14201408t PDF
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Option : Microbiologie
Sujet de thèse :
2013-2014
REMERCIEMENTS
Merci a tous.
Résumé
Les produits pétroliers, du fait de leur utilisation massive, constituent des polluants importants
des aquifères et des sols. Le devenir de ces polluants rejetés dans l’environnement est
principalement gouverné par les processus de biodégradation. L’existence de ces phénomènes
dépend de la biodégradabilité intrinsèque du polluant mais aussi de la présence de microflores
dégradatrices compétentes dans les eaux souterraines et dans les sols.
Au cours de ce travail, nous avons développé une méthodologie permettant d’évaluer la
biodégradabilité des hydrocarbures pétroliers en conditions aérobies. Elle consiste à mesurer,
par méthodes analytiques telles: Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) et
Chromatographie sur Couche Mince (CCM) couplées à un Détecteur à Flamme d’Ionisation
(FID), après incubation dans des conditions optimales, la consommation de chacun des
hydrocarbures présents dans différentes fractions du pétrole (saturés et aromatiques).
En utilisant une méthode de séquençage des gènes codant l’ADNr 16S, les compositions en
micro-organismes des bactéries adaptées au sol contaminé par les hydrocarbures ont été
déterminées. Des arbres phylogénétiques ont été élaborés. Les capacités de dégradation des
bactéries sélectionnées et la présence ou non de gènes fonctionnels de dégradation codant
pour l’oxydation initiale des hydrocarbures (alkB, nahAc, nidA) ont été étudiées.
Les résultats indiquent que le groupe Gamma-Protéobactéries était le principal acteur de cette
dégradation. Pseudomonas sp. groupe bactérien majoritaire spécifique adapté à la pollution
aux hydrocarbures à la capacité de métaboliser (en culture simple) certains hydrocarbures
récalcitrants (alcanes ramifiés tel le Pristane (n-C19) à 35.11% et les aromatiques lourds tels le
Benzo[a]Pyrène (n-C20) à 33.93% et de cométaboliser (en consortium) les différentes
fractions du pétrole brut à 50.44% pour les saturés et à 30.42% pour les aromatiques
polycycliques. L’efficacité de la biodégradation des microflores est liée à la présence de voies
métaboliques particulières chez certains micro-organismes et à la coopération entre les
différents micro-organismes composant les microflores. Ces bactéries hydrocarbonoclastes
peuvent être utilisées pour concevoir des cultures mixtes (consortium) avec des capacités de
biodégradation spécifiques pour les différentes fractions pétrolières dans les traitements des
stations d’épuration.
Because of their massive utilization, hydrocarbons are major pollutants of soils and aquifers.
Biodegradation is a key aspect of the fate of pollutants in the environment. Such knowledge
concerns in particular the intrinsic biodegradability of the products and the distribution in the
environment of competent degradative microflorae.
In this study, a methodology has been developed to assess the aerobic biodegradability of
petroleum hydrocarbons. It is based on the Gas Chromatographic and Thin Layer
Chromatography (TLC) coupled with a Flame Ionization Detector (FID) analysis of
hydrocarbons, after incubation in optimal conditions of major compounds in crude oil
(saturates and aromatics fractions).
Using a method of gene sequencing 16S rDNA, the identification of bacteria adapted to soil
was determined. Based on nearly full length 16S rRNA gene sequencing analysis, a
phylogenetic trees was constructed. Capacity of degradation of selected bacteria and the
presence or absence of functional genes coding for the initial oxidation of hydrocarbons
(alkB, nahAc, nidA) were studied.
The results indicate that the Gamma-Proteobacteria group was the main actor of this
degradation. Pseudomonas sp, specific bacterial group suitable for petroleum hydrocarbon
pollution has the ability to metabolize (single culture) a high mass residues, Pristane (n-C19)
at 35.11% and Benzo[a]Pyrene (n-C20) at 33.93% and co-metabolize (in consortium) fractions
in petroleum-hydrocarbon, 50.44% of saturates and 30.42% of aromatics compounds.
Biodegradation efficiency of soil microflorae depended on the specific metabolic pathways of
some microorganisms and on the cooperation within microbial population. This study
provides a better understanding of the adaptation of bacteria inhabiting polluted environments
and for developing and implanting adequate bio-strategies in the future to enhance oil in
contaminated soil and the biotreatment of oily waste water in refineries.
انًؼبندت انحٕٚٛت نهًحزٔلبث انُفطٛت ف ٙانخزبت انًهٕثت ببنُفط ػٍ طزٚك بكخٛزٚب يحهٛت حزابٛت :حؼ ٔ ٍٛٛحؼزٚف حزكٛب
انكبئُبث انذلٛمت انًخخصصت ف ٙححهٛم انًٕاد انُفطٛت ػٍ طزٚك انبٕٛنٕخٛب اندشٚئٛت (ػًهٛبث حضخٛى خُٛبث يخخصصت
نهحًض انُٕٔ٘ ( ) ADNػٍ طزٚك سهسهت حفبػم انبٕنًٛٛزاس )(Polymérase Chain Réaction
نكثزة إَخبج ٔاسخخذاو انًحزٔلبث انُفطٛت ػهٗ َطبق ٔاسغ فٓ ٙحؼخبزيٍ انًهٕثبث انزئٛسٛت ف ٙانخزبت ٔ انًٛبِ اندٕفٛت.
ٚخضغ أسبسب يصٛز ْذِ انًهٕثبث ف ٙانبٛئت نؼًهٛت انخحهم انبٕٛنٕخٔ .ٙخٕد ْذِ انظبْزة ٚؼخًذ ػهٗ انخحهم انحٕ٘ٛ
انًخخص ببنًهٕثبث ٔ نكٍ أٚضب بٕخٕد كبئُبث دلٛمت فؼبنت ف ٙانخزبت ٔ انًٛبِ اندٕفٛت.
فْ ٙذا انؼًم لًُب بخطبٛك يُٓدٛت نخمٛٛى لببهٛت انبكخٛزٚب ػهٗ انًؼبندت انبٕٛنٕخٛت نهًحزٔلبث انبخزٔكًٛٛبئٛت بٕخٕد
:كزٔيبحٕغزافٛب بٕخٕد انغبس )(CPG األكسد (O2) ٍٛانخ ٙححث ػهٗ انمٛبص يٍ خالل أسبنٛب ححهٛهٛت يثم
ٔكزٔيبحٕغزافٛب ػٍ طزٚك انطبمت انزلٛمت ) (TLCانًؼخًذح ٍٛػهٗ ٔخٕد كبشف انخأ ٍٚببنهٓب ) .(FIDبؼذ يزٔر فخزة
انحضبَت ٔ ححج ظزٔف يٓٛئت ٚخى ححهٛم انًٕاد انُفطٛت انًٕخٕدة ٔانًشكهت نألخشاء انزئٛسٛت انًكَٕت نهبخزٔل انخبو
(انًشبؼت ٔ انؼطزٚت).
ببسخخذاو طزٚمت انخسهسم اند ُٙٛانذ٘ ٚحث ػهٗ ADNr 16Sحى حؼ ٔ ٍٛٛحؼزٚف حزكٛب انكبئُبث انحٛت انذلٛمت انًخخبرة
ٔ انًٕخٕدة ف ٙانخزبت .حًج دراست لذرة ٔ إيكبَٛبث انبكخٛزٚب انًخخبرة ػهٗ ححهٛم انًهٕثبث انبٛخزٔكًٛبئٛت ٔ انبحث ػٍ
اندُٛبث ٔظٛفٛت انخزيٛش ٔ انًخخصت ف ٙاألكسذة األٔنٗ نهًٕاد انُفطٛت )( alkB, nahAc, nidAػُذ انبكخٛزٚب انًحصهت
ػهٓٛب.
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Pseudomonasيخخصص ف ٙحفكٛك انًهٕثبث انُفطٛت ٔ نّ انمذرة نخحهٛم انًهٕثبث نٕحذِ يثم انًكَٕبث انًشبؼت انثمٛهت :
)n-C19( Pristaneبحٕان ٔ %35.11 ٙانًكَٕبث انؼطزٚت )n-C20 ( Benzo [a] Pyrène :بحٕانٔ % 33.93 ٙنّ
%50.44نهًكَٕبث انًشبؼت ٔ بحٕانٙ انمذرة ػهٗ ححهٛم انبخزٔل ببالسخؼبَت ٔانخزبٛت يغ أحٛبء دلٛمت أخزٖ بحٕانٙ
%30.42نهًكَٕبث انؼطزٚت.
حزحبط فؼبنٛت انخحهم انبٕٛنٕخ ٙػٍ طزٚك انبكخٛزٚب انًحهٛت انخزابٛت بٕخٕد يسبراث اٚضٛت يحذدة ٔ يخخصت نُٕع يؼٍٛ
نبؼض انبكخٛزٚب ٔ نٕخٕد انخؼبٌٔ ٔانخزبٛت يغ يخخهف انكبئُبث انحٛت انذلٛمت انًٕخٕدة ف ٙانخزبت.
انكهًبث انذانت :يؼبندت بٕٛنٕخٛت -انًحزٔلبث انُفطٛت – - Pseudomonasانًحزٔلبث انؼطزٚت -انًحزٔلبث انًشبؼت
االنكبٌ -ADNr 16S -حؼ ٍٛٛاندُٛبث انٕظٛفٛت - alkB nahAc, nidAحزبٛت بسٛطت ٔ يخؼذدة نهبكخٛزٚب.
Table des matières
INTRODUCTION .......................................................................................................................................... 1
AVANT-PROPOS ......................................................................................................................................... 75
2. RÉSULTATS ............................................................................................................................................ 79
3. DISCUSSION ........................................................................................................................................... 81
AVANT-PROPOS ......................................................................................................................................... 92
Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques des 16 HAPs prioritaires de la liste EPA d’apères Vandecasteele,
2005 modifié .......................................................................................................................................... 13
Tableau 2: Valeurs guides québécoises et francaises pour différents HAPs [Ministère de l'Enivironnement
du Québec, 1988] .................................................................................................................................. 16
Tableau 3: Normes de rejets en mer méditerranée (Naftec Spa, 2010a). ..................................................... 23
Tableau 4: Exemples de durée de demi-vie des HAPs dans le sol (LCPE, 1994). ........................................ 26
Tableau 5: Méthodes disponibles pour le traitement des eaux contaminées par des produits pétroliers
(Farhadian et al., 2008). ........................................................................................................................ 27
Tableau 6: Différentes techniques de traitement biologique des sols pollués (Scriban,1999). ..................... 31
Tableau 7: Principales souches bactériennes aérobies qui participent à la dégradation des HAPs et des
Alcanes .................................................................................................................................................. 36
Tableau 8: Proportions des différents familles de composés dans divers bruts pétroliers (Bertrand et Mille,
1989)...................................................................................................................................................... 48
Tableau 9: Qualité moyenne du brut Algérien (Naftec Spa, 2007) .............................................................. 49
Tableau 10: Enzymes capables d’oxyder les alcanes (Van Beilen et Funhoff, 2005) ................................... 55
Tableau 11: Diversité des gènes de dégradation des HAPs décrits dans la littérature (Louvel, 2010) ....... 60
Tableau 12: Cultivabilité des bactéries (Amann et al., 1995) ....................................................................... 62
Tableau 13: Composition (%) des fractions pétrolières dans les controles biotiques (P+c et RI+c) et
abiotiques pendant 28 jours d'incubation. ........................................................................................... 90
Tableau 14: Caractéristiques des différents couples d’amorces utilisées lors des PCRs de notre étude. .... 98
Tableau 15: Conditions chromatographiques pour l’analyse des hydrocarbures résiduels par CPG/FID
(Brito et al., 2006) ............................................................................................................................... 101
Tableau 16: Différents phénotypes des bactéries isolées ............................................................................ 111
Tableau 17: Numéro d’accession EMBL-GenBank et l’affiliation des séquences aux OTUs (unité
taxonomique opérationnelle) disponibles sur NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ....................... 112
Tableau 18: Résiduels hydrocarbures aromatiques polycycliques (mg/L) et % de biodégradation par les
souches sélectionnées. HAPs à haut poids moléculaire (50 mg/L) et HAPs à bas poids moléculaire
(100 mg/L) après 30 jours de culture. ................................................................................................ 121
Tableau 19: Résiduels alcanes (mg/L) et % de biodégradation par les souches sélectionnées. (250mg/L)
après 21 jours de culture. ................................................................................................................... 122
ABREVIATIONS
ARNr 16S : Sous-unité 16S de l’ARN ribosomal MEGA 0.5: Molecular Evolutionary Genetics
Analysis
B[a]P: Benzo[a]Pyrène
MSM: Mineral salt medium
BET: Bromure d’éthidium NAD/NADH : Nicotinamide Adénine
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Dinucléotide (oxydé/réduit)
bp / pb, kbp : base pair / paire de base, kilo
NahAc : Naphtalène dioxygénase
base pairs
ND : Non Déterminé
BSASOL:Base de données Basol sur les sols
pollués:http://basol.developpementdurable.gouv.fr/ NidA : Série de dioxygénase Gram-positif
P : Pétrole
GC-MS: Gas Chromatography-Mass Spectrometry
pH : Potentiel Hydrogène
dNTP : Désoxyribonucléotides triphosphates
Phe : Phénanthrène
DO : Densité optique
ppm : partie par million
EDTA : Ethylène Diamine Tétra Acétique
Pyr : Pyrène
qPCR : quantitative Polymerase Chain Reaction Unités de mesure :
qsp : quantité suffisante pour h, min, s : Heure, minute, seconde
RDP : Ribosomal Database Project l, ml, µl : Litre, milli-litre, microlitre
RT-PCR : Transcription inverse suivie d’une mM : Milli-molaire
réaction d’amplification génique
rpm : Rotation par minute
RI : Rejet Industriel
U : Unité
S (16S) : Svedberg
p/v : masse à volume
SARA : Saturés, Aromatiques, Résines et
Asphaltènes v/v : volume à volume
SDS : Sodium Dodécyl Sulfate C° : Celsius
sp. : Espèce non précise km, cm, mm, nm, µm : kilomètre, centimètre,
millimètre, nanomètre, micromètre
Std : Standard
TBE : Tris-Borate-EDTA g, mg, µg : Gramme, milligramme,
TE: Tris base, EDTA microgramme
Tris: trishydroxyméthylaminométhane
TLC/FID: Thin layer chromatography/ flame
ionization detection
Tm: Temperature of melting
UFC: Unité Formant Colonie
UV: Ultra Violet
INTRODUCTION
Introduction
INTRODUCTION
La pollution par les hydrocarbures en milieu marin et terrestre, qu’elle soit chronique
ou accidentelle, pose d’importants problèmes d’élimination. Les voies d’élimination chimique
et physique ont leurs limites du fait de leur coût ou de leur impact secondaire sur
l’environnement. La voie biologique est actuellement en plein essor et suscite de très
nombreux travaux par le monde. A l’heure où se développe une large «sensibilité écologique»
dans notre société, la connaissance des propriétés de biodégradabilité des produits pétroliers
apparaît comme un enjeu essentiel pour légitimer l’utilisation de ces produits. Les activités
industrielles dans les raffineries génèrent une multitude de composés plus ou moins toxiques
pour les organismes vivants. Par exemple, l’extraction, la transformation et l’utilisation des
produits pétroliers produisent des composés organiques tels les hydrocarbures que l’on
retrouve dans le pétrole brut, les fiouls, les essences, les lubrifiants, rejets industriels
principalement les rejets liquides et des composés inorganiques tels que les métaux lourds.
Ces polluants contaminent tous les compartiments de l’environnement : le sol, l’eau, l’air et la
biosphère.
Selon la base de données BASOL (http://basol.ecologie.gouv.fr/), les hydrocarbures,
les solvants halogénés et les métaux lourds sont les composés le plus souvent rencontrés, seuls
ou en mélanges, sur les sites pollués. Les composés les plus récalcitrants sont les
hydrocarbures saturés principalement, les alcanes lourds ramifiés tel le Pristane (C19), les
hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) à haut poids moléculaires tel le Pyrène
(C16) et Benzo[a] Pyrène (C20). Ces polluants sont présents au niveau de sites industriels en
activité, proche des voies de communication routière, au niveau des sols agricoles notamment
et autres écosystèmes aquatiques. Ces substances plus ou moins mobiles se déplacent soit
sous forme particulaire dans l’atmosphère, soit en solution dans les eaux de surface ou
souterraines. Elles peuvent alors atteindre différents écosystèmes naturels. De part leurs
caractéristiques physico-chimiques, ces composés présentent des dangers pour
l’environnement et les organismes vivants. Ils entrent dans la chaine alimentaire, et finissent,
à terme par menacer la santé humaine en raison de leurs des propriétés mutagènes et
cancérigènes (Yakimov et al., 2007).
Malgré leur transformation au cours de l’accumulation, les hydrocarbures enfouis dans
les sols et les nappes aquifères peuvent persister longuement. La formulation des
hydrocarbures d’origine pétrolière doivent prendre en compte des critères de biodégradabilité
afin de limiter autant qu’il est possible les risques environnementaux liés à leur utilisation. De
surcroît, dans l’hypothèse de déversements accidentels, l’autorité publique algérienne se doit
d’être en mesure de prévoir l’impact de toute pollution par ces hydrocarbures. Elle doit
également être à même de prédire si les chances d’atténuation naturelle du site pollué sont
réelles ou si, à l’inverse, il conviendrait d’entreprendre un traitement de dépollution. Il est
donc primordial de mettre en œuvre des moyens de dépollution des sites contaminés. Leur
réhabilitation peut être réalisée par traitement physico-chimique sur site ou après excavation
des sols. Les produits pétroliers sont aussi introduits dans l’environnement marin sous forme
de produits raffinés: carburants et huiles, leurs compositions dépendent de l’origine du pétrole
et des opérations subies au cours du raffinage.
1
Introduction
Ces techniques sont coûteuses et non respectueuses des écosystèmes. Cependant, pour
certains polluants organiques (les hydrocarbures saturés, les HAPs à hauts poids
moléculaires), une approche par bioremédiation peut être envisagée. Elle utilise le pouvoir
épurateur des microorganismes de l’environnement, et présente l’avantage d’être peu invasive
et moins onéreuse. Les groupes de composés pétroliers polluants pour lesquelles la
biodépollution est possible sont : Les hydrocarbures pétroliers (gasoils, fuels, kérosène, huiles
minérales) et Les déchets d’exploitation et de transformation du pétrole (boues et résidus
d’huiles de forages et principalement les rejets ou effluents liquides) (Bertrand et al., 1972).
