Monografía para Optar Al Titulo de Licenciado Químico-Farmacéutico Integrantes

Potencia de antibióticos por Método Cilindro-Placa, MINSA
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA
UNAN-LEON
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
CARRERA DE FARMACIA
Efectividad del método Cilindro-Placa, esterilizando solamente el material volumétrico que entra
en contacto con el microorganismo de prueba. Managua 2009.
Monografía para optar al titulo de Licenciado Químico-Farmacéutico
Integrantes:
Br. Luís Alberto Lindo Rojas.
Br. Francisco Javier López Cáseres.
Br. Carlos Eduardo López Villegas.
Tutoras: Msc. Lissett Arauz Molina.
Lic. Patricia Baca.
Asesora: Lic. Mirna Mendoza.
LINDO ROJAS LUIS, LOPEZ CASERES FRANCISCO, LOPEZ VILLEGAS CARLOS. Página 1
AGRADECIMIENTO
Le damos gracias a Dios, por permitir mantenernos con salud y fe todo el periodo de estudio,
por iluminar nuestras mentes, ya que sin su luz seria imposible haber hecho esta monografía.
A nuestros padres por apoyarnos en cada momento que necesitáramos de su ayuda

económica o moral, la que fue incondicional en nuestras vidas, por estar con nosotros siempre
y por demostrarnos su amor desinteresado.
A nuestros familiares y amigos que de una u otra manera se hicieron presentes para darnos
una mano cuando la necesitáramos, por darnos siempre la aprobación y el respeto que
merecemos y por preocuparse siempre por nuestro bienestar.
A Msc. Lissett Arauz Molina por su abnegada labor de guiarnos durante nuestro trabajo
monográfico e impulsarnos para que este se llevara a cabo de manera exitosa. A ella gracias
por el tiempo dedicado.
A Lic. Nubia Blanco Sampson por darnos la oportunidad de realizar nuestro tema de
investigación en el Laboratorio que dirige.
Al personal del LNCCM por habernos recibido y darnos su apoyo en el transcurso de este
trabajo monográfico, Lic. Mirna Mendoza Pérez, Lic. Patricia Baca Solís, Lic. Santiago
Mejía Sánchez y el personal de apoyo Sra. Francisca Alegría Castellón Ana, Sr. Alberto
Vásquez Cruz.
Dedicatoria
Le dedico a Dios esta monografía ya que el ha sido uno de mis mayores motivos
de felicidad a lo largo de este tiempo, siempre ha sido el que me a acompañado
cuando he necesitado fuerzas para seguir adelante, me sostuvo cuando necesite
un apoyo y siempre hizo salir el sol sobre mi cabeza, dándome el despertar de
cada día para demostrar que nunca se olvidó de mí.
A mis padres les dedico mi monografía para demostrarles que siempre valore
sus esfuerzos, dedicación y trabajo que sin cesar lo hacían, le dedico todo el
trabajo que he hecho de manera especial ya que quisiera de cualquier forma
honrar su empeño que desde pequeño pusieron en mí.
A mis hermanos que aprecio con mucho amor, ya que ellos han sido motivo de
superación, “llegar a la meta siempre y lo mas rápido que se pueda y lo mejor
que se pueda” es el lema que llevamos dentro porque somos personas que
anhelamos mucho llegar a ser alguien en la vida, así que de cierta manera este
trabajo se los dedico para que sepan que un día yo también llegue a la meta.
A Miriam López por compartir grandes momentos en la universidad, brindarme

amor, compresión y apoyarme siempre en lo que necesité.
Luis Lindo
DECICATORIA
Dedico esta investigación monográfica a mi Padre salvador y su hijo Jesucristo

porque me dieron fuerzas, esperanzas, voluntad y fe para ser una persona
profesional en la cual me he transformado, han estado cada segundo de vida,
dándome el aliento para sobrevivir a los momentos duros y abatidos que he
tenido.
A mi padre, madre, hermano y familiares, por nunca dejarme solo, sintiéndome

una persona siempre amada, aunque siempre lejos de ellos me dieron palabras
de motivación para salir adelante.
A Celina mercedes Escobar Amaya, más que abrirme sus brazos de amistad me
regaló su amor dándome más fuerza y motivos para superarme “gracias”.
A mis amigos, compañeros, maestros y todas aquellas personas que he conocido

durante mi estadía en esta alma Mater, personas que me han permitido crecer a
nivel moral como profesional pues considero que de este tipo relaciones y
transferencia de experiencia hacen de un profesional una persona exitosa y con
gran deseo de superación.
Francisco López Cáseres
DEDICATORIA
A Dios, por haberme dado la oportunidad de nacer y guiar mi vida por el

camino del bien; por ser la luz que ilumina mi vida. Darme salud y fortaleza
para salir adelante y levantarme siempre después de una caída.
A mi Madre María Elena Villegas; quien se ha sacrificado por sacarme

adelante y hacer de mí una persona buena, por sus buenos consejos. Por ser
comprensiva y paciente en los momentos que más he necesitado de ella. A ella
por ser muy importante y un ejemplo en mi vida a quien le demostré que su
esfuerzo no ha sido en vano, para ella mi respeto y admiración.
A mi familia por apoyarme y darme fuerzas para seguir adelante, por ser un
ejemplo para mí y guiarme por el buen camino.
A mi novia Heleni Francis Delgado; por estar siempre conmigo en los buenos
y malos momentos dándome su apoyo, su amor y compresión. Por estar junto a
mi cuando la necesitaba y por guiarme ha ser una mejor persona.
Carlos López.
INDICE
1. Introducción………………………………………………………..01
2. Tema y Objetivos …………………………………….....................04
3. Marco Teórico……………………………………………………...05
4.1. Pruebas y valoraciones biológicas……………………………….....06
4.2. Tinción de Gram…………………………………………………....18
4.3. Diseño experimental……………………………………………......19
4.4.Medidas de Dispersión…………………………………….....27
4.5. Material de Laboratorio………………………………………..........29
4.6. Métodos de Esterilización……..........................................................32
4.7. Propiedades Físico-Químicas…………………………………….....34
5. Diseño Metodológico: ………………………………………...........35

5.1. Tipo de Estudio…………………………………………………......36
5.2. Operacionalización de las variables……………………………..….36
5.3. Procedimiento………………………………………………….........37
5.4. Ejecución del ensayo……………………………………..................38
5.5. Material y Equipos…………………………………………..............51
6. Resultados……………………………………………………….......54
7. Análisis de los Resultados ………………………………..................79
8. Conclusiones………………………………………………………...82
9. Recomendaciones…………………………………………...…..…...84
10. Bibliografía…………………………………………………….….....86
11. Anexos…………………………………………………………...…..88
En la actualidad, son numerosos los laboratorios comerciales que preparan antibióticos;

estableciéndose una competencia en su producción, formas de presentación, así como también
las aplicaciones clínicas, las diferentes dosis, grados variables de actividad y por supuesto
potencia en donde han requerido el establecimiento de un organismo estatal regulador y de

control para este tipo de medicamentos.
El ensayo de potencia de antibiótico en un análisis es una de las herramientas microbiológicas
mas utilizada para establecer si el antibiótico logra cumplir con las especificaciones de los
estándares requeridos en donde el método Cilindro-Placa se utiliza para verificar la actividad
microbiológica de nuestro antibiótico. En países latinoamericanos como Colombia, Paraguay,
Brasil, Bolivia se realiza el ensayo de potencia de antibiótico esterilizando solamente el
material que entra en contacto con el microorganismo. Los Laboratorios Nacionales
tradicionalmente han venido utilizando el ensayo de Potencia de antibiótico con material
volumétrico estéril que entra en contacto con el microorganismo. En nuestra revisión
bibliográfica no encontramos investigaciones relacionadas a nuestro perfil de estudio, pero si
se encontraron otros estudios:
Sáenz Bolaiñez Irela y Samcan Corea Suyen. Validación del método microbiológico de
sulfato de gentamicina en inyectable, elaborado en los laboratorios Solka, S.A. UNAN-
león, 1998.
Rojas Mayorga Cecilia Cristina, Torres Reyes Rubenia Mercedes, Toruño Gutiérrez.
Determinación de la potencia antibiótica en 4 especies vegetales, Crysophila, Cojota
caturatos, Cryclanthus bipartitus, Talisia nervosa por el método de difusión agar. Tesis
Licenciatura en Farmacia y Química. Tutor Kelvin José Núñez Martínez. León, nicaragua,
UNAN, 2003.
En la USP XXX no se encontró referencias sobre la esterilización del material volumétrica en

el análisis de potencia de antibióticos, solo refiere la esterilización del material que entra en
contacto con el microorganismo. En el presente estudio se quiere demostrar que se puede
realizar el ensayo con material volumétrico no estéril, que contribuiría a reducir el tiempo del
análisis al no requerir de tiempo de esterilización seca, la cristalería no estaría sometida a
temperaturas altas (180°C) constantemente contribuyendo a la disminución de su vida media.
Debido a que las determinaciones microbianas de potencia están sometidas a variables intra e
inter ensayos, se requieren dos o más ensayos independientes para una estimación fiable de la
potencia en donde para obtener una precisión mínima requerida para la valoración aceptable de
un antibiótico va a depender de los limites de aceptación, una especialidad acabada con
íntervalos de aceptación del 95-105% o 90-110% requiere un número de replicas bajo n= 2-3,
si lo limites de aceptación son mas estrechos 98-102% el numero de réplicas debe ser mucho
mayor n ≥ 6 motivo por el cual los ensayo se deben efectuar en días diferentes para obtener
resultados idóneos ya que los sistemas biológicos presentan una variabilidad que obliga a tener
diferentes criterios para verificar y realizar ensayos.
La variación de este método será de gran aporte para el laboratorio Nacional de Control de
Calidad de Medicamentos MINSA y demás laboratorios privados que realicen este método ya
que contribuirá a disminuir el tiempo de este tipo de análisis y mejorar el método
disminuyendo el margen de error en la medida de los volúmenes, además de reducir el costo
económico de este tipo de ensayo.
2. Tema:
Efectividad del método Cilindro-Placa, esterilizando solamente el material

volumétrico que entra en contacto con el microorganismo de prueba. Managua 2009.
3. Objetivos:
General:
Comprobar la efectividad del método Cilindro-Placa, esterilizando solamente el material

volumétrico que entra en contacto con el microorganismo de prueba.
Específicos:
1. Efectuar el análisis de potencia de Gentamicina esterilizando solamente el

material volumétrico que entra en contacto con el microorganismo de prueba.
2. Realizar la caracterización de la cepa control de St. epidermidis.
3. Verificar la ausencia de microorganismos contaminante en el agar utilizado para

el ensayo microbiológico de gentamicina, mediante aislamiento en agar sangre
de carnero y agar manitol.
4. Cumplir con los criterios de aceptación del diseño experimental.
5. Comparar los resultados obtenidos aplicando el método en el que se esteriliza

todo el material volumétrico y el método esterilizando solamente el material
volumétrico que entra en contacto con el microorganismo.
6. Ejecutar la Calibración del balón aforado de 25ml en condición esterilizada y no

esterilizada.
4.1. Pruebas y valoraciones biológicas.
4.1.1 Valoraciones Microbiológicas-Antibióticos.

4.1.1.1 Aparato
Todos los equipos deben limpiarse bien antes y después de cada uso. Los elementos de vidrio
utilizados para conservar y transferir los organismos de prueba se esterilizan con calor seco o
vapor.
4.1.1.2 Control de Temperatura.
Se requiere control termostático en varias etapas de una valoración microbiológica: durante el

cultivo de un microorganismo y la preparación del inóculo, así como durante la incubación en
placa y las valoraciones en tubo. Mantener la temperatura de las placas de valoración a ± 0.5º
de la temperatura seleccionada. Es imperativo un control más estricto de la temperatura (± 0.1º
de la temperatura seleccionada) durante la incubación en una valoración en tubo y puede
lograrse con circulación de aire o agua. La mayor capacidad térmica del agua representa una
ventaja respecto del aire en circulación.
4.1.1.3 Espectrofotometría.
La medición de la transmitancia dentro de una banda de frecuencia relativamente estrecha

requiere un espectrofotómetro adecuado en el que pueda variarse o restringirse la longitud de
onda de la fuente luminosa mediante el uso de un filtro de 580nm o 530nm para leer la
absorbancia en una valoración en tubo. Para este ultimo propósito, el instrumento puede
disponerse de manera tal que acepte el tubo en el que tiene lugar la incubación, que acepte una
celda modificada equipada con un drenaje que facilita el cambio rápido del contenido o
preferentemente, que tenga una celda de flujo directo para un análisis de flujo contínuo; regular
el instrumento a una absorbancia igual a cero con caldo no inoculado transparente preparado
según las especificaciones de cada antibiótico, incluyendo la misma cantidad de solución de
prueba y formaldehído que se encuentra en cada muestra.
NOTA: puede utilizarse la medición de la absorbancia o transmitancia para preparar los

inóculos.
4.1.1.4 Receptáculos de valoración en Cilindro-Placa
Para las placas de valoración, utilizar placas de Petri de vidrio o plástico (aproximadamente
20x 100mm) con cubiertas de un material adecuado. Para los cilindros de valoración, utilizar
cilindros de acero inoxidable o porcelana con las siguientes dimensiones, cada una de las
cuales tiene una tolerancia de ±0.1 mm: diámetro externo 8mm; diámetro interno 6mm y
longitud 10mm: limpiar con cuidado los cilindros para eliminar todos los residuos.
Ocasionalmente, se requiere una limpieza con un baño acido ejemplo: con acido nítrico 2N o
con acido crómico.
4.1.1.5 Medios y Diluyentes
4.1.1.5.1 Medios de cultivos
Antes de afrontar una validación de un método microbiológico se debe tener la seguridad de

que los medios de cultivo que se van a utilizar tienen una calidad adecuada. Esta calidad viene
definida por sus propiedades nutritivas y selectivas. En consecuencia se debe establecer un
programa de control de los medios de cultivo. Los medios requeridos para la preparación de los
inóculos de organismo de prueba están hechos con los ingredientes mencionados en este texto.
Podrán utilizarse ligeras modificaciones de los ingredientes individuales, o medios
deshidratados reconstituidos, siempre y cuando los medios resultantes posean las mismas
propiedades de promoción de crecimientos o superiores y produzcan una curva de respuesta
estándar similar.
Disolver los ingredientes en agua para hacer 1L y ajustar las soluciones de hidróxido de sodio
1N o ácido clorhídrico 1N, según sean necesarios para obtener el pH especificado después de
la esterilización con vapor.
Se puede obtener de medios de cultivos de 2 semanas:
Preparados por un laboratorio externo fabricante de medios de cultivo se exigirá un certificado

de análisis de cada lote de medio donde constan los resultados obtenidos en los ensayos de
esterilidad y de las propiedades nutritivas y selectivas, así como una breve descripción del
método de control y la fecha de caducidad. Es aconsejable que los controles se realicen como
mínimo con las cepas de microorganismos que se especifican en la Farmacopea. Además es
recomendable efectuar controles periódicos en el momento de la recepción en el laboratorio
para comprobar la calidad de los medios.
Se realizará controles visuales; controles de esterilidad y controles de crecimiento/ inhibición
similares a los que se describen por los medios preparados a partir de medios deshidratados.
Preparados en los laboratorios a partir de medios deshidratados. Los medios se preparan según
las indicaciones del fabricante utilizando agua purificada. En este caso se exigirá el certificado
analítico de cada lote de medio deshidratado. Además, el laboratorio deberá efectuar ensayos
que demuestren la esterilidad y las propiedades nutritivas y selectivas de los medios de
cultivos preparados a partir de medios deshidratados.
Para los medios de cultivo generales se utilizarán las cepas que se indican en la Farmacopea,
para los medios selectivos se utilizarán microorganismos que presenten buen crecimiento y
otros cuyo crecimiento este inhibido en este medio. Los ensayos se deberán hacer para cada
lote de medio que se prepare.
Es aconsejable también asignar a los medios preparados en los laboratorios una fecha de
caducidad. Esta fecha dependerá del medio que se trate y de las condiciones de conservación.
4.1.1.5.2 Diluyentes
La función de un diluyente es dispersar o diluir el producto a examinar. Las farmacopeas

