Insulina humana obtenida por ADN recombinante a través de

Escherichia coli para el tratamiento de diabetes mellitus tipo 1 y 2

Janine Espinoza (*), Miguel Mamani

Facultad de Ciencias de la Salud – Bioquímica y Farmacia
Universidad Privada Franz Tamayo – Sede La Paz

Resumen

En los últimos años hubo un aumento de la demanda de la insulina debido a la

creciente prevalencia de paciente diabéticos en el mundo, por tanto, se requiere en
mayor cantidad a un costo más accesible. Para esto el avance de la biotecnología y la
ingeniería genética hizo posible el desarrollo de la insulina recombinante. Utilizando la
tecnología del ADN recombinante se puede obtener la insulina a partir de bacterias
como la E. coli gracias a su estructura simple y genéticamente modificable por medio de
sus plásmidos. En esta revisión se abordará los procedimientos para obtener la
proinsulina por medio de la tecnología del ADN recombinante, se detallará el diseño del
vector de expresión y como seleccionar la cepa de E. coli para su cultivo en un
biorreactor; seguido de la recuperación de los cuerpos de inclusión para proceder a su
purificación por diferentes métodos cromatográficos, por último, la formulación de la
insulina humana.

Palabras clave: Insulina recombinante, ADN recombinante, Escherichia coli, enzimas

de restricción.

Abstract

In recent years there has been an increase in the demand for insulin due to the
increasing prevalence of diabetic patients in the world, therefore, a greater quantity is
required at a more accessible cost. For this, the advancement of biotechnology and
genetic engineering made possible the development of recombinant insulin. Using
recombinant DNA technology, insulin can be obtained from bacteria such as E. coli
thanks to its simple structure and genetically modifiable by means of its plasmids. In this
review, the procedures for obtaining proinsulin through recombinant DNA technology will
be addressed, the design of the expression vector will be detailed, and the E. coli strain
will be selected for culture in a bioreactor; followed by the recovery of the inclusion
bodies to proceed to their purification by different chromatographic methods, finally, the
formulation of human insulin.

Keywords: Recombinant insulin, recombinant DNA, Escherichia coli, restriction

enzymes.

Introducción

El rápido aumento en el número de pacientes diabéticos a nivel mundial y la exploración

de métodos alternativos de administración de insulina, como la inhalación o la vía oral,
que dependen de dosis más altas, seguramente aumentarán la demanda de insulina
recombinante en un futuro próximo (1). La administración de insulina sigue siendo el
método de farmacoterapia más eficaz en casos de hiperglucemia extremadamente alta.
El tejido pancreático porcino y bovino fue la fuente de la hormona durante muchos
años, seguido de la insulina humana semisintética obtenida por modificación de la
insulina animal. Con el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante, la insulina
humana recombinante (biosintética) estuvo disponible en grandes cantidades por
biosíntesis en microorganismos (Escherichia coli, levaduras) que proporcionan
suministros fiables de la hormona en todo el mundo a precios asequibles. La insulina
humana recombinante fue uno de los primeros productos de la biotecnología (2). Se
demostró que la pureza y la calidad farmacéutica de la insulina humana recombinante
son superiores a la insulina animal y semisintética, los pacientes con diabetes pueden
ser transferidos de forma segura y eficaz de insulina animal o humana semisintética a
insulina humana recombinante sin que se espere ningún cambio en la dosis de insulina
(3). La creciente prevalencia de la diabetes en todo el mundo está destinada a
aumentar la demanda de terapias de insulina recombinante y, en la actualidad, la
mayoría de las terapias de insulina recombinante se producen a partir de cuerpos de
inclusión de E. coli (4). Aquí, se presenta una revisión completa del proceso de
producción de insulina recombinante a partir de cuerpos de inclusión de E. coli la
expresión de proinsulina en Escherichia coli tomó la forma de un promotor de triptófano
con un enlace de metionina a proinsulina. El uso de E. coli como sistema de expresión
para la producción de insulina recombinante a gran escala posee las ventajas de una
alta tasa de crecimiento, requerimiento de medios simples, facilidad de manejo, alto
rendimiento y rentabilidad (1). Los cuerpos de inclusión se extraen de las células, se
lavan y luego se solubilizan las moléculas precursoras(4).Los procesos técnicos del
procedimiento de purificación son diferentes procedimientos cromatográficos,
conectados sucesivamente uno tras otro (por ejemplo, cromatografía de adsorción,
cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de fase inversa o,
respectivamente, cromatografía de fase inversa de alta presión o combinaciones de
ellas) alcanzándose la purificación propiamente dicha por cromatografía (5).

Método

Criterios de selección

Para esta revisión se incluyeron artículos de revisión, artículos de investigación,

patentes y libros que contiene información sobre la insulina recombinante y su proceso
de purificación.

