PRACTICA N° 4

I. OBJETIVOS

❖ Demostrar el diferente comportamiento de los ácidos fuertes y los ácidos

débiles, en lo que se refiere a su capacidad de disociación.
❖ Establecer la diferencia entre acidez real ( pH ) y acidez titulable ( normalidad
) mediante titulación, uso del papel indicador de pH y mediante el cálculo
teórico de pH.

II. MARCO TEORICO

La concentración de protones de hidrogeno [H+] es de considerable importancia para

todos los organismos vivos, y normalmente están bajo un riguroso control a fin de
asegurar la eficiencia de todos los procesos vitales. Así pequeños cambios en dicha
concentración, pueden producir marcados efectos metabólicos y fisiológicos capaces
de afectar la salud y la vida.
a) Ionización del agua
El principal determinante de la pequeña pero efectiva [H+] en los organismos vivos es
el agua. El agua se disocia en iones hidronio [H3O+] e hidroxilo [OH-]. Para
simplificar, nos referiremos al ión hidronio como ión hidrógeno [H+] y escribiremos
el equilibrio como:

La constante de equilibrio de esta disociación viene dada por:

La constante de equilibrio de la ionización reversible del agua nos permite describir
este proceso en términos cuantitativos, es decir, conocer en qué grado se encuentra
ionizada el agua a una temperatura determinada.

El valor de [H2O] en el agua pura es 55,5 M (1.000 g de agua en un litro dividido

por su masa molecular, o sea, 1.000/18=55,5). Dado que las concentraciones de
iones hidrógeno e hidroxilo en el agua pura son muy bajas, este valor es
esencialmente constante (no disminuye significativamente cuando el agua se ioniza),
por lo que podemos sustituirlo en la ecuación anterior y reordenarla como sigue:

El término Kw se conoce como producto iónico del agua, y es constante para una
temperatura dada. El valor de Keq, que se ha determinado a partir de las medidas de
conductividad eléctrica en el agua pura, es de 1,8 x 10-16 M a 25°C. Sustituyendo este
valor en la ecuación anterior tenemos:

Así, el valor del producto iónico del agua a 25ºC es 10-14. A partir de este valor se
puede calcular la concentración de iones hidrógeno e iones hidroxilo en el agua pura
a 25ºC. Puesto que por cada molécula de agua que se disocia se obtiene un ion
hidrógeno y un ion hidroxilo podemos deducir que:

En una disolución acuosa, si [H+] es igual a [OH-], tal como ocurre en el agua pura,
se dice que la disolución es neutra; si [H+] es mayor que [OH-] se dice que es ácida;
y si [H+] es menor que [OH-] se dice que es básica. En cualquier caso, el producto
de ambas concentraciones (Kw) es constante e igual a 10-14 a 25°C, de tal modo que si
una de las dos concentraciones es elevada la otra debe ser proporcionalmente
reducida para que el producto iónico del agua permanezca constante. Ejm Cuando la
concentración de [H+] es muy alta como en una solución de HCl 1 M la
concentración de iones de [OH-] debe ser muy baja como 1 x 10-14
.
 b) Definición de pH :

A partir del producto iónico del agua se introduce la escala de pH. La escala de pH
constituye una forma ágil y cómoda de expresar las concentraciones de iones
hidrógeno (y consiguientemente de iones hidroxilo) en disoluciones acuosas
diluidas. Su uso evita tener que manipular cifras engorrosas del tipo de 0,000001 M
o 10-8 M. Es válida para expresar concentraciones entre 10-14 M y 1 M de iones
hidrógeno. El pH se define como el logaritmo negativo de la concentración de
iones hidrógeno:

Por lo tanto siendo la [H+] = 1 * 10-7 para una solución neutra a 25°C su pH será igual a 7.
Ejm siendo la [H+] de un ácido 0.001, su pH será 3 y la concentración de [OH-] será 0.000
000 000 01 y su pOH
= 11.

c) Medición y cálculo de pH :