oficiales recomiendan varios diluyentes, los cuales están ya validados en el sentido de que no
interfieren en la viabilidad de microorganismo.
4.1.1.6 Soluciones amortiguadoras de fosfato y otras soluciones.
Preparar las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio requeridas para el antibiótico en

análisis de la siguiente manera, o por otros medios adecuados. Las soluciones amortiguadoras
se esterilizan después de su preparación y el pH especificado en cada caso corresponde al pH

después de la esterilización.
4.1.1.7 Unidades y Estándares de referencia.
La potencia de los antibióticos esta especificada en “Unidades” o “ug” de actividad. En cada

caso la “Unidad” o “ug” de actividad del antibiótico se establecen y se definen según el
estándar maestro federal designado para dicho antibiótico. El Estándar de Referencia USP
correspondiente se calibra según el estándar maestro.
El concepto de “ug” de actividad se origino en un caso en que se considero que a preparación

antibiótica seleccionada como estándar de referencia consistía totalmente en una sola entidad
química y, por lo tanto, se le asigno una potencia de 1000 “ug” por mg. En varios casos de este
tipo, como resultado de desarrollo de métodos de fabricación y purificación para antibióticos
particulares, se obtuvieron preparaciones que contenían más de 1000 “ug” de actividad por mg.
Luego se comprendió que dicha preparaciones tenían una actividad equivalente a un número de
“ug” determinados del estándar de referencia original. En la mayoría de los casos, no obstante,
los “ug” de actividad equivalen exactamente a los ug (peso) de la sustancia pura.
En algunos casos surgen complicaciones, por ejemplo, cuando un antibiótico existe como base
libre y en forma salina y los “ug” de actividad se han definido en términos de una sola de
dichas formas; cuando la sustancia antibiótica consta de un numero de componentes muy
similares químicamente pero con diferente actividad antibiótica o cuando las potencias de una
familia de antibióticos se expresan en términos de un estándar de referencia, que consta de un
solo miembro que, no obstante, podría ser heterogéneo. En dichos casos, los “µg” de actividad
definidos en términos de un “Estándar Maestro” equivalen a una “Unidad”. Por consiguiente
no debería suponerse que los “µg” de actividad corresponden a los µg (peso) de la sustancia
antibiótico.
4.1.1.8 Preparación del estándar.
Para preparar una solución madre, disolver una cantidad de estándar de referencia USP e un
determinado antibiótico, pesado con exactitud o todo el contenido del vial e estándar de
referencia USP, cuando corresponda, el disolvente especificado se usa con la tabla no. Y diluir
hasta la concentración requerida según lo indica. Conservar en un refrigerador y usar en le
periodo especificado. El día de la valoración preparar a partir e la solución madre 5 o más
diluciones, por lo general, con una diferencia de concentración entre diluciones sucesivas en
una proporción de 1:1.25 para el caso de una valoración en cilindro en placa.
4.1.1.9 Preparación de la muestra.
A partir de la información disponible para la preparación que se va a valorar (la muestra

desconocida) asignarle a esta una potencia supuesta por unidad de peso volumen y sobre esta
suposición preparar una dilución de prueba según se especifica para cada antibiótico pero con
el mismo diluyente final utilizado para el estándar de referencia USP. La valoración con 5
niveles de estándar requiere un solo nivel de la muestra desconocida a una concentración que
se supone igual al nivel medio de estándar.
TABLA No.1. Soluciones de trabajo del estándar de referencia.
Solución stock estándar de Antibiótico Gentamicina

trabajo
Condición de secado 3 horas
Solvente inicial Buffer #3
Diluente 3
Concentración final U o mg/ml 1mg
Almacenamiento bajo 1mes
refrigeración
Concentración del estándar Solvente final Buffer #3
Concentraciones finales U o µg de 0.064, 0.080, 0.100,

antibiótico/ml 0.125, 0.156 µg
Tabla basada en la USP 30/NF 25, versión en español.
TABLA No.2. Preparación de las solución madre y diluciones de prueba de

estándares.
Soluciones madre dilución de prueba
Antibiótico y Disolvente inicial Solución madre Usar Diluyente Dosis

final dentro final media(mcg de
tipo de
(concentraciones en concentración actividad o
valoración por ml. unidades por ml
aquellos en que este
(cilindro-
especificado)diluyente
placa) CP.
posterior si es diferente
Gentamicina B3 1 mg 30 dias B3 0.1mcg

(CP)
Tabla basada en la USP 30/NF 25, versión en español.
4.1.2 Organismo e inóculo.
4.1.2.1 Organismo de Prueba
El organismo de prueba para cada antibiótico se indica en la tabla no.3 junto con el numero de
identificación ATCC american type culture collection (colección de cultivos tipo de EEUU).
Indicando también el método de valoración para cada uno de los antibióticos. Mantener un
cultivo sobre medio inclinado y bajo las condiciones de incubación especificados en la tabla
no.4 transferir semanalmente a un tubo con medio inclinado.
TABLA No.3. Organismo de prueba para cada antibiótico valorado según el

procedimiento indicado.
Antibiótico Organismo de prueba Numero ATCC.
Gentamicina Staphylococcus epidermides 12228
Tabla basada de USP 30/NF25, versión en español.
4.1.2.2 Preparación del inóculo.
Antes de realizar una valoración, retirar el cultivo de una pendiente o cultivo reciente de
organismo, con 3 ml de solución salina estéril SR y perlas de virio estéril. Inocular la
superficie de 250 ml del medio agar especificado para cada antibiótico.
Expandir la suspensión en forma pareja sobre la superficie del agar con ayuda de perlas
estériles e incubar a la temperatura indicada durante aproximadamente el tiempo señalado. Una
ve finalizado este tiempo, preparar la suspensión madre recogiendo el cultivo de la superficie
en 50ml de solución salina estéril SR.
Para la valoración en Cilindro en Placa, determinar mediante ensayo las proporciones de

suspensión madre que se deben incorporar en el inoculo. Comenzando con los volúmenes
indicados en la tabla no.4, que den como resultado una demarcación satisfactoria de inhibición
de aproximadamente 14-16 mm de diámetro y produzca una relación de dosis reproducible.
Preparar el inoculo añadiendo una porción de suspensión madre a una cantidad suficiente de
medio agar y enfriado de 45-50ºC y agitando por rotación moderada para lograr una
suspensión homogénea.
TABLA No.4. Preparación del inoculo.
Organismo de Condiciones de inoculación Composición del inoculo

prueba (ATCC)
Medio Temperatura Tiempo Medio Cantidad
mlx100mL
S. Epidermidis 1 32-35 24 horas 11 0.25

(12228)
Tabla basada de la USP 30/NF 25, versión en español.
4.1.2.3 Cepas control.
Antes de iniciar un método microbiológico es imprescindible constar con cepas de

microorganismos control que constituyen el reactivo estándar biológico. Estos microorganismos
normalmente serian los necesarios para la comprobación de los métodos de control de productos
no estériles y estériles, los aislados frecuentemente en las zonas de fabricación o los
esterilizados para valoraciones de antibióticos y ensayos de eficacia.
Las cepas de microorganismos deben tener origen e identidad conocida así como una
estabilidad bioquímica que minimice la variabilidad, debido al reactivo biológico.
El crecimiento y la preparación de microorganismos determinan el estado fisiológico de las

células, el cual tiene influencia directa en el resultado de los ensayos. Los ensayos
microbiológicos no utilizan células individuales si no poblaciones de células. Los datos
generados en estos ensayos son menos variables si las poblaciones celulares son homogéneas
Según se indica en Farmacopea Europea y en la USP, el cultivo de microorganismo que se vaya

a utilizar como inoculo de un método debe de proceder de una cepa que no haya sido
subcultivada más de 5 veces desde la cepa de referencia original. Un subcultivo se define como
la siembra de microorganismos a partir de un cultivo a medio fresco estéril. En el caso de
microorganismos que se conservan congelados cada ciclo de congelación, descongelación y
revivificación se considera subcultivo.
4.1.2.4 Cultivos de trabajo.
A partir de un cultivo primario puede realizarse 4 subcultivos de trabajo y de estos realizarse 2

0 3 siembras, según las necesidades. Aumentar el número de resiembras incrementando el
riesgo de alteración fenotípica. Se recomienda no realizar más de 5 pases desde la cepa original.
Par obtener un subcultivo de trabajo, se siembra sobre medio inclinado placa a partir del cultivo
primario se incuba en las condiciones que requiera el microorganismo hasta obtener el
crecimiento adecuado.
Los subcultivos pueden conservarse a temperatura ambiente durante 4 semanas, si bien es

preferirlos mantenerlos en envera a 2-8ºC.
4.1.2.5 Suspensiones Normalizadas o Estandarizadas.
La estandarización de las suspensiones de microorganismos proporciona 1 metodología de

trabajo que facilita la obtención de los resultados esperados normalmente, la Farmacopea para
ensayos de recuperación microbiológica en presencia del producto indica que se siembra un
numero determinado de microorganismos cultivos recientes. Es por ello, que debemos tener 1
sistema para asegurar el numero aproximado de microorganismos que tenemos en una
suspensión sin tener que esperar a los resultados de un recuento, ni trabajar a ciegas.
La manera más fácil de estandarizar 1 suspensión de microorganismos es por determinación de

la turbidez en un espectrofotómetro o en escala de Macfarland. Siempre que preparemos la
suspensión en un mismo medio y a la misma turbidez medida en un espectrofotómetro a 1
longitud de onda determinada, tendremos aproximadamente el mismo numero de
microorganismos.
4.1.3 Procedimiento: Diseño de la Valoración.

La Valoración Microbiológica aumenta su precisión con la segregación de fuentes

relativamente de posibles errores y desviación mediante diseños experimentados.
Es una valoración Cilindro en Placa, las comparaciones esenciales están registradas a las
relacionadas entre las mediciones de diámetro de la zona dentro de las placas, sin tener en
cuenta la variación-placa en su preparación y posterior manipulación.
Las determinaciones microbiológicas de potencia están sujetas a variables intervaloraciones e

intravaloraciones de modo tal que se requieren 2 o mas valoraciones independiente para
obtener una estimación confiable de la potencia de una determinada preparación de valoración
o muestra desconocida.
Comenzando con la solución madre y diluciones de prueba del estándar y de la muestra

desconocida, repetir otro día la valoración de una muestra desconocida dada.
Si la potencia estimada de la segunda valoración difiere mucho, según lo indique el error

estándar calculado respecto de la primera realizar una o más valoraciones adicionales.
El resultado combinado de una serie de valoraciones independientes mas pequeña a lo largo de

varios días es una estimación más confiable de la potencia que el objetivo de una valoración
grande con el mismo numero total placas o tubos.
4.1.3.1 Método Cilindro-Placa
Para preparar placas de valoración utilizando placas petri, colocar 21mL de medio 2 en cada
una de las cantidades requeridas y dejar que se endurezca para formar 1 capa base lisa de
profundidad uniformemente.
En el caso de la Gentamicina utilizar medio 11, agregar 4mL del inoculo de cada siembra,
inclinando la placa hacia atrás y hacia adelante para esparcir el inoculo uniformemente sobre la
superficie y dejar que se endurezca. Dejar caer 6 cilindros sobre la superficie inoculada desde
una altura de 12 mm, utilizando una guía mecánica u otro dispositivo para asegurar el espacio
uniforme en un radio de 2.8cm y cubrir las placas para evitar la contaminación.
Después de llenar los 6 cilindros sobre cada placa con diluciones de antibiótico que contengan
los niveles de prueba que se especifican a continuación.
Incubar las placas a una temperatura de 36-37.5ºC de Gentamicina durante 16-18 horas, retirar
los cilindros, medir y registrar el diámetro de cada zona de inhibición de crecimiento con
aproximadamente 1mm para valoraciones de un nivel con curvas estándar preparar
disoluciones que representen 5 niveles de prueba del estándar (S1 a S5)
Y un nivel de prueba único de la muestra desconocida U3 correspondiente a S3 de la curva

estándar, según se define en la preparación de estándar y preparación de la muestra.
Para derivar la curva estándar llenar los cilindro en cada 1 de las 3 placas con la dilución de
prueba media (S3) del estándar y cada uno de los nueve cilindros restantes con una de las 4
diluciones estándar. Repetir el proceso para las diluciones del estándar.
Para cada muestra desconocida, llenar los cilindros alternos en cada una de las 3 placas con la
dilución de prueba media del estándar (S3) y cada uno de los 9 cilindros restantes con la
dilución de prueba correspondiente (U3) de la muestra desconocida.
4.1.3.2 Calculo.
Para calcular la potencia a partir de datos obtenidos con el método de cilindro en placa o el
método turbidimétrico, proceder en cada caso según se indica en potencia interpolada a partir
de una curva estándar, Utilizando el método de regresión lineal por mínimos cuadros y una
prueba de linealidad. En aquellos casos que se realiza un número de valoraciones del mismo
material con la misma curva estándar, calcular el coeficiente de variación en el resultado de
todas las valoraciones de material. En aquellos caso que se realiza más de una valoración del
mismo material con diferentes curvas estándar, promediar los dos o mas valores de la potencia.
4.2. Tinción de Gram.

