Cultivo de Hongos

Conceptos y técnicas
en ecología fluvial
Edición a cargo de:
ARTURO ELOSEGI
Profesor titular de Ecología en la Universidad del País Vasco
SERGI SABATER
Catedrático de Ecología en la Universidad de Girona
_______________________________________________
Separata del capítulo 11
La biota de los ríos:

los microorganismos
heterotróficos
ANNA M. ROMANÍ
JOAN ARTIGAS
ANTONIO CAMACHO
MANUEL A.S. GRAÇA
CLÁUDIA PASCOAL
Primera edición: abril 2009

ISBN: 978-84-96515-87-1
© los autores, 2009

© de la edición en español, Fundación BBVA, 2009
CAPÍTULO 11
La biota de los ríos:

los microorganismos heterotróficos
ANNA M. ROMANÍ, JOAN ARTIGAS, ANTONIO CAMACHO,

MANUEL A.S. GRAÇA Y CLÁUDIA PASCOAL
11.1. Introducción
En los ecosistemas fluviales se pueden encontrar microorganismos heterótrofos Entre los

tanto en el bentos como en el plancton. En el bentos, las bacterias, hongos y pro- microorganismos
tozoos, juntamente con algas y cianobacterias, y dentro de una matriz mucilagi- heterotróficos de
sistemas fluviales se
nosa de polisacáridos y proteínas, forman el biofilm, que se desarrolla sobre los
cuentan bacterias,
distintos sustratos del lecho (piedras, rocas, granos de arena, limo, hojarasca, ma- hongos y protozoos
crófitos, madera). En arroyos de orden 1 a 4, la comunidad bentónica microbia-
na es la principal responsable de procesar la materia orgánica, siendo su bioma-
sa mucho más significativa que la planctónica (Pusch et al. 1998). En ríos mayores
(orden 5-8) se desarrolla una comunidad planctónica en la que encontramos bac-
terias, ciliados y flagelados.
Las bacterias bentónicas colonizan especialmente rocas, cantos rodados y sedimen-

tos blandos. La densidad y diversidad de bacterias se ve afectada por múltiples fac-
tores, tanto químicos y físicos (disponibilidad de materia orgánica, temperatura,
nutrientes, tamaño de grano del sedimento, oxígeno) como biológicos (desarrollo
de la comunidad algal, actividad bacterívora de protozoos). Las bacterias pueden
llegar a representar hasta un 10% del total de la biomasa microbiana bentónica en
condiciones de luz (donde la mayor parte de la biomasa es algal), y hasta un 70%
en el sedimento hiporreico. La densidad de bacterias en el bentos fluvial varía en-
tre 106-109 células por cm2, y en el plancton entre 104-106 células por mL. La diver-
169
CONCEPTOS Y TÉCNICAS EN ECOLOGÍA FLUVIAL
sidad de la comunidad bacteriana y la variedad de sus capacidades metabólicas le

otorgan un papel clave en los procesos ecológicos fluviales.
La forma de vida de los hongos acuáticos es muy distinta de la de las bacterias, ya

que forman filamentos (hifas) y se reproducen mediante esporas. Los hongos acuá-
ticos crecen preferiblemente sobre sustratos orgánicos (hojas, ramas, madera), lle-
gando hasta el 90% de la biomasa microbiana en la hojarasca (mientras que las bac-
terias pueden representar sobre esos sustratos un 10% de la biomasa microbiana).
Los hongos acuáticos más estudiados y más relevantes desde el punto de vista eco-
lógico son los hifomicetos. Éstos desempeñan un papel fundamental en la descom-
posición de la materia orgánica de los ríos (Pascoal y Cássio 2008). Los hifomicetos
acuáticos son conocidos por producir un elevado número de esporas (conidios), lo
que contribuye a su dispersión y colonización en ambientes acuáticos (Gessner et
al. 2003). Las extremidades de los conidios de los hifomicetos acuáticos producen
mucílago que facilita la adhesión sobre los sustratos que colonizan y descomponen,
en particular hojas provenientes de la vegetación ripariana (Gessner et al. 2007).
Los hongos y las Tanto bacterias como hongos realizan la crucial función de reciclar el material or-
bacterias son los gánico que entra en el ecosistema, ya sea éste de origen autóctono (producción pri-
principales maria en el lecho del río) como alóctono (material de origen terrestre, hojarasca,
descomponedores de
ramas, madera). Estos microorganismos sintetizan enzimas extracelulares capaces
materia orgánica de los
ríos. Además hay de descomponer las moléculas orgánicas complejas y de gran tamaño, para incor-
numerosos porarlas en su organismo como fuente de C, N y P. En general, los hongos tienen
microorganismos mayor capacidad para descomponer material vegetal complejo como la celulosa y
patógenos la lignina (enzimas celulolíticas y ligninolíticas como la celobiohidrolasa y la per-
oxidasa). Gracias a esta capacidad, los hongos rompen los tejidos vegetales y colo-
nizan fácilmente el material vegetal y la hojarasca. En cambio, las bacterias tienen
una mayor capacidad para descomponer polisacáridos simples y péptidos (enzimas
polisacarídicos y peptídicos como la β-glucosidasa y las peptidasas) (Romaní et al.
2006). El proceso de descomposición microbiana por hongos y bacterias es esencial
para la posterior utilización del material por parte de los macroinvertebrados. Ade-
más de su importante papel ecológico, algunos microorganismos fluviales adquie-
ren relevancia como agentes patógenos. Entre los microorganismos causantes de
enfermedades los hay autóctonos, como Legionella, pero la gran mayoría son conse-
cuencia de la contaminación fecal (como virus, bacterias y protozoos parásitos). La
monitorización de la concentración de agentes patógenos es esencial para el con-
trol de la calidad del agua y su potencial efecto infeccioso para la salud humana.
En este capítulo se describen algunas de las técnicas básicas que pueden permitir
estudiar la estructura y el funcionamiento de las comunidades de bacterias y hon-
gos fluviales. Se incluyen dos técnicas básicas de análisis de biomasa bacteriana y
fúngica (técnica 22 y técnica 23), y otras dos técnicas adecuadas para el análisis de
170
LA BIOTA DE LOS RÍOS: LOS MICROORGANISMOS HETEROTRÓFICOS
la diversidad microbiana (técnica 24 y técnica 25). Como medida de la actividad de

estos microorganismos y su papel en el ecosistema fluvial se incluyen la tasa de es-
porulación en hongos (técnica 26) y las medidas de las actividades enzimáticas ex-
tracelulares (técnica 27). Estas técnicas permiten entender aspectos cruciales de la
ecología microbiana en los sistemas fluviales. Sin embargo, no se han incluido en
este capítulo otras técnicas, tales como la medida de producción microbiana me-
diante la incorporación de acetato, glucosa, timidina o leucina marcados radiacti-
vamente (técnicas que pueden hallarse en multitud de manuales específicos), ni
técnicas microscópicas que permiten el análisis de la arquitectura de la comunidad
microbiana bentónica, como sería el uso de la microscopia confocal o de rastreo.
11.2. Toma de muestras de microorganismos heterotróficos

fluviales
Para evitar la contaminación, la toma de muestras para el estudio de microorganis- El muestreo de

mos heterótrofos debe realizarse utilizando material previamente esterilizado (lava- microorganismos debe
do con etanol al 96% y agua Milli-Q o autoclavado). Por lo que respecta al muestreo hacerse con material
estéril
y procesado de las muestras, podemos distinguir entre los microorganismos planc-
tónicos y bentónicos. En función del estudio y de las características del río, interesa-
rá la comunidad microbiana planctónica o bien la bentónica. Dentro de un mismo
tramo fluvial, las condiciones ambientales de corriente, oxigenación y luz pueden va-
riar entre microhábitats y afectar significativamente a la biomasa, diversidad o acti-
vidad metabólica de la comunidad microbiana. El cuadro 11.1 resume las técnicas
básicas de muestreo, que se concretan más adelante en cada técnica específica.
Cuadro 11.1:
Hábitat Método de muestreo
Procedimiento de muestreo
Agua fluvial Recoger un volumen de agua en viales de vidrio estériles para la comunidad
(comunidad planctónica) microbiana en distintos
Rocas, cantos, guijarros Sustratos artificiales de vidrio o cerámica de 1-4 cm2, hábitats fluviales
(comunidad epilítica) incubados en el río durante un mínimo de 6-8 semanas
Rascar una superficie conocida mediante bisturí o cepillo
previamente esterilizados con etanol y agua Milli-Q
Grava, arena, limo Corers de arena (tubo de metacrilato o polietileno de 2-6 cm
(comunidad epipsámica) de diámetro), submuestras (de aproximadamente 1-2 mL)
con una jeringa cortada en su extremo
Para el sedimento blando, pipeta de vidrio de 10 mL con
soporte tipo embudo de goma en su extremo. Se recoge un
volumen de material equivalente a una superficie de
sedimento conocida
Hojarasca Recoger hojarasca y cortar con un sacabocados (fig. 11.3,
técnica 23) una superficie conocida de hoja (1-4 cm2)
Macrófitas (comunidad Recoger una fracción de macrófitas, ocupando un área
microbiana epifítica) conocida de río.
171
TÉCNICA 22 CONCEPTOS Y TÉCNICAS EN ECOLOGÍA FLUVIAL
Técnica 22. Densidad y biomasa de bacterias fluviales
Para muestras planctónicas, el método más comúnmente utilizado es la tinción

de una muestra líquida con DAPI (4,6-diamidino-2 fenilindol), la filtración con
filtros de 0,2 μm de color negro y la observación y conteo con el microscopio de
epifluorescencia (Porter y Feig 1980). Para muestras bentónicas, el método re-
quiere primero separar las bacterias del sustrato y obtener una muestra homogé-
nea en suspensión. El DAPI tiñe todo el DNA, el de células activas y no activas. Ac-
tualmente existen técnicas alternativas que permiten distinguir las bacterias
activas de las inactivas o muertas, como se indica al final de la técnica.
MATERIAL Y PREPARACIÓN
— Viales de vidrio de 15-30 mL limpios con ácido, mejor si son autoclavados, es-
pecialmente para las muestras de agua (o viales estériles de poliuretano tipo
Falcon de 15 mL).
— Material específico para muestreo en función de las muestras a recoger (cua-
dro 11.1).
— Equipo de filtración previamente autoclavado.
— Agua destilada Milli-Q autoclavada (100-200 mL).
— Micropipetas automáticas y puntas de pipeta autoclavadas.
— Filtros Whatman GF/C de 1,4 μm de diámetro de poro.
— Filtros de nailon, de 0,2 μm de diámetro de poro.
— Filtros negros de policarbonato, de 0,2 μm de diámetro de poro.
— Aceite de inmersión de baja fluorescencia (por ejemplo, de Panreac o Leica).
— DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindol). Se pueden guardar soluciones madre de
DAPI de 0,1 mg/mL en el congelador (mejor guardar pequeños volúmenes,
5-20 mL, para evitar que se degrade cada vez que lo descongelamos para ser
utilizado). La luz y el calor hacen perder fluorescencia al DAPI.
— Portaobjetos y cubreobjetos para montar las preparaciones.
— Pinzas.
— Formol al 40%.
— Microscopio de epifluorescencia equipado con filtro UV, excitación 340-380 nm.
PROCEDIMIENTO
Toma de muestras
1. Muestrear según se indica en el cuadro 11.1. Las muestras bentónicas se guar-
dan en agua del río filtrada por filtros de nailon de 0,2 μm para evitar conta-
minar la muestra con bacterias planctónicas, con un volumen suficiente para
que queden cubiertas. Para las muestras planctónicas será suficiente un volu-
men de 20 mL.
172
LA BIOTA DE LOS RÍOS: LOS MICROORGANISMOS HETEROTRÓFICOS TÉCNICA 22
2. Fijar las muestras bentónicas o planctónicas con formol al 2% y guardar en via-

les herméticos estériles. Las muestras se guardan en la oscuridad hasta su pre-
paración y conteo.
Extracción de la muestra
Para todas las muestras bentónicas será necesario obtener una suspensión pre- Los microorganismos se
viamente a la tinción y, por ello, tendremos que extraer la comunidad microbia- separan del sustrato
na adherida al sustrato. En función del tipo de muestra (grosor del biofilm, ma- mediante sonicación,
raspado o adición de
terial muy/poco adherido al sustrato) se pueden utilizar distintos métodos de
pirofosfato
separación:
a) Sonicación. Las muestras se sonican en un baño de ultrasonidos (40 W de

potencia y frecuencia de ultrasonidos de 40 kHz). Sonicar dos veces suce-
sivas, dos minutos cada vez. Un tiempo más largo de sonicación podría pro-
ducir la ruptura de las células bacterianas. Durante la sonicación hay que
mantener las muestras refrigeradas en hielo. En caso de arenas y limos pue-
de ser necesario dejar sedimentar la muestra unos minutos para disminuir
el contenido de partículas que puedan interferir en la observación y con-
teo (fluorescencia amarilla). En este caso, el tiempo de sedimentación
debe ser siempre igual para todas las muestras del estudio, que permita op-
timizar al máximo la visión en el conteo pero sin perder bacterias.
b) Raspado de la muestra con un «raspador celular» (cell scraper) estéril para ob-
tener una suspensión del biofilm. El raspado se puede combinar con la so-
nicación para la correcta extracción de la muestra del sustrato.
c) Adición de pirofosfato sódico hasta una concentración final de 0,05 mmol/L y
dejarla reposar durante 30 minutos. El pirofosfato sódico disgrega la mues-
tra y evita la formación de agregados, facilitando el posterior conteo.
Estos tres métodos se pueden combinar. Es importante utilizar para un estudio

siempre el mismo método de extracción de la muestra del sustrato. La eficiencia
de extracción se debe comprobar mediante técnicas microscópicas (por ejemplo,
microscopia óptica y microscopia electrónica de rastreo).
Alternativamente, y para muestras de comunidades muy delgadas sobre sustratos

artificiales, se puede teñir directamente el sustrato. Este procedimiento permite,
además, identificar la posición de las bacterias en la comunidad bentónica y su
distribución en la superficie.
Tinción y preparación de la muestra para su observación al microscopio

