TÉCNICAS CROMATOGRAFICAS

INTRODUCCIÓN:

Uno de los objetivos de la Bioquímica es el de separar compuestos químicos para su identificación y

caracterización. Para ello se desarrollaron numerosas técnicas que se basan en diferencias
fisicoquímicas de los compuestos, como masa, carga, solubilidad, afinidad, etc. Las técnicas más
utilizadas son: diálisis, electroforesis, cromatografía, precipitación, centrifugación y ultrafiltración.
Todas son aplicables a la purificación tanto de proteínas como de péptidos, aminoácidos, ácidos grasos,
lípidos, hidratos de carbono, nucleótidos y ácidos nucleicos.
La cromatografía es una de las técnicas más usadas. Fue desarrollada por primera vez en el siglo
XIX por un botánico ruso, con el objeto de separar los pigmentos de las plantas, de allí su nombre de
“croma” (color).
En la cromatografía la separación de compuestos de una mezcla se produce debido a que dichos
solutos presentan diferentes propiedades que permiten que varíen en su grado de distribución
entre una fase móvil o migrante y una fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser una matriz
sólida o un líquido o una mezcla de un sólido y un líquido, mientras que la fase móvil puede ser de
naturaleza líquida (cromatografía líquida) o de naturaleza gaseosa (cromatografía gaseosa).
Se entiende por:
SOLUTO: compuesto químico a separar que se encuentra en una muestra.
SORBENTE: fase estacionaria por la que fluye la fase móvil.
SOLVENTE: fase móvil que permite que el soluto migre a través de la fase estacionaria.
En un sistema de solvente y fase estacionaria dado, la distribución del soluto entre las dos fases es una
propiedad exclusiva del soluto y difiere de un compuesto a otro.
Cuando un solvente o fase móvil pasa a través de la fase estacionaria, aquellos solutos que
tengan mayor afinidad por la fase estacionaria van a ser más retardados que aquellos que tengan menos
afinidad y así se producirá la separación de los diferentes solutos. Su distribución, entre las dos fases de
un cromatograma, se puede expresar por el coeficiente de distribución, que por convención es K.

Concentración del soluto en la fase móvil

K=
Concentración del soluto en la fase estacionaria

Un valor de K de 0,2 indica que la fase estacionaria contiene cinco veces más soluto que la fase
móvil.
La distribución de los solutos también se puede expresar en términos del coeficiente de
distribución efectivo B, que indica la relación entre la cantidad total de soluto en cada fase.

Cantidad total de soluto en la fase móvil

_______________________________________________________
B=
Cantidad total de soluto en fase estacionaria

Según la/s sustancia/s a estudiar, las corridas cromatográficas pueden realizarse en papel, en
columnas o en placas.
La eficiencia o resolución de una cromatografía en columna, dependiendo del tipo de
interacción, puede estar en relación directa con el largo de la columna y en relación inversa con el
diámetro de esta y con el tamaño de las partículas de empaquetamiento. En la cromatografía en placa, la
resolución es inversamente proporcional al tamaño de las partículas adheridas al soporte.

Adsorción y Partición
La distribución de solutos entre la fase móvil y la fase estacionaria puede involucrar
mayoritariamente procesos de adsorción o de partición, dependiendo de la naturaleza del soluto y del
tipo de fase estacionaria utilizada.
En la partición, el soluto se encuentra en equilibrio entre dos líquidos inmiscibles (el solvente y
el líquido de la fase estacionaria) y su distribución depende de su solubilidad en los mismos. Los solutos
que poseen mayor solubilidad en el solvente migrarán más rápidamente que los que tienen mayor
solubilidad en la fase estacionaria. Todos los compuestos con diferente coeficiente de partición pueden
ser separados por técnicas cromatográficas basadas en la partición. La distribución del soluto en la

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columna o en dos líquidos inmiscibles en cada fase no varía con la concentración (dentro de ciertos
rangos), ya que el coeficiente de partición de un compuesto es una constante para un sistema dado.
En los procesos de adsorción, el soluto está en equilibrio entre un adsorbente sólido (fase
estacionaria) y un solvente líquido y la distribución de este es más complicada dependiendo de su
afinidad por ambas fases. Cuando el soluto es neutro, las fuerzas predominantes son la interacción
dipolo-dipolo y los Puentes Hidrógeno. Cuando el soluto tiene carga, las fuerzas iónicas son las
responsables de la interacción.
Existen numerosas técnicas cromatográficas que utilizan la partición, la adsorción o ambos
procesos para separar una mezcla de compuestos. Estrictamente hablando, en las cromatografías de
partición no se puede excluir la adsorción de los solutos al soporte de la fase estacionaria.
El primer paso en cualquier procedimiento cromatográfico consiste en elegir un sistema que
separe en forma efectiva las sustancias de una mezcla. Si las mismas son conocidas la elección resulta
más sencilla. Si, por el contrario, dichos componentes no se conocen, la elección debe ser hecha
basándose en la composición del material de origen. Cuando el componente de interés se encuentra en
pequeña proporción dentro de la mezcla, por lo general primero se elimina la mayor parte de sustancias
extrañas contaminantes por otros métodos diferentes; la mezcla resultante parcialmente purificada está
en condiciones de ser cromatografiada.
Las técnicas cromatográficas más utilizadas en bioquímica se describen a continuación:

