Manual Esperma Oms 6 Ed (150-200) .En - Es

Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.
com
1. Introducción
Manual de laboratorio de la OMS para el examen y procesamiento del semen humano, sexta edición
Ni siquiera la evaluación bioquímica de todo el eyaculado podría revelar si los espermatozoides tienen
una exposición anormal al líquido vesicular seminal. La única forma de diagnosticar la EDO mediante
el examen del semen es recolectando las fracciones individuales de la eyaculación y examinando el
contenido, la motilidad y la composición bioquímica del esperma (secreciones de próstata y vesículas
seminales, respectivamente).(13).
examen
2. Básico
Si se diagnostica una secuencia alterada de la eyaculación, existen técnicas quirúrgicas

mínimamente invasivas para tratar la EDO.(266-272), y también puede ser posible reducir la
influencia negativa del líquido vesicular seminal dejando que el hombre recoja toda la
eyaculación directamente en un medio de lavado de esperma.
examen
3. Extendido
3.9.1 Equipo – además del examen de rutina de la eyaculación
Esto incluye cualquier conjunto de dispositivos de recolección de eyaculación que permitan al paciente
recolectar las fracciones de eyaculación en el orden en que son expulsadas.
Fig. 3.8 Dos ejemplos de dispositivos de recogida de eyaculación dividida

exámenes
4. Avanzado
A
técnicas
5. Preparación del esperma
B
de espermatozoides
6. Criopreservación
y control de calidad
7. Garantía de calidad
Reproducido con permiso deUna guía práctica para la andrología práctica de laboratorio, Prensa de la
Universidad de Cambridge(273)
8. Apéndices
3.9.2 Procedimientos del paciente
Se indica al paciente que recolecte las fracciones de eyaculado en el orden en que son
expulsadas, orden que se confirma con el paciente cuando se presentan los viales al
laboratorio. Los viales deben numerarse en orden secuencial, además del etiquetado de
identificación de rutina de los viales.
9. Referencias
136
1. Introducción
Capítulo 3: Examen ampliado
3.9.3 Procedimientos de muestra
Es probable que la formación de coagulos o geles sólo ocurra en fracciones dominadas por la
secreción de vesículas seminales. El examen de las fracciones dominadas por la secreción prostática
puede comenzar después de 5 a 10 minutos de ajuste de la temperatura a 37 °C (para evaluar la
motilidad). Las fracciones con el coágulo se pueden disolver en 30 minutos a 37°C. Las fracciones que
examen
2. Básico
carecen de proteasas de origen prostático pueden resistir la licuefacción por más tiempo.
3.9.4 Examen
La evaluación del volumen, el recuento de espermatozoides, la motilidad y el zinc (marcador

prostático) y la fructosa (marcador de vesículas seminales) se realiza según un examen de rutina de
examen
3. Extendido
eyaculados completos.
3.9.5 Cálculos
Calcular la distribución relativa de volumen, espermatozoides, proporción de espermatozoides

progresivos y marcadores bioquímicos. Primero calcule los números totales en cada fracción,
exámenes
4. Avanzado
luego la distribución relativa en cada fracción (figura 3.9).
Fig. 3.9 Ejemplo de representación gráfica de los resultados de una eyaculación dividida normal de cuatro fracciones, que muestra la distribución de
volumen, espermatozoides, motilidad progresiva, zinc y fructosa.
100 1,80
técnicas
90 1,60
80 1,40
70
Relación molar zinc/fructosa

1.20
Distribución relativa (%)
60
1.00
50
de espermatozoides
0,80
40
0,60
30
20 0,40
10 0,20
0 0.00
Fracción 1 fracción 2 Fracción 3 Fracción 4
Volumen Espermatozoide Progr. Zinc Fructosa Relación molar Zn/Fr
Reproducido con permiso deUna guía práctica para la andrología práctica de laboratorio, Prensa de la Universidad de Cambridge(273)
8. Apéndices
9. Referencias
137
1. Introducción
3.9.6 Interpretación
Se espera que la mayor parte de los espermatozoides se encuentre en el primer tercio de la eyaculación,
dominada por la secreción prostática rica en zinc. Una contribución sustancial de líquido vesicular seminal en
la(s) fracción(es) rica(s) de esperma indica una situación no fisiológica que probablemente obstaculice la
capacidad funcional de los espermatozoides.

examen
2. Básico
La identificación de una fracción de eyaculado con buena motilidad progresiva puede ser útil
para la futura selección de espermatozoides para ART, un hecho descrito mucho antes de la era
de la FIV.(274).
Además, para los laboratorios que no pueden determinar los marcadores de las glándulas accesorias
zinc y fructosa, se puede obtener información útil evaluando la distribución relativa de los
examen
3. Extendido
espermatozoides y la motilidad progresiva, para identificar posibles fuentes de espermatozoides con

mayor probabilidad de éxito en la fertilización.
exámenes
4. Avanzado
técnicas
de espermatozoides
8. Apéndices
9. Referencias
138
1. Introducción
Capítulo 4:
Exámenes avanzados
examen
2. Básico
4.1 Estrés oxidativo seminal y oxígeno reactivo

pruebas de especies................................................. .................................................140
4.2 Evaluación de la reacción acrosómica................................................144
4.3 Evaluación de la cromatina espermática................................................. .......149
examen
3. Extendido
4.4 Flujo y transporte de iones transmembrana en el esperma.................152

4.5 Análisis de esperma asistido por ordenador (casa).........................................155
4.6 Tecnologías emergentes................................................. ................................159
La infertilidad masculina a menudo se debe a una producción insuficiente de espermatozoides, una
morfología anormal de los espermatozoides, una motilidad alterada de los espermatozoides o combinaciones
exámenes
4. Avanzado
de estos. Estos fenotipos se identifican fielmente mediante análisis de semen. Sin embargo, en muchos
pacientes, la infertilidad se debe más bien a una disfunción de los espermatozoides, donde el examen de la
eyaculación arroja parámetros que parecen completamente normales. Los mecanismos que subyacen a la
disfunción del esperma humano siguen siendo enigmáticos. Los espermatozoides humanos tienen que
cumplir una serie de tareas exigentes dentro del tracto genital femenino y deben cubrir distancias de varios
centímetros, donde pueden recibir instrucciones mediante señales químicas y físicas para localizar el óvulo.
Además, los espermatozoides tienen que sufrir una exocitosis acrosómica y una motilidad hiperactivada para
técnicas
atravesar las vestiduras protectoras del óvulo. Los espermatozoides adquieren la mayoría de estas
habilidades sólo dentro del tracto genital femenino durante un proceso de maduración llamado capacitación.
Si bien son esenciales para la fertilización, ninguna de estas funciones de los espermatozoides se evalúa en
un examen de eyaculación clásico.
Para obtener conocimientos más profundos sobre las

de espermatozoides
bases biológicas de la infertilidad por factor masculino, se
ha desarrollado una batería de pruebas funcionales
destinadas a evaluar la competencia de los

espermatozoides humanos para cumplir los procesos
fundamentales esenciales para la concepción.
Para cerrar esta brecha diagnóstica, se requiere una transferencia de conocimientos sobre la
fisiología molecular y celular del esperma a la clínica. Además, implementar investigaciones en el
8. Apéndices
campo de la infertilidad masculina es de fundamental importancia hoy en día, dada la literatura

reciente que evidencia que las alteraciones en los parámetros del semen pueden estar asociadas con
la salud general del individuo.(275). Además, existe evidencia actual de que los contaminantes
ambientales desempeñan un papel importante en la infertilidad masculina.(276), así como en la
disminución documentada del recuento de espermatozoides observada en las últimas décadas.(277).
Se sabe menos sobre si los espermatozoides funcionan de manera necesaria para
9. Referencias
139
1. Introducción
La fertilización también es un espejo de la salud general y de si están influenciados por contaminantes
ambientales. A medida que aumente nuestro conocimiento de los mecanismos moleculares que regulan la
función de los espermatozoides, también aumentarán las oportunidades para el desarrollo de nuevas pruebas
de diagnóstico. Por ejemplo, datos recientes enfatizan la importancia de la compactación y la integridad del
ADN nuclear para determinar la competencia funcional de los espermatozoides humanos. La evidencia
examen
2. Básico
emergente sugiere asociaciones entre la integridad del ADN y la organización de la cromatina en los
espermatozoides y la fertilidad.(278)(Sección 3.2 en la página 86).
De manera similar, los avances en nuestra comprensión de las vías de transducción de señales que
regulan la función de los espermatozoides tendrán implicaciones para el desarrollo de pruebas de
diagnóstico capaces de generar información detallada sobre la naturaleza precisa de los procesos
defectuosos en los espermatozoides de hombres infértiles. Para obtener conocimientos más
examen
3. Extendido
profundos sobre las bases biológicas de la infertilidad por factor masculino, se ha desarrollado una
batería de pruebas funcionales destinadas a evaluar la competencia de los espermatozoides humanos
para cumplir los procesos fundamentales esenciales para la concepción: unión a la zona pelúcida,
exocitosis acrosómica y fusión con la membrana vitelina del ovocito.
Algunas pruebas con fines de investigación requieren que los espermatozoides sean
separados/seleccionados del líquido seminal. Dichos procedimientos deben realizarse lo antes
exámenes
4. Avanzado
posible, y al menos dentro de 1 hora después de la eyaculación, para limitar cualquier daño a
los espermatozoides por parte de células no espermáticas. Además, hay que recordar que la
forma clásica de recoger todo el eyaculado en un recipiente para muestras conduce a
investigaciones de espermatozoides expuestos a entornos no fisiológicos, como el líquido
vesicular seminal.(251, 252)(ver tambiénSección 3.9 en la página 135).
técnicas
4.1 Pruebas de estrés oxidativo seminal y especies reactivas

de oxígeno
4.1.1 Antecedentes
Durante décadas se ha sugerido la hipótesis de que un desequilibrio en las reacciones de reducción-

