Dra.

Mercedes Emelinda Lpez I PERIODO 2013

Tecnica histologica

Definicion
Se define tcnica histolgica al

conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al microscopio

Tecnicas Histologicos
Se realizan una serie de pasos para la

preparacion del tejido para su posterior estudio en el microscopio La tecnica mas comunmente utilizada en los laboratorios de histotecnologia es la de la Parafina Estan relacionadas con los avances de la microscopia

Pasos de la Tcnica

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

Para su realizacin se efectan una serie de pasos secuenciales ordenados Obtencin de la muestra Fijacin de la muestra Deshidratacin Aclaramiento Inclusin Corte Coloracin Montaje

1.Obtenion de la Muestra
De tres fuentes puede provenir el material humano: las necropsias, las biopsias y las piezas operadas. De stas, slo la primera puede darnos material normal; las dos ltimas proporcionarn tejidos patolgicos.
- Necropsias: son

las piezas que se obtienen de un cadver. Para histologa normal es necesario que se trate de un cadver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesin, por lo menos el rgano que se quiere estudiar.

-Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico. - Piezas operadas: los tejidos que han sido extrados de las intervenciones quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados, tambin pueden darnos material de investigacin pero, como en el caso anterior, slo servirn para anatoma patolgica

Obtencion de la Muestra
Autopsias-Necropsias Biopsias

Tipos

Medicolegales Hospitalarias

Tipos Incisionales Excisionales Transoperatorias Por Aguja Citologia Exfoliativa

 Autopsia Forense o Necropsia:

Necropsia Mdico Forense: Es el procedimiento mdico encaminado a que

en la revisin interna y externa del cadver sea posible establecer la causa de muerte del occiso relacionado con una averiguacin previa y en auxilio de una investigacin judicial. Es recomendable que en los siguientes casos se efectu la necropsia mdico legal: 1.- En todas las muertes violentas incluyendo aquellas en que este la duda de violencia. 2.- Personas que fallecieron en reas de reclusin y/o seguridad y que estuvieron bajo responsabilidad de servidores pblicos de seguridad pblica y procuracin de justicia. 3.- Muertes en la va pblica. 4.- Muertes sospechosas de haberse producido por violacin a los derechos humanos.

 Requisitos para la prctica de la necropsia: Orden escrita para la prctica del estudio de necropsia firmada por la

Autoridad Ministerial. Copia de la Averiguacin Previa. Acta Mdica.

En caso de haber recibido atencin mdica horas o das previos a su

muerte, resumen clnico de las intervenciones y tratamientos a las que fue sometido. Orden de entrega a los familiares y de aviso a la Autoridad del Registro Civil.

Objetivos a determinar: 1.- La causa de muerte (Cuando es posible). 2.- La hora aproximada de la muerte. 3.- La identidad del cadver. 4.- Descripcin detallada de las lesiones externas e internas, as como de los hallazgos de necropsia, siguiendo los protocolos internacionalmente aceptados

Autopsias Medicolegales

 Autopsia Clnica:
Es generalmente realizada para determinar no slo la causa de la muerte, que en muchos casos es conocida, sino todos los procesos patolgicos que afectaban al

individuo. Tiene propsitos de estudio e investigacin. Es solicitada por los facultativos que atendieron al paciente y debe ser autorizada por los familiares.

Biopsias

BIOPSIA
es

un procedimiento realizado con el propsito de obtener tejido o clulas del cuerpo para examinarlos con el microscopio.

BIOPSIA
Las biopsias usualmente se realizan para determinar si

un tumor es maligno (canceroso) o para determinar la causa de una infeccin o inflamacin inexplicada.
Los endoscopios flexibles (tubos flexibles de fibra

ptica, con un lente para la visin y luz) permiten que el cirujano observe dentro del cuerpo a travs de una incisin pequea y que tome una muestra de tejido.

Tipos de biopsias:
La biopsia endoscpica La biopsia de la mdula sea La biopsia excisional o inscisional La biopsia de aspiracin por medio de una aguja fina Una biopsia de perforacin La biopsia de raspado La biopsia de la piel

ENDOSCOPISTA TOMANDO MUESTRA

PACIENTE REALIZANDOSE ENDOSCOPIA

RESULTADO DE LA BIOPSIA

Los sitios comunes para las biopsias son:

La mdula sea. Los senos. El tracto gastrointestinal. El rin. El hgado. El pulmn. Los ndulos linfticos. La piel. La tiroides. El cerebro.