1. Dilución. Es posible que sea necesario diluir la mayoría de las muestras previa-
mente a la tinción con DAPI. La dilución debe hacerse con agua Milli-Q (o
agua del río filtrada por 0,2 μm de poro) autoclavada. Habitualmente las
173
muestras de arena y sedimento se diluyen entre diez y cien veces, las muestras
sobre piedras, hojarasca o macrófitos se diluyen de cinco a diez veces. Hay que
determinar la dilución adecuada y decidir el factor de dilución para todas las
muestras del estudio. Es recomendable tomar un volumen de la suspensión y
diluir hasta un volumen final de 5 mL.
2. Tinción. Las submuestras diluidas se tiñen con 2 μg mL–1 de DAPI (añadir 100 μL
de la solución madre concentrada de DAPI al volumen de 5 mL) durante 10 mi-
nutos.
3. Filtración. La suspensión teñida se filtra con filtros negros de 0,2 μm de poro y
a baja presión de vacío (unos 180 mmHg). Para proteger el filtro negro, que
es muy delgado y se rompe con facilidad, se puede colocar debajo del mismo
un filtro Whatman GF/C o de policarbonato.
El conteo bacteriano 4. Preparación de la muestra. El filtro negro con la muestra ya teñida se coloca so-
requiere la tinción con bre un portaobjetos al que previamente se ha añadido una gota de aceite de
DAPI y observación al inmersión. Posteriormente se añade otra gota de aceite de inmersión encima
microscopio de
del filtro y se coloca el cubreobjetos procurando que el filtro negro quede pla-
fluorescencia
no para su correcta observación. Las preparaciones se pueden guardar conge-
ladas durante dos o tres meses sin pérdida significativa de fluorescencia, aun-
que es preferible contarlas de inmediato.
Conteo
1. La tinción de DAPI permite diferenciar las bacterias en color azul claro sobre el
fondo negro del filtro mediante el microscopio de fluorescencia (filtro UV-2A,
Ex. 330-380 nm; véase fig. 11.1). Las muestras se cuentan a 1000 o 1250 au-
mentos, con objetivo de inmersión. Habitualmente se cuentan unos 20-40
campos para cada filtro, hasta un total de 400-1500 organismos. Es práctico dis-
poner de cuadrícula en el ocular para facilitar el conteo. Si se tiene un sistema
Figura 11.1:
a b
Bacterias teñidas con DAPI.
Se pueden observar formas
muy distintas: cocos,
bacilos y filamentos
Nota: a) Muestra suficientemente diluida y disgregada para ser contada. b) Muestra con agregados, filamentos
y material detrítico (amarillo-verdoso), que dificulta su conteo.
174
de análisis de imágenes se pueden fotografiar las muestras y realizar el conteo

automáticamente. Para ello las muestras deberán ser muy claras, lo que resul-
ta complicado con comunidades bentónicas.
2. El cálculo de la densidad bacteriana se realiza aplicando los factores de dilución, La macro 11.1 permite
volumen total de la muestra, volumen de la submuestra, superficie o volumen calcular la densidad y
correspondiente de muestra recogida al campo, superficie total de filtro ocu- biomasa bacterianas
pada por la muestra (a partir del diámetro de la columna de filtración), su-
perficie de filtro contada, y aumentos en el microscopio.
Nº de bacterias n ( A /at ) d (Vm /Vf )

= (11.1)
cm2 S
donde n: número total de bacterias contadas por filtro, A: área de filtración

(un poco menor que la total de filtro y calculada a partir del diámetro de la co-
lumna de filtración), at: área de filtro contada (equivalente al número de cam-
pos contados por la superficie contada de cada campo), d: factor de dilución,
Vm: volumen total de muestra, Vf: volumen de la submuestra teñida y filtrada,
y S: superficie de la muestra de campo.
CÁLCULO DE LA BIOMASA BACTERIANA
La biomasa bacteriana se calcula a partir de las densidades y del tamaño de las dis-
tintas formas observadas, que se aproximan a la correspondiente figura geomé-
trica. En general se calculan biovolúmenes considerando los cocos como esferas,
los filamentos como cilindros y los bacilos como cilindros con extremos semi-
esféricos. El cálculo final de biomasa bacteriana se efectúa a partir del biovolu-
men y de la densidad de cada forma bacteriana observada utilizando la relación
alométrica de Norland (Norland 1993) y un factor de conversión. Entre éstos, el
más utilizado es el 2,2 10–13 g C μm–3 (Bratbak y Dundas 1984). El cálculo de la bio-
masa también se puede realizar de forma mucho más tosca, considerando un
biovolumen medio de 0,1 μm3 por célula bacteriana. Este cálculo permite obte-
ner un valor aproximado de μg C bacteriano por cm2, interesante sobre todo
cuando se está trabajando con distintos niveles tróficos.
BACTERIAS ACTIVAS/INACTIVAS
Entre un 20-70% de las bacterias pueden ser metabólicamente inactivas o estar le-
sionadas o muertas. Por ello, en muchas ocasiones puede ser revelador para el
funcionamiento del ecosistema conocer la proporción de bacterias vivas y muer-
tas (Freese et al. 2006). Las bacterias vivas se pueden medir mediante una doble
tinción que consiste en una mezcla de 3,34 mM de SYTO® 9 (que tiñe todas las
células) y 20 mM de yoduro de propidio (que penetra en las células que tienen
175
Figura 11.2:
Observación de bacterias
epilíticas fluviales con la
doble tinción de SYTO ® 9 y
yoduro de propidio.
Izquierda, en verde claro,
bacterias vivas. Derecha,
con coloración roja,
bacterias muertas
las membranas rotas). Cuando se excita la muestra teñida con luz azul, las célu-
las vivas, con membranas celulares intactas, aparecen verdes, y las muertas tienen
coloración roja. La muestra (obtenida de la misma manera que para la tinción
con DAPI) se tiñe con la mezcla 1:1 de SYTO® 9 y yoduro de propidio durante
15 minutos. Las muestras se filtran a través de filtros negros de policarbonato de
0,2 μm de poro como los utilizados para el DAPI y se preparan para la observa-
ción al microscopio de epifluorescencia.
Hay varios métodos para Las bacterias activas también se pueden detectar midiendo la actividad respirato-
distinguir las bacterias ria (actividad del sistema de transporte de electrones, ETS, electron transport system). Ésta
vivas de las muertas se determina mediante la reducción de CTC (cloruro de 5-ciano-2,3 ditolil tetra-
zolio) en su forma fluorescente (Rodríguez et al. 1992). Sin embargo, no todas
las bacterias son capaces de reducir el CTC, que puede ser dañino para las bac-
terias. Las medidas a nivel celular (como la microautorradiografía, MAR; o la hibri-
dación in situ, FISH), aunque mucho más caras, son métodos potentes y sensibles
que pueden combinarse con los métodos clásicos de conteo mediante fluores-
cencia para una mejor detección de la biomasa bacteriana activa (Smith y Del
Giorgio 2003).
Técnica 23. Biomasa de hongos
La determinación de El ergosterol es una molécula que se encuentra en la membrana celular de los hon-
biomasa fúngica puede gos, cuya función es estructurar e impermeabilizar los lípidos de membrana,
hacerse midiendo el como hace el colesterol en células animales. Existe una buena correlación entre
contenido en ergosterol
la concentración de ergosterol y la biomasa de hongos (Stahl y Parkin 1996). La
determinación de la biomasa fúngica mediante el análisis de ergosterol, descrita
por Gessner y Schmitt (1996), se basa en una extracción de los lípidos y una se-
paración del ergosterol mediante cromatografía líquida; el ergosterol se mide por
absorbancia. La extracción de lípidos se puede realizar mediante extracción en
176
fase sólida (como se describe en este protocolo) o alternativamente mediante se-

paración con ciclohexano (Davis y Lamar 1992).
MATERIAL
Material para el muestreo en el campo

— Sacabocados metálico (diámetro 1-2 cm).
— Papel de filtro.
— Viales de polietileno (20-100 mL).
Material y equipamiento de laboratorio

— Liofilizador.
— Tubos de ensayo de cristal resistentes a la presión (40 mL).
— Baño termostático (hasta 100 ºC) con agitador para tubos.
— Baño de ultrasonidos (sonicador).
— Sistema de vacío para extracción en fase sólida.
— Bomba de vacío.
— Cartuchos para la extracción en fase sólida (por ejemplo de Waters Sep-Pack®
Vac RC, 500 mg, tC18).
— Aparato de cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Éste debe constar
de bomba, inyector, detector de UV programado para lectura a 282 nm y or-
denador para almacenamiento de datos.
— Columna para HPLC (RP 18, 250 × 4,6 mm). La utilización de precolumna es
opcional, si bien alarga la vida de la columna.
— Viales para HPLC.
— Material de cristal (matraces, vasos de precipitados).
— Pipetas.
Productos químicos
— Metanol (CH3OH, calidad analítica o para HPLC).
— Isopropanol (C3H8O, calidad analítica o para HPLC).
— Hidróxido de potasio (KOH, en lentejas, calidad analítica).
— Ácido clorhídrico (HCl, calidad analítica).
— Estándar de ergosterol (C28H44O, pureza > 98%).
PROCEDIMIENTO
Toma de muestras
El análisis de ergosterol puede efectuarse sobre cualquier tipo de sustrato fluvial, La hojarasca contiene
si bien los hongos predominan en la hojarasca y éste es el sustrato habitual en la la mayor parte de la
mayoría de estudios. El análisis de ergosterol en sustratos inorgánicos (arenas, biomasa de hongos
piedra) es menos frecuente, aunque posible.
177
Figura 11.3:
Círculos de hoja y
sacabocados usado para
obtener los discos
1. Muestreo según cuadro 11.1. Las muestras de hoja y madera sumergidas deben
ser lavadas con agua abundante para eliminar restos de material detrítico fino
e invertebrados adheridos en la superficie.
2. Con el sacabocados, cortar círculos (aproximadamente 10 por muestra) y co-
locarlos encima del papel de filtro (fig. 11.3). Éste reduce ligeramente la can-
tidad de agua en la muestra.
3. Las muestras (círculos) se colocan en viales de plástico y son transportadas en
frío (4 ºC) hasta el laboratorio, donde se procede a su congelación (–80 ºC).
Las muestras deben protegerse de la luz, ya que el ergosterol puede sufrir de-
gradación fotoquímica.
Extracción de lípidos y saponificación1

1. Liofilizar las muestras y determinar el peso seco (PS).
2. Transferir las muestras a los tubos de ensayo y añadir 10 mL de KOH 0,14 M
en metanol.
3. Tapar los tubos herméticamente e introducirlos en el baño caliente (80 ºC) y
en agitación durante 30 minutos.
Los lípidos se extraen 4. Dejar enfriar las muestras a temperatura ambiente y sin luz. Transferir el ex-
por saponificación tracto a un recipiente y lavar el sustrato con metanol (2 lavados de 10 mL cada
uno = 30 mL extracto total) y sonicado (2 minutos en baño de ultrasonidos du-
rante cada lavado) para una mayor recuperación.
1
En el caso de arenas y limos, los extractos de lípidos suelen ser más turbios y por esa razón deben ser filtrados
(0,7 μm, filtros de fibra de vidrio Whatman GF/F) antes de su paso por los cartuchos en fase sólida (Sep-Pack®).
178
Figura 11.4:
Sistema de vacío para
extracción en fase sólida
Acondicionamiento de los cartuchos para extracción en fase sólida

1. Conectar los cartuchos y sus correspondientes válvulas al sistema de vacío; an-
tes de iniciarlo las válvulas deben estar cerradas.
2. Añadir 7,5 mL de metanol en cada cartucho.
3. Accionar la bomba para generar vacío y abrir las válvulas. Mediante la regula-
ción de las válvulas, se debe generar un flujo suave y constante del disolvente
a través de la columna (fig. 11.4).
4. Añadir 7,5 mL de disolvente acondicionador acidificado (6 volúmenes de
KOH 0,12 M en metanol + 1 volumen de HCl 0,75 M). Asegurar que el pH de
la solución es < 3.
5. Cerrar las válvulas y la bomba cuando quede 1 mL de disolvente acondiciona-
dor por encima del material empaquetado dentro de la columna. Es muy im-
portante no dejar secar la columna durante este proceso; de no ser así, se debe
reiniciar el acondicionamiento desde el punto 2 de este apartado.
Elución del extracto de lípidos a través de los cartuchos de extracción en fase sólida2
1. Añadir 5 mL de HCl 0,75 M al extracto de lípidos. Sólo si el pH de la muestra
es < 3, el ergosterol podrá ser retenido y concentrado en la columna. Es im-
portante calcular el volumen final del extracto.
2. Transferir el extracto de lípidos al cartucho y accionar la bomba. Abrir las vál-
2
La capacidad de retención del ergosterol a través de las columnas en fase sólida se puede evaluar añadiendo
una concentración conocida de ergosterol diluido en metanol (por ejemplo, estándar de 100 μg ergosterol mL-1)
en una columna adicional. Este extracto deberá ser procesado igual que el resto de muestras.
179
vulas de los cartuchos y regular la presión en el sistema de vacío hasta obtener

un flujo aproximado de 1 mL min–1.
3. Una vez ha pasado todo el extracto a través de la columna, añadir 2,5 mL de
KOH 0,4 M en metanol:H2O (6:4, vol:vol) para proceder a su limpieza.
4. Dejar secar la columna durante 60 minutos. Este proceso se puede agilizar ge-
nerando un vacío máximo, abriendo las válvulas y conectando la bomba.
Elución del ergosterol

1. Colocar viales para HPLC (prepesados) en la salida de cada una de las válvu-
las dentro del sistema de vacío.
2. Accionar la bomba y aplicar el vacío en el sistema.
3. Añadir 1,6 mL de isopropanol a los cartuchos y eluir a un flujo aproximado de
1 mL min–1.
4. Eliminar el vacío en el sistema de manera progresiva (no bruscamente) y retirar
los viales. Pesar los viales y cerrar con su tapón correspondiente. El volumen de
muestra en el vial se calcula considerando δ isopropanol = 0,79 g cm–3 a 25 ºC.
Análisis con el HPLC

1. Las cromatografías deben seguir la siguiente configuración:
a) Fase móvil: 100% metanol.
b) Flujo de la fase móvil: 1,4 mL min–1
c) Temperatura de la columna: 33 ºC.
d) Longitud de onda de detección: 282 nm.
e) Volumen de inyección de muestra: 10 μL.
2. El análisis de las muestras debe ir acompañado de una curva patrón (concen-
traciones de 0 a 200 μg mL–1) de ergosterol en isopropanol. Es aconsejable
analizar los patrones en primer lugar y a continuación las muestras. Para una
mayor exactitud en los resultados, cada muestra puede ser inyectada y anali-
zada dos veces (configurar en cromatograma).
Figura 11.5: 0,8 0,8

