisely evaluate heavy metal role in resistance
selection, microcosms and a better control of heavy metal intakes would need to be
performed. Progressive or direct intake of a metal in a non-contaminated soil, like soil from
the site of Feucherolles or control soils in the different studied sites, could enable to evaluate
the effect of a mono- or poly-metallic pollution on the increase of resistance capacity in the
indigenous community as well as in particular populations.
This study also enables to identify representative bacteria from the microflora resistant to
imipenem, gentamicin and ciprofloxacine, some antibiotics which are frequently used in the
hospital. Results showed a low diversity among the resistant populations, suggesting that
anthropogenic pressures present in this site could favor the maintenance and spread of few
bacterial species and genera presenting particular resistance. These pressures could favor the
selection of two types of population, populations that present intrinsic resistance capacities as
S. maltophilia which had been recovered from medium supplemented with imipenem and
presenting intrinsic resistance to imipenem due to the presence of two metallo- -lactamases;
- 288 -
and bacterial species presenting high capacities for the acquisition of genetic mobile elements.
In this case, presence of genetic determinants implicated in antibiotic resistance and present
on mobile elements can really influence the composition of the indigenous community in
presence of selective pressure. These determinants can be considered as contaminants which
presence may be linked to various human activities that are responsible for their intake, their
maintenance and their spread in the environment (Martinez et al., 2009). In our study,
research of antibiotic resistance genes, usually present on mobile elements showed the
presence of the blaIMP gene, encoding a metallo- -lactamase, in one of the most contaminated
soil. This gene is often found in multi-resistant clinical isolates of different opportunistic
pathogen species like Acinetobacter baumanii or Pseudomonas aeruginosa (Walsh et al.,
2005). Presence of this gene in the environment is poorly investigated and was only
demonstrated in wastewater (Pellegrini et al., 2009). Its presence in the studied soils raises the
question of the process involved in this gene acquisition by environmental strains that can
potentially cause infections in vulnerable individuals and subsequently be spread in the
hospital. Indeed, we observed that the identification of isolates representing the antibiotic
(gentamicin, ciprofloxacin and imipenem) resistant heterotrophic microflora showed the
predominant presence of species or genera also known for their role in nosocomial infections
as S. maltophilia, Streptomyces spp. ou Bacillus spp. As the presence of this gene is poorly
investigated, we wonder if it is naturally present in soil environment or if the contaminants of
these soils act as a selective pressure for its presence. It would be interesting to assess the
prevalence of this gene in other sites, contaminated or not. A complementary study would
also be to identify the species carrying the blaIMP gene in the soil of Pierrelaye and to study its
role in -lactam resistance or to highlight an alternative role that could explain the presence of
this gene with no apparent direct selective pressure (antibiotics). The study of the genetic
environment of this gene in the vector species could help in identifying co-resistance.
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- 313 -
- 314 -
ANNEXES
- 315 -
- 316 -
ANNEXE 1 : Séquences des determinants merA mis en evidence chez P. aeruginosa et S.
maltophilia.
>APA PROFILE POE22 MERA