Fuente de datos y estrategias de búsqueda

Se realizó una búsqueda en PubMed, Embase, Royal Society of Chemistry, PMC, Web
of Sience, Science Direct, Elsevier y Springer Link. La estrategia de búsqueda detallada
se muestra en la figura 1. Se excluyeron los artículos que no responden a los objetivos
de interés. Los artículos que se quedaron fueron revisados para determinar si cumplen
con los criterios de inclusión.

Resultados evaluados

Esta revisión está centrada en recabar información sobre el proceso de obtención de

insulina recombinante desde su obtención por tecnología de AND recombinante,
purificación de la proinsulina hasta su formulación a insulina humana.
 Figura 1. Estrategia de búsqueda de datos Identificación, tamizaje, elegibilidad y criterios
de inclusión. Fuente: Elaboración propia.

Desarrollo

La insulina humana es una proteína compuesta por 51 aminoácidos con un peso

molecular de 5808 Da, que es producida por las células β del páncreas, y juega un rol
esencial en la regulación del metabolismo de glúcidos y grasas (6). La insulina se
sintetiza en la célula beta pancreática a través de una serie de proteínas precursoras
que incluyen preproinsulina y proinsulina. La preproinsulina transporta información
adicional para dirigir la cadena proteica naciente al retículo endoplásmico (RE) donde,
después de la escisión del péptido señal, se pliega de manera eficiente para asumir la
estructura de proinsulina nativa estabilizada por tres enlaces disulfuro (7). La
proinsulina sigue la red del trans-Golgi, donde es procesada por una serie de
endopeptidasas conocidas como prohormona-convertasas (PC1 y PC2), y
exoproteasas carboxipeptidasas E. Las endopeptidasas cortan en dos puntos concretos
dando lugar a la liberación del péptido C. Queda así la insulina madura, que está
formada por una cadena A de 21 aminoácidos y una cadena B de 30 aminoácidos
unidas por dos puentes disulfuro, y teniendo la cadena A un tercer puente disulfuro, si
 Figura 2. Estructura esquemática de la insulina (secuencia primaria). La cadena A se
muestra en azul, la B en verde y los puentes disulfuro en amarillo. En el recuadro se
muestra la estructura 3D. Fuente: Tomado de Patel of Dutta 2018.

bien en este caso es intracatenario (6). En la Figura 2 vemos la estructura de la

insulina.

Escherichia coli es un miembro de la familia bacteriana de las Enterobacteriaceae, es el

habitante comensal más prevalente del tracto gastrointestinal de humanos y animales
de sangre caliente, así como uno de los patógenos más importantes (8). Es un bacilo
gramnegativo, no exigente, oxidasa negativa, catalasa positiva, anaerobio facultativo,
cuya temperatura de crecimiento preferente es a 37 °C (mesófilo), fimbriado y
comúnmente es móvil por flagelos perítricos (9). E. coli participa en la producción de las
vitaminas B y K (10). Escherichia coli es usada en experimentos de genética,
biotecnología y biología molecular debido a que la estructura de su genoma es
altamente flexible, permitiendo la movilidad de material genético por medio de
transposones, secuencias de inserción, bacteriófagos y plásmidos (9). E. coli ha sido el
huésped pionero en la producción de proteínas recombinantes, ya que los
procedimientos originales de ADN recombinante se desarrollaron utilizando su material
genético y bacteriófagos infecciosos (11).
 Vector de expresión

La información genética de la proteína a producir usualmente se inserta en un vector

(plásmido) de expresión (12). El número de copias del plásmido en E. coli puede variar
desde 1 hasta 2 000 por célula, en dependencia de su origen de replicación en la
bacteria. La cepa hospedera, la cual es transformada con el vector de expresión, debe
ser deficiente en la mayoría de las proteasas naturales, mantener la estabilidad
plasmídica y contener los elementos genéticos necesarios, de acuerdo con el sistema
de expresión utilizado (13). Los vectores de expresión se desarrollaron basándose en
una pequeña cantidad de sistemas promotores de genes bien estudiados, que siguen
siendo populares hasta el día de hoy. El fago lambda PL El promotor es uno de los
promotores más fuertes conocidos por E. coli ARN polimerasa (RNAP) (14).También se
ha observado que una alta concentración de ARN mensajero puede conducir a
destrucción de ribosomas y muerte celular (15). El promotor a emplear debe ser
cuidadosamente seleccionado con el fin de poder regular la intensidad de inducción.
Una expresión muy alta del gen heterólogo puede conducir a la formación de cuerpos
de inclusión (agregados intracelulares de proteína), que pueden ser una ventaja para la
purificación de proteínas recombinantes, pero que también requieren pasos adicionales
en la purificación, además de requerir recuperar el plegamiento adecuado de las
proteínas recombinantes antes de la formulación del producto final(12). Normalmente el
plásmido de expresión contiene un gen que proporciona resistencia a antibióticos. Esto
permite emplear una presión de selección para asegurar que se cultivan únicamente las
células que contienen plásmidos, ya que, debido a efectos de segregación, el plásmido
podría perderse y las células libres de plásmido crecerían más rápido (al carecer de la
carga metabólica impuesta por el plásmido), desplazando a las células portadoras del
mismo, con la consecuente pérdida de productividad. Sin embargo, la expresión del gen
de resistencia al antibiótico es probablemente el origen principal de carga metabólica
(16).

