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Introducción

LOGO
 FITOQUÍMICA

Metabolitos secundarios

Alcaloides
Saponinas
Flavonoides
Taninos
Quinonas
Terpenos
DIAGRAMA DE FLUJO DE PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

PLANTA ENTERA

RECOLECCIÓN

SELECCIÓN

ESTABILIZACIÓN
Y SECADO

MOLIENDA

CONSERVACIÓN

EXTRACIÓN EVALUACIÓN FITOQUÍMICA

PRELIMINAR
Secado y molienda

Temperatura ambiente
Estufa a 40°C.
 PREPARACION DE EXTRACTOS
Extraer: Sacar algo que está hundido, inmerso o sepultado en un lugar
Obtener una sustancia que estaba contenida en un cuerpo

Es necesario el conocimiento de diferentes técnicas y de

fuentes potenciales para la obtención de extractos o de
principios activos

Extracción mecánica

Destilación

Extracción con fluidos

en condiciones supercríticas

Extracción con solventes

 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Extracción mecánica: Permite obtener los

principios activos disueltos en los fluidos
propios de la planta, los cuales una vez
extraídos se denominan jugo.

Expresión: Consiste en ejercer una presión

sobre la droga (zumos de cítricos y aceites).
Incisiones o cortes por las que fluyen los
fluidos de la planta. Se utiliza para extraer
material vegetal exudados (gomas, resinas y
mieles)
 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Destilación: Es una técnica que se basa en

la diferente volatilidad de los componentes
de la droga, lo cual permite la separación de
componentes volátiles de otros que son
menos o nada volátiles. Se suelen hacer
destilaciones por arrastre de vapor o de
hidrodestilaciones que facilitan la extracción
de los principios activos volátiles.

Extracción de aceites volátiles

 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Destilación:
 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

• Destilación por arrastre de vapor y extracción

simultánea con solventes orgánicos.
• Hidrodestilación
• Hidrodestilación asistida con radiación
microonda
 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Extracción con fluidos en condiciones supercríticas:

Se opera con dispositivos especiales donde es posible controlar la

presión (P) y la temperatura (T) y se trabaja a P y T superiores a la P y
T críticas.

El gas más utilizados son el dióxido de carbono

EXTRACCION FLUIDO SUPERCRITICO
 EXTRACCION FLUIDO SUPERCRITICO

CO2
 EXTRACCION FLUIDO SUPERCRITICO

CO2
VENTAJAS
“Lo similar disuelve
• Disponibilidad lo similar”
• Barato
• No inflamable
• Reciclable
• Sin restricciones por parte de la Agencia de Protección Ambiental
de los EE. UU. (EPA),
• El CO2 supercrítico (scCO2) no es tóxico,
• Puede usarse potencialmente para la producción de productos
consumibles, como productos farmacéuticos y alimentarios
DESVENTAJAS
• Altamente apolar (disuelve mas eficientemente sustancias apolares)
EXTRACCION FLUIDO SUPERCRITICO
 PROCESO DE EXTRACCIÓN

Extracción con solventes

• Sumergir un material vegetal en un solvente para disolver las sustancias

que le interesa obtener en el solvente.

• Separar el solvente del material vegetal (filtración)

• Recuperación del extracto de la mezcla de disolvente/extracto

El solvente seleccionado debe disolver rápidamente las sustancias

objetivo presentes en el material vegetal y debe poder mantener una alta
concentración de la sustancia objetivo en solución.
 PROCESO DE EXTRACCIÓN

“Lo similar disuelve lo similar”

Selección del solvente

Apolar Medianamente polar Polar

Benceno X Cloroformo Acetato de etilo Acetona Etanol Agua

Dicloromoteno Metanol
Solventes

Tolueno X
CCl4 X
Hexano
CO2 sc
Éter de petróleo
Proteínas,
Algunos isoprenoides
carbohidratos
Metabolitos

(terpenos, esteroles)
Ácidos grasos
Algunos isoprenoides (Saponinas), cumarinas, flavonoides,
alcaloides
 CBD: componente activo
Hexano, eter de petróleo,
CO2sc
Apolares

Mediana polaridad Acetato de etilo

Alta polaridad Agua, etanol/agua

Extracto total: se
prepara con etanol
 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Característica
Control de la
s de la droga
Extracción difusión celular
con
solventes

Naturaleza del Tiempo de

solvente contacto entre la
droga y el
disolvente
Temperatura
 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Extracción discontinua o simultánea:

 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Maceración en frío

Solventes usados

Agua
Agua/etanol
Metanol
Hexano
Acetona
Diclorometano
Acetato de etilo
Éter de petróleo
 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Extracción continua o progresiva:

 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Extracción continua: El solvente utilizado para la extracción se va renovando y

actúa en una sola dirección.