TTCGATGGCGGTATTGCGGCAACTGTGCCTACGATTGACCGCAGTAAGCTGCTGGCCCAGCAGCAGGCCCGCGTC
GACGAACTGCGGCACGCCAAGTACGAAGGCATCCTGGGCGGTAATCCGGCCATCACCGTTGTGCACGGTGAGGCG
CGCTTCAAGGACGACCAGAGCCTTACCGTCCGTTTGAACGAGGGTGGCGAGCGCGTCGTGATGTTCGACCGCTGC
CTGGTCGCCACGGGTGCCAGCCCGGCGGTCCCGCCGATTCCGGGCTTGAAAGAGTCACCCTACTGGACTTCCACC
GAGGCCCTGGCGAGCGACACCATTCCCGAACGCCTTGCCGTAATCGGCTCGTCGGTGGTGGCGCTGGAGCTGGCG
CAAGCCTTTGCCCGGCTGGGCAGCAAGGTCACGGTCCTGGCGCGCAATACCTTGTTCTTCCGTGAAGACCCGGCC
ATCGGCGAGGCGGTGACAGCCGCTTTCCGTGCCGAGGGCATCGAGGTGCTGGAGCACACGCAAGCCAGCCAGGTC
GCCCATATGGACGGTGAATTCGTGCTGACCACCACGCACGGTGAATTGCGCGCCGACAAACTGCTGGTTGCCACC
GGTCGGACACCGAACACGCGCAGCCTCGCGCTGGACGCAGCGGGGGTCACTGTCAATGCGCAAGGTGCCATCGTC
ATCGACCAAGGCATGCGCACGAGCAACCCGAACATCTACGCGGCCGGCGACTGCACCGACCAGCCGCAGTTCGTC
TATGTGGCGGCAGCGGCCGGCACCCGTGCCGCGATCAACATGACCGGCGGCGATGCGGCGCTCGA
>BPA PROFILE POE19 MERA

GTTCGACGGCGGCATCCTGGCGACTGTGCCTGCGGTTGACCGCAGCAAATTACTGGCCCAACAGCAGGCACGCGT
CGATGAGCTGCGCCACGCCAAGTACGAAGGCATCCTGGACGGCAACCCGGCCATCACCGTCCTGCACGGCGAAGC
GCGTTTCAAGGACGACCAGAGCCTTGCCGTCCGTTTGAACGATGGCGGCGAGCGCGTCGTGATGTTCGACCGCTG
CCTGGTCGCCACGGGTGCCAGTCCGGCCGTGCCGCCGATTCCAGGCTTGAAAGAGTCCCCCTACTGGACTTCGAC
CGAGGCCCTGGTCAGCGACACCATTCCCGAGCGCCTAGCCGTGATCGGCTCGTCGGTGGTGGCGCTGGAACTGGC
GCAAGCATTCGCCCGGCTGGGCAGCCAGGTCACGATCCTGGCGCGCAGCACCTTGTTCTTCCGCGAAGACCCTGC
CATCGGCGAGGCTGTCACAGCCGCCTTCCGTGCCGAAGGGATCACGGTGTTGGAACACACGCAAGCCAGCCAGGT
CGCGCATGTGGACGGTGAATTCGTGCTGACCACCGCGCACGGAGAATTGCGCGCCGACAAGCTGCTGGTCGCTAC
CGGGCGGACACCGAACACGCGCAGCCTGGCACTGGACGCAGCGGGAGTCACCGTCAATGCACAAGGTGCCATCGC
CATCGACAAGGGCATGCGCACCAGCACGCCGCACATTTATGCGGCCGGCGACTGCACTGACCAACCGCAATTCGT
CTATGTGGCGGCAGCCGCCGGCACCCGCGCCGCGATCAACATGACGGGCGGGGATGCTGCCATCAA
>CPA PROFILE POE103 MERA