La tinción de gram o coloración de gram es un tipo de tinción diferencial empleado en
microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su
nombre al bacteriólogo danés Christian Gram. Las tinciones diferenciales son aquellas que se
usan para diferenciar de manera mas explicita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los
colorantes diferenciales, que se componen de más de una sustancia tintórea. En algunas
técnicas de coloración, las tinciones diferenciales mas importante que se emplea en
bacteriología son las de gram y la tinción acido resistente.
Se utiliza tanto para referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a
las bacterias que se visualizan de color violeta y bacterias gram negativas a las que se
visualizan de color rosa.
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células de las bacterias, tanto en
gram positivas como en gram negativas.
El lugol esta formado por 2I en equilibrio con KI, el cual esta presente para solubilizar el
Yodo. El Yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el
cristal violeta.
La mezcla de Alcohol-cetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la

misma es soluble el complejo 2I/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se
decoloran, mientras que los gram negativos si lo hacen.
Para poner de manifiesto las células gram negativas utilizan una coloración de contraste.
Habitualmente es una coloración de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la
coloración de contraste las células gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas
permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción
de contraste que pone de manifiesto las bacterias gram negativas, se verán rosas (si no se hizo
la tinción de contraste) o rojas si se uso por ejemplo safranina.
4.3. Diseño Experimental
Cualquier dosificación proporciona un valor al que se le atribuye cierta precisión experimental

ligada a la toma de muestras, las diluciones y las mediciones. Esta precisión se estima
efectuando cierto número de determinaciones independientes y calculando la desviación
estándar.
Se debe considerar que el reactivo es un organismo vivo cuyos crecimientos y multiplicación

presentan un carácter aleatorio. Lo que se mide al final de un experimento es en cierto modo la
suma de una infinidad de reacciones independientes. Para compensar este carácter aleatorio y
tomarlo en cuenta, es necesario repetir el ensayo, en difusión se utilizan 10 cajas de petri.
La necesidad de verificar el paralelismo y la linealidad de las regresiones del patron y la

muestra obliga a emplear al menos 2 concentraciones.
Un plan experimental comprende entonces varias concentraciones de patrón y muestra, y varias

repeticiones de cada una de ellas.
El plan experimental habitual consiste en preparar una serie de 5 concentraciones crecientes del
antibiótico de referencia, una progresión geométrica de 2 o 1.5 según la concentración media,
esto a fin de trazar una curva de referencia. La solución muestra en una concentración estimada
cercana a la solución media de referencia se titula de la misma manera y el titulo se evalúa
sobre la curra de referencia.
El plan mas simple es 2/2, es decir, 2 concentraciones del patrón y 2 concentraciones de

muestra, en cambio el plan 3/3 o 4/4 permite verificar los parámetros (linealidad y
paralelismo).
En la difusión una caja de petri de 90mm de diámetro en la que se colocan 3 soluciones patrón
y 3 soluciones muestra de concentración creciente, es también un bloque. Es preferible colocar
las soluciones mas concentradas en solución opuesta a la menos concentradas para no
arriesgarse a encontrarla lado a lado después de una disposición aleatoria y evitar así las
interacciones y también la confluencias de los halos de inhibición.
Debe de haber una relación cuantitativa en la respuesta obtenida (diámetro del halo de
inhibición, densidad óptica) y la concentración del agente microbiano.
La curva respuesta en función de la concentración debe de tener una pendiente satisfactoria,

ósea debe de haber una notificación significante de la respuesta en función de la dosis. La
respuesta debe de variar en forma lineal con la dosis. El estándar y la muestra se deben de
comportar de igual forma.
Para que el ensayo se considere valido:
• la regresión debe de ser significativa.
• la desviación de la linealidad no debe de ser significativa.
• la desviación del paralelismo no debe de ser significativa.
4.3.1 Diseño 3+3 (Técnica Validada por LNCCM)
Es un método matemático factorial en el que se incluye igual numero de dosis de cada

preparación (3 concentraciones del estándar y 3 concentraciones del desconocido) aplicando el
análisis de varianza ANOVA.
Se preparan tres soluciones del estándar S1, S2, S3 donde la solución S2 es la dosis media.
En este diseño 3+3 se establecen tres niveles de la solución estándar, se prepara un nivel de la
muestra(desconocida),a una concentración igual que el nivel o dosis media del estándar se
prepara el nivel medio de la muestra(S2=D2).
4.3.2 Características del diseño.
H preparaciones (patrón y mas de u desconocido).
3 x H tratamientos: 3 dosis del patrón (S1 S2 S3) y dosis de cada desconocido (D1 D2 D3).
Log dosis equiespaciados (relación de dosis constante).
S2/S1 = S3/S2 =D2 /D1 = D3 / D2
Igual numero de respuestas para cada tratamiento.
4.3.3. Curvas Dósis-Respuestas
Una curva de dosis-respuestas es una representación gráfica de la correlación entre una serie de
dosis, consideradas como la variable independiente y por lo tanto representadas en el eje x de
coordenadas, y el efecto observado, considerado como la variable dependiente y graficado en
el eje y.
Las curvas de dosis-respuesta pueden tomar diferentes formas de acuerdo a los mecanismos
que representan. En algunos casos es posible obtener una mejor representación usando una
escala aritmética para la dosis o usando una escala logarítmica para las
dosis.
Si se obtiene una respuesta de una magnitud definida para cada dosis, dentro de un rango de
dosis, se dice que la respuesta es "gradual". Es decir que a diferentes dosis, D1, D2,...Di, se
observan los efectos, S1, S2,...Si, que varían en forma continua y tienen un valor único para
cada dosis (dentro de la variabilidad normal que siempre se observa cuando se hacen
bioensayos).
La curva dosis-efecto se construye graficando en las ordenadas (S) y en las absisas (D). La
curva pasa por el origen del sistema de coordenadas cartesianas y la pendiente máxima se
presenta en el origen. La pendiente permanece aproximadamente constante durante un rango
amplio de la dosis (cinética de primer orden), después la pendiente disminuye con la dosis
hasta que se vuelve cero (cinética de orden cero) y la respuesta adquiere su valor máximo. A
este valor máximo se le denomina efecto máximo (Dmax) y es una medida de la eficacia del
tóxico. En algunas ocasiones, la relación dosis-efecto no es tan definida y dentro de una
población se observa una distribución de respuestas para cada dosis. En este caso el efecto que
se mide no es la magnitud, se mide el porcentaje de la población en estudio que presenta una
determinada respuesta para cada dosis suministrada. Este tipo de efecto se le denomina cuantal.
En estos casos se acostumbra graficar, en la ordenada, el por ciento de la población que
presenta un determinado valor de la respuesta y en la abcisa, el logaritmo de la dosis
suministrada. Esta curva tiene forma sigmoidal.
Curva Dosis-Respuesta.
La curva pasa por el origen (cuando la dosis es cero, la respuesta es cero) y a valores muy
bajos de la dosis, la curva es horizontal con un valor del efecto igual a cero (la curva va sobre
el eje de las dosis). La respuesta empieza a tener un valor mayor que cero cuando la dosis llega
al nivel límite. De allí en adelante la pendiente de la curva crece con la dosis, hasta que se llega
a una pendiente máxima. Esta pendiente se mantiene por un amplio rango de dosis en que la
respuesta es directamente proporcional a la dosis. A dosis mayores la pendiente empieza a
decrecer hasta que la curva se vuelve asintótica a un valor máximo de las respuestas.
Las concentraciones teóricas en µg/ml para la Gentamicina son las siguientes: 0.064, 0.080,
0.100, 0.0125, 0.0156. A partir de estas concentraciones se construirá la curva dosis- repuesta
de la Gentamicina y se escogerán las 3 concentraciones de trabajo tanto para el estándar como
para la muestra.
4.3.4. El análisis de Varianza
La mayoría de los experimentos consisten en el estudio de los efectos de una o más variables
independientes sobre una respuesta. Estas variables independientes que pueden controlarse en
un experimento se denominan factores.
El análisis de datos generados por un experimento multivariable requiere la identificación de

las variables independientes del experimento; estas no solamente serán factores sino que
pueden ser también instrucciones para la formación de bloques. La repuesta para un diseño de
cuadro latino depende de los factores que representan los tratamientos, pero también es
afectada por dos variables cualitativas independientes de los bloques, “filas” y “columnas”
4.3.5. Procedimiento de Análisis de Varianza
Como el nombre lo indica, el procedimiento de análisis de varianza trata de analizar la

variación de una respuesta y de asignar porciones (componentes) de esta variación a cada una
de las variables de un conjunto de variables independientes. El razonamiento se basa en que las
variables de repuesta se modifican por la variación de algún conjunto de variables
independientes desconocidas. El objetivo del análisis de varianza es identificar variables
independientes importantes en un estudio y determinar como interactúan y afectan a la

repuesta.
4.3.6 ANOVA.
En estadística, análisis de varianza (ANOVA) es una colección de modelos estadísticos y sus

procedimientos asociados. El análisis de varianza sirve para comparar si los valores de un
conjunto de datos numéricos son significativamente distintos a los valores de otro o más
conjuntos de datos. El procedimiento para comparar estos valores está basado en la varianza
global observada en los grupos de datos numéricos a comparar. Típicamente, el análisis de
varianza se utiliza para asociar una probabilidad a la conclusión de que la media de un grupo
de puntuaciones es distinta de la media de otro grupo de puntuaciones.
El ANOVA parte de algunos supuestos que han de cumplirse:
• La variable dependiente debe medirse al menos a nivel de intervalo.

• Independencia de las observaciones.
• La distribución de los residuales debe ser normal.
• Homocedasticidad: homogeneidad de las varianzas.
4.3.6.1 Existen tres tipos de modelos:
• El modelo de efectos fijos asume que el experimentador ha considerado para el factor

todos los posibles valores que éste puede tomar. Ejemplo: Si el género del individuo es
un factor y el experimentador ha incluido tanto individuos masculinos como femeninos,
el género es un factor fijo en el experimento.
• Los modelos de efectos aleatorios asumen que en un factor se ha considerado tan sólo
una muestra de los posibles valores que éste puede tomar. Ejemplo: Si el método de
enseñanza es analizado como un factor que puede influir sobre el nivel de aprendizaje y
se ha considerado en el experimento sólo tres de los muchos más métodos posibles, el
método de enseñanza es un factor aleatorio en el experimento.
• Los modelos mixtos describen situaciones donde están presentes ambos tipos de
factores: fijos y aleatorios.
La técnica fundamental consiste en la separación de la suma de cuadrados (SS) en

componentes relativos a los factores contemplados en el modelo. Como ejemplo, mostramos el
modelo para un ANOVA simplificado con un tipo de factores en diferentes niveles. (Si los
niveles son cuantitativos y los efectos son lineales, puede resultar apropiado un análisis de
regresión lineal).
SSTotal = SSError + SSFactores
El número de grados de libertad (gl) puede separarse de forma similar y se corresponde con la
forma en que la distribución chi-cuadrado describe la suma de cuadrados asociada.
glTotal = glError + glFactores
4.3.6.2 Modelo de efectos fijos
El modelo de efectos fijos de análisis de la varianza se aplica a situaciones en las que el

experimentador ha sometido al grupo o material analizado a varios factores, cada uno de los
cuales le afecta sólo a la media, permaneciendo la "variable respuesta" con una distribución
normal.
4.3.6.3 Modelo de efectos aleatorios
Los modelos de efectos aleatorios se usan para describir situaciones en que ocurren diferencias
incomparables en el material o grupo experimental. El ejemplo más simple es el de estimar la
media desconocida de una población compuesta de individuos diferentes y en el que esas
diferencias se mezclan con los errores del instrumento de medición.
4.3.6.4 Grados de libertad
Por grados de libertad entendemos el número efectivo de observaciones que contribuyen a la

suma de cuadrados en un ANOVA, es decir, el número total de observaciones menos el
número de datos que sean combinación lineal de otros.
4.3.6.5 Pruebas de significación
El análisis de varianza lleva a la realización de pruebas de significación estadística, usando la

denominada distribución F de Snedecor.
Fuente de variación GL SS MS
1º factor a–1 SSA SSA/(a -1)
2º factor b -2 SSB SSB/(b - 1)
Interacción (a -1 ) (b - 1) SSAB SSAB/ (a - 1)(b - 1)
Error ab(n - 1) SSE SSE/ab(n - 1)
Total abn – 1 SST ----------
4.4 Medidas de Dispersión
Las medidas de dispersión son parámetros estadísticos que miden cómo de diseminados se
encuentran los datos de una distribución. Los más utilizados se refieren al grado de lejanía de
los datos respecto a la media y son la desviación media, la varianza, la desviación típica y el
coeficiente de variación.
Las medidas de dispersión muestran la variabilidad de una distribución, indicando por medio
de un número si las diferentes puntuaciones de una variable están muy alejadas de la media.
Cuanto mayor sea ese valor, mayor será la variabilidad, cuanto menor sea, más homogénea
será a la media. Así se sabe si todos los casos son parecidos o varían mucho entre ellos.
4.4.1. La desviación estándar (o desviación típica)
Es una medida de dispersión para variables de razón (ratio o cociente) y de intervalo, de gran
utilidad en la estadística descriptiva. Es una medida (cuadrática) que informa de la media de
distancias que tienen los datos respecto de su media aritmética, expresada en las mismas
unidades que la variable.
4.4.1.1. Interpretación y aplicación
La desviación estándar es una medida del grado de dispersión de los datos del valor promedio.
Dicho de otra manera, la desviación estándar es simplemente el "promedio" o variación
esperada con respecto de la media aritmética.
Una desviación estándar grande indica que los puntos están lejos de la media y una desviación
pequeña indica que los datos están agrupados cerca a la media.
La desviación estándar puede ser interpretada como una medida de incertidumbre. La

desviación estándar de un grupo repetido de medidas nos da la precisión de éstas. Cuando se va
a determinar si un grupo de medidas está de acuerdo con el modelo teórico, la desviación
estándar de esas medidas es de vital importancia: si la media de las medidas está demasiado
alejada de la predicción (con la distancia medida en desviaciones estándar), entonces

consideramos que las medidas contradicen la teoría. Esto es coherente, ya que las mediciones
caen fuera del rango de valores en el cual sería razonable esperar que ocurrieran si el modelo
teórico fuera correcto. La desviación estándar es uno de tres parámetros de ubicación central;
muestra la agrupación de los datos alrededor de un valor central (la media o promedio).
La desviación típica o desviación estándar, σ, es la raíz cuadrada de la varianza:
La razón de ser de este parámetro es conseguir que la medida de dispersión se exprese en las
mismas unidades que los datos a los que se refieren.
4.4.2. El coeficiente de variación (C.V.)
El coeficiente de variación es útil para comparar dispersiones a escalas distintas pues es una
medida invariante ante cambios de escala. Por otro lado presenta problemas ya que a diferencia
de la desviación típica este coeficiente es variable ante cambios de origen. Por ello es
importante que todos los valores sean positivos y su media de por tanto un valor positivo.
Exigimos que:
Es el cociente entre la desviación típica y la media de la distribución:
Este parámetro sirve para relativizar el valor de la desviación típica y así poder comparar la
dispersión de dos poblaciones estadísticas con gamas de valores muy discretas.
4.5. Material de Laboratorio