La question du devenir des hydrocarbures dans les sites pollués a conduit dans un
premier temps à l’isolement et l’étude physiologique de nombreuses bactéries à partir du sol.
Ces études ont permis de montrer que certaines bactéries hydrocarbonoclastes principalement
les Pseudomonas sont capables de baser leur métabolisme exclusivement sur la dégradation
des hydrocarbures bien que de nombreuses sources de carbone plus facilement métabolisables
soient disponibles dans l’environnement (Juhasz et al., 2000). Cependant, les conditions de
culture limitent l’extrapolation du comportement de la souche isolée dans la communauté
exposée (seul 1% des souches d’une communauté est cultivable en condition de laboratoire).
Avec l’essor des outils moléculaires, de nouvelles approches sur l’écologie des communautés
bactériennes soumises à une contamination pétrolière ont pu être envisagées. Il a été démontré
que les consortia possèdent une efficacité de dégradation des hydrocarbures supérieure à des
souches isolées, grâce à la dégradation séquentielle de ces molécules ou encore à la mise en
place de coopérations métaboliques. Aussi, les métabolismes aérobies permettent une
dégradation plus rapide et plus efficace.
Ce travail a pour but d’étudier la capacité de dégradation des bactéries isolées du sol
contaminé par les hydrocarbures pétroliers de la raffinerie d’Arzew –Oran- afin de mettre au
point des procédés fiables de biodégradation accélérée. En cas de pollution, la connaissance
de la microflore locale du sol contaminé et de ses capacités intrinsèques de biodégradation est
essentielle pour pronostiquer les chances d'atténuation naturelle du site pollué.
2
Introduction
C'est en effet la microflore native qui détermine les capacités d'auto-épuration du site en
l'absence de toute limitation d'ordre physico-chimique. C'est pour cela qu'il est important de
connaître les compositions et performances des bactéries capables de dégrader les polluants.
Dans un premier temps, la problématique des effluents industriels, du rejet des
substances toxiques dans l’environnement et des traitements envisagés sera posée. Puis, les
résultats présentés sur les bactéries sélectionnées capables de dégrader les hydrocarbures
pétroliers principalement le rejet industriel liquide et le pétrole brut ainsi que les polluants
ciblés en HAPs et alcanes s’articuleront autour de quatre points principaux :
3
Introduction
Les constituants aromatiques et saturés ciblés ont été ensuite quantifiés individuellement par
la chromatographie en phase gazeuse (CPG), c’est une technique permettant de séparer les
composés d'un mélange. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles
d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. Dans notre étude, nous avons utilisé un
détecteur à ionisation de flamme (FID), afin de pouvoir caractériser les hydrocarbures
résiduels à la fin de la période d'incubation.
4
Chapitre 1
ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Étude bibliographique
1. HYDROCARBURES PETROLIERS
1.1. Définition
Les hydrocarbures sont des composés organiques contenant exclusivement des atomes
de carbones (C) et d'hydrogène (H) (Heider et al., 1999). D'après Harayama et al., (1999), le
terme « hydrocarbure pétrolier » est un terme générique qui désigne les mélanges de
composés organiques présents dans des matières géologiques comme l’huile, le bitume et le
charbon ou dérivés de ces matières.
1.2. Classification
Les hydrocarbures constituent la fraction la plus importante d'un brut pétrolier, ils
représentent entre 65 et 95 % de la plupart des pétroles bruts. Ces hydrocarbures peuvent être
classés en quatre familles principales qui sont présentes en proportions variables selon leur
origine: les hydrocarbures saturés (30 à 70 %), les hydrocarbures aromatiques et
polyaromatiques (20 à 40 %), les composés polaires (5 à 25 %) et les asphaltènes (0 à 10 %)
(Figure 1). Selon Syakti (2004), les hydrocarbures pétroliers sont classés comme suit:
6
Étude bibliographique
Les HAPs présentant un caractère génotoxique élevé, seize d’entre eux ont été classés par
l’American Environmental Protection Agency (EPA) comme polluants fortement toxiques
dont l’étude est prioritaire (Samanta et al., 2002) sont présentés dans la (Tableau 1). Depuis
quelques années, certains de ces 16 HAPs font également partie des listes de l’OMS
(Organisation Mondiale de la Santé) et de la Communauté Européenne. Ces HAPs sont
constitués de cycles aromatiques accolés en nombre croissant, allant de deux cycles (comme
le naphtalène) et n’ayant pas de limite supérieure encore démontrée. Cependant, certains
composés aromatiques contenant du soufre (comme par exemple le phénanthrothiophène :
C14H8S), de l’azote (comme la quinoline : C9H7N) ou de l’oxygène (comme le
dibenzofurane : C12H8O) sont parfois associés, et ces composés peuvent alors être aussi
considérés comme des HAPs. Les HAPs sont très stables, peu volatils et hydrophobes. Les
caractéristiques physico- chimiques de certains HAPs sont détaillées dans le (Tableau 1).
En général, les hydrocarbures aromatiques sont moins abondants que les alcanes, et ne
représentent que 10 à 30 % des hydrocarbures totaux d'un brut pétrolier.
1.2.3. Composés polaires
Les composés polaires correspondent à des molécules hétérocycliques, telles que:
- des composés oxygénés: phénols, acides carboxyliques, alcools, aldéhydes,…
- des composés soufrés: mercaptans, sulfures, disulfures,
- des composés azotés: pyridines, quinoléines,
Les dérivés soufrés sont dans la plupart des cas plus abondants que les composés oxygénés ou
azotés.
7
Étude bibliographique
Alcanes
Hydrocarbures aromatiques n-alcanes et alcanes ramifiés
(monoaromatiques et HAP)
Hexadécane Pristane
Benzène Octadécane
Phénanthrène 10 - 30% 10 - 40% Cycloalcanes
30 - 40%
Toluène
Cyclohexane
Naphtalène
5 - 20%
Métaux Composés
Porphyrines oxygénés Cyclopentane
Composés Composés
Asphaltènes azotés soufrés
8
Étude bibliographique
Les sols contaminés par les hydrocarbures présentent un danger lors d'un contact direct avec
l'homme ou l'animal ou lors de leur transfert dans les chaines alimentaires. C'est le
phénomène de bioaccumulation avec le piégeage par les végétaux et les animaux des
polluants ou de leurs produits de dégradation jusqu'à des teneurs atteignant les seuils de
toxicité (Gabet., 2004). Aux polluants transitant par les cours d’eau s’ajoutent ceux provenant
des territoires proches de la mer. Ils peuvent avoir une origine diffuse (principalement
agricole) ou ponctuelle (stations d’épuration industrielles ou urbaines).
Les impacts de la pollution par les hydrocarbures sont multiples. Les aspects les plus
évidents sont les grandes catastrophes très médiatisés (Soltani, 2004). La plus grande
catastrophe pétrolière fut celle du sous marin d’Ixtoc one, dans le golfe du Mexique où
350 000 tonnes de pétrole brut se sont déversées dans l’océan entre juin 1979 et février 1980.
D’autres sources viennent alourdir le bilan, citons l’exemple de la première guerre du Golfe,
où la fin du conflit en 1991 à révélé la catastrophe des champs de puits de pétrole en flamme
et le naufrage de pétroliers bombardés, déversant des quantités importantes de brut. Le bilan
total a été estimé à 800 000 tonnes déversées, 40 millions de tonnes de sols saturés de pétrole
et 700 km de côtes polluées (Kennish, 2001). En 1980, l’Algérie non plus n’a pas été
épargnée, à ce titre, l’accident du pétrolier Juan Lavalleja a déversé plus de 40 000
tonnes de pétrole dans les eaux territoriales algériennes. Un plan d’action Algérien
national pour la réduction de la pollution marine due à des activités industrielles menées à
terre a été élaboré sous l’égide du Ministère de l'Aménagement du Territoire et de
l'Environnement: MED POL/MED PAS (2005)
(http://www.themedpartnership.org/med/documents/library/backgrounddocuments/naps/en/att
achments%7Cattachments%3A001%7Cfile).
L’essor de l’industrie a entraîné le rejet massif de résidus toxiques dans
l’environnement. Le pétrole constituant la première source mondiale d’énergie, la pollution
par les hydrocarbures est la plus répandue et affecte le milieu marin, les environnements
côtiers et tout particulièrement le sol et les eaux souterraines.
9
Étude bibliographique
Les hydrocarbures aromatiques sont des composés toxiques, de par leur caractère
mutagène, carcinogène et récalcitrant (Phale et al., 2007). Ils constituent une classe de
composés hydrophobes, donnant une stabilité thermodynamique non négligeable. Les HAPs
se trouvent dans l’environnement à des doses relativement faibles, mais leur caractère
hydrophobe entraîne leur bioconcentration dans la chaîne alimentaire. Certains ont été
reconnus comme cancérigènes (benzo(a)pyrène, benzo(a)anthracène, chrysène, benzo (b)
fluoranthène…). Chez l’homme, les HAPs deviennent toxiques après oxydation enzymatique,
provoquant la formation de métabolites électrophiles solubles.
Ces métabolites peuvent alors former des adduits sur les acides nucléiques ainsi que sur les
protéines, amenant à un dérèglement du processus de division cellulaire et à la formation de
tumeurs (Kallimanis et al., 2007). Le Benzo(a)pyrène (BaP) est certainement le plus connu et
le plus étudié des HAPs quant à sa cancérogenicité. Certains de ses dérivés seraient impliqués
dans le développement de cancers du poumon chez l’homme par la formation d’adduits avec
l’ADN, notamment au niveau du gène p53 (Coppotelli et al., 2008). Des études font état
d’une plus grande mutagénicité de mélanges de HAPs lorsque la proportion en BaP est plus
importante (Phale et al., 2007).
L'homme est exposé aux HAPs par l'ingestion de denrées alimentaires (légumes,
viandes grillées), Phillips (1999) indique que l'alimentation est la source majoritaire
d'exposition aux HAPs pour les non fumeurs (70 % de l'exposition). Des études menées dans
différents pays ont montré que la quantité de HAP ingérée variait de 1,2 à 5 μg par jour.
Par comparaison, la fumée de cigarette ajoute 2 à 5 μg par jour pour une consommation d'un
paquet par jour. Les hydrocarbures aliphatiques chlorés (méthanes, éthanes et éthènes chlorés)
sont les plus étudiés car ce sont des composés chimiques qui sont largement utilisés pour leurs
propriétés de solvants et dont la toxicité est avérée (Ruder, 2006). En effet, le contact avec ces
contaminants peut entraîner des dommages, pouvant aller jusqu’au développement de cancers,
au niveau de nombreux organes (foie, reins, système cardio-vasculaire, système reproductif,
système nerveux) (Ruder, 2006 ; Spencer et al., 2002). Le caractère toxique du pétrole ne
s’applique pas qu’aux organismes supérieurs. En effet, de nombreuses études ont permis de
mettre en évidence le caractère toxique de certains hydrocarbures chez les bactéries (Shirai,
1987). Ces molécules agissent principalement en s’accumulant au niveau de la bicouche
lipidique de la membrane plasmique bactérienne. Elles affectent ainsi la cellule bactérienne en
modifiant la structure et l’intégrité membranaire.
Outre ces effets, certains composés volatils aromatiques contribuent, au travers de réactions
faisant intervenir les oxydes d'azote et le rayonnement solaire, à la formation de polluants
photochimiques, tels que l'ozone, nocifs pour la santé et l’environnement.
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Les HAPs sont classifiés selon les propriétés qui indiquent leur propension à transferer
vers les differentes phases. Le coefficient de partage octanol/eau (Kow), (Daugulis and
Janikowski, 2002) permet de qualifier l’hydrophobicité d’une molécule. Plus il est important,
plus la molécule aura tendance à s’adsorber sur une surface solide. La solubilité d’un
composé en phase aqueuse, reflétant le degré d’attraction pour ce solvant, est aussi un bon
indicateur de sa capacité d’adsorption. Dans la mesure où elle définit l’affinité du soluté pour
le solvant (Demaneche et al., 2004), plus la solubilité sera élevée, plus les forces reliant le
soluté au solvant seront fortes et plus l’adsorption sera faible. D’autre part, la température
d’ébullition permet d’évaluer la volatilité d’un composé. Plus la température d’ébullition est
faible, plus le composé aura tendance à transferer facilement vers la phase gazeuse.
Dans l’eau, les HAPs sont généralement présents en faible concentration du fait de
leur faible solubilité. Le caractère lipophile (Log Kow >3,2), des HAPs se traduit par une
tendance à se fixer sur les fractions organiques des matières en suspension (MES) et
sédiments (sols). Cela explique que la présence des HAPs est très marquée sur les matières en
suspension alors qu’elle est peu visible dans la phase aqueuse (Feix and Wiart, 1995).
12
Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques des 16 HAPs prioritaires de la liste EPA d’apères Vandecasteele, 2005 modifié
Anthracène C14H10 178.2 0.0778 216 340 0.045 5.54 Modérée Constaté Cancérigène chez les
animaux. Cancérigène/
Retenu par la norme
européenne relative à l’eau
Fluoranthène C16H10 202 8.72 10-3 107 383 0.26 5.22 Modérée Constaté
potable
Benzo[k] Confirmé
C20H12 252.3 4.12 10-6 169.4 443 0.0008 6 Elevé Cancérigène chez les
fluoranthène
animaux
Cancérigène de l’humain.
Confirmé
Benzo[a]pyrène C20H12 252.3 2.13 10-5 179 496 0.0038 6.04 Elevé Mutagène pour l’Homme
Dibenzo Constaté
C22H14 278.3 9.16 10-8 267 524 0.0006 6.75 Elevé
[a,h]anthracène
La solubilité est déterminée dans l’eau à 25°C. Le Log P0/W est défini comme le logarithme décimal du coefficient de partition K0W d’un composé donné dans un système de standard diphasique octanol/ eau.
Étude bibliographique
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Du fait du caractère toxique des HAPs, il est important de légiférer sur les teneurs
maximales admissibles pour éviter tout risque environnemental ou humain. Au Québec et en
France, ce qui concerne les eaux, le décret n° 2001-1220 du 20 décembre 2001 relatif aux
eaux destinées à la consommation humaine (à l'exception des eaux minérales naturelles)
indique que la somme des concentrations en benzo(b)fluoranthène, benzo(k)fluoranthène,
benzo(a)pyrène, benzo (g,h,i) pérylène et indéno (1,2,3-cd) pyrène ne doit pas excéder 0,1
μg.L-1. Il est à noter que la concentration en benzo[a]pyrène ne doit pas dépasser la valeur de
0,01 μg.L-1.
Dans le domaine de la pollution des sols, les seules données disponibles sont les VCI
(Valeur de Constat d'Impact), au-delà desquelles une étude de la nature de la pollution et de
ses impacts est nécessaire.
Des valeurs dites guides, servant de référence, sont utilisées au Québec [Ministère de
l'Environnement du Québec, 1988] où un seuil de concentration est défini, correspondant à la
valeur d'intervention au-dessus de laquelle le site doit être dépollué. Le (Tableau 2) récapitule
les valeurs retenues par ces gouvernements :
16
Étude bibliographique
3. HYDROCARBURES EN ALGERIE
3.1. Historique et situation géographique de la raffinerie d’Arzew
La raffinerie d’Arzew est l’une des cinq raffineries de pétrole d’Algérie, considérée
parmi les complexes les plus importants dans le Nord d’Afrique (Figure 2), troisième
raffinerie du pays après celles d’Alger et de Hassi-Messaoud. Elle est située dans la zone
industrielle sur le plateau d’el Mahgoune à 2 kilomètre de la ville d’Arzew et environ 40
kilomètres de la ville d’Oran. Elle se situe au voisinage du port d’Arzew qui lui permettant les
enlèvements par bateau des produits finis et semi-finis (Bouharis, 2005). Les enlèvements se
font aussi par : camions, pipes et par wagons. Elle est gérée par la société publique Naftec Spa
-SONATRACH.
Les hydrocarbures Algériens ont été nationalises juste après l’indépendance (24 février 1971),
ils occupent une place importante par rapport l’économie nationale. L’Algérie dispose de
potentialités importantes en pétrole et gaz naturel lesquels ne sont pas exploités sous forme de
matières premières mais transformés en partie sur place, selon une stratégie et une
planification rigoureuses. Le transport, la transformation et la commercialisation des
hydrocarbures ont été confiés à la société nationale SONATRACH dont les principaux sièges
se trouvent à: Hassi Messaoud, Alger, Arzew et Skikda.
Arzew, wilaya d’Oran représente un pôle important de transformation et transport des
hydrocarbures. Elle renferme un grand complexe d’industrie pétrochimique en Afrique.
Néanmoins, le développement d’une telle industrie s’est fait au détriment de l’environnement
de cette belle ville qu’on voit se dégrader d’année en année.
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Étude bibliographique
Elle répond aux exigences suivantes : Traitement de pétrole brut de Hassi Messaoud,
satisfaction des besoins de consommation du marché national, en carburant, lubrifiants et
bitumes, et l’exploitation de produits excédentaires (naphta kérosène, fuel, gas-oil et huile,
GPL (Gaz de Petrole Liquéfié), essences, lubrifiants et bitumes (Figure 3).
Plus que la moitié de la production est destiné au marché local et le reste à l’exploitation
(Europe, USA) qui sont de grands consommateurs de fuel léger a basse teneur en soufre et de
naphta utilisé comme charge pour les unités pétrochimiques produisant des gaz, essences et
gas-oils (Bouharis, 2005). La raffinerie approvisionne la région Ouest et Sud-Ouest du pays
par 62% de sa production. Les fuels (Basse Teneur en Soufre (BTS) et Haute Teneur en
Soufre (HTS) et la naphta pétrochimique sont exportés à partir du port d’Arzew.
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Théoriquement la législation protège la baie algérienne, cependant la réalité est toute autre.
Les textes de la loi restent inappliqués, puisque sur le terrain rien n’est respecté. Les rejets des
déchets riches en hydrocarbures émanant des zones industrielles se déversent directement
dans la grande bleue et sans parler de ceux émanant des bateaux poubelles et les navires de
ballastage qui traversent quotidiennement la côte, comme ce fut le cas en 1989 par le pétrolier
‘Maas Luis’ et en 2003 par le navire italien ‘Valbruna’ (Saker, 2007). En attendant
l’application de ces textes et la concrétisation de ces projets, seule l’état de la faune et la flore
pourra témoigner de la triste vérité.