1.- CROMATOGRAFIA EN PAPEL

En este tipo de cromatografía, la separación de los componentes de una muestra se logra por la
diferencia en la solubilidad de estos entre una fase órganica y una fase acuosa. Se elige papel como
soporte de la fase estacionaria debido a la fácil hidratación de la celulosa; el agua de hidratación
constituye la fase estacionaria y el solvente constituye la fase móvil. Cuando este asciende
(cromatografía ascendente) o desciende (cromatografía descendente) por capilaridad, los componentes
de la muestra previamente sembrados en el papel se distribuyen de acuerdo a su coeficiente de
partición. Este tipo de cromatografía es muy útil para la separación de aminoácidos, azúcares y
péptidos.
El grado de migración de una sustancia se expresa por el Rf (Relación de Frentes), cociente
adimensional que se calcula midiendo la distancia recorrida por la sustancia desde el lugar de siembra y
dividiéndola por la distancia total recorrida por el disolvente.

Distancia recorrida por la sustancia

Rf =
Distancia recorrida por el solvente

Cada sustancia tiene un Rf determinado en las mismas condiciones de temperatura, sistemas de

solventes, soporte, etc. -Para que el Rf sea constante las condiciones deben ser también constantes.

2.- CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC)

Surgió como una modificación de la cromatografía en papel, muy usada actualmente por su gran
versatilidad.
En este tipo de cromatografía, el material cromatográfico se dispone en forma de una fina capa
sobre un soporte que puede ser una placa de vidrio, aluminio o plástico. En la TLC (del inglés “Thin
Layer Chromatography”) se separa por el fenómeno de adsorción cuando se usa ácido silícico o sílica
gel como fase estacionaria.
Se disponen o se “siembran” pequeñas gotas de la mezcla que se va a analizar en la parte
inferior de la placa cuyo borde se introduce verticalmente en una mezcla adecuada de solventes (fase
móvil) contenida en una cámara hermética (cuba de vidrio) (fig. 1). Es muy importante que previo a la
introducción de la placa la cuba esté perfectamente saturada con los vapores del solvente, lo que
significa que la distribución de los vapores es homogénea en todo el volumen de la cuba porque ya han
alcanzado el equilibrio con la fase líquida del solvente. Este efecto se logra recubriendo por lo menos
dos de sus paredes con papel de filtro y asegurándose que sus bordes inferiores queden sumergidos en el
solvente. Se deja que el solvente ascienda por el papel y después de unos minutos que el solvente llegó
a la parte superior se considera que la cuba está saturada. Cuando se introduce la placa en la cuba, el
solvente migra pasando por los puntos de siembra y ascendiendo por capilaridad. Cada componente de
la mezcla tiene ahora la posibilidad de migrar con el solvente, o quedar retenido en la fase estacionaria.

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Los componentes que pasan fácilmente al disolvente serán transportados con rapidez hasta el extremo
superior de la placa, mientras que los componentes de la muestra que no se disuelven fácilmente en el
disolvente son retenidos y permanecerán cerca de la base de la placa. La cromatografía concluye cuando
el frente de corrida del disolvente alcanza el borde superior de la placa.

Frente Placa TLC

Placa TLC Cámara de corrida
Rf

Papel de filtro

Origen
de siembra

Solvente

Figura 1
El resultado es una serie de manchas distribuidas a lo largo de la placa desde el canal de siembra
en dirección al frente de corrida, las cuales pueden ser visualizadas directamente o mediante una técnica
de revelado.
Dos sustancias con Rf similar en un sistema de solventes pueden ser resueltas por una
cromatografía en placa fina haciendo correr nuevamente la muestra en forma perpendicular a la primera
dirección de corrida y con un sistema de solventes distintos a los de la primera corrida (cromatografía
bidimensional). La separación de compuestos mediante TLC permite identificar los componentes de
una mezcla, por comparación de sus Rf con los Rf de patrones sembrados y corridos en la misma placa,
así como también permite cuantificar dichos compuestos por métodos específicos (colorimetría,
fluorescencia, etc.).

