Mtodos y Tcnicas de Tincin

La tincin es un proceso por el cual las molculas de un colorante se absorben a una

superficie. El uso de colorantes permite cambiar el color de las clulas de los
microorganismos y poder realizar la observacin en microscopio ptico. Dado que las
bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran
suspendidas y no pueden observarse claramente sin algn tratamiento previo. De acuerdo a
la reaccin que ocurre, existen diferentes tipos de tincin:
Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfologa celular.
Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre clulas bacterianas
o entre partes de una misma clula, estas tcnicas utilizan ms de un colorante o bien ciertos
reactivos complementarios para la tincin.
Los colorantes ms usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son
catinicos y se combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente,
como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso
conocido como fijacin. Despus de esta habitualmente se realiza la tincin. La fijacin
produce generalmente encogimiento de las clulas, la tincin por el contrario, hace que las
clulas parezcan mayores de lo que son realmente.
Algunos colorantes teirn mejor solo despus de que la clula haya sido tratada con otra
sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. El mordiente se combina con un
constituyente celular y lo altera de manera que ahora s podr atacar el colorante.

Tincin de Gram
1) Las clulas son fijadas por medio del calor sobre un portaobjetos, se tien primero con una
solucin de cristal violeta y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este
punto las clulas Gram positivas y Gram negativas, estn teidas de azul/violeta.
2) El portaobjetos se cubre con una solucin de yodo-yoduro potsico. El KI hace soluble el
I2 en agua. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal
violeta. En este punto las clulas se mantienen iguales.
3) Se inicia con la decoloracin usando una solucin de Alcohol-acetona, sustancias en las que
es soluble el complejo I2-Cristal violeta. Algunos microorganismos no se decoloran. La
diferencia esencial entre los dos tipos de clulas es la resistencia que presentan ante la
decoloracin.
Despus de la decoloracin las clulas Gram positivas son azul\violeta, y las Gram negativas
son incoloras.
4) Para poner de manifiesto las clulas Gram Negativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es de color rojo, como la safranina.
Tincin cido-alcohol resistencia
1) Se coloca sobre el portaobjetos una mezcla de fucsia-fenol, en la que la fucsia hace de
colorante rosa y el fenol de mordiente. Las clulas se tien de rosa, tanto las cido-alcohol-
sensibles como las resistentes.
2) Se usa un decolorante orgnico que hace que las bacterias cido-alcohol sensibles se
decoloren mientras que las acido-alcohol resistentes permanecen rosas.
3) Se utiliza un colorante de contraste, como el azul de metileno.