Cromatogramas de un
patrón de ergosterol (arriba)
0,6 0,6
y de un extracto de lípidos
Absorbancia
Absorbancia
de hojas de Platanus
acerifolia recogidas en un 0,4 0,4
río (abajo)
0,2 0,2
0,0 0,0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Minutos Minutos
La instalación de una precolumna en el sistema de HPLC puede retrasar el tiempo de retención del pico de
ergosterol, como se observa en estos cromatogramas (aproximadamente 14 minutos).
180
Cuadro 11.2:
Sustrato Ergosterol (μg ergosterol/g PS) Referencia
Contenido de ergosterol
Hojas
en diferentes sustratos
Fraxinus excelsior 800-900 Gessner y Chauvet (1994) fluviales (hojas, madera
Alnus glutinosa 575-600 Gessner y Chauvet (1994) y grava)
Corylus avellana 500-600 Gessner y Chauvet (1994)
Quercus ilex 300-400 Gessner y Chauvet (1994)
Madera
Fagus sylvatica 50-60 Hendel y Marxsen (2000)
Grava 40* Artigas et al. (2004)
*
El valor de ergosterol en la grava se expresa en μg ergosterol/g PSLC.
3. Una vez obtenidos los cromatogramas, determinar la posición del pico de er- La medida de ergosterol
gosterol mediante la comparación entre patrones y muestras (fig. 11.5). El requiere el uso de HPLC
tiempo de retención del ergosterol se sitúa alrededor de los 8 minutos. Medir
el área y la altura de los picos.
Cálculo de la biomasa de hongos

1. La concentración de ergosterol en cada muestra se calcula a partir del volu-
men final del extracto y el peso seco o peso seco sin cenizas de la muestra de
hoja o madera (por ejemplo, μg ergosterol/g PS). El peso seco sin cenizas
de la muestra puede ser determinado una vez finalizado el proceso de extrac-
ción o mediante partes alícuotas de la muestra inicial. La concentración de
ergosterol también se puede expresar en función de la superficie (cm2) de sus-
trato analizada. El cuadro 11.2 recoge algunos valores de ergosterol en distin-
tos tipos de sustrato y ríos.
2. La concentración de ergosterol se transforma a biomasa de hongos (en g de car-
bono) aplicando los siguientes factores de conversión. Se considera que 5,5 mg
de ergosterol se encuentran en 1 g de biomasa fúngica (Gessner y Chauvet
1993) y que un 43% de la biomasa fúngica es en forma de carbono (Baldy y
Gessner 1997).
Técnica 24. Comunidad microbiana: métodos moleculares

de estudio de la diversidad
En las últimas dos décadas se han desarrollado técnicas moleculares basadas en Numerosas técnicas
el análisis de la diversidad genética de los microorganismos, normalmente del de biología molecular
operón ribosomal, que han permitido la evaluación detallada de la composi- permiten evaluar la
diversidad de
ción de las comunidades microbianas acuáticas (incluyendo organismos proca-
comunidades microbianas
riotas y eucariotas, sean autótrofos o heterótrofos). Para ello se toman muestras
181
acuática
Cuadro 11.3:
de la diversidad microbiana
habituales para el estudio
Métodos moleculares más
182
Fundamento Pasos Observaciones Nombre de la técnica
Con Amplificación Clonaje Secuenciación Comparación de secuencias en bases de Clonaje y secuenciación

amplificación datos (p.ej. EMBL, GenBank, etc.) (random sequencing in
TÉCNICA 24
del DNA (PCR) clone libraries)

Fingerprinting Separación Desnaturalización química. Separación en DGGE
Sin digestión electroforética función de la secuencia característica (Denaturing Gradient Gel
enzimática del DNA Electrophoresis)
Desnaturalización térmica. Separación en TGGE
función de la secuencia característica que (Temperature Gradient Gel
determina la temperatura de Electrophoresis)
desnaturalización
Se amplifica la región espaciadora entre RISA/ARISA
los genes que codifican para la subunidad (Ribosomal Intergenic
pequeña y grande del rRNA. Separación Spacer Analysis)
determinada por la longitud de los
fragmentos amplificados
Sin desnaturalización, movilidad SSCP
determinada por estructura (Single Strand
tridimensional. Separación en función de Conformation
la secuencia característica Polymorphism)
Fingerprinting Digestión con Electroforesis en gel o capilar, sin RFLP y (t)-RFLP
Con digestión enzimas de desnaturalización. Separación [(terminal)- Restriction
enzimática del DNA restricción determinada por la longitud de los Fragment Length
fragmentos amplificados Polymorphism]
Sin Fijación Hibridación con Recuento La selección de la sonda, condiciones de FISH
amplificación sondas fluorescentes microscópico hibridación o el estado fisiológico de las (Fluorescence In Situ
del DNA de oligonucleótidos o por células son, entre otros, aspectos que Hybridization)
citometría influyen en la eficiencia de la técnica
Extracción Desnaturalización Cinética de Se utiliza para comparar comunidades o Reasociación del DNA
del DNA reasociación la diversidad intracomunitaria a partir de
del DNA extractos de DNA
Fuente: Adaptado de Dorigo et al. 2005.

de las comunidades cuya diversidad se desea estudiar, y se realiza una extrac-

ción y purificación del DNA, para proceder a la amplificación, utilizando la téc-
nica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de fragmentos seleccionados
del operón ribosomal mediante el uso de cebadores específicos (primers) de las
secuencias de este operón para los microorganismos cuya diversidad se preten-
de determinar. La elección de cebadores específicos puede ir dirigida a la de-
tección de microorganismos de diversos niveles taxonómicos (desde cepas de
una especie hasta reinos). Los fragmentos de DNA amplificados corresponden
a los diferentes microorganismos presentes en la muestra cuyo DNA coincida
con la secuencia de los cebadores utilizados para la secuencia génica diana. En
una segunda etapa, se trata de determinar las variaciones en las secuencias del
DNA amplificado, para con ello desvelar la diversidad microbiana. Este segun-
do paso puede realizarse de maneras diversas, bien mediante clonaje y secuen-
ciación, que proporciona una caracterización completa de los fragmentos, o
bien mediante una separación electroforética (con o sin digestión enzimática
previa). Esta última proporciona una separación visual de la mezcla de DNA
(fingerprinting) en función del polimorfismo en la secuencia (DGGE, TGGE,
SSCP; véase cuadro 11.3) o de la longitud de los fragmentos (t-RFLP, AFLP,
ARISA; véase cuadro 11.3). Dicha separación puede también ir seguida de una
escisión y secuenciación de las bandas. A partir de las secuencias se pueden
construir árboles filogenéticos que muestran la similitud de las secuencias do-
minantes en la comunidad microbiana, y con ello proporcionan una visión de
su diversidad. En el cuadro 11.3 se señalan las principales características distin-
tivas de cada una de estas técnicas. La más comúnmente utilizada es la electrofo-
resis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), que se describe a continuación.
Asimismo se incluye un breve resumen del protocolo de clonación, que está en-
tre las técnicas más utilizadas y que ofrece una resolución taxonómica mayor
(Zwart et al. 2002, Kowalchuk et al. 2004, Ausubel et al. 2008). Además de las
técnicas basadas en la amplificación del DNA, existen otras técnicas molecula-
res independientes de dicha amplificación, tales como la hibridación in situ
con marcadores fluorescentes (FISH) o los métodos de reasociación del DNA,
que no se incluyen aquí.
Los protocolos detallados de estas técnicas moleculares aquí descritas pueden

presentar numerosas variantes que deben ser adaptadas para cada estudio con-
creto.
MATERIAL
El material necesario para realizar cada uno de los pasos del proceso se señala
en el cuadro 11.4. La preparación de las soluciones stock se describe en el apén-
dice A.1 (pág. 413).
183
Cuadro 11.4:
A B C D E F G H
Material necesario para
cada uno de los pasos Botella de vidrio pyrex estéril
Nevera portátil
Acumuladores de frío
Nevera (4 °C)
Tubos Eppendorf de 2 mL
Equipo de filtración
Bomba de vacío
Pinzas
Filtro de nytal de 30 µm de poro
Filtro de policarbonato de 10 µm de poro
Filtro de policarbonato de 3 µm de poro
Filtro de policarbonato de 0,2 µm de poro
Etanol 96% para lavado de material
Autoclave
Recipientes estériles
Congelador (–80 ºC)
Cepillo
Ultracentrífuga para tubos Eppendorf
Pipetas automáticas de 5, 40, 200 y 1000 µL
Puntas estériles para pipetas
Tijeras estériles
Sonicador
Hielo picado
Bolas (beads) de circonio/sílice de 0,5 mm de diámetro
Soluciones stock de extracción y purificación*
Isopropanol
Etanol 70%
Vortex o beadbeater (rompedor de células mediante
agitación con bolas de vidrio)
Baño termostatizado
Estufa termostatizada de aire forzado
Desecador
Balanza de precisión
Tubos Falcon de 15 mL
Microespátula
Espectrofotómetro
Tampón TE (Tris-EDTA)*
Microcubeta de cuarzo
Solución estándar de DNA
Agua Milli-Q
Tubos de PCR
Tampón 10X
Solución de MgCl2
Solución stock de oligonucleótidos (10 mM)
184
Cuadro 11.4:
A B C D E F G H
Material necesario para
Cebadores (directo y reverso) cada uno de los pasos
BSA 0,1% (cont.)
Solución 5X de enhancer (solución de intensificación)
Polimerasa termoestable (p. ej. Taq polimerasa)
Termociclador
Horno microondas
Cubeta horizontal para electroforesis
Molde de metacrilato
Peine para preparar los pocillos
Transiluminador y protector visual contra UV
Agarosa (grado para electroforesis)
Solución stock 50X de tampón TAE
(Tris/acetato/EDTA)*
Tampón de carga con y sin azul de bromocresol*
Marcador de tamaño de fragmentos de DNA
Solución de bromuro de etidio
Fuente de electroforesis
Pipetas automáticas y puntas de pipeta tipo Gelsaver
tips, de 1-200 μL
Placas de vidrio para preparación del gel
Espaciadores
Grasa de silicona
Marco de electroforesis
Pinzas para el marco
Generador de gradientes
Bomba
Sistema de electroforesis vertical
Sistema de circulación de líquidos termostatizado
Cámara fotográfica
Pipeta Pasteur
Papel Whatman para cromatografía
Film transparente
Detergente suave (tipo Decon 90 o similar)
Solución 40% de acrilamida:bisacrialmida*
Solución de APS*
Formamida
TEMED
Urea
Glicerol
Butanol
A: Muestreo y procesado de muestra planctónica. B: Muestreo y procesado de muestra bentónica. C: Extrac-

ción y purificación del DNA de microorganismos planctónicos o de microorganismos bentónicos recogidos
por raspado. D: Extracción y purificación del DNA de microorganismos embebidos en sedimentos. E: Cuanti-
ficación del DNA. F: Amplificación del DNA (PCR). G: Electroforesis en gel de agarosa. H: DGGE.
*
Véase el apéndice A.1, en página 413.
185
Técnica 24a. Toma, procesado y conservación de muestras
MICROORGANISMOS PLANCTÓNICOS
Las muestras planctónicas se trasladan rápidamente al laboratorio para su filtra-

do o se filtran in situ. La recolección de los organismos para extraer su DNA pue-
de realizarse o bien concentrando todos los organismos en una única filtración a
través de un filtro de 0,2 μm de poro, o bien mediante filtración fraccionada. En
la filtración fraccionada se busca retirar los microorganismos de mayor tamaño y
concentrar los de las fracciones de menor tamaño, aunque los organismos que vi-
ven adheridos a partículas (inertes o no) quedan retenidos por el filtro que re-
tiene las partículas a las que están adheridos. Se procede del modo siguiente:
1. Recogida de la muestra. Se toma una muestra de agua (1-2 L) en una zona cen-
tral del cauce ligeramente por debajo de la superficie, o en otras partes del
cauce si así se precisa.
2. Poner la muestra en un recipiente estéril (por ejemplo, una botella de vidrio
Pyrex previamente esterilizada).
Los microorganismos 3. Trasladar la muestra al laboratorio (a 4 ºC y en la oscuridad). Filtrar lo antes
planctónicos se obtienen posible (siempre dentro de las primeras 24 horas). Para filtrar se utiliza un
por filtración de la equipo de filtración previamente lavado con etanol y con agua destilada, y es-
muestra
terilizado. En el caso de la filtración secuenciada, se filtra la muestra primero
a través de un filtro de nytal de 30 μm de poro, y el filtrado se pasa consecu-
tivamente a través de filtros de policarbonato de 10 μm, 3 μm, y 0,2 μm de
poro. Todos los filtros se guardan en tubos Eppendorf de 2 mL (conservación
a –80 ºC).
En el caso de no realizar fraccionamiento, la filtración completa de la muestra se

realiza directamente a través del filtro de policarbonato de 0,2 μm de poro. La fil-
tración no fraccionada tiene la ventaja de recoger todos los componentes de la co-
munidad, pero en ella se produce una rápida colmatación del filtro, que puede lle-
var a no detectar los componentes minoritarios de la comunidad. Se recomienda
realizar varias filtraciones en diferentes filtros de policarbonato de 0,2 μm de poro
y realizar la extracción del DNA de todos ellos.
MICROORGANISMOS BENTÓNICOS
Los microorganismos Los microorganismos bentónicos se recogen de acuerdo con las indicaciones del
bentónicos se obtienen cuadro 11.1. La muestra, sea de los sedimentos o del raspado de los materiales du-
por centrifugado ros, se deposita en un tubo Eppendorf de 2 mL y se centrifuga, se retira el sobre-
nadante y se congela el pellet, o material sedimentado (preferiblemente a –80 ºC)
hasta el momento de la extracción del DNA.
186
Técnica 24b. Extracción, purificación y cuantificación del DNA
Los pasos principales a realizar consisten en la homogenización de la muestra, la

disrupción celular para liberar el DNA y la eliminación de los componentes del
extracto que no sean ácidos nucleicos (proteínas, polisacáridos, etc.). Alternati-
vamente a la preparación de los reactivos a partir de sus componentes se puede
recurrir a kits de extracción y purificación de DNA preparados comercialmente.
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA DE MICROORGANISMOS PLANCTÓNICOS

O BENTÓNICOS SOBRE SUSTRATOS DUROS
Los pasos 1 a 12 constituyen el proceso de extracción del DNA y a partir del 13

los de purificación.
1. En el caso de muestras procedentes de raspado, se realiza la extracción a par-

tir del pellet guardado en el tubo Eppendorf. En el caso de muestras recogidas
en un filtro, éste se fragmenta en pequeñas piezas con unas tijeras estériles y se
deposita en un tubo Eppendorf de 2 mL antes de proceder al siguiente paso.
2. Añadir 567 μL de la solución TE (tampón Tris-EDTA), 30 μL de la solución de
dodecilsulfato de sodio, SDS, 10% (véase apéndice A.1 en pág. 413) y dos go-
tas de bolas de 0,5 mm al tubo Eppendorf.3
3. Colocar el tubo Eppendorf en hielo picado y sonicar durante 5 minutos.
4. Mezclar con un vortex (o un aparato tipo beadbeater) durante 10-60 minutos
(dependiendo de la dificultad de ruptura de las estructuras celulares).
5. Añadir 3 μL de la solución stock de proteinasa K (stock de 20 mg/mL) y 10 μL
de la solución de lisozima (stock de 10 mg/mL).
6. Mezclar enérgicamente por volteado (sin utilizar el vortex).
7. Incubar a 37 ºC durante 60 minutos.
8. En muestras con mucho RNA puede ser necesario realizar un tratamiento
con RNAasa para eliminar éste (el procedimiento se suele encontrar en los
kits de extracción de DNA). Se añade la RNAasa (normalmente 3 μL de la so-
lución comercial) y se incuba a 37 ºC durante 60 minutos.
9. Añadir 100 μL de la solución de NaCl 5 M.
11. Incubar a 65 ºC durante 2 minutos.
12. Añadir 80 μL de la solución stock de CTAB/NaCl. Esta solución debe estar
precalentada a 65 ºC y, dada su elevada densidad, debe pipetearse con una
punta cortada en su extremo más fino.
13. Añadir 750 μL de la solución CI (cloroformo:isoamilalcohol) y homogenizar
bien por volteado provocando la emulsión de los dos medios.
3
Por ejemplo, circonio/sílice beads fabricadas por Biospec Products Inc. (www. biospec.com).
187
14. Centrifugar a 13 000 rpm durante 5 minutos.

