BIOQUÍMICA Y FARMACIA

MICROBIOLOGÍA I
MICROBIOLOGÍA I

ESTERILIZACIÓN

OBJETIVOS

• Conocer los fundamentos de los métodos de esterilización

• Esterilizar material de laboratorio en el autoclave

La industria Farmacéutica es uno de los sectores más exigentes en cuanto a calidad de sus
productos y seguridad de sus procesos de fabricación. Estos productos, diseñados y
fabricados de acuerdo con las más exigentes normas de fabricación y verificados según los
más estrictos controles de calidad, deben superar las exigencias de las autoridades sanitarias
y consumidores. Ello obliga a cuidar al máximo tanto la selección de materias primas,
exigiendo a los proveedores mayor pureza en sus suministros, como en el propio proceso
productivo, evitando contaminaciones externas y asegurando la esterilidad del producto
final.

Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo farmacéutico, ya que existen
muchos procesos que requieren la utilización de materiales estériles. Entre éstos se
destacan:

• La esterilización de equipos quirúrgicos y otros materiales de uso médico con el

propósito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes.
• El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va
a ser utilizado en los laboratorios de microbiología.
• La preparación de medios de cultivo que serán empleados con diferentes propósitos
(cultivo de microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, análisis
microbiológico de medicamentos, cosméticos, alimentos, etc.)
• La descontaminación de material utilizado.
• Elaboración de productos farmacéuticos con la condición de esterilidad.

ESTERILIZACIÓN, es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de

vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas, virus, hongos y sus
esporas. Se entiende por muerte, la pérdida irreversible de la capacidad reproductiva del
microorganismo.

En la práctica, la muerte de un microorganismo se alcanza cuando no desarrolla en un medio

de cultivo en el cual ha mostrado que es capaz de proliferar. Este crecimiento se observa
mediante la aparición de colonias en un medio sólido o la presencia de turbidez en un medio
líquido.
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El proceso de esterilización es influenciado por el grado inicial de contaminación que puede

tener el material, así como por los equipos y condiciones de trabajo, que deben estar
controladas para ser desfavorables al desarrollo de microorganismos

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

AGENTES FÍSICOS
Calor

Todos los microorganismos son susceptibles, en distinto grado, a la acción del calor. El calor
provoca desnaturalización de proteínas, fusión y desorganización de las membranas y/o
procesos oxidativos irreversibles en los microorganismos. El calor es considerado como el
método de esterilización por excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte
altas temperaturas sin sufrir ningún tipo de daño. La efectividad del calor como método de
esterilización depende de: la temperatura y el tiempo de exposición.

A. Calor Húmedo

El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se

deben principalmente a dos razones:

• El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas (DNA, RNA,
proteínas, etc.) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto,
reacciones inversas podrían dañar a la célula a causa de la producción de productos
tóxicos. Además, las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas se estabilizan
mediante puentes de hidrógeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotos
por el agua a altas temperaturas.
• El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho más elevado que
el aire. Por lo que, los materiales húmedos conducen el calor mucho más rápidamente
que los materiales secos debido a la energía liberada durante la condensación. Por esto,
el principal método de esterilización que emplea calor húmedo es la esterilización por
vapor a presión.
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Ventajas
• Rápido calentamiento y penetración
• Destrucción de bacterias y esporas en corto tiempo
• No deja residuos tóxicos
• Hay un bajo deterioro del material expuesto.

Desventajas
• No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
• Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos

B. Calor Seco

El calor seco produce desecación de la célula, efectos tóxicos por niveles elevados de
electrolitos, procesos oxidativos y fusión de membranas. Estos efectos se deben a la
transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con
éstos. El aire es mal conductor del calor, y el aire caliente penetra más lentamente que el
vapor de agua en materiales porosos. La acción destructiva del calor sobre proteínas y
lípidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del
medio es baja. Esto se debe a que las proteínas al estabilizarse con los puentes de hidrógeno
intramoleculares, son más difíciles de romperse por el calor seco.