En effet, la pollution par les hydrocarbures en Algérie a fait l’objet de plusieurs études,
parmi lesquelles on cite les travaux de Talbi (2009) et Ghouas en 2005 qui touchent aux
techniques physico-chimiques de traitement des effluents de la raffinerie d’Arzew- Oran, ils
montrent la composition des produits pétroliers tels que Naphta léger et le Naphta lourd, le
kérosène et gasoil. Le gasoil est le produit le plus chargé en alcane (62.36%), ces composés
varient entre (C1 à C30), et en aromatique (17.36%) et il regroupe le benzène et des
hydrocarbures aromatiques non identifiés. Yassa (2005) cible la pollution atmosphérique, ces
travaux traitent la composition en particules organiques de la torche (combustion du pétrole
brut) émis par la raffinerie à Hassi-Messaoud et la comparer avec la pollution présente en
ville. La compostion en particules chimiques atmosphériques en n-alcanes est de 33% pour
(C16 et C34) tel Octadecane (0.012 ppm), et de 47% pour les n-alcanoique acides (A10 à
A30) tel acide pamitique (0.061 ppm). En HAPs 20% tels Phénanthrène (0.011 ppm) et
pyrène (0.003 ppm). Ladji (2010) étudie la composition organique du sable du Sahara pollué
par les hydrocarbures des différentes régions d’Algérie, Hassi-Messaoud, Hassi-Bahbah,
Laghouat, Tougguort et Ghardaia, la plus grande pollution est détectée en n-alcanes à Hassi-
Bahbah avec 66% entre (C16 à C35), le % de chaque n-alcanes est défini dans le sable pollué
et pour chaque ville. En HAPs la ville la plus polluée est Laghouat avec 21.8% entre les
aromatiques légers tels phénanthrènes, anthracène et les aromatiques lourds tels pyrènes et
benzo[a]pyrène, le % de chaque composé aromatique est défini dans le sable pollué et pour
chaque ville. Boutenfnouchet en (2005) a permis d’établir une cartographie de la pollution et
à évaluer la pollution industrielle par les hydrocarbures totaux au niveau de la plateforme
industrielle de Skikda.
Cependant, il serait intéressant de connaître l’identité de ces hydrocarbures directement dans
l’effluent industriel et même dans le pétrole brut avant et après le traitement en raffinerie, qui
est un élément important pour définir le degré du danger qu’ils constituent. C’est pourquoi,
dans notre travail nous nous sommes intéressés à la détermination de la teneur et la nature des
hydrocarbures présents dans le site de traitement de la raffinerie d’Arzew- Oran afin de
prévenir les risques courus dans l’avenir.
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Étude bibliographique
Types du réseau d’assainissement : Aérien et souterrain. Sites récepteurs des effluents : Oued
Tasmanite, mer. Ces rejets ou effluents liquides canalisés dans des systèmes de réseaux semi-
aériens ou souterrains sont récupérés dans des stations appropriées où ils seront traités.
Pour le traitement des effluents des unités de production 1. La méthode la plus simple et la
plus classique de traitement eaux-huile consiste à utiliser la séparation par gravité. Celle-ci
s’effectue dans des bassins rectangulaires (bassin PPI/API). L’huile écumée est renvoyée dans
des réservoirs pour être retraitée, l’eau prétraitée est évacuée vers la mer.
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Effluents traités
Le Tableau 3 ci-dessous illustre les normes de rejets en mer méditerranée.
Paramètres Normes
pH 6.5 à 8,5
DBO5 mg/l 35
DCO mg/l 120
MES mg/l 35
PHENOL mg/l 1
AZOTE TOTAL mg/l 10
PLOMB mg/l 0,1
CHROME EN Cr6+ mg/l 0,05
HYDROCARBURES mg/l 10
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Pétrole
Evaporation
Ecoulement latéral
Sol et sous-sol
Formation
d’une langue
Zone capillaire
Nappe phréatique Pétrole dans la
Phase aqueuse
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Étude bibliographique
Tableau 4: Exemples de durée de demi-vie des HAPs dans le sol (LCPE, 1994).
HAPs Demi-vie
Fluorène 32 à 60 jours
Phénanthrène 2.5 à 210 jours
Anthracène 170 jours à 8 ans
Fluoranthène 268 jours à 377 jours
Pyrène 2010 jours à 5.5 ans
Benzo[a]pyrène 0.3 à 58 ans
Le temps de demie vie correspond au temps nécessaire pour que la moitié d'une quantité ou d'une concentration
d'un polluant disparaisse du milieu ou de l'organisme qu'il contamine (Ballerini et al., 1998)
Les micro-organismes produisent des enzymes qui vont réagir avec les molécules
d’hydrocarbures pour les transformer en molécules généralement plus simples. Si la
biodégradation est complète, les polluants sont entièrement décomposés en CO2, c'est la
minéralisation.
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Étude bibliographique
Tableau 5: Méthodes disponibles pour le traitement des eaux contaminées par des
produits pétroliers (Farhadian et al., 2008).
A titre d’exemple, les differentes étapes du traitement d’un effluent de raffinerie sont
illustrées sur la (Figure 6). Des procédés d’épuration physicochimiques qui permettent
l’élimination de la pollution colloidale précèdent le traitement biologique qui a pour objectif
l’élimination de la pollution dissoute et biodégradable.
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Étude bibliographique
D’après le Royal Haskoning (2003), les meilleures techniques pour éliminer les HAPs des
eaux usées sont les suivantes:
1. séparation de l’huile et de l’eau avec un cyclone, par micro-filtration ou separateur API
(American Petroleum Institute),
2. micro filtration, media filtration granulaire ou flottaison des gaz,
3. traitement biologique.
Généralement, une raffinerie de pétrole traite les eaux usées de procédé de façon
semblable avec une chaine de traitement : l'épuisement des eaux acides sert principalement à
réduire la concentration des sulfures et de l'ammoniac et, à un moindre degré, les phénols
dans les eaux usées en provenance des unités d'hydrotraitement et de craquage, l'eau acide est
chauffée pour en récupérer les gaz. Les eaux acides épuisées sont utilisées de nouveau à
l'unité de dessalage en présence du pétrole brut où les phénols encore présents dans ces eaux
ont une plus forte tendance à migrer dans le pétrole brut en fonction du coefficient de partition
eau-huile. Les eaux usées sont ensuite traitées pour enlever les matières en suspension et les
huiles et graisses. Les eaux circulent d'abord dans des séparateurs où sédimentent les
particules et où flottent les huiles (hydrocarbures) libres qui sont récupérées dans le procédé
de raffinage. Par la suite, un flottateur à air dissous ou induit permet d'éliminer pratiquement
toutes les huiles libres en atteignant des concentrations de l'ordre de 10 mg/l. Un bassin
d'égalisation permet ensuite de régulariser le débit et sert également à équilibrer le pH avant le
traitement secondaire.
Sur ce dernier point, les raffineries se distinguent par leur traitement biologique. Ainsi, il
exixiste les réacteurs à lits bactériens, des systèmes à boues activées ou encore traitement des
eaux dans un étang d'aération. Ces trois systèmes sont suivis d'un décanteur secondaire. Les
eaux usées ainsi traitées sont mesurées et échantillonnées avant d'être rejetées au milieu
récepteur (génralement en mer).
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Étude bibliographique
Les effluents ayant subi un traitement physico-chimique préalable, sont peu chargés en
MES, leur DBO5 est donc essentiellement soluble (la DBO5 exprime le niveau de
biodégradabilité de l’effluent) ; leur composition en nutriments nécessaires à la vie
bactérienne (carbone, azote et phosphore) est rarement équilibrée, un complément est souvent
nécessaire ; les fortes concentrations en sels minéraux sont fréquentes et leurs variations
rapides nuisent au développement de l’épuration biologique, il faut donc les prévenir ; les
valeurs de pH et de température sont souvent variables ; elles doivent être surveillées avec
beaucoup d’attention et rectifiées pour être maintenues dans des zones optimales au
développement de l’activité biologique. Les paramètres de dimensionnement, charge
massique, charge volumique, temps de séjour, âge des boues sont éminemment variables
suivant les procédés utilisés et les secteurs industriels considérés (Gilbert et al., 2005).
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Étude bibliographique
Bien que le traitement biologique aérobie soit le traitement le plus courant pour traiter les
effluents industriels, l’application d’un tel procédé à l’élimination de certaines substances
prioritaires est difficile du fait I) de leur vitesse de dégradation parfois lente (nécessitant des
populations bactériennes adaptées), II) des faibles concentrations rencontrées pour certains
micropolluants (qui limitent les cinétiques), III) de la variabilité de l’effluent (Alinsafi et al.,
2006), IV) des propriétés inhibitrices ou toxiques de certaines molécules sur les
microorganismes et enfin V) des processus de transfert par volatilisation et adsorption qui
peuvent nuire à la biodisponibilité et qui sont rarement maîtrisés (Daifullah et al., 2003; Ania
et al., 2007).
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Étude bibliographique
"Biosparging
(biostimulation-bioaugmentation)
Pour améliorer la dégradation
Tertre biologique
(biotertre)
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Étude bibliographique
La biofiltration consiste à l’utilisation d’un biolfiltre pour traiter les émissions gazeuses : Le
principe consiste à utiliser des microorganismes pour dégrader les polluants contenus dans
l’air à traiter : la phase aqueuse (l’air contaminé) est mise en contact avec une phase aqueuse
dans laquelle se développe la population microbienne, connue aussi sous le nom de la
biomasse. Dans une unité de biofiltration, l’air à épurer (à dépolluer) traverse d’abord un filtre
et un humidificateur afin de supprimer les particules (poussières, graisses) présentes dans le
gaz et d’amener le niveau d’humidité à 100%. L’air est ensuite introduit dans un réacteur (une
cuve) contenant un garnissage formé de matériaux très poreux (très avide pour l’humidité). A
la surface des particules qui constituent le garnissage se trouve un biofilm qui correspond à
une pellicule d’eau contenant des microorganismes (bactéries et champignons) dont la
fonction est de dégrader les polluants présents dans l’air à traiter. Cette technologie est par
exemple utilisée pour traiter l’air pollué par le xylène ou par des composés azotés (Abdelly,
2007).
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Étude bibliographique
La littérature concernant l’oxydation des hydrocarbures par les microorganismes indique que
la croissance cellulaire dépend des processus de transport des hydrocarbures à la surface
cellulaire et de passage à travers l’enveloppe cellulaire jusqu’au cytoplasme (Soltani, 2004).
Dans les conditions naturelles, la biodégradation des hydrocarbures est un processus lent et
complexe, son mécanisme simplifié est décrit dans la Figure 8. Elle se déroule selon une
réaction d’oxydation en chaine, les hydrocarbures sont transformés par cassures successives
en molécules de moins en moins complexe jusqu’à l’obtention de sous-produits simples qui
sont représentés par l’H2O et le CO2 avec renouvellement de la biomasse (Lecomte, 1995).
Deux processus sont communément impliqués dans la biodégradation des composés
organiques (INERIS, 2004) :
O
||
R-CH2- CH2- C-OH
O
||
CH3-C-OH
CO2 + H2O
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
En effet, lorsqu’il ya plusieurs bactéries impliquées, chaque microorganisme peut fournir les
enzymes impliquées dans une certaine étape de la dégradation. Les métabolites intermédiaires
de la dégradation des composés peuvent alors être utilisés comme source de carbone par les
autres bactéries (Marcoux, 1998). De plus, certains métabolites intermédiaires peuvent être
toxiques pour quelques bactéries tandis que d’autres peuvent les utiliser comme source de
carbone. Plusieurs études ont d’ailleurs montré la dégradation des HAPs par différents
consortium bactériens (Mueller et al., 1989; Yu et al., 2005)
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Il est cependant plus simple d’ensemencer le réacteur avec de la boue active provenant d’une
station d’épuration d’eau, dont la population microbienne s’adaptera d’elle-même. Quelque
soit l’origine de la souche dégradant le polluant, une population microbienne extrêmement
variée se développera dans le bioréacteur.
Il arrive souvent que les bactéries ne dégradent pas complètement les composés organiques
mais les transforment en métabolites secondaires, eux-mêmes utilisés comme substrats
nutritifs par d’autres espèces. Ainsi de proche en proche, les microorganismes finissent par
dégrader totalement lescomposés organiques en eau, sels et gaz carboniques (CO2). Les
cellules mortes servent à leur tour de substrat à des espèces saprophytes, si bien que le
réacteur peut être considéré comme un système fermé (Abedelly, 2007).
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Ils interviennent dans la formation de microcolonies, ils facilitent l’association en surface des
bactéries et de part ce fait la formation d’agrégats, ils assurent la formation d’une structure de
type filamenteuse et jouent un rôle dans la dispersion des biofilms (Pamp et Tolker-Nielsen,
2007).
Bactéries
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Chez les bactéries, les phénomènes de transferts les plus connus sont la conjugaison via des
plasmides, la transformation ou la transduction (Juhas et al., 2009). Ces phénomènes de
transferts horizontaux augmentent les capacités métaboliques des bactéries, notamment en
élargissant leur gamme de substrats, et permettent l’adaptation des populations microbiennes
à de nouveaux contaminants (van der Meer et al., 1992; van der Meer et Sentchilo, 2003).
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Étude bibliographique
Des microorganismes ont été isolés dans des sédiments marins, des océans, des eaux côtières,
des étangs arctiques, des lacs et des estuaires. Cependant, ces microorganismes se retrouvent
en proportions variables dans la communauté microbienne totale. Smit et al. (2001) ont
montré que la composition de la microflore des sols est modifiée par la venue d'une pollution
par des carburants, avec un enrichissement en Beta-Protéobactéries et/ou Gama-
Protéobactéries.
Les résultats de Kiyohara et al. (1978) montrent que la plupart des bactéries utilisant les
HAPs ont été trouvées dans des environnements où une activité humaine non négligeable à
amené des contaminations par HAPs. Les auteurs, notent également la rareté des souches
dégradant l'anthracène et le kérosène ainsi que l'ubiquite remarquable des souches dégradant
le phénanthrène. Il n'est pas exclu que cette études complaise aussi certains cas de dégradation
des HAPs par cométabolisme. Si les bactéries capables de dégrader le naphtalène sont
observées dans tous les sols en quantité non négligeables, c'est –à- dire supérieures à 104
UFC/g, les bactéries dégradant les HAPs à trois ou quatre cycles ne sont au contraire
présentes en quantités importantes (de 103à 106 UFC g-1 de sol) que dans les sols contaminés
par les HAPs.
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Étude bibliographique
c- Facteurs microbiologiques
Les hydrocarbures à faible poids moléculaire sont considérés comme des composés
toxiques pour les microorganismes à cause de leur grande solubilité et par conséquent leur
concentration très élevée dans les phases aqueuses (Zhang et al., 2009). L’action toxique du
polluant peut provoquer un ralentissement de l’activité de la microflore du sol (Vogel et
Ballerni, 2001).
Dans un habitat bien défini, il est reconnu que les différentes communautés microbiennes
autochtones ont eu la possibilité de développer des interactions :
· Positives : le concept de commensalisme implique l’action normale d’une population qui
modifie l’environnement de telle façon que ces modifications permettent le développement
d’une espèce.
· Négatives : parmi ces interactions, le phénomène dénommé amensalisme ou «antagonisme»
qui implique la production par une espèce donnée de métabolites inhibiteurs pour d’autre
population qui ne pourront ainsi venir coloniser l’habitat (Vogel et Ballerni, 2001).
d- Facteurs environnementaux
1. Influence de la température
La température est un paramètre pouvant influencer la biodégradation du pétrole en
modifiant son état physique, sa composition chimique, l’activité physiologique des
microorganismes et par conséquent la vitesse de dégradation des hydrocarbures, ainsi que la
nature et la concentration des espèces microbiennes présentes (Leahy et Colwell, 1990). Une
diminution de la température est généralement accompagnée par une diminution de la vitesse
de biodégradation qui peut être expliquée par une décroissance de l’activité enzymatique. Des
températures plus élevées ont pour effet d’augmenter la vitesse de biodégradation (Sikkema et
al., 1995 ). Le maximum de l’activité métabolique des microorganismes est généralement
observé à une température comprise entre 30 et 40 °C. Au delà de la température optimale de
croissance et de biodégradation on assiste à une augmentation de la toxicité des hydrocarbures
et une diminution de l’activité métabolique. Roling et al., (2004) mentionnent une inhibition
totale de la biodégradation au-delà de 80-90°C après l’isolement des bactéries thermophiles.
2. Influence de l’oxygène
L’étape initiale du catabolisme des hydrocarbures par les bactéries et les champignons
inclus l’oxydation de ces substrats par l’intermédiaire d’hydroxylases et d’oxygénases, pour
lesquelles l’oxygène moléculaire est indispensable. Les conditions aérobies sont, nécessaires
pour cette voie d’oxydation microbienne des hydrocarbures dans l’environnement (Leahy et
Colwell, 1990).
La concentration en oxygène a été identifiée comme une variable limitante de la vitesse de la
biodégradation du pétrole dans les sols, Marin et al. (2001), ont constaté une augmentation de
la dégradation des hydrocarbures totaux de 10 % par la bactérie Acinetobactercalcoaceticus,
après un apport supplémentaire d’oxygène par agitation. Théoriquement, 3,5 g d’oxygène sont
nécessaires pour l’oxydation complète de 1 g de pétrole (Soltani, 2004).
3. Influence des éléments nutritifs
Le rejet des hydrocarbures dans les environnements qui contiennent des éléments
nutritifs inorganiques en faibles concentrations, conduit généralement à des rapports
carbone/azote et carbone/phosphore très élevés, défavorables pour la croissance microbienne
(Leahy et Colwell, 1990).
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Étude bibliographique
Le pétrole lui-même contient de tels nutriments en petites quantités, mais ils sont toujours
présents sous forme de composés hétérocycliques (exemple: dérivés de la pyridine et du
pyrrole pour l’azote) ou organométalliques complexes; ils ne sont donc pas utilisables par les
microorganismes. L’azote et le phosphore sont donc des facteurs limitant la biodégradation
des hydrocarbures dans les sols (Bertrand et Mille, 1989).