Antes de identificar los métodos y cálculos para medir el pH es necesario recordar el

concepto de ácido y base. Según Brönsted-Lowry un ácido es un dador de protones, y
una ba8se es un aceptor de protones. A cada ácido corresponde una base conjugada
de modo que, aplicando este formulismo, ácidos y bases no se tratan por separado, sino
como integrantes de pares ácido-base conjugados. Por ejm , CH3-COOH, un donador
de protones ,y el acetato CH3-COO- el correspondiente aceptor de protones , constituye
un par conjugado ácido-base, relacionado entre sí por la reacción reversible:

Cada ácido tiene una tendencia característica a ceder su protón. Los ácidos fuertes
tienen una tendencia elevada a ceder su protón, mientras que los ácidos débiles lo ceden
con más dificultad.

Los ACIDOS FUERTES (ácido nítrico, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico ) están
completamente disociados , la concentración molar de iones de [H+] será igual a la
concentración normal del ácido por lo que se aplica directamente la expresión :
Los ACIDOS DEBILES (Acido acético, acido fórmico, acido fosfórico ) son de mayor
importancia en Bioquímica por el papel que juegan en sistemas biológicos y los roles
que cumplen en el metabolismo y su regulación. La tendencia de cualquier ácido débil ,
HA , a perder su protón y formar una base conjugada A- es definida por la constante de
disociación, a menudo llamada Ka ( a por ácido ).

Así, para la reacción reversible:

la Ka es :

A mayor capacidad de disociación del ácido, mayor será su Ka y viceversa. Al igual que
el pH facilita la expresión de la [H+] , el pKa definido como el – log Ka facilita la
expresión de la Ka. A mayor capacidad de disociación de un ácido, menor será pKa y
viceversa.

Retomando la ecuación para el cálculo de Ka, al despejar podremos tener la siguientes

ecuaciones

(Considerando que la [H+] =[A-])

Conocida la concentración de [H+] el pH se calcula aplicando el -log[H+] o

alternativamente la siguiente ecuación:
Ejemplo : ¿ Cuál será el pH de una solución de ácido acético 0.2 N?

[ H*] = (1.75 x10-5x0.2 ) = 0.001871 M o pH = 4.757 –(-0.699) /2 =

2.728 pH = - log (0.001871) = 2.728
Los ácidos fuertes y débiles presentan diferente pH por lo ya expuesto es decir presentan
distinta “ acidez real”. Pero similar “acidez titulable” es decir la capacidad de
combinación con iones hidroxilo.

d) Curva de titulación de un ácido débil . la ecuación de

Henderson.Hasselbach. Acción Buffer.

De la titulación de un ácido débil se obtienen mucha más información que la sola

determinación de su concentración, si medimos cuidadosamente el pH del ácido que está
siendo titulado después de cada incremento de NaOH, hasta el punto de neutralización.
Una gráfica del pH de la solución vs la cantidad de NaOH añadido es lo que se llama
“una curva de titulación”
La forma de la curva de titulación de cualquier ácido débil es determinada por la
denominada ecuación de Henderson-Hasselbach, la cual es fundamental para
comprender la “ acción buffer” implícita en los mecanismos que mantienen el equilibrio
ácido-básico de la sangre y tejidos de los organismos.
Los Buffers o amortiguadores, son sistemas acuosos que tienden a resistir cambios de
pH cuando pequeñas cantidades de ácido [H+] o base [OH-] son añadidos. Un sistema
buffer consiste en un ácido débil ( el donador de protones ) y su base conjugada ( el
aceptor de protones)

La ecuación de Henderson – Hasselbach, es simplemente otra forma de expresar la Ka

de un ácido débil

Despejando tenemos que :

Y aplicando el – log sería :

 Sustituyendo -log [H+] por pH y -log K por pK tenemos:

En la última ecuación podemos observar que [A-] es el aceptor de protones , es la base

conjugada y la sal, mientras que [HA] es la donador de protones por lo tanto el ácido.