Tincin de Esporas
1) Sobre el portaobjetos con la preparacin se coloca verde malaquita que tie las clulas de
verde.
2) Se lava con agua destilada con lo que las clulas quedan incoloras y las esporas verdes.
3) Se usa safranina para obtener bacterias de color rojo/rosa mientras que las endoesporas
continan verdes.
La tincin es un mtodo sencillo para incrementar el contraste entre la clula y su entorno y
por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada.
Las tcnicas de tincin con diversos colorantes facilitan la observacin al aumentar
notablemente el contraste.
En Microbiologa todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos
extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas.
La fijacin, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo
con diferentes tratamientos:
fijacin por calor o fijacin qumica. La fijacin por calor es la ms utilizada para la
observacin de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la
suspensin bacteriana extendida y seca, a travs de una llama de un mechero.
La fijacin por calor preserva la morfologa externa de los microorganismos pero no
las estructuras internas.
La fijacin qumica con agentes como etanol, formaldehido y cido actico entre
otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras celulares.
Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tincin positiva es la ms frecuente, en ella
un colorante se une aciertas estructuras microbianas.
Todos los colorantes utilizados en microbiologa tienen en comn la presencia de grupos
cromforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los responsables del color
mediante la unin a estructuras celulares por enlaces inicos, covalentes o hidrfobos, los
que establecen enlaces inicos son los ms frecuentes.
Entre los colorantes que se unen por enlaces covalentes destaca el reactivo de Schiff,
utilizado para la tincin de DNA, donde el colorante se une a la desoxi-ribosa. Por otra parte,
en la tincin negativa
se utilizan compuestos que no penetran en las clulas sino que impregnan el medio
circundante. Los microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.
OBSERVACIN IN VIVO
Mtodo de la gota pendiente.
Este procedimiento es la forma ms sencilla de observacin de organismos vivos, nos
proporciona informacin sobre la morfologa, tamao, color y movilidad de las bacterias. Sin
embargo, debido a la falta de contraste con el entorno es una prctica que se utiliza
nicamente para la observacin del movimiento.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Escherichia coli y Pseudomonas sp.en medios de cultivo lquido
(caldo triptona soja), vaso lavador, portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa de siembra,
pipeta Pasteur, aceite de inmersin.
Procedimiento
Tomar una gota de un cultivo lquido reciente (24 horas) usando unasa de siembra o una
pipeta Pasteur estril.
Colocar en el centro de un cubreobjetos y aadir cuatro pequeas gotas de aceite en los
cuatro extremos.
Colocar el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando que la gota quede situada
en el centro de la depresin.
Dar la vuelta al portaobjetos.
Colocar una gota de aceite de inmersin y observar con objetivo de inmersin (100x).
Esta tcnica permite observar el desplazamiento rpido y rectilneo o dando giros y volteretas
en aquellas bacterias que tienen flagelos (Video complementario). Las bacterias inmviles
presentan un movimiento vibratorio denominado movimiento browniano, debido al choque
de las molculas enuna solucin lquida.
Mtodo de observacin directa en contraste de fases o interferencia diferencial. En este caso
la suspensin de microorganismos se observa con un microscopio de contraste de fases o
interferencia diferencial (DIC) que permiten el aumento del contraste.
El microscopio de contraste de fases utiliza un condensador con un diafragma anular opaco
con un anillo transparente que provocan variacin de la longitud de onda dependientes de la
densidad y el ndice de refraccin de la muestra, se observan las clulas ms brillantes sobre
un fondo oscuro.
El microscopio de interferencia diferencial permite la observacin tridimensional de la
muestra por la incorporacin de prismas que generan haces de luz polarizada que se cruzan,
incrementando las diferencias entre los componentes celulares por lo que es muy til para la
observacin de esporas, inclusiones, filamentos septados o vainas entre otros.
Material necesario
Cultivos bacterianos en medio lquido, portaobjetos y cubreobjetos, pipetas Pasteur, aceite
de inmersin.
Procedimiento
Se deposita una gota de la muestras obre un cubreobjetosy se coloca encima un portaobjetos
excavado. La preparacin se observa directamente al microscopio decontraste de fases o de
DIC.Reduca (Biologa). Serie Microbiologa.3 (5): 15-38, 2010ISSN: 1989-362018.
Observacin de Zooglea ramigeray bacterias filamentosas. Microscopa de Interferencia
diferencial (100x).Observacin de Anabaenasp., cianobacteria filamentosa. Microscopa de
contraste de fases (100x).
TINCIONES
Tincin negativa
No se trata de una tincin propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con cromforos,
ni se lleva a cabo ninguna reaccin entre estructuras celulares y los colorantes. En este caso
el frotis se hace con una gota de una solucin de nigrosina o tinta china, ambos son productos
particulados, insolubles, que formarn una pelcula opaca a la luz. En este tipo de tincin se
prescinde de la fijacin por calor, se deja secar la preparacin y se observan los
microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Tincin simple
La mayora de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de
las anilinas, sales orgnicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrn.
Se denominan colorantes bsicos si el cromforo (porcin coloreada) de la molcula est
cargada positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes bsicos.
Otros colorantes de esta categora utilizados con frecuencia en bacteriologa son safranina,
fuchina bsica y verde malaquita.
Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un pH
interno prxima la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, as
los colorantes bsicos son los ms eficaces.
Colorantes cidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina cida tiene un cromforo
cargado negativamente y son utilizados para teir positivamente ciertos componentes como
las protenas.
Material necesario
Cultivos bacterianos de Staphylococcusaureus y Micrococcus luteus, frasco lavador,
cristalizador, soporte y colorantes (safranina y cristal violeta), asa de siembra, aceite de
inmersin.
Procedimiento
Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea alcuota
de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estril.
Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el
asa de siembra. Dejar secar.
Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos.
Cubrir con una pelcula de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire.
Aadir una gota de aceite de inmersin.
Observar con objetivo de inmersin (100 x).
La tincin simple nos proporciona exclusivamente informacin acerca de la forma, tamao
y tipo de agrupacin de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un mtodo
muy sencillo y rpido.