En el laboratorio hay distintos tipos de materiales: vidrio, plástico, porcelana pero ninguno de
ellos cumple las exigencias del laboratorio. Se tendrá que elegir en cada momento el material
según el uso que le queramos dar, ningún utensilio es perfecto.
El vidrio se caracteriza porque tiene mucha resistencia química (frente a ácidos, frente a bases),
tiene mayor resistencia que el plástico, es muy estable, se caracteriza por su transparencia.
Todos los vidrios no son perfectos para todas las técnicas, a veces se necesitan vidrios con
resistencia térmica, con resistencia mecánica. Según el uso que le queramos dar aparecen
vidrios especiales. La mayoría de los utilizados son vidrios borosilicatados, los cuales ofrecen
gran resistencia térmica (vidrio pirex, quimax). Cuando se emplea el material de vidrio hay que
tomar unas precauciones:
•No los podemos someter a cambios bruscos de temperatura (se provocan tensiones que
pueden romper el cristal).
Hay que colocar la estufa de secado o esterilización en frío, ir calentándolo después, y cuando
acaba el tiempo de secado dejar enfriar el material
•No se debe aplicar fuerza sobre llaves, tapones de vidrio
•No se debe someter a variaciones bruscas de presión
•No se debe conservar soluciones concentradas de bases en material de vidrio de borosilicato,

porque son substancias muy cáusticas que pueden destruir la calibración del aparato.
4.5.1. VIDRIO BOROSILICATO
El borosilicato, o silicato de boro, es un material componente de vidrios que se emplean

extensamente en instrumentos ópticos por sus buenas propiedades ópticas, pero también
mecánicas (baja dilatación).Los vidrios de borosilicato se fabrican mediante la sustitución de
grandes cantidades de álcali y, con frecuencia, de toda la cal, con B2O3. Aunque este último
producto es un formador de redes (y no modificador sustitúyente), reacciona también con el
Sio2, casi de la misma forma que el sodio y la cal, que son modificadores. La materia prima es
el bórax, tetraborato de sodio, que al calentarlo da trióxido de boro. El uso de B2O3 reduce el
coeficiente de dilatación, por lo que la resistencia de estos vidrios a los choques térmicos es
muy superior a la de los sodocálcicos. Además, la reducción de la cantidad de alcalinos
presente hace mejor la no reactividad de dicho vidrio. El Pyrex es una marca comercial común
para el vidrio de borosilicato. Su composición media es: 80% SiO2, 4% Na2O, 12% B2O3, 3%
Al2O3, 0.4% CaO, 0.6% K2. Se utiliza para instrumentos de laboratorio, utensilios de cocina,
tuberías para productos químicos y sellos metálicos de baja dilatación. Aunque el vidrio es un
mal conductor térmico, transmite aproximadamente un 95% del calor irradiado que recibe.
4.5.1.1. CARACTERÍSTICAS
Composición Química: %
Silice (SiO2) 80,4
Alúmina(Al2O3) 2,4
Anhidrido Bórico(B2O3) 13,0
Hidroxido Sódico(Na2O) 3,9
Resto de elementos: %
AsO3+ Sb2O3 0,001
PbO 0,1
MgO 0,1
ZnO 0,1
CaO 0,3
K2O 0,3
BaO 0,2
El vidrio de borosilicato cumple los principales estándares internacionales para su uso en

laboratorio, siendo apropiado para su calentamiento incluso a la llama.
4.5.2. Calibración del Material de Laboratorio.
La calibración se define como el “conjunto de operaciones que establecen, en unas condiciones

especificadas, la relación que existe entre los valores indicados por un instrumento o sistema de
medida, o los valores representados por una medida materializada y los correspondientes
valores conocidos de una magnitud de medida”.
La calibración, es el procedimiento metrológico que permite determinar con suficiente

exactitud cuál es el valor de los errores de los instrumentos de medición. Y es de vital
importancia que dichos errores sean lo suficientemente pequeños y que hayan sido
determinados con la mayor exactitud posible.
Cuando se quiere la máxima exactitud en un determinado análisis debemos empezar por la

calibración, suele hacerse midiendo el agua vertida por el recipiente o contenida en el, también
se puede utilizar la densidad de ese liquido para convertir la masa en volumen o con un factor
de corrección, tomando en cuenta que el liquido usado sea agua destilada, la cual se
expande 0.02% por grado en la densidad de los 20 ºC.
El vidrio se expande o se contrae ya sea las condiciones de la temperatura, si sometemos el

material de vidrio a temperaturas muy elevadas las moléculas del vidrio se expanden, mientras
que si lo sometemos a muy bajas temperaturas las moléculas del vidrio se contraen,
descalibrando de esta manera el material de vidrio. Es por eso que se debe trabajar a
temperaturas relativas a la cual fue hecho el material.
4.6. Métodos de Esterilización
La esterilización puede definirse como la ausencia de todas las formas de vida viable. En la
práctica la muerte de un microorganismo se alcanza cuando no es posible detectarlo en un
medio de cultivo en el cual ha mostrado que es capaz de proliferar.
El término de Esterilidad se expresa como la probabilidad matemática de que un producto

permanezca contaminado con microorganismos supervivientes después de haber sido expuesto
a un proceso de esterilización.
4.6.1. Clasificación de las técnicas de Esterilización
La Esterilización se puede seguir mediante el empleo de distintos procesos. La elección de la

técnica mas apropiada depende de las condiciones de estabilidad del producto que va ha ser
sometido a esterilización.
• Esterilizacion por Agentes Físicos.
• Esterilización por Agentes Químicos.
La esterilización por Agentes Físicos se clasifica en:
Esterilización por calor: Para esta técnica depende de la temperatura alcanzada y del tiempo de
exposición. En función de la presencia o no de agua en el medio, este tipo de esterilización
pude dividirse en esterilización por calor húmedo o por calor seco.
4.6.1.1. Esterilización por Calor Húmedo:
Su eficacia para lograr la inactivación de los microorganismos depende de la temperatura

alcanzada, del tiempo de exposición, y de la presencia o ausencia del agua en el medio, el calor
puede producir la muerte del microorganismo mediante cambios en la estructura química. La
muerte de los microorganismos se puede atribuir a la coagulación y desnaturalización de sus
proteínas esenciales.
Equipo de esterilización por calor húmedo:
Agua hirviendo (100ºC)
Tindalización
Esterilización bajo presión
4.6.1.2. Esterilización por Calor Seco
Es el método de elección para la esterilización de productos estables al calor pero sensibles a la

humedad. Las temperaturas y los tiempos necesarios para este proceso son superiores al
método de esterilización por calor húmedo. Este proceso es el de elección en la esterilización
de ceras de aceite, parafinas, glicerol en general de todos aquellos fluidos no acuosos estables
al calor. También se emplea en la esterilización de materiales de cura con algodón y gasas, es
utilizado para la preaparición de productos estériles, materiales de vidrio, ampollas, viales y
frascos.
Equipos:
• Flameado
• Horno o estufa de calor seco
• Túnel de esterilización y despirogenozaciòn
Esterilización por radiaciones: En función del tipo de radiación, estos procesos se clasifican en
esterilización por radicaciones ultravioleta y en esterilización por radiaciones ionizantes.
Esterilización por filtración y manipulación aséptica: este proceso de esterilización se emplea

en aquellos casos en que el producto que se va a tratar no puede ser expuesto a procesos de
esterilización por calor o radiaciones.
La esterilización por Agentes Químicos se realiza principalmente mediante el empleo de

agentes gaseosos. Entre los más empleados hay que destacar el Oxido de Etileno, la
betapropiolactona y el formaldehído.
4.7 Propiedades Físico-Químicas
GENTAMICINA, SULFATO.
X SO4
¾ La inyección de Gentamicina contienen una cantidad de sulfato de Gentamicina

equivalente a no menos del 90% y no más del 125% de la cantidad de Gentamicina
declarada en la etiqueta. Puede contener amortiguadores de pH, conservantes y agentes
complejantes adecuados.
¾ Tienen una Potencia equivalente a no menos de 590µg de gentamicina por mg,

calculado con respecto a la sustancia seca.
¾ pH: 3-5.5
¾ Descripción: polvo blanco o ligeramente pardusco.
¾ Solubilidad: soluble en agua, insoluble en alcohol, acetona, benceno.
5.1 Tipo de estudio: Experimental.
Universo: Gentamicina.
Población: Inyectables de Gentamicina lote NHR.
Muestra: 20 inyectables de Gentamicina lote NHR.
Área de Estudio: El presente estudio fue realizado, en el Centro Nacional de Diagnostico y

Referencia, en el departamento de control microbiológico del Laboratorio Nacional de Control
de Calidad de Medicamentos. (LNCCM), MINSA. Managua.
Criterios: Los criterios utilizados en la selección de la muestra fueron:
• Productos que con mayor frecuencia llega al LNCCM por parte del CIPS.
• Medicamento con elevada prescripción en el Área Clínica del Ministerio de Salud.
• Es un producto que se analiza por el método cilindro en placa.
5.2 Operacionalización de las Variables:

Variable Concepto Indicador Medida
Temperatura La temperatura es un parámetro físico 0 – 180º C Grado centígrado

descriptivo de un sistema que caracteriza el registrado.
calor, o transferencia de energía térmica.
Tiempo de Incubación Periodo en que los medios de cultivos 24-48 horas. Horas.
permiten el crecimiento de microorganismo.
Contaminación de Contaminación por microorganismos ajenos Colonia atípica Numero de

Medios de Cultivos, al ensayo de potencia microbiológica. que no sean unidades
Agar y Caldos. pequeñas color formadoras de
blancas. Colonias.
5.3 Procedimiento: Para desarrollar el trabajo investigativo se inicio con una revisión
bibliográfica en diferentes fuentes de información, biblioteca del complejo docente de la salud,
Laboratorio de Control de Calidad de Drogas y Medicamentos de UNAN-León, información
de Internet, etc.
La parte experimental de nuestro trabajo se inicio con la elaboración de un listado de la

cristalería a utilizar, a continuación se procedió al lavado de cristalería nueva, siguiendo las
instrucciones de un PNT proporcionado por el departamento.
Posteriormente se procedió a preparar medios de cultivo, preparar Buffer y estándar primario

de Gentamicina USP. Luego se trabajo en la Caracterización de la Cepa (Cepa trabajo: St.
epidermidis) para verificar que no hubiera contaminación (Agar Sangre de Carnero, Agar
Manitol). Posteriormente se realizo el ensayo de Estabilidad Bioquímica de la cepa microbiana
y el siguiente paso fue trabajar en el Mantenimiento de cepas (Ensayo Preparación del Inoculo
del Microorganismo de prueba) a utilizar en los ensayos de potencia de Gentamicina.
El departamento de microbiología nos proporciono el patrón primario y un total de 20 ampollas

de Gentamicina (80mg/2ml) para realizar los cálculos del estándar y de la muestra a las
concentraciones proporcionadas por el departamento. Las concentraciones de trabajo
estandarizadas para el ensayo de potencia de antibiótico de gentamicina por el método
Cilindro-Placa fueron: 0.19584, 0.39168, 0.78336µg/ml. A partir de estas concentraciones
preparamos las diluciones del estándar y de la muestra proveniente de la solución STOCK.
Se procedió a depositar la capa base y a inocular la capa siembra en las placas, se colocaron
los cilindros, se llenaron los mismos con el estándar y la muestra, se incubaron por 18 horas.
Se retiro con una pinza estéril lo cilindros, se realizaron las lecturas de los halos con el lector
de zona y se efectúo el análisis de datos con un programa estadístico de análisis de varianza
por ANOVA.
Se llevo a cabo un total de 4 ensayos de potencia de gentamicina, 2 ensayos esterilizando

solamente el material volumétrico que entra en contacto con el microorganismo y 2 ensayos
esterilizando todo el material volumétrico, los ensayos se efectuaron en días diferentes por 2
analistas diferentes.
5.4 Efectuar el ensayo de la siguiente manera:
1. Se realiza el ensayo de potencia de gentamicina con material volumétrico no

esterilizado excepto la que esta en contacto con el microorganismo de prueba.
Iniciar con lavar la cristalería nueva. VER ANEXO No. 1.
Proceder con la preparación de medios de cultivo. VER ANEXO No.2.
Preparar el Buffer. VER ANEXO No.3.
Realizar la técnica de Caracterización de la cepa. VER ANEXO No.4. Y No. 16
A continuación se realizara la estabilidad bioquímica de la cepa microbiana:

1.1. Estabilidad Bioquímica de Cepa Microbiana utilizada en Potencia de Antibiótico. VER
ESQUEMA EN ANEXO No.5.
El procedimiento es el siguiente:
Sacar de la nevera la cepa original media hora antes de realizar el primer pase.
1. Colocar en una gradilla un tubo de ensayo que contenga 9.5 ml de Caldo BHI o Caldo
Tripticasa Soya Estéril y rotular con la siguiente nomenclatura. Cultivo primario de
trabajo.
2. Una vez que la Cepa Original tiene aproximadamente la temperatura ambiente, tomar 1
o 2 asadas utilizando una asa redonda e inocular en el tubo conocido como: Cultivo
primario de trabajo, incubar por 24 horas en condiciones adecuadas para el
microorganismo.
3. Proteger la parte superior del frasco que contiene la Cepa Original colocando parafilm.
4. Regresar el frasco que contiene la cepa original a la nevera.
5. Una vez finalizado el tiempo de incubación del cultivo primario de trabajo proceder a
los siguientes pasos.
6. Colocar en una gradilla 4 tubos de ensayo que contengan Agar Antibiótico número 1
inclinado estéril.
7. Rotular los tubos de la siguiente manera:
7.1. Subcultivo de trabajo 1

8. Del cultivo primario de trabajo, tomar 2 o 3 azadas, utilizando un asa redonda estéril e
inocular a los tubos marcando como: Subcultivo de trabajo 1, Subcultivo de trabajo 2,
Subcultivo de trabajo 3, Subcultivo de trabajo 4. Incubar por 24 horas en condiciones
adecuadas para el microorganismo.
9. Descartar el tubo conteniendo el cultivo primario de trabajo.
10. Una vez finalizado el tiempo de incubación del Subcultivo 1, 2, 3 y 4 proceder a:
11. Guardar en la nevera los Subcultivo de trabajo 1, 2, 3 y 4.
12. Solamente para el día del ensayo de potencia
12.1.Colocar en una gradilla 2 tubos de ensayo que contenga Agar Antibiótico # 1.
12.2.Rotular los tubos de la siguiente manera:
Siembra A
Siembra B
13. Del subcultivo de trabajo 1, tomar 2 o 3, asadas utilizando una asa redonda estéril e
inocular a los tubos marcados como: Siembra a, Siembra b, incubar por 24 horas en
condiciones adecuadas para el microorganismo.
14. Descartar el tubo conteniendo el Subcultivo 1.
15. Una vez finalizando el tiempo de incubación de la siembra (a) y siembra (b), proceder a
la preparación de suspensión de microorganismo y luego descartarlas.
16. Si se requiere preparar suspensión microbiana proceder de la siguiente manera;
17. Sacar de la nevera el subcultivo de trabajo 2
18. Repetir los pasos: 12.1, 12.2, 13, 14, 15.
19. Si se requiere preparar nuevamente la suspensión microbiana proceder de la siguiente

manera:
20. Sacar de la nevera el Subcultivo de trabajo 3 y 4
21. Repetir los pasos: 12.1, 12.2, 13, 14, 15.
22. Se debe tomar en cuenta que el tiempo de almacenamiento en refrigeración de los

subcultivo no debe exceder el mes. Si no se utilizan descartar los tubos.
Se continúa con la preparación del Inoculo:

Preparación del Inoculo del Microorganismo de Prueba. VER ESQUEMA DEL ANEXO
No.6.
Se realiza de la siguiente manera:
1.2. Preparación de la suspensión del microorganismo. VER ANEXO No.7.
1. Seleccionar el microorganismo de prueba para cada antibiotico.
2. De la cepa que esta bajo refrigeración, subcultivo de trabajo, tomar un tubo de

microorganismo seleccionado, que tenga la fecha mas reciente no mayor de 1
mes.
2.1 Tomar de refrigerador:
- Agar antibiótico No 1 inclinado 3 tubos, a excepción para la potencia de

gentamicina 2 tubos.
3. Rotular los tubos: con los siguientes datos:
-Nombre del microorganismo y ATCC.
-Fecha de pase.
-Firma del analista.
4. Pasar 2-3 asadas del cultivo seleccionado a los tubos rotulados anteriormente
agar antibiótico número 1.
5. Incubar: antibiótico No. 1 30-35 ºC
6. Sacar del incubador antibiótico No.1 inclinado con crecimiento del

microorganismo de 24 horas.
7. Anotar en el cuaderno de preparación de estandarización de suspensiones del

microorganismo de prueba, los siguientes datos:
• Nombre del microorganismo
• ATCC
• Fecha de preparación
• Firma del analista
• Factor de dilución practico
• Numero de tubos utilizados: Antibiótico. No 1
• Cantidad de solución salina utilizada (ml)
• Fecha de vencimiento
• Firma del analista
• Porcentaje de transmitancia
8.1 Rotular el tubo para realizar la dilución practica, anotar los siguientes datos:
• ATCC
• Factor de dilución práctica
Ejemplo Teórico 1:14(ml), para obtener el 25℅ T
Práctico 0.5ml; 6.5ml
8.2 Potencia de gentamicina: es exclusivo para este antibiótico.
8.2.2 Rotular el tubo donde se va a hacer la dilución practica de trabajo que se utiliza en el
ensayo, anotar los siguientes datos:
• ATCC
• Dilución 1: 9ml
9. Con una pipeta estéril agregar 2 - 20ml solución salina estéril 0.9% al tubo o frasco con
crecimiento del microorganismo de 24 horas.
En caso de potencia de gentamicina se utilizará 1 tubo y se deberá agregar 12ml de solución

salina.
9.1. Al tubo de dilución práctica agregar el volumen sugerido de solución salina, para obtener
el 25%T.
9.2 Al tubo de dilución (1:10ml) que se utiliza para el ensayo, agregar 9ml de solución salina
estéril, solamente para potencia de gentamicina.
9.3. A dos celdas agregar 4-8 ml de solución salina 0.9% estéril para blanco/spectronic.
10. Esterilizar el asa redonda y dejar enfriar.
10.1. Introducir con mucho cuidado el asa en el tubo o frasco donde está el crecimiento del
microorganismo procurando no rozar la parte externa y desprender toda la masa.
10.2. Depositar toda la masa obtenida del desprendimiento en el erlenmeyer que esta rotulado
(inciso 8), esto se conocerá como solución madre de microorganismo. Una vez utilizado se
guardara en refrigeración hasta la fecha de vencimiento.
10.2.1 Si la solución madre de microorganismos no va a utilizarse el mismo día de su

recolección, proceder a guardar bajo refrigeración hasta el día del ensayo (antes de su fecha de
vencimiento).
Ejemplo: para el resto de antibióticos se realizará el siguiente cálculo:
Inoculo teórico 0.4ml -------25% T
X -------------62.5% T Lectura practico / 100ml medio de cultivo
10.3 Agitar manualmente el erlemeyer con cuidado de no salpicar la retapa, en caso de

erlemeyer con tapón de rosca la agitación se hará eléctrico.
10.4 Con pipeta estéril de 1ml tomar de la solución madre del microorganismo el volumen
sugerido al tubo de dilución práctica que contiene la solución salina. (Inciso 8.1)
Ejemplo:
0.5 ml microorganismo / 6.5ml solución salina
10.5 Con la misma pipeta estéril tomar de la solución madre de microorganismo el volumen
sugerido al tubo de dilución práctica que contiene la solución salina (inciso 8.2 y 8.2.2)
dilución 1:10 ml ese tubo se utilizará para el ensayo de potencia de gentamicina
exclusivamente.
1.1 Una vez utilizado el erlemeyer que contiene la solución madre del microorganismo,
guardar en refrigeración para evitar confusiones.
11.1 Descartar la solución madre de microorganismos hasta concluir la fecha de vencimiento.
B. Estandarización de la suspensión de microorganismo:
1. Agitar de dilución práctica
Ejemplo:
0.5ml microorganismo: 6.5ml de solución salina.
2. Ver procedimiento operativo de spectronic (UV- 1700) shimazu.
2.1 Leer en el espectrofotómetro a 580nm, el porcentaje de transmitancia (aproximadamente el

25%).
3. Blanquear utilizando 2 celdas que contiene solución salina estéril 0.9% hasta obtener 100%T
3.1 Dejar la celda del fondo y sacar la otra.
4. Agregar a la celda 4.8-8ml de la solución práctica (tubo rotulado 0.5ml-6.5ml).
5. Descartar la dilución práctica (tubo rotulado 0.5ml-6.5ml).
5.1 Descartar los tubos de agar antibiótico No 1, sobrante con crecimiento de 24 horas.
6. Con este dato determinar el inóculo del microorganismo de prueba que se debe añadir a
100ml de agar difundido, mediante una regla de 3.
6.1 Anotar en el cuaderno o bitácora (potencia de antibióticos) del analista los siguientes datos:
• Fecha
• ATCC
• % T (práctico)
• Inoculo teórico.
Ejemplo: 0.03ml-100ml medio de cultivo (25% T)
0.03ml ------ 25 % T
X ----------------- 76.8 T práctico
X= 0.092ml
7.1 Solamente para potencia de gentamicina:
Por el factor de dilución se multiplicador 10 (1:10)
Ejemplo: 0.092ml suspensión de microorganismos x 10= 0.92ml/ 100ml del medio

fundido.
1.3. Procedimiento estandarizado de Potencia de Antibiótico mediante el método

Cilindro-Placa (3+3). VER ANEXO No. 8.
Preparación del Patrón.
Para preparar la solución de patrón primario, si la monografía del patrón no indica otra cosa,
secar según las especificaciones establecidas y pesar una cantidad exacta de la sustancia de
referencia y realizar las diluciones de referencia con los solventes y concentraciones indicadas
para cada antibiótico que en total representan 3 diluciones (S3, S2, S1). Almacenar en un
refrigerador la primera dilución de referencia, usarlo dentro del periodo indicado.
Preparación de la muestra.
De la información que se tenga de la muestra, asignarle una concentración teórica por unidad
de peso o volumen y en base a este dato, preparar el día de las pruebas las diluciones como se
especifican para cada antibiótico que en total representan 3 diluciones (D3, D2, D1) con un
valor teórico igual a las del patrón.
Preparación de capa base.
Con ayuda de una pipeta serológica de 25ml, agregar la cantidad de medio fundido a cada plato
petry según Farmacopea. ANEXO No. 10
Distribuir el medio por todo el fondo del plato, colocar la tapa, dejar solidificar. Una vez
endurecido el medio incubar por 15 minutos de 35-37ºC, para evitar el agua condensada.
Colocar la capa siembra.
Preparación de capa Siembra.
Fundir y enfriar a 42ºC una cantidad suficiente del medio de cultivo necesaria para todas las
placas. Mantener siempre en baño termostatizado a temperatura constante.
Agregar el inóculo sugerido de la suspensión del microorganismo de ensayo al medio de

cultivo.
Agitar el frasco haciéndolo girar, para obtener una suspensión homogénea del
microorganismo.
Agregar a cada placa la cantidad indicada del medio inoculado (5 ml) inclinando el plato hacia
atrás y el frente para distribuir el agar inoculado en forma uniforme sobre la capa base
(trasladar a baño maría el medio de cultivo para esta operación en el lugar de la mesa).
Dejar solidificar la capa siembra.
Colocar inmediatamente sobre la superficie del agar inoculado 6 cilindros en cada placa de
forma manual auxiliándose de una pinza y asegurándose que quede un espacio 2-3 mm del
medio y de no colocarlo de forma fuerte, ni brusca, cubrir los platos posteriormente para evitar
contaminación. Dejar 5 minutos en reposo y proceder al llenado de los cilindros el cual debe
ser de 170 µl.
Para llenar los cilindros se realiza el siguiente procedimiento:
En el análisis se usa un total de 10 platos. En cada plato se llena 3 cilindros alternos con las
diluciones de referencia (S1, S2, S3) y los otro 3 cilindros con las diluciones de la muestras
(D1, D2, D3). VER ANEXO No. 17.
El llenado de los cilindros de los cinco primeros platos se debe hacer con una pipeta
automática (cambiando la punta para cada concentración) siguiendo el siguiente orden:
Dilución S1 vs. D1
Dilución S2 vs. D2
Dilución S3 vs. D3
Proceder al llenado de los cinco platos restantes y cambiar la punta de la pipeta para cada
concentración según el siguiente orden:
Dilución D1 vs. S1
Dilución D2 vs. S2
Dilución D3 vs. S3
Obtención de los resultados:

Quitar los cilindros, medir los halos de inhibición usando lector de zona, anotar los diámetros
de cada zona de inhibición y procesar los datos para el diseño 3+3 utilizando un programa:
para ensayo indirecto cuantitativo rectas paralelas con análisis de varianza.
2. Realizar la caracterización de la cepa control de St. epidermidis con pases al Agar
Sangre de Carnero y Agar Manitol:
Se realizó el siguiente procedimiento:
1. Esterilizamos el asa redonda con ayuda de un mechero.
2. Con el asa redonda tomamos una o dos asadas del caldo BHI.
3. Realizamos un estriado en la placa que contenía el agar sangre de carnero.
4. Invertimos la placa.
5. Incubamos a una temperatura de 30-35 ºC por 24 horas.
6. Esterilizamos el asa redonda con ayuda de un mechero.
7. Con el asa redonda tomamos una o dos asadas del caldo BHI.
8. Realizamos un estriado en la placa que contenía el agar manitol.
9. Invertimos la placa.
10. Incubamos a una temperatura de 30-35 ºC por 48 horas.
Efectuar estabilidad bioquímica de la cepa microbiana (ver procedimiento 1.1.).
3. Verificar la ausencia de microorganismos contaminante en el agar utilizado para el

ensayo microbiológico de gentamicina, se efectúa el aislamiento en agar sangre de
carnero y agar manitol.
Seguir el siguiente procedimiento:
Se iniciará con la preparación de los medios de cultivo correspondiente.
A continuación se procederá al aislamiento de la cepa contenida en la capa siembra de la

siguiente manera:
Tomar 2-3 asadas usando asa redonda de agar contenido en las placas del ensayo de
Gentamicina y aislarla en agar sangre de carnero y manitol. Incubar invirtiendo las placas de
24 - 48 horas. Observar el crecimiento de colonias en las placas, realizar Tinción de Gram y
registrar los resultados. Esperando obtener solamente presencia de colonias redondas Gram
Positiva agrupadas en racimos.
4. Para cumplir con los criterios de aceptación del diseño experimental.
El diseño experimental estará basado en un análisis estadístico de ANOVA de dos factores.

Para cumplir con los criterios se hará el siguiente procedimiento: una vez recopilado los datos
de los ensayos de potencia de Gentamicina, se someterán al test estadístico de Anova para
verificar que cumplen con los criterios de aceptación. Los ensayos deben cumplir con estos
criterios para considerarse validos.
Regresión <0.01
Desviación del paralelismo >0.05
Curva Combinada >0.05
Curva Opuesta >0.05
5. Comparación de los resultados obtenidos del ensayo de potencia esterilizando

solamente el material volumétrico que entra en contacto con el microorganismo y el
ensayo de potencia esterilizando todo el material volumétrico y veremos si nuestro
método satisface las expectativas esperadas.
Para efectuar esta comparación se tomarán los resultados de ambos ensayos, no deben de haber
contaminación de microorganismos ajenos. Calcularemos el promedio, luego lo someteremos a
medidas de dispersión como son: la desviación estándar y el coeficiente de variación. Los
ensayos se considerarán válidos si están dentro del rango de la desviación estándar para
ensayos microbiológicos (D.E. <5%)
6. Procedimos a la calibración de balones de 25ml sometido a esterilización y no sometido

a esterilización para determinar la influencia de la temperatura en las moléculas del
vidrio y de esta manera verificar el margen de error de los balones facilitado por el
MINSA. VER ANEXO No. 9.
5.5. MATERIAL Y EQUIPOS.
Material:
Los materiales usados para realizar en el estudio se describen en la tabla siguiente y se han
clasificado en materiales sometidos a esterilización y materiales no sometidos a esterilización
para facilitar su comprensión.
Material de Laboratorio Esterilizado Material de Laboratorio no Esterilizado
Plato petry de vidrio 100mm x 20mm. Balones. 10ml, 25ml, 50ml, 100ml Kimax,
Assistent, Pirex.
Cilindro de acero inoxidable: diámetro Pipeta Pasteur: 1000µl.

externo 8mm, diámetro interno 6mm y
longitud 10mm.
Pipetas serológicas Assistent: 1, 2, 5, 11, 25 Pipetas serológicas Assistent: 1, 2, 5ml.

ml.
Botellas de dilución de 160ml. Pipeta automática VOLAC serie 99080414

volúmenes range 40-200 µl.
Tubos de ensayo de vidrio con rosca Probetas: 50ml, 100ml.

125mm x 25mm.
Pinza de acero inoxidable Celdas de cuarzo.
Puntas de pipeta automática volar.
Pipeta Pasteur.
Equipos:
Espectrofotómetro UV- visible 1700 doble celda SHIMADZU serie: A11024234339 CS.
Lector de zona de inhibición FISHER modelo 290 serie: 126.
Microscopio binocular, NIKON serie 518926.
Microscopio binocular, NIKON serie 518926.
Balanza analítica OHAUS GA 200D serie 2078.
Esteroscopio REICHERT modelo 650 serie: 18694-2.
Vortex Genie 2 scientific industries serie 158719.
Agitador magnético con hotplate marca selecta serie: 0453718.
pH metro Grison modelo GLP-22 serie 431017.
Incubadora crema de 1 puerta para medio de cultivo marca 2. Precisión scientific modelo 4L.
Autoclave P- selecta para descontaminar modelo 4047725 serie 0453696.
Autoclave para esterilizar medios de cultivo, YAMATO modelo 5m510 serie 1800299-6286.
Horno gris celeste para esterilizar cristalería marca: RAYPA modelo DO-90 serie 50467.
Incubadora de 1 puerta precisión scientific serie 9604-0116.
Exhibidor FOGEL para mantenimiento de reactivos y ceparios.
Horno al vacío marca FISHER scientific modelo 281.
Bomba al vacío ILMVAC.
Baño maría.
Mechero Bunsen.
Material de descarte:
Algodón, Papel de aluminio, Papel toalla, Gorros, Guantes, Naso buco, Papel pH.
Otros materiales:
Lápiz graso, Marcadores, Termómetro, Espátulas.
Reactivos:
Azul de bromotimol.
Safranina.
Lugol.
Alcohol cetona.
Cristal violeta.
HCL 1 %.
NAOH 1%.
Agua destilada.
Acido fosforito 18 N.
Después de haber realizado el Ensayo de Potencia de Antibiótico por el método Cilindro-

Placa usando como muestra Gentamicina Sulfato, esterilizando solamente el material
volumétrico que esta en contacto con el microorganismo de trabajo y el otro método en
que se esteriliza toda la cristalería, se generaron los siguientes resultados:
Al realizar el ensayo de potencia de antibiótico esterilizando solamente el material volumétrico

que entra en contacto con el microorganismo de trabajo observamos:
En los medios que se encontraban en las placas se formaron halos sin presencia de colonias
contaminantes observando solamente el crecimiento de St .epidirmidis. VER ANEXO No. 13.
De 22 placas petri utilizadas se contaminó 1 placa, se le realizó prueba de Tincion de Gram

revelando la presencia de bacilos gram (-) largos y gruesos.
Las muestras de Gentamicina Sulfato cumplen con las especificaciones de la Monografía USP:
Se encuentran dentro del límite de tolerancia declarado en la monografía oficial siendo de no

menos del 90% y no más del 125%.
Las muestras de Gentamicina se encuentran dentro de los límites inferior y superior de la

potencia de antibióticos.
Al realizar el ensayo de potencia de antibiótico esterilizando todo el material volumétrico

encontramos iguales resultados a los anteriormente descritos.
En los medios que se encontraban en las placas se formaron halos claros y de circunferencia
bien definidos y solamente con presencia de St. epidermidis VER ANEXO No. 13.
Las muestras de Gentamicina Sulfato cumplen con las especificaciones de la Monografía USP:
Se encuentran dentro del límite de tolerancia declarado en la monografía oficial siendo de no

menos del 90% y no más del 125%.
Las muestras de Gentamicina se encuentran dentro de los límites inferior y superior de la

potencia de antibióticos.
Para verificar la presencia de St.epidermidis se realizó tinción de gram, siembra en agar

sangre de carnero y agar manitol (Caracterización de la Cepa Trabajo). Obteniendo
resultados positivos para cada una de las pruebas. VER ANEXO No. 14.
TABLA No.1 Caracterización de Cepa inicial.
Organismo de Tinción de Gram Agar Sangre Agar Manitol

prueba Carnero
St. epidermidis Colonias moradas Colonias blancas sin Colonias blancas.

en forma de racimos hemólisis.
ATCC 12228 de uva.
St. epidermidis + +/ sin hemólisis +