La estufa de esterilización es el artefacto utilizado en los laboratorios para esterilizar por

calor seco. Se requiere mayor temperatura y tiempo de exposición que el autoclave. La
temperatura varía entre 120 y 180°C, requiriéndose distintos tiempos de exposición. A 140°C
se necesitan por lo menos 5 horas de exposición, mientras que a 160°C se requieren al
menos 2 horas de exposición. Sirve para esterilizar material de vidrio. El papel y el algodón
no pueden ser esterilizados a más de 160°C.

Ventajas
• No es corrosivo para metales e instrumentos.
• Permite la esterilización de sustancias en polvo y no acuosas, además de sustancias
viscosas no volátiles.

Desventajas
• Requiere mayor tiempo de esterilización, respecto al calor húmedo.

Filtración

La esterilización por filtración incluye la remoción mecánica de partículas en un fluido,

líquido o gas. Actualmente, en adición a sus muchas otras aplicaciones comerciales y
científicas, la filtración es usada extensivamente en la producción de fluidos farmacéuticos
estériles y libres de partículas biológicas que no pueden ser esterilizados por otros medios.
Típicamente pueden ser usados para la esterilización de emulsiones oleosas o soluciones
termolábiles. Se usa para esterilizar aceites, algunos tipos de pomadas, soluciones
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oftálmicas, soluciones intravenosas, drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para

cultivos celulares, soluciones de antibióticos y vitaminas.

La relativa facilidad de manipulación, el bajo costo por unidad de volumen esterilizada, y la

eficiencia para remover no sólo microorganismos sino también partículas minúsculas
permiten justificar su uso.

La filtración consiste en el paso de una mezcla de fluidos y partículas sólidas a través de un

medio poroso capaz de retener las partículas en su superficie y/o atraparlas en su matriz.

Los filtros pueden ser clasificados como: de profundidad, de superficie o filtros de

membrana dependiendo de su composición y características de construcción, de sus
interacciones con fluidos y partículas.

Cuando se utilizan en forma independiente, ningún tipo de filtro sería lo suficientemente

efectivo y rentable para lograr los estándares o grados de esterilización que requiere la
industria farmacéutica. La mejor manera para lograr su efectividad, a costos moderados, es
utilizar primero filtros de profundidad y de superficie para remover grandes partículas,
seguidos posteriormente de una filtración de alta eficiencia con filtros de membrana.

Los filtros de membrana son clasificados de acuerdo al tamaño del poro. Aquellos con poros
de 0.22 µm son usados comúnmente como filtros esterilizadores. Un poco más grandes, de
0.45 µm, son usados para esterilizar antibióticos o esteroides en vehículos orgánicos previo a
un proceso de cristalización.

Los fabricantes de filtros validan sus productos usando un protocolo que emplea
Pseudomonas diminuta cultivada en una solución especial.

En la industria farmacéutica se utiliza fundamentalmente en 3 situaciones:

1) Para la esterilización de agua de uso farmacéutico.

2) Para esterilizar productos líquidos que contienen sustancias termolábiles.
3) Para filtrar aire en zonas de procesamiento aséptico.

RADIACIONES

Su acción depende del: Tipo de radiación, tiempo de exposición.

A. Ultravioletas
La radiación UV comprende aquella porción del espectro electromagnético con longitudes
de onda desde 190 nm hasta 390 nm aproximadamente. Como la radiación UV pasa a través
de la materia, los electrones de los átomos absorben energía, con lo que pasan a un estado
altamente energético y se ve alterada su reactividad. Afectan a las moléculas de ADN de los
microorganismos debido a que forman dímeros de pirimidinas adyacentes que inducen
errores en la replicación y por lo tanto la pérdida de viabilidad de las células.
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Aplicaciones: Por ser escasamente penetrante, se utilizan para reducir la contaminación del
aire, agua y de superficies de las zonas de procesamientos de productos farmacéuticos. La
eficacia germicida de la radiación UV varía con la susceptibilidad de los organismos.

B. Ionizantes
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos, estructuras
proteicas y lipídicas, y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.