oxidación (REDOX) dentro del tracto masculino o de las secreciones seminales podría ser perjudicial
de espermatozoides
para la fertilidad.(279-283). Generalmente se acepta que las especies reactivas de oxígeno (ROS)
producidas por los leucocitos son la base de sus efectos nocivos cuando están presentes en niveles
elevados en el semen.Sección 3.4 en la página 108). Sin embargo, todavía no ha habido un estudio
histórico con evidencia decisiva para una prueba determinada o prueba de una relación entre REDOX y
los resultados de la concepción natural o asistida. Sin embargo, en general se acepta que es probable
que el estrés oxidativo sea un modulador importante de la función del esperma humano y de los
resultados de la concepción.(284). Una consecuencia del estrés oxidativo es el daño al ADN del
espermatozoide (Sección 3.2 en la página 86), este es el resultado que se mide con mayor frecuencia,
pero existen varios otros métodos de investigación que pueden usarse para examinar el equilibrio de
antioxidantes y ROS de manera más directa. Desde una perspectiva de diagnóstico clínico, este grupo
de ensayos sólo debe utilizarse e interpretarse con precaución hasta que existan pruebas más
concluyentes de su relevancia diagnóstica. Los procedimientos aquí presentados han sido
ampliamente utilizados en la investigación andrológica, así como en algunos laboratorios de
diagnóstico clínico y reproducción asistida de andrología. Los ensayos que se pueden utilizar para
8. Apéndices
evaluar el equilibrio REDOX o ROS varían tanto en el método como en el tipo de ROS que detectan.
9. Referencias
140
1. Introducción
Capítulo 4: Exámenes avanzados
4.1.2 Luminol
Este método se basa en la respuesta quimioluminiscente del luminol cuando reacciona con un
radical libre. Esta respuesta se puede medir mediante luminometría y calcular el número de
unidades relativas de luz (RLU) por millón de espermatozoides.
examen
2. Básico
4.1.2.1 Procedimiento
Adaptado de Días(285):
1. Prepare una solución madre de luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona) 100 mM en 10 ml de

dimetilsulfóxido (DMSO) pesando 177,1 mg de luminol en un tubo de poliestireno. Envuelva el tubo
examen
3. Extendido
en papel de aluminio, ya que esta solución es sensible a la luz. La solución debe ser estable a
temperatura ambiente pero también puede almacenarse refrigerada.
2. Soluciones de “sonda” de trabajo: luminol 5 mM en DMSO – mediante dilución de 20 µl de solución

madre de luminol en 380 µl de DMSO. Este debe prepararse inmediatamente antes de su uso (sólo
es estable durante 24 horas). Debe estar protegido de la luz.
exámenes
4. Avanzado
3. Se debe permitir que el eyaculado se licue antes de la medición (menos de 30 minutos

pero, de acuerdo con los métodos básicos de examen de eyaculados de la OMS, no más
de 1 hora).
4. Las mediciones en luminometría deben realizarse por duplicado (como mínimo

absoluto).
técnicas
• Para cada eyaculado se prepara un único tubo mezclando 390 µl del eyaculado con 10 µl de
la solución de “sonda” de trabajo. Mezcle con vórtex durante 5 segundos, antes de dividir en
alícuotas al menos para duplicar tubos de medición (o pocillos en una placa).
5. En todos los conjuntos de ensayos debe haber:
• espacios en blanco deDPBSo medios solos

de espermatozoides
• un control negativo de 390 µl de DPBS o medio + 10 µl de “sonda”
• controles positivos, ambos con adición de 50 µl de peróxido de hidrógeno (30%) + 10 µl de

“sonda” de:
• eyacular (340 µl) o

• DPBS o medio (340 µl).
6. Los datos deben tomarse en varias lecturas, espaciadas equidistantemente y en el

orden de cada analito, una vez repetidas, según el tipo de instrumento, y calcular
un promedio.
8. Apéndices
7. Se pueden utilizar controles positivos para evaluar la sensibilidad del ensayo en un entorno específico, mediante
series de diluciones, y también confirmar en cualquier conjunto de ensayos determinado que se produciría la
detección de un resultado significativo.

9. Referencias
141
1. Introducción
8. Los datos se normalizan restando el resultado medio de la muestra del control negativo medio. Esto
se puede corregir por esperma dividiendo por la concentración de espermatozoides en millones por
ml, pero no está claro en ese momento si los resultados por esperma tienen más significado o no
que por muestra, por lo que ambos resultados podrían citarse.
examen
2. Básico
4.1.2.2 Problemas
• Los luminómetros generalmente no están acreditados para diagnósticos in vitro, sino únicamente para
investigación.
• El diseño de los instrumentos (como el volumen de la muestra) y, por tanto, la calibración, la sensibilidad, el
examen
3. Extendido
rango dinámico e incluso las unidades utilizadas varían ampliamente.
• Debido a la variación descrita entre máquinas y metodologías y a la baja calidad de los

estudios de pronóstico, no existen valores de referencia acordados.
• Las fuerzas de corte/mezcla cambian la señal, por lo que los resultados son muy sensibles al
manejo de la muestra y al momento de la medición.
exámenes
4. Avanzado
• El luminol es sensible al pH, los cambios de temperatura y la interferencia de sustancias químicas que a
menudo varían entre los eyaculados, como el ácido ascórbico (disminuye la señal) o las moléculas que
contienen tiol (que aumentan los resultados) y los niveles de otras proteínas presentes.
4.1.3 Potencial de oxidación-reducción

técnicas
Este método se basa en la medición directa del equilibrio REDOX de una muestra por medios
electroquímicos. Como medición integradora de la muestra combinada que requiere una
manipulación mínima y, por lo tanto, es bastante estandarizable, actualmente es un tema de
mucha investigación en subfertilidad. Actualmente sólo existe en el mercado una máquina que
esté protegida por patente. Utiliza sensores de un solo uso para la medición. En uso se deben
utilizar los protocolos más recientes del fabricante, que están más allá de la discusión en este
manual.
de espermatozoides
4.1.3.1 Problemas
• Falta una base de evidencia sólida publicada para el ensayo; Actualmente todavía se considera una
prueba de investigación hasta que surjan datos concluyentes relacionados con el resultado
reproductivo.
• La viscosidad de la muestra y la licuefacción deficiente pueden dificultar el flujo de la muestra y, por tanto,
el llenado de la cámara de referencia.
• Como ocurre con todos los análisis de semen, se debe estandarizar el momento del análisis después de la
eyaculación.
8. Apéndices
4.1.4 Capacidad antioxidante total
Este método está diseñado para evaluar la capacidad de la totalidad del eyaculado para
equilibrar cualquier estrés oxidativo. Por lo tanto, esto mide la capacidad de las enzimas y
sistemas antioxidantes dentro del plasma seminal, así como cualquier antioxidante derivado de
9. Referencias
142
1. Introducción
alimentos o de otro tipo que terminan en el plasma seminal (pero no en los espermatozoides; estos se
eliminan por centrifugación). En el ensayo, los antioxidantes presentes inhiben la oxidación del ácido
2'-azinobis-(ácido 3-etil-benzotiazolina sulfónico) (ABTS) por un catión radical. Fue desarrollado para
usarse, y se usa, en muchos fluidos corporales y, por lo tanto, no es específico del semen.(286). Trolox,
un análogo de la vitamina E (tocoferol), se utiliza para crear un rango estándar, por lo que el ensayo
examen
2. Básico
generalmente se expresa como micromoles de equivalente de Trolox. El ensayo se lee como

colorimétrico, por lo que se requiere un analizador adecuado.
1. Debido a su uso ubicuo en muchos sistemas más allá de la fertilidad, el ensayo está
examen
3. Extendido
disponible en kits preenvasados de varios proveedores. Se deben seguir las

instrucciones de los kits correspondientes. También es posible construir los kits a partir
de ingredientes constituyentes separados adquiridos por separado.
2. Se debe permitir que la eyaculación se licue completamente y luego se centrifuga a

> 1000g durante 15 minutos. Luego se puede eliminar el plasma seminal transparente. Se pueden comprobar 10 µl
de este plasma para confirmar que no hay espermatozoides presentes. Si hay espermatozoides presentes,
exámenes
4. Avanzado
centrifugue nuevamente.
3. El plasma seminal transparente se puede dividir en alícuotas y congelar directamente para su posterior
análisis. Esto puede ser ventajoso al permitir el procesamiento por lotes del ensayo. El laboratorio que
realiza el ensayo debe comprobar y validar la estabilidad de los resultados a cualquier temperatura de
congelación determinada.
técnicas
4. Al prepararse para las mediciones del ensayo, todos los ingredientes deben alcanzar la temperatura
ambiente con anticipación. Todos los componentes del ensayo son sensibles a la luz, por lo que se
debe minimizar la luz tanto como sea posible (por ejemplo, apagando las luces del laboratorio)
mientras se configura y realiza el ensayo.
5. Las mediciones deben realizarse por duplicado (como mínimo absoluto). La

absorbancia se lee a 750 nm.
de espermatozoides
4.1.4.2 Problemas
• Existe una literatura sólida, sólida y claramente definida sobre el procedimiento de ensayo y los agentes
que pueden afectar los resultados en todos los sistemas.(287), pero en términos del uso de este ensayo
para sacar una conclusión médica sobre los parámetros del semen masculino y los efectos de las ROS en la
fertilidad, actualmente todavía se considera una prueba de investigación hasta que surjan datos
concluyentes relacionados con el resultado reproductivo.
• Debido a la variación entre máquinas y metodologías y a la baja calidad de la evidencia para

el pronóstico, no existen límites de referencia basados en la evidencia.
• Lo ideal es que el ensayo se lea en un lector de microplacas debido a la cantidad de duplicados y

estándares.
8. Apéndices
9. Referencias
143
1. Introducción
4.2 Evaluación de la reacción acrosómica
4.2.1 Antecedentes
La integridad de la estructura acrosómica y la capacidad de sufrir exocitosis acrosómica son
examen
2. Básico
necesarias para la fertilidad normal. La reacción acrosómica es un proceso que in vivo ocurre en
las proximidades del ovocito, y que debe tener lugar antes de que el espermatozoide pueda
penetrar las vestiduras del ovocito y fusionarse con el ovocito. Se cree que la entrada de calcio
es un evento iniciador de la reacción acrosómica normal. En casos de teratozoospermia y
oligozoospermia, algunos pacientes pueden tener resultados normales en el examen de la
eyaculación, pero los espermatozoides pueden mostrar alteraciones en la estructura
acrosómica o en la capacidad de responder a estímulos de reacción acrosómica.(288).
examen
3. Extendido
Se sabe que varios estímulos inducen una reacción acrosómica. Entre ellas, las proteínas de la
zona pelúcida.(289)y progesterona(290)se consideran posibles inductores fisiológicos de la
reacción acrosómica en vista de su elevada concentración en la proximidad del ovocito. Otros
estímulos, como los ionóforos de calcio, inducirán la reacción acrosómica, pero los resultados
no están o están menos relacionados con los obtenidos de la reacción acrosómica inducida por
la zona pelúcida.(291). Un metaanálisis reciente(288) demostraron una correlación significativa
exámenes
4. Avanzado
del porcentaje de espermatozoides que reaccionaron con el acrosoma después de la inducción

con estímulos con la tasa de fertilización. El estado acrosómico después de la inducción de la
reacción acrosómica se puede evaluar mediante microscopía o citometría de flujo.(292)con
lectinas marcadas fluorescentemente, comoPisum sativum (aglutinina de guisante) (Sección
4.4.1 en la página 152) oArachis hipogea(lectina de maní) o anticuerpos monoclonales contra el
antígeno acrosómico CD46(293). Inducir la entrada de calcio mediante el uso de un inductor de
la reacción acrosómica es una forma de probar la competencia de los espermatozoides
técnicas
capacitados para sufrir la reacción acrosómica.(294, 295). Sin embargo, se necesitan más
validaciones y evaluaciones antes de que la prueba del estado del acrosoma pueda
considerarse un ensayo clínico de rutina.
Aquí se describirán los procedimientos para la evaluación estática del estado del acrosoma y la
reacción dinámica del acrosoma inducida.
de espermatozoides
4.2.2 Evaluación del estado del acrosoma
El método fue desarrollado originalmente por Cross(296), basado en el estudio de Mortimer et

al.(297), quienes demostraron que la aglutinina de Arachis hipogea (maní) (FITC-PNA) se une a
la membrana acrosómica externa de los espermatozoides. El método fue posteriormente
modificado por Aitken.(294), introduciendo reactivo de hinchazón hipoosmótico (Sección

2.5.13.2 en la página 69) para evaluar la reacción acrosómica sólo en espermatozoides vivos. El
procedimiento es simple y reproducible y produce imágenes muy claras (Figura 4.1 en la
página 147). Es preferible utilizar una preparación de esperma altamente móvil y libre de
contaminantes como leucocitos, células germinales y espermatozoides muertos. Por lo tanto, la
muestra debe lavarse (Sección 5.3 en la página 164) o preparaciones de natación o de
gradiente de densidad (Sección 5.4 en la página 165ySección 5.5 en la página 166), en función
8. Apéndices
de la calidad de la muestra y del protocolo de estudio a seguir.