ATCC 12228
Fuente Primaria. (+): Presencia.
Interpretación:
• LA tinción de gram reveló la presencia de cocos gram (+) en forma de racimos de uvas,
de color moradas característica de nuestra cepa de trabajo.
• Agar Sangre de Carnero: presencia de colonias blancas con crecimiento homogéneo sin
hemólisis.
• Agar Manitol: crecimiento de colonias blancas homogéneas.
Al finalizar los ensayos de Potencia de Gentamicina esterilizando solamente el material

volumétrico que esta en contacto con el microorganismo, se efectúo el aislamiento del
microorganismo localizado en los medios (Agar) de las placas usadas para los ensayos,
comprobando de esta manera la ausencia de microorganismo contaminante. Excepto la
placa que se contaminó. VER ANEXO No. 14.
TABLA No.2 Ensayos de Potencia de Gentamicina esterilizando solamente el material

volumétrico que esta en contacto con el Microorganismo para las dos repeticiones.
Organismo de Tinción de gram Agar Sangre Agar Manitol

prueba. Carnero
St. epidermidis Colonias moradas Colonias blancas sin Colonias blancas.

en forma de racimos hemólisis.
ATCC 12228 de uva.
St. epidermidis + +/ sin hemólisis +

ATCC 12228
Fuente Primaria. (+): Presencia.
Interpretación:
La tinción de gram reveló la presencia de cocos gram (+) en forma de racimos de uvas, de
color moradas característicos de nuestra cepa de trabajo.
Agar Sangre de Carnero: presencia de colonias blancas con crecimiento homogéneo sin
hemólisis.
Agar Manitol: crecimiento de colonias blancas homogéneas.
Los ensayos de Potencia de Gentamicina esterilizando todo el material volumétrico y

esterilizando solamente el material volumétrico que esta en contacto con el
Microorganismo, cumplieron los criterios de aceptación del diseño experimental
ANOVA.
TABLA No.3 Resultados del ensayo de Potencia de Gentamicina esterilizando todo el material
volumétrico. Muestra #1:
ANALISIS DE LA VARIANZA
Fte. Variación Gl SC CM F P
Preparaciones 1 1,1408 1,1408 4,6700 >0.05
Regresión 1 162,0000 162,0000 663,1484 <0.01
Desv. Paralel. 1 0,1250 0,1250 0,5117 >0.05
Curv. Comb. 1 0,0150 0,0150 0,0614 >0.05
Curv. Opuesta 1 0,0067 0,0067 0,0273 >0.05
Tratamientos 5 163,2875
Bloques 7 15,6592 2,2370 9,1573 <0.05
Totales 47 187,2525
Error* 34 8,3058 0,2443
Fuente Primaria.
TABLA No.4 Resultados del ensayo de Potencia de Gentamicina esterilizando todo el material
volumétrico. Muestra #2:
Fte. Variación Gl SC CM F P
Preparaciones 1 5,4675 5,4675 7,4450 >0.05
Regresión 1 168,3613 168,3613 229,2540 <0.01
Desv. Paralel. 1 1,3613 1,3613 1,8536 >0.05
Curv. Comb. 1 0,3037 0,3037 0,4136 >0.05
Curv. Opuesta 1 0,1837 0,1837 0,2502 >0.05
Bloques 7 4,3658 0,6237 0,8493 <0.05
Totales 47 205,0125
Error* 34 24,9692 0,7344
Fuente Primaria.
TABLA No.5 Resultados del ensayo de Potencia de Gentamicina esterilizando solamente el

material volumétrico que esta en contacto con el microorganismo. Muestra #3:
Fte. Variación gl SC CM F P
Preparaciones 1 1,6875 1,6875 5,7413 >0.05
Regresión 1 182,4050 182,4050 620,5907 <0.01
Desv. Paralel. 1 0,0800 0,0800 0,2722 >0.05
Curv. Comb. 1 0,5704 0,5704 1,9407 >0.05
Curv. Opuesta 1 0,0337 0,0337 0,1148 >0.05
Bloques 7 4,2292 0,6042 2,0555 <0.05
Totales 47 198,9992
Error* 34 9,9933 0,2939
Fuente Primaria.
TABLA No.6 Resultados del ensayo de Potencia de Gentamicina esterilizando solamente el

material volumétrico que esta en contacto con el microorganismo. Muestra #4:
Fte. variación gl SC CM F P
Preparaciones 1 6,0919 6,0919 14,8576 >0.05
Regresión 1 147,9200 147,9200 360,7643 <0.01
Desv. Paralel. 1 0,2450 0,2450 0,5975 >0.05
Curv. Comb. 1 0,0004 0,0004 0,0010 >0.05
Curv. Opuesta 1 1,0837 1,0837 2,6432 >0.05
Bloques 7 14,6531 2,0933 5,1054 <0.05
Totales 47 183,9348
Error* 34 13,9406 0,4100
Fuente Primaria.
Se realizaron dos repeticiones para el ensayo de potencia: los ensayos con la variante de
la esterilización de la cristalería y los ensayos sin la variante de la esterilización de la
cristalería, obteniéndose los siguientes resultados:
Ensayo de Potencia de Gentamicina con material volumétrico esterilizado.
ENSAYO DE ANTIBIOTICO
METODO: CILINDRO-PLACA
ANTIBIOTICO: Gentamicina sulfato.
Microorganismo de ensayo: ST. Epidermidis, ATCC: 12228.
Agregar: 0.03ml de microorganismo / 100 ml medio de cultivo. % T: 25.
Medio de cultivo base: 12 ml. Medio de cultivo siembra: 5ml.
Estándar de referencia: Gentamicina sulfato. Vencimiento: 24/02/09.
Procedencia: USA, Potencia: 680 mcg / mg ó UI / mg, lote: j-1.
mg pesado: 10, Venc.: 24/02/09.
Fecha de pesado: 26/01/09 Solv. Inicial: buffer # 3.
Fecha de ensayo: 02/02/09 Solv. Final: buffer# 3.
Analista: 1.
Inoculo práctico: 0.6ml susp. Microb. / 100 ml medio de cultivo. 52.3%T.
CALCULOS: Estándar de referencia.
Solución madre:
10mg X 680µg/mg
10ml
= 680µg/ml
0.8ml:100
= 5.44µg/ml
0.9ml:25ml 1.8ml:25ml 3.6ml:25ml
= 0.1958µg/ml (S1) = 0.39168µg/ml (S2) = 0.79968 µg/ml (S3)
MUESTRA #: 1
NOMBRE GENERICO: Gentamicina Sulfato.

NOMBRE COMERCIAL: Gentamina Inyectable.
LAB. / PROCEDENCIA: UNIPHARM Guatemala C.A.
FECHA FAB. : 09/08 FECHA VENC. : 09/011.
LOTE: NHR FECHA DE ANALISIS: 02/02/09.
ANALISTA: 1. FECHA DE LECTURA: 03/02/09.
CALCULOS:
Pool
1ml / 40,000µg
1ml / 100ml
1ml / 25ml
0.3ml: 25ml 0.6ml: 25ml 1.2ml: 25ml

= 0.192 µg /ml (D1) = 0.384 µg /ml (D2) = 0.768 µg /ml (D3)
POTENCIA DE CILINDRO-PLACA: GENTAMICINA

ESTANDAR : Primario U.S.P. Gentamicina Sulfato P: 680 ug/mg L: J-1 V: 30 dias (24/2/09)
MUESTRA : # 1 Gentamina ( Gentamicina Sulf. 80 mg/2 ml) Sol. inyectable
Laboratorio: UNIPHARM, Guatemala L: NHR F. Fab.: 9/08 V: 9/2011
ANALISTA : # 1 FECHA DE CALCULO: 27/01/09
FECHA DE ANALISIS: FECHA DE REVISION:
REVISADO POR:
<<PATRON>> << MUESTRA >>

CONCENTRACIONES ug/ml || CONCENTRACION ug/ml
0,18 0,39 0,80 || 0,18 0,38 0,78 TOTALES
||
16,20 18,80 20,20 || 16,80 18,60 20,60 111,2
16,60 19,20 21,00 || 17,00 18,80 22,00 114,6
17,40 19,80 21,60 || 17,60 20,40 22,00 118,8
17,40 20,20 22,20 || 18,00 20,20 22,40 120,4
16,60 18,60 22,40 || 17,60 19,60 21,40 116,2
16,00 19,80 22,60 || 18,40 20,00 22,00 118,8
19,00 20,00 22,40 || 17,80 20,60 23,20 123
17,60 18,80 21,40 || 17,20 19,20 21,80 116
||
136,80 155,20 173,80 || 140,40 157,40 175,40 939
Ingrese el número de preparaciones......................................... 2

Ingrese el número de dosis de cada preparción...................... 3
Ingrese el número de placas....................................................... 8
Ingrese el valor de la Potencia Supuesta.................................. 40,80 mg/ml
Ingrese el valor de t par 34 grados de libertad.. 2,03
----------- ANALISIS DE LA VARIANZA ----------- ----------------- ----------------- ----------------

----------- ----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
Fte. variación gl SC CM F p
----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
Preparacione 1 1,1408 1,1408 4,6700 >0.05
Regresión 1 162,0000 162,0000 663,1484 <0.01
Desv. parale 1 0,1250 0,1250 0,5117 >0.05
Curv. Comb. 1 0,0150 0,0150 0,0614 >0.05
Curv. Opuest 1 0,0067 0,0067 0,0273 >0.05
Bloques 7 15,6592 2,2370 9,1573 <0.05
Totales 47 187,2525
Error* 34 8,3058 0,2443
----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
----------- ----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------

----------- CALCULO DE LA POTENCIA E INTERVALO DE CONFIANZA ----------------
----------- ----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
I .................... ..... 0,3276
M .................... ..... 0,0449
R .................... ..... 1,1089
POTENCIA CALCULADA.......................................................... 45,2 mg/ml

PORCIENTO ENCONTRADO…………………………………… 110,78 %
RANGO USP /200: % Pag. ug/mg
C .................... ..... 1,0063
Ms .................... ..... 0,0876
Mi .................... ..... 0,0027
Rs .................... ..... 1,2235
Ri .................... ..... 1,0063
LIMITE SUPERIOR DE LA POTENCIA..................................... 49,9 mg/ml
LIMITE INFERIOR DE LA POTENCIA...................................... 41,1 mg/ml

Tabla F (1,34) : 4,13 ( 5 % )
7,44 (1 % )
% Superior........................................................... 10,34
% Inferior.............................................................. 9,25
Microorganismo de ensayo: ST. Epidermidis ATCC: 12228.
mg pesado: 10, Venc.: 24/02/09.
Analista: 2.
Inoculo práctico: 1ml susp. Microb. / 100 ml medio de cultivo. 81%T.
Solución madre:
10mg X 680µg/mg
10ml
= 680µg/ml
0.8ml:100
= 5.44µg/ml
0.9ml:25ml 1.8ml:25ml 3.6ml:25ml
MUESTRA #: 2

ANALISTA: 2. FECHA DE LECTURA: 03/02/09
CALCULOS:
Pool
1ml / 40,000µg
1ml / 100ml
1ml / 25ml
0.3ml: 25ml 0.6ml: 25ml 1.2ml: 25ml

POTENCIA DE CILINDRO-PLACA: GENTAMICINA

ESTANDAR : Primario Gentamicuna Sulfato L: J-1 Proc.: U.S.A Pot: 680 ug/mg V: 23/10/08, 30 dias
MUESTRA : # 2 Gentamina (Gentamicina Sulfato 80 mg/2 ml Sol. Iny.)
Lab. / Procedencia: Unipharm. L: NHR. F.F: 9/08, F .V: 9/2011.
ANALISTA : # 2 FECHA DE CALCULO: POR:
FECHA DE ANALISIS: FECHA DE REVISION:
REVISADO POR:

0,20 0,39 0,78 || 0,20 0,38 0,78 TOTALES
||
10,20 16,60 18,80 || 16,00 17,80 19,60 99
14,00 17,20 19,00 || 15,20 17,20 19,80 102,4
14,20 16,40 19,00 || 15,00 17,80 19,40 101,8
14,60 16,80 19,60 || 15,20 17,80 19,60 103,6
14,20 16,80 19,00 || 15,60 17,60 20,20 103,4
14,80 17,40 19,00 || 16,20 17,80 19,80 105
16,00 16,80 20,00 || 15,00 17,20 18,80 103,8
15,80 18,20 19,40 || 15,00 17,00 19,40 104,8
||
113,80 136,20 153,80 || 123,20 140,20 156,60 823,8


----------- ----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
Preparacione 1 5,4675 5,4675 7,4450 >0.05
Regresión 1 168,3613 168,3613 229,2540 <0.01
Desv. parale 1 1,3613 1,3613 1,8536 >0.05
Curv. Comb. 1 0,3037 0,3037 0,4136 >0.05
Curv. Opuest 1 0,1837 0,1837 0,2502 >0.05
Bloques 7 4,3658 0,6237 0,8493 <0.05
Totales 47 205,0125
Error* 34 24,9692 0,7344
----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
----------- ----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------

----------- ----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
I .................... ..... 0,3010
M .................... ..... 0,0886
R .................... ..... 1,2263

RANGO USP 29/2006: 90-125 % Pag. 1,144 ug/mg
C .................... ..... 1,0183
Ms .................... ..... 0,1578
Mi .................... ..... 0,0226
Rs .................... ..... 1,4382
Ri .................... ..... 1,0534

Tabla F (1,34) : 4,13 ( 5 % )
7,44 (1 % )
% Superior........................................................... 17,28
% Inferior.............................................................. 14,09
Potencia de Gentamicina esterilizando el material volumétrico que entra en contacto con el M.O.
Medio de cultivo base: 12ml. Medio de cultivo siembra: 5ml.
mg pesado: 10.
Fecha de pesado: 26/01/09 Solv. Inicial: buffer # 3
Fecha de ensayo: 02/02/09 Solv. Final: buffer# 3
Analista: 1.
Inoculo práctico: 0.8 ml susp. Microb. / 100 ml medio de cultivo. 69.3%T.
Solución madre:
10mg X 680µg/mg
10ml
= 680µg/ml
0.8ml:100
= 5.44µg/ml
0.9ml:25ml 1.8ml:25ml 3.6ml:25ml
MUESTRA #: 3
NOMBRE GENERICO: Gentamicina Sulfato

NOMBRE COMERCIAL: Gentamina Inyectable
FECHA FAB. : 09/08 FECHA VENC. : 09/011
LOTE: NHR FECHA DE ANALISIS: 02/02/09
ANALISTA: 1 FECHA DE LECTURA: 03/02/09
CALCULOS:
Pool
1ml / 40,000µg
1ml / 100ml
1ml / 25ml
0.3ml: 25ml 0.6ml: 25ml 1.2ml: 25ml

POTENCIA DE CILINDRO-PLACA: Gentamicina

ESTANDAR : Primario U.S.P, Gentamicina Sulfato P: 680 ug/mg V: 30 dias (24/2/09)
MUESTRA : #3 Gentamina (Gentamicina Sulfato 80 mg/ 2 ml) Sol. Inyectable
Fabricante: Unipharm, Guatemala. Lote: NHR F. F: 9/08, V: 9/2011.
ANALISTA :# 1 FECHA DE CALCULO: 4/2/09
FECHA DE ANALISIS: 2/2/09 FECHA DE REVISION:
REVISADO POR:

0,20 0,39 0,78 || 0,19 0,38 0,77 TOTALES
||
14,10 17,50 18,80 || 14,60 17,60 19,50 102,1
14,60 16,90 19,10 || 15,90 17,10 20,10 103,7
14,90 18,50 19,80 || 14,60 19,00 20,40 107,2
14,20 18,60 19,40 || 14,50 18,00 20,00 104,7
15,90 16,60 19,50 || 15,20 17,10 19,80 104,1
14,70 16,10 19,20 || 15,10 16,90 19,30 101,3
14,80 17,50 19,80 || 15,20 18,00 20,20 105,5
14,40 16,90 19,40 || 15,00 17,30 19,80 102,8
||
117,60 138,60 155,00 || 120,10 141,00 159,10 831,4

