Biología Celular Vegetal I

Instituto de Ciencias Biológicas

PRACTICO Nº4 5

PLASTIDIOS, CLOROPLASTOS Y FOTOSINTESIS

1. INTRODUCCION

PLASTIDIOS

Los plastidios se originan a partir de plastidios más pequeños e indiferenciados llamados

protoplastidios, son organelos que estructuran básicamente por una doble membrana doble
en cuyo interior se acumulan pigmentos u otras sustancias y se encuentran en el citoplasma
de la célula eucariótica de las plantas u otros vegetales como algas unicelulares y
pluricelulares. Tienen la propiedad de multiplicarse por división binaria, pudiendo además
transformarse un tipo de plastidio en otro (inter-conversión). Los plastidios se pueden
clasificar en fotosintéticamente activos: cloroplastos (predominan pigmentos verdes),
feoplastos (predominan pigmentos pardos) y rodoplastos (predominan pigmentos rojos), que
aparecen en algunas algas y plantas verdes, algas pardas y algas rojas, respectivamente; y en
no fotosintéticamente activos donde encontramos los cromoplastos que presentan pigmentos
coloreados y se encuentran en flores y frutos y aquellos no coloreados o leucoplastos, tales
como amiloplastos (almacenan granos de almidón) y frecuentes en órganos de reserva,
oleoplastos (almacenas gotas de aceites) y aleuronoplastos (almacenan proteínas) comunes
en semillas.

FOTOSINTESIS

La fotosíntesis se realiza en dos etapas bien definidas: La primera, se efectúa a nivel de los
tilacoides y consiste fundamentalmente en la captación de unidades energéticas
denominadas “quanta” (singular quantum) por la clorofila. Con esto existe energía suficiente
para la disociación o ruptura de la molécula de agua, generar poder reductor a la forma de
NADPH para la formación de ATP. La segunda etapa ocurre en el estroma, utiliza el ATP y
el NADPH formado en los tilacoides para fijar el CO2 y producir azúcares.

2. OBJETIVOS
- Reconocer diferentes tipos de plastidios, tales como cloroplastos, amiloplastos y
cromoplastos.
- Conocer la ultraestructura del cloroplasto y distinguir donde ocurren la reacciones de luz y la
fijación del CO2.
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3. MATERIALES 4. ACTIVIDADES

• Elodea 4.1. Plastidios

• 2,6 diclorofenol indofenol 0,1%
• microscopios • Papel filtro (10 cm * 15 cm)
• pimentón • Sacarosa 0,25 M
• cubre y portaobjetos • Tubos de ensayo 4
• papa • Gradillas
• lugol • Papel alusa
• morteros • Gotarios
• Espinaca o acelga • Lámparas
• Alcohol • Hojas cardenal variegado
• Matraz enlermeyer • Lugol
• Gasa • Alcohol 1 litro
• Embudos • Vaso precipitado 1 litro
• Pinzas largas metalicas
4.1.1. Observe a través del microscopio un preparado de hoja de Egeria densa (luchecillo,
planta acuática). Esquematice y rotule.

Conteste el siguiente cuestionario:

¿Qué nombre reciben los plastidios que Usted puede reconocer al interior de las células?;
¿Cuál es su forma?;
¿Qué pigmentos contienen en forma mayoritaria? Indique si se trata de pigmentos
fotosintéticamente activos o no.
¿En qué parte concreta de la célula se encuentran?

4.1.2. Tome un trozo pequeño de cáscara de tomate (Solanum lycopersicum) o pimentón

(Capsicum annuum), raspe suavemente el interior de ésta y enseguida observe al microscopio
dejando el lado brilloso hacia arriba al ponerla sobre el portaobjeto y encima coloque el
cubreobjeto. Enseguida observe al microscopio esquematice y rotule.
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Conteste el siguiente cuestionario

¿Qué organelos se ubican al interior de la célula?
¿Qué tipos de pigmentos se encuentran al interior de dichos organelos?
¿Cuál piensa Usted es su función?

