19 OFICINA ESPAÑOLA DE

PATENTES Y MARCAS

ESPAÑA
11 Número de publicación: 2 534 471
51
Int. CI.:
A23L 3/3499 (2006.01)

A23L 3/3508 (2006.01)

A23L 3/3571 (2006.01)

A01N 37/16 (2006.01)

A61L 2/16 (2006.01)

A61L 2/18 (2006.01)

C11D 3/386 (2006.01)

C11D 3/39 (2006.01)

C11D 3/48 (2006.01)

C11D 11/00 (2006.01)

12 TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3

96 Fecha de presentación y número de la solicitud europea: 26.10.2007 E 07867290 (4)
97 Fecha y número de publicación de la concesión europea: 21.01.2015 EP 2089065

54 Título: Método para la descontaminación de priones

30 Prioridad: 73 Titular/es:
27.10.2006 US 854831 P E.I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY
19.04.2007 US 925177 P (100.0%)
1007 MARKET STREET
45
WILMINGTON, DE 19898, US
Fecha de publicación y mención en BOPI de la
72 Inventor/es:
traducción de la patente:
23.04.2015 CROUD, VINCENT BRIAN;
JACKSON, GRAHAM y
COLLINGE, JOHN
74 Agente/Representante:
DE ELZABURU MÁRQUEZ, Alberto
ES 2 534 471 T3

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
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DESCRIPCIÓN

Método para la descontaminación de priones

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y reactivos para ser usados en la descontaminación de priones. En
5 particular, la invención se refiere a la descontaminación de priones de instrumentos quirúrgicos, evitando
ventajosamente un tratamiento con autoclave.

Antecedentes de la invención

La persistencia y resistencia de los agentes de priones responsables de CJD (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob) ha

hecho surgir temores sobre la posibilidad de una transmisión iatrogénica a continuación de una cirugía. Las
10 enfermedades de priones, que incluyen tembladera, tembladera atípica en ovejas, BSE (Encefalopatía Espongiforme
Bovina) en ganado, CWD (Enfermedad de Wasting Crónica) en ciervos y CJD en seres humanos son un grupo
nuevo de estados neurodegenerativos mortales, transmisibles. El agente transmisible denominado prión está
comprendido ampliamente o únicamente por un isómero conformacional de una proteína de prión PrPC celular
normal. El confórmero relacionado con la enfermedad, denominado PrPSc, tiene varias propiedades inusuales que
15 incluyen resistencia a proteólisis, insolubilidad en detergentes y elevada estabilidad térmica. Estas propiedades
Sc
físicas asociadas a observaciones de que PrP el se adhiere fuertemente al acero quirúrgico y otros materiales
presentan problemas en la limpieza y esterilización de instrumentos quirúrgicos ya que la actividad de priones se
conoce que es resistente al tratamiento convencional en autoclave.

En ausencia de un ensayo de diagnóstico pre-clínico para la CJD, no es posible un ensayo pre-quirúrgico de los
20 pacientes. Aunque en una minoría de casos, en los que la CJD se sospecha o es confirmada, los instrumentos
usados pueden ser sometidos a cuarentena o destruidos. Sin embargo, para la mayoría de los procedimientos, son
necesarios nuevos métodos de descontaminación. Hay muchos esfuerzos en marcha, que incluyen los del
Departamento de Sanidad del Reino Unido (por ejemplo, Medical Research Council (MRC), Prion Unit, Londres,
Reino Unido), intentando abordar el problema de las transmisiones iatrogénicas de la CJD.

25 En tratamiento en autoclave estándar y, en algunos casos, el tratamiento en autoclave a temperaturas elevadas

hasta 134ºC, es el patrón hospitalario para la descontaminación de priones. Sin embargo, estudios convencionales
han mostrado la supervivencia de priones bajo condiciones de autoclave (Taylor, DM., J. Hosp. Infect 43:S69-S76
(1999); Jackson et al., J. Gen. Virol 86:869-878 (2005)). Claramente, los priones se acumularán gradualmente bajo
estas condiciones. Incluso el autoclave más eficaz sólo esterilizará hasta el grado en que el calor y el vapor de agua
30 penetren en los artículos que están siendo tratados. Esto no es adecuado cuando se manejan conjuntos quirúrgicos
que comprenden numerosos instrumentos complejos.

Taylor (Taylor D.M., supra) describe el uso de soluciones de hipoclorito de sodio e hidróxido de sodio 2M en la
inactivación de priones. Sin embargo, hay problemas con esta propuesta como una inactivación incompleta y una
incompatibilidad con muchos dispositivos médicos. Además, se ha informado la resistencia de los priones al
35 tratamiento en autoclave.

Las normas de la entidad WHO (Organización Mundial de la Salud) sobre la descontaminación de priones
recomendaron tratamiento en autoclave y sumergir los instrumentos contaminados en NaOH 1M y 20.000 ppm de
NaOCl (Informe de la WHO "Infection Control Guidelines for Transmissible Spongiform Encephalopathies”, 23-26 de
marzo de 1999, Ginebra, Suiza, WHO/CDS/CSR/APH/2000.3). Esto es un procedimiento extremadamente peligroso
40 y puede dejar residuos de sales no deseables sobre las superficies. Aparte de esto, además de los aspectos de
seguridad, el efecto corrosivo de estas especies de halógenos alcalinas u oxidantes a esa concentración, combinado
con las temperaturas y presiones propias del tratamiento en autoclave, probablemente destruirían o al menos
deteriorarían los delicados instrumentos quirúrgicos.

Los reactivos en el comercio actualmente en uso para la limpieza de instrumentos quirúrgicos antes del tratamiento
Sc
45 en autoclave tienen poco a ningún efecto sobre la contaminación de PrP . Los métodos existentes de
descontaminación como los que implican LpH® y LpH®sa (Steris, Inc. Mentor, OH), y Endozyme Plus (Ruhof Corp.,
Mineola, NY) son de uso limitado en destruir ineficazmente. Además, algunos reactivos son incompatibles con
materiales médicos como el polímero Dracom (polisulfona).

Fichet et al. (Lancet 364:521-526 (2004)) describen tres métodos para la desinfección de dispositivos médicos
50 contaminados con priones. En primer lugar describen el uso de un limpiador enzimático (KLENZYME®, Merk & Co.,
Inc., Whitehouse Station, NJ) con tratamiento en autoclave a 121ºC. En segundo lugar, describen un limpiador
alcalino (HAMO® 100 PID, Steris, Mentor, Ohio). El tercer método descrito es el único que se dice que es adecuado
para dispositivos frágiles como endoscopios e implica el uso de un limpiador alcalino sobre los instrumentos
húmedos seguido de un tratamiento con peróxido de hidrógeno vaporizado (VHP) seco. Fichet et al. describen
55 también un limpiador enzimático seguido de tratamiento VHP como muy eficaz. No hay ninguna descripción de la
composición del limpiador enzimático. El ácido peracético es usado y se muestra que es ineficaz (velocidad de
transmisión de 100% a continuación del tratamiento).

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La presente invención busca superar el (los) problema(s) asociado(s) con las composiciones y métodos asociados
con la técnica anterior proporcionando composiciones y métodos eficaces de descontaminación de priones.

Sumario de la invención

Se proporciona una composición acuosa de degradación de priones para ser usada en el método de la
5 reivindicación 1.

Una composición acuosa de degradación de priones comprende (a) una cantidad eficaz de al menos un agente
oxidante; (b) una cantidad eficaz de al menos una primera proteasa; (c) una cantidad eficaz de al menos una
segunda proteasa en que dicha segunda proteasa es diferente de dicha al menos una primera proteasa; y (d) una
cantidad eficaz de un tensioactivo.

10 En una realización preferida, la composición acuosa de degradación de priones comprende dos proteasas
seleccionadas entre el grupo que consiste en NEUTRASE®, ALCALASE®, PRONASE® y Proteinasa K. En una
realización preferida adicional, las dos proteasas son NEUTRASE® y ALCALASE®.

En una realización preferida, el tensioactivo es dodecil-sulfato de sodio (SDS).

En otra realización, la composición acuosa de degradación de priones comprende adicionalmente un ingrediente

15 adicional seleccionado entre el grupo que consiste en ajustadores del pH, agentes tamponantes, agentes quelantes,
inhibidores de la corrosión, estabilizadores de peroxígeno y sus mezclas.

La presente invención proporciona métodos mediante los cuales entidades con priones como instrumentos médicos
pueden ser descontaminadas de la ineficacia de los priones. Según los métodos de esta invención, la entidad
descontaminada de priones se pone en contacto con los compuestos de la composición acuosa de degradación de
20 priones de forma secuencial.

Se ha encontrado sorprendentemente que los métodos de la invención dan lugar a una potenciación de la actividad
de los componentes de la composición de degradación de priones, dando lugar a mejoras en la descontaminación
de priones. En particular, el uso del agente oxidante en combinación con la proteasa descrita con posterioridad da
lugar a un efecto sinérgico.

25 Se proporciona un método para la descontaminación o desinfección de priones que comprende: (a) poner en
contacto una entidad contaminada con priones con al menos un tensioactivo; (b) poner en contacto la entidad con un
agente oxidante y (c) poner en contacto la entidad con al menos una proteasa.

Se proporciona un método secuencial para la descontaminación o desinfección de priones de una entidad

contaminada con priones que comprende: (a) en primer lugar poner en contacto la entidad que va a ser
30 descontaminada con un tensioactivo y seguidamente (b) poner en contacto la entidad que va a ser descontaminada
con un agente oxidante, en que dicho agente oxidante comprende una fuente de peroxígeno y un activador y
seguidamente (c) poner en contacto la entidad con una proteasa.

En otra realización, un método para la descontaminación o desinfección de priones de una entidad contaminada con
priones comprende: (a) en primer lugar poner en contacto la entidad con un tensioactivo y seguidamente (b) poner
35 en contacto la entidad con un agente oxidante y seguidamente (c) poner en contacto la entidad con una primera
proteasa y (d) poner en contacto la entidad con una segunda proteasa.

En una realización preferida, las dos proteasas se seleccionan entre el grupo que consiste en NEUTRASE®,
ALCALASE®, PRONASE® y Proteinasa K. En una realización preferida adicional, las dos proteasas son
NEUTRASE® y ALCALASE®.

40 La entidad contaminada con priones puede tener una superficie sólida o ser un fluido, como un fluido biológico. Las
superficies sólidas incluyen instrumentos médicos y dentales. En un aspecto, la entidad contaminada con priones se
selecciona entre el grupo que consiste en un residuo biológico, una instalación usada en instalaciones de
tratamiento de alimentos, un recinto usado para albergar animales, un instrumento médico, un instrumento dental y
encimeras. El tratamiento de alimentos incluye, por ejemplo, instalaciones de mataderos y de tratamiento de aves de
45 corral. En una realización preferida, la entidad contaminada con priones se selecciona entre el grupo que consiste en
instrumentos médicos contaminados con priones. En otro aspecto preferido, el instrumento médico es un endoscopio
o laparoscopio. Todavía en otro aspecto, el instrumento médico está comprendido por acero, plástico o una
combinación de los mismos. El instrumento médico puede estar comprendido también por otros materiales de
construcción que se encuentran normalmente en dispositivos e instrumentos médicos.

50 En otro aspecto, los métodos de degradación de priones son usados para disminuir y/o eliminar la CJD iatrogénica.

En un aspecto preferido, los métodos para la descontaminación de priones se realizan en un esterilizador de

instrumentos médicos.

En otro aspecto, cualquiera de los métodos de la presente invención comprende adicionalmente y tiene

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preferentemente una etapa final, de tratamiento en autoclave de la entidad contaminada con priones.

En un aspecto preferido, el presente método se usa para una descontaminación a bajas temperaturas en las que se
evita el tratamiento en autoclave.

Se proporciona un estuche de ensayo que comprende: (a) un primer reactivo que comprende un agente oxidante; (b)
5 un segundo reactivo que comprende al menos una proteasa y (c) un tercer reactivo que comprende un tensioactivo.

El segundo reactivo en el estuche de ensayo comprende al menos dos proteasas diferentes. En una realización
preferida, las dos proteasas se seleccionan entre el grupo que consiste en NEUTRASE®, ALCALASE®,
PRONASE® y Proteinasa K. En una realización preferida adicional, las dos proteasas son NEUTRASE® y
ALCALASE®.

10 En otra realización preferida, el primero, segundo y tercer reactivos se proporcionan individualmente en forma de
sólidos. En una realización preferida, el primero, segundo y tercer reactivos en el estuche de ensayo se
proporcionan en forma de polvos sólidos.

En otra realización, el estuche de ensayo comprende adicionalmente un reactivo adicional seleccionado entre el
grupo que consiste en ajustes del pH, agentes tamponantes, agentes quelantes, inhibidores de la corrosión,
15 estabilizadores de peroxígeno y sus mezclas, que pueden ser suministrados como reactivo adicional del estuche de
ensayo o pueden estar incluidos como un reactivo en uno o más primero, segundo y tercer reactivo.

Breve descripción de las figuras

Figuras 1a y 1b. Análisis por transferencia Western de los datos generados en el ejemplo 2 que muestran la eficacia
no detectable de PERASAFE® Sterilant para la descontaminación de priones (Figura 1a) en comparación con el
20 tratamiento combinado con PERASAFE® Sterilant y proteasas y SDS (Figura 1b), en el que se exhibió una
descontaminación.

Figura 2. Transferencia Western de los datos generados en el ejemplo 4 que muestran la eficacia de
descontaminación usando concentraciones optimizadas de enzimas para la degradación proteolítica de PrPSc
conjuntamente con un agente oxidante (PERASAFE® Sterilant) a 40ºC. La columna de marcador es indicada como
25 M; la columna de testigo, C, contiene 12 μl de un homogenato de cerebro al 10% p/v como testigo. En seis
columnas, identificadas mediante tiempos de incubación, se introdujeron 12 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v
tratados a 40ºC durante 2, 10, 20, 30, 40 y 60 minutos.