Percolación Extracción con soxhlet

Temperatura ambiente Temperatura de ebullición

Solventes orgánicos Solventes orgánicos
 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Concentración de líquidos extractivos:

Al vacío
Liofilización
 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS
Concentración de líquidos extractivos:

Al vacío: Utilizando un rotavapor, se trabaja a Liofilización: Consiste en eliminar el solvente mediante una
temperaturas inferiores a 40°C y en ausencia de congelación a temperatura bajas, seguido de una
oxígeno. Se aplica para concentrar líquidos extractivos sublimación del solvente, que pasa directamente del estado
obtenidos con solventes orgánicos y mezclas solido a vapor. Este método se aplica principalmente en el
hidroalcohólicas. caso de líquidos extractivos acuosos.
OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Extractos
 OBTENCIÓN DE DROGAS Y PRINCIPIOS ACTIVOS

Se puede distinguir distintos tipos de extractos según la

concentración de principio activo respecto a la droga
original y según su consistencia.

Extractos fluidos
Extractos blandos
Extractos secos
 Tamizaje fitoquímico

El tamizaje fitoquímico o screening fitoquímico es una de

las etapas intermedias de la investigación fitoquímica, que
permite determinar cualitativamente los principales grupos
químicos presentes en una planta y a partir de allí, orientar
la extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el
aislamiento de los grupos de mayor interés. El tamizaje
fitoquímico consiste en la extracción de la planta con
solventes apropiados y la aplicación de reacciones de color
y precipitación. Debe de permitir la evaluación rápida, con
reacciones sensibles, reproducibles y de bajo costo.
Metabolitos Primarios:
Son los productos químicos necesarios para la vida, resultantes del
metabolismo vital de todo ser vivo, son: los carbohidratos, los lípidos, las
proteínas y los ácidos nucléicos.
Metabolitos Secundarios:
Son subproductos de rutas metabólicas
normales que ocurren en ciertas
especies, siendo particulares dentro de
un grupo taxonómico, estado de vida o
tejido presentando una distribución
restringida dentro del Reino Vegetal
dando origen a la quimiotaxonomía. Su
ocurrencia depende de condiciones
externas tales como ataques de
patógenos, predadores, cambios térmicos
o lumínicos, deficiencias nutricionales o
presencia de otros organismos intra o
interespecíficos.

Quimiotaxonomía: clasificación de las plantas de acuerdo al grupo de

metabolitos secundarios comunes.
 Las plantas tropicales contienen mayor cantidad de aceites
secantes

El almacenamiento de los azúcares en las semillas es más

primitivo que el de los aceites.

Las plantas herbáceas no contienen leucoantocininas,

frecuentes en las leñosas.

Informaciones de esta naturaleza, permiten elegir plantas con probabilidad de

encontrar un cierto tipo de compuestos o de seleccionar métodos de trabajo
de acuerdo a los posibles componentes de un vegetal escogido al azar.
 Hormonas
Terpenos Pigmentos
Aceites esenciales

Cumarinas
Compuestos Flavonoides
fenólicos Lignina
Taninos

Saponinas
Glicósidos cardiacos,
Glicósidos
Glicósidos cianogénicos
Glucosinolatos

Alcaloides
Tamizaje Fitoqímico Preliminar o Screening Fitoquímico Preliminar es
una de las etapas iniciales de la investigación fitoquímica, que permite
identificar cualitativamente los principales grupos de metabolitos
secundarios que se encuentran en una muestra vegetal y a partir de allí
orientar el fraccionamiento para la extracción de los grupos de mayor
interés.
Expresión de los resultados de TFP

EXTRACTOS Y FRACCIONES
JE-I-
JE-I- JE-I- JE-I- JE-I- JE-I- JE-I-
Tipo de JE-I-1A JE-I-1C 3A
1B 2C 2D 2E 2F 5A
Metabolito (3,04)* (9,88) (339,32
(0,41) (11,83) (2,11) (0,93) (0.84) (1,21)
)
Alcaloides +++ - +++ +++ +++ +++ + +++ -

Taninos +++ +++ +++ +++ ++ + + - -

Triterpenos +++ - ++ +++ +++ ++ + - +++

Esteroles +++ - ++ +++ +++ ++ + - -

Cumarinas - - - - - - - - -

Saponinas - - - - - - - - -

Glicósidos - - - - - - - - -

Flavonoides - - - - - - - - -

Quinonas - - - - - - - - -
Reconocimiento de Alcaloides:
Los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en un anillo
heterocíclico, son derivados de aminoácidos, presentan distribución
taxonómica limitada y se encuentran en plantas superiores como sales de
un ácido orgánico.
Atendiendo a su solubilidad, propiedad empleada para extraerlos y
purificarlos, la base del alcaloide es soluble en solventes orgánicos y
pueden formar sales solubles en solventes polares cuando se encuentra en
ácidos minerales diluidos.
Determinación de alcaloides
Desmenuzar finamente en un mortero
(maceración), unos 10 g. de muestra fresca y
colocarlos en un erlenmeyer.

Añadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la muestra esté en

contacto con la solución ácida. Calentar con agitación al baño maría durante
unos 5 minutos.

Enfriar y Filtrar

Colocar en 3 tubos de ensayo 2 ml de filtrado ácido frío. Añadir a cada uno

2 gotas de los reactivos de Dragendorff, Mayer y Wagner. Si se observa
turbidez o precipitados, se considera que la muestra contiene alcaloides.
Prueba positiva para alcaloides
Ensayo para flavonoides
Colocar varias limaduras de magnesio en un tubo de ensayo. Añadir unos 2
ml del filtrado y por la pared del tubo, gota a gota dejar caer varias gotas de
HCl concentrado. La aparición de colores naranja, rosado, rojo o violeta es
prueba positiva para la existencia de flavonoides en la muestra.

Ensayo para Leucoantocianidinas

Colocar unos 2 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Añadir 1 ml de ácido
clorhídrico concentrado. Calentar en baño de agua hirviendo durante 15
minutos.
La aparición de coloraciones rojas es prueba positiva de la existencia de
leucoantocianidinas en la muestra.

Ensayo para Cardiotónicos

En un tubo de ensayo colocar 1 ml de filtrado. Añadir 0.5 ml de Reactivo de
Kedde (mezclar 1 ml de solución A con 1 ml de solución B para preparar este
reactivo antes de su uso). La aparición de coloraciones violetas o púrpuras es
prueba positiva de la existencia de cardiotónicos en la muestra.
 ¿Qué es la Cromatografía?

Es un método de separación
de mezclas en sus
constituyentes individuales.

Tiene dos finalidades:

 Purificación-Separación
Análisis (cualitativo,
cuantitativo)
Definición:
“Es un método de separación o análisis en el cual el flujo de un
solvente, un gas o un fluido supercrítico (fase móvil) promueve la
separación de los compuestos por migración diferencial a partir de
una estrecha zona inicial en un medio adsortivo poroso (fase
estacionaria)”.

La cromatografía es una técnica que permite la separación de los

componentes de una mezcla debido a la influencia de dos efectos
contrapuestos.

a)Retención Efecto producido sobre los componentes de la mezcla

por una fase estacionaria, que puede ser un sólido o un líquido
anclado a un soporte sólido.

b) Desplazamiento. Efecto ejercido sobre los componentes de la

mezcla por una fase móvil, que puede ser un líquido o un gas.
Proceso de las Fase móvil Fase móvil
separaciones
cromatográficas

Es la distribución de
los constituyentes de Fase
una mezcla entre la estacio-
naria
fase estacionaria y la
fase móvil.
¿Por qué se separan los compuestos?

Algunas compuestos son retenidos más fuertemente en la

fase estacionaria por:
 Su mayor polaridad, lo que favorece su adsorción en dicha
fase.
 La menor solubilidad en la fase móvil.

Otras compuestos son menos retenidas, debido a:

 Su menor polaridad, lo que disminuye su capacidad de
adsorción en la fase estacionaria.
 Su mayor solubilidad en la fase móvil
 Aplicaciones como herramienta analítica

Resolución de mezclas

Aislamiento de los constituyentes de una mezcla

Comparación de compuestos

Descripción parcial de compuestos

 Cromatografías de adsorción: Cromatografía liquida de
alta resolución (HPLC), cromatografía en columna,
cromatografía de capa fina (TLC), cromatografía gaseosa.

 Cromatografía de partición, cromatografía en

contracorriente.

 Cromatografía de afinidad.
Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria y de la fase
móvil se pueden distinguir distintos tipos de cromatografía:

a) Cromatografía sólido-líquido. La fase estacionaria es un sólido y

la móvil un líquido.

b) Cromatografía líquido-líquido. La fase estacionaria es un líquido

anclado a un soporte sólido.

c) Cromatografía líquido-gas. La fase estacionaria es un líquido no

volátil impregnado en un sólido y la fase móvil es un gas.

d) Cromatografía sólido-gas. La fase estacionaria es un sólido y la

móvil un gas.
Cromatografía de partición o de reparto

Es fundamentalmente una distribución entre

dos líquidos, fase móvil y fase estacionaria y
esta ultima puede o no estar anclada sobre
un soporte sólido.