4.1.3. Coloque pequeños y finos cortes de papa (Solanum tuberosum). Agregue una pequeña gota
de lugol. Luego móntelos en un portaobjeto con una gota de agua y ubique el cubreobjeto.
Observe los organelos al interior de las células. Rotule y esquematice.

Conteste el siguiente cuestionario:

¿Qué nombre reciben estos organelos?
¿Cuál es su función? Explique.

4.1.4 Resuma sus observaciones en el siguiente cuadro:

Luchecillo Tomate o Pimentón Papa

Tipo de plastidios

Fotosíntesis/si o no

Pigmentos o
compuestos que
contienen
Función

Ubicación en la
planta (órgano,
tejido)

a. Nombre de los tipos de plastidios observados

b. Señalando si son fotosintéticamente activos o no.
c. ¿Qué pigmentos o compuestos contienen cada uno de ellos?
d. ¿En qué organismos o tipo de células se pueden encontrar?

4.1.5 Observación de cloroplastos, en algas verdes. Observe al microscopio preparaciones de

algas verdes. Anote la forma, número y color de los plastidios. Esquematice y rotule.

- Compare la morfología de los cloroplastos con aquellos del luchecillo - Tiña con lugol los
preparados de algas verdes y note donde hay presencia de almidón. ¿Cómo se denominan esos
corpúsculos? ¿Cuál es su función?
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4.2. Ultraestructura de los Cloroplastos

4.2.1. Rotule el esquema del cloroplasto e indique el sitio que ocurren las reacciones lumínicas y
el ciclo de calvin.
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4.2.2 Identifique las partes que rotuló anteriormente en el esquema en las fotomicrografías
electrónicas de cloroplastos. Coloque nombre a las estructuras.

http://www.sinauer.com/cooper/4e/micrographs0302.html
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5.1 Separación de pigmentos fotosintéticos por cromatografía sobre papel

Los cloroplastos deben su color verde a un pigmento denominado clorofila. Sin embargo, lo que
realidad existe en los cloroplastos es una mezcla de pigmentos representados principalmente por
dos tipos de clorofila (clorofila a y clorofila b), por β caroteno y por xantofilas.
Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad, lo cual permite su separación
cuando una solución de la misma asciende por capilaridad por una tira de papel poroso (papel
filtro), ya que las más solubles se desplazarán a mayor velocidad, pues acompañaran fácilmente
al disolvente a medida que éste va ascendiendo. De esta forma, al cabo de cierto tiempo, a lo
largo del papel filtro se irán situando los distintos pigmentos en forma de bandas coloreadas,
tanto más desplazadas cuanto más solubles sean los pigmentos a que pertenecen y tanto más
anchas cuanto mayor sea la abundancia de estos en la mezcla.

Procedimiento: Colocar en un mortero trozos de hojas de espinaca (Spinacia oleracea) lavadas

(quitando las venaciones más gruesas) junto con 50 o 60 ml de alcohol de 96% y una cucharadita
de arena de cuarzo. Triturar sin golpear hasta que el líquido adquiera una coloración verde
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intensa. Filtrar, recogiendo el filtrado en un matraz. Se obtiene así una solución en alcohol de
pigmentos.
Separación de los pigmentos: La solución antes obtenida se vierte sobre una caja de Petri. Se
coloca un papel de filtro (15 cm de ancho por 10 cm de alto) doblado en ángulo (V) sobre la
solución y se deja en reposo el tiempo necesario.
Realice un esquema del cromatograma, coloca el nombre del pigmento que corresponde a cada
banda coloreada, sabiendo que la velocidad de difusión de cada uno de ellos es la siguiente de
mayor a menor: β caroteno, xantofila, clorofila a, clorofila b.
Preguntas:
¿Por qué utilizamos alcohol para extraer la clorofila?
¿Qué pigmentos son los más abundantes? ¿Cuáles se disuelven mejor en el alcohol? Si
agregásemos benceno a la solución alcohólica inicial, el benceno se teñiría de verde y la solución
alcohólica quedaría de color amarillo naranja. ¿Qué nos indicaría esto?
¿Cuáles son los pigmentos accesorios? y ¿Cuál es su función en el proceso fotosintético?
¿Cuál es rol de la clorofila a?
¿Cuál es la función de la clorofila b?