Despus de una biopsia, la muestra de tejido se enva a una de las siguientes reas de la anatoma patolgica para que la examinen y la analicen:
La patologa quirrgica.
La citologa. La autopsia.

BIOPSIA POR CONGELACION

Tcnica utilizada para evaluar Inmediatamente el tejido obtenido durante el acto quirrgico para poder tomar una conducta teraputica con el diagnostico anatomopatologico.

PASOS 1. Congelacin de la muestra del tejido ( anhdrido carbnico)

2. Corte del tejido

congelado (criostato)
3. Tincin de los cortes

El proceso dura unos 10 minutos

H-E y azul de metileno

BIOPSIAS TRANSOPERATORIAS
Se realiza rapidamente durante el acto

quirurgico para decidir un conducta medicoquirurgica

El tejido en fesco sin fijacion se congela a

altas temperaturas con la utlizacion de un aparato llamado CRIOSTATO

BIOPSIAS POR CONGELACION- CRIOSTATO

- Cristato: consta de un micrtomo tipo

Minot incluido en una cmara de congelacin. El volante de inercia que controla la realizacin del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance estn situados dentro de la cmara fra (normalmente a -20 C).

Citologia Exfoliativa
Utilidad Descatar Malignidad

Determinacion de Sexo Estudio Hormonal

CITOLOGIA EXFOLIATIVA
Citologa exfoliativa: estudio

citolgico de las clulas exfoliadas de un rgano en comunicacin con el exterior o fcilmente accesible: crvix y/o vagina, bronquios, mucosa oral, estmago

Es una tcnica que

CITOLOGIA EXFOLIATIVA O PAPANICOLAU

nos sirve para detectar precozmente el cncer cervicouterino.

Citologia cervicovaginal
La toma citolgica cervicovaginal consiste en pasar

suavemente un algodn y una esptula de madera por el cuello uterino El procedimiento es indoloro.

El moco obtenido que contiene clulas se deposita en un pequeo cristal (portaobjetos) y se tie con diversos colorantes. Ms tarde se examinan al microscopio las caractersticas de forma, tamao, coloracin..., etc., que tienen las clulas. Distintas clulas de aspecto normal

CITOLOGIA EXFOLIATIVA
Los pasos a seguir en la toma de citologa son: Anamnesis y registro para citologa. Preparacin de las lminas. Toma de la muestra utilizando esptula de madera o plstico para el exocrvix y cepillo para el endocrvix, teniendo en cuenta: - No hacer tacto vaginal antes de la toma de la muestra - Usar espculo sin lubricante - Exponer muy bien el crvix - Limpiar el exceso de flujo con torunda de algodn.

PAPANICOLAU

 - Extender la muestra en forma adecuada para que quede

delgada - Fijar la muestra utilizando cito-spray, fijador comercial o alcohol al 95%. Identificar adecuadamente la lmina. Informar a la usuaria sobre la importancia de reclamar oportunamente el resultado.

CITOLOGIA EXFOLIATIVA 1. Infeccin

- Vaginosis Bacteriana - Tricomonas - Clamydia - Herpes 2. Otros Cambios reactivos - Cambios reparativos - Inflamacin por atrofia

Citologia Cervicovaginal

La biopsia dirigida y el curetaje endocervical pueden arrojar cualquiera de los siguientes resultado anatomopatologico: Negativa para neoplasia Infeccin por VPH NIC de bajo grado: NIC I NIC de alto grado: NIC II, NIC III Neoplasia microinfiltrante: escamocelular o adenocarcinoma Neoplasia infiltrante: escamocelular o adenocarcinoma

CITOLOGIA EXFOLIATIVA

CITO BRUSCH

La citologa exfoliativa oral se define como el estudio e interpretacin de los caracteres de las clulas que se descaman, natural o artificialmente, de la mucosa oral. Consiste en observar al microscopio la morfologa de las clulas epiteliales superficiales despus de su toma, fijacin y tincin (6). Es una tcnica sencilla, no agresiva, relativamente indolora y bien aceptada por los pacientes, por lo que podra ser til en el diagnstico precoz del cncer oral

2. FIJACION
La fijacin tiene por objeto la conservaion

celular, evitando su destruccion Por lo tanto es un mtodo histolgico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfolgica y qumica de las clulas

2. FIJACIN
La fijacin tiene por objetivo:
Mantener

el tejido en estado natural y evitar su desintegracin o su autolisis.