GTTTGATGGCGGACTGCCCGCCACGCCGCCGCTTGTCTTGCGCGAACGGTTGCTCGCCCAGCAACAGGGTCGTGT
CGACGAACTGCGCCACGCCAAGTACGAAGGCATTCTGGAAAGCACCCCAGCCATCACCGTGCTGCGTGGCTCCGC
CCGCTTCCAGGACAGCCACACGCTCAGTGTGGAACTGGTCGAGGGGGGCGAGCGCATCGTGACCTTCGACCGCTG
CCTGATTGCCACCGGCGCCAGTGCGGCCGTGCCGCCGATTCCCGGACTGCAAGATACCCCCTTTTGGAACTCGGA
AAAGGCGCTGGCAAGCAGCAGTATTCCGCAACGGCTCGCCGTGATCGGCTCATCCGTGGTGGCCTTGGAGCTGGC
GCAAGCCTTTGCCCGGCTGGGTAGCCGCGTCACCATCCTGGCGCGCAACTCGCTGTTCTTCCGTGAAGATCCGGC
CATCGGCGCAGCGCTGACGGCGGCCTTCCGCCTGGAGGGCATCGAAGTGCTGGAACAGACGCAAGCCAGCCAGGT
GGCCCATGCCAACGGCGAGTTCGTGCTGACCACCAAGCACGGTGAAGTGCGGGTCGACCAACTGCTCGTCGCCAC
CGGACGCACGCCCAACACCCACGGCCTGAACCTGGAAGCGGCCGGCGTGCAGCTGGATGAACGCGGTGCCATCCA
GATCGACCAGGGCATGCGCAGCAGCAAAGCGGATATTTATGCGGCCGGCGACTGCACCAACCAGCCGCAGTTCGT
CTATGTCGCGGCGGCGGCCGGCAATCGCGCGGCGATCAACATGACCGGCGGCGAGGCAAT
>DPA PROFILE ATCC31479 MERA

TTCGATGCTGGCCTGCCGGCCGCAGCGCCCGCTGTACTGCGCGAGCGGCTGCTGGCCCAGCAACAAGGCCGCGTC
GAGGAGCTGCGCCATGCCAAGTACGAAGGCATCCTGGCAAGCACTCCGGCCATCACCGTGCTGCGCGGCGAGGCC
CGGTTCAGGGACACGCGCACGCTGACCGTGGCGACCGCTGACGGCGGCACGCACGAGGTGAACTTCGACCGCTGC
CTGATTGCCACCGGCGCGAGCCCGGCGCTTCCGCCAATCCCGGGCCTTGCGGACACACCCCACTGGACCTCCACC
GAGGCGCTGGAAAGCAGCTCGCTCCCCGAGCGGCTGGCCGTGATTGGTTCCTCCGTGGTGGCGGTCGAGTTGGCG
CAAGCCTTCGCCCGGCTGGGCAGCCAGGTCACGATCCTGGCGCGCAGCACGCTGTTCTTCCGAGAAGACCCGGCC
ATCGGGGAAGCCGTAACAGACGCCTTCCGCGCCGAGGGCATCGAGGTGCTGGACCACACCCAGGCGAGCCACGTT
GCCTATGCGGGCGGGGAATTCGTGCTCACCACCGGGCAGGGGGAAGTGCGCGCCGACAAGCTGCTGGTCGCCACC
GGTCGCGCGCCGAACACGCGCAGCCTGAACCTTGAAGCGGCAGGCGTCGAAGTCAATGCGCAGGGAGCCATCGTC
ATCGACCGCGCCATGCGCACGAGCGCACCGCACATCTTTGCTGCCGGCGACTGCACCGACCAGCCGCAGTTCGTC
TATGTGGCGGCGGCGGCCGGCACGCGCGCCGCGATCAACATGACCGGCGGCGACGCGGCGCT
>EPA PROFILE DB3046 MERA
- 317 -
TCGACGCCGGGCTGTCGGCCACCACGCCGGCCGTCCTGCGCGAACGGCTGCTCGCGCAACAACAAGGTCGCGTGG
ACGAACTGCGTCATGCCAAGTACGAAAACATCCTGGAGGGCACGCCGGCCATCAGCGTGCTGCGCGGCAGCGCCC
GTTTCAGCGATGGCCGCACGCTCAGCGTGGAACTGGCAGGCGGCGGCGAGCGCATCCTTGCCTTCGACCGCTGCC
TGGTTGCCACCGGCGCGAGTCCGGCCATTCCGCCGATTCCCGGCCTCCAGGGCACGCCCTACTGGACCTCTACCG
AGGCGCTGGTGAGCGACAGCATTCCCAAACGCTTGACGGTGATCGGATCCTCGGTGGTAGCGCTGGAACTGGCGC
AGGCCTTCGCCCGCTTGGGTAGCAAGGTGACGATTCTGGCGCGCCACACGCTGTTCTTCCGTGAAGACCCGGCCA
TCGGCGAAGCGCTGACGGCGGCCTTCCGGATGGAGGGCATCGAAGTGCTGGAGCAGACGCAAGCCAGCCAGGTGT
CCTACGCCAACGGCGAGTTCGTGCTGACCACCAACCACGGCGAAGTGCGCGCCGACCAACTGCTCGTCGCCACCG
GCCGCACGCCCAACACCCAGGGCATGAACCTAGAAGCAGCCGGCGTGCAGCTGGACGAACGCGGCGGCATCCGGA
TCGACTCCGGCATGCGCAGCAGCGCCCCCGATATCTATGCGGCCGGCGATTGCACCGACCAGCCGCAATTCGTCT
ATGTCGCCGCGGCCGCCGGCACCCGCGCGGCGATCAACATGACCGGCGGCGAGGC
>FPA PROFILE 373 MERA