TINCIN DIFERENCIAL
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiologa; consisten en la
aplicacin de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio
que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas
clulas dentro de una poblacin. La diferenciacin puede ser provocada por un agente
qumico o fsico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes a la tincin en una
misma muestra. Las dos tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa son la tincin
de gram y la tincin de cido alcohol resistencia.
Tincin de Gram
Esta tincin diferencial fue propuesta por el medico dans Christian Gram(1884)(TORTORA
et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumona observ
que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retena el colorante
conocido como marrn Bismark(sustituido posteriormente por el cristal violeta),mientras que
el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.
Es la tincin diferencial ms utilizada de forma rutinaria y prcticamente la primera prueba
a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una
informacin esencial, adems de sobre la forma, tamao y agrupacin celular, como es el
tipo y composicin de la pared que presentan las bacterias. La tincin de Gram divide a las
bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo
gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa.
Material necesario
Cultivos de bacterias gram positivas: Bacillus cereusy. Gram negativas: Escherichia coli,
frasco lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos, asa de siembra, cristal violeta, safranina,
lugol y alcohol, aceite de inmersin.
Procedimiento
Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea alcuota de un cultivo
bacteriano con el asa de siembra estril.
Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el asa de
siembra. Dejar secar.
Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos.
Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Aadir el mordiente lugol, solucin de yodo -ioduro potsico, durante 1 minuto.
Lavar el exceso de mordiente con agua.
Lavar la preparacin con alcohol formando un ngulo con la preparacin, durante 30
segundos (el tiempo de decoloracin es clave para un resultado correcto).
Lavar inmediatamente con abundante agua.
Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.
Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire.
Aadir una gota de aceite de inmersin.
Observar con objetivo de inmersin (100 x).
La diferente estructura y organizacin de la pared celular en estos dos tipos de organismos
hace que ambos grupos respondan de manera distinta, as mientras las bacterias Gram
positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias Gram
negativas se decoloran rpidamente con la aplicacin del alcohol, admitiendo el colorante de
contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color violeta.
Se han propuesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los microorganismos
a esta tincin, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura fsica como a la
composicin de la pared celular, en bacterias Gram positivas la gruesa capa de
pptidoglucano con abundantes entrecruzamientos parece contribuir la retencin del
colorante fundamental, cristal violeta, mientras que en bacterias Gram negativas la delgada
capa de peptidoglucano junto con la abundancia de lpidos en la membrana externa de la
pared celular incrementan la porosidad y por ello, contribuyen a la prdida del colorante
fundamental despus de la decoloracin con alcohol.

Tincin de cido-alcohol resistencia

Se trata de un procedimiento de tincin diferencial, conocido como mtodo de Ziehl-Neelsen,
que tiene gran relevancia por su aplicacin clnica. Permite poder distinguir aquellos
microorganismos cuya coloracin resiste la accin de alcoholes y cidos suaves (cido-
alcohol resistentes) de otros que no resisten la decoloracin (no cido-alcohol resistentes).
Dentro de las bacterias cido alcohol resistentes encontramos dos importantes patgenos:
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la
tuberculosis y la lepra respectivamente.

Tincin Simple
 Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma
tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el
KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no
acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas (Cryptococcus),
sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece
como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede
agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.
En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tincin con tinta china.

