Analyse microbiologique de leau

Robinet et uses et stockage

Sommaire

I. Introduction
...... 2

II. But de
TP2

III. Matriel
utiliss...3

IV. Protocol
exprimental 4

V. Premire jour
4
1. Milieux de cultures
utiliss....4

2. Prlvement deau et condition

dchantillonnage.5

3. Prparation des
dilutions..5

4. La recherche de la flore msophiles arobies

totales..6

5. La recherche des
Streptocoques6

6. La recherche des
coliformes 6

VI. Deuxime
jour..7

1. Lecture et interprtations des

rsultats ..7

1
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Robinet et uses et stockage

VII. Le troisime
jour
..10
1. Dnombrement des colonies sur milieu
TGEA10

2. Observation des bactries ltat frais

11

3. Coloration de
Gram 11

4. Test didentification (TEST

IMVC) ...12

5.
Lensemencement.
...13

VIII. Quatrime jour

....14
Lecture et interprtation des
rsultats...........................................................15

IX. Conclusion
.........16

Introduction

Il est aujourdhui vident que leau est essentielle bien des gards. Disposer dune
eau potable et vacuer des eaux uses qui constituent des problmes majeurs de
lhygine urbaine mais aussi de la plupart des industries alimentaires. Les eaux
destines lalimentation humaine (boissons, prparation daliments etc.) ont des
origines diverses (eaux souterraines ou de surface).
La flore microbienne prsente dans leau est trs varie et dpend de lorigine de leau
(eau de captage ou de distribution, eau rsiduaire etc.).

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Parmi les principaux microorganismes susceptibles de se trouver dans leau on

rencontre essentiellement des germes telluriques et des germes dorigine intestinale.
Es que Le mtabolisme peut identifie les microorganismes ?

Le but de ce TP

Dans ce TP qui droule pendant quatre jours, on a suivi les analyse microbiologiques
des eaux (potables, stockage et uses) afin de rechercher la prsence ou labsence
des germes omniprsent dans leau telle que les germes arobies, les coliformes
surtout fcaux, les Streptocoques et les Staphylocoques. Lobjectifs de ce TP est
dapprendre non seulement des notions thoriques mais aussi pour mieux pratiqu et
manipuler dans un laboratoire de microbiologie.

Matriels utiliss :

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Bec benzne les boites de ptri les flacons

tube essai

Pipette
gradue
Pipette
Pasteur
les lames
Bain marie

Etuve microscope
compteur de colonies

Protocol exprimental :

Premire jour

Milieux de cultures utiliss

Le Milieu TGEA : Pour le dnombrement de la flore msophile arobie

totale (revivifiable).

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Le Milieu Roth : Cest un milieu slectif liquide pour la recherche de

Streptocoques fcaux.

Le Milieu BCPL : Cest un milieu lectif utilis pour la dtection et

lisolement des entrobactries dans leau, il permet de faire une analyse
prsomptive.

Le milieu de Chapman est un milieu slectif, utilis pour les

Staphylocoques.

Milieu TGEA Milieu Chapman

Milieu ROTH Milieu

BCPL

Prlvement deau et condition dchantillonnage :

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a. Prlvement deau de stockage :

A partir de bche deau duniversit on remplit un flacon strile par leau.
Prparation des dilutions :
Pour leau de robinet et leau de stockage : ne ralise
aucune dilution.
Pour leau use (catgories 1 et 2) :
La technique se faite par dilution dcimal successive de 10 -1
jusqu 10-8 On prend 1ml de la solution mre (eau use) et
on le met dans un tube 9 ml deau physiologique.( dilution 10 -
1
) puis on prend 1ml de dilution 10 -1 et on le met dans un autre
tube deau physiologie (dilution10-2) puis on prend 1ml de
dilution 10-2 et on le met dans un autre tube deau physiologie
(dilution 10-3) jusqu la dilution 10-8.
La prparation des dilutions est effectue dans des conditions
aseptiques ( ct de bec benzne).
1) La recherche de la flore msophiles arobies
totales :

partir des dilutions prpares de leau use (10-4 )

On prend 2 fois 1ml de la dilution 10-4et on les met dans

chacune de deux boite de ptri 1ml.
On ajoute dans chaque boitte le milieu TGEA
(ensemencement en profondeur)

On Agite doucement par mouvement circulaire en forme de 8

pour assurer un mlange homogne de leau analyser avec
la glose (milieu) et laisser refroidir sur la paillasse.

On Incube les boites dans incubateurs 37C pendant 24

heurs

Remarque : La mme manipulation est ralise pour les autres

dilutions prpares.