4. Effet de la salinité
Les fortes salinités constituent une barrière naturelle pour la biodégradation des
hydrocarbures. Des chercheurs ont trouvé que la biodégradation des hydrocarbures est
maximale pour une concentration en sel de 0,4 M et diminue lentement pour des valeurs
supérieures et inférieures à celle-ci (Soltani, 2004).
Thiele-Bruhn et Brummer, 2004 ont montré que la vitesse de la biodégradation des
hydrocarbures décroit lorsque la salinité passe de 3,3 à 28,4%, et ils ont attribué ces résultats à
une réduction générale des vitesses métaboliques des microorganismes.
5. Effet du pH
Les biotopes naturels peuvent avoir des valeurs de pH très variables, allant de 2,5 à
11,0. Des valeurs extrêmes de pH pourraient avoir une influence négative sur la capacité des
microorganismes à dégrader les hydrocarbures. La croissance des bactéries hétérotrophes et
des champignons étant favorisée par un pH proche de la neutralité (Leahy et Colwell, 1990).
Liebeg et Cutright, 1999 et Straube et al., 2003 ont trouvé que la dégradation des
hydrocarbures est plus élevée dans des conditions légèrement basiques.
6. Effet de l’humidité
L’humidité est un paramètre important dans le processus de la biodégradation car l’eau
est un élément indispensable au développement des bactéries. Les bactéries sont influencées
par la concentration osmotique et la disponibilité en eau dans le sol, pour cella, Gabet (2004)
a signalé que pour une meilleure activité de biodégradation, l’humidité doit être de 25 à 90%.
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Des études sur la transformation des HAPs par les microrganismes ont montrés leur
toxicité cellulaire (Sikkema et al., 1995). Les HAPs de faible poids moléculaires constituent
généralement 2 à 20% des hydrocarbures des pétroles légers et moins de 2% des
hydrocarbures des pétroles lourds tels les alkyl-benzènes légers qui sont les plus toxiques à
cause de leur solubilité dans l’eau, mais peuvent cependant être métabolisés par les
microorganismes quand ils sont présents en faibles concentrations.
La structure moléculaire des HAPs détermine la vitesse de leur dégradation, un grand
nombre de méthyle empêche l’oxydation initiale, les polyaromatiques sont moins toxiques
pour les microoorganismes, mais ils sont rarement métabolisés et quand ils le sont leur
biodégradation est lente, c’est ce qui explique leur accumulation dans l’environnement. Ces
hydrocarbures aromatiques lourds constituent 2 à 10% des hydrocarbures des pétroles léger et
plus de 35% des hydrocarbures des pétroles lourds.
Les asphaltènes et les résines constituent une fraction faible du pétrole brut, 1 à 5 % du
pétrole légers alors qu’un pétrole lourd peut contenir plus de 25% d’asphaltènes et 20 % de
résines. Cette dernière classe de composés pétroliers n’est pas biodégradable ou très
lentement dégradable.
La biodégradabilité des pétroles bruts est très fortement dépendante de leur
composition (Atlas, 1981), à une température déterminée, un pétrole léger est plus susceptible
d’étre biodégradé qu’un pétrole lourd. Par exemple, un brut à très faible teneur en soufre et
très riche en composész saturés (exemple : Louisiane du Sud) (Tableau 8) sera facilement
biodégradé, contrairement à un fuel de type Bunker C à très haute teneur en soufre et
composés aromatiques. Les n-alcanes contenus dans un pétrole provenant du Vénézuéla sont
moins bien dégradés que ceux présents dans un pétrole de type Léger d’Arabie (Bertrand et
Mille, 1989). Les caractéristiques du brut algérien sont representés dans le Tableau 9.
Tableau 8: Proportions des différents familles de composés dans divers bruts pétroliers
(Bertrand et Mille, 1989)
Bruts pétroliers Saturés Aromatiques Polaires (Résines) Asphaltènes
Louisiane du Sud 69 20 10.3 0.3
Koweit 44 28.3 23.2 4.5
Buncker C 21.1 34.2 30.3 14.4
Léger d’Arabie 48 35 9 7.5
Tunisien (Asthar) 48 32 12 8
Vénézulien 46 21.6 19.3 9
Prudho Bay 55 25 10 10
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Étude bibliographique
Bertrand 1989, a rassemblé des règles qui ont des applications générales à l’ensemble des
micoorganismes :
1- Les hydrocarbures aliphatiques sont assimilés par une grande variété de microorganismes,
les composés aromatiques peuvent être oxydé mais sont assimilés par quelque bactéries
seulement.
2- Les n-alcanes à chaines courtes tels que n-nonane ne sont pas toujours assimilés mais
peuvent être oxydé, seuls quelques bactéries ont la capacité de croitre sur des alcanes plus
court que le n-octane. Quand la longueur des chaines augmente au delà de C9, le facteur de
production augmente, mais la vitesse d’oxydation décroit.
3- Les composés saturés sont plus rapidement dégradés que les insaturés.
4- Les composés ramifiés sont moins rapidement degradés que les composés non substitués.
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Étude bibliographique
Oxydation diterminale
Figure 10: Voie métabolique de dégradation des n-alcanes (van Beilen et al., 2003)
L’étude du système d’alcane hydroxylase de Pseudomonas putida a permis de mettre en
évidence une large spécificité de l’enzyme, celle-ci permettant l’oxydation d’n-alcanes,
d’alkylbenzènes et de cycloalcanes (Van Ravenswaay et van Linden, 1971).
Cette oxydation peut être monoterminale, biterminale ou subterminale, et nécessite de
l’énergie qui est le plus souvent fourni par l’oxydation d’un composé intermédiaire réduit tel
NADH (Figure 11). L’alcool obtenu est ensuite converti après plusieurs réactions en un acide
gras qui pourra être introduit dans les cycles de la β -oxydation et/ou des acides
tricarboxyliques. Les intermédiaires produits servent à d’autres réactions métaboliques, à la
constitution de biomasse cellulaire, de réserves lipidiques (inclusions) et peuvent également
être totalement minéralisés en CO2.
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
FAD : flavo adénine dinucléotide ; NADH : nicotinamide adénine dinucléotide ; ATP : adénine tri-phosphate ;
CoA : coenzymeA ; Cycle TCA : cycle des acides tri-carboxyliques
Figure 12: Voie de dégradation des alcanes chez Pseudomonas putida Gpo1, rôle et
localisation cellulaire des protéines Alk et de leur système de régulation
(Van Beilen et al., 2001)
7.1.2. Voies de dégradation des alcanes branchés
Les alcanes branchés contenant un ou deux groupements méthyles sur leurs chaînes
principales sont complètement métabolisés en CO2. Leurs voies de dégradation semblent
similaires à celles intervenant lors de la dégradation des alcanes linéaires (Thijsse et Van der
Linden, 1961). En général, plus les groupements méthyles sont éloignés sur la chaîne, plus la
biodégradation est facile (Pirnik, 1977). Les molécules présentant des carbones tertiaires sont
dégradées plus lentement. Les composés les plus récalcitrants sont ceux qui comportent un
carbone quaternaire. Plus la chaîne carbonée est grande et/ou plus le carbone substitué est près
du centre de la chaîne principale et/ou plus le degré de substitution est élevé, plus la molécule
est difficilement biodégradable (Mc Kenna, 1972).
Les composés branchés sont en général plus résistants à la dégradation que leurs homologues
linéaires. D'autres raisons pour lesquelles le mécanisme d'oxydation peut contribuer à cette
résistance, sont : I) les cellules sont incapables de transférer les molécules branchées au travers
des membranes, II) le système enzymatique n'est pas capable d'oxyder ce type de molécule,
III) les alcanes branchés ne parviennent pas à induire le système enzymatique d'oxydation ou
enfin, IV) le substrat est toxique pour les cellules.
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Oxydation subterminale
Oxydation terminale
Oxydation diterminale
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Étude bibliographique
Tableau 10: Enzymes capables d’oxyder les alcanes (Van Beilen et Funhoff, 2005)
Soluble méthane hydroxylase : à fer non hémique Methylisinus trichosporium OB3B C1-C16
monooxygenase Reductase: [2Fe-2S], FAD, NADH Methylococcus capsulatus (Bath)
Sous uité de régulation
méthane hydroxylase : à fer non hémique Tous les méthanotrophes connus C1-C5
monooxygenase
P450BM-3 polypeptide: FAD, FMN, NADPH Bacillus megaterium ATCC 14581 C3-C8
Quelques bactéries dégradant les n-alcanes et les cyclo-alcanes disposent d’un système
nécessitant la présence d’un cytochrome P450. Ainsi, une souche d’Acinetobacter
calcoaceticus, dégradant les alcanes à chaînes longues, dispose d’un système enzymatique
comprenant un cytochrome P450 inductible (Kleber et al., 1985). La spécificité de substrat du
cytochrome semble variable selon les micro-organismes (Sariaslani, 1991; Sariaslani & Omer,
1992). Ainsi, le cytochrome P450 identifié chez Xanthomonas sp. est inductible par le
cyclohexane et catalyse l’oxydation de nombreux hydrocarbures (alkylcyclohexane, terpènes
cycliques). Le système enzymatique identifié chez Streptomyces griseus est quant à lui
capable de réaliser l’hydroxylation de composés aromatiques et alicycliques (Sariaslani &
Omer, 1992). Récemment, Maier et al. (2001) ont cloné et étudié le cytochrome P450
d’Acinetobacter sp. EB104, impliqué dans l’oxydation des n-alcanes.
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Étude bibliographique
Entre parenthèses sont annotés les gènes codant pour les enzymes nécessaires à cette réaction d’oxydation.
Figure 14: Réaction d’oxydation initiale du naphtalène par la naphtalène dioxygénase
(NahAc) chez Pseudomonas NCIB 9816 (Habe et Omori, 2003).
L’étape initiale d’attaque des HAPs peut être réalisée via une monooxygénase, une
dioxygénase, ou par oxydation du groupement substitué par l’action de monooxygénase
(Gibson et Parales, 2000 ; Khan et al., 2001 ; Williams et Sayers, 1994). A l’issu de plusieurs
réactions biochimiques, l’attaque par une dioxygénase conduit à un cis-dihydrodiol
caractéristique de la dégradation bactérienne. Les produits sont par la suite minéralisés ou
incorporés en biomasse cellulaire (dépendant du nombre de cycles et de substitutions).
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Étude bibliographique
Figure 15: Dégradation du naphtalène en salicylate par voie intradiol par des bactéries
aérobies du genre Pseudomonas (Vandecasteele, 2005)
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Étude bibliographique
C’est généralement le gène codant la grande sous-unité α de la dioxygénase qui est utilisée
dans les études visant à détecter les gènes de dégradation des composés aromatiques. Cette
sous-unité est par exemple très conservée chez les bactéries du genre Pseudomonas (gène
nahAc chez Pseudomonas putida NAH7). Les différentes études effectuées montrent que cette
sous-unité est conservée au sein des différents genres étudiés : Pseudomonas, Comamonas,
Rhodococcus, mais semble très divergente entre les différents genres (Moser et Stahl, 2001).
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
7.2.3. Diversité des genres bactériens dégradant les HAPs et des gènes codant une
HAP-dioxygènase
De nombreuses bactéries distinctes sont capables d'amorcer la dégradation des HAPs
(Mueller et al., 1997). Il est intéressant de constater que les capacités métaboliques des genres
bactériens semblent liées à la morphologie. Les bactéries capables de dégrader le
phénanthrène et le fluoranthène appartiennent plutôt à des genres à Gram négatif comme
Achromobacter, Burkholderia, Pseudomonas et Sphingomonas (Rockne et al., 2000; Ho et
al., 2000). Des bactéries du genre Pseudomonas, appartenant à la classe des Gamma-
Protéobactéries, ont servi de modèles pour étudier le métabolisme du naphtalène et du
phénanthrène. De même, Pseudomonas aeruginosa a été isolée pour ses capacités à dégrader
le phénanthrène (Romero et al., 1998). L'étude de Juhasz et al. (1997) est l'une des premières
à montrer que Burkhoderia cepacia a été capable de croître sur du pyrène. Les bactéries
capables de dégrader le pyrène sont plus généralement des genres à Gram positif comme
Mycobacterium, Nocardia, Peanibacillus, et Rhodococcus. Les études montrant des genres
bactériens à Gram positif capable de croître sur le fluoranthène sont plus rares (Lopez et al.,
2005). La diversité des bactéries dégradantes peut être définie par une diversité génétique des
gènes codant les arènes dioxygènases, plus particulièrement les gènes codant la sous-unité ɑ
des HAP-dioxygènases. Le gène nah est un des premiers à avoir été étudié (Yen et Gunsalus,
1982), d'autres gènes ont été découverts par la suite (Tableau 11).
Tableau 11: Diversité des gènes de dégradation des HAPs décrits dans la littérature
(Louvel, 2010)
narAa Chromosome Rhodococcus sp. NCIMB 12038 AF082663 Larkin et al., 1999
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
v) elle est facilement obtenue par des méthodes standard d’extraction et de séquençage ; et
enfin, vi) les bases de données pour l’analyse comparative des séquences sont bien fournies et
régulièrement mises à jour (par exemple, Ribosomal Database Project (RDP)
(http://rdp.cme.msu.edu/html/), European Molecular Biology Laboratory (EMBL)
(http://www.ebi.ac.uk/embl/).
Le choix de l’ADNr 16S est parfois contesté. Il serait en effet préférable de pouvoir
établir les phylogénies sur plusieurs gènes afin de ne conserver que l’arbre consensus à toutes
ces phylogénies (Gupta, 1998). Les techniques fondées sur l’étude comparative des séquences
d’ADNr 16S contribuent à améliorer les connaissances concernant la diversité phylogénétique
microbienne associée à un milieu. Le séquençage et l’analyse des séquences obtenues, par
comparaison aux séquences présentes dans les banques de données, permettent d’accéder à la
diversité phylogénétique de l’échantillon (Amann et al., 1995). Même si l’ARNr 16S (~1.500
nucléotides) ne contient environ que deux fois moins d’informations que l’ARNr 23S (~3.000
nucléotides), il est actuellement le biomarqueur phylogénétique bactérien de référence. D’une
part, il est plus facile à cloner et à séquencer et d’autre part, les bases de données sur les
ARNr 16S sont les plus denses et ne cessent d’augmenter. Ainsi, certains serveurs, comme la
base de données RDP (Ribosomal Database Project) proposent des plateformes de traitement
en ligne et sont mis à jours régulièrement, c’est un outil très performant pour positionner
finement une séquence d’ADN 16S et savoir à quoi elle correspond.
Ce marqueur biologique de l’identité est présent chez tous les procaryotes. Il a servi de
pilier à la classification taxonomique des microorganismes jusqu’à ce jour, et par conséquent
à la description des communautés bactériennes de l’environnement. Sur cette base, le Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology (Ludwig et Klenk, 2001) définit les groupes
taxonomiques selon 7 niveaux principaux – Domaine, Phylum, Classe, Ordre, Famille, Genre,
Espèce – certains de ces niveaux pouvant être déclinés en sous-divisions. L’affiliation de
séquences au niveau du phylum est considérée comme fiable et aisée. Actuellement, 52
phylums bactériens majeurs ont été identifiés tous environnements confondus (Rappe et
Giovannoni, 2003).
En définitive, les séquences d’ARNr 16S constituent une bonne base d’affiliation
taxonomique mais la discrimination en genres et espèces doit s’appuyer sur un séquençage
plus systématique d’un panel de « gènes de référence » ou de génomes entiers. De plus, la
classification actuelle ne tient compte ni de la nature des écosystèmes d’où proviennent les
bactéries, ni des fonctions qu’elles y assurent.
La compréhension de la distribution et de l’organisation des groupes taxonomiques dans
différents biotopes reste un challenge pour la microbiologie environnementale.
Les approches moléculaires, indépendantes de la culture des micoorganismes, utilisées
pour déterminer la diversité et la structure des communautés bactériennes dans les
environnements naturels sont variées et se basent essentiellement sur la diversité des
séquences d’ADNr 16S (Theron et Cloete, 2000). Ces techniques reposent sur la variation de
la séquence et la structure secondaire de fragments d’ADNr 16S.
Ces techniques basées sur l’amplification par PCR d’un gène d’intérêt permettent soit
d’étudier des organismes en particulier, soit des groupes d’organismes (populations) ou
encore l’ensemble de la communauté.
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Étude bibliographique
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Étude bibliographique
Dans la classification bactérienne reposant sur le seul critère ARNr 16S, on considère
que deux gènes d’ARNr 16S montrant plus de 96% de similarités de séquence appartiennent à
des microorganismes de même genre, et que deux gènes ayant plus de 98% de similarité
appartiennent à la même espèce. Cependant, en se basant sur d’autres critères comme le taux
d’hybridation ADN : ADN, il s’avère que des espèces différentes peuvent avoir des gènes
d’ARNr 16S similaires à 99% (Torsvik et al., 1996). La notion d’espèce étant difficile à
définir sur des bases moléculaires, la plupart des auteurs préfèrent donc classer les gènes
d’ARNr 16S en unités taxonomiques opérationnelles (OTUs), définies par un seuil de
similarité, plutôt que de les affilier à des espèces ou des genres (Schloss et Handelsman,
2005).
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Étude bibliographique
Certaines de ces études ont prouvé que les taux de dégradation étaient souvent surestimés,
soulignant ainsi l’importance de travailler en milieu fermé afin de pouvoir effectuer des bilans
carbone sur les tests de dégradation effectués. En effet, d’après les travaux de Margesin et al.,
2003), 20 à 25 % de ces taux seraient dus à des pertes abiotiques par volatilisation ou
adsorption au cours des expériences, ce qui ramène le taux de dégradation réel à une valeur
comprise entre 15 et 40 %. Les données obtenues lors d’expérimentations sur site (Margesin
et Schinner, 2001 ; Stefanoff et Garcia, 1995) ont montré que 50 à 95 % du pétrole brut
pouvait disparaître en 3 à 24 mois.
Des études ont été effectuées sur la capacité de consortiums bactériens à dégrader les
produits pétroliers (Richard et Vogel, 1999). Ainsi, Marquez-Rocha et al. (2001) ont utilisé
un consortium contenant des bactéries du genre Pseudomonas, Serratia, Acinetobacter et
Flavobacterium et dégradant le pétrole brut à 85 % en 6 semaines.