Selección de la cepa de producción

En general se buscan cepas con baja tasa de mutación o de inserción de secuencias

provenientes del plásmido. Las cepas derivadas de E. coli K–12 y E. coli B son las más
empleadas. Los avances en el conocimiento de la fisiología de E. coli y en el desarrollo
de herramientas moleculares han permitido la obtención de cepas diseñadas para la
producción de proteína recombinante (12). La cepa IBA 1 de E. coli 20 (F-lambda-ara Δ
(pro lac) rpsL thi recA cytR) es un derivado de la cepa E. coli CSH50R. Es una cepa de
laboratorio derivada de E. coli K-12. Es una cepa que se utiliza para la transformación.
Crece en forma de suspensión uniforme en medio líquido LB (caldo de lisogenia). La
temperatura de crecimiento óptima es 37 ° C. La cepa también crece en medio mínimo
en presencia de tiamina (2 μg / ml) y L-prolina (en el rango de concentración 50-200 μg
/ ml). La cepa forma colonias redondas, planas y de bordes lisos sobre el sustrato rico
en TSA. La E. coli cepa IBA 1 tiene una deleción en el operón prolina-lactosa. La
mutación en el gen rpsL que codifica la proteína ribosómica S12 está asociada con la
resistencia a la estreptomicina (crecimiento en el medio con estreptomicina a una
concentración final de 50 mg / ml). La cepa también tiene una mutación en el gen cytR
que codifica un regulador transcripcional que se une al ADN. De la secuencia del gen,
de 1026 pb de longitud, se escindieron 145 pb. Un método eficaz para producir insulina
humana recombinante utilizando la cepa bacteriana E. coli 20 que carece del represor
cytR se describe en la patente polaca nº PL 180.818 (2)

Enzimas de restricción

Las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas) son proteínas

bacterianas que actúan como un sistema de defensa bacteriana contra el ADN extraño
y dañino (17). Reconocen secuencias específicas de ADN, llamadas sitios de
restricción, y se unen a ellas. Cada enzima de restricción reconoce solo uno o unos
pocos sitios de restricción. Cuando encuentra su secuencia blanco, la enzima de
restricción cortará las dos cadenas de una molécula de ADN. Por lo general, el corte es
en o cerca del sitio de restricción y ocurre en un patrón ordenado y predecible (18).
Para evitar que las enzimas de restricción corten su propio ADN, las bacterias utilizan
una enzima metilasa para añadir un grupo metilo a su propio ADN a fin de protegerlo.
Las enzimas de restricción funcionan mejor en condiciones específicas. A temperaturas
muy altas, las enzimas se desnaturalizan y pierden su forma y funcionalidad. La
temperatura óptima para esta enzima de restricción es de alrededor de 37 °C. Figura 2A
También hay un rango de pH óptimo para la función de cada enzima. Cuando el pH se
aleja del óptimo, las enzimas de restricción sufren cambios de forma que limitan su
capacidad de cortar los sitios de restricción como de costumbre, el pH óptimo para esta
enzima es alrededor de 7 Figura 2A. La función principal de las enzimas de restricción
es cortar el ADN. Los sitios de restricción son secuencias cortas de 6 a 8 pares de
bases que a menudo son palindrómicas (17). Por ejemplo, EcoRI busca el sitio de
restricción GAATTC. Debido a que este es un palíndromo, la hebra superior lee
GAATTC de 5' a 3' y la hebra inferior lee GAATTC de 5' a 3' Figura 2B.

Figura 3. A. Condiciones específicas de temperatura y pH; donde la T° optima es de 37°C y

el pH optimo es de 7. B. Enzima de restricción EcoR1. Fuente: Elaboración propia creada
en BioRender
Clonación de ADN y ADN recombinante
La clonación de ADN es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento
particular de ADN. En un procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro
fragmento de ADN de interés, se inserta primero en un fragmento circular de ADN
llamado plásmido. La inserción se realiza con enzimas que "cortan y pegan" ADN y se
obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN ensamblado de fragmentos
provenientes de múltiples fuentes (19). Los pasos de la recombinación genética del
ADN se detallan en la
Figura 4.