15. Recoger el sobrenadante y depositarlo en un nuevo tubo Eppendorf.
16. Añadir 750 μL de la solución PCI (fenol:cloroformo:isoamilalcohol) y ho-
mogenizar bien por volteado provocando la emulsión de los dos medios.
19. Añadir 750 μL de la solución CI (cloroformo:isoamilalcohol) y homogenizar
22. Añadir 600 μL de isopropanol para precipitar el DNA y mezclar por volteado.
23. Incubar en la oscuridad durante una noche a 4 ºC o 2 horas a temperatura
ambiente.
24. Centrifugar a 12 000 rpm durante 30 minutos. El pellet con el DNA debe ser
visible.
25. Eliminar el sobrenadante.
26. Añadir 500 μL de etanol 70% para lavar los restos de cloroformo.
30. Secar el pellet en un desecador al vacío de 1 a 3 horas.
31. Añadir 100 μL de la solución TE (tampón Tris-EDTA).
32. Resuspender incubando a 37 ºC durante 5 minutos.
La extracción de DNA 33. Cuantificar el extracto (véase procedimiento para cuantificar el DNA extraí-
precisa un proceso largo do, pág. 190).
y cuidadoso 34. Congelar el extracto a –80 ºC hasta el momento de proceder a la amplifica-
ción del DNA.
EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA DE MICROORGANISMOS EMBEBIDOS

EN SEDIMENTOS
1. Poner entre 50 y 300 mg de sedimentos (peso fresco) en un tubo Falcon de

15 mL (Falcon 1).
2. Añadir 2 mL del tampón de extracción TESC.
3. Congelar, y descongelar a 65 ºC. Repetir este paso tres veces.
4. Añadir cuatro gotas de bolas de 0,5 mm (por ejemplo, circonio/sílice, beads).
5. Incubar a 70 ºC durante 30 segundos, mezclar con un vórtex. Incubar de nue-
vo de 5 a 10 minutos (dependiendo de la dificultad de ruptura de las estruc-
turas celulares) y agitar de nuevo el vórtex. Repetir este último paso tres veces.
6. Añadir 15 μL de la solución stock de proteinasa K (stock de 20 mg/mL),
200 μL de la solución de SDS 10%, y 50 μL de la solución de lisozima (stock
de 10 mg/mL).
188
7. Incubar a 50 ºC durante 40 minutos. Agitar por volteado cada 10 minutos.

8. En el caso de muestras con mucho RNA, puede ser necesario hacer un trata-
miento con RNAasa para eliminar éste (habitualmente se puede encontrar el
procedimiento en los kits de extracción de DNA). En ese caso se añade la
RNAasa (normalmente 3 μL de la solución comercial) y se incuba a 37 ºC du-
rante 60 minutos.
9. Añadir 2 mL de la solución CI (cloroformo:isoamilalcohol) y homogenizar
10. Centrifugar a 4000 rpm durante 10 minutos.
11. Recoger el sobrenadante y depositarlo en un nuevo tubo Falcon (Falcon 2).
12. Al tubo Falcon con el sedimento (Falcon 1), añadir 2 mL del tampón de
extracción TESC, homogenizar bien por volteado, centrifugar a 4000 rpm
durante 10 minutos, recoger el sobrenadante y depositarlo en el tubo Fal-
con 2.
13. Al tubo Falcon 2, añadirle 4 mL de la solución PCI (fenol:cloroformo:isoamil-
alcohol) y homogenizar bien por volteado.
14. Incubar el tubo Falcon 2 a 65 ºC durante 10 minutos.
16. Recoger el sobrenadante y depositarlo en un nuevo tubo Falcon (Falcon 3)
17. Al tubo Falcon 3, añadirle 2 mL de la solución CI (cloroformo:isoamilalcohol)
y homogenizar bien por volteado.
19. Recoger el sobrenadante en un nuevo tubo Falcon (Falcon 4) y agitarlo.
21. Comprobar que no queda CI/PCI (se verían dos fases); si queda, repetir el
paso hasta elimina el CI/PCI que queda en la parte inferior.
22. Añadir 2,5 mL de isopropanol (para precipitar el DNA) y mezclar por vol-
teado.
23. Incubar en la oscuridad durante una noche a 4 ºC.
24. Centrifugar a 4000 rpm durante 1 hora. El pellet con el DNA debe ser visible.
26. Añadir 500 μL de etanol 70% para lavar los restos de cloroformo, agitar por
volteado e incubar a –20 ºC durante 10 minutos.
29. Secar el pellet en un desecador al vacío durante 1 a 3 horas.
30. Añadir 250 μL de la solución TE (tampón Tris-EDTA).
31. Resuspender incubando a 37 ºC durante 30 minutos.
32. Pasar a un tubo Eppendorf de 2 mL.
33. Cuantificar el extracto (véase apartado siguiente).
34. Congelar el extracto a –80 ºC hasta el momento de proceder a la amplifica-
ción del DNA.
189
PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR LA CANTIDAD Y PUREZA DEL DNA EXTRAÍDO
Una vez extraído el DNA Una vez completada la extracción del DNA, éste debe cuantificarse para com-
se verifica su pureza probar que el proceso de extracción ha tenido éxito y para evaluar su pureza. Di-
mediante el cha cuantificación puede realizarse de manera espectrofotométrica para deter-
espectrofotómetro
minar si la extracción ha sido suficientemente efectiva y el extracto es lo bastante
puro, o bien mediante una electroforesis en gel de agarosa (normalmente pre-
parado al 0,8-1% p/v de agarosa; véase técnica 24d). En el procedimiento espec-
trofotométrico se determina la absorbancia del extracto de DNA (diluido 1/25)
a diversas longitudes de onda para determinar su concentración y su pureza con
respecto a otras sustancias que podrían estar incluidas en el extracto (polisacári-
dos, proteínas, RNA, …). La medida de la absorbancia a 260 nm permite cuanti-
ficar la concentración de ácidos nucleicos, mientras que la relación entre esta ab-
sorbancia y la determinada a otras longitudes de onda (por ejemplo, 230 para
fenol y polisacáridos, 280 para proteínas) permite determinar la pureza relativa
del extracto. Se resume a continuación el protocolo para la determinación es-
pectrofotométrica.
1. En la microcubeta, añadir 500 μL de tampón TE.

2. Añadir 20 μL del extracto de DNA.
3. Medir la absorbancia de la mezcla a 230, 260 y 280 nm frente a un blanco de
tampón TE.
4. Calcular la concentración de DNA, según la siguiente fórmula:
[DNA ] (mg/mL) = A260 /0, 02 (11.2)
5. Calcular la pureza mediante las siguientes razones (ratios) de absorbancia:
A230/A260: Debe estar comprendido entre 0,3 y 0,9; valores superiores indican la
contaminación del extracto por polisacáridos o por restos del fenol resultan-
tes de un mal lavado en el proceso de extracción.
A260/A280: Valores de esta relación situados entre 1,8 y 2,0 indican un alto gra-
do de pureza de ácidos nucleicos; si se hallan entre 1,8 y 1,9 indican una alta
pureza de DNA. Valores por encima de 2,0 indican contaminación por RNA,
lo cual hace aconsejable la inclusión de la lisis de este RNA utilizando RNAasa
en el proceso de extracción. Valores por debajo de 1,8 indican la contamina-
ción del extracto con proteínas, lo que exigiría un mayor cuidado en la elimi-
nación de éstas durante el proceso de extracción o una posterior purificación.
En caso de ser necesario, el extracto puede purificarse de manera adicional,

por ejemplo, utilizando columnas de purificación (Sepharose G-200).
190
Técnica 24c. Amplificación del DNA (PCR)
AMPLIFICACIÓN DEL DNA
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consiste en la multiplica- El DNA se amplifica

ción in vitro de secuencias específicas de DNA utilizando la actividad enzimática mediante cebadores
de la DNA-polimerasa. Generalmente la secuencia amplificada suele ser la del selectivos
gen que codifica para el 16S rRNA (en los procariotas) y para el 18S rRNA (en
los eucariotas). Cuando la amplificación de las secuencias de los genes codifican-
tes para el RNA ribosómico no da suficiente resolución suele recurrirse al uso de
las secuencias de las regiones intergénicas (ITS). El DNA extraído de las muestras, co-
rrespondiente a toda la comunidad, se amplifica de forma selectiva mediante ce-
badores selectivos que se eligen en función del grupo taxonómico cuyo DNA se
pretenda amplificar. Son necesarios cebadores de iniciación en ambos lados de la
cadena de DNA (cebador directo —forward primer— y reverso —reverse primer—),
cuyas temperaturas de hibridación deben ser similares. Las condiciones a aplicar
en el termociclador (fig. 11.6a), referentes a la desnaturalización, a la hibridación
de los cebadores al extremo 3’ de cada hebra y a la elongación de la hebra, tales
como el número de ciclos, temperaturas y los tiempos de incubación y rampas de
incremento de éstas, son específicas para cada cebador y secuencia a amplificar.
Figura 11.6:
a) Termociclador.
b) Electroforesis en gel de
agarosa 2% del producto de
PCR utilizando cebadores
específicos para
cianobacterias 460 pb
(CYA359F y CYA781r), teñido
con bromuro de etidio
(fotografía de Antonio
Picazo, Universidad de
Valencia). c) Marco de
electroforesis ya montado.
d) Tanque contenedor y
sistema de circulación y
electroforesis vertical
(izquierda) y generador
de gradientes (derecha)
191
Para la amplificación, partimos del extracto de DNA previamente cuantificado

que se conserva congelado. Así, se prepara la mezcla de polimerización y después
se le adiciona el DNA extraído para llevarlo al termociclador.
Normalmente, los reactivos se adquieren ya preparados, en cuyo caso las canti-

dades a añadir serán las que especifique el fabricante. Dada la facilidad de con-
taminación, es recomendable que el material utilizado sea de uso exclusivo y los
reactivos específicos para el uso en biología molecular, en condiciones de traba-
jo extremadamente pulcras. El procedimiento es el siguiente:
1. Tomar un tubo de PCR (200 μL).

2. Añadir 5,75 μL de agua Milli-Q.
3. Añadir 2,5 μL de tampón 10X.
4. Añadir 0,75 μL de MgCl2. Utilizar la concentración recomendada por el fa-
bricante de la polimerasa. Se suelen usar soluciones stock en torno a 50 mM,
de las que se añade la cantidad indicada a la mezcla (por muestra).
5. Añadir 1 μL de la solución de oligonucleótidos (dNTP).
6. Añadir 1 μL del cebador directo (stock 10 pmo/μL).
7. Añadir 1 μL del cebador reverso (stock 10 pmo/μL).
8. Añadir 1 μL de una solución 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA).
9. Añadir 5 μL de la solución 5X de enhancer (solución de intensificación) (pre-
calentado a 65 ºC). Estos productos actúan de manera diversa para incre-
mentar el rendimiento y/o la especificidad de la polimerización, por ejemplo
protegiendo la actividad enzimática o disminuyendo la ligación inespecífica
de los cebadores.
10. Añadir 1 μL de Taq polimerasa.
11. Una vez preparada la mezcla de polimerización con todo lo anterior, se aña-
den aproximadamente 10 ng de DNA del extracto (según la abundancia del
DNA que se desea amplificar en el extracto puede ser necesario añadir ma-
yores cantidades, oscilando normalmente entre 10-100 ng). Para ello el ex-
tracto de DNA se diluye en tampón TE, de manera que haya unos 10 ng en
6 μL. Para el buen funcionamiento de la reacción de polimerización el extrac-
to debe estar bien limpio de compuestos tales como fenol, agentes quelantes
como el EDTA, detergentes u otras sustancias usadas en el proceso de ex-
tracción, ya que éstas dificultan la acción de la polimerasa.
12. Llevar al termociclador y someter al proceso de polimerización (opciones de
amplificación en función de los cebadores).
13. Comprobar que se ha obtenido amplificación y que el tamaño del DNA am-
plificado es correcto mediante una electroforesis en gel de agarosa (0,8-2%)
con tampón TAE 1X, utilizando un marcador de tamaño, tinción del gel con
bromuro de etidio u otros tintes (por ejemplo, SYBR) y observación (prote-
ger la vista) con luz ultravioleta (fig. 11.6b).
192
14. Una vez obtenido el DNA amplificado y comprobado que el proceso ha fun- El DNA amplificado
cionado correctamente, el extracto se congela a –80 ºC hasta su utilización. puede congelarse a
Si se va a utilizar para clonación no se puede congelar y debe utilizarse in- –80 ºC a no ser que
vaya a utilizarse para
mediatamente.
clonación
15. El producto de la amplificación puede ser utilizado tanto para la clonación
como para la separación electroforética que proporciona el fingerprinting
de la comunidad, o incluso para la secuenciación directa (Ausubel et al.
2008).
PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