Richard et Vogel (1999) ont isolé un consortium du sol contenant sept bactéries différentes
(cinq Pseudomonas, un Achromobacter et une non-identifiée) dont trois seulement sont
capables d’utiliser les hydrocarbures comme substrat de croissance. Il semblerait que les
autres bactéries présentes dans le consortium utilisent les intermédiaires métaboliques comme
substrat de croissance. Après 50 jours d’incubation, 90 % du pétrole initial était dégradé. La
dégradation d’un mélange aussi complexe que le pétrole dépend de différents types de
bactéries dont les capacités cataboliques sont complémentaires et qui peuvent ainsi coopérer
dans la biodégradation. Chaque biotope a un potentiel de dégradation, et donc une microflore
indigène qui lui est propre. Une contamination similaire ne provoque pas le développement de
communautés microbiennes similaires (Bundy et al., 2002). De plus, il apparaît que
l’exposition d’un sol à une pollution de type carbonée altère la composition de la microflore
considérée. Ainsi une forte pollution diminue la densité de la population microbienne alors
qu’une teneur plus faible enrichit la microflore en micro-organismes capables de dégrader les
hydrocarbures considérés (Long et al., 1995).
L’évolution de la diversité bactérienne ainsi que la capacité métabolique de la
communauté à faire face à la contamination semble être influencée par l’historique de
contamination de l’environnement étudié (Evans et al., 2004 ; Röling et al., 2004 ). En effet,
les communautés bactériennes présentant ou non un antécédent de contamination, ou encore
soumises à des contaminations chroniques ou accidentelles, ne présentent pas les mêmes
réponses adaptatives. Aussi, la durée d’exposition, la complexité et le niveau de
contamination en hydrocarbures influencent la réponse de la communauté (Yakimov et al.,
2005).
Des successions particulières de groupes bactériens au cours du processus de
remédiation des systèmes étudiés ont pu être mentionnées. Plusieurs études soulignent le lien
existant entre la contamination et la dynamique des communautés bactériennes comme la
dominance de Gamma-Proteobactéries lors de la contamination ou encore l’enrichissement
en Alpha-proteobactéries lors de l’appauvrissement en hydrocarbures (Röling et al., 2002).
Selon Head et al. (2006), la dynamique de la communauté est fonction de l’évolution
qualitative et quantitative des hydrocarbures présents et inversement. Dans le cas d’un pétrole
par exemple, au fur et à mesure que les bactéries dégradent les substrats pour lesquels elles
ont la meilleure affinité, les autres composés du pétrole deviennent prédominants dans le
mélange.
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Étude bibliographique
Il s’en suit ainsi une modification de la communauté avec la sélection d’autres organismes
présentant une meilleure affinité pour les composés restants.
Les capacités des bactéries à biodégrader des hydrocarbures ont ainsi déjà fait l’objet
de plusieurs publications (Abed et al., 2006; Chaillan et al., 2006. Même si leur rôle dans ces
processus reste discutable (De Oteyza et al., 2006), il apparaît que ces structures bactériennes
se développent parfaitement dans des environnements contaminés en produits pétroliers
(Abed et al., 2007 ; Hernandez-Raquet et al., 2006 ; Kasai et al., 2005). Par ailleurs,
l’identification et l’isolement de nombreuses espèces bactériennes hydrocarbonoclastes à
partir de ces écosystèmes soulignent leur potentiel de biodégradation (Chaillan et al., 2004 ;
Goréguès et al., 2004). Les bactéries de par leur richesse spécifique et métabolique
constituent des systèmes de choix pour étudier les processus métaboliques et de modification
de structure de communautés en réponse à une contamination pétrolière. L’étude de la
réponse des communautés microbienne à une contamination pétrolière apparaît d’un grand
intérêt en termes d’écologie microbienne afin de mieux comprendre la capacité d’adaptation
de ces structures face à des changements environnementaux importants.
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Étude bibliographique
Ils ont confirmé la présence, dans leur consortium, de micro-organismes connus pour
dégrader les composés aromatiques, tels que Sphingomonas paucimobilis EPA505 (Ye et al.,
1996), Mycobacterium str.PYR-1 (Cerniglia, 1992) ou Alcaligenes denitrificans WW1
(Stapleton et al., 2000).
Dans une optique de bioremédiation, il semble intéressant de détecter spécifiquement
les gènes impliqués dans la biodégradation. L’expression de ces gènes peut être détectée avec
des méthodes adaptées utilisant les ARNm (Van Hamme et al., 2003). Ces méthodes offrent
une alternative intéressante dans la mesure où la majorité des microorganismes présents dans
les sols par exemple demeurent à ce jour non cultivés. Les études concernant la détection de
certains gènes de dégradation et leur diversité se multiplient donc depuis quelques années.
Beaucoup d’auteurs ont travaillé à l’aide d’amorces dégénérées, en séparant les produits
d’amplification par clonage ou électrophorèse (Watanabe et al., 1998). Certaines voies de
dégradation sont bien caractérisées et quelques gènes de dégradation sont connus à l’heure
actuelle. Ceci a permis le développement d’une grande variété d’amorces.
La détection du gène alkB, impliqué dans le métabolisme des alcanes (Smits et al., 1999) ou
encore des gènes impliqués dans le métabolisme des hydrocarbures aromatiques (Widada et
al., 2002) est actuellement bien documentée. Langworthy et al. (1998) ont par exemple
montré que les gènes nahA et alkB sont plus fréquemment détectés dans les sols pollués que
dans les sols non pollués. Margesin et al. (2003) se sont, eux, intéressés à la caractérisation de
sols alpins pollués. Ils ont montrés que les génotypes des gènes de dégradation de bactéries à
Gram négatif, comme le gène alkB de Pseudomonas putida, se retrouvent plus fréquemment
dans les sols pollués que dans les sols non pollués. Les méthodes basées sur les ARNm
permettent d’évaluer l’expression des gènes de dégradation connus. Wilson et al. (1999) ont
ainsi développé une méthode pour isoler et caractériser les ARNm de micro-organismes
dégradant le naphtalène dans un aquifère contaminé. L’extraction d’ARNm suivie d’une
transcription inverse en ADNc et d’une amplification génique (RT-PCR) et couplée à une
analyse des ADNr 16S permet d’avoir une idée des micro-organismes actifs dans une
microflore (Nogales et al., 2001).
L’amélioration de notre compréhension de la composition des microflores et de
l’activité des micro-organismes impliqués dans la biodégradation permet de mieux envisager
les stratégies de bioremédiation acceptables pour un site pollué. Il est donc important de
développer une approche pluridisciplinaire permettant d’englober l’ensemble des paramètres
intervenant dans l’atténuation naturelle en utilisant toutes les méthodes mises à disposition,
quelles soit basées sur une approche moléculaire, culturale ou physiologique.
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Étude bibliographique
71
Étude bibliographique
72
Chapitre II
PROCÉDURES ÉXPÉRIMENTALES
Procédures expérimentales – Partie I
Partie 1
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Procédures expérimentales – Partie I
AVANT-PROPOS
L'Algérie est un pays producteur de pétrole et son économie est étroitement liée aux
hydrocarbures. La production, l’industrie du raffinage, le transport et l'utilisation du pétrole
contribuent à la pollution de l'environnement et produisent des problèmes écologiques
conséquents. La contamination des sols par des hydrocarbures pétroliers entraîne une baisse
significative de sa qualité et deviennent inutilisables. (Gojgic-Cvijovic et al., 2011). Les
rejets industriels dans les eaux entrainent un déséquilibre des écosystèmes aquatiques.
Le pétrole contient des hydrocarbures simples et des composés complexes, leurs principaux
composants sont les saturés, les composés aromatiques polycycliques (HAPs), les résines et
les asphaltènes (hydrocarbures hétérocycliques ou oxygénés) (Viñas et al., 2002).
L’élimination des hydrocarbures dans le milieu marin et le traitement biologique dans les
stations d'épuration des déchets industriels à partir des raffineries nécessite l'intervention de
différents facteurs biotiques et abiotiques dont la biodégradation par les micro-organismes
particulièrement les bactéries. Les hydrocarbures, y compris les HAPs, ont été classés comme
polluants prioritaires par l’Agence de protection environnementale des États-Unis et par
d’autres organisations de l’environnement et de la santé dans le monde (Yerushalmi et al.,
2003). Afin d'optimiser le processus de bioremediation, deux approches principales ont été
explorées, la biostimulation, où les nutriments sont ajoutés pour stimuler les bactéries, et la
bioaugmentation, dans laquelle les souches microbiennes avec des capacités de dégradation
spécifiques sont ajoutées à des micro-organismes indigènes isolés à partir du sol contaminé
(Viñas et al., 2002).
De nombreux micro-organismes capables de dégrader les hydrocarbures d’origine pétrolière
ont été isolés par les chercheurs. Selon la complexité des produits pétroliers, une combinaison
de souches bactériennes telles un consortium seront nécessaires pour atteindre une
dégradation extensive.
Cependant, la plupart des études rapportées dans la littérature sur la biodégradation du pétrole
brut ont été réalisées avec des cultures de bactéries simples ou mixtes. Il est généralement
admis qu'un seul micro-organisme n'est pas capable de dégrader tous les composés de ce
mélange complexe et les cultures mixtes ont non seulement un large choix de substrat, mais
aussi la dégradation a pu être réalisé dans un système de cooxydation et commensalisme
(Chikere et al., 2011). De nombreux scientifiques ont reporté que les populations mixtes avec
leurs vastes capacités enzymatiques sont nécessaires pour dégrader les mélanges complexes
d'hydrocarbures tels que le pétrole dans les milieux marins, l'eau douce, et le sol.
Les bactéries sont les organismes les plus actifs dans la dégradation du pétrole, elles agissent
comme agents dépolluants primaire sur le pétrole déversé dans l'environnement (Brooijmans
et al., 2009). Le séquençage de l'ADNr 16S a révélé que ces bactéries dépolluantes sont en
majorité affiliées au groupe de Gamma-Proteobacteria et Actinobacteria. Christopher et
Christopher, (2004) ont démontré l'importance des espèces de Pseudomonas dans le stade
précoce de dégradation du pétrole et dans le traitement des sols contaminés. D’autres
bactéries Gram-négatif telles Shewanella et Pseudomonas isolées de boues huileuses se sont
avérées tolérantes aux hydrocarbures saturés, mono-aromatique, et polyaromatiques. Ces
bactéries sont moins sensibles aux composés toxiques que les bactéries Gram-positif (Stancu
et Grifoll, 2011).
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Procédures expérimentales – Partie I
1. MATERIELS ET METHODES
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Procédures expérimentales – Partie I
Pour l'enrichissement, 20g de sol contaminé sont ajoutés à 200 ml de MSM contenant les
polluants filtrés (P ou RI) à 0,025% (v/v) de chaque source de carbone séparément (Brito et
al., 2006). Les cultures ont été maintenues en agitation (200 rpm) pendant 2 heures à
température ambiante (±28°C). Les bactéries capables d'utiliser les polluants ont été isolées
sur MSM. 20 ml de la culture précédente ont été repris en MSM frais dans des conditions
similaires, ainsi l’opération est répétée quatre fois. Après les quatre transferts consécutifs à de
courts intervalles (4 semaines), 1 ml de culture est dilué à 10-8 et 100µl ont été étalées sur
milieu Luria-Bertani (LB) agar et incubées à 30°C.
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Procédures expérimentales – Partie I
78
Procédures expérimentales – Partie I
Les cultures ont été incubées en agitation (180 rpm) à 30 °C pendant 4 semaines. Les témoins
(abiotiques) non inoculés pour chaque polluant ont été mis dans les mêmes conditions de
culture. Les interactions et les témoins non inoculés ont été soumis à l’extraction
d’hydrocarbures avec le dichlorométhane (DCM), puis passer à l’analyse de chromatographie
liquide sur colonnes de silice couplée à des mesures gravimétriques (méthode SARA)-
TLC/FID (type Iatroscan MK-5, Mitsubishi Kagaku Iatron, Tokyo, Japon) (Goto et al., 1994).
La solution du DCM (3 µl) été déposé sur l’extrémité d'une tige de gel de silice (Chromarods-
SIII; Iatron). Toutes les tiges sont repérés par les échantillons, le support est placé dans la
cuve de migration avec le premier éluant le n-hexane pendant 30 minutes pour séparer les
hydrocarbures saturés environ 10 cm à partit du dépôt, ensuite avec le toluène pour séparer les
hydrocarbures aromatiques (5cm), et enfin 2 min dans une solution de 95:5 DCM:méthanol
pour séparer les résines des asphaltènes. Après chaque migration, les colonnes ont été mises à
une température ambiante pendant 5-10 min afin de sécher le solvant et arrêter la
chromatographie. Dès que les colonnes sont séchées, elles sont placées dans le système
Iatroscan pour l’analyse (débit d'hydrogène 160 ml.min-1, le débit d'air 2 L. min-1 et 30 s
vitesse de numérisation scan-1), de manière efficace à analyser 10 échantillons en 5 minutes.
Les composants organiques séparés sur la colonne (chromarod) sont ionisés et chargés à la
fois positivement et négativement. Les données qui en résultent sont des pourcentages de
différentes fractions du mélange complexe représentés par des chromatographes; cette
méthode permet de séparer les hydrocarbures pétroliers en quatre pics appelés les fractions,
saturés, aromatiques, résines et asphaltènes (Maki et al., 1997). L’étalon interne (Std du
laboratoire, Newcastle, UK) a été utilisé pour évaluer la dégradation des hydrocarbures
analysés par TLC/FID, 3µl ont été déposé sur la colonne et analysé comme décrit ci-dessus.
Le processus nous a permis de suivre le contenu total des fractions d'hydrocarbures pétroliers
dans les échantillons contaminés.
2. RÉSULTATS
79
Procédures expérimentales – Partie I
80
Procédures expérimentales – Partie I
3. DISCUSSION
La biodégradation est l'un des principaux moyens par lesquels les polluants
d'hydrocarbures peuvent être retirés de l'environnement et de nombreuses espèces de bactéries
aérobies peuvent utiliser ces hydrocarbures et leurs dérivés dans l’environnement. L'efficacité
de biodégradation varie de 0,13% à 50% pour ces bactéries, d’autres organismes peuvent être
impliqués dans ce processus, agissant souvent sous forme de consortiums.
Il est souvent difficile de trouver des organismes qui dégradent individuellement toutes les
fractions de pétrole brut (aliphatiques et aromatiques) (Das et Chandran., 2011).
81
Procédures expérimentales – Partie I
Dans cette étude, quatre bactéries ont été caractérisées et identifiées, la phylogénie a permis
de les regrouper dans un groupe de Gamma-Protéobactéries et les affilier aux genres
Pseudomonas, Shewanella, Enterobacter et Serratia. Selon la littérature et leur affiliation, ces
souches ont été adaptées à un environnement complexe, et pourraient être d'une grande utilité
en bioremédiation, dans les zones contaminées par les hydrocarbures (Kim et Picardal, 2000).
Des consortiums microbiens ayant la capacité de dégrader le pétrole brut à basse température
ont été étudiée par Deppe et al., (2005), et Shewanella sp. et Pseudomonas sp. ont été les
phylotypes prédominants dans ce microcosme destinés à la biodégradation des hydrocarbures.
Les cultures mixtes montrent plus d’avantage de dégradation par rapport à la monoculture, y
compris la stabilité du consortium, avec une importante adaptation de ces bactéries dans des
combinaisons différentes, elles démontrent la capacité d'utiliser divers hydrocarbures, tels que
les alcanes à longue chaîne (n- C24 à n-C34), le pristane, (méthyl)-naphtalènes et des xylènes,
en tant que seule source de carbone et d’énergie. Katsivela et al., (2005) ont noté que le genre
Enterobacter en communauté microbienne à été détecté dans les boues résiduaires actives de
raffinerie et contribuent à l'épuisement des n-alcanes d'environ 75-100%. En outre, Chikere et
al. (2012) ont noté que la souche CEE_131 (T) a été isolée à partir des sédiments, cette
dernière à la capacité de dégrader les hydrocarbures aromatiques polycycliques à haut poids
moléculaire (quatre à cinq noyaux aromatiques, cette souche présente 91% de séquence
similaire avec Serratia proteomaculans DSM4597 (T).
Jin et al. (2012) ont démontré que Serratia sp. NB2 en culture mixte pourrait améliorer la
dégradation de nitrobenzène par rapport à sa croissance en culture simple.
Dans ce travail, la dégradation des hydrocarbures pétroliers par un consortium sélectionné à
montré que les fractions saturés et aromatiques ont subi une biodégradation. Les voies
métaboliques de dégradation majeures pour de nombreux composants pétroliers ont été
étudiées et documentées (Watkinson et Morgon, 1990) pour expliquer leur sensibilité et
accessibilité par les bactéries. Les n-alcanes sont les composés les plus facilement
biodégradés dans un mélange de pétrole, bien que les composés aromatiques sont
généralement les plus résistants à la biodégradation. Les hydrocarbures aromatiques de bas
poids moléculaire tels que le naphtalène peuvent être oxydés avant de nombreux composés
saturés (Zhu et al., 2001). Comme décrit par Maki et al., (2001), la diminution de la fraction
aromatique pourrait s'expliquer par l'hypothèse que les composés aromatiques ont été
transformés à une forme polaire (transformés à la fraction résine ou asphaltènes).
Différents facteurs influençant sur la dégradation des hydrocarbures ont été rapportés par
Cooney et al. (1985) et la plus importante est celle qui limite la biodégradation est leur
biodisponibilité aux micro-organismes. Les constituants d'hydrocarbures pétroliers se lient à
des composants du milieu, ils sont piégés et donc difficiles à être disponibles ou dégradés
(Barathi et Vasudevan, 2001).
Les hydrocarbures diffèrent par leur sensibilité et accessibilité aux attaques microbiennes, ils
peuvent généralement être classées comme suit: alcanes linéaires> alcanes ramifiés >
aromatiques légers > alcanes cycliques (Ulrici, 2000). Selon Warne Zouekia et al. (2010), une
biodégradation efficace dépend de divers paramètres, notamment sur la composition du
pétrole, sur la capacité des bactéries à adhérer et sur le potentiel de dégradation les
hydrocarbures.
82
Procédures expérimentales – Partie I
Beaucoup de recherches ont été effectuées pour comprendre les propriétés physico-chimiques
des différents constituants du pétrole brut, cependant la compréhension de la façon dont les
principales composantes du pétrole brut peuvent affecter l'adhésion bactérienne est encore très
limitée.