CGTTCGATGGCGGCATCGCCGCTACCACGCCGACCATCCAGCGCACGGCGCTGCTGGCCCAGCAGCAGGCCCGCG
TCGATGAACTGCGCCACGCCAAGTACGAAGGCATCTTGGAGGGCAATCCGGCGATCACTGTGCTGCACGGCTCCG
CCCGCTTTAAGGACAATCGCAACCTGATCGTGCAACTCAACGACGGCGGCGAGCGCGTGGTGGCATTCGACCGCT
GCCTGATCGCCACCGGCGCGAGCCCGGCCGTGCCGCCGATTCCCGGCCTGAAAGACACTCCGTACTGGACTTCCA
CTGAAGCGCTGGTCAGCGAGACGATTCCTAAGCGCCTGGCCGTGATTGGCTCATCAGTGGTGGCGCTGGAGCTGG
CGCAGGCGTTCGCCCGACTCGGAGCGAAGGTGACGATCCTGGCTCGCAGCACGCTGTTCTTCCGCGAAGACCCAG
CTATAGGCGAAGCCGTCACGGCCGCATTCCGCATGGAGGGCATCGAGGTGAGGGAACACACCCAGGCCAGCCAGG
TCGCGTATATCAATGGTGAAGGGGACGGCGAATTCGTGCTCACCACGGCGCACGGCGAACTGCGCGCCGACAAGC
TGCTGGTCGCCACCGGCCGCGCGCCCAACACACGCAAGCTGGCACTGGATGCGACGGGCGTCACGCTCACCCCGC
AAGGCGCTATCGTCATCGACCCCGGCATGCGTACAAGCGTGGAACACATCTACGCCGCAGGCGACTGCACCGACC
AGCCGCAGTTCGTCTATGTGGCGGCAGCGGCCGGCACTCGCGCCGCGATCAACATGACCGGCGGTGACGCGGCCC
TG
>GPA PROFILE 186 MERA