9. Referencias
144
1. Introducción
4.2.2.2 Reactivos
• Pisum sativumaglutinina (PSA) marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC)
(PSA-FITC)
• Arachis hipogea(maní) lectina aglutinina marcada con isotiocianato de fluoresceína

examen
2. Básico
(FITC) (AHLPNA-FITC)
• DPBS, pH 7,4
• NaCl al 0,9% (9 g/L): disolver 0,9 g de NaCl en 100 ml de agua purificada
• 95% (v/v) de etanol

examen
3. Extendido
• Solución madre de PSA y AHLPNA: diluir 2 mg de PSA-FITC o AHLPNA-FITC en 4 ml de DPBS y

almacenar en alícuotas de 0,5 ml a –20 °C
• Solución de trabajo de PSA: diluir 0,5 ml de solución madre de PSA en 10 ml de DPBS y

almacenar a 4 °C. Esta solución es estable hasta por 4 semanas.
exámenes
4. Avanzado
4.2.2.3 Lavado simple de espermatozoides
1. Mezclar bien la muestra de semen y extraer una alícuota de aproximadamente 0,2 ml.
2. Diluir a 10 ml con solución salina al 0,9 % (9 g/l).

técnicas
3. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos.
4. Retire y deseche todo el sobrenadante excepto 20–40 µl.
5. Resuspender el sedimento de esperma en el sobrenadante restante pipeteando suavemente.
6. Repita el procedimiento de lavado.

de espermatozoides
4.2.2.4 Tratamiento de preparados de esperma purificados
1. Diluir el swim-up (Sección 5.4 en la página 165) o preparaciones de gradiente de densidad una vez
lavadas (Sección 5.5 en la página 166) a 10 ml con tampón para obtener una concentración de 10
millones/ml.
3. Retire y deseche todo el sobrenadante excepto 20–40 µl.
4. Resuspender el sedimento de esperma en un tampón de hinchamiento hipoosmótico durante 30 minutos.

8. Apéndices
6. Quitar y desechar el sobrenadante y resuspenderlo en un pequeño volumen de tampón pipeteando

suavemente.
9. Referencias
145
1. Introducción
4.2.2.5 Preparación de un frotis
1. Prepare réplicas de frotis de esperma de aproximadamente 1 cm de largo a partir de aproximadamente 5 µl de suspensión.
2. Inspeccione los frotis húmedos mediante microscopía de contraste de fases (×400).

examen
2. Básico
3. Asegúrese de que los espermatozoides estén distribuidos uniformemente en los portaobjetos sin formar grumos.
4. Deje secar al aire.
5. Fijar en etanol al 95% (v/v) durante 30 minutos.
6. Deje secar al aire.

examen
3. Extendido
4.2.2.6 Tinción con PSA-FITC
1. Vierta 10 ml de solución de trabajo PSA-FITC o AHL-FITC en un recipiente de tinción vertical.
2. Sumerja los portaobjetos fijados y secados al aire en el tinte PSA-FITC.

exámenes
4. Avanzado
3. Dejar teñir durante más de 1 hora a 4 °C. Los tiempos de tinción más prolongados (hasta 18 horas)
no afectarán los resultados del PSA. Tiempos más cortos (menos de 1 hora) dificultarán la
puntuación del tobogán.
4. Lave cada portaobjetos con agua purificada y monte en un medio soluble en agua (
Sección 2.4.9.5 en la página 48).
técnicas
4.2.2.7 Puntuación
Vea la diapositiva con óptica de fluorescencia con un aumento de ×1000 con inmersión en aceite con
excitación de 450 a 490 nm y una combinación dicroica y de filtro adecuada para observar el pico de
emisión de 519 nm.
de espermatozoides
Clasifique los espermatozoides de la siguiente manera:
• Acrosoma vivo intacto: espermatozoides con cola rizada en la que más de la mitad de la cabeza
tiene una fluorescencia brillante y uniforme (Fig. 4.1); y
• vivos que reaccionaron con el acrosoma: espermatozoides con cola rizada que muestran solo una
banda fluorescente en el segmento ecuatorial o ninguna mancha fluorescente en la región del
acrosoma (Fig. 4.1).
• Por lo general, los espermatozoides muertos no se califican en este ensayo, pero monitorear
el porcentaje de células muertas puede permitir solucionar cualquier error en la puntuación/
procesamiento entre las personas que realizan el ensayo. No se esperaría que el porcentaje
de células muertas fuera significativamente diferente del del semen original.
8. Apéndices
9. Referencias
146
1. Introducción
Fig. 4.1 Ejemplos de espermatozoides viables e inviables, teñidos con FITC-PNA, con acrosoma intacto y reaccionados con acrosoma
Esperma inviable espermatozoides viables

examen
2. Básico
esperma viable con acrosoma intacto
espermatozoides viables que reaccionaron con acrosoma

examen
3. Extendido
exámenes
4. Avanzado
Se muestran espermatozoides con acrosoma intacto, con cabezas proximales teñidas (acrosoma), y
espermatozoides que reaccionaron con acrosoma, con bandas ecuatoriales teñidas o regiones
posacrosomales. Las colas rizadas indican la viabilidad del esperma después del procedimiento HOS
(ver tambiénSección 2.5.13.2 en la página 69).
4.2.2.8 Conteo de espermatozoides que reaccionaron en el acrosoma

técnicas
1. Cuente el número en cada categoría acrosómica (acrosoma intacto y acrosoma reaccionado)

con la ayuda de un contador de laboratorio.
2. Evaluar 200 espermatozoides en cada réplica, para lograr un error de muestreo aceptablemente
bajo.
• Calcule el promedio y la diferencia de los dos porcentajes de espermatozoides que reaccionaron

de espermatozoides
con acrosoma de los portaobjetos replicados.
• Determinar la aceptabilidad de la diferencia conTabla 2.3 en la página 33, la diferencia

máxima entre dos recuentos que se espera que ocurra en el 95% de las muestras
debido únicamente al error de muestreo.
• Si la diferencia entre los porcentajes es aceptable, informe el porcentaje promedio de

espermatozoides que reaccionaron con el acrosoma. Si la diferencia es demasiado grande, vuelva a

evaluar las dos diapositivas.
• Informe el porcentaje de espermatozoides que reaccionaron con el acrosoma al número entero más
cercano.
8. Apéndices
4.2.3 Ensayo de reacción acrosómica inducida
La reacción acrosómica se puede inducir mediante el uso de ionóforos (Reacción acrosómica

después del desafío con ionóforos, ARIC)(298)o mediante el uso de progesterona (reacción
acrosómica después del desafío de progesterona, ARPC)(290)u otros estímulos.
9. Referencias
147
1. Introducción
4.2.3.1 Reactivos
• Se complementó con la solución salina equilibrada de Earle (SEBSS–verSección 8.4 en la página 225
) que contiene 3,0% (30 g/L) de BSA Nota: Si se realiza una inducción de progesterona, se debe
utilizar suero deslipidado/desprovisto de carbón para evitar los efectos de la contaminación de
otras moléculas solubles en lípidos (incluidas las hormonas).
examen
2. Básico
• Dimetilsulfóxido (DMSO)
• Ionphore A23187, solución madre de 1 mmol/L: disolver 5,23 mg de A23187 en 10 ml

de DMSO, progesterona 2–10 µg/ml(299)u otros inductores de la reacción acrosómica
(288). Nota: Es posible que existan requisitos legales con respecto a las precauciones de seguridad y los
riesgos deben evaluarse cuidadosamente antes de usar el ionóforo.
examen
3. Extendido
• Etanol al 70% (v/v).
1. Espere entre 30 y 60 minutos para que el semen fresco se licue por completo.
exámenes
4. Avanzado
2. Prepare el medio inductor de capacitación sEBSS nuevo para cada ensayo.
3. Caliente el medio a 37 °C antes de usarlo, preferiblemente en una incubadora de aire con 5 % (v/v) de CO.
2
4. Preparar una población de espermatozoides altamente móvil, libre de contaminantes como

leucocitos, células germinales y espermatozoides muertos, mediante centrifugación en gradiente
técnicas
de densidad (DGC) (Sección 5.5 en la página 166) o nadar usando medio sEBSS fresco.
5. Prepare tubos de control y réplicas experimentales, cada uno con aproximadamente 1 ml de

suspensión con 1×106espermatozoides móviles.
6. Incubar las suspensiones de esperma durante 3 horas a 37 °C en una atmósfera de 5% (v/v) de CO

en aire
2
para inducir la capacitación (aflojar la tapa del tubo para permitir el intercambio de gases).
Si no hay2 una incubadora de CO disponible, utilice unaHEPES-medio tamponado (Sección 8.4 en la
de espermatozoides
página 225), tapar bien los tubos e incubar a 37 °C en el aire.
7. Agregue 10 µl de solución madre de A23187 (1 mmol/L) a los tubos experimentales replicados para
obtener una concentración final de 10 µmol/L.
8. Añadir 10 µl de DMSO al tubo de control.