Figura 3. Un gráfico del ensayo celular de tembladera (el ensayo de cultivo celular descrito en el ejemplo 5). Varias
diluciones de homogenato de cerebro de los animales infectados con cepas RML (Rocky Mountain Laboratories) de
30 priones son aplicados como revestimiento sobre alambres. Los alambres son sometidos al tratamiento de
descontaminación. Se ensayaron tratamientos a 40ºC y 50ºC. Se representaron gráficamente diversas diluciones
(RML) frente al número de unidades infecciosas de cultivo de tejidos (TC IU).

Figura 4. Una transferencia Western de los datos generados en el ejemplo 6 que muestran la eficacia de
descontaminación usando concentraciones optimizadas de enzimas para la degradación proteolítica PrPSc usando
35 diversas concentraciones de SDS en ausencia del agente oxidante (PERASAFE® Sterilant) a 50ºC. La columna de
marcador es indicada como M. La columna de testigo, C, contiene 12 μl de un homogenato de cerebro al 10% p/v
como testigo. En las columnas se introdujeron 12 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v tratado con SDS al 0, 0,5,
1,0, 1,5 y 2,0% (p/v). Las columnas se identifican mediante la concentración de SDS.

Figura 5. Una transferencia Western de los datos generados en el ejemplo comparativo A que muestra la eficacia de
40 descontaminación usando diversas concentraciones de ALCALASE® para la degradación proteolítica de PrPSc en
ausencia de un agente oxidante (PERASAFE® Sterilant) a 50ºC. La columna de marcador es indicada como M. La
columna de testigo, C, contiene 17 μl de un homogenato de cerebro al 10% p/v como testigo. En las columnas se
introdujeron 17 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v tratado con diversas concentraciones de ALCALASE® e
identificadas mediantes concentraciones de ALCALASE® de 1,5, 1,25, 1,0, 0,75, 0,50, 0,25 y 0 mg/ml.

45 Figura 6. Una transferencia Western de los datos generados en el ejemplo comparativo B que muestra la eficacia de
Sc
descontaminación usando diversas concentraciones de NEUTRASE® para la degradación proteolítica de PrP en
ausencia de un agente oxidante (PERASAFE® Sterilant) a 50ºC. La columna de marcador es indicada como M. La
columna de testigo, C, contiene 17 μl de un homogenato de cerebro al 10% p/v como testigo. En las columnas se
introdujeron 17 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v tratado con diversas concentraciones de NEUTRASE® e
50 identificadas mediante las concentraciones de NEUTRASE® de 1,5, 1,25, 1,0, 0,75, 0,50, 0,25 y 0 mg/ml.

Figura 7. Una transferencia Western de los datos generados en el ejemplo 7 que muestra la eficacia de la
descontaminación usando diversas concentraciones de ALCALASE®/NEUTRASE® (basadas en una dilución de
varias veces a partir de los ejemplos anteriores; diluciones de 2, 4, 8, 16, 32 y 64 de alimentos) para la degradación
Sc
proteolítica de PrP en presencia de un agente oxidante (PERASAFE® Sterilant) a 50ºC. La columna de marcador
55 es indicada como M. La columna de testigo, C, contiene 12 μl de un homogenato de cerebro al 10% p/v como

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testigo. En las columnas indicadas como 64, 32, 16, 8, 4 y 2 se introdujeron 12 μl de homogenato de cerebro al 10%
p/v y las diluciones respectivas de ALCALASE®/NEUTRASE®. Por ejemplo, las columna indicada como 2 es una
dilución de 2 veces de las concentraciones estándar de ALCALASE®/NEUTRASE® (es decir, 1,58 mg/ml de
ALCALASE® y 6,32 mg/ml de NEUTRASE®).

5 Figura 8. Una transferencia Western de los datos generados en el ejemplo 8 que muestra la eficacia de
descontaminación usando diversas concentraciones de ALCALASE®/NEUTRASE® (basadas en diluciones de
varias veces de 4, 6,7, 8,3, 10 y 12,5). Cada columna es identificada mediante el factor de dilución, mostrado como
Sc
marcas de las columnas, para la degradación proteolítica de PrP en presencia de un agente oxidante
(PERASAFE® Sterilant) a 50ºC. La columna de marcador es indicada como M. La columna de testigo, C, contiene
10 12 μl de un homogenato de cerebro al 10% p/v como testigo. En las columnas indicadas como 4, 6,7, 8,3, 10 y 12,5
se introdujeron 12 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v y las diluciones respectivas de
ALCALASE®/NEUTRASE®.

Figura 9. Una transferencia Western de los datos generados en el ejemplo comparativo C que muestra la eficacia de
descontaminación usando componentes de formulación PERASAFE® Sterilant en combinación con SDS al 1% p/v,
15 750 μg/ml de ALCALASE® y 3 μg/ml de NEUTRASE® a 50ºC. La columna de marcador es indicada como M. La
columna de testigo, C, contiene 16 μl de un homogenato de cerebro al 10% p/v como testigo. En las columnas
marcadas (a) a (f) se introdujeron 16 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v y los respectivos componentes se
identifican en el ejemplo comparativo C.

Figura 10. Una transferencia Western de los datos generados en el ejemplo 9 que muestra la eficacia de
20 descontaminación usando diversas concentraciones de ALCALASE®/NEUTRASE® (basadas en diluciones de
varias veces de 4, 6,7, 8,3, 10 y 12,5). Cada columna es identificada mediante el factor de dilución, mostrando como
marcas de las columnas, para la degradación proteolítica de PrPSc en presencia de un agente oxidante
(PERASAFE® Sterilant) a 50ºC. Esto es una repetición del trabajo original realizado en el ejemplo 8 (Figura 8). La
columna de marcador es indicada como M. La columna de testigo, C, contiene 12 μl de un homogenato de cerebro
25 al 10% p/v como testigo. En las columnas indicadas como 4, 6,7, 8,3, 10 y 12,5 se introdujeron 12 μl de homogenato
de cerebro al 10% p/v y las diluciones respectivas de ALCALASE®/NEUTRASE®.

Figura 11. Una transferencia Western de los datos generados en el ejemplo 10 que muestra la eficacia de
descontaminación usando diversos componentes de PERASAFE® Sterilant o diluciones de PERASAFE® Sterilant
completo con relación a la formulación 1X estándar en combinación con SDS al 1% p/v, 330 μg/ml de ALCALASE® y
30 1,2 mg/ml de NEUTRASE® a 50ºC. La columna de marcador es indicada como M. La columna de testigo, C,
contiene 13 ml de un homogenato de cerebro al 10% p/v como testigo. En las columnas indicadas como (a) a (e) se
introdujeron 13 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v y los respectivos componentes son como se indicó en el
ejemplo 10.

Figura 12. Transferencia Western de los datos generados en el ejemplo 11 que muestra la eficacia de PERASAFE®
35 Sterilant 1X + SDS al 1% p/v + ALCALASE® + NEUTRASE® para la descontaminación de priones a 40ºC frente a
50ºC. La columna de testigo, C, contiene 12 μl de un homogenato de cerebro al 10% p/v como testigo. En las
columnas 2, 5, 10 y 20 a cada temperatura indican los tiempos de reacción. En estas columnas se introdujeron 12 μl
de homogenato de cerebro al 10% p/v tratado a las temperaturas y tiempos indicados.

Figura 13. Comparación gráfica de las cinéticas de degradación de PrP a 40ºC y 50ºC a partir de la transferencia
40 Western de la Figura 12 y los datos generados en el ejemplo 11. Los datos se describen mejor mediante una caída
exponencial doble debido a las dos especies principales de PrP presentes; PrPC y PrPSc. Los valores de K1/2 son
muy similares para 40ºC y 50ºC (29 segundos y 22 segundos, respectivamente).

Figura 14. Transferencia Western de los datos generados en el ejemplo 12 comparando la eficacia de otros agentes
oxidantes cuando se usan en combinación con SDS al 1% p/v y 300 μg/ml de ALCALASE® + 1,2 mg/ml de
45 NEUTRASE®. La columna de testigo, C, contiene 12 μl de un homogenato de cerebro al 10% p/v como testigo. En
las columnas marcadas como “A”, “B”, “C”, “H”, “N”, “P” y “V” se introdujeron 12 μl de homogenato de cerebro al 10%
p/v tratado como se describe. C = Testigo, A = 16,2 mg/ml de PERASAFE® Sterilant (1X), B y C = 13 mg/ml de
PERASAFE® Sterilant (0,8X), H = una dilución 1:70 de hipoclorito (pH 8), N = 3,34 mg/ml de NaDCC (Neochlor), P =
30 mg/ml de PROXITANE® (pH 6,5) y V = 20 mg/ml de desinfectante VIRKON® S (pH 6).

50 Figura 15. Una representación gráfica de los niveles de inmunorreactividad mostrados en la figura 14 basados en los
datos generados en el ejemplo 12. Las columnas mostradas en la figura 14 fueron cuantificadas mediante
densitometría y son expresadas a continuación mediante un porcentaje del valor del testigo.

Descripción detallada de la invención

A invención proporciona un método de descontaminación de priones.

55 En esta descripción, se usa un cierto número de términos y abreviaturas. Las siguientes definiciones son aplicadas
salvo que se establezca específicamente otra cosa.

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Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión “que comprende” significa la presencia de las
características citadas, números enteros, etapas o componentes como se citan en las reivindicaciones, pero no
excluye la presencia o adición de una o más de otras características, números enteros, etapas, componentes o sus
grupos.

5 Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “aproximadamente” modificando la cantidad de un

ingrediente o reactivo de la invención o empleado en referencia a la variación de una cantidad numérica que se
produzca, por ejemplo, a través de una medición típica y procedimientos de manejo de líquidos usados para
preparar concentrados o soluciones de uso en el mundo real; a través de un error inadvertido en estos
procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, fuente o pureza de los ingredientes empleados para
10 preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término “aproximadamente” abarca también
cantidades que difieren debido a diferentes condiciones de equilibrio para una composición que resulta de una
mezcla inicial particular. Cuando no se modifiquen mediante el término “aproximadamente”, las reivindicaciones
incluyen equivalentes a las cantidades. En una realización adicional, “aproximadamente” significa el valor de
referencia en un 10%, preferentemente en un 5% y lo más preferentemente en un 1%.

15 Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos “prión” y “partículas de priones” se refieren a un
agente proteináceo causante de enfermedades responsable de un cierto número de enfermedades cerebrales
degenerativas en animales y seres humanos. Ejemplos de enfermedades asociadas a priones incluyen, pero sin
limitación, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (todas las formas que incluyen CJD, iCJD (iatrogénica), vCJD (variante),
sCJD (esporádica) y familiar (fCJD)), síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker, Insomnio Familiar Mortal y Kuru.
20 Ejemplos de enfermedades asociadas a priones en animales incluyen, pero sin limitación, tembladera, tembladera
atípica en ovejas, BSE (Encefalopatía Esponjiforme Bovina) en ganado y CWD (Enfermedad de Wasting Crónica) en
ciervos.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión “superficie contaminada con priones” se refiere a una
superficie contaminada (o potencialmente contaminada) con una partícula de prión infecciosa.

25 Como se usa en la presente memoria descriptiva, “cantidad eficaz” se usa para describir la cantidad de una
sustancia particular o combinación de sustancias en una formulación descrita en la presente memoria descriptiva
para conseguir una disminución en el título de partículas de priones infecciosas.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “perácido” es sinónimo de peroxiácido, ácido
peroxicarboxílico, ácido peroxídico, ácido peroxicarboxílico y ácido peróxoico.

30 Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión “ácido peracético” se abrevia como “PAA” y es
sinónima de ácido peroxiacético, ácido etanoperoxoico y otros sinónimos del número de registro CAS 79-21-0 y se
incluirán las formas tanto protonadas como no protonadas (es decir, iones peracetilo).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “perhidrólisis” se define como la reacción de un sustrato
seleccionado (un “activador”) con peróxido para formar un perácido. Normalmente, el peróxido inorgánico se hace
35 reaccionar con el activador para producir el perácido. En una realización, el perácido es ácido peracético.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión “contaminantes biológicos” se refiere a una o más
entidades biológicas no deseadas y/o patógenas que incluyen, pero sin limitación, microorganismos, esporas, virus,
priones y sus mezclas. La presente invención es particularmente eficaz en la destrucción y/o degradación de
priones.

40 Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “desinfecta” se refiere al procedimiento de destrucción o
prevención del crecimiento de contaminantes biológicos. Como se usa en la presente memoria descriptiva, el
término “desinfectante” se refiere a una composición que desinfecta destruyendo, neutralizando o inhibiendo el
crecimiento de contaminantes biológicos. Normalmente, los desinfectantes se usan para tratar objetos inanimados o
superficies.

45 Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término “descontamina” significa proporcionar seguridad
eliminando sustancias perjudiciales (por ejemplo, partículas de priones).

Como se usa en la presente memoria descriptiva, las expresiones “fuente peroxigenada”, “fuente de peroxígeno” y
“fuente de oxígeno” se refieren a compuestos capaces de proporcionar una cantidad eficaz de peróxido de
hidrógeno que incluyen, pero sin limitación, peróxido de hidrógeno, aductos de peróxido de hidrógeno (por ejemplo,
50 aducto urea-peróxido de hidrógeno (peróxido de carbamida)), perboratos y percarbonatos. En una realización
preferida, la fuente de peroxígeno es perborato de sodio.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión “sistema de agentes oxidantes” se refiere a un
sistema (por ejemplo, una composición o formulación) que proporciona una cantidad eficaz de un agente oxidante.
En una realización, el sistema de agentes oxidantes comprende una fuente de peroxígeno y un activador de
55 perácidos que (cuando se mezclan bajo condiciones de reacción acuosa adecuada) genera una cantidad eficaz de
perácido, preferentemente ácido peracético.

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Composición acuosa de degradación de priones

La presente invención se refiere a composiciones para ser usadas en la descontaminación de priones de entidades
contaminadas con priones. En un aspecto, la invención proporciona una composición de degradación de priones que
comprende un agente oxidante, una o más proteasas y un tensioactivo como un tensioactivo/detergente iónico.

