ESPECTROS DE FLUORESCENCIA Y

PROCESOS DE DESACTIVACIÓN BIMOLECULAR

1. OBJETIVOS

El objetivo de esta práctica es el registro del espectro de fluorescencia de la acridina y

la observación del efecto que produce la adición de un desactivador (NaBr o CoSO4).

2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
2.1. FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA

La fluorescencia y fosforescencia son procesos fotoluminiscentes (emisores de luz) que

tienen lugar en la región visible del espectro y que resultan de la excitación y posterior
desexcitación entre estados electrónicos de una molécula (ver Figura 1).
Fenomenológicamente denominamos fluorescencia a una emisión de radiación que cesa cuando
la radiación de excitación se extingue. Por el contrario, denominamos fosforescencia a la
emisión de radiación que persiste por un cierto periodo de tiempo tras remover la fuente de
excitación. Esta diferencia sugiere que la fluorescencia resulta de una conversión inmediata de
la radiación absorbida en energía reemitida, mientras que en la fosforescencia la energía se
almacena y se reemite lentamente.

Figura 1. Emisión fluorescente: quinina (izqda.) y fluoresceína (dcha). Puedes ver un video en el campus virtual.

Para entender el mecanismo molecular de la fluorescencia y fosforescencia necesitamos

una descripción de los niveles electrónicos y de los diferentes tipos de procesos
espectroscópicos de absorción y emisión de radiación. La Figura 2 ilustra la situación en una
molécula diatómica, con dos estados electrónicos singletes (multiplicidad de spin unidad, spines
apareados: 𝑆 = 0 ⇒ (2𝑆 + 1) = 1), denominados S0 y S1. Los niveles de vibración dentro de
cada estado electrónico se especifican mediante el número cuántico de vibración 𝑣. Para una
molécula poliatómica que posee múltiples estados electrónicos y diferentes modos normales de

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 1 Espectros de fluorescencia

vibración utilizamos el esquema de la Figura 3, conocido como diagrama de Jablonski. Los
procesos espectroscópicos que conducen a la fluorescencia y fosforescencia, así como su escala
temporal, se ilustran en esta última figura.

Figura 2. Diagrama de niveles electrónicos de una molécula diatómica. El estado electrónico fundamental se
representa por S0 (Singlete 0). El estado electrónico excitado se representa por S1 (Singlete 1). Dentro de cada
estado electrónico existen múltiples estados de vibración (líneas horizontales con números cuánticos v = 0,1,2,
etc). Se ha dibujado también sobre algunos niveles de vibración la densidad de probabilidad (cuadrado de la
función de onda de vibración). La absorción y emisión de radiación se representan por flechas verticales.

Figura 3. Diagrama de Jablonski. Este diagrama es una generalización de la figura anterior para una molécula
poliatómica, y resume todos los procesos implicados en los espectros de emisión: Absorción, Relajación
vibracional, Conversión interna, Cruce entre sistemas, Fluorescencia, Fosforescencia y Relajación no radiativa.

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 2 Espectros de fluorescencia

 La fluorescencia y la fosforescencia son procesos radiativos (que emiten radiación) de
desexcitación electrónica. Por tanto, requieren como etapa inicial una absorción de radiación
electromagnética (hn) que lleve a la molécula del estado electrónico fundamental (generalmente
singlete: 𝑆! ) a un estado electrónico excitado. Este proceso de excitación ocurre en un periodo
de femtosegundos (10-15 s). Dado que una transición electrónica no puede implicar un cambio
de multiplicidad (Δ𝑆 = 0) la absorción inicial conduce a diversos estados singletes 𝑆" , 𝑆# , etc.
Asimismo, y dado que cada estado electrónico posee múltiples niveles de vibración la absorción
puede llevar a diferentes estados vibracionales, caracterizados por el número cuántico 𝑣, p.e.,
𝑆! (𝑣′′ = 0) → 𝑆" (𝑣′ = 5), etc. Las transiciones que involucran un cambio de energía
electrónica y de vibración se denominan vibrónicas.

