Ue2 Chapitre 1 - Méthodes en Histologie
Ue2 Chapitre 1 - Méthodes en Histologie
Ue2 Chapitre 1 - Méthodes en Histologie
BUTS de ce chapitre :
I- Généralités et définitions.
« Histologie » signifie étymologiquement « science des tissus ». Le concept de tissu, de derme, a
été inauguré fin XVIIème / début XVIIIème par Xavier Bichat, sans microscope ; ce concept a été
élaboré grâce à ses travaux de dissection anatomique.
L'histologie s'est constituée vers le milieu du XIXème siècle à partir de la conjonction de deux
événements, en particulier grâce à l'avènement de la théorie cellulaire (1838), établie à partir des
travaux de Théodore Schwann et de Schleiden.
A partir du début du XIXème siècle, et surtout vers 1840, le microscope optique est perfectionné et
l'optique bénéficie de grandes améliorations. Des lentilles beaucoup plus performantes sont en effet
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fabriquées, ce qui permet d'obtenir des images beaucoup plus proches de la réalité. C'est à cette
époque que les techniques histologiques se mettent en place.
Un tissu est constitué de cellules et des substances qu'elles synthétisent ; ces substances constituent
la matrice extracellulaire ou MEC. Bien que plus complexe, l'examen histologique est aujourd'hui
souvent assimilé à l'examen microscopique.
L'histologie s'est rapidement intéressée à la morphologie des cellules (l'histochimie), mais aussi à
leur fonctionnement et à la conception des tissus (histophysiologie). Au début des années 1960, la
création du microscope électronique permet d'améliorer le grandissement et introduit une nouvelle
façon de voir les cellules et les tissus. Aujourd'hui, l'histologie a pour but de mettre en évidence au
sein de la cellule, in situ (contrairement à la biochimie), les protéines, l'ADN et l'ARNm.
On distingue quatre familles de tissus, qui sont étudiés dans le cadre de l'histologie générale :
Les épithéliums.
Les tissus conjonctifs.
Les tissus musculaires.
Les tissus nerveux.
Ces tissus sont caractérisés par la composition moléculaire de leur MEC, la nature de leur cellule et
la proportion de celles-ci par rapport à la MEC.
L'histologie spéciale s'intéresse à l'étude de la structure des organes en étudiant l'anatomie
microscopique d'une part et l'histophysiologie d'autre part. Les organes sont regroupés en systèmes
ou en appareils ; ceux-ci ont chacun une ou plusieurs fonctions bien définies et assurent le
fonctionnement de l'organisme.
L'anatomie pathologique, quant à elle, étudie les tissus pathologiques. Le diagnostic de nombreuses
pathologies repose sur l'examen microscopique de petits échantillons tissulaires appelés biopsies.
1) Microscopie optique.
Le prélèvement
En histologie humaine, le prélèvement peut se faire sur un cadavre (le plus rapidement possible
après le décès), sur pièces opératoires (rapidement ou bien les pièces doivent être fixées rapidement)
ou encore de façon globale, sans recoupes (= biopsie).
On utilise des instruments bien tranchants, afin de ne pas écraser les tissus et donc d'éviter la
formation d'artefacts (le Scalpel).
La fixation
(Source Wikipédia)
Le but de la fixation est de conserver les structures. En effet, le prélèvement des tissus provoque
leur mort : les cellules déversent leurs enzymes, ce qui provoque une autodigestion du tissu. De
plus, à l'air ambiant, les prélèvements peuvent être contaminés par des bactéries, ce qui entraîne une
putréfaction des tissus.
Son principe repose sur le fait qu'il réagit avec les groupements aminés des protéines. La durée de
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fixation est variable et la quantité de fixateur utilisée doit être au moins dix fois plus importante que
le volume de tissu à fixer : quelques heures suffisent donc pour fixer les petits fragments.
Le fixateur souvent utilisé en France est le liquide de Bouin (acide picrique+formol+acide acétique+eau).
