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    Travaux Pratiques 2 de Microbiologie 1 Année Filière Ingénieur: Coloration Gram Positif/gram Négatif

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    Omar Makhlouf
    Ce document décrit un TP de microbiologie sur la coloration Gram positif/négatif. Le TP comprend la préparation des colorants, le protocole expérimental pour l'étalement, la fixation et la coloration Gram des échantillons, et les éléments à inclure dans le compte rendu.

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    TP de Microbiologie

    Travaux Pratiques 2

    de Microbiologie 1ère Année Filière Ingénieur : Coloration Gram


    positif/Gram négatif

    1. Principe :

    Certains genres de bactéries ont en commun une membrane qui retient certains colorants. Ces
    genres forment le groupe des bactéries Gram positif (Gram+). Toutes les autres bactéries soit
    qu'elles n'ont pas de membrane soit que la nature de leur membrane est totalement différentes
    se laissent décolorer par la méthode de Gram. Elles sont dites Gram négatif (Gram-).

    2. Matériel utilisé :

    La manipulation est réalisée par groupe d’étudiants. Chaque groupe doit avoir un prélèvement
    du sol, une lame dégraissée, une pince à lame, un Bec Bunsen, pissette d’alcool absolu,
    pissette d’éau, Microscope biologique avec immersion, colorants. La blouse blanche et les
    gans sont obligatoires pour chaque étudiant.

     Préparation des colorants :


    Violet phéniqué (Nicole) :

    On mélange 1 gramme de violet de gentiane (cristal violet) avec 10 ml d’alcool absolu dilué
    avec 90 ml d’eau phéniquée à 1%.

    Liquide de Lugol (IKI) :

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    TP de Microbiologie
    1 g d’iode et 2 g d’iodure de potassium sont dilués avec 300 ml d’eau distillée.

    Solution de Fuchsine :

    Une solution de fuchsine saturée dans 10 ml d’alcool est mélangée avec 90 ml d’eau distillé

    3. Protocole expérimental

    1.1. Etalement :

    L'étalement doit se faire en couche mince, sur une lame dégraissée.

    1.2. Dessiccation :

    Il faut laisser sécher l’échantillon à l'air libre.

    1.3. Fixation :

    Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame opposée à
    l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement.
    On peut également fixer en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool méthylique versées
    directement sur le prélèvement. A ce stade, les germes ne sont plus considérés comme
    contaminants.

    1.4. Coloration de Gram :

    ETAPE 1 : coloration par le violet de gentiane

    L’action combinée du violet de gentiane et du lugol (appelé mordanceur car il renforce


    l'action du violet de gentiane) forme un complexe chimique qui colore le cytoplasme de
    toutes les bactéries en violet.

    ETAPE 2 : décoloration par l’alcool

    La paroi bactérienne de Gram positif est imperméable à l'alcool les bactéries restent
    colorées en violet.

    La paroi bactérienne Gram négatif est perméable à l'alcool (du fait de sa constitution chimique
    différente et d'une différence d'épaisseur): l'alcool pénètre dans les bactéries et décolore leur
    cytoplasme: les bactéries deviennent "incolores".
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    TP de Microbiologie

    ETAPE 3 : Récoloration par la fuchsine

    Les bactéries à paroi imperméable à l'alcool « ne prennent pas » la fuchsine, elles


    restent colorées en violet et sont dites à Gram positif.

    Les bactéries à paroi perméable à l'alcool, qui ont été décolorées, sont recolorées par la
    fuchsine. Elles sont colorées en rose et sont dites à Gram négatif.

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    TP de Microbiologie

    4. Travail demandé pour le compte rendu


    A la fin de la dissection, chaque groupe d’étudiants doit avoir un compte rendu contenant:

    1- Titre de l’expérience
    2- Objectif de l’expérience
    3- Matériel utilisé pour la réalisation de l’expérience
    4- Méthode utilisée pour réaliser l’expérience
    5- Description détaillée des résultats obtenus
    6- Conclusion

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