Tincin Diferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en funcin de
los diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitucin qumica.
Los ejemplos clsicos sera la tincin de GRAM o la de Ziehl-Neelsen
En la imagen: BGN y levaduras en una tincin GRAM

Tincin GRAM: Morfologa Bacteriana

Ya hemos visto que la tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la deficinin
"taxonmica" de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que presentan
las clulas bacterianas.
En lo relativo a la coloracin, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de
microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teidos de color azul-violeta y de Gram
negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.
Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una tincin GRAM:
Cocos
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular. Diplococos, aparecen por
pares. Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos
irregulares, a veces de gran tamao

Bacilos
grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Utilizamos el trmino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de diferentes formas en

una misma especie.
Por Rangel Hugo
Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar utilizada en microscopa para mejorar el
contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que
usualmente se utilizan en biologa y medicina para resaltar estructuras en tejidos biolgicos
que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes
colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definicin y examinar grandes cortes de
tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares
(por ejemplo clasificando diferentes clulas sanguneas) o incluso para resaltar organelas
dentro de clulas individuales.
En bioqumica, esto implica agregar un colorante especfico (esto significa que se una de
manera selectiva ya sea a ADN, protenas, lpidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para
cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tincin como el
marcado fluorescente pueden servir para los mismos propsitos.
Tincin de Gram
Tambin puede utilizarse a menudo un mtodo que no tie igualmente todas las clulas, un
proceso denominado tincin diferencial.
La tincin de este tipo ms extensamente utilizada es la tincin de Gram, denominada as
por el bacterilogo dans Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su
reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y
gramnegativas. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con cierto
detalle la tincin de Gram.
Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien primero con una solucin de cristal
violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el
exceso de colorante. En este estado todas las clulas, tanto las gramnegativas como las
grampositivas, estn eidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de
yodo (I2) yoduro potsico (KI). El ingrediente activo es aqu el yodo, el yoduro potsico
simplemente hace soluble el yodo en agua.
El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De
nuevo tanto las clulas gram positivas como las gramnegativas se encuentran en la misma
situacin. Se lleva a cabo despus de la decoloracin, usando bien alcohol o bien acetona,
sustancias en las que es soluble el complejo yodo cristal violeta. Algunos organismos
(grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia
esencial entre esos dos tipos de clulas est, por lo tanto, en la resistencia a la decoloracin.
Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las
gramnegativas son incoloras.
Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus
de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas mientras que las
grampositivas permanecen azules.
Tincin negativa
Es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir pero se colorea
un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La
sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los
constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es
una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble
en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas
en microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas
alrededor de las clulas bacterianas.
Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar utilizada para mejorar el contraste en la
imagen vista al microscopio. Los colorantes son sustancias que usualmente se utilizan para
aumentar la definicin y examinar poblaciones celulares.

Tipos de tcnicas de tincin

Tinciones simples
Se usa un nico colorante, que siempre es de tipo bsico. Se utilizan solamente para
incrementar el contraste; todas las clulas absorbern el colorante y quedarn teidas del
mismo color. Se fija el espcimen, se aade el colorante y se deja el tiempo adecuado para
que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparacin ya est lista para ser
observada.
Tinciones diferenciales
Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La tcnica de tincin diferencial
consta de dos etapas: una tincin simple seguida de una tincin de contraste. En la tincin de
contraste se utiliza otro colorante que tie (y por tanto, revela) las clulas no teidas por el
primer colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiologa.
Tinciones especficas
Se utilizan para incrementar el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras
particulares, entre las que se incluyen en los flagelos y las cpsulas.