5 Agente oxidante

El agente oxidante puede ser cualquier entidad química o mezcla capaz de oxidar (o catalizar la oxidación) de
proteínas, preferentemente proteína(s) de priones.

El agente oxidante puede ser cualquiera de los que se conoce que son eficaces en formulaciones con eficacia
biocida. El agente oxidante se puede seleccionar entre el grupo que consiste en un peróxido, persal, perácidos,
10 persulfatos, peroxiftalatos, cloros orgánicos, dióxido de cloro y sus mezclas estables. Ejemplos incluyen hipoclorito
de sodio, perborato de sodio, percarbonato de sodio, peróxido de hidrógeno, ácido peracético, dióxido de cloro,
peroximonopersulfato de potasio, dicloroisocianurato de sodio, ácido triclorocianúrico y sus mezclas estables.

En una realización el agente oxidante se proporciona en forma de un líquido o un sólido disuelto en un disolvente
polar (por ejemplo, agua). Una vez disuelto, el agente oxidante proporciona una concentración adecuada de
15 especies activas de agente oxidante en la composición de degradación de priones. “Agente activo oxidante” se
refiere a las especies oxidantes totales según se determina mediante titulación de oxígeno AVOX/yodométrica
disponible, u otro método adecuado (método tiosulfatimétrico, método permanganométrico o método cerimétrico), es
decir, el poder oxidante (véase las publicaciones "Peroxide Chemistry", Waldemar Adam, Editor, Wiley-VCH,
Weinheim, Germany, 2001 y "Organic Peroxides", Daniel Swern, Editor, John Wiley and Sons, Inc., Hoboken, NJ,
20 1971). En el método yodométrico, el poder oxidante de los productos se mide convenientemente en términos de la
cantidad de yodo liberado mediante reacción con yoduro de potasio (determinado mediante una titulación posterior
de ese yodo). El procedimiento es estándar en la técnica y los resultados pueden ser expresados en términos de
hipohalito disponible, perácido o halógeno, o de oxígeno, o simplemente como “poder oxidante”.

Los agentes oxidantes preferidos son los que tienen una buena eficacia a bajas temperaturas y buena
25 compatibilidad con materiales.

En una realización preferida, el agente oxidante comprende peróxido, un peróxido modificado, un perácido como
ácido peracético o sus mezclas. Éste puede ser una mezcla en equilibrio de ácido peracético, peróxido de hidrógeno
y ácido acético o ser generado in situ a partir de una fuente apropiada de peroxígeno y un “activador”. Ejemplos de
activadores (o precursores de perácidos) incluyen, pero sin limitación, tetraacetiletilenodiamina (TAED),
30 nonanoiloxibenceno-sulfonato (NOBS), nonanoiloxi-sulfonato de sodio (SNOBS), nonil-amido-caproil-oxibenceno-
sulfonato (NACA-OBS), ésteres de ácidos carboxílicos, triacetina, diacetina, ácido acético, tetracetil-glicol-urilo
(TAGU), óxido de diacetil-hexahidrotriazina, N-acil-lactamas, acetil-trietil-citrato (ACT), pentaacetato de glucosa,
octaacetato de sacarosa y ácido acetil-salicílico, por mencionar algunos. En una realización preferida, el activador es
un donante de N-acilo como TAED, SNOBS, TAGU, N-acil-lactamas. En un aspecto preferido adicional, el activador
35 es TAED.

Se reconocerá que el ácido peracético y el peróxido existirán en formas tanto protonadas como desprotonadas,
dependiendo la relación del pH y pKa de las especies relevantes. Ejemplos de desinfectantes basados en perácidos
disponibles en el comercio incluyen, pero sin limitación, PERASAFE® Sterilant y RelyOn® Disinfectant.
PERASAFE® Sterilant es una combinación en polvo de una fuente de oxígeno (40-60% p de perborato de sodio y
40 10-30% p de tetraacetiletileno-diamina), estabilizador, inhibidor de la corrosión, tampón y desinfectante, que cuando
se mezcla con agua, genera un sistema de agente oxidante que comprende aproximadamente 0,26% de ácido
peracético (en forma de un mezcla de ácido peracético e iones peracetilo) a pH 8,0, cuando se prepara según las
instrucciones del fabricante.

El agente oxidante es un sistema de peroxígeno. Un sistema de peroxígeno es una combinación de una fuente de
45 peroxígeno (por ejemplo, una persal como perborato de sodio o percabonato de sodio) y un activador como
tetraacetil-etilenodimina (TAED) o L-acetil-caprolactama, u otro activador como se cita con anterioridad, que genera
ácido peracético y aniones peracéticos in situ tras la disolución. Preferentemente, el sistema de peroxígeno es usado
en fase líquida, preferentemente en solución, preferentemente en solución acuosa.

En un aspecto, el agente oxidante comprende al menos un perácido alifático de C1 a C10. En un aspecto preferido,
-
50 el agente oxidante comprende iones peracetilo (CH3C(O)OO ) y/o ácido peracético (CH3C(O)OOH; CAS 79-21-
0).Preferentemente el agente oxidante comprende peróxido de hidrógeno y/o ácido peracético, más preferentemente
el agente oxidante comprende peróxido de hidrógeno, ácido peracético e iones peracetilo. Un agente oxidante
preferido es PERASAFE® Sterilant suministrado por la entidad Antec International, Sudbury, Reino Unido (una
sucursal de E.I. DuPont de Nemours and Company, Inc., Wilmington, DE, USA). En una realización particular,
55 PERASAFE® Sterilant es formulado para una solución de almacenamiento que varía de 0,1X a 20X de
PERASAFE® Sterilant, preferentemente de 0,5X a 5X de PERSAFE® Sterilant, más preferentemente 0,5X a 2X de
PERSAFE® Sterilant. En caso de conflicto, preferentemente PERSAFE® Sterilant es formulado de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, es decir, 81 g/ 5 litros para una solución madre de PERSAFE® Sterilant 1X.

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La cantidad de agente oxidante en la composición acuosa de degradación de priones es una cantidad eficaz, es
decir, una cantidad que, cuando se usa en la composición con los otros componentes, es eficaz para la degradación
de priones. Preferentemente, cuando el agente oxidante es ácido peracético, es usado a una concentración
equivalente a 0,26% p/v de ácido peracético (0,26% surge del uso de PERSAFE® Sterilant a 16,2 g/l de forma que
5 un 0,1% permanece 24 horas después de la constitución). Se ha descubierto sorprendentemente que hay una
sinergia entre el agente oxidante y la proteasa (enzima de degradación de priones) usada en la presente invención.
Por tanto, el uso reducido de agente oxidante puede ser compensado mediante un uso aumentado de enzima y
viceversa. Las cantidades exactas de agente oxidante y proteasa se pueden determinar mediante las condiciones en
uso, consideraciones de costes y el grado de eficacia requerida. Estas cantidades pueden ser fácilmente
10 determinadas por un experto en la técnica.

Preferentemente, el agente oxidante es usado a pH neutro. En una realización, el intervalo de pH es de

aproximadamente 5 a aproximadamente 9, preferentemente de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 y lo más
preferentemente de aproximadamente 8 por razones de compatibilidad de materiales.

Opcionalmente, es incluido también peróxido de hidrógeno en la composición oxidante además de otro agente
15 oxidante. Preferentemente, el peróxido de hidrógeno está en solución, más preferentemente en solución acuosa.

Opcionalmente, es incluido también ácido acético en la composición oxidante.

Proteasas

La composición acuosa de degradación de priones comprende al menos una proteasa que, cuando se combina con
el agente oxidante, está presente en una cantidad eficaz para la degradación de priones.

20 Las proteasas o petidasas (usadas de forma intercambiable) son enzimas que escinden las uniones de amidas en
sustratos de proteínas (véase Walsh, Enzymatic Reaction Mechanisms. W.H. Freeman and Company, San
Francisco, Chapter 3 (1979) y Rao et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62(3):597-635 (1998)). Las proteasas incluyen
cualquier enzima perteneciente al grupo de enzimas EC 3.4, según se define por la entidad Nomenclature
Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. Estas enzimas pueden ser subdividas
25 de forma amplia en dos categorías principales, exopeptidasas y endopeptidasas, dependiendo de su sitio de acción.

Como las proteasas son ubicuas para todos los organismos vivos, las proteasas adecuadas para la degradación de
priones para ser usadas en la composición de esta invención pueden ser aisladas a partir de una diversidad de
organismos eucorióticos y/o procarióticos. Las proteasas útiles en el comercio han sido aisladas a partir de plantas
(por ejemplo, papaína, bromelaína y queratinasas), animales (por ejemplo, tripsina, pepsina y renina) y microbios
30 como hongos (por ejemplo, proteasas de Aspergillus oryzae) y bacterias (especialmente proteasas bien conocidas
aisladas a partir del género Bacillus). Las especies de Bacillus secretan dos tipos extracelulares de proteasas,
proteasas neutras (muchas de las cuales son metalo-enzoproteasas, como NEUTRASE®, normalmente activa en un
intervalo de pH general de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, véase el documento US 6.636.526) y
proteasas alcalinas (como ALCALASE®, normalmente caracterizada por una actividad elevada a pH alcalino, véase
35 GENBANK® P00780 y P00782, Van der Osten et al., J. Biotechnol., 28:55-68 (1993)).

Un subgrupo de las proteasas de serina provisionalmente denominadas subtilasas ha sido propuesto por Siezen, et
al., supra. Estas proteasas de serina son útiles en la composición, método y estuche de ensayo de esta invención.
Se definen mediante análisis de homología de más de 40 secuencias de aminoácidos de serina proteasas
previamente denominadas proteasas de tipo subtilisina. Una subtilisina fue previamente definida como una serina
40 proteasa producida mediante bacterias Gram-positivas u hongos y según Siezen, et al., y es actualmente un
subgrupo de las subtilasas (o “subtilisina proteasas”). Se ha identificado una amplia diversidad de subtilisinas y ha
sido determinada la secuencia de aminoácidos de un cierto número de subtilisinas. Éstas incluyen más de seis
subtilisinas de cepas de Bacillus, a saber, subtilisina 168, subtilisina BPN’, subtilisina Carlsberg, subtilisina Y,
subfilina amilosacchariticus y mesentericopeptidasa (Kurihara et al., J. Biol. Chem. 247 5629-5631 (1972); Wells et
45 al., Nucleic Acids Res. 11 7911-7925 (1983); Stahl and Ferrari, J. Bacteriol. 159 811-819 (1984), Jacobs, et al., Nucl.
Acids Res. 13 8913-8926 (1985); Nedkov et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366 421-430 (1985), Svendsen, et al.,
FEBS Lett. 196 228-232 (1986)), una subtilisina de una actinomicetales, termitasa de Thermoactinomyces vulgaris
(Meloun et al., FEBS Lett. 198 195-200 (1985)), y una subtilisina fúngica, Proteinasa K de Tritirachium album (Jany
and Mayer, Biol. Chem. Hoppe- Seyler 366 584-492 (1985)). Para una referencia adicional, véase la tabla I de
50 Siezen et al., supra.

Las subtilisinas están bien caracterizas física y químicamente. Además del conocimiento de la estructura primaria
(secuencia de aminoácidos) de estas enzimas, se determinaron más de 50 estructuras por rayos X de resolución
elevada de subtilisinas que delinean la unión del sustrato, estado de transición, productos, al menos tres inhibidores
de proteasas diferentes y definen las consecuencias estructurales para una variación natural (Kraut, Ann. Rev.
55 Biochem. 46 331-358 (1977)).

Un subgrupo de subtilasas particularmente útiles para esta invención, I-S1, comprende las subtilisinas “clásicas”,
como subtilisina 168, subtilisina BPN’, subtilisina Carlsberg (por ejemplo ALCALASE®, disponible en la empresa
Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca) y subtilisina DY.

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Un subgrupo adicional de las subtilisinas I-S2 es reconocido por Siezen et al. (supra). Las proteasas del subgrupo I-
S2 son también proteasas útiles en esta invención y se describen como subtilisinas altamente alcalinas y
comprenden enzimas como subtilisina PB92 (por ejemplo, MAXACAL®, Gist-Brocades NV, Dinamarca), subtilisina
309 (por ejemplo, SAVINASE®, Novozymes) y subtilina 147 (por ejemplo, ESPERASE®, Novozymes) y elastasa
5 alcalina YaB.

Las mutaciones al azar y dirigidas al sitio del gen de la subtilasa han surgido a partir del conocimiento de las
propiedades físicas y químicas de la enzima y contribuyeron a una información relativa a la actividad catalítica de la
subtilasa, especificidad de sustrato, estructura terciaria, etc. (Wells, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:1219-1223
(1987); Wells, et al., Phil. Trans. R. Soc. Lond.A. 317:415-423 (1986); Hwang and Warshel, Biochem. 26 2669-2673
10 (1987); Rao, et al., Nature 328:551-554 (1987); Carter, et al., Proteins 6:240-248 (1989); Graycar, et al., Annals of
the New York Academy of Sciences 672 71-79 (1992); and Takagi, Int. J. Biochem. 25 307-312 (1993)).

Ejemplos de proteasas y variantes de proteasas que son útiles en esta invención han sido descritos en numerosas
patentes y solicitudes de patentes de los Estados Unidos que incluyen, pero sin limitación, las publicaciones de
solicitudes de patentes de EE.UU. US 200502391885 A1 y US 20060147499 A1 y las patentes de EE.UU.
15 concedidas: US 5.500.364, US 6.506.589, US 6.555.355, US 6.558.938, US 6.558.939, US 6.605.458, US
6.632.646, US 6.682.924, US 6.773.907, US 6.777.218, US 6.780.629, US 6.808.913, US 6.835.821, US 6.893.855,
US 6.921.657, US US 7.026.53, US 7.098.017 y US 7.109.016.