9. Incubar todos los tubos a 37 °C durante 15 minutos.
10. Retire una pequeña alícuota de cada tubo para determinar la motilidad.
11. Próximos pasos en cuanto al esperma preparado (Sección 4.2.2.4 en la página 145).
Proceso (Secciones 4.2.2.5y4.2.2.6), puntaje (Sección 4.2.2.7) y contar (Sección

8. Apéndices
4.2.2.8) como se describe arriba en las páginas 146-147.

9. Referencias
148
1. Introducción
4.2.3.3 Control de calidad
• Cada vez que se realiza la prueba se debe analizar una muestra de control positivo (semen de un
hombre cuyos espermatozoides hayan respondido bien previamente al ionóforo o a la
progesterona).
examen
2. Básico
• Cada vez que se prepara un nuevo lote de tinte, realice una prueba cruzada con el tinte antiguo,
utilizando espermatozoides de control positivo con una respuesta conocida, para garantizar que el
tinte se haya realizado correctamente.
4.3 Evaluación de la cromatina espermática

examen
3. Extendido
4.3.1 Antecedentes
La estabilidad de la estructura de la cromatina espermática es de fundamental importancia para el

desarrollo y la calidad del embrión, probablemente debido a la protección y rápida disponibilidad del
genoma paterno.(300). La alteración de la estabilidad de la cromatina espermática se asocia con una
menor fecundación en reproducción asistida(301). Las anomalías en la estructura de la cromatina del
exámenes
4. Avanzado
espermatozoide pueden provocar daños en el ADN del espermatozoide, como roturas de hebras
simples o dobles, debido a una compactación defectuosa del ADN (es decir, anomalías en la
sustitución de histonas por protaminas). La normalidad de la cromatina espermática se puede evaluar
mediante la evaluación de las roturas de las cadenas de ADN (Sección 3.2 en la página 86) o mediante
colorantes que se unen a histonas (azul de anilina) o ácido nucleico (cromomicina A3) y se evalúan
histológicamente o mediante citometría de flujo.
técnicas
4.3.2 Evaluación del azul de anilina
El azul de anilina (AB) se une a los residuos de lisina de las histonas. El porcentaje de espermatozoides
teñidos con AB se puede evaluar en semen completo o seleccionado (swim-up o preparado en
gradiente de densidad (verSección 5.5 en la página 166)) espermatozoides.
de espermatozoides
4.3.2.1 Protocolo
reactivos
• El polvo de AB se disuelve en agua que contiene ácido acético glacial al 4% (pH 3,5) a una
concentración final del 5%.
Procedimiento
1. Toma 1×106espermatozoides (no menos de 200 000 espermatozoides, en caso de que no se

disponga de 1 millón).
2. En caso de semen completo, lavar los espermatozoides dos veces en cualquier medio de cultivo de esperma
(Sección 5.3 en la página 164) (centrifugar a 500g durante 5 minutos a temperatura ambiente). En caso de
espermatozoides seleccionados, centrifugar una vez a 500 g durante 5 minutos.

8. Apéndices
3. Retire el sobrenadante y fije el sedimento en 50 µl de paraformaldehído al 4% (concentración

final: 200 000 espermatozoides/10 µl) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Coloque una gota de 10 µl de la muestra y déjela secar al aire.
5. Sumerja el portaobjetos en solución AB durante 7 minutos a temperatura ambiente.

9. Referencias
149
1. Introducción
6. Lave el portaobjetos dos veces con agua para eliminar el exceso de tinte.
7. Deje que el portaobjetos se seque al aire.
8. Evalúe bajo un microscopio óptico, inmersión en aceite (objetivo de ×100 y aumento ocular
examen
2. Básico
de ×10–12,5). Se deben puntuar al menos 200 espermatozoides.
Fig. 4.2 Ejemplo de espermatozoides AB positivos (a) y AB negativos (b) en microscopía

óptica (×1000, inmersión en aceite)
examen
3. Extendido
exámenes
4. Avanzado
técnicas
de espermatozoides
De Marchiani et al.(302)
4.3.2.2 Problemas
•
La puntuación puede resultar difícil en algunos casos. En particular, pueden surgir dificultades en caso de
aglutinación de espermatozoides.
• La puntuación depende del operador.
4.3.3 Evaluación de cromomicina A3

8. Apéndices
La cromomicina A3 (CMA3) compite con las protaminas por unirse al surco menor de la hélice
del ADN. El porcentaje de espermatozoides teñidos con CMA3 se puede evaluar ya sea en
semen completo o en espermatozoides seleccionados por swim-up.
9. Referencias
150
1. Introducción
4.3.3.1 Protocolo
reactivos
1. Prepare la solución madre de CMA3:
examen
2. Básico
• Prepare el tampón McIlvaine (20 ml para almacenar a temperatura ambiente):
• Añadir 16,47 ml de una solución de Na

2
HPO40,2 M y 3,53 ml de una solución de ácido cítrico
0,1 M10.
• Añadir MgCl2para alcanzar una concentración final de 10 mM. El pH debe ser 7,0.
examen
3. Extendido
• Disuelva 5 mg de polvo de CMA3 en 10 ml de tampón McIlvaine para obtener una solución madre
2X. Se pueden almacenar alícuotas de solución madre de CMA3 a –20 °C.
2. En el momento de su uso, diluir alícuotas de esperma 1:1 en tampón McIlvaine para obtener una
concentración final de CMA3 de 0,25 mg/ml.
Procedimiento
exámenes
4. Avanzado
1. Toma 1×106espermatozoides (no menos de 400 000 espermatozoides, en caso de que no se

disponga de 1 millón).
• En caso de semen entero, lavar los espermatozoides dos veces en cualquier medio de cultivo de
esperma (Sección 5.3 en la página 164) y centrifugar a 500 g durante 5 minutos a temperatura
ambiente.
técnicas
• En caso de espermatozoides seleccionados, centrifugar una vez a 500 g durante 5 minutos.
2. Retire el sobrenadante y fije el sedimento en 50 µl de paraformaldehído al 4% (concentración

final: 400 000 espermatozoides/10 µl) durante 30 minutos a temperatura ambiente.
3. Tomar 20 µl de la muestra y centrifugar a 300 g durante 7 minutos a temperatura ambiente.
4. Retire el sobrenadante y lave una vez dentro.DPBScentrifugando a 300 g durante 7 minutos a

de espermatozoides
temperatura ambiente.
5. Retire el sobrenadante, agregue 100 µl de solución CMA3 (0,25 mg/ml) e incube durante 20
minutos a temperatura ambiente.
6. Añadir 200 µl de tampón McIlvaine y centrifugar a 300 g durante 7 minutos a temperatura

ambiente.
7. Deseche el sobrenadante, resuspenda el sedimento en 10 µl de tampón McIlvaine y colóquelo en un portaobjetos.
8. Deje que la gota se seque al aire, agregue una gota de DPBS y coloque un cubreobjetos sobre ella.
9. Lea con un aumento de 1000× (inmersión en aceite) con un microscopio de fluorescencia (longitud
8. Apéndices
de onda de excitación: 445 nm, longitud de onda de emisión: 575 nm). Se deben puntuar al menos
200 espermatozoides.
9. Referencias
151
1. Introducción
Fig. 4.3 Ejemplos de espermatozoides positivos para CMA3 (a) y negativos para CMA3 (b) (panel izquierdo)
examen
2. Básico
examen
3. Extendido
exámenes
4. Avanzado
técnicas
En el panel derecho (campo brillante) es posible visualizar la presencia de espermatozoides CMA3 negativos en el mismo campo.
de espermatozoides
Adaptado de Marchiani et al.(303)
4.3.3.2 Problemas
• La puntuación puede resultar difícil en algunos casos. En particular, pueden surgir dificultades en
caso de aglutinación de espermatozoides o en caso de fondo fluorescente.
• La puntuación depende del operador.
4.4 Flujo y transporte de iones transmembrana en el esperma

8. Apéndices
4.4.1 Antecedentes
El análisis funcional del flujo y transporte de iones transmembrana en los espermatozoides puede ser un
camino a seguir en la búsqueda de herramientas de diagnóstico para comprender mejor la infertilidad por
factor masculino y los trastornos de los órganos reproductivos masculinos. Navegación,

9. Referencias
152
1. Introducción
La capacitación, la hiperactivación y la exocitosis acrosómica están orquestadas por

cambios en el pH intracelular (pH), el
i
voltaje de membrana (V ) y el Ca intracelular.2+
metro
concentración ([Ca2+] ). Estos

i
eventos de señalización están mediados por la interacción de
canales iónicos, intercambiadores y transportadores únicos, en su mayoría específicos de los
espermatozoides, por ejemplo, CatSper Ca.2+canales, vSlo3 K+canales, H 1 H+canales, na+/H+
examen
2. Básico
intercambiadores (sNHE, NHA1, NHA2), Ca2+ATPasas (PMCA4) y Mg2+transportadores (CNNM2,

CNNM4). Muchos casos de disfunción espermática aún inexplicable podrían deberse a la
función defectuosa de una o más de estas proteínas. En apoyo de esta idea, las aberraciones
genéticas que afectan a los genes CatSper, la función o expresión defectuosa de CatSper y la
función defectuosa del canal de K+ se han asociado con la infertilidad masculina.(304). Hasta el
momento, faltan procedimientos de diagnóstico rutinarios para evaluar la función de los
canales iónicos, intercambiadores y transportadores en el esperma de los pacientes. Sin
examen
3. Extendido
embargo, se han desarrollado protocolos de investigación para investigar (con un rendimiento

bajo a medio) la actividad de los canales iónicos en el esperma de pacientes en el marco de
estudios clínicos.
4.4.2 Electrofisiología y Ca cinético2+fluorimetría para evaluar la

función de CatSper
exámenes
4. Avanzado
El canal CatSper, específico de los espermatozoides y activado por progesterona, controla la entrada
de Ca2+en el flagelo, afectando así el comportamiento de natación. La pérdida de la función CatSper se
asocia con la infertilidad masculina y el fracaso de la FIV(304-307), lo que sugiere que los
espermatozoides disfuncionales de CatSper pueden fertilizar solo usando ICSI.
La función de CatSper en el esperma humano puede estudiarse mediante electrofisiología y

técnicas
fluorimetría cinética de Ca2+, respectivamente. Los espermatozoides móviles se purifican mediante el

procedimiento swimup o DGC. Los registros electrofisiológicos de las corrientes CatSper de esperma
humano se realizan en soluciones que carecen de iones divalentes en la configuración de célula
completa, con el electrodo de vidrio colocado en la gotita citoplasmática o en la región del cuello. Una
vez que se establece el sello de un gigaohmio (una medida de resistencia eléctrica, GΩ) y la
configuración de la celda completa, se pueden evocar corrientes CatSper monovalentes prototípicas
mediante la despolarización del voltaje de la membrana. La falta de atenuación significativa de estas
corrientes indica una disfunción de CatSper.
de espermatozoides
Para California2+fluorimetría, los espermatozoides en suspensión están cargados con un Ca fluorescente2+
tinte indicador (por ejemplo, Fura-2 o Fluo-4). Para eliminar el exceso de indicador extracelular
después de la carga, los espermatozoides se sedimentan mediante centrifugación y se resuspenden
en tampón nuevo,
i
y [Ca2+] del esperma en suspensión se controla mediante la emisión de
fluorescencia de los indicadores, por ejemplo en placas de microtitulación o en una cubeta utilizando
un lector de placas de fluorescencia o un espectrómetro, respectivamente. La fluorescencia emitida
por el Ca2+El indicador se registra antes y después de la inyección de un agonista de CatSper (p. ej.,
progesterona, prostaglandinas), tampón (control negativo) y Ca2+ionóforo ionomicina (control positivo)
en los pocillos o en la cubeta. Fallo de los agonistas de CatSper, pero no de la ionomicina, para
aumentar la fluorescencia, es decir, [Ca2+] , es indicativo de una pérdida de
i
la función CatSper.
Recientemente, esta técnica identificó a dos pacientes infértiles que padecían una pérdida de la
función CatSper. El diagnóstico genético reveló que la pérdida de la función CatSper y, por tanto, la
infertilidad se debía a una aberración genética que afectaba a un gen CatSper. Es de destacar que
8. Apéndices
también un solo espermatozoide [Ca2+] se utilizaron imágenes para estudiar