5.2 Fotosíntesis, “Fase Clara” (Reacción de Hill)

Corte trozos pequeños de hojas de espinaca (Spinacia oleracea) y agregue 20 ml de

sacarosa 0,25 M, deje reposar 5 minutos, luego agite de forma intermitente por 15 minutos.
Filtre a través de la gasa y reciba la solución acuosa en un matraz Erlenmeyer.
Prepare en una gradilla 4 tubos de ensayo (márquelos para no confundirlos). Cubra los tubos
1 y 2 con papel alusa para protegerlos de la luz y luego agregue los siguientes compuestos a
cada tubo:

Tubos Suspensión de Sacarosa 0,25 M 2-6 DICLOROFENOL

Cloroplastos INDOFENOL 0,1 %
1 15 gotas 5 ml. ------------------------
2 15 gotas 5 ml. 4 gotas
3 15 gotas 5 ml. 4 gotas
4 15 gotas 5 ml. ------------------------

Coloque los tubos frente a la fuente lumínica durante 20 minutos, después observe la
coloración de cada tubo. Consideré que el 2 - 6 Diclorofenolindofenol 0,1 % es un colorante
azul que al reducirse (captar electrones) se decolora.
En base a la experiencia anterior, responda lo siguiente:
¿Qué reacción química está ocurriendo en los tubos expuestos a la luz?
¿Qué reacción equivalente ocurre en los cloroplastos en ausencia de 2 - 6
Diclorofenolindofenol?
En el proceso analizado ¿Ha ocurrido transformación de energía luminosa en energía química?
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¿Por qué?
¿Ocurre síntesis de ATP (Fotofosforilación) en esta reacción?
¿De qué factores depende esta síntesis?
¿Por qué empleó una solución de cloroplastos y no una solución de clorofila?

5.25.3 Síntesis de Almidón mediante la fotosíntesis.

A partir de esta experiencia Usted podrá comprobar la síntesis de almidón a partir de la

fotosíntesis. Para detectar almidón en muestras se puede colocar unas gotas de lugol (solución de
yoduro de potasio yodado) sobre la sustancia a testear. Si la muestra adquiere un color azulado
es porque contiene almidón. Esto se puede demostrar haciendo la siguiente prueba: colocar en un
vaso de precipitados un poco de maicena (almidón de maíz) con una cuchara de agua y agregar
unas gotas de lugol. Observar qué color toma la muestra. Este será un control positivo del
método de detección de almidón.

Procedimiento:
a) Seleccionar plantas de cardenal de hojas variegadas en buenas condiciones fisiológicas y
con un buen desarrollo de la superficie foliar para el desarrollo de la actividad.
b) Sacar una hoja, dibujarla y colorearla.
c) Esta misma hoja hervirla en alcohol etílico, para eliminar la coloración conferida por los
pigmentos. Eliminar el alcohol etílico. Colocar las hojas decoloradas, con mucho cuidado
en una cápsula de Petri y agregar unas gotas de lugol.
d) Observe la coloración que adquiere realice un esquema.

¿Qué zona de la hoja da reacción positiva para el almidón?

¿Qué zona da reacción negativa para el almidón?

Interprete los resultados.
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Fundamentos de la Reacción de Hill

En 1937, Robert Hill descubrió que cuando se iluminan extractos de hojas que contienen
cloroplastos se desprende oxígeno y se reduce un aceptor de electrones no biológico añadido
al medio según la reacción de Hill.