Ejemplos de proteasas disponibles en el comercio incluyen, pero sin limitación, el grupo consistente en Bacillus sp.
(por ejemplo, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, etc.), proteasas
20 como subtilisinas (ALCALASE®; disponible en la empresa Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca), la proteasa
neutra NEUTRASE® (disponible en la empresa Novozymes), EVERLASE® (Novozymes; una proteasa de Bacillus
sp. Disponible en la empresa Sigma-Aldrich, catálogo nº P5985), POLARZYME® (Novozymes; una proteasa tratada
por ingeniería genética a partir de aplicaciones de lavados a bajas temperaturas), SAVINASE® (disponible en la
empresa Novozymes), Sus scrofa pepsin, Carica papaya chymopapain, Ananas comosus bromelain, Carica papaya
25 papain, Streptomyces griseus PRONASE® (también conocida como PRONASE E® o PRONASE®), Tritirachium
album Proteinasa K (que incluye Proteinasa K producida de forma recombinante a partir de Pichia pastoris), y sus
mezclas. Estas proteasas son enzimas disponibles en el comercio y pueden estar disponibles en una diversidad de
formas de productos que incluyen polvos, comprimidos y formulaciones líquidas. En otro aspecto la(s) enzima(s)
dispobible(s) en el comercio puede(n) ser opcionalmente purificada(s) o parcialmente purificada(s) antes de ser
30 usada(s) en los presentes métodos. Los métodos para purificar proteínas son bien conocidos en la técnica. En una
realización preferida, la proteasa se selecciona entre el grupo que consiste en Proteinasa K, PRONASE®,
ALCALASE®, NEUTRASE®, y sus mezclas.

En un aspecto, la composición usada en los métodos de esta invención comprende una combinación de dos o más
proteasas. Preferentemente, cuando están presentes dos o más proteasas en la composición, las proteasas se
35 seleccionan entre el grupo que consiste en PRONASE®, Proteinasa K, ALCALASE® y NEUTRASE®.

En una realización preferida, la proteasa es una combinación de Proteinasa K y PRONASE®, ALCALASE® y

NEUTRASE® o ALCALASE® y PRONASE®. Cuando la composición comprende dos o más proteasas, las
proteasas pueden ser usadas de forma secuencial o simultánea en una mezcla para proteólisis. Sin embargo, debe
apreciarse que cuando se pone en contacto una entidad contaminada con priones con varias proteasas a la vez, las
40 actividades individuales pueden ser reducidas y puede ser necesaria una compensación, por ejemplo, mediante un
tiempo de contacto más prolongado. Esto se expone más en detalle con posterioridad.

Como es obvio para un experto en la técnica, cuanto mayor sea la concentración de la(s) proteasa(s), mayor y más
rápida es la destrucción que se consigue. Las combinaciones de la concentración de proteasas y el tiempo pueden
ser escogidas según las necesidades. Éstas pueden ser optimizadas mediante ensayos y errores rutinarios.

45 Las proteasas son susceptibles a una manipulación o modificación genética y/o de nivel de péptidos o productos
químicos. Será evidente para un experto en la técnica que las truncaciones, mutaciones o adaptación de las
proteasas (por ejemplo, para hacerlas más resistentes a las propias proteasas) no interfieren con la invención con la
condición de que la actividad de peptidasa de la(s) enzima(s) sea retenida mediante esta(s) manipulación(es). De
hecho, es aceptado que PRONASE® está más en la naturaleza de una preparación de proteasas fraccionadas más
50 que una enzima purificada de forma recombinante y el uso de un producto de sub-fraccionamiento de PRONASE®
de una fracción clonada y purificada de forma recombinante de la(s) peptidasa(s) comprendida por PRONASASE®
está abarcada por la presente invención. Las proteasas termoestables son particularmente preferidas, si son
obtenidas mediante modificación de proteasas existentes o bien clonando proteasas a partir de organismos
termofílicos.

55 En general, la proteasa total añadida a la composición de la invención es de aproximadamente 1,6 g/l (1,6 mg/ml).
Sin embargo, la cantidad eficaz de proteasa puede variar y variará, por ejemplo, desde menos de 0,1 hasta más de
20 g/l, dependiendo de la cantidad de agente oxidante presente. Los intervalos típicos son de 0,1 a 5 g/l o desde 1 a
4 g/l. Se añadirán más proteasas si está presente menos agente oxidante e inversamente, se puede usar menos
proteasa en una composición eficaz si está presente más agente oxidante.

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Tensioactivo/detergente

La composición de degradación de priones usada en el método de la presente invención comprende un tensioactivo.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, los términos “tensioactivo” y “detergente” se usarán de forma
intercambiable e incluyen tensioactivos de iones híbridos, tensioactivos aniónicos, tensiactivos catiónicos y
5 tensioactivos no iónicos. Ejemplos de tensioactivos incluyen, pero sin limitación, los tensioactivos aniónicos, como
dodecil-sulfato de sodio (SDS), lauril-sulfato de amonio y otras sales de alquil-sultato, monohidrato de 1-
octanosulfonato de sodio, sal de sodio de N-lauroilsarcosina, lauril-sulfato de sodio, lauril-éter-sulfato de sodio
(SLES), hidrato de taurodesoxicolato de sodio y alquil-benceno-sulfonato; tensioactivos catiónicos como bromuro de
cetil-trimetilamonio y otras sales de alquil-trimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio, sebo-aminapolietoxilada, cloruro de
10 benzalconio y cloruro de bencetonio; tensioactivos de iones híbridos (anfóteros) como dodecil-betaína, óxido de
dodecil-dimetilamina, cocamidopropilbetaína y coco-anfo-glicinato; y tensioactivos no iónicos como alquil-poli(óxido
de etileno), copolímeros de poli(óxido de etileno) y poli(óxido de propileno), alquil-poliglucósidos (por ejemplo, acetil-
glucósido), decil-maltósido, alcoholes grasos, alcohol cetílico, alcohol oleílico, cocamido-monoetanolamina,
cocamido-dietanolamina y cocamido-trietanolamina).

15 En una realización particular, el tensioactivo se selecciona entre el grupo que consiste en dodecilbenceno-sulfonato
de sodio, lauril-éter-sulfato, condensado de óxido de etileno/óxido de propileno/alquil-fenol, poliglicol-éter o alcoholes
grasos, condensado de ácido graso-óxido de etileno, poliglicol-éter de alquil-fenoles, etoxilato de alcohol graso,
lauril-éter-sulfato de sodio, dodecil-sulfato de sodio y combinaciones de dos o más de los mismos.

En otra realización particular, el tensioactivo es un tensioactivo catiónico o aniónico, preferentemente un tensioactivo

20 aniónico y, más preferentemente, dodecil-sulfato de sodio (SDS), hidrato de taurodesoxicolato de sodio, monohidrato
de 1-octanosulfonato de sodio, dodecil-sulfato de litio, sal de sodio de N-lauroilsarcosina o una combinación de dos o
más de los mismos. Preferentemente, el tensioactivo es SDS.

El tensioactivo puede ser usado a cualquier concentración eficaz. Ésta se puede determinar fácilmente y/o ser
optimizada mediante ensayo y error rutinario. Cuando el tensioactivo es SDS, la concentración final del tensioactivo
25 con respecto al contacto con una entidad contaminada con priones con un tensioactivo es preferentemente de
aproximadamente 1% (porcentaje en peso) a aproximadamente 6%, más preferentemente de aproximadamente 1%
a aproximadamente 3%, incluso más preferentemente de aproximadamente 1% y los más preferentemente 1%,
basada en la optimización de la transferencia Western. Nuevamente, hay una sinergia entre las enzimas,
tensioactivo y agente oxidante y los niveles de componentes pueden ser variados para ajustarse a las necesidades.

30 Las proteasas pueden estar adversamente afectadas (por ejemplo, adolecer de actividad reducida o pérdida de
actividad) en presencia de tensioactivo en exceso. Las proteasas individuales tienen características individuales y
está dentro de las capacidades de un experto en la técnica evitar la pérdida de actividad debida a la acción del
tensioactivo. Deben ser seguidas las instrucciones del fabricante cuando sea posible. Ventajosamente, el (o los)
nivel(es) de tensioactivos está(n) limitado(s) con el fin de no inhibir significativamente la actividad de las proteasas
35 para la degradación de priones con anterioridad y en el momento del contacto con la proteasa.

Componentes adicionales

En una realización preferida, la composición de degradación de priones comprende al menos un inhibidor de la

corrosión. Aunque el inhibidor de la corrosión puede que no contribuya a la eficacia de la composición de
degradación de priones, se prefiere el uso de al menos un inhibidor de la corrosión, especialmente cuando se
40 descontaminan en instrumentos delicados. Ejemplos de inhibidores de la corrosión se describen en el documento
US 5.077.008 y normalmente incluyen pero sin limitación, triazoles (por ejemplo, benzotriazol), azoles, fosfatos y
benzoatos. En una realización el inhibidor de la corrosión es benzotriazol o tolil-triazol. En una realización preferida,
el inhibidor de la corrosión es benzotriazol.

En otra realización preferida, la composición de degradación de priones comprende al menos un estabilizador de

45 peroxígeno. Los estabilizadores de peroxígeno son conocidos, véase, por ejemplo, el documento US 5.624.634.
Ejemplos de estabilizadores de peroxígeno adecuados para ser usados en la composición de esta invención
incluyen estabilizadores de peróxido de hidrógeno y estabilizadores de perácidos. Estos estabilizadores incluyen,
pero sin limitación, amino-tri(ácido metileno-fosfónico) (serie DEQUEST® 2000), ácido 1-hidroxietilideno-1,1-
difosfónico (HEDP; serie DEQUEST® 2010), ácido hexametileno-diamino-tetrametileno-fosfónico (serie DEQUEST®
50 2050), ácido hexametileno-triamino-pentametileno-fosfónico (serie DEQUEST® 2090, dietelileno-triamino-
pentametileno-fosfonato (serie DEQUEST® 2060), ácido etileno-diamino-tetrametileno-fosfónico (DEQUEST® 2041),
ácido dipicolínico, ácidos fosfónicos y sus sales. Los estabilizadores DEQUEST están disponibles en la empresa
Solutia, Inc., St. Louis, MO. En una realización preferida, el estabilizador de peroxígeno es ácido etileno-diamino-
tetrametileno-fosfónico (DEQUEST® 2041) o ácido 1-hidroxietilideno-1,1-difosfónico (HEDP; DEQUEST® 2010) y/o
55 sus sales.

Realizaciones preferidas

En una realización preferida, la composición de degradación de priones comprende al menos dos proteasas y el
tensioactivo es dodecil-sulfato de sodio. En una realización preferida adicional, las dos proteasas se seleccionan

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entre el grupo que consiste en PRONASE®, ALCALASE®, NEUTRASE® y Proteinasa K y el tensioactivo es dodecil-
sulfato de sodio. Más preferentemente, la composición de degradación de priones comprende dos proteasas y las
dos proteasas son NEUTRASE® y ALCALASE®. Preferentemente, el agente oxidante de la composición de
degradación de priones comprende ácido peracético a un pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8 y, por
5 tanto, consiste en las formas tanto protonadas como desprotonadas.

Método para descontaminar la entidad infectada con priones

La presente invención proporciona un método secuencial para descontaminar una entidad contaminada con priones
que comprende poner en contacto la entidad contaminada con (a) una cantidad eficaz de al menos un agente
oxidante, (b) una cantidad eficaz de al menos una proteasa y (c) una cantidad eficaz de al menos un tensioactivo. La
10 etapa de contacto se realiza durante un periodo de tiempo suficiente para degradar las partículas de priones. Los
agentes oxidantes preferidos, proteasas, tensioactivos y sus cantidades para ser usados en los métodos de esta
invención son como se describieron con anterioridad.

El método comprende opcionalmente la etapa de tratar en autoclave la entidad después del contacto con la
composición de degradaciones de priones. El protocolo para el uso de la composición de degradación de priones es
15 compatible con el hardware existente como las máquinas usadas para el prelavado de instrumentos médicos antes
del tratamiento en autoclave.

En una realización, se usan etapas de al menos un agente oxidante y al menos dos proteasas en combinación con
un tensioactivo.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método como se describió anteriormente en el que la primera proteasa
20 es NEUTRASE® y la segunda proteasa es ALCALASE®.

Contacto simultáneo/secuencial

Las etapas de contacto del método de esta invención se realizan de forma secuencial.

Cuando se usa más de una proteasa, las proteasas pueden ser combinadas en una etapa única. Sin embargo, la
actividad de las proteasas puede ser rebajada en esta realización debido a que cada proteasa digiere a la otra.
25 Todavía, las etapas individuales en los métodos de la presente invención se llevan a cabo de forma secuencial. Las
etapas de los métodos de esta invención pueden ser repetidas y cualquiera de los métodos puede comprender
adicionalmente etapas de lavado para separar la composición de degradación de priones, por ejemplo, a partir de
una superficie sólida.

El método de esta invención comprende (a) poner en contacto en primer lugar la entidad contaminada con priones
30 con un tensioactivo y seguidamente (b) poner en contacto la entidad con un agente oxidante y seguidamente (c)
poner en contacto la entidad con al menos una proteasa.

En otra realización, un método secuencial para la descontaminación o desinfección de priones de una entidad
contaminada con priones comprende: (a) poner en contacto en primer lugar la entidad con un tensioactivo y
seguidamente (b) poner en contacto la entidad con un agente oxidante y seguidamente (c) poner en contacto la
35 entidad con una primera proteasa, y (d) poner en contacto la entidad con una segunda proteasa. Cuando se pone en
contacto la entidad contaminada con priones con dos proteasas, puede ser ventajoso separar la totalidad o una
parte de la primera proteasa antes de que la entidad se ponga en contacto con la segunda proteasa. En una
realización, sustancialmente la totalidad de la primera proteasa es separada antes del contacto con la segunda
proteasa. Esto se aplica igualmente a cada etapa de proteasa en una secuencia de etapas múltiples.

40 Es deseable separar la etapa de aplicación de tensioactivo de la(s) etapa(s) de aplicación de proteasa(s) si el

tensioactivo afecta adversamente a la actividad de la proteasa. En esta realización, al menos una proporción del
tensioactivo es separado (o diluido) antes de que la entidad se ponga en contacto con una proteasa con el fin de
maximizar la actividad de la proteasa.