i
CatSper en esperma de
pacientes para obtener información sobre espermatozoides individuales, por ejemplo, la fracción de
células sensibles y la presencia de subpoblaciones. Este hallazgo reveló que una sensibilidad reducida
a la progesterona es común en pacientes subfértiles y se correlaciona con la tasa de fertilización.(308).
9. Referencias
153
1. Introducción
4.4.3 Métodos electrofisiológicos y fluorimétricos para estudiar la

función del K+canales
La función de K+Los canales, es decir, Slo3, en el esperma humano se pueden estudiar con un
rendimiento bajo y medio utilizando grabaciones de parche de células completas y fluorimetría V, metro
respectivamente. Slo3 representa el principal K+Canal en el esperma humano. Es activado por Ca2+y,
examen
2. Básico
por lo tanto, establece el potencial de membrana del espermatozoide humano en una [Ca2+] -moda
dependiente.
i
En registros electrofisiológicos de células enteras, el uso de soluciones extracelulares que contienen

iones divalentes para suprimir las corrientes CatSper y un K+Solución de pipeta basada en, las
corrientes prototípicas de Slo3 pueden evocarse mediante la despolarización del voltaje de la
membrana. Este enfoque llevó al descubrimiento de varios pacientes con K anormal+actividad del
examen
3. Extendido
canal y potencial de membrana en reposo despolarizado, así como una baja tasa de fertilización en la
FIV.
Un enfoque de detección de rendimiento medio para evaluar K+La actividad del canal en los
espermatozoides se basa en indicadores fluorescentes sensibles al voltaje. Estos indicadores notifican metro
cambios de V como cambios en su emisión de fluorescencia, por ejemplo mediante una redistribución
metro
dependiente de V entre el medio extracelular y el citoplasma. Para la detección, los espermatozoides,

exámenes
4. Avanzado
ya sean purificados o diluidos del eyaculado, se incuban con el indicador durante algunos minutos.
Posteriormente, se registra la fluorescencia en la población en placas de microtitulación o en una
cubeta utilizando un lector de placas de fluorescencia o un espectrómetro, respectivamente, o a nivel
unicelular mediante citometría de flujo. Posteriormente, los espermatozoides son desafiados con el K+
-ionóforo valinomicina y soluciones que contienen diferentes K+concentraciones. La valinomicina
ajusta el potencial de membrana al K respectivo+-Potencial de Nernst. De este modo, la fluorescencia
se puede convertir en valores de Vm, lo que permite cuantificar el potencial de membrana en reposo
técnicas
(V ) del espermatozoide, denominado K.+Calibración de punto nulo. Varios estudios que utilizaron este
descansar
enfoque para determinar V y, por lo tanto, indirectamente K+-La actividad del canal en el esperma
descansar
humano sugirió una relación entre V y la tasa de fertilización en la FIV. descansar
4.4.4Métodos para detectar (mal)funcionamiento de transportadores e intercambiadores de iones

de espermatozoides
Hasta el momento, no existen técnicas para evaluar con un rendimiento razonable la actividad de los intercambiadores
y transportadores de iones en el esperma humano. Por lo tanto, su papel en la disfunción de los espermatozoides sigue
siendo difícil de alcanzar.
4.4.5 Resumen
En la última década, tecnologías nuevas y emergentes han demostrado que la función de los espermatozoides
(y, por tanto, la fertilización) está orquestada por un conjunto único de canales iónicos, transportadores e
intercambiadores, en su mayoría específicos de los espermatozoides. Sin embargo, las disfunciones de estos
componentes clave de señalización no pueden detectarse mediante un análisis de semen de rutina. Para la
mayoría de estas proteínas, faltan pruebas funcionales y las técnicas actuales para evaluar la función CatSper
o Slo3 son demasiado exigentes para implementarlas en el laboratorio clínico. Por lo tanto, para obtener más
8. Apéndices
información sobre los mecanismos patológicos que subyacen a la disfunción de los espermatozoides, se
requiere un conjunto de pruebas novedosas y fáciles de usar adecuadas para una integración perfecta en el
marco del análisis de semen actual.

9. Referencias
154
1. Introducción
4.5 Análisis de esperma asistido por ordenador (CASA)
4.5.1 Uso de CASA para evaluar la motilidad de los espermatozoides

examen
2. Básico
4.5.1.1 Antecedentes
Los sistemas CASA se utilizan mejor para el análisis cinemático de espermatozoides, ya que pueden
detectar y analizar células móviles. Las estimaciones del porcentaje de motilidad pueden no ser
confiables, ya que dependen de la determinación del número de espermatozoides inmóviles y los
desechos pueden confundirse con espermatozoides inmóviles.
examen
3. Extendido
Muchos factores afectan el rendimiento de los instrumentos CASA, por ejemplo, la preparación de
muestras, la velocidad de fotogramas, la concentración de espermatozoides y la profundidad de la
cámara de recuento.(45, 46, 136, 309, 310). Sin embargo, se pueden obtener resultados fiables y
reproducibles si se siguen los procedimientos adecuados.(309). Directrices sobre el uso de CASA(311,
312)Se debe consultar y todos los miembros del personal deben recibir capacitación adecuada tanto
en el uso del equipo CASA como en las fortalezas y debilidades de la tecnología.
exámenes
4. Avanzado
Al utilizar CASA para obtener parámetros de movimiento, se deben analizar las huellas de al
menos 200 espermatozoides móviles por muestra. Esto implica que será necesario detectar
muchos más espermatozoides. Si se van a clasificar los espermatozoides por tipo de
movimiento, o si se planean otros análisis de variabilidad dentro de un espécimen, se
necesitarán las huellas de al menos 200, y si es posible 400, espermatozoides móviles.
El instrumento CASA debe estar vinculado a un software informático que permita la

técnicas
organización de datos y el análisis estadístico. Las distribuciones de muchos de los parámetros

del movimiento no son gaussianas; Por lo tanto, la mediana, más que la media, es más
apropiada como resumen de la tendencia central de cada variable. Es posible que sea necesario
transformar matemáticamente las mediciones de espermatozoides individuales antes de
realizar ciertos análisis estadísticos.
de espermatozoides
Cada unidad CASA debe instalarse correctamente para garantizar un funcionamiento óptimo. Los
fabricantes indican configuraciones específicas, pero los usuarios deben verificar que la herramienta
esté funcionando para proporcionar el grado necesario de confiabilidad y reproducibilidad. Es esencial
el uso de materiales de control de calidad adecuados, como grabaciones de vídeo (Sección 8.6.2 en la
página 235). Algunos autores analizan los sistemas CASA en sus trabajos.(46, 309, 312-314).
4.5.1.3 Preparación de la muestra de esperma
Las muestras de esperma para CASA deben recolectarse y prepararse como se describe en el Capítulo 2. El
sistema CASA debe mantener la muestra a una temperatura estable de 37 °C, ya que el movimiento del
esperma humano es sumamente sensible a los cambios de temperatura. Las características de motilidad y
8. Apéndices
concentración de espermatozoides se pueden evaluar en el eyaculado sin diluir, siempre que no haya un
exceso de residuos u otros contaminantes. La motilidad de los espermatozoides se puede calcular en
muestras con una concentración de espermatozoides de 2×106/ml a 50×106/ml(102), dependiendo del sistema
CASA. A menudo pueden producirse errores en muestras con una alta concentración de esperma (por
ejemplo, superior a 50×106/ml). Estas muestras deben diluirse, preferiblemente con líquido seminal del mismo
paciente. Si este es un análisis de semen crudo:

9. Referencias
155
1. Introducción
1. Centrifugue una porción de la muestra de esperma a alta velocidad (hasta 16 000 g o el máximo disponible) durante
6 minutos para obtener líquido seminal libre de espermatozoides.
2. Diluir la muestra de semen nativo con plasma seminal puro para lograr una concentración inferior a
50×106/ml.
examen
2. Básico
Cabe señalar que esto aún puede cambiar las propiedades del semen; por lo tanto, los
parámetros de motilidad que se rigen por efectos fluidodinámicos (viscosidad,
viscoelasticidad) u otros factores ambientales podrían estar sujetos a alteración.
Las cámaras de recuento desechables con una profundidad de 20 µm proporcionan resultados de

motilidad fiables y, por lo general, se deben puntuar dos cámaras. Deben analizarse varios campos de
examen
3. Extendido
visión representativos. No se ha estudiado en detalle cómo afecta la elección exacta de estos campos a
los resultados. Sin embargo, los campos deben abarcar toda el área de la cámara y los sistemas
sugieren que un análisis mínimo de seis campos de visión por cámara (12 campos de visión en total)
generalmente da un resultado confiable. Si es posible, se deben evaluar al menos 200
espermatozoides móviles en cada cámara. Se utilizan principios similares de control de calidad como
evaluación estándar de la motilidad (Sección 2.4.6 en la página 23). Las muestras se pueden analizar
inmediatamente o después del registro. El análisis de las grabaciones se presta a una mejor
exámenes
4. Avanzado
estandarización y procedimientos de control de calidad (Sección 8.6.2 en la página 235).
Existe cierto desacuerdo sobre cuánto tiempo se deben observar los espermatozoides para lograr resultados
precisos, pero al menos 1 segundo es suficiente para mediciones CASA básicas.(46). La duración de la
observación de las células nadadoras puede tener un impacto significativo en los resultados.
(315); Las comparaciones entre análisis de diferente duración deben realizarse con cuidado.
técnicas
4.5.1.4 Terminología CASA
Algunas variables estándar medidas con sistemas CASA, como se muestra en la Fig. 4.4, son:
• VCL, velocidad a lo largo del camino curvilíneo (μm/s): la velocidad promedio en el tiempo de la cabeza del
espermatozoide que se mueve a lo largo del camino trazado por el esperma como se describe en dos
dimensiones bajo un microscopio;