------------ ------------------ ------------------ ------------------------------- ------------------ ------------------ -----------------

------------ ANALISIS DE LA VARIANZA ------------ ------------------ ------------------ -----------------
------------ ------------------ ------------------ ------------------ ------------ ------------------ ------------------ -----------------
------------------ ------------------ ------------------ ------------ ------------------ ------------------ -----------------
Preparacione 1 1,6875 1,6875 5,7413 >0.05
Regresión 1 182,4050 182,4050 620,5907 <0.01
Desv. paralel 1 0,0800 0,0800 0,2722 >0.05
Curv. Comb. 1 0,5704 0,5704 1,9407 >0.05
Curv. Opuesta 1 0,0337 0,0337 0,1148 >0.05
Bloques 7 4,2292 0,6042 2,0555 <0.05
Totales 47 198,9992
Error* 34 9,9933 0,2939
------------------ ------------------ ------------------ ------------ ------------------ ------------------ -----------------
------------ ------------------ ------------------ ------------------ ------------ ------------------ ------------------ -----------------

------------ CALCULO DE LA POTENCIA E INTERVALO DE CONFIANZA -----------------
------------ ------------------ ------------------ ------------------ ------------ ------------------ ------------------ -----------------
I ...................... ..... 0,3011
M ...................... ..... 0,0473
R ...................... ..... 1,1151
POTENCIA CALCULADA............................................................... 45,5 mg/ml

C ...................... ..... 1,0067
Ms ...................... ..... 0,0880
Mi ...................... ..... 0,0072
Rs ...................... ..... 1,2246
Ri ...................... ..... 1,0168
LIMITE SUPERIOR DE LA POTENCIA........................................ 50,0 mg/ml
LIMITE INFERIOR DE LA POTENCIA.......................................... 41,5 mg/ml

Tabla F (1,34) : 4,13 ( 5 % )
7,44 (1 % )
% Superior................................................................. 9,83
% Inferior.................................................................... 8,81
Agregar: 0.03ml de microorganismo / 100 ml medio de cultivo. % T: 25
Estándar de referencia: Gentamicina sulfato. Vencimiento: 24/02/09
mg pesado: 10.
Analista: 2.
Inoculo práctico: 0.9ml susp. Microb. / 100 ml medio de cultivo. 82.3%T.
Solución madre:
10.5mg X 680µg/mg
10ml
= 714µg/ml
0.8ml:100
= 5.712µg/ml
0.8ml:25ml 1.7ml:25ml 3.5ml:25ml
MUESTRA #: 4

ANALISTA: 2 FECHA DE LECTURA: 03/02/09.
CALCULOS:
Pool
1ml / 40,000µg
1ml / 100ml
0.7ml / 50ml
0.8ml: 25ml 1.7ml: 25ml 3.5ml: 25ml

POTENCIA DE CILINDRO-PLACA: Gentamicina

ESTANDAR : Primario U.S.P, Gentamicina Sulfato P: 680 ug/mg V: 30 dias (24/2/09)
MUESTRA : # 4 Gentamina (Gentamicina Sulfato 80 mg/ 2 ml) Sol. Inyectable
Fabricante: Unipharm, Guatemala. Lote: NHR F. F: 9/08, V: 9/2011.
ANALISTA :# 2. FECHA DE CALCULO: 03/02/09 POR: F. Lo
FECHA DE ANALISIS: 27/1/09 FECHA DE REVISION:
REVISADO POR:

0,20 0,39 0,78 || 0,19 0,38 0,77 TOTALES
||
13,00 15,90 17,10 || 14,30 15,60 18,00 93,9
13,70 15,80 16,80 || 13,80 16,20 18,80 95,1
13,20 15,50 16,90 || 13,70 15,70 18,50 93,5
15,10 16,90 18,80 || 14,90 16,30 22,10 104,1
13,90 15,40 17,90 || 14,00 16,60 18,20 96
12,80 15,10 17,50 || 14,20 16,00 17,60 93,2
12,60 16,90 17,50 || 14,60 15,70 17,80 95,1
13,00 14,90 17,80 || 13,80 16,60 18,10 94,2
||
107,30 126,40 140,30 || 113,30 128,70 149,10 765,1

----------- ----------------- ----------------- ----------------------------- ----------------- ----------------- ----------------

----------- ----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
Preparacione 1 6,0919 6,0919 14,8576 >0.05
Regresión 1 147,9200 147,9200 360,7643 <0.01
Desv. parale 1 0,2450 0,2450 0,5975 >0.05
Curv. Comb. 1 0,0004 0,0004 0,0010 >0.05
Curv. Opuest 1 1,0837 1,0837 2,6432 >0.05
Bloques 7 14,6531 2,0933 5,1054 <0.05
Totales 47 183,9348
Error* 34 13,9406 0,4100
----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
----------- ----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------

----------- ----------------- ----------------- ----------------- ----------- ----------------- ----------------- ----------------
I .................... ..... 0,3011
M .................... ..... 0,0998
R .................... ..... 1,2583

C .................... ..... 1,0116
Ms .................... ..... 0,1549
Mi .................... ..... 0,0470
Rs .................... ..... 1,4285
Ri .................... ..... 1,1143

Tabla F (1,34) : 4,13 ( 5 % )
7,44 (1 % )
% Superior........................................................... 13,53
% Inferior.............................................................. 11,45
Comparación de ambos métodos de ensayos de potencia de Gentamicina Sulfato por el

método Cilindro-Placa esterilizando todo el material volumétrico y esterilizando
solamente el material volumétrico que esta en contacto con el microorganismo de prueba.
TABLA No.8 Porcentaje encontrados y el análisis estadístico de los ensayos de Potencia de

Gentamicina.
Ensayo de Potencia de Ensayo de potencia de Gentamicina

Gentamicina con material esterilizando el material
Analistas
volumétrico esterilizado. volumétrico que esta en contacto
con el Microorganismo.
ANALISTA 1 110.78 % 111.51%
ANALISTA 2 122.75 % 125.73 %
PROMEDIO 116.77 118.62
D.E. (< 5%) 1,30814755
Coeficiente de Variación 1,12027708
Fuente Primaria.
Con respecto a la calibración de 2 balones de 25ml, 1 balón sometido a esterilización y 1

balón no sometido a esterilización. Se obtuvieron los siguientes resultados:
TABLA No.9 Resultados de la Calibración de balón aforado de 25ml no sometido a

esterilización.
Calibración de un balón de 25 ml(MINSA) No Esterilizado
Volumen 25ml ±0.6ML Ident:5641 Pirex Clase A No esterilizado
D.aire 0.00118 D.liquido 0.997044 D.pesas 0.9
T ºC Masa Masa
Masa Masa Contenida contenida al Volumen
Inicial Final Aparente vacio Contenido ml
25 24,5947 49,5107 24,916 24,9128204 24,98668103
25 24,5947 49,4975 24,9028 24,8996221 24,97344359
25 24,5947 49,4961 24,9014 24,8982223 24,97203961
25 24,5947 49,5175 24,9228 24,9196195 24,99350032
25 24,5947 49,5273 24,9326 24,9294183 25,00332812
25 24,5947 49,5244 24,9297 24,9265187 25,0004199
25 24,5947 49,5002 24,9055 24,9023217 24,97615125
Promedio 24,98650912
Desviacion Limite Intervalo

Estandar 0,012991377 Confianza
C.V. 0,051993566 0,6ml>0,00962397ml
Intervalo
Confianza 0,00962397
Fuente Primaria.
TABLA No.10 Resultados de la Calibración de balón aforado de 25ml sometido a

esterilización.
Calibración de un balón de 25 ml(MINSA)Esterilizado
Volumen 25ml ±0.6ML Ident:N.D. Assisten Clase: N.D. Esterilizado
D.aire 0.00118 D.liquido 0.997044 D.pesas 0.9
T ºC Masa Masa
Masa Masa Contenida contenida al Volumen
Inicial Final Aparente vacio Contenido ml
25 22,5487 47,5747 25,026 25,0228064 25,09699308
25 22,5487 47,4681 24,9194 24,91622 24,99009068
25 22,5487 47,4638 24,9151 24,9119205 24,98577848
25 22,5487 47,4431 24,8944 24,8912232 24,96501976
25 22,5487 47,4647 24,916 24,9128204 24,98668103
25 22,5487 47,4615 24,9128 24,9096208 24,98347195
25 22,5487 47,4481 24,8994 24,8962225 24,97003394
Limite Intervalo
Promedio 24,99686699 Confianza
Desviacion 0,6ml>
Estandar 0,04511383 0,033420179
C.V. 0,18047794
Intervalo
Confianza 0,033420179
Fuente Primaria.
Según el ensayo de potencia de Gentamicina descrito en la USP y la realización de los ensayos,

pero con la diferencia de la esterilización solamente del material volumétrico que esta en
contacto con el microorganismo, observamos que no existe ninguna influencia en la variable
que se le realizó a estos ensayos; ya que cumplieron con las especificaciones establecidas en la
monografía de esta farmacopea.
En relación a los resultados obtenidos:
Encontramos que en las placas con medios de cultivo no hay contaminación debido a que
observamos halos claros y de circunferencia bien definidos, y a su alrededor colonias
pequeñas de color blanquecino gram positivo confirmando la presencia del microorganismo de
prueba St. epidermidis.
Obtuvimos la contaminación de 1 placa de las 22 con las que se estaba trabajando, atribuible a
la falta de experiencia de los analistas lo que se compenso utilizando placas extras, no
afectando ni modificando este resultado a nuestro estudio.
La caracterización del St. epidermidis en la prueba de tinción de gram, el aislamiento en agar

sangre de carnero y agar manitol antes de iniciar y finalizar cada uno de los ensayos fue para
verificar la presencia de esta bacteria así como la ausencia de otras bacterias contaminantes;
demostrándose de ésta forma que las características morfológicas básicas de nuestro
microorganismo de trabajo (St. epidermidis) coincidieron con las descritas por la literatura para
estas pruebas, manifestándose que no hubo contaminación de cultivos en el desarrollo de los
ensayos.
Al comparar y analizar los resultados obtenidos de los ensayos de potencia de Gentamicina

esterilizando solamente el material volumétrico que esta en contacto con el microorganismo y
esterilizando todo el material volumétrico nos revelan que no hay presencia de
microorganismos contaminantes en ambos métodos y que hay una mínima dispersión en los
resultados como lo demostró la Desviación Estándar; se verifica claramente que la dispersión
de los resultados entre un analista y otro, es mínima y se encuentran dentro del rango de
aceptación permitido de la Desviación Estándar para ensayos Microbiológicos(< 5%).
Con respecto a los criterios de aceptación a ser evaluados y el uso valido de análisis de
varianza (ANOVA) como herramienta de inferencia estadística, relacionado con el tratamiento
del valor (P): la regresión, desviación del paralelismo, curva opuesta y combinada han
demostrado tener valores aceptables para la valides a cada uno de nuestros ensayos.
En la calibración de los balones aforados se demostró que la temperatura es un factor que

interviene en el desarrollo del ensayo de potencia de antibióticos, debido a que al someterlos a
altas temperaturas las moléculas del vidrio se expanden provocando una variabilidad en el
volumen, causando de esta forma un error en las concentraciones de las diluciones de estándar
y de la muestra, además de afectar la vida media del producto.
Después de realizar nuestro trabajo de investigación hemos llegado a las

siguientes conclusiones:
Se demuestra que al realizar el ensayo de potencia de Antibióticos esterilizando solamente el

material volumétrico que entra en contacto con el microorganismo de prueba, este es viable y
reproducible, sin evidencias de posibles contaminaciones en los medios de cultivos usados en
el desarrollo del ensayo.
El cambio efectuado en el ensayo no interfiriere en el análisis de potencia de gentamicina, ya

que cumplen con los rangos de tolerancia del activo y criterios de aceptación del diseño
estadístico 3 + 3 que hacen valido este tipo de ensayo.
Al comparar los 2 ensayos; efectuando la variante de la esterilización y no efectuando la

variante demostramos que se obtienen resultados similares y aceptables al ser sometidos a los
test estadísticos.
Con la calibración de los balones se logro demostrar la influencia de la temperatura sobre el

material de vidrio sometido a esterilización causando un error en las medidas de volúmenes y
afectando directamente las concentraciones de las soluciones trabajo.
Para mejorar esta investigación recomendamos lo siguiente:
• Proponemos a futuros investigadores interesados en el tema realizar la validación del

ensayo de potencia en el que se esteriliza solamente la cristalería que entra en contacto
con el microorganismo por el método cilindro en placa con el objetivo de demostrar la
eficacia y tener evidencia irrefutable de que el ensayo es viable.
• Para tener una mejor apreciación de los resultados de las muestras sería conveniente
incorporar un tercer analista en los ensayos.
• A todo interesado en el tema, en vista de los nuevos avances científicos y con lo

respecta a las nuevas técnicas de caracterización de microorganismos es necesario
recurrir a nuevos métodos de identificación por biología molecular.
• Al Laboratorio Nacional de Control de Calidad de Medicamentos, tener un mayor

control en el sistema de entrada y salida, en los cambios vestimenta para asegurar más
el control de polvo, partículas y microorganismos para el control microbiológico.
• Incorporar diferenciales de presión al sistema de aire del departamento de

microbiología para reducir el riesgo de contaminaciones microbiológicas en las áreas de
trabajo.
• A los Analistas, tener extrema precaución en el desarrollo del ensayo para prevenir
contaminaciones de los medios de cultivo. Por otra parte hay que tener una buena
manipulación de la técnica para desarrollar el ensayo.
• Code of federal regulations, Food and Drugs, 21.office of the federal register
national archives and records administration 1986. Pag.242,244,251.
• Mendenhall William, Estadística Matemática con Aplicaciones 2ed. grupo

editorial Iberoamérica. México, 1994.Pág.547-548,557.
• Merck. Manual de cultivos. 2ed. 1982.

• The United State Pharmacopeia (USP) 30. The National Formulary (NF) 25, 2007.
Pag.111-118.
• Validación de Métodos Analíticos/Asociación Española de Farmacéutica de

Industria (AEFI)/ 2001.Pág.190-206.
• "Medidas de dispersión," Enciclopedia Microsoft® Encarta® Online 2008

http://mx.encarta.msn.com © 1997-2008 Microsoft Corporation. Reservados todos
los derechos.
• Potencia vs. eficacia. universidad de Arizona.
http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c2-5-1-1.html.
• Vidrio borosilicato. Instrumentación científico técnica(I, C, T, S.L.)

http://www.ictsl.net/productos/propiedadestecnicas/021b079654102b433/
Cronograma de Actividades
Actividades Especificación de Actividades Periodo 2008-2009
Elaboración de Protocolo Tema, Objetivos, Antecedentes, Noviembre 2008

Justificación, Marco Teórico
Procedimiento Experimental Material y Método Enero 2009
Procesamiento de información de Resultados y Análisis de Marzo 2009

Resultados
datos
Elaboración de Informe Final Conclusión, Recomendación, Marzo 2009

Anexos
Presentación de Informe Final Trabajo Investigativo Abril 2009

Terminado
ANEXO No. 1.
Lavado de cristalería nueva
1. Depositar la cristalería nueva en agua caliente por 1 hora.