• Tienen gran penetrabilidad y se utilizan para esterilizar materiales termolábiles como

jeringas descartables, sondas, etc. No se utilizan para medios de cultivo o soluciones
proteicas porque producen alteraciones de los componentes.
• Se usa en medicamentos en estado sólido lábiles al calor. Así se usa para vitaminas,
antibióticos, esteroides, hormonas, sistemas terapéuticos de implantación, etc.
• No se usa para formas farmacéuticas líquidas.
• Es costoso por lo que se usa solamente a gran escala.

ESTERILIZACIÓN POR VAPOR A PRESIÓN

Autoclave. El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de Microbiología para

esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se
desnaturalicen a temperaturas mayores a 100°C. Es un sistema cerrado donde se forma
vapor de agua que se somete a una presión elevada, lo que hace que el agua alcance una
temperatura de 121°C causando la desnaturalización de enzimas lo que conlleva a la muerte
de los microorganismos y la destrucción de las esporas. Habitualmente, se esteriliza a 121°C
durante 15 minutos, sin embargo, en algunas oportunidades, dadas las características del
material, es necesario variar el tiempo de esterilización.

Cuando se utiliza este método es importante controlar en el autoclave la relación entre la

temperatura, la presión y el tiempo de exposición, ya que éstos son factores críticos en el
proceso. Sólo cuando el vapor se coloca bajo presión, es cuando su temperatura aumenta
por encima de los 100°C y esto permite alcanzar las temperaturas de esterilización.

Éste es el método de elección para esterilizar materiales termoestables y no sensibles a la

humedad como medios de cultivo, cultivos de microorganismos para descartar, uniformes,
instrumentos quirúrgicos, etc.

Ventajas: no deja residuos, es un método rápido (cada proceso dura de 30 a 60 minutos); su

seguridad, es el método que menos fallos y toxicidad presenta; su economía, es el
esterilizador con mejor relación costo/beneficio.

Inconvenientes: degrada materiales plásticos, corrosión de metales, deterioro de filos

cortantes y la imposibilidad de esterilizar aceites, grasas y polvos.
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Precauciones

• Antes de comenzar el proceso de esterilización es necesario remover todo el aire de la

cámara del autoclave, porque de lo contrario no se podrán alcanzar las condiciones de
esterilización requeridas debido a que la cámara interna del equipo no podrá ser saturada
por el vapor de agua.
• El tiempo de esterilización se debe comenzar a contar una vez que se han alcanzado los
121°C en la cámara interna del autoclave.
• Los recipientes con cierre hermético deben ser introducidos en el autoclave sin cerrar
totalmente el tapón, para facilitar la entrada del vapor durante el proceso. Al sacar del
autoclave después de la esterilización se cierra totalmente estos recipientes.

PROCEDIMIENTO

Preparar los materiales limpios, secos y envueltos para aislar del medio ambiente.

1. Revisar que el nivel de agua destilada coincida con la marca indicadora. En caso
necesario añadir agua destilada.
2. Colocar los medios de cultivo, materiales de laboratorio dentro del autoclave.
3. El material debe colocarse correctamente dentro del equipo para que permita la
correcta distribución del vapor de agua. Para ello tomar en cuenta:
• Distribuir el material en forma ordenada en toda la superficie interna disponible.
• Evitar que el material toque las paredes del autoclave.
• Colocar la ampolla del indicador biológico en el lugar que se considere más difícil
que llegue el vapor.
4. Conectar el autoclave, cerrar la tapa
apretando las manijas y esperar a que
salga vapor de agua por la salida de
purgado. Después cerrar esta salida.
5. Esperar que se alcancen los 121°C o
15 lbs de presión y comenzar a contar
el tiempo de esterilización (15
minutos). Una vez alcanzada esta
temperatura deberá bajarse el nivel
de calentamiento a medio o bajo.
Revisar continuamente la escala del
manómetro.
6. Cuando termine el tiempo de esterilización, apagar el autoclave.
7. Esperar que bajen la presión y la temperatura del equipo para abrirlo y retirar los
medios de cultivo y materiales esterilizados.
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CUESTIONARIO

• ¿Cuál es el fundamento de la tindalización?

• ¿Cuál es el fundamento de la pasteurización?
• ¿En los procesos de esterilización que es Indicador biológico?
• Describa las características de Bacillus stearothermophilus
• Describa las características de Pseudomonas diminuta