GTTCGACGCCGGGCTTTCCGCCATGACGCCGACCGTCCTACGCGAACGTCTGCTCGCGCAGCAACAAGACCGTGT
CGCCGAACTGCGCCACGCCAAGTACGAAAGCATCCTGGAGAGCACGCCGGCGATCAGCGTGCTGCGCGGCACCGC
CCGTTTCCAGGACGGCCACACGCTCAGCGTGAAACTGGCCGAGGGTGGCGAGCACATCGTAGCCTTCGACCGCTG
CCTGGTCGCCACCGGCGCAAGCGCGGCCGTTCCACCGATTCCAGGACTGAAAGACACGCCGTACTGGACCTCAGA
CCAGGCACTGGCGAGCGATACAATCCCTAAGCGGCTCGCCGTGATCGGCGCCTCCGTAGTGGCAGTGGAACTGGC
GCAGGCCTTCGCCCGGCTGGGTAGCGAGGTCACGATCCTGGCACGCAGTGCGATGTTCTTCCACGAAGACCCGGC
CATCGGCGCGGCGGTGACGGAGGCCTTCCGTATGGAGGGCATCGAAGTGCTGGAGCAAACGCAAGCCAGCCAGGT
GTCCCACGCCAACGGCGAGTTCGTACTGGCCACCAACCATGGTGAGTTACGTGCCGACCAACTGCTCGTCGCCAC
CGGCCGCACGCCCAATACCCAGGGCCTGAACCTGGAAGCGGCCGACGTGCAGCTGGACGAGCGCGGCGGCATCCA
GATCGACGAGCGCATGCGCACCAGCGCAGCGGATATCTATGCGGCCGGCGACTGCACCGACCAACCGCAGTTCGT
CTACGTCGCGGCAGCGGCTGGCACCCGCGCGGCAATCAACATGACCGGCGGCGAGGCAGCAGCTCAA
>HPA PROFILE LMG9009 MERA

GTTCGACGGCGGTATTGCGGCAACTGTGCCTGCGATTGACCGCAGCAAACTGCTGGCCCAGCAGCAGGCCCGTGT
CGATGAACTGCGGCACGCCAAATACGAAGGCATCCTGGACGGCAATCCAGCCATCACCGTTTTGCACGGTGAAGC
GCGTTTCAAGGACGACCAGAGCCTGGTCGTCCGTTTGAACGAGGGTGGCGAGCGCGAGGTAACGTTCGACCGCTG
CCTGGTCGCCACCGGTGCCAGTCCGGCCGTGCCGCCGATTCCGGGCCTGAAAGAGTCACCCTACTGGACTTCCAC
CGAAGCGCTTGTCAGCGACACCATTCCCGCACGCCTGGCCGTGATCGGTTCGTCGGTGGTGGCGTTGGAACTGGC
GCAAGCCTTTGCCCGGCTCGGCAGCCAGGTCACGATCCTGGCACGCAGCACCTTGTTCTTCCGGGAAGACCCGGC
CATCGGCGAGGCCGTGACAGCCGCTTTCCGCGCCGAGGGCATCGAGGTGCTGGAGCACACGCAAGCCAGCCAGGT
CGCCCATGTGAACGGCGAATTCGTGCTGACCACCGGACACGGTGAATTGCGCGCTGACAAGTTGCTGGTTGCCAC
CGGTCGGGCACCGAATACGCGCAGCCTCGCGCTGGACGCGGCGGGGGTCACTGTCAATGCGCAAGGGGCCATCGT
TATCGACCAAGGCATGCGCACGAGCAACCCGAACATCTACGCGGCCGGCGACTGCACCGACCAGCCGCAGTTCGT
CTACGTGGCAGCGGCCGCCGGCACCCGTGCCGCGATCAACATGACCGGCGGCGACGCAGCCCTC
>IPA PROFILE PA6 MERA2