DEL PRODUCTO AMPLIFICADO
Como se ha indicado en el punto 13 del protocolo anterior, la bondad del pro-

ceso de amplificación por lo que se refiere a la cantidad y calidad del producto
obtenido se evalúa mediante una electroforesis en gel de agarosa. Se usa del
modo siguiente:
1. Pesar la cantidad apropiada de agarosa, entre 0,8 y 2 g según la concentra-

ción de agarosa en el gel. Se suele utilizar una concentración 0,8% para los
productos de extracción de DNA y entre 1,5 y 2% para los productos de PCR.
Generalmente, la concentración debe ser más baja cuanto mayores sean los
fragmentos de DNA a separar.
2. Añadir la agarosa en un matraz Erlenmeyer de 0,5 L.
3. Añadir 100 mL de tampón Tris/acetato/EDTA (TAE) 1X.
4. Hervir durante 2 minutos, evitando que se vierta.
5. Dejar enfriar hasta una temperatura de 55 ºC, sin que solidifique.
6. Preparar el molde de metacrilato, incluyendo el peine con el número de po-
cillos necesario para las muestras y el marcador, sin que éste toque el fondo.
7. Verter cuidadosamente la agarosa evitando la formación de burbujas, o eli-
minado éstas si se forman (por ejemplo, pinchándolas con una aguja estéril).
8. Dejar solidificar el gel durante media hora.
9. Retirar el peine.
10. Colocar el molde con el gel en la cubeta de electroforesis, con los pocillos
más próximos al polo negativo.
11. Añadir a la cubeta de electroforesis tampón TAE 1X hasta cubrir el gel de ma-
nera sobrada.
12. Preparar cada muestra en un tubo Eppendorf pequeño añadiendo 10 μL del
producto amplificado y 4 μL del tampón de carga con azul de bromocresol.
13. Cargar los pocillos de los extremos con el marcador molecular de tamaño.
14. Cargar el resto de los pocillos con las muestras que corresponda.
15. Conectar la fuente eléctrica (120 V) y dejar el tiempo suficiente para que co-
rra la muestra (entre 0,5 y 1,5 horas, según el tamaño del gel).
193
16. Una vez finalizada la electroforesis, teñir el gel sumergiéndolo durante unos
15 minutos en una solución de bromuro de etidio preparada añadiendo unas
10-20 gotas de éste (hasta que el agua adquiera un ligero color) a 1 L de agua
Milli-Q. Toda la manipulación del bromuro de etidio y del gel a partir de este
instante se debe realizar con guantes y otras medidas protectoras, utilizando
material específico y recogiendo el material desechado en un recipiente ade-
cuado. Los residuos son tóxicos, ya que el bromuro de etidio es mutágeno y
potencialmente cancerígeno.
17. Lavar el gel con agua del grifo.
18. Visualizar el gel con luz ultravioleta y fotografiar si se desea.
Técnica 24d. Separación del DNA por DGGE (fingerprinting

de la comunidad)
La DGGE proporciona un Las técnicas electroforéticas se basan en la separación de moléculas cargadas al

patrón de bandas de someterlas a un campo eléctrico a través de un gel. La electroforesis en gel con gra-
DNA característico de la diente químico desnaturalizante (DGGE), generalmente usando urea y formamida
comunidad microbiana
para desnaturalizar, al igual que su equivalente de desnaturalización con gra-
diente de temperatura (TGGE), se utilizan de manera rutinaria para estudios cua-
litativos y semicuantitativos de la diversidad de comunidades microbianas. Los
productos de amplificación son separados electroforéticamente en un gel de poli-
acrilamida en función de las diferencias en sus secuencias, que determinan pa-
trones diferentes de desnaturalización y con ello de migración. En la DGGE la se-
paración del DNA es función de las características de desnaturalización de la
doble hélice de DNA. La carrera electroforética se realiza en una cubeta vertical
en la que se coloca un gel de poliacrilamida entre un gradiente desnaturalizante.
En ella se obtiene un patrón de bandas característico de la comunidad. El patrón
obtenido en la DGGE ofrece una visión de la diversidad de la comunidad (finger-
printing). Además se puede obtener información taxonómica con la escisión de
las bandas, su reamplificación, y la secuenciación de los productos de esa nueva
amplificación, o bien mediante análisis de hibridación con oligonucleótidos mar-
cados específicos para determinados taxones. En la DGGE se deben considerar
las condiciones de la carrera electroforética y la dificultad de comparación de los
patrones cuando aparecen muchas bandas, lo que puede hacer necesaria la rea-
lización de diversos geles y combinaciones de muestras. Cuando el número de
bandas es grande, diferentes fragmentos de DNA podrían migrar juntos, limitan-
do de esta manera la sensibilidad de la técnica.4
4
Para el tratamiento estadístico de los datos obtenidos en la DGGE se sugiere Fromin et al. (2002), y para dudas
sobre la técnica se puede consultar la dirección http://ddgehelp.blogspot.com/
194
PREPARACIÓN DEL GEL
La acrilamida y la formamida son tóxicas, por lo que todo el procedimiento se

debe realizar con guantes y, cuando se manipulen estas sustancias, en campana
de gases, evitando la contaminación y recolectando todos los residuos contami-
nados en recipientes especiales.
1. Limpiar cuidadosamente todo el material (cristales, espaciadores, peines, etc.)

con detergente (tipo Decon 90 o similar, no usar materiales abrasivos), poste-
riormente con isopropanol, etanol al 96% y finalmente agua Milli-Q. Es espe-
cialmente importante eliminar los restos de silicona de electroforesis anteriores.
2. Colocar los espaciadores alineados a lo largo de los bordes del cristal más lar-
go, situar el cristal pequeño en la parte externa y sujetarlos con pinzas. Sellar
los bordes y, especialmente la parte baja, con cinta y silicona (usar el mínimo
necesario). Poner las placas de cristal en el marco.
3. Comprobar el buen funcionamiento del generador de gradientes con un flu-
jo de agua Milli-Q. Una vez comprobado que el bombeo funciona correcta-
mente, vaciar el tubo por bombeo y colocar la punta del tubo de salida (con
una punta de pipeta en el extremo) en el centro de la parte superior de la cá-
mara que contendrá el gel (el espacio entre cristales).
4. Preparar igual volumen (15-30 mL de cada, dependiendo del tamaño del gel)
de las dos soluciones de acrilamida, la de mayor y la de menor concentración
desnaturalizante. Por ejemplo, para preparar un gradiente desnaturalizante
30-70%, se prepara una solución al 30% (menor porcentaje desnaturalizante)
y una al 70% (mayor porcentaje desnaturalizante), de acuerdo con lo reseña-
do en el cuadro 11.5.
También puede prepararse una solución 100% desnaturalizante con concen-
tración 40% de formamida y 7 M de urea (a partir de 84 g de urea disueltos en
el mínimo posible de agua Milli-Q, 80 mL de formamida 100%, 2 mL de solu-
Porcentaje Cuadro 11.5:

Cantidades de reactivos
Reactivo [Final] 0 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 (en mL) a añadir para
preparar las soluciones
Milli-Q – 3,6 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 desnaturalizantes a aplicar
Acrilamida: Aprox. 8% 1,3 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 en el generador
bisacrilamida de gradientes
(37:1) 40%
Tampón TAE 1X 0,1 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
50X
Urea Variable 0,0 1,3 1,6 1,9 2,2 2,5 2,8 3,1 3,4 3,7 4,0 4,3
Formamida Variable 0,0 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 3,0 3,3 3,6 3,9 4,2
Glicerol 2% 0,0 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3
195
ción tampón TAE 50X, 4 mL de glicerol, 40 mL de la solución 40% de acrila-

mida:bisacrilamida [37:1], y agua Milli-Q hasta 200 mL) y una solución 0% (lo
mismo, pero sin añadir formamida ni urea), y juntarlas en las proporciones
adecuadas para hacer las dos soluciones (mayor y menor porcentaje desnatu-
ralizante) que se vayan a utilizar. La urea se disuelve en caliente.
5. Verter 15-20 mL de solución con la mayor concentración de desnaturalizante en
la cámara correspondiente del generador de gradientes. Llenar el tubo suave-
mente, evitando burbujas de aire. Poner en marcha el agitador de esta cámara.
6. Verter 15-20 mL de solución con la menor concentración de desnaturalizante
en el otro compartimento del generador de gradientes.
7. Añadir 150 μL de APS y 15 μL de TEMED a cada una de las dos soluciones des-
naturalizantes, mezclándolo bien con las soluciones de acrilamida. Al añadir
estas sustancias comienza la polimerización de la acrilamida, desde este mo-
mento se dispone de unos 15 minutos para completar el montaje del gel.
8. Abrir las llaves de salida de las cámaras del generador de gradientes, evitando
la formación de burbujas.
9. Conectar la bomba del generador de gradientes, a un flujo de 5 mL/min (si
no se dispone de sistema de bombeo puede colocarse el generador de gra-
dientes sobre las placas y dejar que el líquido pase por gravedad), completán-
dose el vertido del gel en unos 4-6 minutos.
10. Detener el llenado cuando el líquido esté aproximadamente 0,5 cm por de-
bajo del nivel que ocupará el peine. Limpiar el tubo y el generador de gra-
dientes con un flujo de agua Milli-Q (que se descarta).
11. Añadir unos mL de agua Milli-Q saturada con butanol.
12. Dejar polimerizar el gel durante una hora.
Las técnicas 13. Limpiar el espacio entre las placas tres veces con agua Milli-Q. Secar el espa-
electroforéticas se basan cio entre las placas con papel Whatman.
en la separación de 14. Colocar el peine en la parte superior.
moléculas cargadas al
15. Con una pipeta Pasteur, añadir una mezcla de solución de acrilamida 0% (sin
someterlas a un campo
eléctrico a través formamida ni urea), 50 μL de APS y 5 μL de TEMED (stacking gel).
de un gel 16. Dejar polimerizar el gel durante 15 minutos.
17. Quitar el peine del gel y la tapa de la parte inferior de las placas de cristal.
Carrera electroforética y revelado del gel

1. Colocar el marco con el gel (fig. 11.6c) en el tanque contenedor de la solución
tampón (fig. 11.6d).
2. Llenar el contenedor con tampón TAE 1X. Ajustar el tampón para que suba
justo sobre el nivel de los pocillos. Evitar el contacto del tampón con la cáma-
ra de electroforesis superior. El tampón se renueva cada tres o cuatro carreras.
3. Conectar el sistema de circulación del baño y calentar a 60 ºC.
4. Llenar los pocillos con tampón.
5. Precorrer el gel durante media hora a 60 voltios (unos 50 mA).
196
6. Lavar los pocillos con tampón.

7. Cargar las muestras, añadiéndoles previamente el tampón de carga de gel
(10-50%) con puntas de pipeta para carga de geles. Cargar alrededor de 10
μL de muestra.
8. Cargar los marcadores de tamaño (normalmente uno a cada extremo y uno
en el centro del gel).
9. Comprobar el buen funcionamiento del sistema de circulación.
10. Cubrir la cubeta con film plástico para disminuir la evaporación.
11. Correr la electroforesis durante unas 15 horas a 50-60 voltios.
12. Finalizar la electroforesis y desconectar el aparato y el sistema de circulación.
13. Retirar el gel de la cámara apoyado sobre una de las placas de cristal.
14. Teñir el gel durante 30 minutos en una solución de TAE 1X con 50 μL de una
solución 10 mg/mL de bromuro de etidio, con agitación suave.
15. Colocar el gel en el transiluminador de luz ultravioleta.
16. Fotografiar cuidadosamente el gel con un sistema de fotografía digital.
17. Trabajar la fotografía con un programa de análisis de imagen.
18. Si se desea obtener más información taxonómica, las bandas se pueden es-
cindir, reamplificar y secuenciar, aunque para ese tipo de estudios la clona-
ción es un procedimiento más adecuado.
Técnica 24e. Clonación
La clonación de los fragmentos amplificados por PCR, con posterior secuencia- La clonación es
ción, es un procedimiento costoso, por lo que no suele utilizarse para estudiar di- adecuada solamente
ferencias espaciotemporales en toda la comunidad microbiana, sino más bien para el estudio de la
diversidad taxonómica
para el estudio de la diversidad de grupos taxonómicos concretos. El análisis de
las secuencias clonadas hace posible identificar las secuencias dominantes en el
producto inicial de la PCR.
En la técnica de clonación, los fragmentos de DNA amplificados son unidos a un

vector (un plásmido) que suele llevar un gen que codifica para unas característi-
cas distintivas (normalmente una resistencia a un antibiótico y un enzima para
una determinada reacción), de manera que al ser insertado en una bacteria ésta
integra tanto el fragmento de DNA procedente de la amplificación como el gen
que le confiere dichas características, las cuales permiten identificar las colonias
de las bacterias que han incorporado el vector. Fundamentalmente, los pasos del
proceso de clonación son:
Ligación del DNA amplificado al vector. La reacción se realiza en tubos Eppendorf

de 0,5 mL de capacidad, en los que se introduce la mezcla de ligación consis-
tente, fundamentalmente, en DNA-ligasa (por ejemplo, T4 DNA-ligasa), el vec-
197
tor de clonación (un plásmido, que en el protocolo resumido que incluimos

aquí incluye un gen de resistencia a un antibiótico, generalmente a la ampicili-
na, junto con la capacidad de síntesis de β-galactosidasa que permite la degra-
dación de XGal), el producto de PCR a clonar (que no se debe haber congela-
do previamente), un tampón, y agua Milli-Q. Se incluyen, además de las
muestras, un control positivo, consistente en un fragmento de DNA diferente al
amplificado, y un control negativo, en el que no se añade DNA. Todo esto se in-
cuba a temperatura ambiente, durante aproximadamente una hora, o durante
una noche a 4 ºC.
Transformación (introducción del vector en las células competentes). La clonación se rea-