3.- CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL O DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

Se utiliza para separar compuestos de una muestra según su tamaño y forma molecular,
mediante una matriz que actúa como tamiz molecular. Para ello se utilizan geles de estructura
polisacárida empaquetados en columnas de vidrio o plástico. El primer gel utilizado fue un dextrano
modificado conocido con el nombre de Sephadex. El dextrano es un polímero de la glucosa obtenido de
la fermentación de la sacarosa por un microorganismo. Las moléculas lineales de dextrano son
transformadas en una malla tridimensional por un tratamiento químico. En la Figura 2 se observa una
micrografía de barrido de una partícula de Sephadex a diferentes aumentos.

Figura 2. Fotografía de partículas de dextrano vistas

al microscopio electrónico. En esta fotografía se
observa la superficie de la partícula y con mayor
aumento se puede observar la trama de la malla en el
interior de la partícula.

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Ligeras variaciones en la concentración del dextrano o en su Peso Molecular (PM), permiten obtener
mallas de diferente trama que tienen diferentes rangos de fraccionamiento en la separación dependiendo
del tamaño de los poros que forma el gel.

Figura 3. Propiedades de Sephadex (tipos comerciales).

El dextrano modificado se hincha considerablemente cuando se hidrata en agua o en soluciones

electrolíticas y empaquetado en una columna actúa como un tamiz para moléculas de diferente tamaño.
Cuando se filtra una solución acuosa, las moléculas pequeñas que pueden penetrar en los poros
del gel tendrán un lento progreso en la columna y permanecerán más tiempo en la fase estacionaria
(líquido contenido adentro de las esferas del gel), en cambio las moléculas grandes que no pueden
penetrar en los poros eluirán primero. Las moléculas son eluídas según tamaño molecular decreciente.
Este fenómeno se puede explicar gráficamente en la Figura 4. Es el único tipo de cromatografía en la
que los componentes de la muestra no presentan ningún tipo de interacción química con la matriz, la
separación se debe a un proceso netamente físico.

Figura 4. Cromatograma teórico obtenido de un fraccionamiento de alta resolución por

filtración en gel.

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El volumen de elución (Ve) del soluto estará dado por el volumen de líquido que debe agregarse a la
columna para producir la salida de un soluto en el efluente.
Las moléculas muy grandes permanecen en el volumen de exclusión o volumen muerto (Vo).
Este volumen de exclusión es el volumen de la fase acuosa en el exterior de las esferas del gel. El
volumen de líquido contenido en el interior de las esferas de gel corresponde al volumen de la fase
estacionaria (Vs). En la Figura 5 se observa una representación esquemática de cada fase.

Figura 5

Para determinar en la práctica el Vo de una columna se usan moléculas de muy alto PM, como,
por ejemplo, Dextran Blue (P.M. 2.000.000), el Ve de éste corresponderá al Vo.

El Volumen Total (Vt) de la columna será el volumen de la fase móvil más el volumen de la
fase estacionaria (Vs). Como éste último es difícil de medir experimentalmente, se determina el Vt
sembrando una molécula de muy bajo PM, como, por ejemplo: CoCl2, alanina, etc, y luego el Vs se
calcula matemáticamente:

Vt - Vo = Vs

El Ve no es suficiente para definir el comportamiento de una sustancia ya que varía con el Vt y

con el empaquetamiento de la columna. Por esta razón la elución de un soluto se caracteriza mejor
mediante el Coeficiente de Distribución Kd o Kav.

Ve – Vo Ve – Vo
_____________ _____________
Kd= Kav=
Vs Vt - Vo

La filtración en gel es muy usada para determinar el PM de una proteína globular. Para ello debe
calibrarse previamente la columna haciendo pasar dos o tres proteínas de PM conocido (A, B, y C) y
determinando su Ve, graficando luego el logaritmo decimal del PM (Figura 6) en función del Ve,
obteniéndose una recta de pendiente negativa. De este modo se puede calcular por interpolación el PM
de una proteína desconocida, determinando su Ve en la misma columna.