Il présente le désavantage de provoquer un phénomène d'auto-fluorescence cellulaire pouvant gêner
les observations au microscope photonique à fluorescence. Il dégrade aussi rapidement les acides
nucléiques.
(Source Wikipédia)
Pour que la lumière puisse passer à travers le tissu à examiner, celui-ci doit être très fin. Or les
tissus sont mous, il faut donc leur donner une consistance solide. C'est le principe de l'inclusion :
l'inclusion en paraffine consiste à infiltrer et à enrober les tissus à examiner avec de la paraffine.
L'inclusion est précédée de deux étapes essentielles. Il faut tout d'abord procéder à la déshydratation
: on passe les tissus dans des bains d'alcool de degré croissant (70°, 80°, 90°, 95°, 99°, puis enfin
100°). L’intérêt de la déshydratation est d’éliminer le fixateur. L'alcool (éthanol) est ensuite
remplacé par un solvant miscible à la paraffine : il s'agit soit de xylène, soit de toluène
(hydrocarbures). Ces substances éliminent l’éthanol.
Au fur et à mesure de leur infiltration par le solvant, les tissus ont tendance à s'éclaircir : cette étape
est donc parfois appelée éclaircissement ou clarification. Une fois totalement imprégné, le tissu est
placé dans de la paraffine fondue (portée à 56/58°C) ; la chaleur provoque l'évaporation du solvant
(et sa dissolution dans la paraffine) : les espaces ainsi libérés sont remplis par la paraffine.
Puis la paraffine est placée dans de petits moules, à température ambiante, ce qui provoque son
durcissement et donc la rigidification des fragments tissulaires prélevés. On procède alors au
démoulage : on obtient des fragments tissulaires inclus dans un bloc de paraffine.
La microtomie
(Source Wikipédia)
On isole ensuite des coupes dans le bloc de paraffine. On utilise pour cela un microtome, qui fait
avancer le bloc sur un rasoir : le bloc avance d'environ 2 à 3 um à chaque fois (en MO classique, les
coupes mesurent environ 5 um). L'ensemble des tranches vont former un ruban dans lequel on
retrouve des coupes sériées de prélèvement tissulaire.
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Coloration des lames
(Source Wikipédia)
Les tissus de l'organisme ne sont pas spontanément colorés, ce qui rend les observations difficiles.
Les colorants utilisés en histologie sont plus ou moins sélectifs ; la plupart sont des composants
acides ou basiques en milieu aqueux qui forment des sels avec les radicaux ionisés des tissus. Des
composants acides sont utilisés pour les zones tissulaires basophiles, et des composants basiques
sont utilisés pour les zones tissulaires acidophiles .
La coloration la plus utilisée est HES : hématéine/éosine/safran. L'hématéine est une substance
plutôt basique, qui colore les noyaux en violet donc colore les acides nucléiques. L'éosine est une
substance plutôt acide, qui colore plutôt les cytoplasmes (en rose) donc colore les protéines. Enfin,
le safran colore les fibres de collagène en jaune.
Cependant, pour que l'on puisse utiliser une coloration, la paraffine doit être éliminée. On procède
donc au déparaffinage, qui consiste à passer les lames dans des bains de toluène ou de xylène afin
de dissoudre la paraffine. On effectue ensuite une réhydratation : l'alcool se mélange avec l'eau et le
toluène, on passe les lames dans des bains d'alcool de degré décroissant (de 100° à 70°, voire
50/40°).
On peut également avoir recours à une coloration histochimique, appelée PAS (Periodic Acid
Schiff), qui met en évidence le glycogène, les glycoprotéines et à peu près tout ce qui contient des
sucres.
Les techniques d'immunomarquage sont également assimilées à des techniques de coloration ; on
utilise des anticorps couplés à des substances que l'on peut révéler en microscopie (enzymes,
substances fluorescentes, ... ) (voir plus loin).
L'hybridation in situ, quant à elle, consiste à mettre en évidence des séquences spécifiques d'ADN
en utilisant une sonde marquée.