La desexcitación posterior depende de la competencia entre los diferentes procesos de

transferencia de energía entre la molécula y el medio. Si es posible una interacción por
colisiones que permita la cesión de energía de la molécula excitada a su entorno, entonces la
molécula puede perder energía descendiendo por la escalera de niveles de vibración del estado
excitado, p.e., 𝑆" (𝑣′ = 3) → 𝑆" (𝑣′ = 2) → 𝑆" (𝑣′ = 1) → 𝑆" (𝑣′ = 0). Este proceso se conoce
como relajación vibracional. Este proceso es mucho más lento y ocurre en picosegundos (10-12
s). Cuando la molécula alcanza el estado de vibración más bajo del estado electrónico excitado
𝑆" (𝑣′ = 0) cabe la posibilidad de que se desexcite al estado electrónico fundamental 𝑆!
mediante diversos procesos colisionales no radiativos. Sin embargo, si las moléculas del
entorno no admiten la gran cantidad de energía necesaria para la relajación al estado electrónico
fundamental la molécula puede sobrevivir en el estado excitado el tiempo suficiente para que
tengan lugar procesos radiativos. Denominamos fluorescencia a la emisión de radiación
procedente de procesos de emisión espontánea que conducen a la molécula al estado electrónico
fundamental.

Fluorescencia: 𝑆" (𝑣 $ ) ⟶ 𝑆! (𝑣 $$ ) + ℎ𝜈

Desde un punto de vista mecanocuántico una transición espectral tiene las mismas reglas
de selección en absorción y en emisión. De hecho, el coeficiente de emisión espontanea de
Einstein (Amn) es directamente proporcional al coeficiente de absorción inducida (Bmn). Así, una
transición activa en absorción, por ejemplo una transición p→p*, también lo es en emisión, y
la intensidad fluorescente podrá ser alta (dependiendo de los otros procesos no radiantes que
compiten con la fluorescencia). En este caso el tiempo de vida del estado excitado será corto
(~ns). Por ello las sustancias fluorescentes suelen corresponder a sistemas aromáticos con

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 3 Espectros de fluorescencia

transiciones electrónicas permitidas. El proceso de emisión fluorescente ocurre en periodos de
tiempo muy cortos (~10-7-10-9s).

Tabla 1. Escala de tiempos de los procesos radiativos y no radiativos implicados en los espectros de
fluorescencia.

Transición Proceso Escala de tiempo

(segundos)
S0 ® S1 o Sn Absorción (Excitación) 10-15
Sn ® S1 Conversión interna 10-14 a 10-10
S1 ® S1 Relajación vibracional 10-12 a 10-10
S1 ® S0 Fluorescencia 10-9 a 10-7
S1 ® T1 Cruce entre sistemas 10-10 a 10-8
S1 ® S0 Relajación no radiativa (Quenching) 10-7 a 10-5
T1 ® S0 Fosforescencia 10-3 a 100
T1 ® S0 Relajación no radiativa (Quenching) 10-3 a 100

Si la absorción está prohibida (p.e., transiciones n-p*) también lo estará la emisión, por lo que
la intensidad fluorescente será despreciable y predominarán otros procesos no radiantes, como,
p. e., la fosforescencia, o desexcitación radiativa entre estados de distinta multiplicidad (p.e.
triplete → singlete),

Fosforescencia: 𝑇" (𝑣 $ ) ⟶ 𝑆! (𝑣 $$ ) + ℎ𝜈

2.2. ESPECTROS DE FLUORESCENCIA

2.2.1. Fase gas: Componentes vibrónicas

Debido a que la fluorescencia puede conducir a diferentes niveles de vibración del

estado electrónico fundamental el espectro puede presentar diferentes componentes vibrónicas,
al igual que ocurre en los espectros de absorción (p. e., en la práctica de absorción del I2). Ahora
bien, mientras que la absorción se produce principalmente desde el estado de vibración
fundamental (𝑆! (𝑣 $ ′ = 0) → 𝑆" (𝑣 $ = 0, 1, 2, . . )) la emisión fluorescente parte preferentemente
del nivel 𝑣 $ = 0 del estado excitado (𝑆! (𝑣 $ ′ = 0, 1, 2, . . ) ← 𝑆" (𝑣 $ = 0)), por lo que la
fluorescencia ocurrirá a menores energías que la absorción. Esto explica que las emisiones
fluorescentes ocurran a longitudes de onda mayores que la absorción (Figura 4), como se
observa en fase gas (ver práctica de fluorescencia inducida por láser).