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 A
5,0
B
PM
PM desconocido
desconocido
= 49.000
49.000

4,5
C

4,0

60 70 80 90 100

Ve X
Volumen eluído (ml)

Figura 6. Curva de calibración de una columna de filtración en gel. Interpolando a partir de dicha
recta se puede obtener el PM de “X”.
Proteína A: PM 100.000, Ve = 63 ml
Proteína B: PM 67.000, Ve = 74 ml
Proteína C: PM 25.000, Ve = 95 ml

El valor vigente de la filtración en gel se debe a la versatilidad de las condiciones en las que se efectúa
la separación (en presencia de iones o cofactores esenciales, detergentes o urea, alta fuerza iónica, en
frío, etc.), al mismo tiempo que se realiza independientemente de cambios en el pH, o en la
concentración de iones metálicos. etc., que afectan la actividad de algunas macromoléculas biológicas.
También presenta alta reproducibilidad y simplicidad como técnica de separación

4.- CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

Tanto las proteínas como los péptidos y aminoácidos se purifican frecuentemente en columnas
que se cargan con partículas de resinas sintéticas portadoras de grupos iónicos unidos a ellas en forma
covalente. En cada esfera pueden existir miles de estos grupos. De acuerdo a la carga de estos ligandos,
hay dos tipos de resinas de intercambio: aniónicas y catiónicas, las cuales poseen cargas positivas y
negativas respectivamente.
Uno de los primeros intercambiadores iónicos utilizados fue la celulosa, que al ser hidrofílica no
desnaturaliza a las proteínas. Actualmente se preparan intercambiadores en donde la matriz es Sephadex
o Sepharosa que poseen mayor capacidad y mayor velocidad de flujo.
La clase de grupo aniónico o catiónico determina el tipo y la fuerza del intercambiador. La
cantidad (densidad de ligando) y disponibilidad de estos grupos determina su capacidad. Los
intercambiadores iónicos pueden ser fuertes o débiles según su grado de ionización varíe con el pH.
Los intercambiadores fuertes están completamente ionizados en un amplio rango de pH mientras
que los débiles tienen un grado de ionización y una capacidad de intercambio que varía
marcadamente con el pH por lo que son útiles en un rango de pH más acotado. Algunos ejemplos
son:

Matrices de intercambiadores aniónicos:

Amino etil (AE) - intercambiador débil

-O-CH 2-CH 2-NH 3

Dietil amino etil (DEAE) - intercambiador débil

-O-CH 2-CH 2-NH(CH2-CH 3)2

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Matrices de intercambiadores catiónicos

Carboximetil (CM) - intercambiador débil

-O-CH2-COO=

Sulfopropil (SP) - intercambiador fuerte

-O-CH2-CH2-CH2-SO3

En primer lugar, las resinas de intercambio iónico se equilibran con los iones del buffer, es decir
las cargas de la resina interaccionan electrostáticamente con el ion de carga opuesta del buffer
(contraión), así la columna equilibrada está en condiciones de ser “sembrada” con una muestra. Después
de sembrar la muestra, se lava con el mismo buffer de equilibrio, para eluir todas las sustancias que no
interaccionan con los grupos iónicos de la matriz debido a que no presentar la carga opuesta a los
mismos. En segundo lugar, se realiza la elución de los compuestos unidos aumentando la fuerza iónica
por agregado de sal (NaCl) y/o modificando el pH, de modo de debilitar las interacciones entre los
solutos y la fase estacionaria (ligando). Los solutos eluyen gradualmente en grado de afinidad creciente:
primero se despegan los compuestos menos cargados que interaccionan débilmente con la matriz y
luego los que presentan mayor afinidad y son fuertemente adsorbidos por su mayor intensidad de carga.
El eluído se recoge en fracciones pequeñas y generalmente se cuantifica la cantidad de proteína en cada
fracción por absorbancia al UV (λ=298nm) o a través de una reacción colorimétrica. Luego la matriz
debe ser regenerada, intercambiando los iones del gradiente salino por los del contraión del buffer de
equilibrio, para quedar en condiciones de ser usada nuevamente.
La separación se logra debido a la diferencia de cargas que existe entre las sustancias a separar.
Se trata de una técnica de muy alto poder resolutivo, ya que es capaz de separar moléculas que tienen
mínima diferencia en la carga, como por ejemplo dos proteínas que difieren en un único aminoácido.
Las proteínas presentan algunos grupos con carga positiva y otros con carga negativa por lo que
se dice que tienen comportamiento anfótero; es decir que la carga neta que poseen es dependiente del
pH. El punto isoeléctrico de una proteína (pI) corresponde al valor de pH en el que tiene carga neta
nula. Por lo tanto, a un valor de pH=pI, la proteína no se une a ningún tipo de intercambiador.

