FUNDAMENTOS DE

ESPECTROMETRÍA
DE MASA.

Orlando Lucas Aguirre, Mag, Q.F.

1
 Temario:

 FUNDAMENTOS DE ESPECTROMETRÍA DE
MASA.
 DESCRIPCIÓN GENERAL DEL EQUIPO LC-
MS/MS
 IONIZACIÓN A PRESIÓN ATMOSFÉRICA (API).
 ANALIZADORES DE MASA.
 MODOS DE ADQUISICIÓN EN
ESPECTROMETRÍA DE MASA. SIMPLE (MS) Y
EN TÁNDEM (MS/MS)

2
 NOBEL EN QUÍMICA 2002
Espectrometría de Masa y RMN aplicado al análisis de Proteínas

3
 ESPECTROMETRÍA DE MASA (MS)
“El principio básico de la MS es generar, separar y detectar
iones en base a su relación m/z y abundancia”
Jürgen H. Gross, Mass Spectrometry

ESPECTRÓMETRO DE MASA

4
 Diagrama conceptual MS
GC Cuadrupolar (Q)
Gases o líquidos Sector Magnético
Tiempo de vuelo (ToF) Multiplicador de
volátiles por EI, electrones
Trampa de iones (Trap)
CI
LC Fotomulltiplicador

Solidos o
Soluciones
FUENTE ANALIZADOR
por ESI, IONES DETECTOR
APCI o DE IONES IONES DE MASA
MALDI

Solidos por
MALDI

SISTEMA DE
DATOS 5
Espectro de masa ESI - Chloridazon
•Molecular Formula C10H8ClN3O
•Average mass 221.643 Da
•Monoisotopic mass 221.035583 Da

LC-MS /ESI+

LC-MS /ESI-

6
 Espectro de masa EI: Chloridazon
•Molecular Formula C10H8ClN3O
•Average mass 221.643 Da
•Monoisotopic mass 221.035583 Da

GC-MS / EI Ion molecular

7
 Resolución y Exactitud de Masa en MS
Resolución de Masa: Habilidad para separar dos masas
adyacentes. Mide la delgadez del pico MS.
Exactitud de Masa: Indica la exactitud de la masa
prroporcionada por el MS

8
 Resolución de masa en MS
Método de Ion Individual Método de Ion Doble
Ancho total a la mitad de la altura 2 picos de iones adyacentes
máxima FWHM con un valle máximo de 10%

FWHM= 0.3 Daltons de

ancho de pico

m m
R= R=
FWHM Dmr
R = 279/0.3 = ~ 1000 R = 1 000/1 = ~ 1000 9
 Exactitud de masa en MS
La exactitud de masa es la diferencia observada entre la
masa teorica y la masa medida.

Dm exactitud = mreal - mmedida

Generalmente se expresa en partes por millón (ppm).

ppm = 106 * Dm exactitud / mmedida

Por ejemplo: masa teorica:1000, masa medida:999.9;
exactitud de masa = 100 ppm
La exactitud de masa esta ligada a la resolución. Un
instrumento de baja resolución no puede proporcionar
10
una alta exactitud.
 Resolución y exactitud de masa
3 compuestos diferentes 3 compuestos diferentes
Misma masa nominal 3 masas exactas diferentes
BAJA RESOLUCIÓN ALTA RESOLUCIÓN,
ALTA EXACTITUD.

249.0479

Los instrumentos de alta resolución (ToF, FTMS, Sector Magnético, etc)

proporcionan información de masa con una exactitud mejor que 5ppm, lo cual es
suficiente para determinar la composición elemental
11
 LC-MS produce información en 3-D