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2) La recherche des Streptocoques :

Test prsomptif :

On utilise 2 tubes contenant milieu Roth (un tube double

concentration, et lautre simple concentration)
On a utilise le flacon dchantillon (solution mre de leau de
stokage).
On ajoute 1ml dchantillon dans tube qui contient le milieu
Roth simple concentration, et 10 ml dchantillon dans le tube
qui contient le milieu Roth double concentration.
On homognise les tubes

Incubation des tubes dans une tuve T de 37C pendant 24

heurs

3) La recherche des coliformes :

Test prsomptif :
Avant lensemencement on doit vrifier sil y a de lair dans les
cloches du durham pour le vider pour ne pas fausser nos rsultats.

On prendre 2 tubes de milieu BCPL (un tube double

concentration, et lautre simple concentration).

On ajout 1ml dchantillon (solution mre de leau de stokage)

dans une tube qui contient de BCPL simple concentration,
et 10 ml dchantillon dans le tube qui contient de BCPL
double concentration.
On ferme et homognise les tubes.

Incuber les tubes dans une tuve une temprature de 37C

pendant 24h.

4) La recherche des Staphylocoques :

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On utilise le milieu de culture : Chapman.

On met dans une boite de ptrie le milieu de Chapman.
A laide dune pipette gradue, on prlve 1ml (de solution
mre deau de stokage) et puis on le verser sur le milieu
(ensemencement en surface).
Incuber les tubes dans une tuve un temprateur de 37C
pendant 24h.
Le deuxime jour

La premire tape :

Lecture et interprtations des rsultats :

Aprs lincubation on retient nos boites et tubes de ltuve pour voir sil ya une
multiplication bactrienne :

Sur le milieu BCPL : il ny a pas changement de couleur vers le jaune ; et pas de

production de gaz dans la cloche de Durham. Donc, le rsultat est ngative sur le
milieu BCPL (pour les deux tubes) il n y a pas la capacit de dgradation de lactose
en fermentation avec production co2

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Sur le milieu Roth : lapparition dun trouble, Donc, le rsultat est positif sur le
milieu Roth. (pour le tube DC) prsence des streptocoques qui tolre
lazide de sodium

Sur le milieu Chapman : prsence des colonies

La deuxime tape :

A ct du bec benzne (dans la zone strile), on met 15ml du milieu

mac conkey dans une boite Ptri strile, et on le laisse solidifier.

A partir dun tube BCPL positif (de eau us de dilution10 -1) subit un
virage de couleur du viol vers le jaune, avec une pipette gradue, on
prend 1ml de ce denier et on ensemence en strie sur la boite Ptri du
milieu mac conkey.

Test de confirmation

- pour les streptocoques : On prend un prlvement dun milieu

Roth positif+ pour faire la coloration de gram.
- pour les staphylocoques : On prend un prlvement dun
milieu BCPL positif+ pour faire la coloration de gram.

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Coloration de Gram :

A partir d'une colonie de milieu Routh(les colonies jaune), on

ralise la coloration de Gram :

On Dpose une goutte d'eau

distille sur une lame en
verre.
On Prlever un fragment de
colonie l'aide d'une pipette
Pasteur.
On Dissocie soigneusement
l'inoculum dans la goutte d'eau
et on laisser scher.
On fait la fixation par le passage de lame 2 3 fois
dans flamme bleu de bec benzne.

A. Les tapes de coloration :

On recouvrit la lame par le violet de gentiane
pendant une minute.
Rinage rapidement l'eau du robinet.
On recouvrit la lame par lugol pendant minute.
Rinage l'eau du robinet.
Dcoloration avec lalcool pendant 30 seconds.
Rinage leau de robinet.
On recouvrit la lame par fuchsine pendant une minute.
Rinage leau du robinet.

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On sche la lame pour lobservation

microscopique

Rsultat De Coloration De Gram

Ne sont pas des Staphylocoques sont des

bactries gram ngative qui tolr la salinit.

Troisimes jour

Premire tape :
1. Dnombrement des colonies sur milieu TGEA :
Aprs lincubation on retient nos boites puis laide dun compteur
de colonies on dnombre les colonies bactrienne apparaitre dans le
milieu TGEA, le tableau ce dessous exprime les rsultats de comptage
de colonies.

La moyenne de nombre de colonies = la somme de nombre

de colonies de deux boite TGEA / 2

Dilution /l 10-1 1 1 1 1 1 1 1
e nombre
des
0- 0- 0- 0- 0- 0- 0-
2 3 4 5 6 7 8
colonies

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2eme Indnombr 8 4 2 0 1 1 0
jour able 1 7 6 8 0 0 2

Interprtation de tableau :

Aprs les rsultats obtenues dans le tableau ce dessus, on

remarque que la moyenne de nombre de colonies de la premire
dilution (10-1) est indnombrable et elle commence de se diminue
progressivement de la dilution 10-2 jusqu la dilution 10-4. Puis, elle
se dbute augmente partir de dilution 10 -5 jusqu la dilution 10-
8
.
Donc, ces rsultats sont illogiques, parce que en ralit les
rsultats doivent se diminues successivement.