Figura 7. Curvas de valoración de una proteína. Punto isoeléctrico

Se pueden separar las proteínas presentes en una muestra basándonos en la naturaleza anfótera
de las mismas (Figura 7). A medida que se modifica el pH en el que se realiza la cromatografía, cambia
la carga neta de las proteínas, por lo que cada una de ellas presenta diferente grado de interacción con la
matriz.
Una vez seleccionado el intercambiador, se puede optimizar la purificación ajustando el valor
del pH. La Figura 8 muestra los diferentes perfiles de elución obtenidos por la cromatografía de una
mezcla de proteínas modelo en una columna de intercambio catiónico en diferentes condiciones de pH.

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 1: apotransferrina
1 2 3 2: ribonucleasa A
3: citocromo C

Figura 8: Selección del pH óptimo para la separación de proteínas Standard

Se puede observar que a medida que se aumenta el pH, mejora la resolución en la separación
de las proteínas.

5.- CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Algunas proteínas pueden aislarse a partir de mezclas muy complejas y alcanzar un alto grado
de purificación empleando este tipo de cromatografía. Se basa en la capacidad de unión específica y no
covalente que presentan algunas proteínas con moléculas llamadas ligandos. Un ejemplo típico son las
proteínas que se unen fuertemente a sus coenzimas específicas, las cuales se han unido previamente a
una sustancia polimérica sólida. Cuando se siembra la mezcla de proteínas sólo quedan retenidas
aquellas que pueden unirse específicamente (Figura 9).

Figura 9. Fundamento de la Cromatografía de Afinidad

Luego de lavar la columna para eliminar los componentes de la muestra que no interaccionan
con la matriz, se realiza la elución de la proteína unida específicamente por competición con una alta
concentración de ligando libre.

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 Esta cromatografía de afinidad se utiliza para separar enzimas y receptores. La interacción
antígeno-anticuerpo también puede ser aprovechada por este tipo de metodología.

6.- CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA

Este tipo de cromatografía está basada en la interacción de las regiones hidrofóbicas externas de
las proteínas con grupos hidrofóbicos unidos a una matriz hidrofílica (agarosa, por ejemplo). La elución
puede realizarse debilitando la interacción hidrofóbica por disminución de la fuerza iónica con
gradiente concentración decreciente de una sal como el (NH4)2SO4 o bien por aumento del pH. Las
proteínas unidas muy fuertemente pueden eluírse utilizando una solución con polietilenglicol o
soluciones reguladoras de elevado pH.

7.- HPLC (High Performance Liquid Chromatography )

Los materiales cromatográficos utilizados en HPLC (adsorción, partición o intercambio iónico),

están en el orden de 5 a 10 m y se empaquetan en columnas de acero inoxidable (10 a 30 cm de largo y
1 a 3 mm de diámetro). Para su elución es necesario que el solvente sea impulsado por alta presión, y
esto se logra mediante el empleo de bombas.
La elución de la columna puede ser llevada a cabo, dependiendo del tipo de gel utilizado, con
los mismos principios que rigen la cromatografía tradicional.

COMPONENTES
Los componentes esenciales encontrados en un equipo de HPLC incluyen una bomba, inyector,
columna, detector y registrador (Figura 10). La columna es considerada como el corazón del sistema.
Debido a que la fase estacionaria esta compuesta por partículas muy pequeñas, se requiere una alta
presión en las bombas para mover la fase móvil a través de la columna. El proceso cromatográfico
comienza con la inyección de la muestra (soluto). A medida que cada componente es separado en la
columna y el soluto eluye de la misma, son detectados y registrados constituyendo lo que se denomina
cromatograma. Para colectar, almacenar y analizar los datos cromatográficos, existen numerosos
sistemas de procesamiento de datos. La calidad de la separación cromatográfica puede ser determinada
matemáticamente analizando la Eficiencia, Selectividad y resolución de la cromatografía.
Eficiencia (N): describe la separación potencial teórica del sistema cromatográfico elegido.
Selectividad (a): es una medida de la retención relativa de dos componentes de una mezcla. La
selectividad de una columna depende del empaquetamiento de la columna y las condiciones de la
elución. Resolución (R): estima el grado de separación cromatográfico. Depende de la eficiencia y la
selectividad. La resolución también depende de un llamado factor de capacidad, k’. Este factor indica el
grado de interacción de la fase estacionaria y la fase móvil por comparación del tiempo de elución de un
componente dado con el del frente del solvente.
Estos tres factores describen completamente las características de la separación y pueden ser usados
para analizar no solo el soluto, sino también el solvente y la fase estacionaria.
Las mayores ventajas del HPLC sobre otras técnicas cromatográficas son la velocidad, resolución y
sensibilidad lo que permite la detección de cantidades de soluto extremadamente bajas. La extrema
versatilidad de la técnica de HPLC hace que tenga innumerables aplicaciones (Tabla 1).