El tiempo de reacción o incubación para cada etapa será normalmente de menos de 24 horas, preferentemente
45 menos de 2 horas, más preferentemente menos de 1 hora y lo más preferentemente menos de 20 minutos.

Tratamiento en autoclave

En un aspecto de la invención, el método de esta invención comprende adicionalmente el tratamiento en autoclave

de la entidad.

El tratamiento en autoclave, si se emplea como se describe en la presente memoria descriptiva, se puede llevar a
50 cabo usando cualquier ciclo adecuado en autoclave. Los ciclos típicos incluyen 121ºC durante 18 minutos o,
preferentemente, 134ºC durante 18 minutos. Pueden ser escogidos ciclos alternativos por el operario para adaptarse
a las necesidades particulares. Pueden ser empleados ventajosamente ciclos prolongados en autoclave. El
tratamiento en autoclave en agua puede mejorar los efectos destructores de priones y, por lo tanto, es preferido
cuando se usa el tratamiento en autoclave.

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Ventajosamente, se realiza una etapa de tratamiento en autoclave como una etapa final en los métodos de la
presente invención, es decir, el tratamiento en autoclave se realiza después de la(s) etapa(s) de contacto. Una etapa
de tratamiento en autoclave proporciona las ventajas de minimizar la extensión de la infección a través de la entidad
contaminada con priones y es particularmente ventajosa cuando la entidad es un instrumento quirúrgico. Además,
5 combinando la(s) etapa(s) de contacto con el tratamiento en autoclave de esta manera, puede haber
ventajosamente un aumento multiplicativo de la eficacia, es decir, si cada método puede reducir el título infeccioso
en 5 unidades logarítmicas, entonces se combinan para reducir la infecciosidad incluso más, como en 10 unidades
logarítmicas.

Preferentemente, se evita o se realiza el tratamiento en autoclave durante un tiempo reducido como menos de 3
10 horas, preferentemente el tratamiento en autoclave se omite; especialmente para instrumentos médicos frágiles.

Temperatura

La composición de degradación de priones y sus componentes individuales, como en un método de tratamiento

secuencial, se puede poner en contacto con la entidad contaminada con priones en un intervalo de temperaturas. En
una realización la(s) etapa(s) de contacto está(n) a una temperatura en el intervalo de 15ºC a aproximadamente
15 80ºC, preferentemente de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 60ºC, más preferentemente de
aproximadamente 40ºC a aproximadamente 60ºC y, lo más preferentemente, de aproximadamente 45ºC a
aproximadamente 55ºC.

Como el contacto del tensioactivo se realiza en una etapa separada que no incluye una proteasa, el tensioactivo se
puede poner en contacto con la entidad contaminada con priones a cualquier temperatura adecuada. De hecho,
20 puede ser usada una temperatura elevada. Una etapa separada para el contacto del tensioactivo con la entidad es
flexible y se realiza preferentemente a una temperatura de al menos 70ºC, preferentemente al menos 80ºC,
preferentemente al menos 90ºC, preferentemente al menos 100ºC.

La temperatura puede estar restringida por la naturaleza de la entidad, por ejemplo, algunas instalaciones médicas
como los endoscopios no pueden tolerar temperaturas elevadas como las usadas en el tratamiento en autoclave.
25 Para estas situaciones, los métodos de la invención ventajosamente no implican las condiciones de autoclave y la
elección de la temperatura se debe hacer por el operario con respecto a las tolerancias de la entidad que está
siendo descontaminada. Ejemplos de métodos según la presente invención que evitan el uso de las condiciones de
autoclave se pueden encontrar en la sección de ejemplos. Ventajosamente, los métodos según la presente
invención como los de los ejemplos pueden sustituir tratamientos convencionales de la técnica anterior como LpH®,
30 LpH®se, y tratamiento EndozymePlus. Véase la publicación de la solicitud de patente de EE.UU nº 2006/0217282
A1.

El tiempo de reacción o el tiempo de incubación para cada etapa será normalmente de menos de 24 horas,
preferentemente menos de 2 horas, más preferentemente menos de 1 hora y, lo más preferentemente, menos de 20
minutos.

35 Las temperaturas de incubación, es decir, las temperaturas a las que la(s) proteasa(s) se pone(n) en contacto con la
entidad variarán según la proteasa usada. Generalmente, es aceptable cualquier temperatura desde temperatura
ambiente (por ejemplo, 15-20ºC) hasta aproximadamente 80ºC, siendo más preferida de aproximadamente 20ºC a
aproximadamente 60ºC, es incluso más preferida de aproximadamente 40ºC a aproximadamente 60ºC y la más
preferida de aproximadamente 45ºC a aproximadamente 55ºC. A medida que la temperatura se aparta del calor
40 óptimo para una proteasa particular, tarda más tiempo la desactivación de los contaminantes de priones.
Claramente, esto puede estar compensado mediante una incubación durante un tiempo más prolongado o usando
una mayor concentración de proteasa. A temperaturas por encima de 60ºC las actividades pueden ser inferiores y
las enzimas pueden resultar inactivadas, pero claramente las preparaciones de proteasas individuales tendrán
temperaturas de desactivación individuales y deben ser seguidas las normas del fabricante siempre que sea posible.

45 Como se usa en la presente memoria descriptiva, “baja temperatura” significa menos de 134ºC, preferentemente
menos de 121ºC, más preferentemente menos 100ºC, incluso más preferentemente menos de 90ºC, incluso más
preferentemente menos de 80ºC, incluso más preferentemente menos de 70ºC, todavía incluso más
preferentemente menos de 60ºC y, lo más preferentemente, significa una temperatura como de aproximadamente
35ºC a aproximadamente 60ºC.

50 Características del método

Preferentemente, la(s) etapa(s) de contacto se lleva(n) a cabo con agitación. Preferentemente, dicha agitación es
una agitación rotatoria, por ejemplo, a aproximadamente 750 rpm.

Los ejemplos presentados en la presente memoria descriptiva incluyen las condiciones óptimas de uso en máquinas
lavadoras automáticas. Además, las condiciones escogidas son ventajosamente de bajo coste.

55 Ventajosamente, cuando la entidad contaminada con priones es un instrumento médico, los métodos para la
descontaminación de priones se realizan en un esterilizador de instrumentos médicos.

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Entidad contaminada con priones

La entidad contaminada con priones puede ser cualquier objeto físico en el que se desee desactivar y/o suprimir
priones. El término abarca fluidos así como sólidos (objetos), como dispositivos o instrumentos médicos (incluidos
instrumentos quirúrgicos). Los fluidos incluyen fluidos biológicos. Los priones que van a ser desactivados o
5 suprimidos pueden estar en la entidad (por ejemplo, en solución o suspensión en un fluido) o pueden estar sobre la
entidad (por ejemplo, unidos, enlazados o asociados de alguna otra manera con la superficie de una entidad sólida).
Por tanto, la entidad puede tener una superficie. Entidades que tienen superficie incluyen, por ejemplo, un
instrumento médico, un instrumento de laboratorio, una superficie de un recinto esterilizado, una encimera o la
superficie de una zona o instalación usada para la preparación o tratamiento de alimentos o la superficie de un
10 recinto usado para albergar animales. La superficie puede comprender metal, plástico o cualquier otro material
relevante de construcción. El metal puede ser acero como acero quirúrgico.

Cuando la entidad contaminada con priones es una superficie sólida, puede ser también encimeras de laboratorio,
instrumentos de laboratorio o una instalación de laboratorio, por ejemplo, en un recinto esterilizado para
investigación, producción y ensayo de compuestos farmacéuticos y biológicos.

15 Ejemplos no limitativos de entidades que pueden estar contaminadas con priones y que pueden ser ventajosa y
eficazmente descontaminadas según los métodos de esta invención, incluyen superficies de instalaciones
quirúrgicas de complejos veterinarios u hospitalarios así como superficies que entran en contacto con dicha
instalación quirúrgica. Preferentemente, la entidad es un instrumento médico que incluye instrumentos frágiles como
un laparoscopio o endoscopio.

20 La entidad puede ser usada en la industria de tratamiento de alimentos. Por tanto, la entidad contaminada con
priones se puede seleccionar entre el grupo que consiste en depósitos, transportadores, suelos, desagües,
refrigeradores, congeladores, superficies de instalaciones, paredes, válvulas, cintas, conductos, alcantarillas,
conexiones, grietas y combinaciones de dos o más de los mismos. La entidad contaminada con priones se puede
seleccionar entre una superficie de un granero o establo para ganado como aves de corral, ganado bovino, vacas
25 lecheras, cabras, caballos y cerdos; y/o criaderos para aves de corral y gambas.

La superficie diana se puede poner en contacto con las presentes composiciones de descontaminación de priones
usando cualquier número de medios. El tiempo, temperatura y concentración eficaz usados cuando se pone en
contacto el lugar deseado se pueden determinar fácilmente por un experto en la técnica. Los métodos específicos de
contacto incluyen pulverización, tratamiento, inmersión, remojo, vertido, mezcla, combinación, pintado,
30 revestimiento, aplicación, fijación y cualquier otro que comunique la(s) presente(s) composición(es) de
contaminación de priones con la superficie que va a ser tratada, es decir, que conoce o sospecha que está siendo
contaminada con partículas de priones.

Descontaminación

La descontaminación se refiere a la reducción del título de priones en una muestra o complejo específico. La
35 descontaminación se puede referir a la supresión de priones de una superficie tanto si dichos priones son
desactivados como si no. Por tanto, la descontaminación incluye la desactivación e incluye también la eliminación de
priones independientemente de que sean o no destruidos/desactivados. Cuando se descontamina, es importante
que la infecciosidad de los priones se suprima de la superficie o solución que está siendo descontaminada. Esto
puede ser mediante destrucción /desactivación) o mediante simple separación. Por tanto, los métodos de esta
40 invención pueden comprender adicionalmente, después de poner en contacto la entidad contaminada con priones
con (a) una cantidad eficaz de al menos un agente oxidante, (b) una cantidad eficaz de al menos una proteasa y (c)
una cantidad eficaz de al menos un tensioactivo, separando la entidad tratada de los reactivos de tratamiento. El
aspecto importante es que los priones (es decir, PrPSc) ya no están asociados con la superficie o solución que está
siendo descontaminada o se reducen en número y/o título. Claramente, si permanecen priones no infecciosos o
45 fragmentos adheridos a la superficie tratada después de la descontaminación, esto no afectaría materialmente a la
descontaminación o al hecho de que la superficie haya sido satisfactoriamente descontaminada.

En un aspecto de esta invención, las composiciones de degradación de priones y los métodos son usados para
disminuir y/o eliminar la CJD iatrogénica.

La descontaminación puede ser valorada mediante cualquier ensayo adecuado. Preferentemente, el ensayo usado
50 es una transferencia Western o un bioensayo. Claramente, los ensayos como los bioensayos y/o ensayos de
transferencia Western tienen un límite de sensibilidad. En la medida en que se haya reducido el título de priones
(número/inefectividad de priones), entonces se considerará que ha tenido lugar la descontaminación de priones.

Preferentemente, la descontaminación de priones es de 100 veces, preferentemente 1.000 veces, preferentemente

10.000 veces, preferentemente 100.000 veces, preferentemente 1.000.000 veces o incluso más. Preferentemente,
55 los priones son completamente eliminados o desactivados.

La desinfección se refiere a la limpieza en la medida en que destruya o prevenga el crecimiento de microorganismos

patógenos además de la descontaminación asociada con la infecciosidad de priones. La desinfección se produce

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mediante la acción combinada de una cantidad eficaz de agente oxidante (por ejemplo, ácido peracético), una
cantidad eficaz de la(s) proteasa(s) y una cantidad eficaz del tensioactivo.

Métodos de ensayo

La reducción en priones producida mediante los métodos de la presente invención puede ser verificada mediante
5 cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Ejemplos específicos de técnicas de ensayo adecuadas se
proporcionan en la presente memoria descriptiva para ilustrar la valoración de la reducción de priones.

Claramente, ciertos métodos se presentarán como más adecuados para una situación dada que otros métodos. Por
ejemplo, si la descontaminación de priones está teniendo lugar en solución, entonces la propuesta de una
transferencia Western puede ser la más adecuada. Si la descontaminación de priones está teniendo lugar en una
10 superficie, entonces la visualización directa de esa superficie puede ser lo más adecuado. Alternativamente, para
una descontaminación de priones que tiene lugar en una superficie, un bioensayo puede ser lo más adecuado. La
elección de los métodos de ensayo individuales para situaciones individuales está dentro de las capacidades de un
experto en la técnica. Se apreciará que en muchas situaciones el indicador más importante es la pérdida/reducción
de infecciosidad. Actualmente, la infecciosidad de priones es valorada lo más habitualmente mediante un bioensayo.
15 Sin embargo, es igualmente apropiado el ensayo bioquímico de PrPSc confórmero infeccioso.

Un ejemplo de un método de verificación adecuado es un ensayo de inmunotransferencia. Ventajosamente, el

ensayo de inmunotransferencia consiste o está basado en el ensayo descrito por Wadsworth et al. (Lancet 358:171-
180 (2011)).

Un ejemplo de un método de verificación adecuado es un bioensayo. Los métodos de bioensayo están

20 generalmente orientados a las especies de priones individuales que estén siendo ensayadas. La selección de
métodos de bioensayo adecuados se basan ventajosamente en las especies de priones que están siendo
ensayadas.

Estuches de ensayo

Se describen también estuches de ensayo para ser usados en la descontaminación de entidades contaminadas con
25 priones. En una realización, el estuche de ensayo comprende un conjunto de reactantes de los que un primer
reactante comprende un agente oxidante, un segundo reactante comprende al menos una proteasa y un tercer
reactante comprende un tensioactivo.

En una realización preferida, el segundo reactante comprende al menos dos proteasas. En una realización más
preferida, la al menos una o las al menos dos proteasas se seleccionan entre el grupo que consiste en PRONASE®,
30 Proteinasa K, ALCALASE® y NEUTRASE®. En una realización más preferida, el segundo reactante comprende al
menos dos proteasas, en que las dos proteasas son ALCALASE® y NEUTRASE®.

