SEMINARIO Nº5:

Tinciones empleadas en Microbiología

Cátedra de Microbiología y Parasitología.
Docente Responsable: Prof. Cs. Biol. German Gonzalo Casasola.
INSTITUTO SUPERIOR EN FORMACIÓN, CAPACITACIÓN Y SUPERACIÓN PROFESIONAL
“LIC. MYRIAM BEATRIZ GLOSS”
1º Año de Enfermeria Profesional
Año 2024
 1

Objetivo general
Que los alumnos observen y reconozcan las diferentes técnicas de coloración que se
emplean en microbiología para la observación morfológica y caracterización de
microorganismos de interés sanitario.

Especificaciones del tema

INTRODUCCIÓN: preparación de muestras para microscopía óptica

Como casi todos los microorganismos son casi incoloros cuando se los observa a
través de un microscopio óptico estándar, por ejemplo el índice de refracción de las
bacterias es similar al medio que las rodea y por tanto son difíciles de ver al
microscopio, por este motivo es preciso prepararlos para la observación y una de las
maneras de hacerlo consiste en someterlos a tinciones (coloración).
En este seminario se describen las principales técnicas de tinción diferenciales.
El término tinción significa simplemente colorear los microorganismos con un
colorante que destaque ciertas estructuras, tamaño y morfología.
COLORANTES
Son sustancias que contienen grupos cromóforos (grupos con dobles enlaces
conjugados que dan al colorante su color) y pueden unirse a las células mediante
interacciones iónicas (cargas eléctricas).

Pueden dividirse en dos clases generales:

➔ Colorantes básicos: tienen grupos cargados positivamente (+) y se unen a

moléculas cargadas negativamente, como ácidos nucleicos, muchas proteínas y la
superficie de células procariotas. Algunos son: azul de metileno, fucsina básica,
cristal violeta, safranina y verde de malaquita.

➔ Colorantes ácidos: poseen grupos cargados negativamente (-) (grupos carboxilos

e hidroxilos fenólicos), uniéndose a estructuras de las células cargadas
positivamente. Ejemplos: eosina, rosa de bengala, fucsina ácida y nigrosina o
tinta china. Estos últimos no son atraídos por la mayor parte de los tipos de
bacterias porque la superficie bacteriana con carga negativa repele los iones
negativos del colorante, de modo que este tiñe el fondo en lugar de la estructura
bacteriana.
 2

TIPOS DE TINCIONES

Las tinciones pueden ser:

a) Tinciones simples: son aquéllas que utilizan un solo colorante. Muestran la forma, el
tamaño y el ordenamiento de las bacterias. El azul de metileno, el cristal violeta y la
fucsina son buenos colorantes simples que actúan sobre las células bacterianas
rápidamente.

b) Tinción indirecta: Aquí el microorganismo se tiñe por la ayuda de un mordiente, el

cual se define como una sustancia que forma un compuesto insoluble con el colorante y
determina su fijación a las estructuras celulares. Como ejemplo el Lugol (Iodo)
c) Tinción vital: es la que permite reconocer las células vivas.
d) Tinción positiva: tiñe el microorganismo y no el medio que lo rodea.
e) Tinción negativa: el microorganismo permanece sin teñir y resulta sobre un fondo
coloreado. Por ejemplo, la nigrosina o tinta china para observar cápsulas.
 3

f) Tinciones diferenciales: Son aquéllas que utilizan dos o más reactivos. Un colorante
primario y uno secundario o de contraste. Con ellas se pueden observar diferencias entre
células o estructuras especiales. Las más importantes son:

➔ Tinción de Gram.
➔ Tinción de microorganismos ácido-alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen).

➔ Tinción de Endosporas o Tinción de Schaeffer-Fulton para endosporas .

PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS PARA LA TINCIÓN

Antes de teñir los microorganismos se los debe fijar (adherir) al portaobjetos. El proceso
de fijación produce la muerte simultánea de los microorganismos y su adherencia al
portaobjetos. También preserva diversas partes de los microorganismos en su estado
natural. Cuando se debe fijar una muestra se extiende una película delgada del material
que contiene los microorganismos sobre la superficie del portaobjetos. Esta película,
denominada extendido, se deja secar al aire. A continuación en la mayor parte de los
procedimientos de tinción el portaobjetos se fija pasándolo varias veces a través de la
llama de un mechero Bunsen con el lado del extendido hacia arriba o cubriéndolo con
alcohol metílico durante 1 minuto. Se aplica el colorante, se lo lava con agua y se lo seca
con papel absorbente. Si no se realiza la fijación el colorante podría arrastrar los
microorganismos del portaobjetos. Una vez efectuado el procedimiento descrito los
microorganismos están listos para la observación microscópica.
 4

TINCIÓN DE GRAM
La tinción de Gram fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en
1884 y es uno de los procedimientos de tinción más útiles porque permiten clasificar las
bacterias en dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativas de acuerdo a las
diferencias de la pared celular según retengan o no el colorante primario (el cristal violeta).

PARED CELULAR

Las membranas citoplasmáticas de la mayoría de los procariotas están rodeadas de unas

rígidas capas de Peptidoglucano o Mureína que proporciona rigidez frente a la lisis
osmótica y también determina la forma de cada célula bacteriana. La mayoría de los
procariotas no pueden sobrevivir en la naturaleza sin pared celular.

PARED CELULAR GRAM POSITIVA

Las bacterias gram positivas presentan una pared gruesa que consta de varias capas de
peptidoglucano (90%) que se sintetiza en forma de cables entrecruzados que le otorga
rigidez y resistencia. Tienen moléculas ácidas, llamadas ácidos teicoicos, embebidas en la
pared celular, son en parte responsables de la carga eléctrica total negativa de la
superficie celular. Los ácidos teicoicos también unen Ca2+ y Mg2+ para transportarlos al
interior de la célula.

PARED CELULAR GRAM NEGATIVA

Las paredes celulares gram negativas son más complejas (tanto desde el punto de vista
estructural como químico) que las de las células grampositivas. Inmediatamente por fuera
de la membrana citoplásmica se encuentra una delgada capa de peptidoglucano que
representa tan sólo entre un 5% y un 10%. No contiene ácidos teicoicos ni lipoteicoicos. En
la parte externa de la capa de peptidoglucano se halla la membrana externa, la cual es
exclusiva de las bacterias gramnegativas que ofrece protección frente a condiciones
 5

ambientales adversas (p. ej., el sistema digestivo del organismo hospedador, un factor
importante en los microorganismos de Enterobacteriaceae).

La zona externa está formada fundamentalmente por lipopolisacárido (LPS) también

conocido como endotoxina y constituye un potente estimulador de las respuestas
inmunitarias. Los LPS se desprenden de la bacteria hacia el medio de cultivo y el
hospedador. Los LPS activan los linfocitos B e inducen la liberación de interleucina 1,
interleucina 6, factor de necrosis tumoral y otros factores por parte de los macrófagos, las
células dendríticas y otras células. Los LPS ocasionan fiebre y pueden provocar shock
séptico.

PROCEDIMIENTO DE LA TINCIÓN DE GRAM

➔ 1. Un extendido fijado con calor se cubre con un colorante violeta básico, por lo
general violeta de genciana o cristal violeta. Como el colorante violeta imparte su
color a todas las células, se lo denomina colorante primario.
➔ 2. Después de un breve lapso, se escurre el colorante violeta con agua destilada, se
lava el extendido y se lo cubre con Lugol (yodo) que actúa como mordiente.
Cuando se lava el yodo, tanto las bacterias gram ­positivas como las gram negativas
aparecen de color violeta oscuro o púrpura.
➔ 3. A continuación se lava el portaobjetos con alcohol o con una solución de
alcohol-acetona. Esta solución es un agente decolorante que elimina el color
violeta de las células de algunas especies pero no de otras. Se elimina el alcohol con
 6

agua y se tiñe el portaobjetos con safranina, un colorante básico que actúa como
colorante de contraste o secundario.
➔ 4. Luego se vuelve a lavar el extendido, se lo seca con papel absorbente y se lo
examina con el microscopio óptico. Las células que retienen el colorante primario se
tiñen de violeta (ya que poseen una pared gruesa) y se denominan gram
positivas. Mientras las que tienen una delgada pared y no retienen el colorante
primario, se tiñen de rosado o rojizo luego de aplicar el colorante de contraste o
secundario son las gram negativas.