Así la ecuación de Henderson- Hasselbach establece las relaciones cuantitativas entre el

pH, la acción buffer de una mezcla de ácido débil con su base conjugada, y el pKa de
ácido débil.

III. PARTE EXPERIMENTAL

A) Acidez Real y Acidez titulable.

Procedimiento :

1. Uds. Dispondrán de una solución HCl 0.01 N y otra de ácido acético 0.01 N
2. Medir en un erlenmeyer 5 ml de la solución de HCl 0.01 N, añadir 2 gotas del indicador
fenoltaleína al 1 % y titular con NaOH 0.01 N en la forma indicada en la práctica
anterior.
3. Lea en la bureta el volumen gastado de NaOH 0.01 N
4. Utilizando papel indicador, mida el pH de la solución de HCl 0.01 N y el de la solución
de ácido acético 0.01 N
5. Mediante las expresiones que estime convenientes, calcule el pH teórico de ambas
soluciones de ácido.

Cálculos
 Resultados:

Anote los resultados en la siguiente tabla :

ml gastados
pH estimado pH calculado
de NaOH
0.01 N
Solución de ácido 4.7 ml 1.5 ml 0.1
HCl 0.01 N
Solución de ácido 5.5 ml 3.5 ml 3.9 ml
acético 0.01 N

Interrogantes:

1. ¿Cómo explica estos resultados?

Con un ácido fuerte el ph es menor en cambio un ácido débil el ph es mayor.

2. ¿Cuál será la concentración de una solución de HCl para que su pH sea igual al pH de la
solución de ácido acético 0.01 N que Ud. a usado?

ph = -log H 3.9=-log h 0.000038= H

3. ¿Cuál es el fundamento del uso de indicadores?

Un cambio químico se caracteriza por alterar la estructura de las sustancias involucradas,

lo cual se evidencia a través de modificaciones en los indicadores. Esta transformación es
significativa ya que nos permite distinguir entre ácidos y bases.

4. ¿ Que son soluciones buffer?

Son mezclas de ácidos débiles y sus correspondientes bases conjugadas, o de bases débiles
y sus ácidos conjugados, que tienen la capacidad de resistir cambios significativos en su
pH cuando se les añaden pequeñas cantidades de ácidos o bases fuertes.

5. ¿ Qué importancia tiene la cantidad de bicarbonato en sangre?

La cantidad de bicarbonato en sangre es esencial para mantener el equilibrio ácido-base

del organismo, actuando como un tampón que regula el pH sanguíneo entre 7.35 y 7.45.
Este equilibrio es crucial para el funcionamiento óptimo de enzimas y otras moléculas
sensibles al pH. Además, el bicarbonato ayuda a controlar la acidez al neutralizar ácidos
producidos por el metabolismo, y sus niveles anormales pueden indicar trastornos
metabólicos como acidosis o alcalosis, siendo un indicador clave de la salud metabólica y
renal.
B) Determinación de pH de diferentes

soluciones Resultados:

1 2 3 4 5

Muestra

pH estimado
 ENZIMAS

I. OBJETIVOS

1. Estudiar la influencia del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.

2. Evaluar la influencia de la temperatura sobre la velocidad de una reacción enzimática

3. Estudiar la influencia de la [E] sobre la velocidad de una reacción enzimática.

1.

II. MARCO TEORICO

Las enzimas son proteínas que intervienen en las reacciones químicas de los organismos
vivos, incrementando la velocidad de estas hasta alcanzar su punto de equilibrio.

En una reacción bioquímica catalizada por una enzima, a medida que progresa la reacción,
aumenta la concentración de los productos a expensas de la desaparición de los
correspondientes substratos, en tanto que la enzima permanece inalterable.