Cromatograma de Ion Total -TIC

12
 LC-MS produce información en 3-D

Cromatograma
Intensidad de Ion Total -TIC

Espectro de masa de los picos

resueltos

13
DESCRIPCIÓN GENERAL DEL
EQUIPO LC-MS/MS

14
Cromatógrafo Liquido acoplado a Espectrómetro de
Masa LC-MS

INTRODUCCIÓN Flujo HPLC

DE MUESTRA
Columna HPLC

MS

API Alto Vacio

1- 2-
INTER 3- SISTEMA
FUENTE DE ANALIZADOR
FASE DETECTOR DE DATOS
IONES DE MASA

15
 Cromatografo Liquido acoplada a
Espectrometro de Masa LC-MS
Combina el poder de separación de la
cromatografía Liquida con el poder de detección
de la espectrometría de masa.
LC MS/MS

16
Componentes del Espectrómetro de masa Xevo
TQXS
Fuente de Iones
Sistema de
Electrospray- ESI
infusión

17
 Tandem Cuadrupolar MS/MS
 El analizador “Triple cuad” consiste de dos
cuadrupolos separados por una celda de colisión.
 El termino correcto es “Tandem Cudrupolar” debido a
que actualmente se usa nuevos diseños de celda de
colisión diferentes al cuadrupolar.
Ejemplo en modo de Q1 Q2 Q3
Escaneo de Ion Producto Estático Celda de Escaneo
Lentes RF Colisión

18
 Instrumentos Triple Cuadrupolar
En un espectrómetro de masa en tandem o triple cuadrupolar, MS1
y MS2 son analizadores de masa que filtran los iones.

MS1 Celda de Colisión MS2

MS1 es usado como un En la celda de colisión, MS2 es usado como un
selector de masa y los iones que vienen selector de masa y
permite que los iones del MS1 se colisionan permite que los iones
de una determinada con átomos de Ar y se productos de una
masa pasen hacia la fragmentan en iones determinada masa
celda de colisión productos. pasen hacia el detector

19
 IONIZACIÓN A PRESIÓN
ATMOSFÉRICA
(API).

IONIZACIÓN ELECTROSPRAY
(ESI)

20
INTRODUCCIÓN DE MUESTRA

FUENTE DE ANALIZADOR DE
INTERFASE DETECTOR
IONES MASA

Alto vacio

SISTEMA DE DATOS

21
 Ionización a Presión Atmosférica-API
La muestra es desolvatada e ionizada bajo
condiciones de presión atmosférica.
TIPOS:
 Ionización por Electrospray- ESI.
 Ionización Química a Presión Atmosférica- APCI.
 Fotoionización a Presión Atmosférica-APPI.

Fuente ESI

22
 Ionización por Electrospray-ESI
 Se aplica un campo eléctrico a través de una
interface que forma una celda electroquímica.
 Los iones en solución son transferidos a la fase
gaseosa.
Reducción

Oxidación

Electrones

Electrones
Alto Voltaje 23
 Formación de Gotas en Electrospray Positivo
Mas Iones Negativos
que Positivos

Liquido

Gotas cargadas
positivamente
Cono de Taylor

Mas Iones Positivos

Alto Voltaje que Negativos
Punta de la Sonda
Electrosporay
24
 Gas de Nebulización Electrospray Neumático
(Nitrógeno)
(Usa Gas de Nebulización)

Flujo del
Liquido

Pluma ElectroSpray

25
 Muestras analizadas en Modo ES
Muestra Típicas de ES Ion Positivo
Péptidos y proteínas
Moléculas pequeñas polares
Medicamentos y sus metabolitos
Contaminantes ambientales
Colorantes
Algunos organometalicos
Sacaridos pequenos

Muestra Típicas de ES Ion Negativo

Algunas proteínas
Algunos metabolitos de medicamentos (por ejemplo
conjugados)
Oligonucleótidos
Algunos sacáridos y polisacáridos
26
 Proceso ESI
1. NEBULIZACIÓN: Producción y expulsión de gotas
cargadas hacia la región de desolvatacion.
2. DESOLVATACIÓN: Eliminación de solvente de las gotas.
3. PRODUCCIÓN DE IONES EN FASE GASEOSA.