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 4 Espectros de fluorescencia

 Fluorescencia Absorción

Energía
(inversamente proporcional a la longitud de onda)

Figura 4. a) Transiciones vibrónicas de absorción y fluorescencia (indicando los números cuánticos de las
componentes de vibración de partida y llegada. b) Diagrama de Jablonski con las componentes de vibración.

Adicionalmente, si las frecuencias de vibración de los dos estados electrónicos son similares lo
será también la distribución de niveles de vibración y en estos casos el espectro de emisión de
fluorescencia resultará muy semejante y aproximadamente especular al espectro de absorción.

2.2.2. Fluorescencia en disolución: Desplazamiento de Stokes

Si las moléculas fluorescentes se encuentran en disolución, la estructura vibracional se

pierde y los espectros de absorción y fluorescencia aparecen como bandas anchas,
aproximadamente simétricas (Figura 5). La separación entre los máximos de absorción y
emisión se conoce como desplazamiento de Stokes (no confundir con la rama Stokes de los
espectros Raman). La magnitud del desplazamiento de Stokes depende de la molécula en
particular y de su entorno de solvatación, siendo los disolventes más polares los que típicamente
producen mayores desplazamientos.

Para observar un espectro de fluorescencia es necesario realizar simultáneamente una

excitación de la muestra y la detección de la señal fluorescente. Se puede proceder de dos
maneras: a) Espectro de emisión. Se barre el espectro de emisión mientras la excitación se
mantiene fija a la longitud de onda de máxima absorción. b) Espectro de excitación. Se barre la
señal de excitación y se detecta a la longitud de onda de máxima emisión.

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 5 Espectros de fluorescencia

Figura 5. a) Bandas de fluorescencia (verde) y absorción (azul) en disolución para la molécula de rodamina 6G,
mostrando la separación entre los máximos de las dos bandas o desplazamiento de Stokes.

2.3. DESACTIVACIÓN FLUORESCENTE (QUENCHING)

Tanto la fluorescencia como la fosforescencia tienen en común el hecho de ser procesos

unimoleculares. Ahora bien, en algunos casos la presencia de una segunda molécula (de igual
o diferente naturaleza química, o incluso una impureza) es capaz de aceptar y/o disipar la
energía de excitación de la molécula original, actuando como desactivador mediante procesos
bimoleculares. La desactivación de la fluorescencia (“quenching”) puede producirse mediante
mecanismos colisionales, de transferencia de energía o por la formación de complejos. La
desactivación compite con la fluorescencia, produciendo una pérdida de intensidad fluorescente
que dependerá de la cantidad de desactivador, como se observa en la Figura 6. En esta práctica
observaremos cuantitativamente la variación de la intensidad fluorescente al introducir
diferentes desactivadores.

Figura 6. Disminución fluorescente (“quenching”) de una disolución de quinina al introducir un desactivador.

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 6 Espectros de fluorescencia

 3. CINÉTICA FLUORESCENTE

Supongamos que partimos de una concentración inicial [A]0, y que permitimos que
disminuya hasta cero mediante un proceso de fluorescencia aislado descrito mediante:

A* → A + hν

La evolución temporal de A* es:

%
− %& [𝐴∗ ] = 𝑘(! [𝐴∗ ] (1)

donde 𝑘(! está relacionada con el coeficiente de Einstein de emisión espontánea y se caracteriza
por las propiedades del estado excitado. Integramos la ecuación y obtenemos:

"
[𝐴∗ ] = [𝐴∗ ]! × 𝑒 )*! & (2)

Podría pensarse que a partir de las medidas de la intensidad de fluorescencia en función del
tiempo se podría obtener la constante de velocidad de emisión de fluorescencia 𝑘(! . Sin
embargo, existen otros procesos de desactivación del estado excitado (no radiativos) que
compiten con el proceso de emisión, como puede verse en la siguiente tabla:

Proceso Velocidad
A + hν → A * Excitación 𝑘,-. [𝐴] 𝐼 = 𝐼,-.
A* → A + hν’ Fluorescencia 𝑘(! [𝐴∗ ]

A* → A Otros caminos de desactivación ! 𝑘# [𝐴∗ ]