En una realización adicional, el estuche de ensayo comprende uno o más reactantes adicionales en los que los
reactantes adicionales se seleccionan entre el grupo que consiste en ajustadores del pH, agentes tamponantes,
agentes quelantes, inhibidores de la corrosión, estabilizadores de peroxígeno y sus mezclas. Alternativamente, el
35 primer, segundo o tercer reactante puede comprender adicionalmente uno o más de los reactantes adicionales.

En una realización adicional, cada uno de los reactantes en el estuche de ensayo es suministrado en forma sólida,
preferentemente en forma de polvos, para favorecer la estabilidad en almacenamiento. Los reactantes del estuche
de ensayo se mezclan con un disolvente polar hasta una concentración eficaz de cada uno de los reactantes. Una
vez que se mezclan eficazmente en el disolvente polar, se proporciona una composición de descontaminación de
40 priones lista para ser usada. El disolvente polar preferido es agua.

Los reactivos usados son agua soluble, estable y de baja toxicidad. El protocolo para su uso es compatible con el
hardware existente, por ejemplo, como se usa en los departamentos de descontaminación de hospitales para
prelavar y tratar en autoclave instrumentos. Por tanto, la invención proporciona la descontaminación de la
infecciosidad de priones de instrumentos quirúrgicos. Ventajosamente, el método de la presente invención puede ser
45 practicado usando la maquinaria existente.

La invención se ilustra seguidamente por medio de ejemplos que no deben ser considerados como limitación de su
alcance. En particular, la(s) etapa(s) en los ejemplos en los que una entidad es tratada con tensioactivo a
temperatura elevada no está(n) en relación características esenciales de la invención, sino que es (son) meramente
etapas opcionales ventajosas.

50 Ejemplos

Ejemplo comparativo 1. Tratamiento combinado de oxidación y proteasa

Este ejemplo describe métodos mediante los cuales una entidad contaminada con el material infeccioso PrPSc
puede ser descontaminada y el material infeccioso desactivado en una suspensión acuosa mediante una exposición
secuencial de la entidad (en el ejemplo, la entidad es un tejido cerebral infectado) a un agente oxidante más SDS

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tensioactivo y dos enzimas proteolíticas (ALCALASE® y NEUTRASE®).

Preparación de muestras de tejidos

El cerebro de la corteza frontal humana infectada con CJD fue homogeneizado a 20% (p/v) en PBS Dulbecco
GIBCOBRL 14190-094 (Paisley, Reino Unido), solución tamponante de fosfato, denominada en lo sucesivo “PBS”,
5 haciendo pasar el tejido cerebral a través de agujas de calibre 18, calibre 21 y calibre 23 para producir el
“homogenato”. El homogenato se diluyó hasta 15% p/v con PBS, se concentró en pequeñas partes alícuotas y se
almacenó a -70ºC.

Protocolo A: Uso de concentraciones de ALCALASE®/NEUTRASE® en presencia de PERASAFE® Sterilant

Cada reacción se realizó a un volumen total de 100 μl, que contenía 60 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v.

10 (a) Una muestra de homogenato de cerebro, 60 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v, se puso en contacto con
20 μl de agente oxidante 5X PERASAFE® Sterilant, preparado según las instrucciones del fabricante para una
concentración de ácido peracético al 0,26% a pH 8,0 usando solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 5 μl de
SDS al 20% p/v. La mezcla de reacción resultante contenía PERASAFE® Sterilant y SDS al 1% p/v.

(b) La mezcla de reacción se incubó al 50ºC durante 10 minutos y se analizaron 40 μl de la mezcla de reacción.

15 (c) Tratamiento con una primera proteasa: ALCALASE® (Novozymes). Se preparó una solución de 10 mg/ml de
ALCALASE® en agua. Una parte alícuota de 3 μl de esta solución enzimática se añadió a la solución de 85 μl de
homogenato tratado producido en la etapa (b) anterior. La concentración final de ALCALASE® fue de 300 μg/ml.

(e) Tratamiento con una segunda proteasa: NEUTRASE® (Novozymes). Se preparó una solución de 10 mg/ml de
NEUTRASE® en agua. Se añadió una parte alícuota de 12 μl de esta solución enzimática a una solución de 88 μl de
20 SDS/PERASAFE® Sterilant y homogenato tratado con ALCALASE® producido en la etapa (c) anterior. La
concentración final de NEUTRASE® fue de 1,2 mg/ml. La mezcla se incubó a 50ºC durante 10 minutos.

Detección PrPSc mediante transferencia Western

Los materiales del tratamiento con SDS/PERASAFE® Sterilant/ALCALASE®/NEUTRASE® (protocolo A) descritos

anteriormente fueron sometidos a un análisis de transferencia Western. Las transferencias fueron visualizadas los
25 anticuerpos ICSM 18 e ICSM 35 para detectar cualquier PrPSc restante en las muestras. Usando cualquier
anticuerpo, no hubo PrPSc detectable. Para la información de anticuerpos y métodos de detección en los mismos,
véanse los documentos EP934531 A1 y EP1565213. Todos los anticuerpos descritos en la presente memoria
descriptiva se pueden encontrar haciendo referencia a la solicitud de patente (PCT) Nº PCT/GB99/03617; patente
británica Nº GB 2.348.203; Patente Australiana Nº AU 773763; Patente Sudafricana Nº ZA 2001/3947; y documento
30 US 6.534.036.

Resulta claro a partir de este ejemplo que los métodos de la presente invención conducen a una descontaminación
significativa de priones. Después del tratamiento según el protocolo A, con agente oxidante y dos proteasas, se
observaron niveles elevados de destrucción de PrP a todas las concentraciones de proteasa como se manifiesto
mediante falta total de inmunorreactividad, que es equivalente a una reducción de al menos 1.200 veces de
35 infecciosidad. Esta estimación está basada en un límite de detección previamente determinado para el protocolo de
inmunotransferencia Western específico usado (Wadsworth et al., Lancet 358(9277): 171-180 (2001)) que es un
método de ensayo preferido.

Usando este método de ensayo, se determinó que se pueden detectar fácilmente 12 μl de un homogenato de
cerebro al 10% p/v en el testigo sin tratar. La sensibilidad de la inmunotransferencia Western para PrP es siempre de
40 10 nl de un homogenato al 10% p/v. Por tanto, si los 12 μl de homogenato al 10% p/v es la cantidad de partida en un
experimento y no es detectable ninguna señal mediante transferencia Western, entonces ha habido una reducción
mayor o igual a 1.200 veces en PrP.

Ejemplo comparativo 2. Comparación de descontaminación de priones usando PERASAFE®

Tratamiento esterilizante solamente y tratamiento de PERASAFE® Sterilant y proteasas en una etapa única

45 En este ejemplo, la descontaminación de priones se demostró según la presente invención mediante oxidación
usando PERASAFE® Sterilant y tratamiento con proteasas (protocolo C), en comparación con un tratamiento
ineficaz de la técnica anterior de PERASAFE® Sterilant solamente (protocolo B).

Protocolo B: Tratamiento solamente con PERASAFE® Sterilant (comparativo)

Se usó el siguiente protocolo para preparar muestras tratadas solamente con PERASAFE® Sterilant.

50 (a) Se preparó una solución madre de PERASAFE® Sterilant 5X, 1 ml, añadiendo 81 mg de polvo de PERASAFE®
Sterilant a 1 ml de H2O destilada y desionizada (dd) a 37ºC. Se usó una mezcladura por torbellino para disolver el

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polvo y la solución se incubó a 37ºC durante 15 minutos.

(b) Se prepararon 300 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v de CJD y se sometieron a mezcladura por torbellino
para asegurar una suspensión uniforme centrifugando en un microcentrifugadora a un ajuste de velocidad mínima de
1(80x g) durante 1 minuto.

5 (c) Se separaron 200 μl de materia sobrenadante del homogenato de cerebro y se transfirieron a un tubo limpio que
había sido calentado a 37ºC. Se añadieron 65 μl de solución madre de PERASAFE® Sterilant 5X y se mezclaron
con el homogenato mediante mezcladura por torbellino.

(d) Se añadieron 65 μl de PBS a la mezcla producida en la etapa (c) mezclada por torbellino.

(e) Se separó una parte alícuota de 20 μl de mezcla de homogenato de la etapa (d) para un tubo separado que
10 contenía 20 μl de tampón de carga SDS 2X y seguidamente el tubo separado se congeló a -70ºC en
aproximadamente 5 minutos.

(f) La mezcla restante de la etapa (d) se incubó a 37ºC con agitación (750 rpm).

(g) Se separaron partes alícuotas adicionales de 20 μl de la mezcla producida en la etapa (d) en los tiempos de 5,
10, 30, 60 y 120 minutos para separar tubos que contenían cada uno 20 μl de tampón de carga SDS 2X. Cada parte
15 alícuota se congeló a -70ºC en aproximadamente 5 minutos.

(h) Todas las partes alícuotas se descongelaron simultáneamente en un bloque de calentamiento a 100ºC. Se midió
el tiempo mezcladura por torbellino de las partes alícuotas cada dos minutos durante un total de 10 minutos y las
partes alícuotas se centrifugaron a velocidad máxima en una microcentrifugadora (15.000 x g).

(i) Para cada muestra alícuota de 20 μl, la muestra se introdujo en un pocillo separado que contenía gel de
20 acrilamida al 16% tamponado con tris-glicina. El gel se llevó a 200 voltios durante 80 minutos. Los 20 μl restantes de
muestra se congelaron y se almacenaron a -70ºC.

(j) Las muestras tratadas con gel de acrilamida de la etapa (i) se sometieron a un análisis de transferencia Western
sobre una membrana de poli(fluoro de vinilideno) (PVDF) (Imobilon-P) durante 90 minutos a 40 voltios o a 15 voltios
durante una noche (más de 12 horas).

25 (k) La membrana fue bloqueada en proteína láctea al 5% y PBS durante 45-60 minutos.

(l) Las muestras tratadas se incubaron con anticuerpo primario durante 1 hora, ICSM35B a 0,2 μg/ml en PBS. Se
usó un volumen de 25 ml para una membrana única.

(m) Las transferencias se revelaron seguidamente según el sistema Storm® para gel y análisis de transferencia y un
sistema de formación de imágenes de transferencia (tecnología del sistema Phosphorimager®, disponible en la
30 empresa Molecular Dynamics, Inc., Sunnyvale, CA), para la cuantificación.

Protocolo C: Degradación proteolítica con Proteinasa K y PRONASE® conjuntamente con oxidación con
PERASAFE® Sterilant

Se usó el siguiente protocolo para preparar muestras tratadas con PERASAFE® Sterilant conjuntamente con
Proteinasa K (PK) y proteasas PRONASE®.

35 (a) Se preparó una solución madre de PERASAFE® Sterilant de 5x, 1 ml, añadiendo 81 mg de polvo de
PERASAFE® Sterilant a 1 ml de H2O destilada y desionizada (dd) a 37ºC. Se usó una mezcladura por torbellino
para disolver el polvo y la solución se incubó a 37ºC durante 15 minutos.

(b) Se prepararon 300 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v de CJD y se sometieron a mezcladura por torbellino
para asegurar una suspensión uniforme centrifugando en una microcentrifugadora al ajuste de velocidad mínima de
40 1(80 x g) durante 1 minuto.

(c) Se separaron 200 μl de materia sobrenadante del homogenato de cerebro y se transfirieron a un tubo limpio, que
había sido calentado a 37ºC. Se añadieron 65 μl de solución madre de PERASAFE® Sterilant 5X y se mezclaron
con el homogenato mediante mezcladura por torbellino.

(d) Se añadieron 55 μl de una solución de SDS al 20% p/v en H2O dd a la mezcla producida en la etapa (c) y la
45 mezcla resultante se mezcló por torbellino.

(e) Se añadieron 10 μl de una solución de 10 mg/ml de PK en H2O dd y 10 μl de una solución de 40 mg/ml de

PRONASE® en H2O dd a la mezcla producida en la etapa (d) y la mezcla resultante se mezcló por torbellino.

(f) Se retiró una parte alícuota de 20 μl de mezcla de homogenato de la etapa (e) para un tubo separado que
contenía 20 μl de tampón de carga SDS 2X y seguidamente el tubo separado se congeló a -70ºC en
50 aproximadamente 5 minutos.

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(g) La mezcla restante de la etapa (e) se incubó a 37ºC con agitación (750 rpm).

(h) Se retiraron partes alícuotas adicionales de 20 μl de la mezcla producida en la etapa (e) en los tiempos de 5, 10,
30, 60 y 120 minutos para separar tubos que contenían cada uno 20 μl de tampón de carga SDS 2X. Cada parte
alícuota se congeló a -70ºC en aproximadamente 5 minutos.

5 (i) Todas las partes alícuotas se descongelaron simultáneamente en un bloque de calentamiento a 100ºC. Se midió
el tiempo la mezcladura por torbellino de las partes alícuotas para cada dos minutos durante un total de 10 minutos y
las partes alícuotas se centrifugaron a velocidad máxima en una microcentrifugadora (15.000 x g).

(j) Para cada muestra de parte alícuota de 20 μl, la muestra se introdujo en un pocillo separado que contenía gel de
acrilamida al 16% tamponado con tris-glicina. El gel se llevó a 200 voltios durante 80 minutos. Los 20 μl restantes de
10 la muestra se congelaron y se almacenaron a -70ºC.

(k) Las muestras tratadas con acrilamida-gel de la etapa (j) se sometieron a un análisis por transferencia Western
sobre membrana de poli(fluoro de vinilideno) (PVDF) (Imobilon-P) durante 90 minutos a 40 voltios o bien a 15 voltios
durante una noche (más de 12 horas).

(l) La membrana fue bloqueada en proteína láctea al 5% y PBST durante 45-60 minutos.

15 (m) Las muestras tratadas fueron incubadas con anticuerpo primario durante 1 hora, ICSM35B a 0,2 μg/ml en PBST.
Se usó un volumen de 25 ml para una membrana única.