Paso 1: Identificación y
aislamiento del gen de
interés o fragmento de
ADN clonado.
Purificación del ADN: Para
aislar los genes deseados
o una secuencia
determinada de la
molécula de ADN, se debe
obtener el ADN del
organismo y purificar el
ADN de algunas de las
otras macromoléculas
como lípidos y proteínas,
etc. Se lisa la membrana
celular para obtener el
ADN. La lisozima se usa
normalmente para
descomponer la pared
celular de una bacteria,
Figura 4. Pasos de la tecnología de ADN recombinante. mientras que las
Fuente: Elaboración propia creada en BioRender.
proteasas ayudan a
eliminar las proteínas asociadas con el ADN. La Figura 5 es una representación general
del aislamiento y purificación de ADN:

Figura 5. Representación general del aislamiento y purificación de ADN Fuente:

MicroscopeMaster.com creado en BioRender

Una vez que se destruyen las macromoléculas utilizando varias enzimas, se utiliza una
centrífuga para sedimentar los restos celulares de modo que se depositen en el fondo
del tubo mientras se puede extraer el sobrenadante. Por último, el ADN se recupera
mediante precipitación mediante el uso de etanol.
Aislamiento del gen de interés: Una vez que se purifica el ADN; se utilizan enzimas de
restricción para aislar el gen de interés. Luego, las enzimas actúan como tijeras
moleculares dado que son capaces de cortar eficazmente el ADN en ubicaciones
específicas para aislar el gen deseado. La digestión con enzimas de restricción puede
producir fragmentos con extremos escalonados (extremos adhesivos) donde una cola
de una sola hebra se extiende en ambos extremos del fragmento. Estos extremos
también se conocen como extremos cohesivos y consisten en pares de bases que
finalmente se emparejan con pares de bases complementarias del vector. Además de
aislar genes de interés en el laboratorio, también se pueden obtener de: Biblioteca
genómica y Biblioteca de ADNc (20).
Paso 2: Inserción de este gen aislado en un vector adecuado.
El segundo paso implica insertar los genes aislados en el primer paso en un vector
adecuado. Este ADN circular de doble hebra es particularmente importante para las
bacterias, ya que porta genes resistentes a los antibióticos. La Figura 6 es una
representación esquemática de un plásmido utilizado en tecnología de ADN
recombinante. Para insertar la secuencia de ADN / gen de interés en el vector, se utiliza
enzimas de restricción en este caso la EcoRI.

Figura 6. Representación esquemática de un plásmido utilizado en tecnología de ADN

recombinante Fuente: Elaboración propia creado en BioRender

Entonces se inactiva el gen que codifica la proteína responsable de la resistencia a la

estreptomicina. Si bien la enzima de restricción está involucrada en cortar el gen de
interés y el vector en secuencias dadas, los dos están unidos por ADN ligasa, una
enzima que une al ADN. Se ha demostrado que una mayor concentración de vector
aumenta la probabilidad de vectores autoligables, por lo que es importante controlar la
concentración relativa de cada una de las dos moléculas (vectores e inserciones).(19)
Algunas de las otras técnicas utilizadas para controlar la autoligación de vectores
incluyen: desfosforilación del vector, doble digestión, conversión de extremos adhesivos
en extremos romos, reacción de ligadura.
La Figura 7 es una representación esquemática del proceso de ligadura y digestión por
restricción:
Paso 3: Introducción de este
vector en un organismo / célula
adecuado llamado huésped
(transformación).
La transformación es el tercer paso
de la tecnología del ADN
recombinante e implica la
introducción del ADN recombinante
(plásmido modificado) en la célula
huésped (bacteria). El objetivo
principal de este paso es recuperar
grandes cantidades de la molécula
de ADN. Uno de los métodos que se
utilizó para introducir el plásmido
modificado en la célula consiste en
enfriar las células y calentarlas
rápidamente. Esto crea pequeños
Figura 7. Formación de un plásmido poros en la membrana celular a
recombinante a partir de un ADN donador y un
través de los cuales los plásmidos
vector receptor. El vector es un plásmido que
porta un sitio de restricción EcoRI que sufre podían ingresar a la célula. Sin
desdoblamiento por enzimas y prepara la
embargo, con el tiempo, estos
ligadura mediante eliminación de grupos fosfato.
El donador se trata con enzimas de restricción y agujeros / poros empezarían a
un enlace covalente cierra la molecula por
ligadura. Un marcador de restencia farmacológica
cerrarse. Hoy en día, se están
mostrado como strR en el plasmido. Fuente: utilizando varios métodos nuevos
Microbiologia Clinica Jawetz (19)
para introducir vectores en las células
como la electroporación y microinyección. (20)
Paso 4: Selección de la célula huésped transformada.
Este paso de la tecnología del ADN recombinante tiene como objetivo seleccionar las
células huésped que contienen el vector recombinante modificado (plásmido
modificado). Algunas de las células absorben plásmidos que se sometieron a
autoligado, mientras que otras tomaron plásmidos con genes no deseados (algunas no
incorporan ninguno de los plásmidos). Para lograr los resultados deseados, es
importante seleccionar sólo células que contengan plásmidos con el gen de interés.
Aquí, se pueden utilizar varios métodos para seleccionar células transformadas. Uno de
los métodos más utilizados consiste en hacer crecer las células en placas de agar con
antibiótico (por ejemplo, estreptomicina). En este método, se pueden usar medios como
MacConkey-Sorbitol Agar para cultivar E. coli durante la noche (a 37 grados C en pH
neutro). También se agrega el antibiótico apropiado a las placas.
Paso 5: Multiplicación o expresión del gen introducido en el hospedador.
En este paso, los biorreactores se utilizan para la producción a gran escala. Se
procederá con el cultivo en un birreactor.