Por tanto, tenemos que incluir estos procesos en la ecuación cinética, y teniendo en cuenta que
A* es un estado singlete:
%
− %& [𝐴∗ ] = 𝑘(! [𝐴∗ ] + 𝑘/0 [𝐴∗ ] + 𝑘12 [𝐴∗ ] + 𝑘13 [𝐴∗ ]= 𝑘(! [𝐴∗ ] + ∑ 𝑘4 [𝐴∗ ] (3)

siendo 𝑘/0 , 𝑘12 y 𝑘13 las constantes de velocidad de los procesos no radiativos de relajación
vibracional, cruce de estados y conversión interna, respectivamente. Integrando la ecuación:
[𝐴∗ ] = [𝐴∗ ]! × 𝑒 )*! & (4)
donde
∗
𝑘! = 𝑘!" + 𝑘#$ + 𝑘%& + 𝑘%' = 𝑘!" [𝐴∗ ] + ∑ 𝑘𝑖 [𝐴 ] (5)

La constante cinética 𝑘! es la que se determina experimentalmente.

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 7 Espectros de fluorescencia

El tiempo de vida fluorescente, 𝜏( , vendrá entonces dado por:
"
𝜏( = * (6)
!

Par considerar la cinética global del proceso de absorción y emisión fluorescentes es necesario
introducir algunos conceptos adicionales. Definiremos en primer lugar el rendimiento
cuántico de fluorescencia como la fracción de moléculas que experimentan fluorescencia:
3! *!" [7∗ ] 9:;<=4%,% %: (;><?:.=:@=4,
Ф( = 3 =* = (7)
%&' %&' [7]3 9:;<=4%,% %: ,-.<?=4ó@

Como se ha mencionado anteriormente, los procesos fluorescentes son muy rápidos, lo que
permite aplicar la aproximación del estado estacionario:
%
[𝐴∗ ] = 𝑘,-. [𝐴]𝐼 − 𝑘(! [𝐴∗ ] − ∑ 𝑘4 [𝐴∗ ] ≈ 0 (8)
%&

por lo que
*%&' [7]3
[𝐴∗ ] = (9)
*!" B∑ $*(

y, por tanto, el rendimiento cuántico se reduce a:

3! * " [7∗ ] *" D"

Ф( = 3 =*! !
= * " B∑ = D! ≤ 1 (10)
%&' %&' [7]3 ! * ( !

Así, cuanto mayor sean los procesos que compiten con la fluorescencia y mayores sean sus
constantes de velocidad, tanto más corto será el tiempo de vida real del estado electrónico
excitado. El tiempo de vida de fluorescencia puede medirse experimentalmente a partir de las
curvas de desexcitación que miden el decaimiento de la intensidad fluorescente con el tiempo.

Otros procesos fotofísicos no radiativos son los procesos de desactivación bimolecular

o procesos de quenching, en los que mediante colisiones con otra molécula diferente que
denominamos Q (desactivador), pueden desactivarse, entre otros, los estados electrónicos
excitados singlete S1 transfiriendo su energía electrónica.
A* + Q → A + Q†

donde Q† representa un estado excitado de la molécula Q y la velocidad del proceso es

𝑣 = 𝑘) [𝐴∗ ][𝑄] (11)
Este proceso de transferencia de energía mediante colisiones es competitivo con el proceso
radiativo de fluorescencia y su estudio se realiza comparando medidas en presencia y en
ausencia de desactivador (Q). Aplicando la aproximación del estado estacionario la ecuación
cinética se expresa como:
%
[𝐴∗ ] = 𝑘,-. [𝐴]𝐼 − 𝑘E [𝐴∗ ][𝑄 ] − 𝑘(! [𝐴∗ ] − ∑ ′𝑘4 [𝐴∗ ] ≈ 0 (12)
%&

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 8 Espectros de fluorescencia

Por tanto, resulta:
*%&' [7]3 *%&' [7]3
[𝐴∗ ] = " ∗ ∗
=* ∗
(13)
* ) [F]B*! [7 ]B∑ $*( [7 ] ) [F]B*! [7 ]

La ecuación del rendimiento cuántico para el proceso global es:

3! * " [7∗ ] *!" *!"
Ф( = 3 =*! =* [F]B* " [7∗ ]B∑ * [7∗ ]
=* (14)
%&' %&' [7]3 ) ! ( ) [F]B*!

Siendo 𝑘( la constante de velocidad experimental en ausencia de desactivador.

De la ecuación se puede deducir que el desactivador disminuye el rendimiento cuántico de
fluorescencia en una cantidad función de la [Q].
En ausencia de desactivador, [𝑄 ] = 0,
*!"
Ф!" = Ф! ([𝑄] = 0) = (15)
*!