Tincin adecuada
En su forma ms simple, el verdadero proceso de tincin puede implicar la inmersin de la
muestra en la solucin colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el
exceso de colorante y la observacin. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de
un mordiente. Cuando la solucin de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la
tincin mordentada permanece.
Tincin negativa:
Un mtodo sencillo de tincin para bacterias, que adems es un claro caso de cromofobia y
que por lo tanto funciona aun cuando los mtodos de tincin positiva fallan, es la tincin
negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos
y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la
muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser
observados fcilmente por medio de microscopa en campo claro como inclusiones claras
muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea
Tincin indirecta:
Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente
habitual es el cido tnico.
Tincin directa:
Hablamos de tincin directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato,
sin otro tratamiento previo.
Tincin Gram:
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio
bacteriolgico. Su utilidad en la prctica de referencias a la morfologa celular bacteriana
(cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tincin de GRAM
1. Se tie el espcimen con el primer colorante, cristal violeta.
2. Se aade el mordiente, yodo.
3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solucin de acetona o etanol. En este
momento, las bacterias Gram negativas pierden su tincin violeta, pero las Gram positivas
retienen el colorante.
4. Como colorante de contraste se aade safranina, que tie de rosa las bacterias Gram
negativas, previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les
proporciona un color violeta ms intenso.
Una tincin cido-alcohol resistente se realiza segn los siguientes pasos:
1. Tincin primaria con fucsina bsica, que tie todas las clulas de rojo.
2. Calentamiento suave de la preparacin para facilitar la penetracin del colorante en el
interior de la clula.
3. Decoloracin con una solucin de cido clorhdrico en etanol. Este decolorante elimina
la fucsina de todas las clulas excepto de las micro bacterias, que la retienen debido a su
superficie crea.
4. Coloracin de contraste con azul de metileno. Se tien de azul todas las clulas
previamente decoloradas, lo que facilita la diferenciacin entre las clulas de
Mycobacterum, an teidas de rojo, v las clulas restantes del espcimen.
Tincin: RODAMINA-AURAMINA
Los cidos miclicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen
de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio,
empleado como contraste, evita la fluorescencia inespecfica. Todos los microorganismos
cido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parsitos, se tien con estos
colorantes.
Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden
ser reteidos con la coloracin de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tincin
con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. De esta forma, los resultados
positivos pueden ser confirmados con las coloraciones tradicionales, que adems permiten
la diferenciacin morfolgica.
Tincin: NARANJA DE ACRIDINA
El fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico ya sea en su forma nativa o
desnaturalizada. En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la
fluorescencia puede variar, dependiendo del pH y de la concentracin. El naranja de
acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde si el
microorganismo est vivo y roja si est muerto. De todos modos, como el colorante se
intercala en el cido nucleico, el germen viable se inactivar poco tiempo despus de la
tincin.
Colorantes:
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad
especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos cidos.
Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teir clulas animales, para hacer ms
visibles sus ncleos. Es tambin utilizado para teir los extendidos de sangre para ser
utilizados en citologa y como colorante vital en el recuento de reticulocitos.
Azul Nilo: Tie los ncleos de color azul. Tambin puede ser utilizado para teir clulas
vivas.
Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tie
las paredes celulares de color prpura. El cristal violeta es un componente importante en
la coloracin de Gram.
Eosina: La eosina se utiliza ms frecuentemente como contra coloracin de la
hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al
material citoplasmtico, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares. Adems
imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada tambin en
algunas variantes de la coloracin de Gram, y en muchos otros protocolos de tincin.
Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los ncleos celulares de rojo, y se
utiliza principalmente como contracoloracin. Tambin puede ser utilizada para darle una
coloracin amarilla al colgeno.
Verde de metilo; El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo
claro, para teir la cromatina de las clulas y facilitar as su visualizacin.
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio
que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes.
Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares.
Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso
llamado fijacin. Para bacterias, la fijacin por el calor es lo ms corriente, aunque tambin
puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la
fijacin, si se aade el colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el
protoplasma. La fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido fijadas sobre un
portaobjetos. Tratando despus ste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente el
proceso de tincin.
Conceptos bsicos.
Tincin primaria: es el colorante principal que se va usar para teir en un principio a las
clulas.
Mordiente: es la sustancia que sirve para fijar los colorantes en la tincin.
Agente decolorante: es como su nombre lo indica, el agente que ayuda a decolorar una parte
de las clulas que se han teido.
Tincin de contraste: es la sustancia que contra tie las clulas que han sido previamente
decoloradas y adems le da un color diferente de la primera vez que se tio.
Tinciones para microbiologa.
Tincin de Gram.
Tincin de Ziehl-Neelsen
Tincin de Schaeffer-Fulton
Tincin de Conklin
Tincin de Grocott
Tincin de Dieterle
Tincin negativa
Tincin con mucicarmina
Tincin simple.
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma
tonalidad.
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que
el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped,
pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos.
La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas
(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la
cpsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de
Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia
de leucocitos.
Tincin de Gram
Tambin puede utilizarse a menudo un mtodo que no tie igualmente todas las clulas, un
proceso denominado tincin diferencial. La tincin de este tipo ms extensamente utilizada
es la tincin de Gram, denominada as por el bacterilogo dans Hans Christian Gram, quien
la desarrollo. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse
en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.
Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales
de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con cierto detalle la tincin
de Gram. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien primero con una solucin
de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para
quitar el exceso de colorante.
En este estado todas las clulas, tanto las gramnegativas como las grampositivas, estn
teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo (I2) yoduro
potsico (KI). El ingrediente activo es aqu el yodo, el yoduro potsico simplemente hace
soluble el yodo en agua. El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua
con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se
encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus de la decoloracin, usando bien
alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo cristal violeta.
Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo
hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est, por lo tanto, en la resistencia
a la decoloracin.
Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las
gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza
una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina
o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas
mientras que las grampositivas permanecen azules.