de espermatozoides
• VSL, velocidad a lo largo de la trayectoria en línea recta (μm/s): la velocidad calculada a lo largo de
una línea recta entre el primer y el último punto de la trayectoria;
• VAP, velocidad a lo largo de la trayectoria promedio (μm/s): la velocidad promedio en el tiempo

calculada a lo largo de la trayectoria promedio. Esto se define como una trayectoria curva suave,
calculada según el algoritmo integrado en el sistema CASA; Estos algoritmos son diferentes en
diferentes sistemas, por lo que los valores pueden no ser comparables entre sistemas o con
diferentes parámetros de adquisición, como la velocidad de fotogramas.
• ALH, la amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (μm): la magnitud del desplazamiento
lateral de la cabeza del esperma alrededor de la trayectoria promedio. ALH a menudo se expresa
como el valor máximo o promedio de dichos desplazamientos. Los diferentes sistemas CASA
calculan ALH utilizando diferentes algoritmos, por lo que los valores pueden no ser comparables.
8. Apéndices
• MAD, desplazamiento angular medio (grados): valores absolutos promediados en el

tiempo del ángulo de rotación instantáneo de la trayectoria curvilínea. Cabe señalar
que esto no mide el ángulo de giro de la dirección en la que apunta la cabeza del
espermatozoide.
9. Referencias
156
1. Introducción
• Otras medidas comúnmente utilizadas se derivan del cálculo de estas cinco

variables:
• LIN, linealidad: linealidad de la trayectoria curvilínea (velocidad en línea recta / velocidad

curvilínea);
examen
2. Básico
• WOB, oscilación: una medida de oscilación de la trayectoria curvilínea respecto de la trayectoria
promedio (velocidad de trayectoria promedio/velocidad curvilínea);
• STR, rectitud: linealidad de la trayectoria promedio (velocidad en línea recta / velocidad de

trayectoria promedio); y
examen
3. Extendido
• BCF, frecuencia de cruce de ritmo (Hz): la frecuencia promedio a la que la trayectoria curvilínea
cruza la trayectoria promedio. Sin embargo, cabe señalar que se ha demostrado que el BCF no se
correlaciona con la frecuencia del latido flagelar.(316).
• D, dimensión fractal: la evaluación cuantitativa de las propiedades de “llenado de espacio” de las

curvas en un plano(310).
exámenes
4. Avanzado
Fig. 4.4 Terminología estándar para variables medidas por sistemas CASA
camino en línea recta VSL
promedio cabeza rastreada

centroides
técnicas
camino
con línea no recta
camino
VCL ALH angular

VAP desplazamiento
de espermatozoides
Nota:Los diferentes instrumentos CASA utilizan diferentes algoritmos matemáticos para calcular muchas de estas variables de
movimiento. Aún no se conoce la comparabilidad de las mediciones entre todos los instrumentos.
4.5.2 Uso de CASA para evaluar la hiperactivación de los espermatozoides
La hiperactivación es un fenómeno biológico importante del esperma humano que se

manifiesta a través de la capacitación (el proceso de adquirir la capacidad de fertilizar) y que
comprende un cambio de comportamiento en la forma de onda flagelar. La hiperactivación
suele caracterizarse por un aumento de la amplitud del latido flagelar, una disminución de la
frecuencia del latido y una guiñada no progresiva de lado a lado.(317).
8. Apéndices
Los complejos parámetros del movimiento flagelar de los espermatozoides hiperactivados

resultan difíciles de identificar de forma fiable e inequívoca mediante análisis manuales. Como
resultado, los autores han propuesto varios algoritmos y sistemas informáticos para el análisis
cuantitativo del movimiento de los espermatozoides individuales para evaluar los estereotipos
de motilidad. Estos análisis se han basado en cantidades derivadas.
9. Referencias
157
1. Introducción
siguiendo el movimiento de la cabeza(318, 319). Las capacidades computacionales modernas

permiten la evaluación simultánea de los parámetros cinéticos de miles de espermatozoides y
su clasificación.(320). La medición directa de la forma de onda flagelar también se puede utilizar
para comprender con mayor precisión el cambio en los parámetros cinemáticos durante la
hiperactivación.(321).
examen
2. Básico
4.5.3 Uso de CASA para evaluar la morfología del esperma
El análisis de imágenes tiene el potencial de generar importantes avances en la cuantificación, objetividad y
reproducibilidad en la evaluación de la morfología del esperma. Hay sistemas comerciales disponibles para
cuantificar la morfología de la cabeza y la pieza intermedia del espermatozoide, y posiblemente de la pieza

examen
3. Extendido
principal. Sin embargo, los defectos de la cola que afectan la motilidad se pueden evaluar más directamente
utilizando CASA para medir la motilidad y el movimiento. El uso de sistemas CASA para la evaluación
morfológica se basa en un alto nivel de estandarización y calidad de la tinción de las células, con resultados
fácilmente sesgados debido a la variación en la tinción. Por esta razón, los sistemas de tinción automatizados
a menudo pueden ser una combinación sensata para CASA en cuanto a morfología, para ayudar a eliminar la
variación.
exámenes
4. Avanzado
Los sistemas automatizados de análisis de morfología tienen el potencial de lograr una mayor objetividad,
precisión y reproducibilidad que los sistemas manuales.(95). La precisión y la reproducibilidad pueden ser al
menos del 92%(322), que es superior a la evaluación manual realizada por un técnico experimentado. Sin
embargo, la reproducibilidad y precisión de los resultados de la evaluación morfométrica del esperma asistida
por ordenador (CASMA) pueden verse comprometidas por inconsistencias metodológicas, como el enfoque, la
iluminación, la preparación de las muestras y la tinción.(323, 324), y por dificultades técnicas para diferenciar
correctamente las cabezas de esperma de los restos seminales, particularmente cuando la concentración de
técnicas
espermatozoides es baja(322, 324-326). La naturaleza de la evaluación automatizada significa que no hay
forma de compensar los defectos y artefactos de la preparación. Por lo tanto, pequeñas diferencias en el
sombreado del fondo en relación con la tinción celular pueden dar como resultado una clasificación incorrecta
o una incapacidad para identificar la célula como un espermatozoide, con el consiguiente sesgo en los
resultados.
Al igual que con la evaluación manual de la morfología, los procedimientos e instrumentos deben
estandarizarse y mantenerse un control de calidad para garantizar resultados comparables y
de espermatozoides
confiables. El semen podrá tratarse como se describe en la sección sobreEyaculaciones viscosas o

cargadas de desechos en la página 45para reducir el fondo de las grabaciones CASMA. Si la
concentración de espermatozoides es baja (< 2×106/ml), las muestras deberán concentrarse mediante
centrifugación, como se describe en la sección sobreEyacula con baja concentración de
espermatozoides en la página 45. Sin embargo, cabe señalar que la centrifugación puede afectar la
morfología del esperma y se debe registrar su uso.
Dos estudios han informado relaciones significativas entre los resultados de CASMA y los criterios de
valoración de fertilidad. Coetzee et al.(327)descubrieron que los resultados automatizados de la
morfología normal del esperma son predictores significativos tanto de las tasas de fertilización in vitro
como del embarazo. Garrett y cols.(102)encontró que el porcentaje de espermatozoides en el semen
que exhibían una morfología de la cabeza característica de aquellos que están unidos a la zona
pelúcida (“zona preferida”, %Z) junto con la velocidad en línea recta (VSL) en el semen se relacionaban
significativa e independientemente con la natural. tasas de embarazo en un gran grupo de parejas
8. Apéndices
subfértiles. Las relaciones tanto de %Z como de VSL con la fertilidad parecían ser continuas y no se
identificó ningún valor umbral por encima del cual no hubiera ningún aumento adicional en la tasa de
embarazo. Se requieren más estudios sobre los resultados de fertilidad, así como sobre la función y
los trastornos de los órganos reproductivos masculinos, en grandes poblaciones para perfeccionar la
aplicación de CASA para medir la morfología del esperma.
9. Referencias
158
1. Introducción
Los sistemas automatizados pueden ser útiles para obtener datos de investigación adicionales (incluso sobre
subpoblaciones morfológicas de espermatozoides, integridad de la membrana plasmática, índice de energía
de los espermatozoides)(328-330)y para sistemas de control de calidad, pero se necesita más investigación
para demostrar sus beneficios con fines clínicos.

examen
2. Básico
La falta de IQC puede provocar una gran cantidad de errores CASA entre sistemas y
laboratorios. Por lo tanto, es necesario estandarizar el proceso y QC para CASA.(331). A pesar de
los resultados emergentes de estudios comparativos(332-337), todavía no hay pruebas
suficientes que permitan el uso del análisis informático CASA en la práctica clínica amplia.
4.6 Tecnologías emergentes

examen
3. Extendido
En los últimos años, se han desarrollado muchas tecnologías emergentes que son
potencialmente capaces de aumentar significativamente la eficiencia y el conocimiento
del análisis informático en un futuro próximo. Estas tecnologías se pueden clasificar en
computacionales (desarrollos algorítmicos) o tecnológicas (incorporación de nuevos
dispositivos o pruebas funcionales).
exámenes
4. Avanzado
4.6.1 Avances computacionales
Los avances en los algoritmos de procesamiento de imágenes están permitiendo el análisis de

espermatozoides en mayor número y con más detalle de lo que era posible anteriormente. Se ha
demostrado que los nuevos sistemas pueden extraer las huellas de células individuales en muestras
con una concentración de células mucho mayor que el CASA tradicional, como se muestra en la figura
técnicas
4.5a. (338, 339). Se ha demostrado que el uso de mediciones cinemáticas CASA para clasificar los
espermatozoides en diferentes subpoblaciones mejora la comprensión y el seguimiento de los
cambios en la motilidad celular.(320).
Yendo más allá de las medidas de motilidad derivadas de la cabeza, ahora es posible rastrear
automáticamente la forma de onda flagelar de las células nadadoras (verFigura 4.5b en la página 160
)(316). Si bien se requiere más cuidado al tomar imágenes de las células para garantizar que el flagelo
latente sea visible y enfocado, el seguimiento del flagelo puede permitir una abundante variedad de
de espermatozoides
posibilidades diagnósticas, toxicológicas y terapéuticas en la investigación del esperma humano. La

visualización del latido flagelar en un líquido de viscosidad conocida también permite evaluar la
energía gastada por la célula o su variación en la población.
Además de los sistemas CASA comerciales, se han desarrollado varias ofertas de código abierto o
disponibles gratuitamente para aumentar el acceso a análisis asistidos por computadora.(316, 340).
Comentario:Se debe tener cuidado al emplear tecnologías emergentes que

no han sido certificadas para uso clínico, pero se debe fomentar su uso para
investigar más a fondo cuestiones de investigación.
4.6.2 Avances tecnológicos