El cociente de rendimientos cuánticos de fluorescencia en relación con la ausencia de

desactivador viene dado por la llamada Ecuación de Stern-Volmer,
Ф,+ (+, (- [)]*(+ (- [)]
= × =1+ (16)
Ф+ (+ (+, (+

Teniendo en cuenta la definición de rendimiento cuántico, vemos que es necesaria la medida

de la intensidad de la radiación absorbida,
9:;<=4%,% %: (;><?:.=:@=4, 9!
𝜙 = 4@&:@.4%,% %: ;>G ,-.<?-4%, = 3 (17)
%&'

Sin embargo, si las medidas de la intensidad de fluorescencia en función de la concentración

del desactivador las llevamos a cabo en las mismas condiciones experimentales (eficiencia y
geometría del sistema óptico, misma longitud de onda e intensidad de excitación, etc.), entonces
la intensidad absorbida 𝐼,-. será igual en todos los experimentos, por lo que no será necesario
determinarla. Por tanto, en estas condiciones el cociente de rendimiento cuántico es:
3!" *) [F]
3!
=1+ *!
= 1 + 𝑘H0 [𝑄] (18)

Donde 𝑘H0 es la constante de Stern-Volmer, que viene definida por:

*
𝑘H0 = *) = 𝜏 · 𝑘E (19)
!

Por tanto, una representación de 𝐼(! /𝐼( frente a la concentración de desactivador dará lugar a
una línea recta (ver Figura 7), de cuya pendiente se puede obtener la constante de desactivación
𝑘F si se conoce el tiempo de vida medio 𝜏.

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 9 Espectros de fluorescencia

 2

1.8

1.6

I0f / If
1.4

1.2

1
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
103 [Q] (mol/l)

Figura 7. Ejemplo de representación de 𝐼(! /𝐼( frente a [𝑄]

4. EXPERIMENTO

La Figura 8 muestra el esquema general de un fluorímetro. El principio general de

operación tiene semejanzas con el de un espectrómetro de absorción visible-ultravioleta (VIS-
UV) y comparten muchos elementos comunes. En un espectrofotómetro y en un fluorímetro
pueden distinguirse cuatro grandes bloques funcionales: fuente de radiación, monocromador,
celda de muestra y detector. Sin embargo la diferencia entre ambos consiste en que en un
espectrómetro de absorción el detector se sitúa detrás de la fuente, a fin de medir la cantidad de
luz absorbida o transmitida por la fuente. En cambio, en un fluorímetro disponemos el detector
en ángulo recto con la señal de excitación, ya que queremos medir la radiación emitida por la
muestra tras ser excitada. Una segunda diferencia es el uso de dos monocromadores en el
fluorímetro, con objeto de poder barrer tanto la señal de emisión como la de detección.

Figura 8. Esquema de bloques de un espectrómetro de absorción (izqda.) y de un fluorímetro (dcha.).

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 10 Espectros de fluorescencia

 La construcción de los diferentes elementos del fluorímetro se muestra en la Figura 9.
En primer lugar se sitúa la fuente de radiación, que tiene por objeto excitar la muestra. Podemos
distinguir dos grandes tipos de fuentes: fuentes coherentes (la radiación avanza con la misma
fase) y fuentes no coherentes. Las fuentes coherentes proceden de los láseres, y tienen la ventaja
de que pueden aportar una gran intensidad de radiación y de que en muchos casos son
sintonizables (o al menos emiten a varias longitudes de onda seleccionables). En un fluorímetro
convencional utilizamos fuentes no coherentes, que son las que proceden de emisores térmicos
o eléctricos, como las lámparas o los filamentos incandescentes. En esta práctica se emplea una
lámpara de xenón, que proporciona un espectro continuo de alta intensidad que cubre toda la
región UV-VIS. La desventaja principal de usar una fuente no coherente es el hecho de que
emite en una región muy amplia de espectro, por lo que deben ir acompañadas de un dispositivo
que permita seleccionar la longitud de onda, denominado monocromador. El monocromador
está basado en uno o varios elementos ópticos dispersivos como prismas o rejillas de difracción,
que permiten reducir considerablemente la región de emisión de la fuente (aunque a costa de
perder una gran parte de intensidad y sin llegar a las pequeñas anchuras de banda de los láseres).
Los monocromadores disponen de elementos mecánicos que permiten cambiar la orientación
de los componentes ópticos y así barrer un determinado intervalo del espectro electromagnético.
Los monocromadores llevan igualmente una o varias rendijas que permiten regular el ancho de
banda espectral. El fluorímetro utilizado en esta práctica tiene dos monocromadores. El
monocromador de la fuente de radiación selecciona la longitud de onda de excitación, mientras
que el monocromador de detección sirve para analizar la emisión fluorescente.