Cultivo celular y fermentación en el biorreactor

En un biorreactor de escala de laboratorio, se pueden alcanzar rutinariamente

densidades mayores a los 100 g/L de biomasa empleando las condiciones de cultivo
adecuadas. Se ha acumulado una considerable experiencia en el cultivo de E. coli, lo
que ha permitido mejorar notoriamente las productividades de los cultivos (12). En la
Tabla 1 se muestra proteínas recombinantes producidas en cultivos de E. coli.
Tabla 1. Algunas de las mayores concentraciones de proteína recombinante alcanzadas en
cultivos de alta densidad celular de E. coli. Fuente: Adaptado a partir de Lara, A,2011 (12)
de Choi et, al 2006 (21)
Proteína Cepa Condición de cultivo y Concentración Referencia
fuente de carbono alcanzada
Proteína Verde W3110 Alimentación exponencial, 25 g/L (22)
fluorescente PTS- glucosa, extracto de
GalP+ levadura.
Factor de BL21 pH-stat, medio R, glucosa, 9.7 g/L (23)
crecimiento (DE3) extracto de levadura
ILGF-2
Proteína TG1 Alimentación exponencial, 8.6 g/L (24)
morfogenética de medio definido, glucosa,
hueso cuerpos de inclusión
Proteína Verde W3110 Lote, glucosa (100 g/L), 8.3 g/L (22)
fluorescente PTS- extracto de levadura
GalP+
Aminolevulinato MG1655 Lote, medio LB con 5.2 g/L (25)
sintetasa suplemento optimizado
El medio de cultivo debe estar balanceado para la producción de biomasa y proteínas
recombinantes. Los principales componentes incluyen la fuente de carbono, nitrógeno,
fósforo, azufre, potasio, y magnesio. Es necesario también incluir cofactores
enzimáticos como Mb, Co, Ni, Fe, Ca, Cu, Mn, entre otros. Los factores de crecimiento
como la tiamina son necesarios para un adecuado crecimiento. Aunque en cultivos en
matraz agitado se agregan mono y difosfato de potasio para formar un amortiguador de
pH, esto no es necesario en cultivos en biorreactor, en los que el pH es controlado
mediante la adición de ácido o base (12).

Las células bacterianas para cultivo son de una reserva de glicerol almacenada a -80 °
C. Se cultivan células de E. coli 20, que albergaban el plásmido pIBAINS con el gen de
la insulina humana, durante 18 a 30 ° C en matraces con agitación que contenían 50 ml
de medio GMS (26) suplementado con estreptomicina (100 μg / ml), prolina (600 μg /
ml) . mL) y tiamina (2 μg / mL) hasta que la densidad óptica a 600 nm es de
aproximadamente 0,5 a 1,0. Los matraces se utilizan como inóculo para un fermentador
Bioflo Celligen 310 7.5 L (volumen medio GMS inicial 4 L). En el fermentador no se
utilizaron antibióticos. Las células se cultivan durante 15-16 ha 37 ° C. Durante la etapa
de crecimiento del cultivo, se agrega exponencialmente glucosa al 40% y prolina 12 mg
/ ml como fuente de carbono. El nivel de glucosa se mantiene por el pH-stat en el rango
de concentración de 30-50 mg / dL. Después de la inducción, el cultivo se crece durante
4-5 h hasta que la DO 600 nm es de aproximadamente 50-60, alcanzando la fase
estacionaria de crecimiento (2). Los cultivos de E. coli para la producción de proteínas
recombinantes son llevados a cabo bajo condiciones aerobias. Para evitar que la
bacteria esté limitada por oxígeno, se requiere suministrar oxígeno al biorreactor a una
velocidad que sea al menos igual que la velocidad de consumo (12).
Recuperación de cuerpos de inclusión