Zona de
producción
de ion en fase
de gas

Zona de desolvatación donde

se produce la Fisión
Coulumbica

Punta del capilar Cono de muestra 27

 Nebulización ESI

Cono de Taylor
Los siguientes factores
interactúan para establecer
un ESI reproducible:
Alto Voltaje

 CAPILAR: diámetro interno y externo, forma de la

punta y material de construcción (metálico, silica, etc)
 VOLTAJE DEL CAPILAR (Vc).
 ELUYENTE HPLC: Flujo, tensión superficial y
concentración de electrolitos.
 GAS DE NEBULAZACION: Flujo y temperatura.
28
 Voltaje del capilar (Vc)

 Modo Spray Axial (Voltaje optimo)

 Modo Rim Emission (Señal inestable)
 Descarga de corona (Baja relación señal/ruido)

Potencial Electrostático
Aplicado (kV)

29
 Voltajes de Operación del Electrospray

Ion Positivo (V) Ion Negativo (V)

Infusión 3000 - 4000 2500 - 3500

(<50uL/min)

Flujo LC 2500 - 3500 2000 - 3000

30
 Desolvatación ESI
GAS DE DESOLVATACION (Drying Gas): Gas N2
 T°: 200–500o C.
 Flujo: 5-50 L/min (300–3000 L/H)

31
 Desolvatación ESI
FISION COLUMBICA

Zona de
Punta del capilar
producción
de iones en
fase de gas

Zona de desolvatación donde se

produce la Fisión Coulumbica

Cono de muestra

32
Temperatura y Flujo del Gas Desolvatacion (N2)
según el Flujo del LC

Flujo LC (uL/min) Temp Desolv (°C) Flujo Gas L/H

<10 100-120 200-250

10-20 120-250 200-400

20-50 250-350 200-400

>50 350-400 500-800

Nano LC Ninguno Optimizado

33
 Producción de iones en fase gaseosa.
Factores que determinan el numero de cargas dentro
de la gota (N) y el radio de la gota (R):
 ELUYENTE HPLC: Flujo y composición
 GAS DE NEBULIZACION : Tipo y flujo
 GAS DE DESOLVATACION: Temperatura y flujo
 CAPILAR: Voltaje

34
Ionización por Electrospray - ESI (+)

35
Ionización por Electrospray - ESI (-)

36
 Analitos disponibles para ESI
COMPUESTOS:
 Que contienen Heteroatomos (Cl , Br)

Clorpirifos Atrazine

 Que producen una carga a través de un efecto

inductivo (Azocompuestos, ftalatos, opiaceos)
 Compuestos capaces de contener cargas
múltiples (proteínas, péptidos)
37
 Analitos disponibles para ESI
COMPUESTOS:
 Ionizables (Ácidos, bases, etc)

Carbofuran 2,4-D

 Que tienen un fuerte momento dipolar pero que

no se pueden ionizar (Aldehidos, eteres, etc).
Formación de aductos Na, K o MeCN.
38
 Proceso de Ionización ESI

ESI POSITIVO
Se forma un “Aducto” por la adición de un ión
positivo ( H+, NH4+, Na+ )

M + H+ [M+H]+

ESI NEGATIVO
Se produce por la remoción de un protón (Ion
hidrogeno) de una molécula.

M - H+ [M-H]-
39
 Ionización en solución en ESI
IONES POSITIVOS: Son producidos por la adición de un
ión positivo ( H+, NH4+, Na+).“aductos”.

+H+
+

H
Carbofuran

IONES NEGATIVOS: Son frecuentemente producidos por la

remoción de un protón (Ion hidrogeno) de una molécula.