liza sobre células competentes (para la transformación) de Escherichia coli (se pue-
den adquirir ya preparadas y se guardan congeladas). A estas células, una vez des-
congeladas en un baño con hielo, se les añade el producto de la ligación
mezclándolo con la propia pipeta. Se incuba en hielo durante 20 minutos, se le
somete a un choque térmico a 42 ºC durante 50 segundos (sin agitar), se devuel-
ve al hielo durante un par de minutos, se añade aproximadamente 1 mL de me-
dio de cultivo líquido (medio Luria-Bertani —LB—, o medio SOC) y se incuba
durante una hora y media a 37 ºC en agitación. Se prepara también un control
con el plásmido no ligado.
Cultivo de las bacterias transformadas para, a partir de cada colonia, obtener los
clones. Se toma el producto de la transformación y se transfieren unos 100 μL
a una placa de medio LB/ampicilina/XGal, incubándolo durante una noche a
37 ºC.
Las células transformadas, que contienen el fragmento de DNA clonado, dan lugar
a colonias blancas, ya que son capaces de crecer en medio con ampicilina y de-
gradar XGal, que es lo que caracteriza al plásmido introducido). Estas colonias
se seleccionan y se vuelven a plaquear en medio sólido LB/ampicilina/XGal, ob-
teniéndose con ello cada uno de los clones. Cada uno de ellos se deberá ampli-
ficar picando con un asa de siembra estéril en la colonia y juntando con la mez-
cla de polimerización para llevar al termociclador. Con el producto amplificado
se corre una electroforesis en gel de agarosa para comprobar que efectivamente
contienen el DNA que se pretendía clonar. El producto de PCR purificado po-
drá ser utilizado para su secuenciación y, con ello, para la asignación filogenéti-
ca del donante de DNA comparando la secuencia con las de las bases de datos
(véase técnica 24f).
Actualmente los vectores, las células competentes y la mayoría de los reactivos

pueden adquirirse comercialmente en kits comerciales de clonación (por ejem-
plo, pGEM®-T Easy Vector System de Promega).
198
Cuadro 11.6:
Molde Cantidad necesaria (ng)
Cantidades mínimas de DNA
Producto de PCR de 100-200 pb 10 monoespecífico (de una
misma secuencia)
Producto de PCR de 200-500 pb 20
necesarias para la
Producto de PCR de 500-1000 pb 30 secuenciación
Producto de PCR > 1000 pb 100
DNA de cadena sencilla 100
DNA de doble cadena 250
Técnica 24f. Secuenciación y asignación filogenética
Para la secuenciación se parte de un producto de PCR, que puede provenir tan- Lo más sencillo es
to de un clon, de una banda de DGGE, o del producto amplificado en la PCR de secuenciar el DNA en un
una muestra presuntamente uniespecífica. La secuencia a realizar debe ser única. laboratorio comercial
Es necesario cuantificar la cantidad de DNA que contiene el extracto para llevar
a secuenciar la cantidad correcta de DNA (cuadro 11.6). Cuando sea necesario, la
muestra se diluye con agua Milli-Q. Es necesario tener un producto de PCR bien
purificado, sin contaminación por fenol, RNA, proteínas u otros compuestos que
puedan interferir en el proceso de secuenciación. La pureza puede determinar-
se mediante el procedimiento anteriormente descrito en el apartado «procedi-
miento para cuantificar la cantidad y pureza del DNA extraído» (pág. 190) La pu-
rificación del producto de PCR previo al proceso de secuenciación se puede
realizar con kits comerciales (por ejemplo, con filtración o minicolumnas), aun-
que éste es un proceso que habitualmente también pueden realizar los laborato-
rios dedicados a la secuenciación, a los que se puede remitir el DNA purificado o
sin purificar, con las instrucciones oportunas al respecto.
Una vez secuenciado, el laboratorio de secuenciación remitirá los resultados en

el formato acordado, por lo que debemos asegurarnos de contar con el software
adecuado para poder leerlo. Por ejemplo, los secuenciadores ABI (Applied Bio-
systems) utilizan el programa Chromas 1.45.5
Al abrir el archivo se pueden presentar tres posibilidades.
a) Que la secuencia sea perfecta y cada posición tenga asignada correctamente

un nucleótido.
b) Que haya dos hebras secuenciadas, una del directo y otra del reverso. El soft-
ware es capaz de identificarlo y solucionarlo.
5
Se puede encontrar más información en http://www.technelysium.com.au/chromas.html
199
c) Que en muchas posiciones aparezca la letra «N», lo que significa que en la se-
cuenciación no se ha podido asignar un único nucleótido en esa posición.
Esto indica que probablemente teníamos una mezcla de distintas secuencias y
no es posible la secuenciación.
Si la secuencia es correcta, se puede alinear y comparar con otras existentes en

las bases de datos. Actualmente la herramienta más utilizada para la parte inicial
de este proceso es BLAST (Basic Local Alignment Search Tool).6
Los pasos a realizar son:
Una vez secuenciado el 1. Ir a Nucleotide BLAST.

DNA, se puede comparar 2. Introducir la secuencia o cargar directamente el archivo, darle un nombre a la
la secuencia con las búsqueda y seleccionar la base de datos donde buscar (por ejemplo, GenBank,
existentes en bases de
EMBL o ARB Silva Databases).
datos
3. Guardar el resultado y secuencias que interese alinear con la nuestra.
Una vez se tienen identificadas, se importan las secuencias con alta homología
con la nuestra usando programas como Bioedit.7 Mediante un programa de com-
paración de similitud de secuencias (por ejemplo, Clustal X) se procede a cons-
truir los árboles filogenéticos que indican la proximidad de la secuencia con otros
existentes en la base de datos. Muchos programas sirven tanto para manejar las
secuencias como para construir las relaciones filogenéticas, como el software ARB
(Ludwig et al. 2004).8
Técnica 25. Evaluación de la diversidad de los hongos acuáticos
La identificación de los Esta metodología se basa en la identificación de los hongos acuáticos a partir de
hifomicetos acuáticos se la observación de esporas (conidios). En los ríos, los conidios se pueden encon-
basa en la identificación trar dispersos en la columna de agua o concentrarse en las espumas, principal-
de las esporas al
mente después de zonas de corriente elevada o en períodos de lluvia (Gessner
microscopio
et al. 2003). Los conidios constituyen la fase asexuada de los hongos. La morfo-
logía de los conidios es generalmente sigmoide o tetrarradiada, lo que facilita su
identificación. Además del análisis morfológico de los conidios, son cada vez más
habituales las técnicas moleculares para evaluar la diversidad de los hongos acuá-
ticos, en particular la DGGE y RFLP (técnica 24), ya que no todas las especies
6
BLAST fue desarrollada inicialmente por el NCBI (National Center for Biotechnology Information). Más infor-
mación sobre esta herramienta en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi o http://www.ebi.ac.uk/blast/
7
Más información en http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html
8
Más información en http://www.arb-home.de/
200
de hongos esporulan en condiciones de laboratorio. La utilización de cebado-

res específicos de la región ITS del rDNA confirma que las comunidades de hi-
fomicetos acuáticos que colonizan sustratos vegetales están mayoritariamente
dominadas por Ascomycota, seguido de Basidiomycota y de Chytridiomycota
(Bärlocher 2007).
MATERIAL Y EQUIPAMIENTO
— Frascos de vidrio con tapa de rosca (10-50 mL).

— Cucharas.
— Botellas de vidrio de 1 L.
— Bolsas de plástico (con mallas de 0,5 a 10 mm).
— Placas de Petri de 9 cm y de 5 cm de diámetro.
— Agitador.
— Bombas de acuario con tubos de silicona.
— Sistema de filtración conectado a un sistema de vacío o a una trompa de agua.
— Portaobjetos y cubreobjetos.
— Microcopio óptico (160-400 aumentos).
— Microscopio invertido para los aislamientos (100-200 aumentos).
— Aguja de disección pequeña.
— Filtros con poro 5-8 μm (Millipore).
— Autoclave.
— Mechero Bunsen.
— Tubos de polipropileno para criopreservación (2 mL, Sarstedt).
— Cámara de flujo laminar.
— Bolsas de plástico tipo Zip lock para transporte de hojas.
— Nevera portátil.
REACTIVOS
— Azul de triptano en lactofenol a 60% (lactofenol: 10 mL de fenol, 10 mL de

ácido láctico y 10 mL de agua desionizada) o azul de algodón (cotton blue) en
ácido láctico a 0,1%.
— Agua desionizada.
— Agua del río filtrada y esterilizada en autoclave (120 ºC, 20 min).
— Agua-agar (2% p/v agar en agua desionizada, esterilizar en autoclave, verter
asépticamente en placas de Petri de 9 cm de diámetro y dejar solidificar).
— MEA (1% p/v de extracto de Malta y 1,5% p/v de agar en agua desionizada,
esterilizar en autoclave, verter asépticamente en placas de Petri de 5 cm de
diámetro y dejar solidificar).
— MEA con antibiótico (MEA preparado como antes, adicionar asépticamente
solución de estreptomicina y/o cloranfenicol (0,1% de concentración final)
201
previamente esterilizada por filtración, verter asépticamente en placas de Pe-

tri de 5 cm de diámetro y dejar solidificar).
— FAA (etanol 70%, acido acético glacial, 37% formaldehído, 1:3:1 / v/v/v).
— Etanol 96%.
— Formaldehído 37%.
— Glicerol (10-30%) esterilizado en autoclave.
PROCEDIMIENTO
Toma de muestras
Las esporas de Los hifomicetos acuáticos se pueden encontrar en ríos de pequeño orden bordea-
hifomicetos son dos por vegetación, aunque también en grandes ríos (Pascoal et al. 2005). La se-
especialmente lección de los sitios y tiempos de muestreo deben hacerse de acuerdo con los ob-
abundantes en las
jetivos del estudio, y así los hongos acuáticos se pueden muestrear de distinta
espumas que se forman
naturalmente en los ríos manera:
a) a partir de las espumas,

b) a partir de la columna de agua,
c) a partir del material vegetal acumulado en el lecho fluvial.
a) Muestreo de los hongos acuáticos a partir de las espumas

Las espumas concentran un elevado número y diversidad de conidios (fig. 11.7),
permitiendo conocer la diversidad de estos hongos, aunque no su abundancia.
1. Recoger una muestra de espuma densa mediante una cuchara y transferir-
la a un frasco pequeño con tapa de rosca.
2. Eliminar el exceso de agua a fin de concentrar la muestra.
3. Transportar la espuma con sus conidios en una nevera a 4 ºC y proceder lo
más rápido posible a su observación, para evitar que las esporas germinen.
4. Parte de las espumas puede ser fijada con una gota de FAA, lo que permite pre-
servar las muestras durante años. Alternativamente, las espumas pueden ser fi-
jadas durante algunos meses con etanol al 96% o con formaldehído al 2-4%.
Para muestras b) Muestreo de los hongos acuáticos a partir de la columna de agua

cuantitativas de conidios 1. Recoger 1 L de agua del sitio de muestreo.
es preferible filtrar agua 2. Transportar en una nevera a 4 ºC hasta el laboratorio.
Esta técnica es cuantitativa, pero tiene la desventaja de necesitar un gran volumen

de agua para encontrar una muestra representativa de la diversidad local.
c) Muestreo de los hongos acuáticos asociados a detritus vegetales

1. Preparar bolsas de plástico (malla 0,5-10 mm) que contengan hojas senes-
centes y dejar colonizar en el río durante dos semanas (véase técnica 26).
202
Figura 11.7:
Espuma en el río donde se
concentra gran densidad
de conidios de hifomicetos
acuáticos
2. Alternativamente, se pueden recoger detritus vegetales del lecho de los ríos,

tales como hojas en descomposición.
3. Los detritus vegetales deben ser colocados en sacos de plástico y transpor-
tados en la nevera a 4 ºC hasta el laboratorio.
Procedimiento en el laboratorio
a) Espumas
1. Colocar una gota de espuma en el portaobjetos y dejar secar al aire.
2. Colocar una gota de azul de algodón o azul de triptano en el cubreobjeto,
y aplicarlo directamente sobre el portaobjeto.
3. Observar al microscopio óptico (entre 160 y 400 aumentos).
b) Agua
1. Filtrar de 250 a 1000 mL de agua, dependiendo de la densidad de coni-
dios en suspensión, a través de filtros (47 mm de diámetro, y 5-8 μm de poro,
Millipore). No se aconseja filtrar volúmenes muy grandes, ya que la acu-
mulación de sedimentos dificulta identificar los conidios.
2. Cortar el filtro de acuerdo con el tamaño del portaobjetos.
3. Teñir el filtro con azul de algodón o azul de triptano.
4. Colocar el cubreobjeto.
5. Observar al microscopio óptico.
c) Material vegetal
1. Lavar las hojas con agua desionizada para eliminar los sedimentos.
203
Figura 11.8:
Frascos con aireamiento de
bombas de acuario (a) o en
agitador (b)
2. Colocar las hojas en frascos Erlenmeyer con agua del río previamente fil-
trada y esterilizada o agua desionizada esterilizada.
3. Airear los frascos mediante bombas de acuario o un agitador para inducir
la esporulación (fig. 11.8).
4. Una vez transcurridas 24-48 horas, filtrar volúmenes adecuados de agua (fil-
tros de 5-8 μm de poro).
5. Cortar el filtro de acuerdo con el tamaño de los portaobjetos.
6. Añadir colorante (azul de algodón o azul de triptano) al filtro.
7. Cubrir con los cubreobjetos.
8. Observar al microscopio óptico.
Figura 11.9:
Conidios de hifomicetos
acuáticos provenientes de
espumas observadas al
microscopio óptico
33,63 μm
204
80 µm Figura 11.10:
Conidios de hifomicetos
acuáticos de la colección
del Departamento de
55,08 µm
Biología de la Universidad
de Minho (Braga, Portugal)
39,25 µm
86,44 µm
40 µm 72,04 µm
24,96 µm
13
1,2
3µ 36,1 µm
m
Nota: a) Alatospora acuminata. b) Varicosporium elodeae. c) Geniculospora grandis. d) Clavariopsis aquatica. e) Lunulos-
pora curvula. f) Articulospora tetracladia. g) Anguillospora filiformis. h) Heliscus lugdunensis. i)Heliscus submersus.
Identificación
La identificación se hace al microcopio óptico con una ampliación que, general- La identificación de
mente, varía entre 160 y 400 aumentos, dependiendo del tamaño de los conidios. esporas al microscopio
Los conidios tienen dimensiones que pueden variar entre 12 μm y 400 μm (figs. tiene sus limitaciones.
Para ir más allá hay que
11.9 y 11.10). Las formas sigmoides son las más difíciles de identificar. Existen po-
aislar los hongos en
cas claves de identificación para hifomicetos acuáticos; se aconseja consultar In- cultivos puros
gold (1975) o Gulis et al. (2005) para climas templados, o Santos-Flores y Betan-
court-López (1997) para climas tropicales. Algunos hongos son difíciles de
identificar sobre la base solamente del análisis de los conidios. Para el estudio más
detallado de la taxonomía, ecofisiología o toxicología de los hongos acuáticos, es
preferible mantenerlos en cultivos puros.
Aislamiento de los hongos en cultivo puro