TAGTCATTTTGTATACTACGCGCATCTGCGCGGGAGCAATTCGATGGCGGATGGCCCCACTGGGCGACATCTGGC
CCGAGCGGCTGCGGCCCAGCAGCGGCCCGTGTCGAAGAACTCCGTCATGCCAAGTACGAAAGGCTCCTGGACGGG
AATTCCGGCCTTCCCGTTCTGCACGGGGAAGCGCGGTTTCAGGGACAACAAAACCTTTTCGTTAGTTTGAACGAA
GGGGGGGAGCGCGTCGTGGTGTTCGACCGCTGCCTGGTCGCCACGGGTGCCAGTCCGGCCATGCCGCCGATTCCG
GGCTTGAAAGAGTCACCCTACTGGACTTCCACCGAGGCCTTGGTCAGCGACACCATTCCCGAACGCCTGGCCGTC
ATCGGCTCGTCGGTGGTGGCGCTGGAACTGGCGCAAGCCTTCGCCCGGCTGGGTAGCCAGGTCACGATCCTGGCG
CGCAATACGTTGTTCTTCCGCGAAGACCCTGCCATCGGCGAGGCCGTCACAGCCGCCTTCCGTGCCGAAGGAATC
AAGGTACTGAAACATACGCAAGCCAGCCAAGTCGCCCATGTGGACGGCGAATTCGTGCTGACCACTGCACACGGC
- 318 -
GAAGTGCGCGCCGACAAACTGCTGGTCGCCACCGGTCGGACACCGAACACGCGCAGCCTGGCATTGGACGCAGCG
GGGGTAGCTGTCAATGCGCAGGGTGCCATCGTCATCGACCAGGGCATGCGCACGAGCAGCCCGAACATCTACGCG
GCCGGCGACTGCACCGACCAGCCGCAGTTCGTCTATGTGGCGGCAGCGGCCGGCACTCGTGCCGCCATCAACATG
ACCGGCGGCGACGCCGCCATCAATCTGACCGCGATGCCGGCCGTGGTGTTCACCGATCCGCAAGTGGAACCTGGT
AGCGCTAACA
>ASM PROFILE 478 S.M MERA

GTTCGATGGCGGTATTGCGGCAACTGTGCCTACGATTGACCGCAGTAAGCTGCTGGCCCAGCAGCAGGCCCGCGT
CGACGAACTGCGGCACGCCAAGTACGAAGGCATCCTGGGCGGTAATCCGGCCATCACCGTTGTGCACGGTGAGGC
GCGCTTCAAGGACGACCAGAGCCTTACCGTCCGTTTGAACGAGGGTGGCGAGCGCGTCGTGATGTTCGACCGCTG
CCTGGTCGCCACGGGTGCCAGCCCGGCGGTCCCGCCGATTCCGGGCTTGAAAGAGTCACCCTACTGGACTTCCAC
CGAGGCCCTGGCGAGCGACACCATTCCCGAACGCCTTGCCGTAATCGGCTCGTCGGTGGTGGCGCTGGAGCTGGC
GCAAGCCTTTGCCCGGCTGGGCAGCAAGGTCACGGTCCTGGCGCGCAATACCTTGTTCTTCCGTGAAGACCCGGC
CATCGGCGAGGCGGTGACAGCCGCTTTCCGTGCCGAGGGCATCGAGGTGCTGGAGCACACGCAAGCCAGCCAGGT
CGCCCATATGGACGGTGAATTCGTGCTGACCACCACGCACGGTGAATTGCGCGCCGACAAACTGCTGGTTGCCAC
CGGTCGGACACCGAACACGCGCAGCCTCGCGCTGGACGCAGCGGGGGTCACTGTCAATGCGCAAGGTGCCATCGT
CATCGACCAAGGCATGCGCACGAGCAACCCGAACATCTACGCGGCCGGCGACTGCACCGACCAGCCGCAGTTCGT
CTATGTGGCGGCAGCGGCCGGCACCCGTGCCGCGATCAACATGACCGGCGGCGATGCGGCGCTCG
>DSM PROFILE 979 S.M MERA