H - H+ -

2,4-D
40
 Ionización en solución en ESI
 ESI trabaja mejor en Reducción
soluciones con alto
Oxidación
porcentaje de solventes
orgánicos (acetonitrilo o
metanol), aunque la
Electrones
solución debe tener algo
de contenido acuoso y Alto Voltaje
Electrones

algunos iones.
 Las moléculas con gran tendencia a la ionización
presentan señales de electrospray más fuertes; por
ello ciertos aditivos de la fase móvil, como la adición
de ácido fórmico, pueden mejoran las señales en
el ESI+. 41
 Solventes y aditivos usados en LC-MS-API
CRITERIOS DE SELECCIÓN:
Ionización.
Volatilidad: Es mejor usar buffers volátiles.
Ácidos: H2SO4, HCl, Acido metasulfonico. Pueden
dañar el instrumento y no deben ser usados. Se debe
usar ácidos orgánicos volátiles (TFA, fórmico, acético)
Formación de aductos: Sodio, Amonio, Acetato
Surfactantes: Afecta la formación del spray, la
evaporación de la gota y compite con la ionización.
Concentración de buffers: Mantenerlo tan bajo como
sea posible (en el orden de mM). Si el buffer es muy alto
puede ocurrir supresión iónica.
42
 Solventes y aditivos comunes en LC-MS-API

 Agua
 Metanol
 Acetonitrilo
 Acido Fórmico (<0.1%)
 Acido Acético (<0.1%)
 Acido Trifluoroacetico (<0.1%)
 Acetato de Amonio (<10 mM)
 Formiato de Amonio (<10 mM)
43
Efecto del GAS DE CONO o Curtain Gas en ESI:
Previene el ingreso de iones cluster al analizador de masa:

44
Gas de Cono – Reduce los racimos

45
Intercambio de polaridad ESI

46
ANALIZADORES DE
MASA

47
INTRODUCCIÓN DE MUESTRA

FUENTE DE ANALIZADOR DE
INTERFASE DETECTOR
IONES MASA

Alto vacio

SISTEMA DE DATOS

48
Tipos de Analizadores de masa

BAJA RESOLUCIÓN:
 Cuadrulopo Q
 Trampa de Iones Trap
ALTA RESOLUCIÓN:
 Tiempo de vuelo ToF
 Sector Magnético
 Resonancia Ion-Ciclotron con
Transformada de Fourier FT-MS
 Ion mobility
 Orbitrap
ANALIZADORES HÍBRIDOS
Q-Tof, Q-q-Q, Q-Trap, etc
49
 Analizador de masa CUADRUPOLAR
Las moléculas de un especifico valor m/z tienen una
trayectoria estable (Ion resonante) a un determinado
valor de voltajes dc y rf, el resto de iones son
inestables y se pierden

Ion resonante Detector

Ion no resonante

rf y -dc

Fuente Voltajes dc y rf

rf y +dc

50
 Teoría del Cuadrupolo
 Un cuadrupolo esta constituido de cuatro varillas paralelas
organizados equidistantemente a partir de un eje central.
 Los iones pueden ser filtrados a través de la aplicación de
voltajes RF y DC a lo largo del eje central y su masa puede ser
medido para generar un espectro de masa.
 Dependiendo del potencial exacto aplicado al cuadrupolo, los
iones con masas muy grandes o muy pequeñas, no pasaran a
través del cuadrupolo. Estos iones chocaran contra las varillas y
se perderán.

51
Esquema del Instrumento
Tandem Cuadrupolar

52
Analizador Cuadrupolar

53
Uso del Cuadrupolo como filtro de masas
(U, V varían linealmente)

54
Uso del Cuadrupolo como filtro de masas –Ejemplo
de una mejor línea operacional (mejor resolución)

55
Uso del Cuadrupolo como filtro de masas –Ejemplo
de una línea operacional óptima (óptima resolución)

56
 Diagrama de estabilidad del Cuadrupolo

PENDIENTE= WIDTH GAIN

LINEA DE SCAN
VOLTAJE DC

924

923

922
WIDTH
OFFSET

VOLTAJE RF

57
INTRODUCCIÓN DE MUESTRA

FUENTE DE ANALIZADOR DE
INTERFASE DETECTOR
IONES MASA

Alto vacio

SISTEMA DE DATOS

58
Detector en MS: Multiplicador de electrones
Se utiliza un dinodo de conversión para convertir ya sea los
iones positivos o negativos en electrones. En el dinodo de
conversión se usa altos potenciales para acelerar los iones
de masa elevada y de esta manera mejorar la sensibilidad.
IONES