2. Utilizar guantes de goma y sumergir la cristalería en una solución al 2% de HCL, con
una relación de 2ml por cada 3 litros de agua destilada (24-48 horas).
3. Proceder a lavar cristalería con una solución de detergentes con ayuda de hisopos, paste
y 3 ciclos de enjuague.
4. Enjuagar con agua de grifo 5 veces.
5. Sumergir y enjuagar cristalería con agua destilada 3 veces.
6. Realizar prueba al agua de lavado, con azul de bromotimol (20ml de muestra de agua
mas 4 gotas de azul de bromotimol, para una coloración azul o verdosa se debe de
continuar el enjuague y para coloración amarilla realizar secado).
7. Escurrir y secar cristalería en un horno a 100ºC x 1 hora.
8. Almacenar en lugar seco y cerrado.
ANEXO No. 2.
Medios de cultivo usados para el ensayo de Potencia de Gentamicina Sulfato.
Medio número 1
Pectona……………………….. ………………….…6g
Digerido pancreático de caseína…………………….4g
Extracto de levadura……………………………...…3g
Extracto de carne…………………………………....1.5g
Dextrosa……………………………………………..1g
Agar…………………………………………………15g
Agua c.b.p……………………………………..……1000ml
pH después de la esterilización……..…………..…..6.6 ± 0.1
Medio número 11
Pectona.…………………………...…………………6g
Digerido pancreático de caseína…………………….4g
Extracto de levadura…………………………………3g
Extracto de carne…………………………………....1.5g
Dextrosa……………………………………………..1g
Agar…………………………………………………15g
Agua c.b.p…………………………………………1000ml
pH después de la esterilización ………………….8.3±0.1
Agar Sangre de Carnero
Pectona de caseína………………………………….. 15g
Pectona de harina de soya…………………………….. 5g
Sodio Cloruro; agar -agar…………………………….. 15g.
Agua c.b.p…………………………………………….1000ml
Para su preparación disolver 40g / l esterilizar al autoclave y verter en placa. pH: 7.3 ± 0.1
Agar manitol
Pectona de carne…………………………………10g
Extracto de carne………………………………...1g
Sodio Cloruro…………………………………... 75g
(-) – manita………………………………………10g
Rojo de Fenol……………………………………0.025g
Agar-Agar…………………………………………12g
Agua c.b.p…………………………………………1000ml
Para su preparación disolver 108g / l esterilizar al autoclave y verter en placa. pH: 7.4 ± 0.1
Caldo BHI
Infusión de cerebro……………………………….200g
Infusión de corazón……………………………….250g
Pectona…………………………………………….10g
Cloruro de Sodio…………………………………...5g
Glucosa……………………………………………..2g
Fosfato disódico…………………………………….2.5g
ANEXO No. 3.
Solución Buffer usada para el ensayo de Potencia de Gentamicina Sulfato.
SOLUCION AMORTIGUADORA No. 3: 0.1M, pH 8- disolver 13.61 g de fosfato monobásico de

potasio y 0.523g de fosfato monobásico de potasio en 1000ml de agua. Ajustar el pH con acido
fosfórico 18N o hidróxido de potasio 10N a 8 ±0.1.
Anexo No. 4.
Ensayo de caracterización de Cepa Trabajo.

Polvo liofilizado de
St. epidermidis
ATCC 12228
1-2 asada
Agar sangre de carnero

1 asada 1-2 asada
(24 horas).
Tinción de Gram. BHI

Agar manitol (24-48 horas).
Anexo No. 5.
Estabilidad bioquímica de
la cepa microbiológica
Retirar de la nevera la cepa

original
Tomar 1 tubo con 9.5ml de caldo

BHI (cultivo primario de trabajo)
Tomar 1-2 asadas

de la cepa original
Inocular el cultivo
primario de trabajo
Incubar por 24 horas

Regresar la cepa original a la nevera
Tomar 4 tubos con agar antibiótico Nº 1

Rotular
Subcultivo de Subcultivo de Subcultivo de Subcultivo de

trabajo Nº 1 trabajo Nº 2 trabajo Nº 3 trabajo Nº 4
Tomar de 2-3 asadas Tomar 2-3 asadas del cultivo

primario de trabajo, inocular
Inocular 2 tubos los tubos
Siembra Ay B
con agar
Incubar por 24 horas
Incubar por 24
horas
Preparar la
suspensión de M.O.
Anexo No. 6.
Preparación del inoculo del

microorganismo de prueba
Preparación de suspensión del Estandarización de la

microorganismo de prueba suspensión de M.O.
Retirar del refrigerador
1 Tubo de la cepa seleccionada

Agitar el tubo de dilución
(subcultivo de trabajo) 1:10
práctica (0.5ml-7.5ml)
Blanquear usando solución

Pasar 2-3 asadas 3 tubos inclinado agar salina estéril al 0.9%
antibiótico Nº 1
Leer en un espectrofotómetro a
Rotular los tubos
580nm el % de T.
Incubar a 30-35º C Y
Agregar a la celda 4.8-8ml de
retirar 24 horas después.
la solución practica.
Agregar 12ml de solución Regresar el contenido de

salina estéril a un tubo la celda al tubo.
Esterilizar el asa Descartar el tubo de

redonda y dejar enfriar dilución practica
Rotular 1 tubo (solución Descartar los tubos de

madre microorganismo) agar antibiótico Nº 1
Deposite la masa obtenida Determinar el inoculo del M. O.

en el tubo y agitar el tubo para 100ml de agar fundido
Rotular un tubo de dilución Rotular 1 tubo de dilución

práctica practica de trabajo (1:10) Factor de dilución se
multiplica por 10 (1:10)
Agregar 7.5ml de solución salina Agregar 9ml de
solución salina
Tomar 0.5ml de la solución
madre M.O. y depositar en el Tomar 1ml de la sln
tubo. madre y depositarla en el
tubo
Anexo No. 7.
Preparación de la Suspensión del Microorganismo.
ANEXO No. 8.
Procedimiento de
potencia de antibiótico
cilindro-placa
Preparación del patrón Preparación de la muestra
Realizar diluciones a Realizar diluciones a

concentraciones indicadas concentraciones indicadas
S1, S2, S3. D1, D2, D3.
Preparación de capa base Preparación de capa siembra
Agregar 12mL de medio Inocular el medio de cultivo con

fundido a cada plato M.O.
Incubar x 15’a 35‐37 ºC Agregar 5ml de medio inoculado a
capa base de cada plato,
esperando que solidifique.
Colocar 6 cilindros a cada plato y

llenar con 170µL
3 cilindros con S1, S2, S3. 3 cilindros con D1, D2, D3.
Dejar predifusion por 1 hora

Incubar platos de 16-18 horas
Medir diámetros de los halos
Anexo No. 9.
Calibración de Balones Aforados.
1) Previamente, el balón aforado se limpia y se enjuaga, después se cuelga en posición

invertida vertical hasta que se seque.
2) Una vez que el balón esta seco, se coloca junto con su tapón en la balanza y se obtiene
su masa. Debe de tomarse en cuenta que para los balones aforados grandes no se puede
utilizar una balanza analítica ordinaria (tomar en consideración la capacidad de la
balanza).
3) Una vez realizada la operación anterior se procede llenar el balón hasta su marca de
aforo con agua destilada (fuera de la balanza), cuidando que tanto la boca del mismo
como su tapón no queden húmedo (para esto es adecuado usar un embudo).
4) Después de obtener la primera medida de la masa del balón con el agua, se procede a
extraer una pequeña porción del agua que esta contenida en el mismo, para lo cual se
puede usar una pipeta (fuera de la balanza).
5) Luego, la porción de agua retirada se repone tomando como referencia la marca de

aforo.
6) Se coloca el balón lleno de agua en la balanza y se obtiene su masa.
7) Todo el procedimiento anterior se repite seis veces más. En este caso el peso inicial
permanecerá constante, registrándose en cada caso la masa obtenida después de reponer
el agua retirada.
8) Una vez calculado los volúmenes contenidos, determine el valor promedio. La

desviación estándar, el coeficiente de variación y el intervalo de confianza.
9) Compare los límites de confianza obtenidos con la tolerancia que da el fabricante para
ese equipo.
10) Anexo No. 10.
Especificaciones del método Cilindro-Placa
Tabla basada en la USP30/ NF25.
Fármaco Gentamicina
Método Cilindro-placa
Solvente inicial Buffer 3
Solvente final Buffer 3
Tiempo de refrigeración 1 Mes
M.O. de ensayo Staphylococcus epidermidis # ATCC 12228
Inoculo Teórico 0.03 ml/ 100 ml medio
Temperatura incubación 36-37.5 ºC
Dilución Teórica 1:14ml
Dilución Practica 0.5:6.5ml
Capa Base 12 ml
Capa siembra 5 ml
Anexo No. 11.
Lavado de cristalería sucia.
1. Descontaminar en autoclave a 121ºC (15-18lbs) por 35 minutos.

2. Descartar en una bolsa plástica los desechos o agares.
3. Proceder a lavar cristalería con ayuda de Hisopos, paste y solución de detergente, 3
ciclos hisopados y 3 ciclos de enjuague.
4. Enjuagar cristalería y sumergir en una pana plástica conteniendo 1 solución de jabón
desinfectante, agua potable y 10g de detergente (dejarla por 24 horas). Ver bitácora de
lavado de cristalería.
5. Después de las 24 horas; proceder a lavar cristalería con ayuda de hisopos, paste y
solución de detergente, 3 ciclos hisopados y 3 ciclos de enjuague.
6. Proceder a lavar y enjuagar nuevamente con agua de grifo 5 veces.
7. Sumergir o enjuagar cristalería con agua destilada 3 veces.
8. Realizar prueba con azul de bromotimol al enjuague final (20ml de muestra mas 4 gotas
de azul de bromotimol, para una coloración azul o verdosa se debe de continuar el
enjuague y para coloración amarilla pH de 6-7.6 realizar secado.)
9. Escurrir y secar cristalería en horno a 100ºC / 1hora.
10. Una vez secada la cristalería se procede a clasificar y almacenar en su respectivo
estante.
ANEXO No. 12.
Cuñas de agar inclinado conteniendo crecimiento del Microorganismo test.
A partir de las cuñas se preparan las suspensiones de microorganismos para los ensayos.
ANEXO No. 13.
Placas de ensayos de potencia de gentamicina (cilindro-placa)
(A)
La imagen evidencia que no hubo contaminación en las placas durante el desarrollo de los ensayos, lo cual demuestra
que no presentaban diferencias visibles en la formación y tamaños de lo halos.
(B)
(C)
Las imágenes B y C que se presentan demuestran cada uno de los ensayos utilizando cristalería esterilizada y no
esterilizada, esterilizando solamente el material que entra en contacto con el microorganismo de test.
ANEXO No. 14.
(A) (B) (C)

Las siguientes imágenes muestran las técnicas de caracterización efectuadas en el ensayo de potencia
(A) La imagen presenta los estriados de la cepa en agar sangre de carnero.
(B) La imagen presenta la tinción de gram de St. epidermidis.
(C) La imagen presenta los estriados de la cepa en agar manitol.
ANEXO No. 15.
(A) (B)
La imagen (A) balón esterilizado e imagen (B) balón no esterilizado. Estas imágenes demuestra la calibración de
la cristalería para conocer el grado de variabilidad que existe cuando es sometido cierto grado de temperatura.
ANEXO No. 16.
Realizar Tinción de Gram.:
• Agregar 2 gotas de agua destilada a cada lado de la porta objeto.

• Hacer 2 asas en la cepa o siembra o cultivo y adicionar en la porta objeto.
• Homogenizar la muestra con el agua y extender.
• Fijar el frotis.
• Adicionar por 1 minuto cristal violeta, lavar con agua.
• Luego solución de lugol por 1 minuto de manera que cubra todo el extendido.
• Lavar con agua.
• Adicionar por 30 segundos alcohol-cetona, lavar con agua.
• Adicionar por 30 segundos safranina, solo si la tinción es de contraste.
• Secar.
• Observar en el microscopio.
ANEXO No. 17.

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Potencia de antibióticos por Método Cilindro-Placa, MINSA

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

Monografía para optar al titulo de Licenciado Químico-Farmacéutico

 Br. Luís Alberto Lindo Rojas.

 Br. Francisco Javier López Cáseres.

 Br. Carlos Eduardo López Villegas.

Tutoras: Msc. Lissett Arauz Molina.

Lic. Patricia Baca.

Asesora: Lic. Mirna Mendoza.

A nuestros padres por apoyarnos en cada momento que necesitáramos de su ayuda

A Miriam López por compartir grandes momentos en la universidad, brindarme

Dedico esta investigación monográfica a mi Padre salvador y su hijo Jesucristo

A mi padre, madre, hermano y familiares, por nunca dejarme solo, sintiéndome

A mis amigos, compañeros, maestros y todas aquellas personas que he conocido

Francisco López Cáseres

A Dios, por haberme dado la oportunidad de nacer y guiar mi vida por el

A mi Madre María Elena Villegas; quien se ha sacrificado por sacarme

5. Diseño Metodológico: ………………………………………...........35

En la actualidad, son numerosos los laboratorios comerciales que preparan antibióticos;

potencia en donde han requerido el establecimiento de un organismo estatal regulador y de

En la USP XXX no se encontró referencias sobre la esterilización del material volumétrica en

Efectividad del método Cilindro-Placa, esterilizando solamente el material

Comprobar la efectividad del método Cilindro-Placa, esterilizando solamente el material

1. Efectuar el análisis de potencia de Gentamicina esterilizando solamente el

2. Realizar la caracterización de la cepa control de St. epidermidis.

3. Verificar la ausencia de microorganismos contaminante en el agar utilizado para

4. Cumplir con los criterios de aceptación del diseño experimental.

5. Comparar los resultados obtenidos aplicando el método en el que se esteriliza

6. Ejecutar la Calibración del balón aforado de 25ml en condición esterilizada y no

4.1. Pruebas y valoraciones biológicas.

4.1.1 Valoraciones Microbiológicas-Antibióticos.

4.1.1.2 Control de Temperatura.

Se requiere control termostático en varias etapas de una valoración microbiológica: durante el

La medición de la transmitancia dentro de una banda de frecuencia relativamente estrecha

NOTA: puede utilizarse la medición de la absorbancia o transmitancia para preparar los

4.1.1.4 Receptáculos de valoración en Cilindro-Placa

4.1.1.5 Medios y Diluyentes

4.1.1.5.1 Medios de cultivos

Antes de afrontar una validación de un método microbiológico se debe tener la seguridad de

Se puede obtener de medios de cultivos de 2 semanas:

Preparados por un laboratorio externo fabricante de medios de cultivo se exigirá un certificado

La función de un diluyente es dispersar o diluir el producto a examinar. Las farmacopeas

4.1.1.6 Soluciones amortiguadoras de fosfato y otras soluciones.

Preparar las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio requeridas para el antibiótico en

se esterilizan después de su preparación y el pH especificado en cada caso corresponde al pH

4.1.1.7 Unidades y Estándares de referencia.

La potencia de los antibióticos esta especificada en “Unidades” o “ug” de actividad. En cada

El concepto de “ug” de actividad se origino en un caso en que se considero que a preparación

4.1.1.8 Preparación del estándar.

4.1.1.9 Preparación de la muestra.

A partir de la información disponible para la preparación que se va a valorar (la muestra

TABLA No.1. Soluciones de trabajo del estándar de referencia.

Solución stock estándar de Antibiótico Gentamicina

Solvente inicial Buffer #3

Concentración final U o mg/ml 1mg

Almacenamiento bajo 1mes

Concentración del estándar Solvente final Buffer #3

Concentraciones finales U o µg de 0.064, 0.080, 0.100,

Br. Luís Alberto Lindo Rojas.

Br. Francisco Javier López Cáseres.

Br. Carlos Eduardo López Villegas.