TINCIÓN DE SCHAEFFER-FULTON PARA ENDOSPORAS (o verde de malaquita)

Algunas especies de Bacteria producen estructuras llamadas endosporas (Figura 2.42)
durante un proceso denominado esporulación. Las endosporas (el prefijo endo significa
«interior») son células muy diferenciadas extremadamente resistentes al calor, a las
sustancias químicas agresivas y a la radiación. Son estructuras de supervivencia y
permiten al organismo soportar condiciones de crecimiento desfavorables, entre otras
temperaturas extremas, la sequedad o la carencia de nutrientes. Así, las endosporas
pueden considerarse la etapa durmiente o latente del ciclo vital de una bacteria: célula
vegetativa → endospora → célula vegetativa. Además, son dispersadas con facilidad por el
viento, por el agua o en el intestino de los animales. Las bacterias que forman endosporas
se encuentran habitualmente en el suelo, y las mejor estudiadas son las especies del
género Bacillus y Clostridium.
La endospora es una estructura deshidratada formada por múltiples capas que protege a
la bacteria y le permite vivir en un «estado de latencia». La endospora contiene una copia
completa del cromosoma bacteriano, las concentraciones mínimas imprescindibles de sus
 7

ribosomas y proteínas esenciales y una elevada concentración de calcio unido a ácido

dipicolínico.
 8

Procedimiento de Tinción con Verde de Malaquita

➔ A un extendido previamente fijado intensamente con calor (se lo pasa 20 veces por
la llama) se aplica el colorante primario verde de malaquita y se lo calienta hasta
la emisión de vapores durante alrededor de 5 minutos. El calor ayuda a que el
colorante atraviese la pared de la endospora.
➔ Luego se lava el preparado con agua destilada durante cerca de 30 segundos para
eliminar el verde de malaquita de todas las partes de las células salvo las
endosporas.
➔ A continuación se aplica sobre el extendido safranina, un colorante de contraste,
se lava con agua y se seca con papel de filtro.
➔ Se observa al microscopio óptico con el objetivo de inmersión en aceite (100x). Las
células distintas de las endosporas o que no contienen endosporas se tiñen
debilmente de color rosado o rojizo, mientras que las endosporas se tiñen de color
verde.

A. Sumergir el frotis fijado con verde de malaquita: todas las células de color verde
B. Decolorar con agua destilada: endosporas de color verde, resto de la célula incolora.
C. Contrateñir con safranina: endosporas de color verde, resto de la célula color rojizo o rosado.
 9

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN (para microorganismos ácido-alcohol resistentes)

Las micobacterias es un grupo de bacterias que poseen una capa de peptidoglicano (con
una estructura ligeramente distinta), que está entrelazado y unido mediante un enlace
covalente a un polímero de arabinogalactano, y rodeado de una capa lipídica ceriforme
de ácido micólico (ácido graso de alto peso molecular). Estas bacterias se definen como
ácido-alcohol resistentes. Los microbiólogos utilizan esta tinción para identificar a todas
las bacterias del género Mycobacterium, que comprende dos patógenos importantes;
Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis, y Mycobacterium leprae,
el agente causal de la lepra. La capa lipídica es antifagocítica y responsable de la virulencia
de estas bacterias. Esta tinción tam bién se utiliza para identificar las cepas patógenas del
género Corynebacterium y Nocardia.

Procedimiento de la Tinción ácido-alcohol resistente:

1. En el primer paso se aplica el colorante rojo carbolfucsina a un extendido fijado
previamente y se calienta suavemente el portaobjetos durante varios minutos. (El
calentamiento aumenta la penetración y la retención del colorante.)
2. Luego se enfría el portaobjetos y se lo lava con agua destilada.
3. A continuación el extendido se trata con ácido-alcohol, un decolorante el más
común es alcohol-HCl que elimina el color rojo de las bacterias que no son
ácido-alcohol resistentes. Los microorganismos ácido-alcohol resistentes
retienen el color rojo porque la carbolfucsina es más soluble en los lípidos de la
pared celular. En las bacterias que no ácido-alcohol resistentes las paredes
carecen de componentes lipídicos y la carbolfucsina se elimina con facilidad durante
la decoloración, lo que deja a las células incoloras.
 10

4. Luego el extendido se colorea con azul de metileno, que actúa como colorante de
contraste. Las bacterias que no son ácido-alcohol resistentes aparecen azules
después de la aplicación del colorante de contraste.