Los cuerpos de inclusión deben recuperarse de las células bacterianas mediante un

método mecánico o basado en lisozimas (27) (28). Los métodos mecánicos para
romper la envoltura celular implican el uso de ultrasonidos, triturar la suspensión celular
en un molino coloidal como un Dyno-Mill, o pasar la pasta celular a través de una
prensa Manton-Gaulin o una prensa francesa (4). En general, los métodos mecánicos
pueden alterar las células de manera efectiva, pero pueden comprometer la calidad de
las proteínas en los cuerpos de inclusión más que los métodos basados en lisozimas
(29). Ni la centrifugación ni la filtración por membrana tienen ningún efecto en la
extracción y el lavado de los cuerpos de inclusión (30).

Aislamiento de cuerpos de inclusión

Las células se recolectan mediante centrifugación a 15.000 xg durante 15 min a 4ºC.

Las células sedimentadas se suspenden en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 8,0,
NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, lisozima al 0,043%). La suspensión bacteriana se mezcla
durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, se agrega 20 ml de Triton X-100 y la
suspensión se agita durante 10 min. Las células se lisan mediante un homogeneizador
de alta presión y se somete a centrifugación a 18.400 xg durante 15 min a 4ºC. Los
sedimentos resultantes se lavan con Tris-HCl 50 mM pH 8,0, NaCl 500 mM y Triton X-
100 al 1% y se centrifuga de nuevo a 18.400 xg durante 15 min a 4ºC. A continuación,
los sedimentos se lavan dos veces con Tris-HCl 50 mM pH 8,0, tampón NaCl 500 mM.
Finalmente, la suspensión de los cuerpos de inclusión se centrifuga 15.000 xg durante
15 min a 4 ° C. Los cuerpos de inclusión obtenidos se congelan a -30 ° C para su
posterior preparación (2).

Lavado de cuerpos de inclusión

Los cuerpos de inclusión recuperados de lisados de células bacterianas pueden estar

muy contaminados con células enteras intactas, proteínas del huésped, ARN, pared
celular de peptidoglicano y fragmentos de membrana (28). Después de la lisis de las
células de E. coli, los cuerpos de inclusión deben lavarse secuencialmente para eliminar
los contaminantes que a menudo tienen fuertes interacciones iónicas e hidrófobas con
las proteínas del cuerpo de inclusión (27).
Después del lavado, el sobrenadante se descarta para dejar el sedimento del cuerpo de
inclusión (4). En la Tabla 2 se resume una lista de aditivos utilizados para lavar los
cuerpos de inclusión que contienen proteínas de fusión de proinsulina.
 Tabla 2. Una lista de aditivos, sus funciones específicas y ejemplos pertinentes de lavados de
cuerpos de inclusión que contienen proteínas de fusión de proinsulina Fuente: Downstream
procesing of recombinant human insulin and its analogues producction for E. coli inclusión
bodies (4)

Aditivo Función Concentración

EDTA Un quelante de metales para inactivar las metaloproteasas. 0,5 mM

Altera el sitio de inserción del lipopolisacárido en la 1 mM
membrana externa bacteriana. 2 mM

Glicerol Incrementa la presión osmótica. 5%

Lisozima Cataliza la hidrólisis de las uniones beta 1,4 entre los 0,02%
residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-
glucosamina en un peptidoglicano.

NaCl Solubiliza la impureza a través de la interacción iónica. 0,05 M

0,1 M
0,2 M
0,5 M

Triton Elimina fragmentos y fosfolípidos de la membrana. 0,66%

X100 Facilita la disociación de desechos y proteínas solubles de 1%
los cuerpos de inclusión 2%

Tween 20 Extrae los componentes de la membrana externa bacteriana 0,05%

Urea Un agente caotrópico para extraer los componentes de la 0,5 M

membrana externa bacteriana 2M
3M
4M

Solubilización de cuerpos de inclusión

Los cuerpos de inclusión se solubilizan convencionalmente utilizando una alta

concentración de desnaturalizantes, como el clorhidrato de guanidina (GdnHCl) y la
urea, lo que da como resultado una alteración completa de la estructura de la proteína
(28). Para las proteínas que contienen numerosos residuos de cisteína, se puede
agregar ditiotreitol (DTT) o β-mercaptoetanol (BME) para reducir la formación incorrecta
de enlaces disulfuro. Triton X-100 y dodecil sulfato de sodio se pueden usar para
extraer proteínas de cuerpos de inclusión, aunque su uso es bastante poco común en la
solubilización de proteínas de fusión de proinsulina (27). Los cuerpos de inclusión que
contienen insulina se disuelven en tampón de 12 mM carbonato (NaHCO 3 ) con EDTA
0,2 mM. El pH de la solución se ajusta aproximadamente 11,9 con NaOH 5 M y se agita
durante 45 min a temperatura ambiente. Luego, el pH se ajusta 10,8 con HCl 2 M.
Finalmente, la suspensión se centrifuga a 24.000 xg durante 15 min a 4 ° C para
eliminar los residuos insolubles (2).