GTTCGATGCTGGCCTGCCGGCCGCAGCGCCCGCTGTACTGCGCGAGCGGCTGCTGGCCCAGCAACAAGGCCGCGT
CGAGGAGCTGCGCCATGCCAAGTACGAAGGCATCCTGGCAAGCACTCCGGCCATCACCGTGCTGCGCGGCGAGGC
CCGGTTCAGGGACACGCGCACGCTGACCGTGGCGACCGCTGACGGCGGCACGCACGAGGTGAACTTCGACCGCTG
CCTGATTGCCACCGGCGCGAGCCCGGCGCTTCCGCCAATCCCGGGCCTTGCGGACACACCCCACTGGACCTCCAC
CGAGGCGCTGGAAAGCAGCTCGCTCCCCGAGCGGCTGGCCGTGATTGGTTCCTCCGTGGTGGCGGTCGAGTTGGC
GCAAGCCTTCGCCCGGCTGGGCAGCCAGGTCACGATCCTGGCGCGCAGCACGCTGTTCTTCCGAGAAGACCCGGC
CATCGGGGAAGCCGTAACAGACGCCTTCCGCGCCGAGGGCATCGAGGTGCTGGACCACACCCAGGCGAGCCACGT
TGCCTATGCGGGCGGGGAATTCGTGCTCACCACCGGGCAGGGGGAAGTGCGCGCCGACAAGCTGCTGGTCGCCAC
CGGTCGCGCGCCGAACACGCGCAGCCTGAACCTTGAAGCGGCAGGCGTCGAAGTCAATGCGCAGGGAGCCATCGT
CATCGACCGCGCCATGCGCACGAGCGCACCGCACATCTTTGCTGCCGGCGACTGCACCGACCAGCCGCAGTTCGT
CTATGTGGCGGCGGCGGCCGGCACGCGCGCCGCGATCAACATGACCGGCGGCGACGCGGCGCTGG
>JSM PROFILE L2920 MERA

TGCGGCGGGAAAGTCCGTTCGATGGCGGTATTGCCGCCGCCGCGCCGGCGATCCTGCGCGAGCGTTTGCTGGCGC
AGCAGCAGGCGCGCGTCGATGAACTGCGCCAGGCCAAGTACGAGGGGATTCTGGACAGCACCCCGGCCATTACCG
TGCTGCGCGGCGAAGCCCGCTTCCAGGACAGGCACACCCTGAAGGTACAACTCGGCGACGGTGCCGAGCGCGTGG
TCGCGTTCGACCGCTGCCTGATCGCCACCGGCGCGAGTCCCGCGCTTCCACCGATCCCCGGCTTGCAAGACACCC
CCTACTGGACCTCGACCGAAGCACTGGCCAGCGACACGATCCCGCCGCGCCTGGCGGTCATCGGCTCGTCGGTGG
TCGCGGTCGAGTTGGCGCAGGCCTTTGCCCGGCTGGGCAGCCGGGTCACGATCCTGGCGCGCAGTACGCTGTTCT
TCCGCGAAGACCCTGCCATCGGCGAAGCCGTGACGGCTGCGTTCCGCGCGGAGGGCATCGAGGTACTGGAGCATA
CCCAGGCGAGCCAGGTCGTCTACACCGAGGGCGCGTTCGTGCTGACCACGGCACACGGCGAGTTGCGCGCCGACC
GGTTGCTGGTCGCCACCGGCCGCACCCCGAATACCCGCGGCCTGAATCTCGAAGCGGCAGGCGTCGAGCTCAATG
GGCAAGGAGCCATCATCATCGACCGCGCGATGCGTACCTCTGCGCCTCACCTCTACGCCGCCGGCGACTGCACCG
ACCAGCCGCAGTTCGTGTACGTTGCCGCGGCGGCCGGGACCCGCGCCGCGATCAACATGACCGGCGGCGATGCGG
CGCTGGACCTGACGGC
- 319 -
ANNEXE 2 : Séquence du déterminant blaIMP mis en évidence dans le sol 14 du site de
Pierrelaye.
>BLA-IMP P14-1
GGAATAGAGTGGCTTAATTCTCAATCCATTCCCACACATGCATCTGAATTAACAAATGAACT
TCTTAAAAAGGACGGTAAGGTGCAAGCTAAAAACTCATTTAGCGGAGTCAGTTATTGGCTAG
TTAAAAATAAAATTGAAGTTTTTTATCCCGGCCCGGGGCACACTCAAGATAACGTAGTGGTT
TGGTTACCTGAAAAGAAAATTTTATTCGGTGGTTGTTTTGTTAAACCGGATGGTCTTGGTAA
TTTGGGGGACGCAAATTTAGAAGCTTGGCCAAAGTCCGCCAAAATATTAATGTCTAAATATG
GTAAAGCAAAACTGGTTGTTTCAAGTCATAGTGAAATTGGGGACGCATCAC
- 320 -

