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    TD Spectrometrie de Masse de L3

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    Ce document présente quatre exercices portant sur la séparation de composés par HPLC et leur identification par spectrométrie de masse. Le premier exercice décrit une expérience de séparation de quatre composés par HPLC et demande de commenter les résultats. Le deuxième exercice concerne l'analyse d'un cytochrome par LC/MS. Le troisième porte sur la détermination de masses de différents oligomères d'hémocyanine. Le dernier aborde la détection de deux composés par MS et CPG/MS.

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    sur 4

    TD méthodes séparatives et spectrométrie de masse

    L3 chimie et chimie-physique

    Enseignant : Y. FRANCOIS

    Exercice 1
    Un expérimentateur est en présence d’un mélange de quatre composés (Eugénol, Carvone,
    3-hydroxyacétophénone, 4-hydroxyacétophénone). Il souhaite séparer de manière optimale
    ces quatre produits afin de doser l’eugénol par HPLC UV. La colonne utilisée est une phase
    stationnaire C18, et la phase mobile un mélange eau/acétonitrile. La longueur d’onde d’étude
    est 203 nm.

    Formule chimique des composés :

    O O
    Oh
    OMe O

    Première expérience :
    Condition eau/ACN 40/60 HO
    OH

    Eugénol Carvone 4-hydroxyacétophénone 3-hydroxyacétophénone

    Première expérience : Condition eau/ACN 40/60

    Pic 1 Pic 2 Pic 3 Pic 4


    tr (min) 3.77 4.08 14.10 17.21
    ω (min) 0.55 0.50 0.78 0.74

    Deuxième expérience :
    Condition eau/ACN 80/20
    Pic 1 Pic 2 Pic 3 Pic 4
    tr (min) 7.84 9.72 Inconnu Inconnu
    ω (min) 0.43 0.51 Inconnu Inconnu

    Troisième expérience :
    Mode gradient
    Temps % ACN % H2O

    0.00 20 80
    10.00 20 80
    13.00 60 40
    20.00 60 40
    21.00 20 80

    Pic 1 Pic 2 Pic 3 Pic 4


    tr (min) 7.87 9.77 17.38 18.92
    ω (min) 0.41 0.46 0.14 0.17

    (1) Commenter l’ordre de sortie des 4 composés. Est-il conforme à la théorie ?


    (2) Calculer la résolution entre les pics 1 et 2, et entre les pics 3 et 4 pour chaque
    expérience.
    (3) Commenter l’augmentation du temps de rétention lorsque la proportion d’eau augmente. 
    (4) Schématiser le gradient d’élution utilisé pour séparer ces quatre composés. Quel intérêt
    d’utiliser un gradient plutôt que de travailler en mode isocratique ? Commenter.
    (5) Donner deux méthodes différentes pour identifier de manière exacte les pics ?
    (6) Aurait il été possible de passer les composés en MS simple (sans couplage avec la LC)
    (7) Donner va valeur de la masse du pic majoritaire pour l’eugénol en impact électronique et
    en ionisation chimique.

    Exercice 2
    Le spectre suivant est celui du cytochrome analysé par couplage LC/MS avec introduction
    par électrospray (ESI) en mode positif

    Calculer la masse de cette molécule ?

    Exercice 3

    Le spectre de masse de différents oligomères d’hémocyanine native provenant de


    Bithograea thermidron (catégorie de crabe vivant dans les profondeurs de l’océan) a été
    réalisé à l’aide d’un ESI-TOF.

    (1) Calculer la masse de chaque oligomère ?

    Remarque : pour le calcul de la charge du troisième, du quatrième et du cinquième massif de


    pics, prendre en compte les masses 13659 et 13868, 17122 et 17341, 19612 et 19824

    (2) Sachant que la masse d’un monomère est au alentour de 75000 Da, déterminer le
    nombre de monomère formant chaque composé ?
    (3) Pourquoi avoir utilisé un appareil ESI-TOF ?
    Exercice 4

    Considérons un mélange de deux composés : le 1,2-éthanediol (C2H6O2) et l’éthanethiol


    (C2H6S).

    1. Est-il possible de détecter et d’identifier ces deux composés par spectrométrie


    de masse (MS) ? Expliquer ?
    2. Un couplage de la MS avec la chromatographie en phase gazeuse (CPG) est
    proposé. Dans ce cas, sera-t-il possible de détecter et d’identifier ces deux
    composés ? Expliquer ?

    Donnée isotopique :

    M M+1 M+2
    12 13
    C 98,9% C 1,1%
    16 17 18
    O 99,8% O ε O 0,2%
    32 33 34
    S 95,02% S 0,75% S 4,21%

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