El compartimento de muestra depende en gran medida del estado de agregación de la

sustancia bajo estudio. En esta práctica realizaremos espectros de baja resolución sobre
muestras líquidas, por lo que la muestra se dispondrá en cubetas de sección cuadrada (1 cm de
lado) construidas en cuarzo (el vidrio óptico no permite alcanzar el UV). El detector final del
espectrómetro está formado por un fotomultiplicador. En un fotomultiplicador la radiación
incidente da lugar a la emisión de electrones por efecto fotoeléctrico (fotocátodo), que son
posteriormente conducidos a una cadena de dínodos, que actúan como multiplicadores de
electrones por emisión secundaria, alcanzado finalmente un fotoánodo. Los fotomultiplicadores
se caracterizan por su alta sensibilidad y bajo ruido.

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 11 Espectros de fluorescencia

 Figura 8. Fluorímetro utilizado en esta práctica, distinguiendo sus elementos principales.

5. PRELABORATORIO

Antes de iniciar la práctica cada alumno debe leer el guión de prácticas y contestar en
el cuaderno de laboratorio a las preguntas siguientes. El profesor le indicará cuando iniciar la
práctica.

a) Defina en el cuaderno de laboratorio los términos siguientes: Absorción, Relajación

vibracional, Conversión interna, Cruce entre sistemas, Fluorescencia,
Fosforescencia y Relajación no radiativa, utilizando como ayuda el “Gold Book” de
la IUPAC (http://goldbook.iupac.org). Explique si la fluorescencia es una emisión
inducida o espontánea.
b) Dibuje una transición vibrónica en una molécula diatómica y escriba la ecuación que
gobierna la frecuencia de dicha transición.
c) Suponiendo que dos estados electrónicos de una molécula diatómica están separados
19000 cm-1, que los estados de vibración están descritos por el modelo del oscilador
armónico y que la frecuencia fundamental de vibración ocurre a 310 cm-1 (estado
electrónico fundamental) y 190 cm-1 (estado electrónico excitado) realice una
Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 12 Espectros de fluorescencia
 predicción de los números de onda a los que aparecerían las emisiones fluorescentes
v'=6® v" (0, 1, 2, 3, 4).
d) Dibuje un esquema del fluorímetro indicando sus componentes funcionales.
e) ¿En qué casos el espectro de absorción y el de fluorescencia presentan una forma
aproximadamente especular?
f) ¿De qué factores depende la intensidad de una transición de absorción? ¿A qué se
debe la semejanza en intensidades entre el espectro de absorción y el de excitación?
g) ¿A qué se debe la posible presencia de varios máximos en el espectro de excitación?
h) En disolución suele observarse que no coinciden los máximos de las bandas
vibrónicas 0-0. ¿Cuál es el motivo?
i) ¿Qué posibles mecanismos existen para la desactivación fluorescente?

6. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
a) Normas de seguridad específicas

Esta práctica requiere el uso de gafas de laboratorio y guantes para la manipulación de los
compuestos químicos. Los compuestos utilizados son tóxicos. Todos los residuos deben
recogerse apropiadamente. No se puede verter ningún líquido por la pila.

b) Preparación de muestra: disolución fluorescente y desactivador

Prepare una disolución inicial de acridina (50 ml) de concentración 5 × 10-6 M a partir de la
disolución proporcionada por el profesor, añadiendo medio ácido (HCl, 0,1 M). Igualmente se
prepararán disoluciones de uno de los desactivadores, bien NaBr (4×10-3 M) o CoSO4 (2×10-2
M). Finalmente se prepararán mezclas de acridina y desactivador como sigue, tomando un
volumen final total de 10 ml. Utilice una micropipeta para mayor precisión en los volúmenes.