Le montage des lames
(Source Wikipédia)
Les lames sont montées pour préserver les colorations (plus difficile avec les marquages, pour
lesquels on utilise généralement des photos). Les lames sont déshydratées grâce à des bains en
toluène, puis on colle des lamelles de verre par-dessus (grâce à des résines synthétiques) afin de
préserver les préparations. Les lames ainsi montées peuvent être conservées pendant plusieurs
dizaines voire plusieurs centaines d'années.
Ces techniques sont cependant mises en défaut pour un certain nombre d'analyse, car l'alcool dissout
les graisses.
2) Microscopie électronique.
La microscopie électronique (ME) repose exactement sur les mêmes principes que la MO mais un
faisceau d'électrons remplace le faisceau de photons et les prélèvements s'effectuent sous vide ; on
utilise d'autre part des lentilles magnétiques.
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La préparation des tissus comporte les mêmes grandes étapes qu'en MO, mais avec des adaptations
dues à la contrainte de rapidité qui est encore plus importante pour la fixation.
Le fixateur utilisé est le glutaraldéhyde (plusieurs bains, 1heure au total), et l'on effectue
généralement une post-fixation grâce à l'acide osmique (tetroxyde d’osmium) afin d'obtenir de
meilleures observations.
La déshydratation est effectuée grâce à de l'oxyde de propylène.
Pour l'inclusion, on utilise des résines synthétiques d'époxy. Celles-ci présentent les avantages
suivants :
- stable au bombardement électronique,
- peu de rétrécissement,
- durcissement uniforme.
Les désavantages sont que ces résines sont très visqueuses et présente une compatibilité limitée
avec l’éthanol.
Les coupes sont réalisées sur un ultra-microtome avec rasoir de verre ou de diamant : on obtient des
coupes d'environ 80 nm d'épaisseur. Ces coupes sont ensuite déposées sur de petites grilles de cuivre
mesurant quelques centimètres de diamètre, et l'observation se fait entre les barreaux.
Il n'existe pas de techniques de coloration en ME, mais des techniques de contraste des tissus. On
utilise fréquemment l'acétate d'uranyle (qui contraste les nucléoles) et le citrate de plomb, qui
contraste les membranes (l'acétate d'uranyle et citrate de plomb sont des sels de métaux lourds).
Remarque : La cryohistologie repose sur l'utilisation d'un microtome à congélation (environ -18°C/-
25°C) ; utilisée en particulier pour les lipides, elle permet une observation rapide et possède des
applications très utiles. Elle est notamment utilisée pour des examens extemporanés (au bloc
opératoire), associée à des techniques de coloration rapides mais moins efficaces.
(Source Wikipédia)
Polynucléaires neutrophiles
Noyaux bleu
Cytoplasme des cellules profondes bleu
Cytoplasme des cellules superficielles rose
(Source Wikipédia)
Colorations spéciales : mise en évidence d’un composé donné non identifié sur l’HES.
· Coloration de cellules encore vivantes (non fixées). On peut prendre l’exemple du Bleu de
Crézyl qui permet la coloration du RER des réticulocytes ( cellule précédant le stade de globule
rouge)
· Mise en évidence d’inclusions lipidiques : coloration par diffusion d’huiles ( Soudan IV, rouge ;
Noir Soudan, noir et O red Oil, rouge).Cette coloration ne peut se faire uniquement à partir de
tissus/ cellules frais ou congelées car les inclusions lipidiques disparaissent après traitement par
le toluène.
IV- La microscopie
a) Le microscope optique.
Le microscope repose sur trois systèmes de lentilles. Le premier condense la lumière sur l’objet à
examiner, tandis que le second constitue l’objectif : les lentilles élargissent l’image et la projettent
vers le troisième système de lentilles qui lui constitue l’oculaire.
Les préparations histologiques sont généralement colorées et observées par trans-illumination. Le
grandissement du microscope est égal au produit du grandissement de l’objectif par le
grandissement de l’oculaire. Les objets de taille inférieure à environ 0,1-0,2 µm ne sont pas
distinguables : cela constitue la limite de la microscopie optique.