Le cométabolisme joue également un rôle important dans la biodégradation du pétrole.
Plusieurs hydrocarbures complexes, ramifiés, cycliques et aromatiques ne sont pas
biodégradables individuellement, ils ne peuvent être oxydés que par cométabolisme dans un
mélange d’hydrocarbures due à la présence d’autres substrats qui peuvent être métabolisés
facilement au sein d’un mélange complexe (Atlas, 1981).
Dans la présente étude, le système enzymatique d'alcane hydroxylase a été étudié, il s’agit du
gène alkB, codant une alcane hydroxylase intervenant dans l’attaque initiale des alcanes. Le
genre Pseudomonas a été différencié des autres genres par sa possession du gène alkB. La
première découverte dans la biodegradation de l’hexane concernant Pseudomonas fluorescens
(Smits et al., 2003). Les gènes codant pour l’alkB sont présents dans de nombreux groupes
bactériens ɑ -,ẞ- et ƴ -Proteobacteria, telles Rhodocuccus erythropolis, Pseudomonas
aeruginosa, plusieurs Acinetobacter sp. et Alcanivorax borkumensis (Van Beilen et al., 2005).
Les souches bactériennes peuvent contenir plusieurs alcanes hydroxylases membranaires de
types AlkBs, et il ya une explication possible à cette redondance apparente, les enzymes
peuvent avoir différentes gammes de substrat: certains enzymes oxydent les n-alcanes de C5 à
C12, tandis que d'autres oxydent de C10-C16 (Van Beilen et al., 2004). Différents AlkBs
pourraient également être actifs au cours des différentes phases de croissance, une autre
explication est que les AlkBs pourraient avoir des affinités constantes pour différents alcanes
ou quelques AlkBs pourraient préférentiellement oxyder les composés non-linéaires, ramifiés,
aliphatiques cycliques ou aromatiques.
La fraction organique des sols contaminés associée aux sables des localités du Sahara
Algérien a été caractérisé, elle contient une fraction de n-alcanes appartenant à C16-C35, des
hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) et des acides carboxyliques (Ladji et al.,
2010), ce qui peut expliquer l’adaptation des communautés bactériennes aux composés
organiques présents dans les sols contaminés.
Les résultats obtenus dans cette étude précisent que le consortium sélectionné, à été identifié
comme un consortium bactérien qui a le potentiel de dégrader les hydrocarbures pétroliers.
L'analyse phylogénétique a révélé que les souches appartiennent à des genres de
Pseudomonas, Enterobacter, Serratia et Shewanella. La culture bactérienne mixte
sélectionnée pourrait être utilisée en bioremédiation.
Récemment, des souches à Gram-négatif appartenant à Shewanella et Pseudomonas isolées de
boues actives sont révélées être tolérantes aux composés saturés (n-hexane, n-heptane,
n-décane, n-pentadécane, n-hexadécane, cyclohexane), aux mono-aromatiques (benzène,
toluène, styrène, isomères du xylène, éthylbenzène, propyl benzène) et aux aromatiques
polycycliques (Stancu et Grifoll, 2011). Dans le domaine de la bioremédiation, le choix d'une
méthode de biodégradation dépend en grande partie sur les capacités de dégradation naturelle
de la microflore locale. À cet égard, la TLC/FID est une technique prometteuse pour évaluer
en détail les capacités de bioremédiation de la microflore bactérienne.
83
Procédures expérimentales – Partie I
Cette méthode présente des avantages dans la mesure où on peut utiliser des hauts points
d'ébullition dans les mélanges des hydrocarbures tels que les saturés de poids moléculaire
élevé, les aromatiques, les résines et les asphaltènes, dont certains peuvent ne pas être
détectable par la GC ou la HPLC (Zhu et al., 2001). Dans une optique de bioremédiation,
l’analyse fonctionnelle des bactéries selectionnées, et donc des gènes intervenant dans les
processus de dégradation est un paramètre clé.
De ce qui précède, il est assez judicieux que cette culture bactérienne mixte présente des
candidats potentiels pour la bioremédiation des sites pollués par les hydrocarbures, cette étude
fournit un aperçu d'une meilleure compréhension de l'adaptation des bactéries vivant dans des
environnements pollués et d'élaborer une solution de mettre en œuvre des bio-stratégies
adéquates à l'avenir pour intervenir, contribuer et améliorer le bon fonctionnement au niveau
des sites de traitement biologique des raffineries.
Sites de prélèvement 1 et 2
Figure 17: Carte de l'Algérie, région d’échantillonnage de sols contaminés par les
hydrocarbures pétroliers - raffinerie d'Arzew-Oran (Smail et Khalef., 2007)
84
Procédures expérimentales – Partie I
0.8
LGM 106
0.6
LGM 101
DO
Jours
Figure 18: Courbe de croissance (DO) de bactéries en présence du pétrole (P) pendant
15 jours d'incubation.
0.8
LGM 106
0.6
LGM 101
DO
Jours
Figure 19: Courbe de croissance (DO) de bactéries en présence du rejet industriel (RI)
pendant 15 jours d'incubation
85
Procédures expérimentales – Partie I
M 1 2 3 4 5 6
1500 bp
1000 bp
800 bp
600 bp
400 bp
200 bp
Figure 20: Amplification PCR de l’ADNr 16S des bactéries du consortium sélectionné.
M: Marqueur de taille (ADN Smart Ladder 200 pb), 1 : Souche LGM 101, 2: LGM 103,
3: LGM 104, 4 : LGM 106, 5 : Contrôle positif (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853),
6: Contrôle négative sans ADN.
86
Procédures expérimentales – Partie I
32
Pseudomonas synxantha IAM12356
36 Pseudomonas mucidolens IAM12406
46 Pseudomonas azotoformans KS 0034
41 Pseudomonas fluorescens IAM 12022
100 Pseudomonas cedrina subsp. fulgida : DSM 14938 LMG 21467
75 Pseudomonas cedrina CFML 96-198
64
LGM 106 Gammaproteobacteria
Shewanella basaltis J83 (NR_044418)
Proteobacteria
Shewanella hafniensis P010 (NR_041296)
100
Shewanella oneidensis MR-1 (NR_074798)
97
80 LGM 101
62 Shewanella putrefaciens CN-32 (NR_074817)
87 Shewanella putrefaciens LMG 26268 (NR_044863)
87 LGM 103
61 Enterobacter hormaechei ATCC 49162 CIP 103441(NR_042154)
99
Enterobacter ludwigii EN-119 DSMZ 16688 CIP 108491(NR_042349)
Enterobacter asburiae JCM6051 (NR_024640)
45 Serratia plymuthica K-7 (NR_037111)
100
Serratia liquefaciens CIP 103238 (NR_042062)
LGM 104
99
Serratia proteamaculans 4364 (NR_037112)
Serratia proteamaculans 568 (NR_074820)
63
Serratia proteamaculans DSM 4543 (NR_025341)
Serratia grimesii DSM 30063 (NR_025340)
Sphingobium scionense (T) WP01 Alphaproteobacteria
0.02
Les arbres ont été générés avec 1000 répétition et le pourcentage (%) au niveau des nœuds représente les valeurs
de probabilités de la robustesse de la similitude. Bar = 0,02 substitution de nucléotides par site.
Figure 21: Arbre phylogénétique par la méthode Neighbor-joining basée sur les
séquences d’ADNr 16S des souches du consortium bactérien (LGM 106, LGM 101, LGM 103,
LGM 104) et des espèces apparentées du BLASTn database.
87
Procédures expérimentales – Partie I
1 2 3 4 5 M
1500 bp
1000 bp
800 bp
600 bp
400 bp
200 bp
88
Procédures expérimentales – Partie I
A Std (Standard)
Standard (rod 2) (2,1) Atlas,nrg_ch14.CeG_Iatroscan 03-18 1004,2,1,1
Acquired 18 March 2009 10:22:35
Response
64
Saturates
0.11
62
60
Aromatics 0.26
58
56 Resins
0.33
54
52 Asphaltenes
0.46
50
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Retention time
64
Response
64
62
62
60 0.12
60
0.11
58
58
56 0.47
56 0.28
54
0.23 54
0.35
52
0.33 52
0.46 0.42
50 0.32
64 64
0.11
62 62
60 60 0.47
0.26 0.12
58 58
56 56
0.33
54 54 0.27
0.35
52 0.46 52
0.42
50 50
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
Retention time Retention time
(A) Standard (Std), (B) Pétrole brut (P), (C) P avec Consortium, (D) le rejet industriel
(RI) et (E) RI avec consortium après 4 semaines d’incubation.
Figure 23: Chromatogrammes de la TLC/FID par (Iatroscan).
89
Procédures expérimentales – Partie I
Tableau 13: Composition (%) des fractions pétrolières dans les contrôles biotiques (P+c
et RI+c) et abiotiques pendant 28 jours d'incubation.
P: Pétrole brut, (P+c): Pétrole avec consortium, RI: Rejet industriel, (RI+c): Rejet industriel
avec consortium.
Std : Standard
90
Procédures expérimentales – Partie II
Partie 2
91
Procédures expérimentales – Partie II
AVANT-PROPOS
La production pétrolière, le raffinage et le transport des hydrocarbures contribuent fortement à
la pollution de l'environnement. L'industrie pétrochimique génère des rejets d'effluents
liquides vers un site de traitement. Les boues et les rejets industriels qui résultent de ce
procédé de traitement ont une teneur élevée en hydrocarbures dérivés du pétrole,
principalement des alcanes et des composés aromatiques (Overcash et Pal., 1979), ce qui les
rend des produits de déchet potentiellement dangereux. La dépollution, l’incinération des
déchets d’origine pétrolière des sites contaminés est une préoccupation majeure, en raison
d’une part, de l’impact de cette pollution sur l’environnement et la santé, liée notamment à la
propagation des molécules dangereuses dans le milieu et leur transfert dans les nappes
phréatiques et dans la chaîne alimentaire, et d’autre part des coûts exorbitants engendrés par
les projets de réhabilitation qui exigent souvent l’excavation des sols et le transport onéreux
des terres vers les installations de dépollution (Baheri et Meysami., 2001).
Les traitements mis en œuvre pour dépolluer les sites contaminés sont nombreux et depuis des
années déjà, de nouvelles technologies sont en développement. Sur le terrain, les techniques
de traitement thermiques et physico-chimiques sont les plus répandues, Le traitement
biologique, qui repose sur le pouvoir d’autoépuration naturel des micro-organismes
(bactéries, champignons), suscite actuellement un grand intérêt. L’étape ultime est
l’élimination complète (minéralisation) des polluants. Le traitement biologique peut se faire
enfin sur site. Deux types de traitements sont fréquemment utilisés : le traitement en tertre
dynamique (landfarming) ou en tertre statique (biotertre). L’intérêt de ces techniques réside
essentiellement dans le fait qu’elles ne nécessitent ni excavation, ni transport, ce qui rend leur
mise en œuvre bien moins coûteuse (Persson et Welander 1994). L’atténuation naturelle des
hydrocarbures pétroliers dans les sites pollués est dépendante à la fois des caractéristiques
physico-chimiques des polluants et des sols considérés. Cette situation justifie l’utilité des
études sur la biodégradabilité des produits pétroliers pour évaluer les possibilités d'atténuation
naturelle dans les sols afin de définir des stratégies de bioremédiation.
L’atténuation naturelle d’une pollution désigne l’ensemble des processus qui concourent à la
réduction de la pollution sur le site considéré. Il s’agit essentiellement de la migration des
polluants sous toutes leurs formes, mais aussi de la biodégradation. L’évaluation de
l’atténuation naturelle dans un site pollué défini est un objectif essentiel. En effet, elle vise à
prévoir le devenir de cette pollution pour en tirer les conclusions relatives aux actions à
entreprendre (Leahy et al., 1990).
D’autre part si une action de réhabilitation doit voir le jour, elle permet de proposer un type de
traitement et ses modalités principales (Atlas et al., 1991; Babla et al, 1998). Il semble donc
essentiel de travailler à la caractérisation de communautés bactériennes, telles que celles
dégradant les hydrocarbures pétroliers, car les relations entre les micro-organismes, entre eux
et vis-à-vis de leur environnement est un élément essentiel pour comprendre un écosystème,
et donc envisager une stratégie de bioremédiation.
Le pétrole brut est essentiellement composé d’hydrocarbures, parmi lesquels les
hydrocarbures saturés, les hydrocarbures aromatiques, les résines, et les asphaltènes. Ces
composés sont fortement nocifs, particulièrement les aromatiques puisqu’ils montrent des
propriétés toxiques, mutagènes et carcinogènes (Sudip et al., 2002).
92
Procédures expérimentales – Partie II
L’intérêt de ce travail est d’isoler à partir du sol contaminé par les hydrocarbures d’origine
pétrolière de la raffinerie d'Arzew des souches bactériennes aptes à vivre en présence des
composés ciblés, et d’évaluer la capacité de dégradation des souches sélectionnées par le
dosage des hydrocarbures résiduels par la GC/FID. Les isolats bactériens seront identifiés par
l’analyse des séquences d'ADNr 16S en utilisant les amorces universelles.
93
Procédures expérimentales – Partie II
Par ailleurs, des amorces spécifiques (biomarqueurs) seront utilisées afin d’amplifier les gènes
de dégradation (AlkB, NahAc et NidA). Dans cette étude, nous rapportons les isolats
capables de dégrader les hydrocarbures aromatiques et aliphatiques présents dans le pétrole
brut.
1. MATERIELS ET METHODES
1.1. Site de prélèvement
La collecte des échantillons s’est réalisée en Juin 2009 à partir des différents sites
(sols) contaminés par les hydrocarbures au niveau de la zone d’Arzew (Naftec-Sonatrach)
(Figure 25) et aussi à partir de bourbier stocké sur le site. Sur terrain, les échantillons du sol
contaminé sont prélevés à partir de 2 à 5 cm de la surface du sol pour des analyses
microbiologiques. Quinze échantillonnages au total ont été utilisés à partir de trois sites
contaminés par les hydrocarbures. Le pétrole brut (P) et le rejet industriel (RI) utilisé dans
cette étude sont fournis par la même compagnie, utilisé comme seule source de carbone et
d’énergie en culture d’enrichissement. Le pétrole utilisé en tant que source de carbone a été
filtré et conservé à 4°C.
94
Procédures expérimentales – Partie II
La précision de cette méthode a été évaluée en comparant la différence de coloration entre les
cultures en présence d’un témoin sans source de carbone pour chaque polluant.
95
Procédures expérimentales – Partie II
Après 15 à 20 min dans un bain de bromure d’éthidium à une concentration de 0,5 μg.ml-1
(BET : agent intercalant de l’ADN), les gels d’agarose ont été placés sous lumière UV afin de
visualiser par fluorescence la qualité et la quantité des ADNs génomiques extraits.
96
Procédures expérimentales – Partie II
Ainsi, les amorces ou les sondes utilisées sont plus ou moins dégénérées de manière à cibler
une diversité plus ou moins importante.
Dans cette étude, grâce à la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), des gènes d’intérêts
(également appelés biomarqueurs) ont été spécifiquement amplifiés (Tableau 14), à partir
de l’ADN génomique des souches bactérienne étudiées, trois gènes fonctionnels modèles ont
été choisis pour amplification, Il s’agit :
- Le gène alkB, codant une alcane hydroxylase intervenant dans l’attaque initiale des alcanes,
des amorces dégénérées ont été dessinés spécialement dans le but d'amplifier la séquence du
gène par PCR (Paisse et al. 2011). Un premier alignement de 42 séquences ont été utilisées à
partir d’une banque de données. Les séquences de l’alkB ont été utilisées pour l'alignement
des séquences de quatre groupes d'alcane hydroxylase décrits par Heiss-Blanquet et al,
(2005): le groupe de Rhodococcus, Pseudomonas groupe1, Pseudomonas groupe 2 et le
groupe d’Acinetobacter. Un second alignement de nucléotides de la même séquence a été
réalisé pour définir le niveau de la dégénérescence des amorces conçues (Paisse et al. 2011).
- Le gène nahAc codant la grande sous-unité de naphtalène dioxygénase chez les bactéries à
Gram-négatif, responsable de la première étape de dégradation des HAPs, intervenant dans le
métabolisme de composés aromatiques (tels : naphtalène, phénantrène ou encore
benzo[a]pyrene). Les amorces utilisées pour amplifier la grande sous-unité de la naphtalène
dioxygénase ont été développées suite à l’alignement sur ClustalW des séquences de
Burkholderia sp. U62430, Pseudomonas aeruginosa D84146, Pseudomonas fluorescens
AF00483 selon Bordenave et al. (2007)
- Les bactéries Gram-positif possèdent, quant à elles, plusieurs copies de gènes cataboliques
(nidA) leur conférant une large gamme de spécificité. Ainsi le système décrit chez
Mycobacterium PYR-1 comporte NidBA, dont le substrat préféré est le pyrène, et NidA3B3
qui oxyde préférentiellement le fluoranthène, mais qui oxyde aussi le naphtalène, le
phénanthrène, l’anthracène et le pyrène (Khan et al., 2001; Kim et al., 2006). Mycobacterium
6PY1 possède Pdo1 qui oxyde préférentiellement le pyrène, ainsi que le phénanthrène, et
Pdo2 qui oxyde les HAPs de 2 à 3 cycles avec une préférence pour le phénanthrène (Krivobok
et al., 2003).
Ces trois gènes cataboliques participent à la dégradation des hydrocarbures en condition
oxique, la dégradation d’hydrocarbures en condition d’aérobiose étant plus rapide qu’en
anaérobiose.
97
Procédures expérimentales – Partie II
Tableau 14: Caractéristiques des différents couples d’amorces utilisées lors des PCRs de
notre étude.
La température d’hybridation est évaluée à partir du Tm de chaque amorce calculé selon la formule Tm = 2nA/T
+ 4nG/C (avec nA/T le nombre de bases A et T dans l’amorce et nG/C le nombre de bases G et C). Y=C/T ;
R=A/G ; S= C/G ; W=A/T ; M=A/C ; K=G/T ; H=A/C/T ; N=A/C/T/G.
nidA GP F GGG GAA CAC GGT GCC RTG DAT RAA 292 52°C
GP R GGG GAA CAC GGT GCC RTG DAT RAA (Cébron et al.,2008)
Les souches utilisées comme contrôle positif (test de biodégradation des substrats
sélectionnés et amplifications PCR) sont des souches de références du laboratoire d’accueil
EEM (Equipe Environnement et Microbiologie de Pau).