Ambas fases deben ser inmiscibles.

En general, se emplea un sistema de dos

fases: una rica en un solvente orgánico y
otra rica en agua.
 Cromatografía de Adsorción

Usa una fase estacionaria sólida  El soluto se adsorbe sobre la

y una fase móvil líquida o superficie de las partículas
gaseosa sólidas, la separación se
explica con la deserción de
sustancias contenidas en la
CROMATOGRAFÍA DE
ADSORCIÓN
fase móvil sobre un
sólido estacionario
Fase estacionaria: sólido.
Fase móvil:  Pueden ser sistemas
líquido/sólido y gas/sólido. En
Líquido ( CSL)
cualquier fenómeno de
Gas (CSG) adsorción influyen tres
variables:
adsorbente, eluente y solutos .
Cromatografía de adsorción

La distribución tiene lugar entre un adsorbente sólido (fase estacionaria) y

un eluyente líquido (fase móvil) en la cromatografía líquida, o entre un
adsorbente sólido o líquido y un eluyente gaseoso, en el caso de
cromatografía de gases.

Características del adsorbente

• Insoluble en el eluyente.
• Inerte a las sustancias para ser separadas.
• La interacción entre el adsorbente y las moléculas adsorbidas debe
ser reversible (interacciones dipolo-dipolo y puentes de hidrógeno).
• Polaridad opuesta a la de la fase móvil.
Cromatografía de adsorción-Tipos de Fase estacionaria

Gel de sílice (silica gel)

Alúmina

Silicato de magnesio (Florisil)

Carbón activado

Poliamida
Cromatografía de adsorción-Tipos de Fase estacionaria-
Silicagel

El gel de sílice es una forma

granular y porosa de dióxido
de silicio fabricado
sintéticamente a partir de
silicato sódico.
Cromatografía de adsorción-Tipos de Fase estacionaria-
Silicagel
Cromatografía de adsorción-Tipos de Fase estacionaria-
Silicagel
Fase reversa (RP)
Fase normal
Grupos
silanoles

RP-8: C8
RP-18: C18
 C18 (ODS) OH

Weak
Strong
CH3
 Tightly packed network Loose network

H2O H2O CH3OH CH3OH

H2O
H2O
H2O CH3OH
H2O H2O CH3OH CH3OH

CH3OH
Nonpolar solute CH3OH
Nonpolar solute

Nonpolar stationary phase

57
Cromatografía de adsorción-Tipos de Fase estacionaria-
Silicagel
Cromatografía de adsorción-Tipos de Fase estacionaria-
Silicagel
Cromatografía de adsorción-Cromatografía en columna
Gravedad
Presión

Solventes
Elución
Es el método más utilizado para la separación de compuestos orgánico a
escala preparativa.
Cromatografía de adsorción-Cromatografía en columna

La fase estacionaria se deposita en el interior de una columna de vidrio

que termina con una placa porosa que impide su paso y en un
estrechamiento con una llave.

La mezcla se deposita sobre la parte superior de la fase estacionaria

mientras que la fase móvil atraviesa el sistema.

Los compuestos van saliendo por separado de la columna y se recogen

en fracciones, los más polares quedan más retenidos y para que salgan
generalmente hace falta aumentar la polaridad del disolvente.

El tiempo necesario para eluir un compuesto de la columna se llama

tiempo de retención

http://www.youtube.com/watch?v=rHeH3cOm_nI
Cromatografía de adsorción-Cromatografía en columna

Las variables que más influyen en la eficacia de la separación en

cromatografía de columna y utilizando gel de sílice como adsorbente:

a)Diámetro de la columna y cantidad de gel de sílice. La altura del

adsorbente está relacionada con la diferencia de Rf de los componentes de
la mezcla. El diámetro de la columna con la cantidad de producto a
separar.

b) Elección del disolvente. El disolvente tienen que conducir a una buena

separación de los componentes de la mezcla en capa fina, utilizándose en
muchos casos mezclas de disolventes y se realiza una elución en
gradiente. Una de las mezclas más utilizadas es hexano/acetato de etilo.
Silica gel-Tamaños de partícula

Silica gel para columna y TLC Silica gel para HPLC

230-400 mesh: 40-63 μm 5 μm: tamaño de partícula estándar para
HPLC.
0.7-0.85 cm3/g
60 Å
3,5-1,8 μm: para obtener mayor
resolución.
70-230 mesh: 63-200 μm
0.8 cm3/g