La actividad enzimática usualmente es expresada por:

a) La desaparición del sustrato (P)

b) La aparición del producto (P)

c) La modificación de los cofactores

Diversos factores modifican la actividad enzimática:

a) El pH del medio

b) La concentración de la enzima

c) La temperatura de la reacción

d) La concentración del sustrato

e) La fuerza iónica ambiental

f) El tiempo de reacción

g) El efecto de inhibidores y activadores

En la presente práctica se estudiará algunas de las propiedades de las reacciones

enzimáticas. Para ello utilizaremos como modelo experimental, la acción hidrolítica de la
pepsina sobre la proteína albumina de huevo.

La ovoalbúmina es una proteína globular presente en altas concentraciones en la clara de

huevo, apareciendo en el huevo fresco como una solución viscosa y ligeramente
opalescente. Esta proteína en su estado natural tiene las dimensiones de 13 mµ, y está
constituida de 584 residuos de aminoácidos dispuestos en una sola cadena polipeptídica,
con un PM de 64500 y un pI de
4.6. Esta es la proteína que será utilizada como sustrato de la pepsina, previa
desnaturalización. La desnaturalización de la albumina se logra hirviendo el huevo por
algunos minutos; entonces, se extrae la clara, se la licua con agua destilada, finalmente,
esta solución es filtrada. Se obtiene así, una solución no viscosa pero turbia, a la cual tiene
que observar cuidadosamente antes y después de añadirle pepsina.

Recuerde Ud. que la pepsina es una enzima proteolítica secretada por las células
principales del estómago al estado de “zimógeno” o “proenzima” (pepsinógeno). Su
activación requiere de un pH muy ácido e implica la remoción de un péptido bloqueador de
su extremo amino terminal.

La enzima así activada, digiere a las proteínas hidrolizando los enlaces peptídicos situados
hacia el lado amino de los residuos de fenilalanina, tirosina y triptófano, además de
aspartato, glutamato y leucina , mientras que no actúa si el aminoácido anterior es prolina.
 En las células somáticas normales, las actividades catalíticas de las numerosas enzimas se
mantienen muy constantes, ya que existe un equilibrio entre la síntesis y la degradación
enzimática, pero constantemente llegan al espacio extracelular pequeñísimas cantidades de
muchas enzimas intracelulares. En muchas enfermedades orgánicas está aumentada la
salida de enzimas desde el interior celular, esto puede deberse por un aumento de la
permeabilidad de las membranas celulares, o bien por disolución de la estructura celular.
De esta manera se originan modificaciones del nivel enzimático en el plasma sanguíneo, de
indudable valor que ayudan a realizar un diagnóstico.

La enzima Lactato deshidrogenasa se encuentra concentrada en el corazón, riñón, hígado,

músculo y otros tejidos corporales. El daño a alguno de estos tejidos resulta en un aumento
de los niveles séricos de LDH. Niveles elevados de LDH están asociados con infarto del
miocardio, daño renal, hepatitis, enfermedades musculares y otras patologías. Existen a lo
menos cinco isoenzimas de LDH dependiendo de su origen tisular.

III. PARTE EXPERIMENTAL

 A) Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción
enzimática Procedimiento:

1. Preparar 5 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro: (los valores se encuentran en ml)

1 2 3 4 5

Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0

HC1 1.0 N 2.0 0.5 0.0 0.0 0.0

Na2CO3 10% 0.0 0.0 0.0 0.5 2.0

Agua destilada 0.0 1.5 2.0 1.5 0.0

2. En otros 5 tubos de prueba pequeños, medir 0.3 ml de una solución de pepsina al 1%

3. Preincubar los 10 tubos en baño maría a 37° C por 5 minutos

4. Agregar rápidamente a cada uno de los 5 primeros tubos, los 0.3 ml de la solución de
pepsina preincubada en cada uno de los segundos tubos.

5. Mezclar bien y continuar la incubación a 37° C por 10 minutos. Observar cuidadosamente

cada tubo antes y después de agregar la enzima.

6. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5
cruces, al final de 1,5 y 10 minutos. (NO SE REALIZÓ POR ERROR DE INSUMOS)

1 2 3 4 5

pH estimado

1 minuto

Aclaramiento 5 minutos

10 minutos
7. Haga el cálculo teórico del pH de los tubos 1 y 2 y compruebe con papel indicador el pH de
todos los tubos.