(n) Las transferencias se desarrollaron seguidamente según el sistema Storm® para análisis de gel y transferencia y
un sistema de formación de imágenes de transferencias para la cuantificación.

Alternativamente, se preparó una solución madre de PERASAFE® Sterilant 5X añadiendo 81 mg de polvo de

20 PERASAFE® Sterilant a 1 ml de H2O dd a 37ºC con mezcladura por torbellino para disolver.

Las figuras 1a y 1b muestran los resultados de sistemas de transferencia Western para los protocolos B y C,
respectivamente. El tratamiento de oxidación solo (PERASAFE® Sterilant solamente, protocolo B) no muestra
destrucción de priones, pero la oxidación seguida de tratamiento con proteasas (protocolo C) es altamente eficaz,
desapareciendo el material priónico en el valor de tiempo de “cinco minutos”.

25 El tratamiento de “0 minutos” en la figura 1b muestra menos material priónico que el que era de esperar, esto puede
ser debido a los procedimientos implicados. Este tratamiento es realmente de aproximadamente 4 minutos y cada
tratamiento probablemente es más exactamente considerado por ser prolongado en 4 minutos de forma que “5
minutos” son aproximadamente 9 minutos, “10 minutos” son aproximadamente 14 minutos, etcétera. Por tanto, 9
minutos de tratamiento parece que proporcionan la destrucción de niveles indetectables, sin temperaturas elevadas
30 y sin tratamiento en autoclave o el uso de tratamientos químicos, cáusticos o corrosivos.

Ejemplo comparativo 3. Descontaminación de superficies quirúrgicas.

Los materiales de degradación de priones (agente oxidante y proteasas) producidos en el protocolo B del ejemplo 2
se llevaron a cabo sobre segmentos de alambre de acero sumergidos en homogenato infectados.

Los alambres de acero (5 mm x 0,15 mm) fueron incubados durante 30 minutos con un homogenato al 20%
35 preparado a partir del cerebro de un ratón CD1 enfermo terminal con templadera de los laboratorios Rocky Mountain
(RML).

Los alambres fueron tratados según la presente invención y se observó una descontaminación significativa para el
tratamiento bajo el protocolo B.

Se realizó una comparación usando B, el uso de agente oxidante solo (PERASAFE® Sterilant) no fue eficaz.

40 Ejemplo comparativo 4. Descontaminación de priones usando un agente oxidante (PERASAFE® Sterilant) en

combinación con proteasas de degradación de priones a 40ºC

La finalidad de este experimento fue determinar la eficacia de descontaminación usando una combinación de
proteasas con PERASAFE® Sterilant a aproximadamente 40ºC.

Se siguió el protocolo A del ejemplo 1 salvo que se indique otra cosa. Se produjo una mezcla de reacción única que
45 contenía 120 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v en un volumen total de 200 μl. Se retiraron partes alícuotas
de 20 μl para diversos valores del tiempo, se inactivaron y se sometieron a análisis por transferencia Western in toto.
Por tanto, se analizaron equivalentes de 12 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v para cada valor del tiempo. Se
usó un protocolo de sensibilidad elevada para la detección de la transferencia Western de PrP, con un límite de
detección conocido de 10 nl de un homogenato de cerebro al 10% p/v. Por tanto, la destrucción completa de PrP es
50 según se puso de manifiesto mediante una falta total de inmunorreactividad es equivalente a al menos una
reducción de 1.200 veces de la infecciosidad.

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La reacción se llevó a cabo en presencia de PERASAFE® Sterilant 1X y SDS al 1% p/v. Las formaciones sólidas de
ALCALASE® y NEUTRASE® se prepararon en forma de soluciones madre de 100 mg/ml en agua y se usaron a
concentraciones finales de 3,16 mg/ml y 12,63 mg/ml, respectivamente.

La mezcla de reacción se incubó a 40ºC con muestras de 20 μl retiradas para análisis a valores de tiempo de 2, 10,
5 20, 30, 40 y 60 minutos. El PrPSc residual se visualizó mediante detección de transferencia Western usando
anticuerpo monoclonal anti PrP biotinilado ICSM35 como el anticuerpo primario, como se muestra en la figura 2. Los
encabezados de las columnas indican M para la columna de marcador, C para la columna de testigo y los tiempos
de incubación como las restantes columnas. La inspección de la transferencia en la figura 2 indica que la destrucción
completa (> 1.200 veces) se consiguió después de 10 minutos a 40ºC.

10 Ejemplo Comparativo 5. Eficacia de descontaminación usando un ensayo de cultivo celular de infecciosidad de

priones

La eficacia de la descontaminación se valoró en un cultivo celular (un ensayo celular de tembladera, SCA). Se usó
una composición de descontaminación de priones que contenía PERASAFE® Sterilant 1X y SDS a 1% p/v y una
mezcla de ALCALASE® y NEUTRASE® a concentraciones finales de 3,16 mg/ml y 12,36 mg/ml. La solución se usó
15 a 40ºC y 50ºC con un tiempo de contacto de 10 minutos.

En este ensayo unos alambres de acero inoxidable fueron revestidos con diversas diluciones de homogenato de
cerebro de animales infectados con la cepa RML (Rocky Mountain Laboratories) de priones (véase el ejemplo 3).
Los alambres fueron seguidamente tratados con el reactivo de descontaminación o se usaron sin tratar. Fueron
incubados con una línea celular altamente susceptible (N2a-PK1, una línea celular de neuroblastoma de múridos)
20 clonada para que fuera altamente susceptible a priones RML (véase la publicación de Klöhn et al., PNAS, 100:
11666-11671 (2003)). A continuación de diversas tandas de crecimiento celular y dilución las células se filtraron y se
sometieron a ensayo celular de tembladera estándar por unidad de prión MCR (SCA; Klöhn et al., supra) para
cuantificar el número de unidades infecciosas de cultivo de tejido presentes.

La dilución de las proteínas RML para los alambres se representó gráficamente con respecto al número de unidades
25 infecciosas de cultivo de tejido (TC IU). Los resultados del ensayo se muestran en la figura 3. Como se puede
observar a partir de la figura 3, se consiguió una destrucción completa de contaminantes (>109 veces) después de
10 minutos a 40ºC y 50ºC (descon a 40ºC y descon a 50ºC, respectivamente).

Ejemplo de referencia 6. Optimización de concentración de dodecil-sulfato de sodio con reactivos ensayados en los
ejemplos 4 y 5

30 La finalidad de este ejemplo es repetir el experimento descrito en el ejemplo 4 con concentraciones variables de
tensioactivo (SDS) en ausencia del agente oxidante.

El protocolo básico usó homogenato de cerebro al 10% p/v en bruto. Se produjeron mezclas de reacciones
individuales que contenían 12 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v en presencia de ALCALASE®/NEUTRASE®
y concentraciones variables (0, 0,5, 1,0, 1,5 y 2,0% p/v) de SDS en un volumen total de 20 μl. Las partes alícuotas
35 se sometieron a un análisis de transferencia Western en su conjunto. Por tanto, se analizaron equivalentes de 12 μl
de homogenato de cerebro al 10% p/v para cada valor del tiempo.

Las reacciones se llevaron a cabo en presencia de 3,16 mg/ml de ALCALASE® y 12,63 mg/ml de NEUTRASE®. La
mezcla de reacción se incubó a 50ºC durante 10 minutos. Se visualizó PrPSc residual mediante detección de
transferencia Western usando ICSM35 biotinilado como el anticuerpo primario. Se usó el protocolo de alta
40 sensibilidad para la detección por transferencia Western de PrP con un límite de detección conocido de 10 nl de un
homogenato de cerebro al 10% p/v. La destrucción completa PrP según se puso de manifiesto por una falta total de
inmunorreactividad es equivalente a al menos una reducción de >1.200 veces de la infecciosidad, que se muestra en
la figura 4. Como se muestra en la figura 4, en ausencia de PERASAFE® Sterilant, ningún estado proporcionó la
destrucción completa. Como tal, una concentración de SDS de 1% p/v parece ser óptima.

45 Ejemplo comparativo A. Optimización de concentración de ALCALASE® en ausencia de PERASAFE® Sterilant

Un protocolo básico usó homogenato de cerebro al 10% p/v en bruto. Cada mezcla de reacción se preparó para
proporcionar un volumen total de 20 μl que contenía 17 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v. Las mezclas de
reacción contenían SDS al 1% p/v, 5 mg/ml de NEUTRASE® y una gama concentraciones de ALCALASE® desde
1,5 mg/ml hasta 250 μg/ml. Las mezclas de reacción se incubaron a 50ºC durante 10 minutos. Se usó un protocolo
50 de sensibilidad elevada para la detección por transferencia Western de PrP, con un límite de detección conocido de
10 nl de un homogenato de cerebro al 10% p/v. Por tanto, la destrucción completa de PrP se puso de manifiesto por
una falta total de inmunorreactividad que es equivalente a al menos una reducción de 1.700 veces de la
infecciosidad.

El PrPSc residual se visualizó mediante detección por transferencia Western usando ICSM35 biotinilado como el
55 anticuerpo primario, que se muestra en la figura 5. Las columnas se identifican como M para la columna de
marcador, C para el testigo y 1,5, 1,25, 1,0, 0,75, 0,50, 0,25 y 0, basadas en las concentraciones de ALCALASE®

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usadas, concentraciones en mg/ml. Como se muestra en la figura 5, en ausencia de un agente oxidante (es decir
PERASAFE® Sterilant), los reactivos ensayados mostraron una baja eficacia a 50ºC durante más de 10 minutos.

Ejemplo comparativo B. Optimización de concentración de NEUTRASE® en ausencia de PERASAFE® Sterilant

Un protocolo básico usó homogenato de cerebro al 10% p/v en bruto. Cada mezcla de reacción se preparó para
5 proporcionar un volumen total de 20 μl que contenía 17 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v. Las mezclas de
reacción contenían SDS al 1% p/v, 1,5 mg/ml de ALCALASE® y una gama concentraciones de NEUTRASE® de 1,5
mg/ml a 250 μg/ml. Las mezclas de reacción se incubaron a 50ºC durante 10 minutos. Se usó un protocolo de
sensibilidad elevada para la detección por transferencia Western de PrP, con un límite de detección conocido de 10
nl de un homogenato de cerebro al 10% p/v. Por tanto, la destrucción completa de PrP se puso de manifiesto por
10 una falta total de inmunorreactividad que es equivalente a al menos una reducción de 1.700 veces de la
infecciosidad.

El PrPSc residual se visualizó mediante detección por transferencia Western usando ICSM35 biotinilado como el
anticuerpo primario, que se muestra en la figura 6. Las columnas se identifican como M para la columna de
marcador, C para el testigo y 1,5, 1,25, 1,0, 0,75, 0,50, 0,25 y 0, basadas en las concentraciones de NEUTRASE®
15 usadas, concentraciones en mg/ml. Como se muestra en la figura 6, en ausencia de agente oxidante (por ejemplo,
PERASAFE® Sterilant), los reactivos ensayados mostraron una baja eficacia a 50ºC durante 10 minutos.

Ejemplo de referencia 7. Optimización de concentraciones de NEUTRASE®/ALCALASE® en presencia de

PERASAFE® Sterilant

La finalidad de este experimento fue mostrar que la velocidad de inclusión de enzima se podría reducir
20 sustancialmente cuando se usa en combinación PERASAFE® Sterilant.

Un protocolo básico usó homogenato de cerebro al 10% p/v en bruto. Cada mezcla de reacción se preparó para
proporcionar un volumen total de 100 μl que contenía 60 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v. Las mezclas de
reacción que contenían PERASAFE® Sterilant 1X, SDS al 1% p/v, y una gama de concentraciones de ALCALASE®
y NEUTRASE® (medidas mediante velocidades relativas de dilución; diluciones de 2X, 4X, 8X, 16X, 32X y 64X). Las
25 mezclas de reacción se incubaron a 50ºC durante 10 minutos y se analizaron 40 μl de cada mezcla de reacción. Se
usó un protocolo de sensibilidad elevada para la detección por transferencia Western de PrP, con un límite de
detección conocido de 10 nl de un homogenato de cerebro al 10% p/v. Por tanto, la destrucción completa de PrP se
puso de manifiesto por una falta total de inmunorreactividad que es equivalente a al menos una reducción de 1.200
veces de la infecciosidad.

30 Se visualizó PrPSc residual mediante detección por transferencia Western usando ICSM35 biotinilado como el
anticuerpo primario, que se muestra en la figura 7. Las columnas se identifican como M para la columna de
marcador, C para el testigo y 64, 32, 16, 8, 4, 2 y 0, basados en los factores de dilución de las concentraciones de
proteasas usadas. Como se muestra en la figura 7, La destrucción más elevada se produjo en la columna marcada
como 2. Esto es una dilución de dos veces de las concentraciones estándar de ALCALASE®/NEUTRASE® (es decir
35 1,58 mg/ml de ALCALASE® y 6,32 mg/ml de NEUTRASE®). Como consecuencia se puede conseguir niveles
elevados de destrucción a concentraciones de enzimas 8 veces inferiores a las previamente ensayadas en ensayos
de cultivos celulares. El nivel de destrucción es de al menos 1.000 veces. La descontaminación eficaz a 50ºC
durante 10 minutos en presencia de PERASAFE® Sterilant con SDS al 1% p/v y concentraciones de enzimas de 400
μg/ml y 1,6 mg/ml de ALCALASE® y NEUTRASE®, respectivamente.

