ESQUEMA DE OBTENCIÓN DE PLANTAS TRANGÉNICAS RESISTENTES A

A. CONSTRUCCIÓN GÉNICA
HERBICIDAS
B. TRANSFORMACIÓN INDIRECTA MEDIADA POR Agrobacterium EN
TABACO

Vector T-DNA
Vector T-DNA
Secuencia señal extraída de los Agrobacterium
Tejido aislado (hojas,
cloroplastos de Petunias tallos, cotiledones, etc)
EPSPS de bacterias
Promotor del insensible al glifosato La secuencia T de la construcción ingresa
CaMV Plásmido binario: A. tumefaciens con plásmido
confeccionado y plásmido manejado propio de la bacteria al genoma de la planta, algunas células se
(sin región T, solo con región Vir) transforman y otra no.

La secuencia señal permite que la proteína de la EPSPS se dirija a los

cloroplastos. La EPSPS inactiva el glifosato, compuesto químico que toxico Llevamos a otra placa con el medio selectivo solo
que altera los cloroplastos y causa muerte de la planta. aquellas que han podido crecer, es decir resistir para que
se formen:
Plántulas Callos
D. COMPROBACIÓN DE RESISTENCIA ROCIANDO Medio selectivo
GLIFOSATO A PLANTAS DE TABACO P. transgénica lista para con antibiótico
análisis y pruebas de campo

C. PROTEINA SEÑAL Y DE EPSPS SE DIRIGE A LOS

CLOROPLATOS

Cuando se aplica glifosato, este se dirige

hacia los cloroplastos, pero es inactivado
por la EPSPS, de esta forma la planta
transgénica no sufre daño, a diferencia de Tanto la proteína señal como la proteína de interés (EPSPS)
una normal. traducidas se dirigen hacia los cloroplastos, en este lugar se
De tipo silvestre Transgénica libera la enzima EPSPS y se queda retenida aquí.
 ESQUEMA DE OBTENCIÓN DE PLANTAS TRANGÉNICAS PRODUCTORAS DE
ANTICUERPOS
B. TRANSFORMACIÓN INDIRECTA MEDIADA POR Agrobacterium
A. CONSTRUCCIÓN GÉNICA
Vectores T-DNA
cDNA de la Cadena Ligera cDNA de la Cadena Pesada Vector T-DNA
Agrobacterium
Tejido aislado (hojas,
tallos, cotiledones, etc)
Secuencia señal Secuencia señal
de ratón de ratón Terminador
Terminador
Plásmido binario: A. tumefaciens con plásmido La secuencia T de la construcción ingresa
Promotor del Promotor del confeccionado y plásmido manejado propio de la bacteria al genoma de la planta, algunas células se
CaMV CaMV (sin región T, solo con región Vir) transforman y otra no.

Llevamos a otra placa con el medio selectivo solo

Obtenemos las secuencias del cDNA de la Cadena aquellas que han podido crecer, es decir resistir para que
Ligera y Pesada del Genoma Humano se formen:
Plántulas Callos

Medio selectivo
P. transgénica lista para
D. PLANTA TRANSGÉNICA QUE EXPRESA UN ANTICUERPO análisis y pruebas de campo
con antibiótico
FUNCIONAL
C. PLANTAS TRANGÉNICAS QUE EXPRESAN LAS
Entrecruzamiento CADENAS
mediante injerto para
obtener en anticuerpo
completo

Planta transgénica que expresa la Cadena Ligera y la Cadena pesada

formando un anticuerpo funcional, estas se unen en el citoplasma
Planta transgénica que Planta transgénica que
mediante enlaces disulfuros
expresa la Cadena Ligera Se cruzan ambas plantas expresa la Cadena Pesada
 ESQUEMA DE DISEÑO DE PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
c. Selección - escrutinio
a. Inmunización b. Fusión Cultivo celular
Células del
Linfocitos B mieloma
Linfocitos B HGFRT- ,
Antígeno HGFRT+, Ig+, Fusión Cél. del mieloma
inmortal
Linfocitos B Hibridoma
Bazo mortal no fusionado no fusionada
HGFRT +, inmortal
PEG
Selección en medio HAT

Linfocitos B Cél. del mieloma Linfocito B Hibridoma Células del

no fusionado no fusionada Viven, crecen por un tiempo mieloma
s
Viven
Se inocula al ratón con el Ag., este debe ser y después mueren Mueren
purificado de preferencia. Los linfocitos B Hibridomas
producidos se extraen del bazo del animal. HGFRT +, inmortal
Uno de los componentes del medio HAT, la aminopterina inhibe la
dhfr presente en los 3 tipos de células, pero los hibridomas sobreviven
por presentar HGFRT+ que actúa sobre otro componente llamado
Se utiliza un agente fusogeno como el polietilenglicol (PEG), se obtienen hipoxantina.
heterocariones (46 X) o hibridomas que heredan la HGFRT+, algunas no
f. Purificación de los Ac. monoclonales logran fusionarse quedándose en su estado original.
Escrutinio: sensibilidad,
Técnicas especificidad, rápido y sencillo
e. Mantenimiento del hibridoma d. Clonación
Cromatográficas
Clon 1 Clon 2

Exclusión Afinidad Intercambio

molecular iónico N2 líquido

Pesca microscópica Hibridomas en un

medio líquido

Anticuerpos monoclonales
Se puede criopreservar en N2 líquido de forma infinita, siempre y cuando
Se elige la técnica dependiendo de las características del Ac. no se evapore y se vaya adicionando periódicamente. Esta técnica nos Se puede utilizar la Pesca microscópica, esta se realiza con un capilar y un
y del uso, si es para diagnóstico in vitro 50-70% de pureza y garantiza la estabilidad génica del hibridoma evitando que se separe. microscopio, se absorben uno por uno cada tipo de hibridoma con el capilar y
si es para usos in vivo 95-99% de pureza. se lleva a un pocillo con medio.