Resultados:

1. En papel milimetrado haga una gráfica con los resultados obtenidos colocando en el eje de
abscisas el pH y en el eje de ordenadas la actividad enzimática

2. El pH óptimo de la pepsina es …………..………………………………………….......

Interrogantes: (REALIZAR)

1. ¿Por qué se debe cocer un huevo antes de comerlo?

Se debe de cocer el huevo por la presencia de albúmina en la clara de huevo, la cual es el
sustrato de la pepsina. La albúmina requiere una anterior desnaturalización, esto se debe a que
las proteínas están compuestas por por una estructura tridimensional, lo cual complica el
trabajo por su forma, para concluir podemos decir que los alimentos tienen que estar cocidos,
para que de esa forma se encuentren desnaturalizados, para que así la enzima pueda trabajar de
una forma más rápida y es por ello que el huevo se debe de hervir.

2. ¿Por qué ocurre aclaramiento de la solución sustrato de ovoalbúmina cuando se le añade

pepsina?
Cuando se añade pepsina a una solución de ovoalbúmina, la pepsina hidroliza la ovoalbúmina
en fragmentos más pequeños, lo que resulta en un aclaramiento de la solución. Esto se debe a
que los fragmentos más pequeños de proteína son más pequeños y tienen una menor capacidad
para dispersarse en la solución, lo que resulta en una solución más clara.

3. ¿Por qué el pH afecto la actividad de las enzimas?

La forma en que las enzimas se organizan depende de sus cargas eléctricas, lo que significa
que hay un pH específico en el que su estructura es ideal para funcionar mejor (llamado pH
óptimo). En este punto, las enzimas trabajan más rápido, lo que se traduce en una mayor
actividad enzimática.
 B) Efecto de la temperatura sobre la velocidad de una reacción

enzimática Procedimiento

1. Para determinar la temperatura óptima para la actividad de la pepsina se debe

preparar: 4 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro: (los valores se

encuentran en ml)

1 2 3 4

Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0

HCl 1.0 N 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua destilada 1.5 3.5 4.2 4.2

2. En otros 4 tubos de prueba pequeños, medir 0.3 ml de una solución de pepsina al 1%

3. Preincubar los 8 tubos por 5 minutos a las siguientes temperaturas

Tubo 1 2 3 4

Temperatura Baño
0°C T. amb. 37°C
hirviente

4. Agregar rápidamente a cada uno de los 4 primeros tubos, los 0.3 ml de la solución de
pepsina preincubada en cada uno de los segundos tubos.

5. Mezclar bien y continuar la incubación a la temperatura correspondiente por 10

minutos. Observar cuidadosamente cada tubo antes y después de agregar la enzima.

6. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5
cruces, al final de 1,5 y 10 minutos.
Resultados:

3. En papel milimetrado haga una gráfica con los resultados obtenidos colocando en el eje de
abscisas el pH y en el eje de ordenadas la actividad enzimática. Señale la Temperatura
óptima de la Pepsina

Interrogantes:

1. ¿Cómo explicaría ud. el resultado obtenido en el último tubo? (X)

2. ¿Qué es la temperatura óptima? (SI REALIZAR)

Es aquella en la que no experimentamos ni frío ni calor. En el contexto de la biología, la
temperatura óptima se refiere a la temperatura a la que una enzima o un organismo funcionan
de manera más eficiente. Por ejemplo, la temperatura óptima para la mayoría de las enzimas es
alrededor de 37 grados Celsius, que es la temperatura corporal normal de los seres humanos. Si
la temperatura es demasiado baja, las enzimas no funcionarán de manera eficiente y si la
temperatura es demasiado alta, las enzimas pueden desnaturalizarse y perder su actividad.

C) Efecto de la [E] sobre la velocidad de una reacción enzimática.