Cada vez más, el desarrollo de CASA y otros avances computacionales emergentes se
8. Apéndices
complementa con el uso de tecnologías adicionales para mejorar la calidad y el acceso a

los diagnósticos.
9. Referencias
159
1. Introducción
Los sistemas CASA existentes, normalmente diseñados para uso en laboratorio, suelen ser caros e
inaccesibles. El uso de teléfonos inteligentes puede tener un gran potencial para el análisis de
esperma porque son móviles, están equipados con cámaras digitales de alta calidad y se pueden
conectar fácilmente a un microscopio.(341). Actualmente, los dispositivos basados en teléfonos
inteligentes no pueden lograr la calidad y precisión necesarias para un análisis de semen completo; sin
examen
2. Básico
embargo, el uso generalizado de dichos dispositivos podría resultar útil como medio para que los
hombres busquen asesoramiento médico, investigación y tratamiento causal temprano y adecuado.
Se debe tener cuidado al emplear tecnologías emergentes que no han sido certificadas para uso
clínico, pero se debe fomentar su uso para investigar más a fondo cuestiones de investigación.
Fig. 4.5 Ejemplos de expresiones gráficas de diferentes aplicaciones CASA

examen
3. Extendido
(a) (b)
exámenes
4. Avanzado
a) Imagen típica codificada por colores de una muestra densamente concentrada durante 10 segundos bajo un objetivo de 10 aumentos (cada trayectoria
técnicas
representa un espermatozoide móvil)(339); b) La forma de onda flagelar de un espermatozoide (de izquierda a derecha): en medios de baja viscosidad, en medios
de alta viscosidad e hiperactivados(316)

de espermatozoides
8. Apéndices
9. Referencias
160
1. Introducción
Capítulo 5:
preparación de esperma
examen
2. Básico
técnicas
5.1 Introducción................................................. ................................................. ......161
examen
3. Extendido
5.2 Principios generales................................................. ..........................................163

5.3 Lavado sencillo................................................. ................................................164
5.4 Natación directa................................................. .................................................165
5.5 gradientes de densidad discontinuos................................................. ........166
5.6 Clasificación de células de activación magnética (macs)..........................................166
5.7 Preparación de muestras de semen infectado por el VIH........................................167
5.8 Preparación de los espermatozoides testiculares y epididimarios...............167
exámenes
4. Avanzado
5.9 Preparación de muestras de eyaculación retrógrada.................................169

5.10 Preparación de muestras de eyaculación asistida........................................170
5.1 Introducción
técnicas
5.1.1 Justificación
Es posible que sea necesario separar los espermatozoides del plasma seminal para diversos fines, como
pruebas de diagnóstico e investigación para la competencia funcional, evaluación de los efectos de la
composición de los medios y recuperación de espermatozoides para tecnologías de reproducción asistida
(ART). La premisa bajo la cual se consideran las técnicas de preparación de espermatozoides para TRA es
asegurar la buena calidad del esperma y la eliminación de factores perjudiciales para la fertilización. Si se van
a realizar pruebas de la función de los espermatozoides, es fundamental que los espermatozoides se separen
de espermatozoides
del plasma seminal dentro de la hora siguiente a la eyaculación, para limitar cualquier daño causado por
células no espermáticas.(284)y para reducir los efectos perjudiciales del aumento de la osmolalidad que se
produce en los eyaculados conservados in vitro(147, 342).
Una técnica ideal de preparación de espermatozoides

debería recuperar una población de espermatozoides
altamente funcional que preserve el ADN y no induzca
disfunción a través de la producción de ROS por parte
de los espermatozoides y los leucocitos.

8. Apéndices
9. Referencias
161
1. Introducción
Aunque algunos componentes del plasma seminal mixto parecen ayudar a los espermatozoides
a penetrar el moco cervical en comparación con, por ejemplo,tirodo solución (Overstreet et al.,
1980), el impacto negativo del líquido vesicular seminal en la motilidad de los espermatozoides,
la supervivencia y la protección del ADN de los espermatozoides está bien documentado. (13,
256), al igual que la presencia de “factores incapacitantes” en el plasma seminal
examen
2. Básico
(343). Además, algunos componentes del plasma seminal son obstáculos para lograr el
embarazo cuando se superan las barreras naturales en el ART, como la IIU o la FIV. La
separación de los espermatozoides humanos del plasma seminal y su procesamiento para
obtener una preparación final que contenga un alto porcentaje de células morfológicamente
normales y móviles, con daño reducido en el ADN, libre de desechos, células no germinales y
espermatozoides muertos, es importante para la práctica clínica y la investigación. umbrales
pronósticos.
examen
3. Extendido
5.1.1.1 Elección del método
La elección de la técnica de preparación del esperma está dictada por la naturaleza de la muestra de
semen.(344, 345)y su finalidad. Para la reproducción asistida, incluidos los procedimientos de FIV, las
técnicas de preparación de esperma deben producir una población de espermatozoides con un daño
exámenes
4. Avanzado
mínimo en el ADN.(346). Una técnica ideal de preparación de espermatozoides debería recuperar una
población de espermatozoides altamente funcional.(347)que preserva el ADN y no induce disfunción a
través de la producción de ROS por los espermatozoides y los leucocitos(348, 349). Los
espermatozoides recuperados deben tener una morfología adecuada y conservar la motilidad
funcional para el tipo de TAR que se esté considerando. Se ha sugerido diluir el semen con medios de
cultivo y centrifugar para preparar muestras normozoospérmicas para la IIU.(345, 350), mientras que
la elección del método también viene dictada por la indicación o el propósito de uso. Por ejemplo, la
técnicas
técnica de natación directa es útil para seleccionar espermatozoides móviles, ya que refleja la
capacidad móvil de los espermatozoides para nadar en el medio de cultivo. Los estudios han
demostrado que la fragmentación del ADN, caracterizada por la presencia de daño en el ADN de una o
dos cadenas, se correlaciona negativamente con los resultados del TAR.(346, 351, 352)(Sección 3.2 en
la página 86). Tanto la técnica de swim-up directo como la de pellets redujeron significativamente la
tasa total de fragmentación del ADN, aunque el swim-up de pellets implica centrifugación, lo que
podría afectar otros parámetros funcionales de los espermatozoides.(353, 354). La técnica de natación
directa se utiliza a menudo cuando las muestras de semen se consideran en gran medida normales,
de espermatozoides
mientras que en casos de oligozoospermia, teratozoospermia o astenozoospermia severa,

generalmente se prefiere la DGC debido al mayor rendimiento y, por lo tanto, al mayor número total
probable de espermatozoides móviles recuperados. Los gradientes de densidad también se pueden
alterar para optimizar el manejo de propiedades específicas de muestras individuales: se puede
reducir el volumen total del material del gradiente, limitando la distancia a la que sedimentan los
espermatozoides y maximizando la recuperación total de espermatozoides móviles, o se puede
aumentar el tiempo de centrifugación para muestras con alta viscosidad.
Cada laboratorio debe determinar la fuerza centrífuga y el tiempo de centrifugación necesarios para
formar un gránulo de esperma manejable. Cuando el número de espermatozoides es
extremadamente bajo, puede ser necesario modificar la fuerza centrífuga o el tiempo, para aumentar
las posibilidades de recuperar el máximo número de espermatozoides. Las modificaciones de los
tiempos recomendados y las fuerzas centrífugas deben probarse rigurosamente antes de la
8. Apéndices
implementación clínica. El método de preparación más adecuado puede identificarse a partir de la

capacidad funcional de los espermatozoides preparados, determinada, por ejemplo, por la motilidad
de los espermatozoides (Sección 2.4.6 en la página 23) y vitalidad (Sección 2.4.7 en la página 26).
9. Referencias
162
1. Introducción
Capítulo 5: Técnicas de preparación de esperma.
5.1.1.2 Eficiencia de la separación de espermatozoides del plasma seminal y manejo de
organismos infecciosos
La eficacia de una técnica de selección de espermatozoides suele expresarse como el número absoluto
de espermatozoides, el número total de espermatozoides móviles o la recuperación de
espermatozoides móviles morfológicamente normales. Swim-up generalmente produce una menor
examen
2. Básico
recuperación de espermatozoides móviles (< 20%) que DGC (> 20%). Swim-up y DGC también producen
diferentes niveles de contaminación con componentes seminales en la preparación final de esperma.
Utilizando el zinc de la secreción prostática como marcador de componentes seminales solubles, se ha
demostrado una difusión del zinc dependiente del tiempo desde el semen hacia el medio flotante
superpuesto.(355). La concentración final de zinc en las preparaciones swim-up fue mayor que la
obtenida después de la preparación con gradiente de densidad.
examen
3. Extendido
Las muestras de semen pueden contener agentes infecciosos dañinos y los técnicos deben manejarlas
como un riesgo biológico con extremo cuidado. Además de eliminar los espermatozoides de baja
calidad, incluidos los inmóviles, la preparación del esperma debe permitir la eliminación de otras
células, como leucocitos y bacterias.(356), así como sustancias tóxicas o bioactivas.(347). Las técnicas
de preparación de esperma no pueden considerarse 100% efectivas para eliminar agentes infecciosos
del semen (Sección 5.7 en la página 167). Pautas de seguridad, como se describe enSección 8.2 en la
página 214, debe observarse estrictamente. Las buenas prácticas de laboratorio son fundamentales
exámenes
4. Avanzado
para la seguridad del laboratorio(48, 357).
5.2 Principios generales
Algunas de las técnicas de preparación de esperma disponibles se describen en las siguientes

secciones. Para todos ellos, el medio de cultivo sugerido es una solución salina equilibrada
técnicas
suplementada con proteínas y que contiene un tampón adecuado a las condiciones

ambientales en las que se procesarán los espermatozoides. Para los procedimientos de
reproducción asistida, como ICSI, FIV e inseminación artificial, es imperativo que la albúmina
sérica humana esté altamente purificada y libre de contaminación viral, bacteriana y previa. La
albúmina diseñada específicamente para tales procedimientos está disponible comercialmente.
Para fines de diagnóstico, se puede utilizar BSA mucho menos costoso (Sección 8.4 en la
página 225). Si la incubadora contiene sólo aire atmosférico y la temperatura es de 37 °C, el
medio debe estar tamponado (verSección 8.4.1 en la página 225). El cumplimiento de esto
de espermatozoides
asegurará que el pH del cultivo sea compatible con la supervivencia de los espermatozoides. La
disposición final de los espermatozoides procesados determinará qué medio tamponado es el
adecuado. Por ejemplo, los ensayos de función de los espermatozoides en general requerirán
un medio que admita la capacitación de los espermatozoides, que normalmente contiene
bicarbonato de sodio (25 mmol/L).
El semen para ART debe recolectarse de manera estéril (Sección 2.5.12 en la página 68). Las
técnicas y materiales estériles son esenciales a la hora de aplicar una técnica de preparación de
esperma para aplicaciones terapéuticas.
Nota:Aunque los medios se pueden preparar en el laboratorio, cabe señalar que el

rendimiento de la solución y su seguridad no se pueden controlar con precisión.
Generalmente se espera que, cuando estén disponibles, en ART se utilicen medios
comercialmente fabricados, probados y aprobados para uso terapéutico.
8. Apéndices
A continuación se proporcionan ejemplos de medios que se pueden preparar o comprar, pero

esto no es una recomendación para su uso terapéutico en ART.
9. Referencias
163
1. Introducción
5.3 Lavado sencillo
Este sencillo procedimiento de lavado proporciona un alto rendimiento de espermatozoides si

las muestras de semen son de buena calidad, pero no elimina los restos ni los leucocitos
presentes en el semen.
examen
2. Básico
5.3.1 Reactivos
• BWW,EBSS,SEBSS,htf(disponible comercialmente o verSección 8.4 en la página 225) u otros

medios patentados y adecuadamente probados y fabricados, complementados
preferiblemente con albúmina sérica humana (HSA) o suero, como se describe a continuación
examen
3. Extendido
• HSA, altamente purificada y libre de endotoxinas y contaminación viral, bacteriana y

priónica.
• Suplemento de HSA: a 50 ml de medio añadir 300 mg de HSA, 1,5 mg de piruvato de sodio,