40 Ejemplo de referencia 8. Optimización adicional de concentraciones ALCALASE®/NEUTRASE® en presencia de

PERASAFE® Sterilant

Un protocolo básico usó homogenato de cerebro al 10% p/v en bruto. Se preparó cada mezcla de reacción para
proporcionar un volumen total de 100 μl que contenía 60 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v. Las mezclas de
reacción que contenían PERASAFE® Sterilant 1X, SDS al 1% p/v, y una gama de concentraciones de ALCALASE®
45 y NEUTRASE® a diluciones variadas (4 [790 μg/ml de ALCALASE® + 3,16 mg/ml de NEUTRASE®], 6,7 [474 μg/ml
de ALCALASE® + 1,89 mg/ml de NEUTRASE®], 8,3 [379 μg/ml de ALCALASE® + 1,52 mg/ml de NEUTRASE®], 10
[316 μg/ml de ALCALASE® + 1,26 mg/ml de NEUTRASE®], y 12,5 [253 μg/ml de ALCALASE® + 1,01 mg/ml de
NEUTRASE®]). Las mezclas de reacción se incubaron a 50ºC durante 10 minutos y se analizaron 40 μl de cada
reacción. Se usó un protocolo de sensibilidad elevada para la detección mediante transferencia Western de PrP, con
50 un límite de detección conocido de 10 nl de un homogenato de cerebro al 10% p/v. Por tanto, la destrucción
completa de PrP se puso de manifiesto mediante una falta total de inmunorreactividad que es equivalente a una
reducción de al menos 1.200 veces de la infecciosidad.

Se visualizó PrPSc residual mediante detección por transferencia Western usando ICSM35 biotinilado como el
anticuerpo primario, que se muestra en la figura 8. Las columnas se identifican mediante M para la columna de
55 marcador, C para el testigo y 4, 6,7, 8,3, 10 y 12,5, basados en los factores de dilución de las concentraciones de
proteasas usadas. Como se muestra en la figura 8, se pueden conseguir niveles elevados de destrucción a
concentraciones de ALCALSE® y NEUTRASE® 10 veces menores que las previamente ensayadas en cultivos
celulares.

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Ejemplo comparativo C. Ensayo de componentes individuales que comprenden PERASAFE® Sterilant con SDS y
enzimas

Un protocolo básico usó homogenato de cerebro al 10% p/v en bruto. Cada mezcla de reacción se preparó para
proporcionar un volumen total de 20 μl que contenía 16 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v. Las mezclas de
5 reacción contenían SDS al 1% p/v, 750 g/ml de ALCALASE®, 3 mg/ml de NEUTRASE® más diversos componentes
de PERASAFE® Sterilant.

Columna Componente
(a) Estabilizadores/Inhibidores de la corrosión (191 μg/ml)
(b) Tensioactivo (165 μg/ml)
(c) Ácido orgánico (3,36 mg/ml)
(d) Activador (4,44 mg/ml)
(e) Agente oxidante (8,03 mg/ml)
(f) Agua (testigo)

Las reacciones se incubaron a 50ºC durante 10 minutos y se analizaron 40 μl de cada reacción. Se usó un protocolo
de sensibilidad elevada para la detección mediante transferencia Western de PrP, con un límite de detección
conocido de 10 nl de un homogenato de cerebro al 10% p/v. Por tanto, la destrucción completa de PrP se puso de
10 manifiesto mediante una falta total de inmunorreactividad, que es equivalente al menos a una reducción de 1.600
veces de la infecciosidad.

Se visualizó PrP80 residual mediante detección por transferencia Western usando ICSM35 biotinilado como el
anticuerpo primario, como se muestra en la figura 9. Las columnas se identifican como M para la columna de
marcador, C para el testigo y a-f, basándose en el componente anteriormente identificado. La figura 9 muestra que
15 ningún componente único produjo niveles de destrucción comparables a los observados con PERASAFE® Sterilant
activo (e). Parece que la eficacia es un resultado de la actividad oxidativa producida por ácido peracético a partir de
TAED/perborato de sodio. Sin embargo, cuando se combina con proteasas en las composiciones de esta invención,
se consigue una destrucción de priones significativamente mejorada.

Ejemplo de referencia 9. Repetición de la optimización de concentraciones de ALCALASE®/NEUTRASE® en

20 presencia de PERASAFE® Sterilant

Se repitió el experimento descrito en el ejemplo 8 para confirmar que una reducción de 10 veces los niveles de
enzima en la formulación era eficaz cuando las enzimas se combinan con agente oxidante.

Un protocolo básico uso homogenato de cerebro al 10% p/v. Cada mezcla de reacción se preparó para proporcionar
un volumen total de 100 μl que contenía 60 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v. Las mezclas de reacción
25 contenían PERASAFE® Sterilant 1X, SDS al 1% p/v y una gama de concentraciones de ALCALASE® y
NEUTRASE® (4 [790 μg/ml de ALCALASE® + 3,16 mg/ml de NEUTRASE®], 6,7 [474 μg/ml de ALCALASE® + 1,89
mg/ml de NEUTRASE®], 8,3 [379 μg/ml de ALCALASE® + 1,52 mg/ml de NEUTRASE®], 10 [316 μg/ml de
ALCALASE® + 1,26 mg/ml de NEUTRASE®], y 12,5 [253 μg/ml de ALCALASE® + 1,01 mg/ml de NEUTRASE®]).
Las mezclas de reacción se incubaron a 50ºC durante 10 minutos y se analizaron 40 μl de cada reacción. Se usó un
30 protocolo de sensibilidad elevada para la detección mediante transferencia Western de PrP con un límite de
detección conocido de 10 nl de un homogenato de cerebro al 10% p/v. Por tanto, la destrucción completa de PrP se
puso de manifiesto mediante una falta total de inmunorreactividad, que es equivalente al menos a una reducción de
1.200 de la infecciosidad.

Se visualizó PrPSc residual mediante detección por transferencia Western usando ICSM35 biotinilado como el
35 anticuerpo primario, como se muestra en la figura 10. Las columnas se identifican como M para la columna de
marcador, C para el testigo y 4, 6,7, 8,3, 10 y 12,5, basados en los factores de dilución de las concentraciones de
proteasas usadas. La figura 10 muestra que se pueden conseguir niveles elevados de destrucción a
concentraciones de ALCALSE® y NEUTRASE® al menos 10 veces inferiores a las previamente ensayadas en
cultivos celulares. La figura 10 confirma los descubrimientos previos en el ejemplo 8.

40 Ejemplo 10. Ensayo adicional de componentes individuales que comprenden PERASAFE® Sterilant con SDS y
enzimas + combinaciones activas redox

Un protocolo básico usó homogenato de cerebro al 10% p/v en bruto. Cada mezcla de reacción se preparó para
proporcionar un volumen total de 20 μl que contenía 13 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v. Las mezclas de
reacción contenían SDS al 1% p/v, 300 μg/ml de ALCALASE®, 1,2 mg/ml de NEUTRASE® más varios componentes
45 de concentraciones de PERASAFE® Sterilant.

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Columna Componente
(a) PERASAFE® Sterilant (16,2 g/l) (1X)
(b) PERASAFE® Sterilant (8,1 g/l) (0,5X)
(c) PERASAFE® Sterilant (3,24 g/l) (0,2X)
(d) Estabilizadores/Inhibidores de la corrosión (191 mg/ml)
(e) Perborato de sodio + activador (8,03 mg/ml)

Las reacciones se incubaron a 50ºC durante 10 minutos y se analizaron 40 μl de cada reacción. Se usó un protocolo
de sensibilidad elevada para la detección mediante transferencia Western de PrP, con un límite de detección
conocido de 10 nl de un homogenato de cerebro al 10% p/v. Por tanto, la destrucción completa de PrP se puso de
manifiesto mediante una falta total de inmunorreactividad, que es equivalente a al menos una reducción de 1.300
5 veces de la infecciosidad.
Sc
Se visualizó PrP residual mediante detección por transferencia Western usando ICSM35 biotinilado como el
anticuerpo primario, como se muestra en la figura 11. Las columnas se identifican como M para la columna de
marcador, C para el testigo y a-e, basadas en el componente anteriormente identificado. La figura 11 muestra
niveles elevados de destrucción que se confirmaron con PERASAFE® Sterilant 1X en presencia de SDS al 1% p/v,
10 300 μg/ml de ALCALASE® y 1,2 mg/ml de NEUTRASE®. Parece que una velocidad de inclusión reducida de
PERASAFE® Sterilant 0,5X puede proporcionar niveles suficientes de descontaminación.

Ejemplo 11. Comparación de la eficacia de descontaminación mediante PERASAFE® Sterilant 1X basado en la

composición de descontaminación a 40ºC y 50ºC

La finalidad del siguiente experimento fue comparar la eficacia de descontaminación mediante la composición de
15 descontaminación (PERASAFE® Sterilant 1X + SDS al 1% p/v + 300 μg/ml de ALCALASE® + 1,2 mg/ml de
NEUTRASE®) a 40ºC y 50ºC.

Un protocolo básico usó homogenato de cerebro de vCJD al 10% p/v. Se usó una mezcla de reacción que contenía
60 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v en un volumen total de 100 μl para cada temperatura. Las mezclas de
reacción contenían una formulación equivalente de la mezcla de descontaminación [PERASAFE® Sterilant 1X y
20 SDS al 1% p/v + 300 μg/ml de ALCALASE® + 1,2 mg/ml de NEUTRASE®]. Se retiraron partes alícuotas de 20 μl
para diversos valores del tiempo, se inactivaron añadiendo tampón de carga 2x de SDS y congelando en nitrógeno
líquido. Todas las mezclas de reacción se descongelaron y se llevaron a ebullición antes de ser sometidas a
detección mediante transferencia Western para PrPSc residual usando ICSM35 biotinilado como el anticuerpo
primario.

25 Se tomaron muestras de las mezclas de reacción (40ºC frente a 50ºC) para los tiempos de 0, 2, 5, 10 y 20 minutos y
los resultados se muestran en la figura 12, con los tiempos de muestras en las marcas de las columnas. C es para el
testigo. Los niveles de inmunorreactividad en la figura 12 fueron cuantificados mediante densitometría y se
representaron gráficamente en función del tiempo en la figura 13. Las curvas cinéticas que describen la pérdida de
PrP, % de inmunorreactividad restante, con respecto al tiempo en minutos se ajustaron a funciones de caída
30 exponencial doble y los resultados superpuestos como líneas para todos los datos en la figura 13. Se observó una
ligera reducción en la velocidad de destrucción a 40ºC respecto a 50ºC. Sin embargo, se consiguieron niveles muy
elevados de destrucción después de un tiempo de incubación de 10 minutos a ambas temperaturas.

Ejemplo 12. Comparación de agentes oxidantes con PERASAFE® Sterilant como aditivos para la composición para
descontaminar entidades infectadas

35 La finalidad de los siguientes ejemplos fue comparar agentes oxidantes químicos para ser usados en la composición
de descontaminación que comprende SDS (1% p/v) y dos proteasas de degradación de priones (300 μg/ml de
ALCALASE® y 1,2 mg/ml de NEUTRASE®). Los agentes oxidantes incluían NaDCC (dicloroisocianurato de sodio),
PROXITANE® (un desinfectante basado en ácido peracético disponible en la empresa Solvay Chemicals, Bruselas,
Bélgica), desinfectante VIRKON® S (un desinfectante que comprende peroximonosulfato de potasio y NaCl,
40 dodecilbenceno-sulfonato de sodio y ácido sulfúrico), solución de hipoclorito (es decir, blanqueador) y PERASAFE®
Sterilant.

Un protocolo básico usó homogenato de cerebro de vCJD al 10% p/v. Cada mezcla de reacción se preparó usando
60 μl de homogenato de cerebro al 10% p/v en un volumen total de 100 μl. Se usaron concentraciones constantes
de SDS y enzimas [SDS al 1% p/v y 300 μg/ml de ALCALASE® + 1,2 mg/ml de NEUTRASE®]. En todas las mezclas
45 de reacción y todas las mezclas de reacción se incubaron durante 10 minutos a 50ºC.

La reacción A contenía 16,2 mg/ml de PERASAFE® Sterilant estándar.

La reacción B contenía 13,0 mg/ml de PERASAFE® Sterilant estándar.

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La reacción C contenía 13,0 mg/ml de PERASAFE® Sterilant.

La reacción H contenía una dilución 1:70 de solución de hipoclorito (es decir, blanqueador), (pH 8,0).

La reacción N contenía 3,34 mg/ml de NaDCC.

La reacción P contenía 30 mg/ml de PROXITANE® (pH 6,5).

5 La reacción V contenía 20 mg/ml de VIRKON® S (pH 6,0).

Se retiraron partes alícuotas de 20 μl después de una incubación de 10 minutos y se inactivaron añadiendo tampón
de carga 2x SDS y congelando en nitrógeno líquido. Todas las mezclas de reacción se descongelaron y se llevaron
Sc
a ebullición antes de ser sometidas a detección mediante transferencia Western para PrP residual usando ICSM35
biotinilado como el anticuerpo primario. Los resultados se muestran en la figura 14. Las columnas en el gel
10 corresponden a las reacciones anteriormente citadas.

Como se muestra en la figura 14, otros agentes oxidantes son eficaces cuando se usan como el agente oxidante en
una composición de descontaminación que comprende tensioactivo y las dos proteasas de degradación de priones
diferentes. Los niveles de inmunorreactividad en la figura 14 se cuantificaron mediante densitometría y se
expresaron como un porcentaje del valor de la concentración, % de inmunorreactividad, en la figura 15.

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REIVINDICACIONES

1. Un método secuencial para la descontaminación o desinfección de priones, que comprende:

(a) poner en contacto en primer lugar una entidad contaminada con priones que va a ser descontaminada con al
menos un tensioactivo, y seguidamente

5 (b) poner en contacto la entidad con un agente oxidante, en que dicho agente oxidante comprende una fuente de
peroxígeno y un activador, y seguidamente

(c) poner en contacto la entidad con al menos una proteasa.

2. El método de la reivindicación 1, en que el agente oxidante comprende:

(a) perborato o percarbonato; y

10 (b) tetraacetil-etilenodiamina (TAED) o N-acetil-caprolactama.

3. El método según la reivindicación 1 o 2, en que la al menos una proteasa comprende Neutrasa aislada a partir de
Bacillus amyloliquefaciens o Alcalasa aislada a partir de Bacillus licheniformis.

4. El método según la reivindicación 1 o 2, en que el al menos un tensioactivo es dodecil-sulfato de sodio.

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