35-60 mesh: 200-500 μm
Cromatografía de adsorción- Cromatografía de Capa Fina

Rf es el factor de retardo o retraso, que

mide la movilidad relativa de cada
componente con respecto al máximo
posible, la distancia recorrida por el frente
de fase móvil.
Componente 1: Rf = a / D
Componente 2: Rf = b / D 
Componente 3: Rf = c / D
Cromatografía de adsorción- Cromatografía de Capa Fina
Cromatografía de adsorción- Cromatografía de Capa Fina

APLICACIONES

1. Servir de guía para el desarrollo de las condiciones optimas para

realizar separaciones por cromatografía liquida en columna. Razones:
bajo costo y rapidez.

2. Control de pureza de compuestos orgánicos y organometálicos

(Industria Farmacéutica, Laboratorios Clínicos y Laboratorios Industriales.

3. Aplicación en Estudios Bioquímicos y Biológicos

Cromatografía de adsorción- Cromatografía de Capa Fina

Grosor de la Fase
Estacionaria (FE)
Humedad de las FM y FE.
Temperatura
Grado de Saturación de la cámara de
desarrollo con los vapores de la FM
Tamaño de la muestra aplicada
Cromatografía de adsorción- Cromatografía de Capa Fina
Cromatografía de adsorción- Cromatografía de Capa Fina
Cromatografía líquida de alta resolución
Técnica analítica de separación mas ampliamente utilizada
Alta sensibilidad
Fácil adaptación a determinaciones cuantitativa exactas
Idoneidad para separación de especies no volátiles o termolábiles
Gran aplicabilidad a una amplia diversidad de sustancias de interés
científico e industrial

Se utiliza en la determinación de:

1.Compuestos iónicos, como aminoácidos, sales inorgánicas, acido

orgánicos.

2. Compuestos de alto peso molecular. Como polímetros, hidrocarburos,

polinucleares, productos naturales.

3. Compuestos termolabiles y no volátiles, como vitaminas, pesticidas,

esteroides, plastificantes, drogas y un numero muy grande de otros
productos farmacéuticos
 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

 Sistema muy poderoso de purificación

 Sistema restringido
 Se basa en la interacción específica de dos
compuestos
Antígeno - Anticuerpo
Enzima - sustrato
Receptor - Ligando
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
Cromatografía de exclusión molecular (filtración por gel)

NO existen interacciones entre

la fase estacionaria y el soluto.
Se separa por tamaño de
partícula.

Las moléculas pequeñas penetran

Sephadex
en los intersticios del gel
quedando retenidas.

Las partículas de mayor tamaño,

al no poder ingresar al interior del
gel, son eluídas.

Así, se consigue separar las

moléculas de acuerdo a su
tamaño molecular
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Intercambio aniónico
F.E. con carga positiva, une aniones,
bien los del disolvente (F.M.) o bien los de
la muestra (de ahí la palabra intercambio).

Intercambio catiónico
F.E. con carga negativa, une cationes,
bien los del disolvente (F.M.) o bien los de
la muestra.
Cromatografía líquida de alta resolución

 Cromatografía de líquidos de alta eficacia

 Fase móvil, líquido a alta presión
 Fase estacionaria sólido en columnas de un
diámetro de 3 a 10 micras.
 Analito: líquido.
 Utiliza instrumentación especializada.
Cromatografía líquida de alta resolución

El equipo de HPLC ésta

constituido por:
- Reservorio de solvente:
Recipiente que contiene
la fase móvil.
- Inyector
- Bomba
- Columna
- Detector
Cromatografía líquida de alta resolución
 La separación de los compuestos…
Columna
Fase
Móvil

Inyección Migración Elución

Compuestos
 Cromatografía de líquidos en columna

 Sentido de flujo

A+B
1

A+B
A B
2
 Cromatografía de líquidos en columna

 Sentido de flujo

3 A B

4 A B
 Cromatografía de líquidos en columna

 Sentido de flujo
Tiempo

A B Registrador

Diafragma
de
Columna
inyección
de muestra
Detector
 Ejercicio
Explique el comportamiento del siguiente cromatograma

Fase Reversa
Eluente: Methanol / Water

60/40

70/30

80/20
 Ejercicio
Explique el comportamiento del siguiente cromatograma

Fase normal
Eluente: Hexane/methanol

100/0

98/2

95/5
Cromatografía de adsorción-Tipos de Fase estacionaria-
Silicagel
GRACIAS