TABLA1. Usos comunes del HPLC

CIENTÍFICOS INDUSTRIALES FARMACEUTICOS

Monitoreo de drogas Separación de Análisis de drogas
toxicología Pesticidas, Polímeros Testeo de formulaciones,
Separación de aminoácidos, Aceites Detección de trazas de
Proteínas, lípidos Anti-oxidantes contaminantes, control de calidad
y carbohidratos. Surfactantes y screening de drogas.
Formulaciones complejas
Estudio de Mecanismos de reacción.

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La técnica de HPLC puede usarse para la separación e identificación de componentes de una mezcla
compleja. A su vez pueden emplearse técnicas analíticas (g-mg) y preparativas (g-kg)
Otros factores que afectan este tipo de cromatografía son:
1) enpaquetamiento de la columna: modo de separación, grupos unidos a la matriz de la fase estacionaria,
tamaño de poro, tamaño de particula, carga de muestra y área de superficie.
2) configuración de la columna: longitud, diámetro interno y material de construcción (acero, plástico,
polietercetona)
3) condiciones de elución: composición del solvente, la velocidad de flujo, la temperatura, el perfil de
elución a) isocrático: cuando se utiliza un solo solvente, b) con gradiente: cuando se utiliza una mezcla de
solventes que cambia su proporción a medida que se avanza la corrida, este cambio puede ser lineal o
escalonado.
Frecuentemente la experimentación es la mejor forma de determinar las óptimas condiciones de las variables.
Sin embargo, se ha desarrollado un modelo teórico para ayudar en la separación. En este modelo teórico los
factores que afectan una separación están divididos en factores químicos, conocidos como la selectividad
(alfa) y la capacidad (k’), y el factor físico, conocido como la eficiencia (N) (ya mencionados anteriormente).

COMPONENTES DE UNA COLUMNA Y SU CONTRIBUCION A LA EFICIENCIA

CROMATOGRAFICA

Columna

Matriz Recipiente

Naturaleza de la Tamaño de la Longitud Diámetro Material

superficie de la partícula partícula

Factores químicos Factores físicos

Alfa, K N
resolución Tiempo de vida, eficiencia, velocidad

Columna

Solvente Colector de
Detector/es
fracciones
Sistema de
liberación del Inyector
solvente

Muestra Registrador

Figura 10 Esquema de los componentes de un equipo de HPLC.

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8.- FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography)

Se basa en los mismos principios que el HPLC pero las presiones utilizadas son menores. Esta
cromatografía se utiliza de preferencia para la separación de proteínas dado que las condiciones de corrida
permiten la conservación de las actividades biológicas de las mismas (Figura 11).

Figura 11. Fotografía de un equipo de FPLC.

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 Parte Experimental

1. Cromatografía en capa fina (TLC)

Objetivo: separación e identificación de lípidos de un extracto de hojas de pasto (planta gramínea de la

especie Chloris gayana) utilizando TLC (cromatografía en capa delgada).

Obtención del extracto lipídico de hojas de gramíneas

Se pasan por mortero aproximadamente 20 g de hojas de gramíneas, se ponen en un erlenmeyer con tapa
esmerilada con 150 ml de cloroformo, se mezcla y se deja 6 hs o toda la noche en heladera; se agregan 150 ml
de metanol, se mezcla y se deja 4 hs más en heladera. Se filtra por papel de filtro, y el filtrado se pasa a una
probeta, se agregan 40 ml de agua destilada y se mezcla con cuidado por inversión. Se deja particionar toda la
noche en heladera y se desecha la capa superior; se concentra la capa inferior en rotavapor hasta 3-5 ml. Se
obtiene un extracto listo para ser sembrado.

Preparación del material cromatográfico

Se utilizan placas de sílica gel de 5 x 10 cm y 0.25 mm de espesor adquiridas en firmas comerciales (Riedel-
deHaën). Las placas se activan en estufa a 110°C durante una hora (deshidratación) y luego se dejan enfriar.

Procedimiento: se siembra la muestra a determinar junto a diferentes soluciones estándares en la parte

inferior de la placa o del papel. Ambas son introducidas en una cuba hermética que contiene cloroformo,
metanol, acetona, ácido acético y agua proporción 50/10/20/10/5 v/v/v/v/v.
Cuando el frente de corrida del disolvente alcance el borde superior de cada placa (aproximadamente entre 30
a 40 minutos) se saca la placa de la cuba y se la deja secar en campana. Posteriormente se procede al revelado
en una cuba o cámara hermética que contiene yodo en forma de cristales, así las manchas toman un color
anaranjado-amarillento característico y procedemos a su identificación.