Endurecer el material Eliminar bacterias u otros

agentes.

Fijacin de la muestra.

FIJADORES

Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los agentes

fsicos que se utilizan para tal fin.

Cualidades que debe tener un fijador:

1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes

de que aparezcan los fenmenos agnicos o post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.).

2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.

3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.

 4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.). 5. No provocar o impedir la produccin de

estructuras artificiales. 6. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos

Manera de actuar de los fijadores

Vara con la composicin o naturaleza de los mismos:

coagulando las protenas sin combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor), formando combinaciones qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales), o reducindose en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino (cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes,

favoreciendo as la coloracin ulterior de los tejidos (recurdese que stos, en su mayora, son reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al combinar una molcula de hidrgeno).

TIPOS DE FIJACION
Fijacin por Fijacin por perfusin:

inmersin: el tejido se sumerge en las soluciones fijadoras.

el rgano que debe fijarse se infiltra con el medio de fijacin a travs de su propio sistema vascular.

Tipos de fijadores Fisicos y Quimicos

FIJADORES FSICOS:

1. Desecacin 2. Calor seco. 3. Calor hmedo. 4. Fro. 5. Congelacin y desecacin.

Fijadores Quimicos
Fijadores qumicos
Son los ms utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por

una sola sustancia qumica, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias sustancias intervienen en su constitucin.

FIJADORES SIMPLES: a) Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los

casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos. b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica. c) Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.). d) cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares. e) Bicromato de potasio al 3-5%.

FIJADORES COMPUESTOS:
En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmioactica. b) Lquido de Zenker, mezcla bicromatosublimado-actica. c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol. d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica

3. DESHIDRATACION
Las piezas al ser retiradas del

fijador, o despus de haberlas Deshidratacin en alcoholes sucesivos lavado, estn embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto, en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergindolos en lquidos anhidros, vidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratacin brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etlico de graduacin creciente.

4. ACLARAMIENTO
Impregnacin por un disolvente de la parafina Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol (este ltimo es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratacin no ha sido bien lograda y debemos repetir el bao de alcohol absoluto

PENETRACION EN PARAFINA
Penetracin de la

parafina Se sumergen las piezas en parafina (56-58 de punto de fusin), mantenida lquida en la estufa a no ms de 62C. Despus de 1 a 2 horas se renueva la parafina

5. Inclusion en parafina
Inclusin definitiva o A los 15-30 minutos la

formacin del bloque En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusin de la que ha servido para la penetracin. Se colocan las piezas orientndolas y luego se pone el molde en heladera

parafina se habr solidificado completamente

6. CORTE
El objeto de la inclusin es

hacer posible la reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrtomos son instrumentos de gran precisin que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los cortes ms corrientes son los de 4-6 micras

Tipos de Microtomo
- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija

mientras la cuchilla se desliza por unas guas especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos. - Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, sta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta. Tipo Criostato

7. Coloracion

Clasificacin de los colorantes: Segn su origen se clasifican en: COLORANTES NATURALES: - Animales (carmn) - Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn) ANILINA):

COLORANTES ARTIFICIALES O SINTTICOS (COLORES DE - cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o

eosinato de sodio). Son colorantes citoplasmticos.

- Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares. - Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. - Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un poder disolvente superior al del lquido que ha servido para preparar la solucin colorante (Sudn lll, rojo escarlata).

COLORACION
las coloraciones pueden ser:
- Ortocromticas: los tejidos adquieren un color igual

al de la solucin colorante empleada. - Metacromticas: una sustancia o un componente celular se tie con un color diferente al del colorante empleado.

C OLORACI ON Colorantes ms utilizados en histologa humana:

HEMATOXILINA: - Es un colorante vegetal. - Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes artificiales (xido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.)

- Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solucin colorante), comportndose en este caso como un colorante indirecto.
EOSINA: - Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixantnicos halogenados con tres grupos arilo). - Presenta autofluorescencia espontnea. - Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas. Para colorear se emplea generalmente una batera de coloracin

 PAS (cido Perydico de Schiff): Tie carbohidratos (mucopolisacridos) de color rojo, por ejemplo las clulas caliciformes en el intestino. Tricrmico de Masson: Tie de color azul la colgena, de rojo la queratina, y de morado los ncleos (muy utilizada para los cortes de piel). Nissl: Tie de color morado el retculo endoplsmico rugoso y los corpsculos de Nissl en las neuronas.

COLORANTES Y REACCIONES HISTOLOGICAS COMUNES

REACTIVO Hematoxilina RESULTADO Azul: ncleo; regiones acidas del citoplasma; matriz del cartlago

Eosina

Rosa: regiones bsicas del citoplasma; fibras de colgena.

Tricmica de Masson

Azul oscuro: ncleo Rojo: musculo, queratina, citoplasma Azul claro: mucingeno, colgena.

Acido peryico de Schiff

Magenta: molculas ricas en glucgeno y carbohidratos.

Colorante de Wright y Giemsa ( clulas

Rosa: eritrocitos, grnulos de eosinfilos Azul: citoplasma de monocitos y linfocitos.

Tinciones histolgicas
REACTIVO Hematoxilina y Eosina (H-E) Azan NUCLEOS Azul violeta CITOPLASMA Rojo o Azul violeta (ribosomas y RER) Rosa palido o azul tenue FIBRAS COLAGENAS Rojo FIBRA ELASTICAS Sin tincin o rosa

Rojo brillante

Azul

Sin tincin o rojo a azul rojizo (abundan, ligamentos. Negro violeta (r-f) o rojo pardo (o)

Para elastina (resorcina-fucsina u orcreina)

Van gieson

Azul negro

Amarillo o parduzco claro

Rojo

Sin tincin especial

Tricomica de Goldner

Pardo negro

Rojo ladrillo

Verde

Sin tincin.

EH (hematoxilina ferrica) de Heindenhain.

Heterocromatina y nucleolo azul negro

Centriolos, cinocilios,

Sin tincin especial o gris amarillento

Gris tenue

Tinciones histoqumicas
Reaccin de PAS Tincin rojo violeta. El acido peryodico grupos aldehdos en el glucgeno y el los componentes sacridos de las glicoprotenas. El reactivo de Schiff los tie de rojo violeta
Tincin azul. Polianiones: moco sulfatado, glucosaaminoglucanos, hialuranos. Naranja-rojo o pardo Lpidos Tincin purpura

Azul alciano

Lpidos (Sudan III, Negro, aceite rojo 0) Tincin d Feulgen para ADN

Azul de toluidina

Tincin azul. Tie la cromatina (ADN), el nuclolo y los ribosomas.

8. Montaje
Luego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a

la aclaracin y montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro. crecientes.

La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones

La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de

este paso es impregnar el corte con un disolvente del Blsamo de Canad, que al mismo tiempo le confiere un ndice de refraccin semejante al del vidrio. y se deposita sobre el mismo una gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto.

Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte

Reglas Bsicas para el diagnostico de un preparado Histolgico

Mrese el preparado a simple vista: Determinar si es

un rgano macizo o hueco, bordes son artificiales o naturales. Mrese con el microscopio con el aumento menor y determinar si hay una organizacin definida ( Corteza y Medula) Examnese todo el corte minuciosamente con los aumentos menor- mediano Procdase a un diagnostico hstico especifico cuidadoso Solo utilcese gran aumento para detalles celulares.

PASOS DE LA TECNICA
I. Fijacin En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo

menos durante 6 hs.

II. Corte Se le da el tamao deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa,

con el fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'.

III. Deshidratacin 1) Alcohol 70, 1h30'.

2) Alcohol 96, 1h30'. 3) Alcohol 100 (l), 1h30'. 4) Alcohol 100 (ll), 1h30'. 5) Toluol, entre 1h30' y 3hs.

IV. Inclusin 1) Secado de la muestra con gasa.

2) Parafina 56 (l), 1h30'. 3) Parafina 56 (ll), 1h30'. 4) Formacin de la barra. 5) 30' de frezzer. 6) Fractura del taco V. Corte