Tincin cido alcohol resistencia

Esta tincin sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen
un alto contenido en lpidos y en cidos miclicos y que no pueden ser calificadas por la
tincin de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina fenol,
en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las clulas se tien de
rosa, tanto las cido alcohol sensibles como las resistentes. Despus se usa un decolorante
orgnico que hace que las bacterias cido alcohol sensibles se decoloren mientras que las
cido alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tincin de Gram se utiliza un colorante
de contraste que en este caso es el azul de metileno que tie las clulas cido alcohol
sensibles de color azul quedando las clulas cido alcohol resistentes de color rosa.
Tincin de esporas
Se utiliza para teir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.
Sobre el portaobjetos con la preparacin se echa verde malaquita que tie las clulas de verde.
Luego se lava con agua destilada con lo que las clulas se quedan incoloras y las endosporas
permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa
mientras que las endosporas continan con su color verde de la verde malaquita.
 Tincin negativa
Es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir pero se colorea
en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La
sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad con los
constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es
una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble
en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas
en microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas
alrededor de las clulas bacterianas.

Las tinciones se usan para tres cosas fundamentalmente:

Descripcin de microorganismos en base a su morfologa, estructura y distribucin.

Deteccin de determinados microorganismos para diagnostico clnico, por ejemplo.
Clasificacin de microorganismos segn sus caractersticas tintoriales.

Tipos de colorantes:
cidos:
En disolucin se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas
positivamente y no las clulas, que tienen carga negativa.
Sales de Na. K, Ca, in amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina cida...
Bsicos:
En disolucin se cargan positivamente unindose a estructuras con carga negativa como las
clulas.
Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o
carbol-fucsina.

Caractersticas de un cultivo para una buena tincin:

Ha de estar en fase exponencial de crecimiento y no ser viejo.
Debe haberse obtenido de un cultivo slido, para tinciones simples puede ser necesario
usar un cultivo liquido.
Preparacin de un frotis:
Suspensin de una colonia de un cultivo puro en una gota de agua
Extensin de la gota en un porta, con ayuda de otro porta, en la parte central del primero.
Secado al aire.
 Fijacin a la llama para deshidratar la muestra. Se hace pasando tres veces el porta por la
llama rpidamente.
Tipos de tinciones:
Simples: se usa un solo colorante disuelto en solucin acuosa o alcohlica, y se
suplementan con un mordiente para una mejor fijacin del colorante adems de aumentar el
grosor de algunas estructuras para su mejor visin. Sirven para ver la morfologa y las
agrupaciones que forman los microorganismos entre ellos y con otras clulas.
Diferenciales: Se usa mas de un colorante. Tie de diferente modo a las clulas de
distintas especies.
TINCIN DE GRAM
Es la ms importante en bacteriologa. Gracias a ella distinguimos dos tipos de bactrias:
Gram +. Son aquellas que se tien con cristal violeta (colorante primario)
Gram -. Son aquellas que se tien con safranina (colorante secundario)
Las gram + aparecern violetas, y las gram aparecern rosas. Las diferencias entre + y
obedecen a la estructura de su pared celular:
Las gram + tienen una pared muy gruesa que contiene muy pocos lpidos, mientras que
lasgram son muy delgadas y contienen gran cantidad de lpidos.