2. Cromatografía de filtración en gel.

Objetivo 1: determinación experimental de Vt, Vs yV0 de una columna de Sephadex G-75 utilizando una
mezcla de Dextran Blue (PM 2.000.000) y CoCl2 (PM 129,5) y.

Procedimiento: Se pesan 2,5 g de Sephadex G-75 y se agregan 50 ml de buffer fosfato-citrato 10 mM pH 7.

Se deja toda la noche a temperatura ambiente. Se carga con Sephadex G-75 una columna de vidrio,
pipeteando cuidadosamente para evitar la formación de burbujas, y se lava con 10 volúmenes del buffer para
equilibrarla. Se pesan 1 mg de dextran blue y 1 mg de CoCl2 y se disuelven en 1 ml del mismo buffer. Se
siembran 100 l de la mezcla en la columna y se eluye con el buffer. Se miden los volúmenes de elución de
ambos componentes y se calculan Vt, Vs yV0 de este sistema cromatográfico.

Objetivo 2: purificación final de la enzima ureasa de soja. El extracto crudo de la enzima fue purificado
mediante FPLC con una columna DEAE-celulosa (15 × 3.0 cm) equilibrada con buffer fosfato-citrato 10 mM
pH 7. Las fracciones fueron separadas mediante un gradiente lineal de NaCl (100 – 500 mM en el mismo
buffer fosfato), a una velocidad de flujo de 0.5 mL min−1.
La fracción que presentó actividad será desalada por los alumnos, pasando la muestra por la columna de
Sephadex G-75, previamente calibrada. Una vez terminada la separación, se agregará a las fracciones (1 mL)
100 l del sustrato, Urea 10 mM, incubándose 10 min a 37°C. Finalmente se revelará la formación de
amoníaco mediante el método de Berthelot, de la misma manera que en los TP 1,2 y 3.

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PROBLEMAS:
1- Al realizar una TLC se encontró que el Rf de una sustancia A=0,62 y el de una sustancia B=0,39. Si el solvente
usado en la corrida migra 24 cm, calcule la distancia recorrida por cada una de ellas e indique que sustancia tiene
mayor afinidad por la fase móvil.

2- En qué orden saldrían las siguientes proteínas después de filtrar en gel de Sephadex G-200 (límite de exclusión
aproximado:200.000) una mezcla de mioglobina (PM=16.000), catalasa (PM=500.000), quimotripsinógeno
(PM=26.000) y albúmina sérina (PM=65.000).

3- Se analizaron una serie de proteínas estándares y una enzima desconocida por medio de filtración en gel
Sephadex G-200. Abajo se da el volumen de elución (Ve) para cada proteína.

Proteína PM Ve (ml)
Lisozima 14.000 200
Quimotripsinógeno 25.000 190
Ovoalbúmina 45.000 170
Aldolasa 150.000 125
Desconocida ----- 130

Dé la línea de mejor ajuste para los puntos de los estándares y determine el peso molecular de la enzima
desconocida.

4- Las proteínas: ovoalbúmina (pI= 4,6), ureasa (pI=5) y mioglobina (pI=7) se aplicaron a una columna de DEAE-
celulosa a pH 6,5. La columna se eluyó con un buffer diluido de pH 6,5 y luego con el mismo buffer conteniendo
concentraciones crecientes de NaCl. ¿En qué orden se eluirán las proteínas de la columna?

5- La casa Amersham Pharmacia Biotech vende, para cromatografía de filtración en gel, el producto "Sephadex G-
100 Superfine", con las siguientes características:
Material: dextrano entrecruzado con epiclorohidrina
Tamaño de partícula: 10-40 m (seco)
Volumen de lecho: 15-20 ml/g (en agua)
Límite de exclusión para proteínas globulares: 100 kDa
Intervalo de fraccionamiento para proteínas globulares: 4-100 kDa

Una muestra contiene las proteínas indicadas a continuación. Explique como será la elución de los distintos
componentes de la mezcla.
Lactoferrina: 77 kDa, pI=8,8
Proteína ligante de retinol (RBP): 21 kDa, pI=4,6
Lisozima: 15 kDa, pI=10,5
Ceruloplasmina: 134 kDa, pI=4,4
Glutatión: 333 Da, pI=2,25

6- Resuelve el problema anterior empleando como medio cromatográfico Sephadex G-75. (El Sephadex G-75 tiene
un intervalo de fraccionamiento para proteínas globulares de entre 3 y 70 kDa).