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(Source Wikipédia)
C'est le signe d'une différence d'indice de réfraction, densité d'un objet ou encore la vitesse de
traversée de l'objet par la lumière.
La lumière va se déplacer différemment dans les différentes structures. La lumière va plus vite dans
l'air que dans l'eau que dans le verre. Le microscope à contraste de phase est très utilisé en
bactériologie grâce à sa particularité de révélation des objets peu opaques, notamment dans le
domaine dentaire dans la recherche en parodontologie, recherche de la flore bactérienne de la
gencive dite maladie parodontale ou parodontie.
c) Le Microscope a Fluorescence.
La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière après avoir
absorbé des photons de plus haute énergie. La microscopie en fluorescence repose sur la formation
d'une image par détection de cette lumière émise.
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(Source Wikipédia)
d) Le microscope électronique.
La microscopie électronique à transmission est une technique de microscopie où un faisceau
d'électrons est « transmis » à travers un échantillon très mince. Les effets d'interaction entre les
électrons et l'échantillon donnent naissance à une image, dont la résolution peut atteindre 0,8
Angströms. Les images obtenues ne sont généralement pas explicites, et doivent être interprétées à
l'aide d'un support théorique. L'intérêt principal de ce microscope est de pouvoir combiner cette
grande résolution avec les informations de l'espace de Fourier, c'est-à-dire la diffraction. Il est aussi
possible d’étudier la composition chimique de l’échantillon en étudiant le rayonnement X provoqué
par le faisceau électronique. Contrairement aux microscopes optiques, la résolution n’est pas limitée
par la longueur d’onde des électrons, mais par les aberrations dues aux lentilles magnétiques.
(Source science-et-vie.net)
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(Source svt.edunet)
(Source encyclopedie-enligne)
c) Technique de l’immunohistochimie
L'immunofluorescence directe sur coupe en congélation est une méthode très spécifique qui évite
toutes les réactions non spécifiques dues à l'accrochage de l'Ac au récepteur du Fc des
immunoglobulines, à condition d'utiliser l'Ac à la dilution optimale. Mais c'est une méthode peu
sensible (pas d'amplification du signal) et qui nécessite d'utiliser des Ac couplés à un chromogène
fluorescent (Fluorescéine, Rhodamine, Rouge Texas….). Intérêt : permet facilement les doubles
marquages et évite les problèmes liés aux peroxydases endogènes. Le marquage est labile dans le
temps : des milieux de montages spéciaux permettent d'éliminer l'effacement du marquage.
· tissus fixés inclus en paraffine : les avantages sont l'utilisation a posteriori quand le tissu a été
fixé et la possibilité d'études rétrospectives (sur blocs ou sur lames) ainsi qu'une morphologie bien
conservée. Mais certains épitopes sont détruits : pour y remédier, nécessité d'une bonne fixation (ni
trop courte, ni trop longue). Le choix du fixateur est important (en règle préférer le formol
tamponné), car certains épitopes sont détruits par certains fixateurs (alcooliques surtout) et
l'éventuelle décalcification. Eviter les températures excessives au moment de l'inclusion et du
séchage des lames. Nécessité pour de nombreux épitopes d'un démasquage antigénique
(prétraitement qui permet de rompre les liaisons moléculaires créées par le fixateur et modifiant la
configuration spatiale des épitopes et leur accessibilité aux antigènes) : digestion enzymatique ou
plus souvent chauffage des coupes dans un tampon au four à micro-ondes, autocuiseur, ou bain-
marie.
Exemple :
Un premier anticorps de souris anti-kératines se fixe spécifiquement sur les kératines. La présence
de cet anticorps est révélé par la fixation d'un anticorps secondaire biotynilé de lapin anti-souris (kit
DAKO LSAB kit, Peroxidase universale K680). Cette méthode utilise la haute affinité de la
streptavidine pour la biotine. La streptavidine est couplée à l'enzyme péroxydase et va se fixer sur
l'anticorps secondaire biotynilé. L'activité de la péroxydase induira la coloration du chromogène.
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