On peut dire quil y a des fautes de manipulation lors

densemencement, ainsi des contaminations.

Le rsultat sur le milieu mac cockney a partir

dun BCPL + sont des colonies isole avec un
bon ensemencement

Deuxime tape :
Test didentification (TEST IMVC)
Les milieux de cultures utiliss :

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Milieu deau peptone : Les peptones sont des produits de

dgradation plus ou moins avance des matires protique (lextrait
de viande).

Milieu Clark et Lubs : Milieu permet ltude de la voie de

fermentation du glucose mettre en vidence le type de voie
fermentative utilise pour dgrader le glucose sera un moyen de
diffrencier les bactries entre elle dans une dmarche
didentification. Il permet une diffrenciation entre les bactries
utilisant : la voie fermentative des acide mixtes et celles utilisant la
voie fermentative butane-diolique .

Citrate de simmons : Dans ce milieu le citrate (C6H5O73-) est

l'unique source de carbone. L'utilisation de ce substrat, pour la plupart
des bactries pouvant le cataboliser, et se traduira par une
alcalinisation du milieu.

Milieu TSI : Ou Le milieu de Hajna-Kligler est un milieu permet

la recherche de plusieurs caractres biochimiques. Trois glucides sont
retrouvs dans ce milieu, Il est trs utilis dans l'identification des
Enterobacteriaceae.

Lensemencement :

Tous les tests suivants sont raliss partir de milieu mac

conkey, condition que lensemencement dans leau
peptone, Clark et Lubs et Citrate de simmons sont
raliss partir de la mme colonie.

1. Lensemencement en eau
peptone : Dans un tube deau peptone on ensemence partir
dune colonie du milieu mac conkey.

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2. Lensemencement en milieu Clark

et Lubs : on ensemence partir de la mme colonie que lon a
utilise pour leau peptone.

3. Lensemencement en milieu citrate de simmons : Le milieu

est prsent sous forme de glose incline. La pente est
ensemence par une strie longitudinale, ralise laide dune
pipette de pasteur partir de mme colonie de milieu mac
conkey .

4. lensemencement en milieu Hagna Kligler (TSI): Le milieu

est prsent sous forme de glose incline avec un culot. On
Ensemence abondamment la surface partir de milieu mac
conkey, par stries serres ou par inondation, puis le culot par
simple piqre centrale, l'aide de la mme pipette boutonne.
Toutes les tapes de lensemencement sont ralises ct
de bec benzne.

Les milieux de cultures utilises dans les tests

didentifications avant lensemencement :

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Eau peptone Clarck et Lubs Citrate simmons TSI

Quatrime jour

Lecture des rsultats :

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1) La mise en vidence de la production

dindole :

On ajoute 3 5 gouttes de milieu Covacks dans le tube deau

pepton dj incub.

2) La mise en vidence de type fermentaire :

On divise le milieu Clarck et Lubs dj incub en deux, on

laisse du volume dans le tube et on dpose le 2 me du volume
dans un autre tube essai strile.

Puis, on ajoute:
De 3 5 goutes test VP (VPI puis VPII) dans le 1irtube qui
contient l du Clarck et Lubs.
De 3 5 goutes test RM dans le 2me tube qui contient l du
Clarck et Lubs.

Les rsultats et interprtation :

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Par comparaissant avec le tableau cit dans la fiche technique

de TP, et selon nos rsultats obtenues on conclue que la
souche est : Escherichia coli.

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Indole Rouge de Voges Citrate de

mthyle Proskauer Simmons

+ + - -
Escherichia
coli

Quelques caractristiques dEscherichia coli :

Les principaux tests positifs :

Catalase +, oxydase +, lactose +, mannitol +,

ONPG+.

Les principaux tests ngatifs : Ure -, TDA-, glatinase

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Conclusion

Leau est llment le plus rependu dans la terre, il est

ncessaire pour la vie de toute sorte dtres vivants quelque
soit tres humains, animaux, vgtaux, et mme
microorganismes.
Grace cette importance deau, il doit tre protger pour
quil soit propre la consommation.
Les analyses des diffrentes types deau disent quil
contient pas mal de microorganismes bnfiques (la flore
msophiles arobies totale dans leau potable), et
pathognes (Streptocoques, Staphylocoques, et coliformes
(tel que : Escherichia coli) dans leau use).
Donc il faut bien gurir leau pour mieux la sauv car rien
peut la remplacer.

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