Contrôle positif pour l’amplification de l’ADNr 16S : ADN génomique total de la souche
EEM 50 Pseudomonas aeruginosa.
Contrôle positif pour l’amplification de alkB : souche EEM 48 Marinobacter
hydrocarbonoclastticus ATTC 27132.
Contrôle positif pour l’amplification de nahAc : souche EEM 25 Alcaniorax venusti IS 04.
Contrôle positif pour l’amplification de nidA : souche Cd1 Rhodococcus rubberrzofil.
La vérification des amplifications PCR par comparaison avec un contrôle (ADN) positif est
réalisée par une électrophorèse sur gel d’agarose de 1 à 2 % en fonction de la taille du
fragment attendu (conditions de migration identiques à celle décrites précédemment).
98
Procédures expérimentales – Partie II
Les séquences codant pour l’ARN ribosomique 16S ont en parallèle été vérifiées avec le
programme CHECK_CHIMERA du Ribosomal Database Project II (RDP)
(http://35.8.164.52/cgis/chimera.cgi?su=SSU) pour déterminer d’éventuelles séquences
hybrides générées par PCR. Les séquences ont ensuite été alignées à l’aide du logiciel
ClustalW, puis ajustées à la taille de la séquence nucléotidique la plus courte
(http://helios.bto.ed.ac.uk/evolgen/filatov/proseq.html). Une analyse par le logiciel
MEGA5.05 (www.megasoftware.net) a permis de générer une matrice de distance élaborée
par comparaison des séquences d’ADN selon la méthode de neighbor joining. Cette matrice
est ensuite représentée sous forme d’un arbre phylogénétique. Des analyses de bootstrap
avec 1000 itérations ont été effectuées pour vérifier la robustesse des arbres. Par ailleurs, les
séquences obtenues dans cette étude ont été déposées dans les banques de données
DDBJ/EMBL/GenBank (voir numéros d’accession dans chapitre des résultats).
Les substrats (SIGMA-ALDRICH) de croissance choisis lors des tests de dégradation sont :
99
Procédures expérimentales – Partie II
Squalène C30H50
Figure 24: Structure des substrats en hydrocarbures ayant fait l’objet dans cette étude.
La concentration en hydrocarbures est de 50 mg/L pour les aromatiques lourds et 100 mg/L
pour les aromatiques légers, et 250 mg/L pour les alcanes (Brito et al., 2006).
100
Procédures expérimentales – Partie II
L’acquisition des données se fait par le logiciel informatique Borwin software (Borwin ver. 1.22, JMBS Developments,
Grenoble, France)
101
Procédures expérimentales – Partie II
2. RESULTATS ET DISCUSSIONS
102
Procédures expérimentales – Partie II
A la base, la solution de sels de Tétrazolium est incolore tandis que son produit «Formazan »
donne une solution fortement colorée (pourpre). Les sels sont réduits en présence d’un agent
réducteur (NADH) qui est responsable de la couleur pourpre.
L’activité totale (intensité de la couleur) de cette déshydrogénase dans l’échantillon augmente
avec l’augmentation des cellules viables et liée directement avec le nombre de cellules
métaboliquement actives dans le milieu.
Le (Tableau 16) résume les différents phénotypes, 5 groupes ont été obtenus avec le test INT,
ils ont été caractérisés : pétrole brut +, phénanthrène +, pyrène +, le benzo[a]pyrène+, et
(pétrole brut, benzo [a] pyrène) +.
103
Procédures expérimentales – Partie II
104
Procédures expérimentales – Partie II
La (Figure 28) illustre l’appartenance et la phylogenie des souches testées sur les
hydrocarbures aromatiques (Phe, Pyr et B[a]P) et les alcanes (Pristane, Octadécane et
Squalène). Ces souches appartiennet au groupe des Gamma-Protéobactéries et sont affiliées
aux genres de Pseudomonas sp. et Acineteobacter sp. Des isolats appartenant au groupe ƴ -
protéobactéries, étroitement liée à Acineteobacter sp. et Enterobacter sp. ont la capacité à
dégrader des hydrocarbures pétroliers (Wong et al, 2010 ; Thangaraj et al, 2008 ; Katsivela et
al, 2002).
Dans cette étude, le pourcentage élevé des isolats est représenté par le genre Pseudomonas sp.
ces bactéries sont faciles à cultiver dans les conditions utilisés et préférent le climat des
environnements méditerranéens (Fiorella et Spain, 1997); le genre Pseudomonas est parmi les
espèces qui montrent une grande efficacité à dégrader les hydrocarbures aromatiques
polycycliques et les alcanes (Zhang et al, 2011 ; Rocha et al, 2011).
Les isolats aappartenant au groupe Firmicutes incluant les bactéries du genre Bacillus et
Enterobacter (Figure 28) ont la capacité de minéraliser les hydrocarbures aromatiques
polycycliques lègers, Bacillus subtilis à la capacité d’assimiler le Pyrène (Das et Mukherjee.,
2007), et il a été démontré que la voie métabolique de dégradation du Benzo[a] Pyrène est
réalisée par B. Subtilis (BMT4i) (Lily et al.,2010).
Le pourcentage élevé des souches de Pseudomonas identifiées (~56%) dans ce travail pourrait
être liée à la propriété de ces microorganismes à coloniser les environnements contaminés par
des hydrocarbures (Karamalidis et al., 2010). Dans ce contexte, Pérez-Silva et al., (2006) ont
rapporté que l'espèce Pseudomonas était parmi les micro-organismes prédominants dans des
échantillons de sol hautement pollués par les hydrocarbures. Les espèces de ce genre ont une
large affinité pour les hydrocarbures et peuvent dégrader les alcanes tels, alycyclics,
thiophènes et aromatiques (Allen et al. 1997, Obayori et al., 2000). Les souches bactériennes
isolées sont adaptées à un environnement difficile, chose qui pourrait être d'une grande utilité
pour les inclure dans le domaine de décontamination et de bioremediation qui impliquent des
micro-organismes dans de telles circonstances.
105
Procédures expérimentales – Partie II
L’étude du gène alkB a permis de mettre en évidence la présence de ce gène chez les bactéries
du sol contaminé par les produits pétroliers de la raffinerie d’Arzew. Ainsi, malgré
l’optimisation des outils utilisés pour la détection de ce gène chez les bactéries, le gène alkB
ne permet pas de rendre compte de la réponse à une contamination pétrolière dans
l’environnement étudié. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces observations. Tout
d’abord, la dégradation des alcanes au sein de communautés impliquerait plusieurs familles
d’enzymes, dont les cytochromes P450, aux spécificités de substrats différentes. Il serait donc
intéressant de suivre également la détection des gènes codant pour les cytochromes P450
durant 30 jours d’incubation. Par conséquent, la detection de ce gène n’étant pas spécifique à
la contamination, ce gène ne peut être utilisé comme gène modèle pour caractériser la réponse
de la communauté bactérienne à une contamination pétrolière spécifique aux alcanes.
Cependant, la recherche d’autres gènes de dégradation tels les gènes codant un cytochrome
(P450), susceptible d’intervenir dans la dégradation des iso-alcanes sont nécessaires afin de
mieux caractériser la microflore bactérienne, et sa capacité de dégradation vis-à-vis d’une
contamination par les alcanes.
Gène Nah Ac
La naphtalène dioxygénase (nahAc) susceptible d’intervenir dans l’attaque initiale des
hydrocarbures aromatique des bactéries Gram-négatif. La taille recherchée est de 437 bp.
La (Figure 30) représente un des gels des tests de mise au point de la méthode PCR, la taille
amplifiée est de 600 bp pour la plupart des souches testées. Le séquençage du produit PCR à
révélé que la partie amplifiée code pour une protéine (amino acid permease, APC family) et
non pas pour les dioxygenases responsables de l’attaque initiale des aromatiques (cela peut
s’expliquer par le problème d’alignement des amorces).
Gène NidA
La taille recherchée est de 292 bp. La (Figure 31) représente un des gels des amplifications.
Les amorces ont permis d’amplifier différentes tailles chez les souches potentiellement
impliquées dans la dégradation des aromatiques, chez les bactéries Gram-positif et les
bactéries Gram-négatif. La bande amplifiée entre 200 et 450 bp ne correspondait pas à la taille
recherchée sauf pour les souches LGM 10 et LGM 12 à environ 292 pb, ces souches sont
Gram-négatif appartenant au genre Pseudomonas sp. Résultats qui ne concordent pas avec la
littérature, les bactéries Gram positif possèdent plusieurs copies de gènes cataboliques leur
conférant une large gamme de spécificité. Le système décrit chez Mycobacterium PYR-1
comporte NidA, dont le substrat préféré est le pyrène, et NidA3B3 qui oxyde
préférentiellement le fluoranthène, mais qui oxyde aussi le naphtalène, le phénanthrène,
l’anthracène et le pyrène (Khan et al., 2001; Kim et al., 2006).
Un séquençage des produits amplifiés pour les Gram-positif et Gram-négatif est en cours afin
de confirmer la présence ou pas du gène nidA et l’appartenance de ce gène à la banque de
données des gènes responsables dans l’attaque initiale des hydrocarbures aromatique des
bactéries Gram-positif (Cébron et al., 2008).
106
Procédures expérimentales – Partie II
2.4. Biodégradation (%) des bactéries sélectionnées vis-à-vis des substrats choisis
Afin de caractériser au mieux les capacités de dégradation des bactéries identifiées vis-
à-vis des substrats sélectionnés, la quantité du substrat biodégradé a été mesurée en utilisant
l’analyse en chromatographie en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme
(CPG-FID). Ce type d’analyse nécessite, pour être répétable, une intégration très minutieuse
des chromatogrammes. Au niveau du test lui-même, il convenait également de ne pas négliger
la mise en œuvre de fioles dites « abiotiques », afin de quantifier les pertes liées notamment
aux fuites de substrats, des fioles dites « biotiques » pour s’assurer que la bactérie utilise la
source de carbone mise en culture et fioles dites « T0 » afin de vérifier la quantité
d’hydrocarbure mise au départ.
Quantification des hydrocarbures résiduels par CPG-FID
Les hydrocarbures résiduels sont donnés par CPG-FID en fin de test de dégradation. C’est
l’analyse fine du chromatogramme qui nous permet de quantifier ces hydrocarbures résiduels.
Les pics sont intégrés par rapport à la ligne de base du chromatogramme. C’est la différence
d’aire entre les chromatogrammes en début et en fin de test qui nous permet d’accéder aux
pourcentages de dégradation.
L’ensemble des résultats (%) de biodégradation des alcanes linéaires (C18) et branchés
utilisés (C19 et C30) et les aromatiques légers (Phe) et aromatiques lourds (Pyr er B[a]pyrene
par 23 espèces choisies sont présentés dans le (Figure 32 et 33 respectivement).
Biodégradation des n-alcanes
La dégradation des composés linéaires et ramifiés a été étudiée de façon indépendante pour
confirmer l'activité de dégradation des bactéries sélectionnées vis-à-vis des alcanes, à la fin de
la période d’incubation de 21 jours, les n-alcanes diminuent au cours du temps, mais reste
toujours présent à la fin du test de dégradation. Le genre Pseudomonas est un groupe de
bactéries qui présente une gamme variée d'activités métaboliques, y compris la dégradation de
divers hydrocarbures aliphatiques (n-alcanes) (Binazadeh et al, 2009) et ramifiés comme
source de carbone et d'énergie (Xie et al, 2011 ; Vomberg et Klinner, 2000).
Les alcanes avec une longueur de chaîne carbonée de C18, C19 et C30 ont été utilisés pour
tester la capacité de certaines bactéries qui ont répondu positivement au test de sélection
précédent (test INT). Les résultats indiquent que sur une période de 21 jours d'incubation à
30 °C dans le milieu MSM contenant 250 mg/L d’alcane que la dégradation de n-alcanes est
estimée à 13,29 % pour l’Octadecane par Pseudomonas sp. (LGM 27), 21.33% pour le
Squalène par Pseudomonas sp. (LGM 31) et 35.11% pour le Pristane (Tableau 18) par
Pseudomonas sp. (LGM 20), à signaler que ces souches possèdent le gène alkB.
La minéralisation du Pristane (C19) par les bactéries est plus rapide, alors qu’elle est plus
lente sur les n-alcanes tels Octadecane et Squalène (C18 et C30), la biodégradation de
l’Octadecane (C18) était beaucoup plus lente que c’elle du Pristane, cela est due au caractère
hydrophobe élevé de l’octadécane (Grötzschel et al, 2002 ; Hua et Wang, 2011).
La valeur résiduelle minimale des n-alcanes observée est pour 242.58 mg/L pour le Pristane
par Pseudomonas sp. (LGM 20), 304.17 mg/L pour l’Octadecane par Pseudomonas sp. (LGM
27) et 322.54 mg/L pour Squalène par Pseudomonas sp (LGM 31), cependant les pertes en
abiotique sont de 18.35% pour le Pristane 0.17% pour l’Octadécane.
107
Procédures expérimentales – Partie II
108
Procédures expérimentales – Partie II
Un isolat observé possédant le gène alkB à la capacité de dégrader à la fois les HAPs et les n-
alcanes, Pseudomoans sp. LGM 2 à la capacité de minéraliser l’alcane ramifié (Pristane) à
29.65% après 21 jours d’incubation, le Pyrène à 9.61%, et le Benzo[a]Pyrène à 15.37%
après 30 jours d’incubation, cette souche de Pseudomonas sp. possède à la fois les voies
cataboliques responsables de la dégradation des aromatiques et des aliphatiques. Il a été
rapporté que les deux composés HAP et alcanes peuvent être dégradés par une seule espèce
bactérienne (Sotsky et al, 1994; Whyte et al., 1997).
Le genre Pseudomonas à la capacité de croître sur les deux fractions aliphatiques et
aromatiques de pétrole, ce genre d’espèce présente un grand intérêt dans la bioremediation,
non seulement pour la dégradations des hydrocarbures pétroliers, mais aussi une gamme
variée de composés xénobiotiques (Parales et al., 2002). Cette capacité différencie
Pseudomonas sp. (LGM2) de toutes les bactéries isolées à partir du même site contaminé par
les hydrocarbures.
Dans notre étude, la prédominance de la minéralisation des hydrocarbures aliphatiques
estimée à 35.11% cas du Pristane (Tableau 19), elle est plus élevée que c’elle des
aromatiques estimée à 33.93% cas du B[a]P (Tableaux 18) ainsi que la dégradation des
aliphatiques est plus rapide, ces résultats ont été observés dans plusieurs études (Vinas et al.,
2002 ; Manee et al, 1998 ; Hasanshahian et Giti (2008).
L’accessibilité difficile des substrats complexes pour les microorganismes apparaît comme un
facteur limitant important à prendre en compte pour expliquer ce phénomène. En effet, ce sont
les hydrocarbures les plus lourds et complexes (cas du Squalène dans notre étude) qui
résistent le plus à la biodégradation.
Dans la présente étude, les résultats montrent les C18, C30 des n-alcanes sont faiblement
dégradés par les bactéries testées en comparant avec C19, les données fournies de l’étude par
Ladji et al, (2010) ont montré que les n-alcanes tels C18 et C30 ne sont pas des constituants
abondants dans le sable contaminé par les hydrocarbures de Hassi-Messaoud, donc moins
presents dans le pétrole brut, contrairement aux composés aromatiques qui sont plus présents
dans le sable contaminé. A ce stade, il est important de considérer l’adaptation et la
biodisponibilité des composés pour utilisation microbienne (Reid et al., 2000).
L'adaptation des bactéries aux contaminants a été largement mentionnée dans la
biodégradation du pétrole (Horowitz et Atlas., 1977 ; Solano et al., 2000). Penet et al., (2006)
ont montré une comparaison entre les échantillons de sol contaminé et non contaminé par une
adaptation à la pollution, les capacités de dégradation des bactéries du sol contaminé ont été
plus élevés que ceux des sols non contaminés.
Ce travail a montré que les souches sélectionnées identifiées comme Pseudomonas sp. ont le
potentiel d’utiliser efficacement les fractions de n-alcanes ramifiés (Pristane) comme source
de carbone et certains Pseudomonas sp., Bacillus sp. Enterobacter sp et Acinetebacter sp.
étaient capables de dégrader les hydrocarbures aromatiques récalcitrants comme le pyrène et
le Benzo[a]Pyrène. Par conséquent, nos résultats suggèrent que ces micro-organismes peuvent
être intéressants pour une application dans les techniques de la bioremédiation et utilisées
dans un site de traitement biologique des eaux usées des stations de raffinerie. Ils seraient
donc des candidates potentiellement importantes afin de sélectionner un consortium en
biotechnologie.
109
Procédures expérimentales – Partie II
Ainsi, ces souches peuvent être utilisées pour concevoir des cultures mixtes avec des
capacités de biodégradation spécifiques pour des fractions pétrolières déterminés. Néanmoins,
des études devraient être menées pour évaluer les interactions microbiennes au cours de la
biodégradation des hydrocarbures au fil du temps.
La valeur résiduelle minimale des HAPs observée est pour 109.94 mg/L pour Phénanthrène et
35.74 mg/L pour le Pyrène par Pseudomonas sp. LGM 10, et 114.67 mg/L pour B[a]P par
Pseudomonas sp. (LGM 11), cependant les pertes en abiotique sont de 38,75%, 63,01% et
10% respectivement (Tableau 18).
Les rendements de biodégradation dans les stations d’épuration dans les raffineries doivent
être étudiées par des expériences de bioaugmentation selon Andreoni et Gianfreda, 2007 qui
ereposait sur l’introduction dans ces sites des microorganismes présentant les capacités
métaboliques nécessaires à la dégradation des polluants présents. Cela consiste à ensemencer
le site avec des microorganismes adaptés à la dégradation du (ou des) xénobiotique(s)
présent(s), afin d’assurer ou d’accélérer le processus de dépollution. Cet ajout peut se faire
sous la forme d’une souche unique, ou d’un groupe de souches appelé consortia (Samanta et
al., 2002; Silva et al., 2009; Zanaroli et al., 2010). Ce qui conduirait à la mise au point de
nouvelles technologies de bioremédiation des sites de traitement biologiques contaminés par
les hydrocarbures pétroliers.