7- Disponemos de una columna con microesferas de polietileno con grupos sulfopropil unidos covalentemente
(fase estacionaria). ¿Para qué tipo de cromatografía podremos utilizarlas?
a) de filtración en gel; (b) de intercambio aniónico; (c) de intercambio catiónico; (d) de afinidad

8- A partir de un antisuero se pretende purificar un anticuerpo anti-insulina, empleando cromatografía de afinidad

en una columna rellena con Biogel-A a la que se ha unido insulina de forma covalente a través de un grupo
espaciador de 6 carbonos.
Elegir de entre las fases móviles siguientes la más adecuadas para la etapa de lavado tras sembrar la muestra y para
la
. elución de lo retenido en la columna
a. Mezcla cloroformo/metanol 2:1
b. Alcohol isopropílico
c. NaCl 0.9%
d. 0.5 mg/ml de insulina en tampón fosfato pH=7.4
e. 2 mg/ml de IgG anti-insulina en tampón fosfato pH=7

9- Predecir el orden de elución de las siguientes proteínas cuando una mezcla de las mismas se pasa a través
de una columna de Sephadex G-200 (intervalo de fraccionamiento: 10.000 a 200.000): 1) citocromo c
(PM = 13.000), 2) triptófano sintetasa (PM = 117.000), 3) hexoquinasa (PM = 96.000), 4) ATP sulfurilasa
(PM = 440.000), 5) glucosa oxidasa (PM = 154.000) y 6) xantina oxidasa (PM = 300.000).

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BIOSEGURIDAD

CLOROFORMO: El cloroformo es un líquido incoloro de aroma agradable no irritante

y de sabor ligeramente dulce. Se enciende espontáneamente cuando alcanza
temperaturas muy altas.
También se le llama triclorometano y tricloruro de metilo.
Respirar cerca de 900 partes de cloroformo por millón de partes de aire (900
ppm) por corto tiempo puede causar mareo, cansancio y dolor de cabeza. Respirar
aire, ingerir alimentos, o tomar agua que contiene suficiente cloroformo por largo
tiempo puede dañar el hígado y los riñones. El contacto de la piel con grandes
cantidades de cloroformo puede producir ulceración.
METANOL: El compuesto químico metanol, también conocido como alcohol metílico
es el alcohol más sencillo. A temperatura ambiente se presenta como un líquido
ligero (de baja densidad), incoloro, inflamable y tóxico que se emplea como
anticongelante, disolvente y combustible. Su fórmula química es CH 3OH. El metanol
es un líquido incoloro, su ingestión puede producir ceguera, sordera y muerte . Por
evaporación de esta sustancia a 20 °C, puede alcanzarse bastante rápidamente una
concentración nociva en el aire. En la piel puede producir dermatitis y en los ojos,
irritación.

ACETONA: También llamada propanona, es un compuesto químico de fórmula

química CH3(CO)CH3 del grupo de las cetonas que se encuentra naturalmente en el
medio ambiente. A temperatura ambiente se presenta como un líquido incoloro de
olor característico. Se evapora fácilmente, es inflamable y es soluble en agua.
Si una persona se expone a la acetona, ésta pasa a la sangre y es transportada a
todos los órganos en el cuerpo. Si la cantidad es pequeña, el hígado la degrada a
compuestos que no son perjudiciales que se usan para producir energía para las
funciones del organismo. Sin embargo, respirar niveles moderados o altos de
acetona por períodos breves puede causar irritación de la nariz, la garganta, los
pulmones y los ojos; dolores de cabeza; mareo; confusión; aceleración del pulso;
efectos en la sangre; náusea; vómitos; pérdida del conocimiento y posiblemente
coma.
Tragar niveles muy altos de acetona puede producir pérdida del conocimiento y daño
a la mucosa bucal. El contacto con la piel puede causar irritación y daño.
El aroma de la acetona y la irritación respiratoria o la sensación en los ojos que
ocurren al estar expuesto a niveles moderados de acetona son excelentes señales
de advertencia que pueden ayudarlo a evitar respirar niveles perjudiciales de
acetona.

ACIDO ACÉTICO: Es un líquido corrosivo y, por tanto, debe ser manejado con
cuidado apropiado, dado que puede causar quemaduras en la piel, daño
permanente en los ojos, e irritación a las membranas mucosas. Estas quemaduras
pueden no aparecer hasta horas después de la exposición. Los guantes de látex no
ofrecen protección, así que debe usarse guantes especialmente resistentes, como
los hechos de goma de nitrilo, cuando se maneja este compuesto. El ácido acético
concentrado se enciende con dificultad en el laboratorio. Hay riesgo de
inflamabilidad si la temperatura ambiente excede los 39 °C (102 °F), y puede formar
mezclas explosivas con el aire sobre esta temperatura.

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