Escisión por bromuro de cianógeno

En la traducción de proteínas de E. coli, la proteína recombinante debe traducirse como

una proteína de fusión en la que la extensión N-terminal proporciona el iniciador N -
formilmetionina (fMet) (31). Dado que el sistema inmunológico humano reconoce el fMet
como un cuerpo extraño, es importante eliminarlo para evitar reacciones inmunogénicas
no deseadas. Para eliminar la secuencia señal, el enlazador de metionina de la
proinsulina se puede escindir con bromuro de cianógeno (CNBr) antes de la
purificación(4). Este proceso implica la suspensión de una muestra de proteína en ácido
fórmico al 70% y la incubación con CNBr a temperatura ambiente en la oscuridad
durante 12 a 16 h (32).

Intercambio buffer

Para el intercambio buffer se utilizará el método de diafiltración. La diafiltración es una

variación de la ultrafiltración, en la que se agrega disolvente nuevo a la solución de
alimentación para reponer el volumen ultrafiltrado, y en el proceso se lavan las
moléculas pequeñas, como las sales, de las macromoléculas retenidas (33). Una de
sus ventajas está en una mayor concentración de proteínas. Por ejemplo, la diafiltración
se aplica después de la solubilización del cuerpo de inclusión y la reacción de sulfitolisis
para eliminar la alta concentración de urea y reactivos de sulfitolisis (34). Además de
eso, las muestras renaturalizadas se pueden concentrar e intercambiar tampón por
diafiltración en un tampón adecuado para que se produzca la conversión enzimática
(27) (34).Se ha informado de un rendimiento de recuperación de hasta 95% -98% con
diafiltración (34).

Purificación

Renaturalización: Después de disolverse, se deja que la muestra se plegara durante el

período subsiguiente de 18 h con agitación vigorosa y aireación. Al final de la
renaturalización, el pH se ajustó a 9,0 con HCl 2 M. La renaturalización se estudia a
temperatura ambiente y a 8 ° C.

Reacción de citraconilación: El precursor de insulina se trata con anhídrido

citracónico para controlar la digestión enzimática requerida para formar insulina y
prevenir la degradación de la insulina. Se añade 1 ml de anhídrido citracónico y NaOH 5
M a la solución de proteína en porciones de modo que el pH de la solución
permaneciera en el rango de 8,7 a 9,3. Después de la adición de la cantidad total de
anhídrido citracónico, la solución se agita durante 2,5 h. Luego se añade 3 ml de una
solución de etanolamina 2 M. La cantidad se calcula según la fórmula: anhídrido
citracónico 3 x V y se mezcló durante 45 min.

Tripsinización: Después de la citraconilación, el pH de la solución se ajustó a 8,8 con

HCl 2 M y se diluye de modo que la conductividad fuera inferior a 5 mS. Luego se
agrega 70 μl de una solución de tripsina al 1% y la solución se mezcla durante
aproximadamente 16-18 ha temperatura ambiente. La cantidad de tripsina se calcula de
acuerdo con la fórmula: solución A280 nm x V (dm 3 ) / 75. La reacción se inhibe con 1
mg / ml de aprotinina.

Cromatografía de baja presión en DEAE Sepharose: Se aplicó una muestra de

proteína a una columna empaquetada con DEAE Sepharose y se equilibró con Tris 0,5
M pH 8,6, seguido de Tris 20 mM pH 8,6, se aplica una muestra de proteína. Después
de la aplicación, la columna se enjuaga con tampones: DW I - Tris 20 mM pH 8,6
(conductividad 6 mS) y DW II - Tris 20 mM pH 8,6 + isopropanol al 20% (conductividad
3 mS). La insulina se eluye con tampón DE - Tris 20 mM pH 8,6 + isopropanol al 30%
(conductividad 6 mS).

Decitraconilación: La fracción principal se eluye de la columna se diluyó 2 veces con

H 2 O y el pH se disminuyó a 2,9 con HCl 2 M. La muestra se agita durante 1 hora y se
dejó a 4ºC durante la noche.

Precipitación de insulina: Se añade una solución de cloruro de zinc 1 M a la muestra

y se ajusta el pH a 5,9. La solución se agita durante 1 h. La cantidad de cloruro de zinc
añadido se calcula de acuerdo con la fórmula: 2 x V cm 3 solución / 100. Luego, la
muestra se centrifuga a 18.400 xg durante 15 min a 4 ° C. El precipitado se puede
almacenar a 4 ° C hasta por 30 días.