Disolución Acridina Desactivador

V / ml V / ml
1 5 0
2 5 0,5
3 5 1
4 5 2
5 5 3
6 5 4
7 5 5

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 13 Espectros de fluorescencia

 c) Registro del espectro de absorción

Como experimento inicial se registrará el espectro de absorción VIS-UV de la acridina

utilizando alguno de los espectrofotómetros del laboratorio, con el fin de observar las bandas
de absorción del compuesto. Explore el rango 320-580 con resolución de 1 nm. Se medirá el
máximo del espectro de absorción, que se tomará como longitud de onda de excitación para los
experimentos de emisión fluorescente.

d) Registro del espectro de emisión

Seguidamente se registrará con el fluorímetro el espectro de emisión. En este experimento el

monocromador de la fuente se sintoniza a la frecuencia de excitación, realizando un barrido de
la señal de emisión. Para operar el espectro de fluorescencia debe operarse como sigue:

d1) Arranque el programa de control. Seleccionar los parámetros correspondientes a

emisión y la longitud de onda de excitación.

d2) Seleccione un intervalo de barrido de longitudes de onda de 280 a 640 nm

(resolución 1 nm, 1 barrido).

d3) Envíe el espectro al programa de análisis, mida el máximo de emisión y exporte el

espectro (formato texto) a una memoria USB para representar los datos posteriormente.

e) Registro del espectro de excitación

El espectro de excitación se obtiene situando el monocromador de detección a una longitud de

onda específica y barriendo la longitud de onda de la fuente. En este caso seleccionaremos como
longitud de onda de detección el máximo del espectro de emisión, y operaremos como sigue:

e1) Arranque el programa de control. Seleccione los parámetros correspondientes a

excitación y la longitud de onda de excitación.

e2) Seleccione el mismo intervalo de longitudes de onda y resolución que en el caso

anterior.

e3) Envíe el espectro al programa de análisis, mida el máximo de excitación y exporte

el espectro (formato texto) a una memoria USB para representar los datos
posteriormente.

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 14 Espectros de fluorescencia

 f) Registro de los espectros de emisión en presencia de desactivador

f1) Después de observar la emisión fluorescente de la acridina (disolución 1) registre

los espectros de emisión en presencia de desactivador (disoluciones 2 a 7) en el rango
410-640 nm. En cada experimento lave y homogenice la cubeta con la nueva disolución.

f2) Para cada espectro integre el área bajo la curva (sin corrección de línea base).

g) Disponer los residuos y limpiar el material

Disponga los residuos en un recipiente. NO VIERTA NINGÚN PRODUCTO QUÍMICO

POR LA PILA.

7. TRATAMIENTO DE DATOS
a) Compare los espectros de absorción, emisión y excitación

Compruebe las diferencias entre los espectros de emisión y excitación disponiendo los
espectros sobre una misma gráfica. Dibuje en otra gráfica el espectro de absorción

b) Integre los espectros de emisión

Integre las señales de emisión para las disoluciones 1-7 y anote los resultados en una tabla.
Calcule I0/I, siendo I0 la señal sin desactivador e I el valor de cada disolución.

c) Determine el tiempo de vida de fluorescencia

El tiempo de vida fluorescente (τ) de la acridina se obtiene a partir de los datos de experimentos
de decaimiento fluorescente. En este caso tome el valor 𝜏 = 32,1 ns.

d) Determine la constante de desactivación fluorescente

Determine la constante de desactivación fluorescente empleando la ecuación de Stern-Volmer,

aproximando las intensidades fluorescentes al área bajo la curva de cada espectro.

8. RESULTADOS

Presente los resultados en el informe de prácticas.

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 15 Espectros de fluorescencia

 9. BIBLIOGRAFÍA
• HOLLAS, J. M., Modern Spectroscopy, John Wiley & Sons (2004)
• HOLLAS, J. M., High Resolution Spectroscopy, John Wiley & Sons (1998)
• REQUENA, A., ZÚÑIGA, J., Espectroscopía, Pearson Prentice Hall (2004)
• LAKOWICZ, J. R., Principles of Fluorescence Spectroscopy, Springer (2006)
• E. M. Ebeid, J. Chem. Educ. 62, 165 (1985)
• D. M. Goodall, D. R. Roberts, J. Chem. Educ. 62, 711 (1985)

Quím. Experimental IV – Quím. Física – UVa 16 Espectros de fluorescencia