2H2O + A ¾ luz ® AH2 + O2

Donde A es el aceptor de Hill, 2,6-diclorofenol indofenol (DCPIP), azul en su estado

oxidado es incoloro en el reducido. Cuando se iluminaba el extracto en presencia del
colorante este se volvía incoloro a la vez que se desprendía oxígeno. En oscuridad ni se
reducía el colorante, ni se desprendía oxígeno. Ésta fue la primera pista de que la energía
absorbida por la luz hace que fluyan electrones desde el agua a un aceptor electrónico.

DCPIP (azul) + H20 DCPIP-H(azul palido) + ½ 02

Además Hill determinó que esta reacción no requería CO 2, ni se reducía en estas

condiciones, disociando por tanto el desprendimiento de oxígeno de la reducción del CO 2.
Años más tarde, Severo Ochoa descubrió que el NADP + es el aceptor electrónico biológico
en los cloroplastos, según la reacción:

2H2O + 2NADP + ¾ luz ® NADPH + 2H+ + O2

5.3 Reacción de Hill PROTOCOLO

Materiales:
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- Hojas frescas de acelga
- Mortero y mano
- Papel Filtro o gasa
- Centrifuga y tubos falcón de 15 ml
- Gradilla para tubos
- Solución de sacarosa 0.5 M
- DCPIP 116 mg/ l ( se disuelve en agua)
- Lampara

METODOLOGÍA:

Aislamiento de cloroplastos:

Pesar 6 g de hojas de acelga previamente desnerviadas y lavadas dos veces con agua
destilada fría. Cortar las hojas en pequeños trozos y macerar en un mortero agregando 2
ml de sacarosa 0.5 M hasta completar 10 ml con la misma solución. (Ver figura 1 (a y b)
a b

Figura 1 a) Acelga trozada en pequeños trozos, b) Macerado de la acelga con solución

0.5 M de sacarosa

Filtrar el homogenado a través de gasa y recogerlo en un tubo falcón de 15 ml (Figura 2 a,

b y c). Centrifugar el filtrado durante 10 minutos a 1000 r.p.m. Traspasar el sobrenadante
a un nuevo tubo Falcón de 15 ml (se elimina el precipitado) y volver a centrifugar durante
10 minutos a 2500 r.p.m. Desecar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 6 ml de
sacarosa 0.5 M.

I
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b
c
a

Figura 2 a) Filtrado de la acelga, b) Centrifugación y c) Resultado del centrifugado a

1000r.pm. Se recuperabrenadante
so y se vuelve a centrifugar 10 m a 2500 r.p.m.

Resuspender el precipitado que se obtiene de la segunda centrifugación en 6 ml de

sacarosa 0.5 M.

Preparar en una gradilla 4 tubos para la reacción de Hill, según la tabla Nº1 (márquelos).
Cubra los tubos 1 y 2 con papel alusa y luego agregue los compuestos que están en la
tabla 1. Los tubos 3 y 4 deben estar expuestos a la luz de la lámpara o colóquelos directos
a los rayos del sol. Dejar reaccionar al menos 30 minutos, ojala una hora.

Tabla Nº1 Reacción de Hill

Tubos Suspención de Sacarosa 0.5 M 2,6 diclorofenol
cloroplastos indofenol (DCPIP)
1 0.5 ml 5 ml ------------
2 0.5 ml 5 ml 4 gotas
3 0.5 ml 5 ml 4 gotas
4 0.5 ml 5 ml ------------
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El resultado esperado de esta actividad se muestra en la figura 3. El primer tubo (1)

corresponde a control negativo, pues no contiene el reactivo 2,6 diclofenol indofenol
(DCPIP), el tubo (2) es aquel tubo que estuvo a resguardo de los rayos de luz, pero si
contenía DCPIP y el tubo (3) estuvo expuesto a los rayos de luz y también contenía
DCPI.

1 2 3

Figura 3. Tubo 1 No contiene DCPI, Tubo 2 contiene DCPI en oscuridad y tubo 3 contiene
DCPIP al sol.
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