ELECTRONES
59
Modos de Adquisición en
Espectrometría de Masa
(MS y MS/MS)

60
 MODOS DE ADQUISICIÓN en MS/MS

MS1 Celda de MS2

Modo de Adquisición
Q1 colisión Q2
MASA SIMPLE - MS
• MS Scan ESCANEO INACTIVO
(Sin Gas/
• Monitoreo de Ion Individual INACTIVO
FIJO Energía de
(SIR o SIM) Colisión)
TÁNDEM MASA - MS/MS
• Escaneo de Ion Producto
FIJO ESCANEO
(Product Ion Scan, Daughter Scan)
ACTIVO
• Monitoreo de Reacción Múltiples Inducción de la
FIJO fragmentación FIJO
MRM
(Con gas +
• Escaneo de Ion Precursor ESCANEO Energía de FIJO
ESCANEO Colisión) ESCANEO
• Perdida constante neutral (sincronizado (sincronizado
con MS2) con MS1)
61
 ESCANEO MS
MS SCAN

Q1 Celda de colisión Q2
Fuente SIN GAS / ENERGÍA
INACTIVO
SCAN COLISIÓN

62
63
 Peso Molecular Promedio vs Monoisotopico

Peso Molecular
Promedio:
Se calcula sumando
los pesos atómicos
(en u.m.a) de cada
elemento.

Peso Molecular
Monoisotopico:
Se calcula sumando
los pesos exactos (en
u.m.a) de los isotopo
mas abundante de
cada elemento
64
Espectro obtenido por LC-MS Scan

65
66
 MONITOREO DE ION INDIVIDUAL
SINGLE ION MONITORING - SIR O SIM

Q1 Celda de colisión Q2
Fuente SIN GAS / ENERGÍA
INACTIVO
FIJO COLISIÓN

67
Ejemplo SIM

68
 MODO DE ADQUISICIÓN MS/MS

MS1 es utilizado En la celda de MS2 es utilizado

como un selector de colisión, los iones como un selector de
masa y permite que que vienen del MS1 masa y permite que
los iones de una colisionan con los los iones productos
masa particular átomos de Ar y se de una masa
pasen hacia la celda fragmentan en iones particular pasen
de colisión productos hacia el detector.

En la celda de colisión se aplica un potencial (típicamente 5-40 eV) para

controlar la energía de colisión entre los iones y los átomos de Argón

69
 ESCANEO DE ION PRODUCTO
DAUGHTER SCAN –PRODUCT ION SCAN

Celda de colisión
Q1 CON GAS + Q2
Fuente ENERGÍA DE
FIJO COLISIÓN
SCAN

70
Efecto de la Energía de Colisión en Daughter Scan

Clorfenamina (MW = 274)

230

71
Espectro de iones producto de AZA1 PM=841.497620

72
 MONITOREO DE REACCIÓN MÚLTIPLES
MULTIPLE REACTION MONITORING - MRM

CELDA DE COLISIÓN Q2
Q1
Fuente CON GAS + ENERGÍA
FIJO
FIJO DE COLISIÓN

73
 Modo de adquisición MRM
• Solo iones de un especifico m/z (ION PRECURSOR) pasan
a través Q1 e ingresen a la celda de colisión
Q1 Celda de colisión Q2

• En la celda de colisión, los iones son fragmentados por la

aplicación de energía y un gas inerte: N2, Ar o He.
(Disociación Inducida por Colisión-CID)
• Solo fragmentos específicos (ION PRODUCTO) pasan a
través de Q2.

TRANSICION MRM: Precursor > Producto

74
 Disociación Inducida por Colisión (CID)
Colisión de iones en fase gaseosa con moléculas neutras (Ar,
N2) que produce roturas y rearreglos de sus enlaces que son
representativo de su estructura molecular.
Daughter Scan de AZA1 PM = 841.5

75