El aislamiento requiere entrenamiento y tiempo:
1. Esparcir una gota de la suspensión de conidios provenientes de las espumas
o de los detritus vegetales en cajas de Petri con agua-agar.
2. Observar los conidios al microscopio invertido.
205
3. Seleccionar el conidio que queramos, y cortar el agar a su alrededor con una

aguja de disección.
4. Transferir el pedazo de agar con el conidio a una caja de Petri con MEA y an-
tibiótico.
5. Incubar a 15-18 ºC y monitorizar el crecimiento del hongo.
6. Cuando el hongo tenga cerca de 1 cm, y si no se observa contaminación por
bacterias, transferir un pedazo del cultivo a MEA y otro pedazo a un frasco Er-
lenmeyer con agua para inducir la esporulación (como se indica anteriormen-
te).
7. Controlar los conidios liberados de cada cultivo puro durante cerca de dos
semanas mediante la observación microscópica de una gota de la suspensión
teñida (fig. 11.10).
8. Si se sospecha de contaminación bacteriana, transferir de nuevo un pedazo
del cultivo a una nueva placa de Petri con antibiótico.
9. Efectuar tantos aislamientos de conidios a partir del agua-agar como sea po-
sible. Se pueden colocar las restantes placas de agua-agar a 8-10 ºC para re-
trasar el crecimiento de los hongos.
10. Cuando se obtenga un cultivo puro en MEA, se pueden almacenar pedazos del
cultivo en frascos de vidrio con tapón de rosca esterilizados y que contengan
agua destilada estéril a 18 ºC. También se pueden guardar pedazos de los cul-
tivos en tubos de criopreservación estériles con glicerol (10-30%) y a –80 ºC.
Técnica 26. Tasa de esporulación
La tasa de esporulación Las tasas de esporulación de hifomicetos acuáticos informan sobre la actividad re-
mide la actividad productora de los hongos en hojas en descomposición. En general las hojas son
reproductora de los colonizadas inmediatamente después de caer en el agua del río. Los hifomicetos
hongos
crecen rápidamente y en poco tiempo empiezan a canalizar energía para la re-
producción, de lo que resulta la producción de una gran cantidad de esporas.
Esta actividad depende de la calidad del sustrato y de la cantidad de nutrientes o
contaminantes en el agua. La tasa de esporulación baja muy rápidamente después
de la primera o segunda semana en descomposición. Aunque se pueden usar sus-
tratos naturales para obtener esporulación en laboratorio, es recomendable po-
ner hojas senescentes en bolsas y depositarlas durante un tiempo determinado en
el río para que sean colonizadas por los hongos y proceder a la esporulación en
condiciones de laboratorio.
MATERIAL
— Bolsas de plástico (con mallas de 0,5 a 10 mm).

— Hojas de árbol senescentes.
206
— Spray para remojar las hojas.

— Bandejas de plástico o aluminio.
— Cuerdas para amarrar las bolsas en el río.
— Sacabocados o tijeras.
— Pinzas.
— Frascos Erlenmeyer de 250 mL.
— Papel de aluminio.
— Agua de río filtrada, agua destilada esterilizada o agua con nutrientes.
— Agitador orbital o aireador de acuario.
— Conexiones en «T».
— Puntas desechables de pipetas de 5 mL.
— Detergente líquido.
— Sistema de filtración.
— Filtros con poros de 5 μm (Millipore MF o equivalente).
— Estufa (50 ºC).
— Balanza, +1 mg de precisión.
— Microscopio (recomendado ocular de 10X y objetivo de 40X; el objetivo de
16X puede ser útil para una visión general de los filtros).
— Portaobjetos y cubreobjetos.
— Azul de triptano en lactofenol a 60% (lactofenol: 10 mL de fenol, 10 mL de
ácido láctico y 10 mL de agua desionizada) o azul de algodón (cotton blue) en
ácido láctico a 0,1%.
— Bolsas de plástico tipo Zip lock para transporte de las hojas.
— Nevera portátil.
PROCEDIMIENTO
Preparación del material

Recoger hojas senescentes de árboles, ya sea directamente de los árboles durante Para el estudio de los
la senescencia, o del suelo del bosque de ribera. Es mejor usar hojas de un único heterótrofos sobre hojas
árbol para minimizar la variabilidad. En caso de usar hojas del suelo deben ser re- es importante utilizar
hojas a punto de caer,
cientemente caídas, ya que rápidamente son colonizadas por hongos terrestres. Si
o recién caídas
la caída de hojas es continua, lo mejor es usar trampas, que pueden ser plásticos
colocados directamente en el suelo o amarrados entre árboles (fig. 11.11), en las
que se dispone alguna piedra en su centro para que las hojas se deslicen hacia él.
Se deben hacer agujeros en esta parte central a fin de impedir la acumulación de
agua, que podía alterar la calidad de las hojas. Después de ser recogidas, las ho-
jas se deben secar al aire y guardar en lugar seco.
Preparación de las hojas para colocación en el río

1. Poner unos 3 g de hojas, o entre 2 y 8 hojas, en una bandeja de plástico o alu-
minio.
207
Figura 11.11:
Trampas para recolección de
hojas senescentes
de árboles
Foto: A. Encalada.
2. Humedecer las hojas con un spray a fin de que queden flexibles y no se frag-
menten con la manipulación.
3. Poner las hojas dentro de las bolsas y guardar en frío hasta que sean puestas
en el agua. No se deben dejar más de 24 horas para evitar la actividad micro-
biana.
4. Amarrar las bolsas en grupos de cuatro y disponerlas en zonas de acumulación
natural de hojas (fig. 11.12). Amarrar a un tronco en la orilla o a piedras.
Figura 11.12:
Hojas en las bolsas antes
de ser colocadas en el río
Foto: M.F. Feio.
208
5. Las tasas de esporulación se pueden medir al cabo de una fecha determinada, por
ejemplo, una semana. Sin embargo, para conocer la evolución de la actividad de
hifomicetos acuáticos, se disponen varias bolsas en el río, que se recolectan en fe-
chas determinadas. Por ejemplo, después de 2, 5, 10, 20, 40 y 60 días (véase téc-
nica 20). El tiempo adecuado varía en función de las condiciones ambientales.
Procedimiento en el laboratorio
1. Sacar las bolsas del agua e introducirlas en una bolsa tipo Zip lock con un
poco de agua del río. Transportar las bolsas hasta el laboratorio en frío (ne-
vera portátil).
2. En el laboratorio, lavar las hojas suavemente con agua destilada o agua del río
para eliminar sedimentos o invertebrados. Debe evitarse usar agua de la red ya
que tiene cloro y puede inhibir la actividad microbiana.
3. Cortar pedazos de hojas (cerca de 10 cm2) mediante tijeras o sacabocados
(véase fig. 11.3) y colocarlos en frascos Erlenmeyer. Sacar de cada bolsa de
5 a 8 trozos o círculos que deberán ser recogidos de todas las hojas, para mi-
nimizar las variaciones entre hojas.
4. Poner las muestras en un frasco Erlenmeyer usando pinzas finas.
5. Limpiar el material de preparación con alcohol cuando se pase de una mues-
tra a otra a fin de evitar contaminaciones con hifas y esporas.
6. Añadir a los frascos Erlenmeyer 15 mL de agua destilada o agua del río filtra-
da (0,5 μm de poro).
7. Poner los frascos Erlenmeyer en un agitador orbital a una velocidad que pro-
voque una ola de cerca de 1 cm de alto. Si no hay agitador orbital, conectar
una bomba aireadora de acuarios, usando una punta desechable de pipeta de
5 mL con el objetivo de crear una pequeña turbulencia (véase la fig. 11.8; téc-
nica 25). Para comparar resultados es imprescindible usar siempre las mismas
condiciones, ya que la tasa de esporulación depende de la turbulencia.
8. Mantener estas condiciones durante 24 a 48 horas. Es importante anotar el Las hojas se incuban en
tiempo exacto, pues los resultados se expresan por unidad de tiempo. Es tam- el río, y posteriormente
bién de máxima importancia controlar la temperatura. Para ello, se puede en el laboratorio, en un
agitador orbital
mantener una temperatura similar a la del río donde el material fue recogido,
o bien usar una temperatura constante próxima al promedio anual de las
aguas en el río. Esta última opción permite comparar resultados de experi-
mentos hechos en cualquier época del año.
Preparación para la observación

1. Al final del período de incubación, sacar los discos de hojas con unas pinzas
largas, e introducirlos en el horno en cajas hechas con papel de aluminio. Se-
car a 50-60 ºC hasta peso constante (en general, de 2 a 3 días).
2. Añadir 1 o 2 gotas de detergente a los frascos Erlenmeyer, donde se encuentra
la suspensión de esporas.
209
3. Filtrar (5 μm de poro) un volumen apropiado de la suspensión, limpiando va-

rias veces el Erlenmeyer (en caso que todo el volumen sea filtrado) con agua,
así como las paredes del vaso de filtración.
4. Colocar el filtro en una placa de Petri pequeña, añadir unas gotas de azul de
triptano hasta que todo el filtro quede húmedo, pero sin que se inunde.
5. Secar a 50-60 ºC durante aproximadamente una hora. Los filtros así prepara-
dos se pueden guardar durante meses.
Conteos
1. Colocar el filtro en un portaobjetos. Si el filtro es mayor que el portaobjetos,
cortar el filtro por la mitad.
2. Poner un cubreobjetos y observar a 400X. Contar el número de esporas por
cada campo de microscopio (fig. 11.13).
3. Contar un mínimo de 100 esporas y 30 campos de microscopio.
4. Determinar el área del campo de microscopio, el área del filtro donde están
retenidas las esporas (ligeramente más pequeña que el área total del filtro).
5. Las tasas de esporulación E (número de esporas por día y por mg de hoja) se es-
timan mediante la expresión:
n A /a
E= (11.3)
t p
donde n: número promedio de esporas por campo de microscopio, a: área del

campo de microscopio (mm2), A: área del filtro (mm2), t: tiempo (días), y p: peso
total (mg) de los discos de hojas (alternativamente, área total de los discos).
Figura 11.13:
Espora de Casaresia
sphagnorum
Foto: V. Ferreira.
210
Otras consideraciones
El número de esporas producido depende de las condiciones a las que las hojas
estuvieron expuestas, de la calidad del sustrato y del tiempo de incubación. Valo-
res entre 75 y 7000 esporas por g de hoja y por día han sido descritos en la lite-
ratura (Suberkropp 2001, Bärlocher 2005).
Técnica 27. Actividades enzimáticas extracelulares
Las enzimas extracelulares son sintetizadas principalmente por bacterias y hon- Las actividades
gos pero también por algunas algas y protozoos. Estas enzimas están ligadas a la enzimáticas
superficie de la célula microbiana (o en el espacio periplasmático en las bacterias extracelulares son una
expresión del
gramnegativas) y actúan fuera de la célula (Chróst 1991). En general, la expre-
metabolismo microbiano
sión «actividad enzimática extracelular» se refiere a las enzimas ligadas a las cé- heterotrófico
lulas, pero también a las posibles enzimas libres (formando parte de la matriz po-
limérica en el biofilm o ligadas a partículas detríticas). El término ectoenzima se
refiere específicamente a las enzimas ligadas a las células. Estas enzimas descom-
ponen moléculas de alto peso molecular a moléculas de bajo peso molecular, que
pueden incorporar directamente los microorganismos para ser metabolizadas y
usar como fuente de materia orgánica (C, N y P). La tasa de descomposición de
la materia orgánica depende directamente de esta actividad enzimática.
En la descomposición de la materia orgánica intervienen tanto enzimas hidrolíti-

cas como oxidativas (peroxidasas, fenoloxidasas, responsables de la descomposi-
ción de lignina). En este capítulo se describe la técnica para la medida de activi-
dades enzimáticas hidrolíticas mediante fluorescencia. Esta técnica se basa en la
utilización de compuestos complejos (sustratos artificiales), que contienen el en-
lace sobre el cual actúa la enzima cuya actividad queremos medir. En un extremo
de este enlace hay una molécula fluorescente (metilumbeliferona, MUF, o ami-
nometilcumarina, AMC), que emite fluorescencia solamente cuando está libre
(gracias a la acción de la enzima; fig. 11.14). Las muestras se incuban con este sus-
trato artificial y se mide la fluorescencia final (es decir, los enlaces que han sido
rotos por causa de la actividad de las enzimas presentes en la muestra). Los sus-
H CH2OH H Figura 11.14:

CH2OH
O O O OH HO O O Diagrama de la reacción que
O O β -Glucosidasa OH tiene lugar durante la
+
OH +H2O medición de la actividad de
H H HO H H
HO la enzima β-glucosidasa
H CH3 OH H CH3
OH
Nota: El sustrato artificial 4-metilumbeliferil-β-D-glucósido se descompone en D-glucosa y MUF gracias a la ac-
tividad de la (β-D- glucosidasa).
211
Cuadro 11.7:
Relacionada con
Enzimas extracelulares más Enzima Sustrato artificial el metabolismo de Concentración
habituales en estudios de
ecología fluvial β-D-glucosidasa MUF-β-D- C (último paso de la 0,01-0,5 mM
(EC 3.2.1.21) glucopiranósido (o descomposición de
MUF-β-D-glucósido) celulosa, celobiosa o
pequeños oligómeros
con enlaces β-D-glucosa)
β-D-xilosidasa MUF-β-D- C (último paso de la 0,01-0,5 mM
(EC 3.2.1.37) xilopiranósido (o descomposición de
MUF-β-D-xilósido) hemicelulosa,
descomposición
de xilobiosa o
xilooligosacáridos)
Celobiohidrolasa MUF-celobiósido C (degradación de 0,1-5 mM
(EC 3.2.1.91) celulosa)
Leucina- Leu-AMC N, C (descomposición 0,01-0,5 mM
aminopeptidasa (L-leucina-4-metil-7- de péptidos)
(EC 3.4.11.1) cumarinilamida)
Fosfatasa MUF-fosfato P (descomposición de 0,01-0,5 mM
(EC 3.1.3.1-2) ésteres de fosfato)
MUF-N-acetil-β-D- Degradación y síntesis 0,01-0,5 mM
β-N-acetilglucosaminidasa
glucosaminida de la pared fúngica.
Degradación de quitina
por parte de bacterias
Quitinasa MUF-β-N,N’,N’’- Descomposición de 0,01-0,5 mM
triacetilquitotriósido quitina
(MUF-[GlnNAc]3
Nota: Se incluye el nombre de la enzima y el código de la EC (Enzyme Commission, clasificación universal de las en-
zimas), el sustrato artificial que se utiliza para su medición, el metabolismo en el cual está involucrada la enzima
y el rango de concentración de sustrato artificial habitualmente utilizado en estudios en sistemas acuáticos.
tratos artificiales más utilizados y que existen en el mercado se resumen en el cua-

dro 11.7. En la mayoría de estudios se miden actividades enzimáticas extracelula-
res potenciales, es decir, en condiciones de saturación de la enzima, lo cual per-
mite comparar muestras en distintas condiciones y en función del tiempo, pero
dificulta acercar a la actividad real en la naturaleza. Por ello, previamente al pro-
tocolo hay que realizar la cinética enzimática para determinar qué concentración
utilizar para el estudio.
MATERIAL
— Viales de 100-125 mL de vidrio ámbar (o de polietileno) para guardar las so-

luciones de sustrato artificial y de los patrones madre de MUF y/o AMC.
— Viales de vidrio (de 15-30 mL) o frascos de centrífuga (tipo Falcon de 15 mL)
para realizar la incubación.
— Matraces de 100 mL para preparar las soluciones patrón.
— Matraces de 1000 mL para preparar la solución tampón.
212
— Agitador para incubar los viales junto con los patrones y blancos, con control
de temperatura.
— Centrífuga (necesaria para medidas en muestras con material en suspensión
como suele ocurrir con el sedimento).
— Pipetas automáticas.
— Sustratos artificiales de la o las enzimas (cuadro 11.7).
— Patrón de MUF o AMC (según la actividad medida).
— Glicina (en polvo).
— Hidróxido sódico (lentejas).
— Agua Milli-Q.
PREPARACIÓN PREVIA DEL MATERIAL
Preparación de los sustratos artificiales fluorescentes

Los sustratos artificiales fluorescentes se diluyen en agua destilada y autoclavada y
en viales ámbar (o cubiertos de la luz) para obtener una concentración de 10 mM.
Esta solución concentrada se guarda en el congelador (–20 ºC), se descongela y
vuelve a congelar de inmediato cada vez que se utiliza. Algunos sustratos artificia-
les de MUF son de difícil disolución, como la MUF-β-glucósido y la MUF-celobió-
sido, y es necesario añadir 1-2 mL de hidroximetil éter en el sustrato en polvo para
facilitar su disolución en agua y dejarlo unas 10-12 horas, en fresco (4 ºC) y a os-
curas para minimizar la fotodegradación. En algún caso también será necesario so-
nicar la solución (fracciones de 5 minutos máximo con el fin de evitar el aumen-
to de temperatura) para mejorar la disolución del sustrato en agua.
Preparación de patrones concentrados de MUF y AMC

Soluciones de MUF y AMC se disuelven con agua destilada y autoclavada a una
concentración de 10 000 μM y se guardan al congelador. Se descongelan cada vez
que sea necesario preparar soluciones patrón.
Preparación de la solución tampón de glicina 0,05 M, pH = 10,4

Para obtener 1000 mL se toman 196,5 mL de glicina 0,2 M (18,76 g en 250 mL)
y 803,5 mL de NaOH 0,2 M (8 g en 1000 mL). La solución tampón se prepara con
agua destilada y se controla el pH final. Se puede guardar a temperatura am-
biente en un recipiente de vidrio no expuesto a la luz.
Determinación previa de la concentración de sustrato artificial: cinéticas enzimáticas

Para medidas rutinarias se utilizan concentraciones de sustrato artificial en con- Es esencial determinar
diciones de saturación. Para analizar las actividades enzimáticas extracelulares la cinética de la enzima
potenciales hay que analizar previamente el comportamiento cinético de esta cuya actividad queremos
medir
actividad. Para ello hay que realizar incubaciones a concentraciones crecientes
del sustrato artificial (por ejemplo, 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 y 0,5 mM, en función
213
de la muestra y la enzima que estemos midiendo, véase el cuadro 11.7). Los re-
sultados se ajustan a una curva hiperbólica de Michaelis-Menten y se calcula la
constante de saturación (Km) y la velocidad máxima (Vmax.). Estos valores permi-
ten decidir la concentración de saturación a utilizar en los ensayos de medidas
potenciales. En la mayoría de trabajos con medidas de actividades enzimáticas
potenciales esta concentración de saturación se encuentra alrededor de los
0,3 mM para comunidades bentónicas (un poco superior para la celobiohidro-
lasa, hasta 1 mM).
PROCEDIMIENTO
Recogida de muestras en el campo

El procedimiento de muestreo es básicamente el mismo que el descrito para el
conteo de bacterias. Para las muestras bentónicas, debe considerarse un mínimo
de cinco réplicas para cada actividad.
1. Muestreo según el cuadro 11.1. Las muestras bentónicas se guardan en agua

del río filtrada (por filtros de nailon de 0,2 μm de diámetro para evitar conta-
minar la muestra bentónica con bacterias planctónicas) con un volumen co-
nocido para que queden cubiertas (4-10 mL es suficiente). Es mejor utilizar
agua del mismo río para no alterar las condiciones osmóticas y de nutrientes.
Si el río es de cabecera y tiene una densidad bacteriana en transporte muy
baja, es posible utilizar directamente agua del río sin filtrar.
2. Guardar las muestras bentónicas o de agua en viales estériles y en frío (nevera
portátil) hasta el laboratorio. Empezar la incubación tan pronto como sea po-
sible (el mismo día de muestreo o como máximo el día siguiente, guardando
siempre las muestras en frío). Antes de empezar la incubación, sacar las mues-
tras de la nevera para que adquieran la temperatura ambiente.
Extracción de la muestra
Siempre que se pueda se Para medir las actividades enzimáticas de las comunidades adheridas o de biofilm
utiliza la comunidad (como cualquier otra medida metabólica) es preferible utilizar la comunidad mi-
microbiana intacta, y no crobiana intacta y no un extracto en suspensión. Por ello, se utilizan sustratos ar-
un extracto en
tificiales colonizados o muestras de hojarasca y sedimento (cuadro 11.1). En ca-
suspensión
sos de muestras epífitas es muy complicado obtener un círculo de muestra
representativa del total (fig. 11.3), por lo que, solamente en estos casos, se extrae
la comunidad microbiana adherida.
Sumergir la muestra en un vial con un volumen conocido que la cubra, con agua
del río filtrada por 0,2 μm de poro y sonicar en un baño de ultrasonidos (por
ejemplo, tres veces 2 minutos, comprobar al microscopio si aún se observan algas
adheridas, mantener siempre el mismo tiempo de sonicación). Tomar una sub-
214
muestra del líquido extraído para el análisis de la actividad. Tomar también una
muestra para el control de la fluorescencia de la muestra.
Incubación
1. Preparar los materiales a incubar: muestras (bentónicas con un volumen co-
nocido de agua y/o muestras de agua o del extracto de una muestra epifítica),
blanco (agua Milli-Q, para cada actividad a medir, que permite controlar la de-
gradación abiótica del sustrato artificial), control (muestra de agua del río
para controlar la fluorescencia del agua), patrones de MUF o de AMC (en fun-
ción de la actividad a medir). Es indicado que el volumen sea el mismo en to-
das las muestras a incubar.
2. Añadir a las muestras y al blanco un volumen del sustrato artificial (por ejem-
plo, de MUF-fosfato para medir fosfatasa) para tener la concentración final de
saturación obtenida con la curva de saturación previa. En las muestras control
no hay que añadir sustrato artificial alguno para la actividad (fluorescencia na-
tural del agua).
3. Colocar las muestras en un agitador, a oscuras, y con control de la temperatu-
ra. La temperatura de incubación puede ser la misma que la del río o, alterna-
tivamente, se pueden realizar las incubaciones siempre a temperatura estándar
de laboratorio (20 ºC). El tiempo de incubación es de alrededor de 1 hora. Para
muestras con actividades muy altas pueden utilizarse tiempos de incubación
menores y también tiempos más largos para muestras poco activas. La lineali-
dad de la actividad enzimática con el tiempo se mantiene durante los primeros
90 minutos, por lo que es conveniente no realizar incubaciones más largas. Es
importante calcular con exactitud el tiempo de incubación para tener una bue-
na medida de la actividad, y conviene utilizar siempre el mismo tiempo de in-
cubación para las muestras del mismo río.
4. Añadir tampón de glicina 0,05 M de pH = 10,4, que desnaturaliza las proteínas
y detiene la reacción enzimática. Este tampón básico también convierte el MUF
y el AMC en sus formas aniónicas más fluorescentes. Se añade el tampón a to-
das las muestras, controles, blancos y patrones con una relación ½ v/v tam-
pón/muestra.
5. En caso de tener muestras turbias (por ejemplo, muestras de sedimento), des- La incubación se detiene
pués de añadir el tampón, centrifugar levemente (por ejemplo, 4 minutos a con tampón de glicina
2000-3000 rpm). Tomar el sobrenadante para medir la fluorescencia.
Medida de la fluorescencia
Medir la fluorescencia a 365 nm de excitación y 455 nm de emisión para el MUF
y 364/445 excitación/emisión para el AMC en el fluorímetro, con cubeta de cuar-
zo de 10 mm. La cuantificación de la fluorescencia se realiza con soluciones pa-
trones de MUF y AMC, y calculando la recta de calibración. La intensidad de la
fluorescencia del blanco del sustrato y del blanco del agua se resta de todas las
215
muestras para corregir la posible hidrólisis no enzimática del sustrato y la pre-

sencia de compuestos fluorescentes en el agua.
Cálculo de las actividades enzimáticas

Las actividades enzimáticas se expresan como nmoles (o μmoles) de MUF o AMC
liberados por hora y cm2 de biofilm (epilítico) o de superficie proyectada del sus-
trato que se mide (epipsámico, epifítico) o por peso seco (epifítico) o por L
(agua). En algunos casos (excluyendo la fosfatasa, que también es algal), la acti-
vidad enzimática específica se puede calcular por célula bacteriana, a pesar de
que no se conoce la fracción de esta comunidad que, efectivamente, contribuye
a la actividad metabólica analizada (Karner et al. 1992). También se puede ex-
presar la actividad enzimática por unidad de biomasa microbiana (contenido de
carbono microbiano del biofilm) o por el contenido de proteínas.
Las actividades enzimáticas pueden variar en función de múltiples factores, y espe-

cialmente de la cantidad y calidad de materia orgánica. El rango de valores es muy
amplio y varía en función de la enzima que se mida (Romaní y Marxsen 2002).
11.3. Bibliografía
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Conceptos y técnicas

Separata del capítulo 11

La biota de los ríos:

Primera edición: abril 2009

© los autores, 2009

La biota de los ríos:

ANNA M. ROMANÍ, JOAN ARTIGAS, ANTONIO CAMACHO,

En los ecosistemas fluviales se pueden encontrar microorganismos heterótrofos Entre los

Las bacterias bentónicas colonizan especialmente rocas, cantos rodados y sedimen-

sidad de la comunidad bacteriana y la variedad de sus capacidades metabólicas le

La forma de vida de los hongos acuáticos es muy distinta de la de las bacterias, ya

la diversidad microbiana (técnica 24 y técnica 25). Como medida de la actividad de

11.2. Toma de muestras de microorganismos heterotróficos

Para evitar la contaminación, la toma de muestras para el estudio de microorganis- El muestreo de

Técnica 22. Densidad y biomasa de bacterias fluviales

Para muestras planctónicas, el método más comúnmente utilizado es la tinción

2. Fijar las muestras bentónicas o planctónicas con formol al 2% y guardar en via-

a) Sonicación. Las muestras se sonican en un baño de ultrasonidos (40 W de

Estos tres métodos se pueden combinar. Es importante utilizar para un estudio

Alternativamente, y para muestras de comunidades muy delgadas sobre sustratos

Tinción y preparación de la muestra para su observación al microscopio

de análisis de imágenes se pueden fotografiar las muestras y realizar el conteo

Nº de bacterias n ( A /at ) d (Vm /Vf )

donde n: número total de bacterias contadas por filtro, A: área de filtración

CÁLCULO DE LA BIOMASA BACTERIANA

Técnica 23. Biomasa de hongos

fase sólida (como se describe en este protocolo) o alternativamente mediante se-

Material para el muestreo en el campo

Material y equipamiento de laboratorio

Extracción de lípidos y saponificación1

Acondicionamiento de los cartuchos para extracción en fase sólida

vulas de los cartuchos y regular la presión en el sistema de vacío hasta obtener

Elución del ergosterol

Análisis con el HPLC

Figura 11.5: 0,8 0,8

Grava 40* Artigas et al. (2004)

Cálculo de la biomasa de hongos

Técnica 24. Comunidad microbiana: métodos moleculares

Con Amplificación Clonaje Secuenciación Comparación de secuencias en bases de Clonaje y secuenciación

del DNA (PCR) clone libraries)

Fuente: Adaptado de Dorigo et al. 2005.

de las comunidades cuya diversidad se desea estudiar, y se realiza una extrac-

Los protocolos detallados de estas técnicas moleculares aquí descritas pueden

A: Muestreo y procesado de muestra planctónica. B: Muestreo y procesado de muestra bentónica. C: Extrac-

Técnica 24a. Toma, procesado y conservación de muestras

Las muestras planctónicas se trasladan rápidamente al laboratorio para su filtra-

En el caso de no realizar fraccionamiento, la filtración completa de la muestra se

Técnica 24b. Extracción, purificación y cuantificación del DNA

Los pasos principales a realizar consisten en la homogenización de la muestra, la

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA DE MICROORGANISMOS PLANCTÓNICOS

Los pasos 1 a 12 constituyen el proceso de extracción del DNA y a partir del 13

1. En el caso de muestras procedentes de raspado, se realiza la extracción a par-

14. Centrifugar a 13 000 rpm durante 5 minutos.

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA DE MICROORGANISMOS EMBEBIDOS

1. Poner entre 50 y 300 mg de sedimentos (peso fresco) en un tubo Falcon de

7. Incubar a 50 ºC durante 40 minutos. Agitar por volteado cada 10 minutos.

PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR LA CANTIDAD Y PUREZA DEL DNA EXTRAÍDO

1. En la microcubeta, añadir 500 μL de tampón TE.

[DNA ] (mg/mL) = A260 /0, 02 (11.2)