Cromatografía Sephadex G-25: El precipitado de insulina se suspendió en agua y el

pH se ajusta a 3,0. Para intercambiar el tampón de muestra, la muestra de proteína se
aplica en una columna empaquetada con Sephadex G-25 equilibrada con acetato de
amonio 5 mM pH 4,0. La insulina se eluye con el mismo tampón.

Medición de la concentración de proteínas: La concentración de proteína se midió a

una longitud de onda de 280 nm. El espectrofotómetro se calibró con agua.

Formulación

Después de la purificación cromatográfica final, el producto debe acondicionarse para

su posterior formulación en un medicamento que sea estable durante el
almacenamiento. Los principales factores de riesgo que intervienen en la manipulación
del producto tras la purificación cromatográfica final son: la desamidación de la
molécula de insulina, la formación de agregados fibrillas (35)

La agregación puede ocurrir después de estresar la molécula por agitación, bajo pH,
alta temperatura, alta concentración de proteínas, alta fuerza iónica y en presencia de
desnaturalizantes o alta concentración de solvente orgánico (4) de (Nielsen et al.2001;
Tiiman y col.2013). La desamidación puede ocurrir cuando hay una exposición
prolongada a condiciones ácidas para formar insulina desamido A21 (36). Por tanto,
para evitar la fibrilación y desamidación de la insulina, las sales residuales y los
tampones de la purificación cromatográfica deben eliminarse mediante cristalización y
liofilización. Los cristales de insulina se pueden aislar mediante centrifugación,
decantación o filtración y, finalmente, se lavan para eliminar el contenido de zinc
residual. Después de la cristalización del zinc, el siguiente paso que sigue es el secado
por congelación (37). El producto recombinante se solubilizará cuando esté listo para
su envasado (4). Pueden añadirse aditivos específicos a la formulación para prevenir el
crecimiento bacteriano y la agregación de proteínas, o para modificar la cinética de
absorción in vivo de la insulina. El flujo general del proceso de recombinación de la
insulina humana y su procesamiento posterior se resume en la Figura 8.
Figura 8. Flujo de procesamiento posterios de la insulina recombianate. Fuente: Adaptado de Downstream procesing of
recombinant human insulin and its analogues producction for E. coli inclusión bodies (4) creado en BioRender
 Punto Crítico de Control (PCC)

Tabla 3. Punto Critico de control encontrado en el diagrama de flujo de la obtención de insulina humana de E coli. Fuente: Elaboración propia.

PCC Peligros Límites críticos Monitoreo Acciones Verificación Registros

Significativos para cada ¿Qué? ¿Como? ¿Cuando? ¿Quién? correctivas
medida
preventiva

Purificación Químicos. Desestabilización Polípeptido Detectar Cada Encargado Rechazar los Verificación Registro de
de la del producto insulina insulina producción en de productos con de la baja producción.
proinsulina insulina. des- el paso de producción desestabilización cantidad de
e insulina. treonina. purificación. Encargado de la insulina. insulina des-
de control treonina.
de calidad.
Figura 9. Diagrama de flujo del proceso de la tecnología de ADN recombinante para la
obtención de cuerpos de inclusión, su procesamiento posterior de la proinsulina y su
purificación. Fuente: Elaboración propia.
Conclusión

Existe una gran demanda de insulina a nivel mundial por el aumento de los casos de
Diabetes Mellitus tanto del tipo 1 como del tipo 2. Para una producción mayor de
insulina es necesaria la aplicación de la biotecnología farmacéutica, donde, gracias a
los grandes avances se pudo desarrollar la obtención de insulina humana por ADN
recombinante a través de Escherichia coli, por lo cual es importante el desempeño de
las industrias para seguir avanzando en el desarrollo de insulina recombinante
terapéutica. Se presentó una revisión completa en cuanto a la insulina recombinante a
través de Escherichia coli, procesamiento posterior de la proinsulina paso a paso,
desde la identificación y aislamiento del gen hasta la formulación del mismo. Cabe
recalcar que la purificación es un procedimiento con alta dificultad, involucra procesos
de cromatografía, renaturalización y precipitación, donde pueden existir fallas en los
procesos, contaminación por parte de los reactivos o de otros microorganismos,
cambios bruscos de pH porque son muy sensibles. Esto generaría repetir varios
procedimientos ya que al momento de la formulación puede implicar un riesgo para el
paciente. Es oportuno tomar todas las medidas de control de calidad. A su vez muestra
las etapas criticas de control durante el desarrollo, logrando que esta revisión ayude
como guía para optimizar el desarrollo de insulina humana por ADN recombinante a
través de Escherichia coli para su futura elaboración o mejora del proceso de obtención
de insulina recombinante.

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