BIBLIOGRAFÍA:
➔ Capítulo 2. Estructura y funciones de las células microbianas (pág 43-48). Brock:
Biología de los microorganismos. 14ºEd. Madrid, España: Ed. Pearson Educación.

➔ Capítulo 3. Observación de los microorganismos a través del microscopio (pág

68-72). Tortora: Introducción a la Microbiología. 9º Ed. Buenos Aires, Argentina: Ed.
Médica Panamericana.
ACTIVIDADES

1. ¿Qué colorantes aplicaría en una tinción simple?

a. Cristal Violeta
b. Fucsina
c. Azul de Metileno
d. Solo uno de los anteriores
e. Todos los anteriores
 11

2. Para la fijación de los microorganismos y adherirlos al portaobjeto se emplea:

a. Calor
b. Agua destilada
c. Alcohol 70%
d. Alcohol metílico
e. Ninguna de las anteriores
3. Cuando resulta un fondo coloreado y el microorganismo permanece sin teñir se
trata de una:
a. Tinción Diferencial
b. Tinción Negativa
c. Tinción Positiva
d. Tinción simple
e. solo c es correcta
f. solo b y d son correctas
4. La células bacterianas poseen su superficie cargada negativamente (-), se
podrán teñir con:
a. colorante ácido con carga (+)
b. colorante básico con carga (-)
c. colorante ácido con carga (-)
d. colorante básico con carga (+)
5. ¿Cuáles de los siguientes colorantes son básicos?
a. Violeta de genciana
b. Rosa de bengala
c. Verde de malaquita
d. Tinta china
e. Safranina
6. En el procedimiento de la tinción de Gram se emplea como mordiente:
a. Solución de agua destilada
b. Solución de alcohol-cetona
c. Solución de Iodo o lugol
d. Ninguna es correcta
7. En el procedimiento de la tinción de endosporas se emplea como decolorante:
a. agua destilada
b. calor
c. alcohol etílico
 12

8. La pared celular de las gram negativas se caracterizan por:

a. una capa gruesa de peptidoglucano, se tiñe de rosado.
b. una capa delgada de peptidoglucano, se tiñe de violeta
c. una capa delgada de mureína, se tiñe de rosado.
d. una capa gruesa de peptidoglucano, se tiñe de violeta.
9. ¿Qué factores inducen a una bacteria a formar una endospora?
a. Temperaturas extremas
b. Abundancia de nutrientes
c. Sequedad
d. Radiación
e. Químicos desinfectantes
f. Escasez de nutrientes
g. Todas son correctas
h. solo b es incorrecto
i. solo f es incorrecto
10. El principal componente químico de las endosporas es:
a. Iones de Calcio
b. Ácido micólico
c. Ácido dipicolínico
d. Peptidoglucano
11. ¿Cuál de los siguientes géneros de bacterias poseen una capa lipídica
ceriforme de ácidos micólicos que las hacen ácido-alcohol resistentes?
a. Bacillus
b. Clostridium
c. Nocardia
d. Mycobacterium
12. Utilizar las siguientes opciones para responder las preguntas 13,14 y 15
a. Verde de malaquita
b. Cristal Violeta
c. Safranina
d. Azul de Metileno
e. Carbolfucsina
 13