Procedimiento

7. Preparar 4 tubos de prueba de acuerdo al siguiente cuadro: (los valores se encuentran en

ml)

1 2 3 4

Solución de ovoalbúmina 5.0 5.0 5.0 5.0

HCl 1.0 N 0.5 0.5 0.5 0.5

Agua destilada 1.5 3.5 4.2 4.2

Preincubar los 4 sistemas a 37°C y luego añadir:

1 2 3 4

Pepsina 1% preincubada 3.0 1.0 0.3 0.0

Pepsina 1 % hervida 0.0 0.0 0.0 0.3

1. Mezclar bien y continuar la incubación a 37°C por 10 minutos. Observar cuidadosamente
cada tubo antes y después de agregar la enzima.

2. Expresar el aclaramiento (la actividad enzimática) de cada uno de los tubos, con 0 a 5
cruces, al final de 1,5 y 10 minutos.(NO SE REALIZÓ POR ERROR DE INSUMOS)

1 2 3 4

1 minuto

Aclaramiento 5 minutos

10 minutos

3. Calcule la concentración de la pepsina en cada uno de los tubos en miligramos por tubo.

Resultados:

1. En papel milimetrado haga una gráfica con los resultados obtenidos colocando en el eje de
abscisas la [E] y en el eje de ordenadas la actividad enzimática.
 Interrogantes:

1. ¿Qué ocurriría si se sigue aumentando la [E] sin modificar la [S].

Al aumentar la concentración enzimática también aumenta la actividad enzimática y al no
modificar el sustrato no llega a tener una velocidad máxima

2. ¿En el laboratorio clínico, qué requisitos son fundamentales para la determinación de la

actividad enzimática en líquidos biológicos con fines diagnósticos?

1. Muestra de calidad: Es importante asegurarse de que la muestra biológica utilizada sea de buena
calidad y representativa del estado del paciente. Esto implica tomar las precauciones adecuadas
durante la recolección, transporte y almacenamiento de la muestra para evitar la contaminación o
degradación de las enzimas.
2. Preparación adecuada de la muestra: Antes de realizar la determinación de la actividad enzimática,
es necesario preparar la muestra de manera adecuada. Esto puede incluir la centrifugación de la
muestra para separar los componentes celulares, la dilución de la muestra si es necesario, o el uso de
reactivos específicos para estabilizar las enzimas.
3. Control de condiciones: Es importante controlar las condiciones en las que se realiza la
determinación de la actividad enzimática. Esto incluye mantener una temperatura constante, pH
adecuado y utilizar los reactivos y equipos adecuados para la medición.
4. Uso de estándares y controles: Para asegurar la precisión y fiabilidad de los resultados, es
necesario utilizar estándares y controles de calidad. Los estándares permiten establecer una relación
cuantitativa entre la actividad enzimática medida y una concentración conocida, mientras que los
controles permiten verificar el funcionamiento adecuado de los reactivos y equipos utilizados.
5. Calibración y validación: Antes de realizar la determinación de la actividad enzimática, es
necesario calibrar los equipos y validar los métodos utilizados. Esto implica realizar pruebas de
control de calidad y comparar los resultados obtenidos con los valores de referencia establecidos.

3. Menciones 5 fármacos que actúan inhibiendo a las enzimas

1. Omeprazol: Inhibe la enzima H +/K+-ATPasa en las células parietales del estómago, reduciendo la
producción de ácido gástrico.
2. Estatinas: Inhiben la enzima HMG-CoA reductasa en el hígado, reduciendo la síntesis de
colesterol.
3. Aspirina (ácido acetilsalicílico): Inhibe la enzima ciclooxigenasa (COX), reduciendo la
producción de prostaglandinas y tromboxanos.
4. Allopurinol: Inhibe la enzima xantina oxidasa, reduciendo la producción de ácido úrico y
previniendo la formación de cálculos renales.
5. Enalapril: Inhibe la enzima convertidora de angiotensina (ECA), relajando los vasos sanguíneos y
reduciendo la presión arterial.