Certains microorganismes épurateurs ont de plus la capacité d’améliorer la solubilisation des
hydrocarbures particulièrement les HAPs, molécules fortement hydrophobes, par la
production de biosurfactants (formation de micelles), ou par la production de biofilms
(matrices extracellulaires adhésives et protectrices) (Johnsen et Karlson, 2004; Leglize et al.,
2008). C’est par exemple le cas de la souche bactérienne Pseudomonas aeruginosa P-CG3,
capable de produire un biosurfactant améliorant fortement la solubilisation du phénanthrène et
du pyrène au sein de sols contaminés (Cheng et al., 2004).
Dans notre travail des souches LGM 4 et LGM 8 sont des bactéries Gram-positif, appartenant
au genre Bacillus présentent des capacités de dégradation des composés aromatiques de
31.49% et 28.74% pour le B[a]P respectivement. Ces souches sont potentiellement
considérées comme positives pour le gène nidA, d’après la littérature c’est un gène spécifique
des Gram-positif (Andreoni et al., 2004), le genre Bacillus est capable de se protéger des
effets toxiques inhérents aux HAPs, et peut être susceptibles de produire des biosurfactants.
La formation également de biofilms est une des stratégies mises en place dans l’amélioration
de la dégradation des HAPs (Andreoni et al., 2004). Cette formation de biofilms permet à la
fois aux microorganismes de se protéger des effets toxiques des HAPs, mais aussi d’améliorer
leur biodisponibilité (Johnsen et Karlson, 2004).
Les bactéries sélectionnées ont montré des préférences spécifiques pour les différentes
sources de carbone testées, par conséquent leur capacité à utiliser les différents constituants
du pétrole, ces souches peuvent être utilisées pour concevoir des cultures mixtes (consortium)
avec des capacités de biodégradation spécifiques pour les différentes fractions pétrolières.
110
Procédures expérimentales – Partie II
111
Procédures expérimentales – Partie II
112
Procédures expérimentales – Partie II
Souches plus proche parent BLAST % d’identité Numéro Numéro Groupe amplification
déterminé (EMBL) d’OTUs d’accession Phénotypique alkB
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Procédures expérimentales – Partie II
Souches plus proche parent BLAST % d’identité Numéro Numéro Groupe amplification
déterminé (EMBL) d’OTUs d’accession Phénotypique alkB
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Procédures expérimentales – Partie II
Souches plus proche parent BLAST % d’identité Numéro Numéro Groupe amplification
déterminé (EMBL) d’OTUs d’accession Phénotypique alkB
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Procédures expérimentales – Partie II
ARZEW
ORAN
Figure 25: Carte d’Algérie, région d’échantillonnage de sol contaminé par les
hydrocarbures – Raffinerie d’Arzew- ORAN (Ladji et al., 2010).
1 2 3 4 5 6 7 C- P M
1500 bp
1000 bp
800 bp
600 bp
400 bp
200 bp
Figure 26: Gel d’électrophorèse des produits PCR d’ADNr16S des souches
sélectionnées.
M: SmartLadder 10000 bp DNA, P: Contrôle positif Pseudomonas sp. EEM 50,
C- : Contrôle négatif (échantillon sans ADN), 1: souche LGM 52, 2: LGM 79, 3: LGM 92,
4: LGM 59, 5: LGM 84, 6 : LGM 1.
116
Procédures expérimentales – Partie II
Proteobacteria
36
OTU1 LGM76
Gammaproteobacteria
OTU2 LGM35
Pseudomonas syringae D84026
67 OTU17 LGM59
Pseudomonas sp. 122 EU003535
Pseudomonas fluorescens GU198121
74
Kocuria sp. CCBAU 10913 JF772568 Actinobacteridae
93 OTU16 LGM57
uncultured Corynebacterium sp.GQ424180
99 99 OTU13 LGM68
Agrococcus sp. 8 1Kb EF540451
0.02
Les arbres ont été générés avec 1000 répétitions et les pourcentages (%) au niveau des nœuds représentent les valeurs
de probabilité de la robustesse de la similitude. Bar = 0.02 substitution de nucléotides par site.
Figure 27: Arbre phylogénétique par la méthode Neighbor-joining basée sur les séquences 117
d’ADNr16S repésentés par des OTUs affiliées aux Protéobactéries, Firmicutes et Actinobactéries
isolées du sol contaminé par les hydrocarbures et des espèces apparentées du BLASTn database.
Procédures expérimentales – Partie II
LGM 35
Pseudomonas extremorientalis KMM 3447
LGM 36
Pseudomonas meridiana CMS 38
Pseudomonas antarctica CMS 35
LGM 29
Pseudomonas veronii CIP 104663
Pseudomonas trivialis P 513/19
Proteobacteria
Pseudomonas poae P 527/13
LGM 38
Pseudomonas lurida : DSM 15835
Pseudomonas costantinii CFBP 5705
Pseudomonas tolaasii LMG 2342
LGM 25
LGM 10
Pseudomonas fragi ATCC 4973
Pseudomonas psychrophila E-3
LGM 12
Proteobacteria
Pseudomonas lundensis ATCC 49968
Pseudomonas brenneri strain CFML 97-391
Pseudomonas proteolytica CMS 64
Pseudomonas panacis CG20106 Gammaproteobacteria
Pseudomonas migulae CIP 105470
LGM 30
LGM 2
LGM 5
LGM 14
LGM 27
LGM 26
LGM 20
LGM 40
LGM 48
LGM 31
LGM 22
Pseudomonas gessardii CIP 105469
Pseudomonas libanensis CIP 105460
LGM 11
Pseudomonas cedrina subsp. fulgida : DSM 14938 LMG 21467
Pseudomonas cedrina CFML 96-198
Acinetobacter radioresistens DSM 6976
Acinetobacter venetianus ATCC 31012
LGM 7
Acinetobacter lwoffii DSM 2403
LGM 24
Serratia fonticola DSM 4576
Serratia proteamaculans DSM 4543
Serratia grimesii DSM 30063
Bacillus subtilis subsp. subtilis DSM 10
Firmicutes
Firmicutes
Les arbres ont été générés avec 1000 répétitions et les pourcentages (%) au niveau des nœuds représentent les valeurs de
probabilité de la robustesse de la similitude. Bar = 0.05 substitution de nucléotides par site. 118
Figure 28: Arbre phylogénétique par la méthode Neighbor-joining basée sur les séquences d’ADNr 16S
des souches LGM affiliées aux Protéobactéries et Firmicutes isolées du sol contaminé par les
hydrocarbures et des espèces apparentées du BLASTn database.
Procédures expérimentales – Partie II
1 2 3 4 5 6 7 P M
1000 bp
800 bp
600 bp
400 bp
Figure 29: Gel d’électrophorèse des produits PCR d’AlkB des souches sélectionnées.
M: SmartLadder 10000 bp DNA, P: Contrôle positif : Marinobacter carbonocalsticus
(EEM48), 1: souche LGM2, 2: LGM5, 3: LGM14, 4: LGM25, 5: LGM22, 6: LGM 27,
7: LGM26.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 P C- M
1500 bp
1000 bp
800 bp
600 bp
400 bp
200 bp
Figure 30: Gel d’électrophorèse des produits PCR de NahAc des souches sélectionnées.
M: SmartLadder 10000 bp DNA, P: Contrôle positif : Alcaniorax sp. EEM25, C- : Contrôle négatif, 1:
souche LGM 1, 2: LGM 52, 3: LGM 2, 4: LGM 3, 5: LGM 4, 6: LGM 7: LGM 53, 8: LGM 6, 9 :
LGM 54, 10 : LGM 55, 11 : LGM 7, 12 : LGM 8, 13 : LGM 10, 14 :LGM9.
119
Procédures expérimentales – Partie II
1 2 3 4 5 6 P 7 C- M
1500 bp
1000 bp
800 bp
600 bp
400 bp
200 bp
Figure 31: Gel d’électrophorèse des produits PCR de NidA des souches sélectionnées.
M: SmartLadder 10000 bp DNA, P: Contrôle positif Rhodococcus sp. (Cd1), C- : Contrôle négatif,
1: souche LGM 2, 2: LGM 4, 3: LGM 7, 4: LGM 8, 5: LGM 9, 6: LGM 10, 7: LGM 11, 7:LGM 12.
120
Procédures expérimentales – Partie II
LGM 2 116,63 ± 2,1 7,63 ± 0,9 35,74 ± 0,7 9,61 ± 0,5 146,45 ± 0,3 15,37 ± 0,1
LGM 10 109,94 ± 0,01 11,51 ± 0,007 35,38 ± 0,6 10,14 ± 0,4 150,3 ± 1,2 13,62 ± 0,6
LGM 12 111,58 ± 1,7 9,96 ± 0,8 36,62 ± 2,21 8,93 ± 1,6 146,28 ± 1,7 14,96 ± 1
LGM 8 122,31 ± 0,03 5,67 ± 001 38,72 ± 0,5 7,89 ± 1,02 120,76 ± 0,8 28,74 ± 0,4
LGM 4 131,35 ± 0,9 2,03 ± 1,7 39,95 ± 0,5 6,73 ± 0,7 114,67 ± 1,04 31,49 ± 0,5
LGM 60 132,31 ± 0,4 0±0 39,79 ± 0,9 6,78 ± 0,7 117,74 ± 3,7 31,63 ± 1,9
LGM 7 125,42 ± 1,3 3,59 ± 1,3 39,38 ± 0,7 7,42 ± 1,4 118,98 ± 3,7 30,13 ± 2,6
LGM 11 127,27 ± 0,7 2,75 ± 0,3 38,8 ± 0,2 7,83 ± 0,1 111,67 ± 3,2 33,93 ± 1,7
121
Procédures expérimentales – Partie II
Octadécane
Pristane Squalène
LGM 5 262,57 ± 3,7 32,42 ± 1,05 323,61 ± 0,36 4,95 ± 0,1 354,34 ± 6,62 3,94 ± 2,56
LGM 14 272,55 ± 2,5 30,56 ± 1,09 327,34 ± 0,52 4,68 ± 0,15 365,7 ± 1,83 3,18 ± 2,2
LGM 25 266,52 ± 1,5 31,68 ± 0,82 324,28 ± 0,5 5,25 ± 0,14 371,16 ± 2,77 0,69 ± 0,74
a
LGM 22 252,09 ± 2,4 35,11 ± 0,45 333,65 ± 1,93 ND 358,65 ± 6,08 4,46 ± 1,64
LGM 27 270,9 ± 0,9 31,53 ± 0,18 304,17 ± 2,65 13,29 ± 0,77 361,11 ± 1,18 2,1 ± 0,67
a
LGM 26 244,59 ± 0,01 33,25 ± 3,82 324,14 ± 1,93 5,51 ± 0,56 379,79 ± 6,97 ND
a
LGM 20 242,58 ± 0,4 34,41 ± 0,08 320,72 ± 1,28 7,11 ± 0,37 364,04 ± 0,8 1,5 ± 0,41
LGM 30 303,57 ± 2,9 23,47 ± 0,56 321,14 ± 1,03 6,15 ± 1,03 349,49 ± 5,32 8,22 ± 9,7
LGM 36 313,96 ± 1,6 22,8 ± 0,31 327,8 ± 1,72 4,18 ± 0,5 362,53 ± 1,81 ND
LGM 48 327,59 ± 1,6 20,24 ± 0,31 328,76 ± 2,42 6,84 ± 0,71 370,14 ± 1,32 ND
LGM 38 308,74 ± 1,1 23,77 ± 0,21 320,19 ± 1,08 6,16 ± 0,32 380,52 ± 0,45 ND
LGM 29 294,34 ± 0,5 26,47 ± 0,1 320,46 ± 1,08 5,87 ± 0,45 370,95 ± 3,85 ND
LGM 31 314,5 ± 0,5 22,69 ± 0,1 332,3 ± 1,68 2,84 ± 0,86 322,54 ± 28,54 21,33 ±,21,75
LGM 35 300,86 ± 5,9 25,25 ± 1,12 322,38 ± 4,2 6,56 ± 1,23 367,2 ± 4,07 1,24 ± 1,13
ND : non dégrader
AB: contrôle abiotique
122
Procédures expérimentales – Partie II
40
35
30
25
% Biodégradation du Benzo[a]Pyrène
20
15 % Biodégradation du Pyrène
10 % Biodégradation du Phénanthrene
5
0
LGM2 LGM10 LGM12 LGM8 LGM4 LGM60 LGM7 LGM11
Figure 32: Histogramme montrant la biodégradation (%) des aromatiques utilisés dans
cette étude par les souches les plus performantes.
40
35
30
25
20 % Biodegradation de l'Octadécane
15
% Biodegradation du Pristane
10
5 % Biodegradation du Squalène
0
LGM2
LGM5
LGM14
LGM25
LGM22
LGM27
LGM26
LGM20
LGM30
LGM40
LGM36
LGM48
LGM38
LGM29
LGM31
LGM35
Figure 33: Histogramme montrant la biodégradation (%) des alcanes utilisés dans cette
étude par les souches les plus performantes.
123
Chapitre III
L’objectif de notre travail était ambitieux puisqu’il visait à établir des relations entre la
composition (culture simple ou consortium) des bactéries sélectionnées, leur bagage
génétique permettant l’oxydation initiale des principaux types d’hydrocarbures et les
capacités de dégradation des hydrocarbures par ces bactéries hydrocarbonoclastes. Le
principal but était d’explorer la diversité des bactéries capables de dégrader les hydrocarbures
pétroliers à partir de la station de raffinerie d’Arzew afin de caractériser la réponse de
communautés bactériennes à une contamination pétrolière. Dans cette perspective, nous avons
abordé différents axes de recherche :
II)L’identification par des méthodes ADN des bactéries hydrocarbonoclastes afin de mettre
en interactions les communautés associées à des concentrations élevées en hydrocarbures
pétroliers choisis.
Cette étude a été menée sur les communautés bactériennes présentes dans les sols de la
raffinerie de la région d’Arzew en Algérie. Ces sols sont soumis depuis plusieurs décennies à
une contamination en hydrocarbures chronique et élevée. Ils constituent ainsi un modèle de
choix pour comprendre les mécanismes microbiens impliqués dans la réponse à la présence
d’hydrocarbures. En effet, ces populations bactériennes sont supposées posséder les systèmes
enzymatiques permettant de répondre à la contamination.
Afin de mettre en évidence la réponse adaptative précoce, un intérêt tout particulier a été
apporté aux composés récalcitrants (alcanes ramifiés et aromatiques lourds) et à l’étude des
mécanismes mis en place par la communauté bactérienne pendant quelques semaines (2 à 4)
selon la contamination.
Ces différentes études ont fait appel à l’utilisation de techniques de biologie moléculaire afin
d’accéder à l’identification précise des microorganismes dominants (extraction ADN, PCR,
séquençage, analyse par bioinformatique, élaboration d’arbres phylogénétiques et dépôt de
séquences dans la banque de données universelle ‘GenBank’) couplées à des méthodes
analytiques chimiques (CPG/FID et TLC/FID) permettant le dosage résiduel des
hydrocarbures.
L’atténuation naturelle d’une pollution désigne l’ensemble des processus qui concourent à la
réduction de la pollution sur le site considéré. Il s’agit essentiellement de la migration des
polluants sous toutes leurs formes, mais aussi de la biodégradation.
125
Conclusions et perspectives
L’évaluation de l’atténuation naturelle dans un site pollué défini est un objectif essentiel. En
effet, elle vise à prévoir le devenir de cette pollution pour en tirer les conclusions relatives aux
actions à entreprendre. D’autre part, si une action de réhabilitation doit voir le jour, elle
permet de proposer un type de traitement et ses modalités principales.
126
Conclusions et perspectives
127
Conclusions et perspectives
128
Conclusions et perspectives
Les informations disponibles sur les enzymes impliquées dans les voies de dégradation
des HAPs sont assez fragmentaires, sauf pour les HAPs modèles comme le phénanthrène ou
le naphtalène (Seo et al., 2009). De plus, celles-ci ne sont disponibles que pour des
microorganismes généralement cultivables et isolés. Or les microorganismes épurateurs
agissent le plus souvent en consortia au sein des environnements pollués, et beaucoup d’entre
eux ne peuvent être isolés et étudiés facilement. De plus, ces consortia possèdent des
capacités de dégradation plus importantes que les microorganismes isolés (Molina et al.,
2009; Vila et al., 2010). Obtenir plus d’informations sur ces consortia permettrait de franchir
une nouvelle étape dans la compréhension des capacités de biodégradation des HAPs, et donc
d’améliorer les techniques de bioremédiation.
L’évaluation de la bioremédiation peut être étudiée par les techniques d’empreintes
génétiques appliquées aux gènes de dégradation. Le polymorphisme des gènes considérés est
alors détecté par restriction enzymatique et examen des profils de restriction après
amplification génique. Enfin, l’avènement des approches indépendantes de la culture
(métagénomique) pourrait donner un nouvel élan à des approches d’isolement des
microorganismes, qui représentent le moyen le plus direct et le plus opérationnel de tirer parti
sur le plan biotechnologique de la richesse microbiologique à partir d’échantillons
d’environnement pollué.
Chaque méthode apporte un éclairage partiel de la diversité des communautés bactériennes et
leur combinaison est susceptible de fournir une image plus réaliste de sa complexité
(Bombach et al., 2010; Hill et al., 2000).
D’un point de vue plus appliqué, les résultats obtenus pourraient permettre de développer des
outils de diagnostic et de suivi des sites contaminés par les hydrocarbures pétroliers ou rejet
industriel. Connaissant les séquences d’ADNr 16S des bactéries dégradant les HAPs et les
alcanes, on peut envisager de les détecter in situ par qPCR en fonction des conditions
environnementales.
Les études de biodégradabilité de produits tels que les produits pétroliers ont pour but de
répondre à une série de questions. Elles doivent notamment donner la possibilité de pouvoir
juger, en cas de déversements accidentels, si les chances d’atténuation naturelle de la
pollution sont réelles. La microflore indigène de sol et aquatique sur laquelle survient un
déversement constitue l’acteur principal du processus d’atténuation naturelle. C’est la raison
pour laquelle, il est important d’avoir une bonne vision des relations existant entre la
composition bactérienne d’une microflore et son aptitude à dégrader le polluant. Appliqué à la
gestion des bassins de traitement des eaux rejetées polluées, un tel suivi permettrait de mieux
comprendre le système de traitement des eaux contaminées par les hydrocarbures pétroliers et
d’améliorer l’efficacité du traitement par bioremédiation.
129
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