13. ¿Cuál de las opciones del punto 12 se emplea como colorante de contraste en la
tinción de Ziehl-Neelsen?
14. ¿Cuál de las opciones del punto 12 se emplea como colorante secundario en la
Tinción de Schaeffer-Fulton para endosporas ?
15. ¿Cuál de las opciones del punto 12 tiñen de violeta a las bacterias gram positivas?
16. Indicar Verdadero o Falso según corresponda:

a. En una tinción simple se emplean dos o más reactivos y se utiliza para visualizar la
morfología de las bacterias. V F
b. Se puede usar un mordiente para fijar mejor el colorante en la muestra. V F
c. En una tinción negativa la superficie de la célula repele a la nigrosina porque este
colorante es ácido y tiene carga negativa. V F
d. En el procedimiento de tinción de Gram se utiliza el cristal violeta como colorante de
contraste, el yodo como mordiente, el alcohol como decolorante y la safranina como
colorante secundario. V F

e. Los lipopolisacáridos de la membrana externa de las bacterias gram negativas

actúan como endotoxinas y provocan respuestas inmunitarias como la fiebre y shock
séptico. V F

f. Los ácidos teicoicos son los responsables de la carga negativa de superficie de las
bacterias gram positivas V F

17. Situación problemática I:

En la tinción de endosporas se utiliza: (1) la safranina como colorante de contraste,

(2) el agua como decolorante, (3) el verde de malaquita como colorante primario y
(4) el calor como mordiente. ¿Cuál es el orden correcto de este procedimiento?

a. 1, 2, 4, 3
b. 1, 2, 3, 4
c. 4, 2, 3, 1
d. 3, 4, 2, 1
18. Situación problemática II: En una tinción de Gram podría omitirse un paso y aun
así sería posible la diferenciación entre células grampositivas y gramnegativas. ¿Cuál
es ese paso?
a. Se omite la fijación con calor c. Se omite el mordiente
b. Se omite el colorante secundario d. Se omite el colorante primario
 14

19. Caso clínico Nº1: Suponga que usted se encuentra en el laboratorio y tiñe una
muestra obtenida de un paciente con lepra mediante la aplicación de un colorante
básico, carbolfucsina con calor, decoloración con ácido-alcohol y azul de metileno
como colorante de contraste.

19.1 En la observación microscópica las bacterias causantes de esta infección son:

a. AAR (+) se tiñen de azul

b. AAR (-) se tiñen de rojo
c. AAR (+) son incoloras
d. AAR (+) se tiñen de rojo

19. 2 ¿Cuál es el nombre científico del microorganismo causante de esta patología?

20. Ejercicio de aplicación: En el laboratorio usted cuenta con los siguientes medios de
cultivos (placas de Petri) que contiene a los siguientes géneros bacterianos:

Placa 1 Placa 2 Placa 3

 15

Si desea observar endosporas empleando la tinción de verde de malaquita ¿De cuál

medio obtendrá la muestra a teñir?

a. Placa de Petri 1
b. Placa de Petri 2
c. Placa de Petri 3

21. Suponga que tiñó Bacillus mediante la aplicación de verde de malaquita con calor y
luego utilizó un colorante de contraste como safranina.

21.1 En la observación microscópica las estructuras rojizas corresponden a:

a. Paredes celulares
b. Cápsulas
c. Endosporas
d. Citoplasma

21.2 La imagen microscópica se obtuvo

empleando un ocular de 10X y un
objetivo de inmersión en aceite. Calcule
el aumento total de la imagen que se
encuentra observando.

22. Ejercicio de aplicación: Usted se encuentra observando la siguiente muestra en el

laboratorio. ¿Qué forma presentan las bacterias? ¿Son gram positivas o gram negativas?
 16

Bacterias vistas al microscopio óptico (1000x) cortesía del profesor German Casasola

23. Caso clínico Nº2: Usted en el laboratorio se encuentra observado una muestra de
secreción purulenta teñida con Gram de un paciente masculino que presenta el meato
urinario inflamado y que siente ardor al orinar. Ubique las bacterias en esta
microfotografía óptica ¿Cuál es la enfermedad? mencione el nombre científico de la
bacteria causante de la misma. ¿Es gram positiva o gram negativa?

24. Situación problemática III: Se presenta un caso sospechoso de un paciente con fiebre
Tifoidea. Usted analiza una muestra de materia fecal y para confirmarlo emplea la tinción
de gram. ¿De qué color se teñirá el presunto patógeno y cuál es su nombre científico?
17