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Les métaux lourds dans les écosystèmes anthropisés :

une pression favorisant la sélection de pathogènes

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HAL Id: tel-00834182

HAL is a multi-disciplinary open access L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est

THESE DE L‘UNIVERSITE DE LYON

L’UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1

Ecole Doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie et Modélisation

(arrêté du 7 août 2006)

Soutenue publiquement le 17 Décembre 2010

Les métaux lourds dans les écosystèmes anthropisés :

Mme VALLAEYS Tatiana, Professeur, Université Montpellier II Rapporteur

Vice-président du Conseil Scientifique M. le Professeur J-F. Mornex

Vice-président du Conseil d’Administration M. le Professeur G. Annat

Vice-président du Conseil des Etudes et de la Vie M. le Professeur D. Simon

COMPOSANTES ET DEPARTEMENTS DE SCIENCES ET TECHNOLOGIE

Faculté des Sciences et Technologies Directeur : M. le Professeur F. Gieres

Je remercie René Bally pour son accueil au sein du Laboratoire d’Ecologie

Je remercie également tous nos partenaires de Dijon, Paris, Tunisie et du Burkina

Un grand merci à toute l’équipe 6, chercheurs, techniciens, thésards, post-docs, qui

PARTIE I : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ...........................................................................19

I- Ecologie des modèles ....................................................................................................................23

Chapitre 1 : Distribution des modèles Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia dans

Partie 1 : Diversité de résistance aux métaux et aux antibiotiques chez P. aeruginosa et S.

Partie 2 : Evaluation de la diversité du déterminant merA chez P. aeruginosa et S. maltophilia,

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .........................................................................................279

Figure 1. Le résistome ...........................................................................................................4

Tableau 1. Source de P. aeruginosa et S. maltophilia dans l’environnement hospitalier (non

Hg2+ Hg0 Cytoplasme

opéron mer streptomycine

opéron czc Imipénème

Zn2+, Co2+, Cd2+

Figure 4. Exemples de co-sélection de résistance. D’après Baker-Austin et al., 2006.

 La co-régulation, quant à elle, s’observe lorsque la régulation d’un mécanisme, induite

Nowadays, an increasing number of bacterial species broadly distributed in the environment

Hg2+ Hg0 Cytoplasm

mer operon streptomycin

czc operon Imipenem

Zn2+, Co2+, Cd2+

Figure 8. Examples of resistance co-selection (from Baker-Austin et al., 2006).

Pseudomonas aeruginosa et Stenotrophomonas maltophilia, bactéries Gram négatif de

I-1- Bactéries environnementales ubiquistes

 Distribution de P. aeruginosa dans les environnements naturels

 Distribution de S. maltophilia dans les environnements naturels

Ainsi, P. aeruginosa et S. maltophilia sont isolées à la fois d’environnements

I-1-b- Présence dans les milieux pollués et capacité de bioremédiation

 Les eaux usées

 Les environnements contaminés en métaux lourds

 Les environnements contaminés en hydrocarbures

 Les environnements présentant d’autres types de contaminations

Ainsi, les modèles bactériens P. aeruginosa et S. maltophilia sont fréquemment retrouvés

I-1-c- Présence dans les environnements hospitaliers

La présence de P. aeruginosa et S. maltophilia dans l’environnement hospitalier a

Sources potentielles de S. maltophilia Sources potentielles de P. aeruginosa

I-2- Interactions avec d’autres organismes

En plus d’une grande capacité d’adaptation à un large panel d’environnements, P.

I-2-a- Interactions avec les plantes

De nombreuses études ont mis en évidence la présence de S. maltophilia dans la

I-2-b- Interactions avec les animaux