0,18 ml de lactato de sodio (jarabe al 60% (v/v)) y 100 mg de bicarbonato de sodio.
exámenes
4. Avanzado
• Suplemento de suero si es necesario (p. ej., a los medios no propietarios descritos): a 46 ml

de medio añadir 4 ml de suero del paciente inactivado por calor (56 °C durante 20 minutos),
1,5 mg de piruvato de sodio, 0,18 ml de lactato de sodio ( 60% (v/v) de jarabe) y 100 mg de
bicarbonato de sodio.
5.3.2 Procedimiento
técnicas
1. Mezclar bien la muestra de semen.
2. Diluir toda la muestra de semen 1+1 (1: 2) con medio para promover la eliminación del
plasma seminal.
3. Transfiera la suspensión diluida a varios tubos de centrífuga, preferiblemente con no

más de 3 ml por tubo.
de espermatozoides
4. Centrifugar a 300–500 g durante 5 a 10 minutos.
5. Aspire y deseche con cuidado los sobrenadantes.
6. Resuspender los gránulos de esperma combinados en 1 ml de medio pipeteando suavemente.

7. Centrifugar nuevamente a 300–500 g durante 3–5 minutos.
8. Aspire y deseche con cuidado el sobrenadante.
9. Resuspender el sedimento de esperma, pipeteando suavemente, en un volumen de medio apropiado para
su disposición final, por ejemplo, inseminación.

8. Apéndices
El número de lavados para eliminar el plasma seminal se puede reducir utilizando menos tubos y
aumentando el volumen en cada tubo. Si se hace esto, se debe aumentar la fuerza centrífuga y la
duración de la centrifugación para garantizar la sedimentación completa de los espermatozoides, por
ejemplo, 500 a 600 g durante 8 a 10 minutos. Tenga en cuenta que la fuerza de centrifugación varía
con el radio y el número de revoluciones por minuto (rpm) (consulteSección 8.2.2 en la página 217
para el cálculo de fuerzas centrífugas).
9. Referencias
164
1. Introducción
5.4 Natación directa
Los espermatozoides pueden seleccionarse por su capacidad para nadar fuera del plasma
seminal y entrar en el medio de cultivo. Esto se conoce como la técnica del “swim-up”. Es
preferible no diluir ni centrifugar el semen antes del swim-up, ya que esto puede provocar
examen
2. Básico
daños peroxidativos en las membranas del esperma.(348). Por lo tanto, la natación directa de
los espermatozoides del semen es el método preferido para separar los espermatozoides
móviles.(por ejemplo, 45, 46). La técnica de natación directa se puede realizar colocando capas
de medio de cultivo sobre el semen licuado o colocando capas de semen licuado debajo del
medio de cultivo. Luego, los espermatozoides móviles nadan hacia el medio de cultivo. Este
procedimiento proporciona un menor rendimiento de espermatozoides que el lavado, pero los
selecciona por su motilidad y es útil cuando el porcentaje de espermatozoides móviles en el
examen
3. Extendido
semen es bajo, por ejemplo, para FIV e ICSI.
5.4.1 Reactivos
• BWW,EBSSoSEBSS(Sección 8.4 en la página 225) suplementado preferiblemente con HSA o suero,

como se describe a continuación
exámenes
4. Avanzado
• HSA, altamente purificada y libre de endotoxinas y contaminación viral, bacteriana y

priónica.
• Suplemento de HSA: a 50 ml de medio añadir 300 mg de HSA, 1,5 mg de piruvato de sodio,

0,18 ml de lactato de sodio (jarabe al 60% (v/v)) y 100 mg de bicarbonato de sodio.
técnicas
• Suplemento de suero: a 46 ml de medio añadir 4 ml de suero del paciente inactivado por

calor (56 °C durante 20 minutos), 1,5 mg de piruvato de sodio, 0,18 ml de lactato de sodio
(jarabe al 60% (v/v)) y 100 mg. de bicarbonato de sodio.
5.4.2 Procedimiento
1. Mezclar bien la muestra de semen.

de espermatozoides
2. Coloque 1 ml de semen en un tubo de centrífuga cónico estéril de 15 ml y coloque suavemente

1,2 ml de medio encima. Alternativamente, pipetee el semen con cuidado bajo el medio
de cultivo.
3. Incline el tubo en un ángulo de aproximadamente 45° para aumentar el área de superficie de la

interfaz del medio de semencultivo e incube durante 1 hora a 37 °C.
4. Vuelva a colocar suavemente el tubo en posición vertical y retire 1 ml superior de medio. Este
contendrá espermatozoides altamente móviles.
5. Dilúyalo con 1,5–2,0 ml de medio.
6. Centrifugar a 300–500 g durante 5 minutos y desechar el sobrenadante.

8. Apéndices
7. Resuspender el sedimento de espermatozoides en 0,5 ml de medio para evaluar la concentración de

espermatozoides, la motilidad total y la motilidad progresiva (Sección 2.4.6 en la página 23 y
Sección 2.4.8 en la página 28).
8. La muestra podrá utilizarse directamente con fines terapéuticos o de investigación.

9. Referencias
165
1. Introducción
5.5 gradientes de densidad discontinuos
Los gradientes de densidad discontinuos se pueden utilizar como un método eficaz y adaptable para
recolectar esperma de alta calidad para ART. Puede proporcionar una buena selección de
espermatozoides móviles, libres de otros tipos de células y desechos. Es más fácil de estandarizar que
examen
2. Básico
la técnica de natación y, por tanto, los resultados son más consistentes. Esta técnica se utiliza para
recuperar y preparar espermatozoides para su uso en FIV e ICSI.
Este método utiliza la centrifugación del semen sobre gradientes de densidad que consisten en sílice coloidal
recubierta con silano, que separa las células únicamente por su densidad. El método de preparación más
utilizado es un método simple de preparación de gradiente de densidad discontinuo en dos pasos. Se deben
seguir las instrucciones de los fabricantes.(ver 84). La preparación de espermatozoides mediante

examen
3. Extendido
centrifugación en gradiente de densidad (DGC) generalmente da como resultado una fracción de
espermatozoides altamente móviles, libres de desechos, leucocitos contaminantes, células no germinales y
células germinales en degeneración.
Hay varios productos comerciales disponibles para hacer gradientes de densidad adecuados para el
procesamiento del semen. Cualquier desviación de las recomendaciones procesales debe basarse en
evidencia. La mayoría de los medios de gradiente de densidad contienen componentes de masa molecular
exámenes
4. Avanzado
relativa alta que tienen una osmolalidad inherentemente baja, por lo que generalmente se preparan en un
medio que es isoosmótico con los fluidos del tracto reproductivo femenino.
5.5.1 Reactivos y procedimiento
Prepare y utilice según las instrucciones del fabricante, como se analizó anteriormente. Se debe
técnicas
tener cuidado si se preparan grandes volúmenes de gradiente, ya que es susceptible a la

contaminación por microorganismos. Si alguno se observa al microscopio, debe desecharse.
5.6 Clasificación de células de activación magnética (MACS)
La llegada de la ART, en particular cuando se requiere recuperar espermatozoides para la concepción

de espermatozoides
asistida, como la ICSI en el caso de infertilidad por factor masculino, ha llevado al desarrollo de
ensayos adicionales para la recuperación funcional optimizada de los espermatozoides, libres de
daños significativos en el ADN.
Una revisión sistemática Cochrane(358)no observaron diferencias clínicas o de nacidos vivos entre
MACS y espermatozoides seleccionados mediante unión de ácido hialurónico (HA-ICSI) u otras técnicas
de selección, en nacidos vivos. Además, se ha observado una mayor fragmentación del ADN después
de la DGC, lo que resulta en una menor probabilidad de embarazo entre las parejas de FIV/ICSI.(354).
5.6.1 Reactivos y equipos para la recuperación de espermatozoides mediante MACS
• htf-modificadoHEPESbuffer
8. Apéndices
• Microesferas o microperlas conjugadas con anexina V
• AnexoinVmicrobeadkit (Miltenyi Biotec, Huburn, CA, EE. UU.; kit de anexina V

MACSGoodManufacturing Practice (GMP), Miltenyi Biotec, Alemania)
9. Referencias
166
1. Introducción
• Columna de separación o imán con globo de hierro (Mini MACS, Miltenyi Biotec)
• Tubos Eppendorf (1,5 ml)
• Centrífugo
examen
2. Básico
• Incubadora.
5.6.2 Procedimiento
1. Se suspende una alícuota de 0,5 ml de esperma enhtf-modificadoHEPEStampón, obtenido después del

examen
3. Extendido
lavado de esperma para eliminar el plasma seminal, o antes de la DGC, cuando se agrega el procedimiento.
2. Centrifugar y suspender el sedimento en 80 µl de tampón de unión, con 20 µl de microesferas

conjugadas con Anexina V (kit de microperlas Anexina V, Miltenyi Biotec, Huburn, CA, EE. UU.),
durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3. Añadir 400 µl de solución de unión y colocar en una columna de separación y pasar las células no
exámenes
4. Avanzado
marcadas (viables) a través de la columna.
4. La fracción no marcada se recupera y procesa como se describe(359).
5.7 Preparación de muestras de semen infectado por el VIH

técnicas
Si el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) está presente en el semen, el ácido ribonucleico (ARN) viral y
el ADN proviral se pueden encontrar libres en el plasma seminal y en las células no espermáticas. En una
revisión sistemática y metanálisis(360)En el estudio se realizaron 11.585 ciclos de TAR con uso de esperma
lavado entre 3.994 mujeres de parejas VIH discordantes, el 56,3% logró un embarazo clínico y no se produjo
seroconversión del VIH sin supresión viral plasmática. Como los receptores del VIH (CD4, CCR5, CXCR4) se
expresan únicamente en células no espermáticas, se ha propuesto una combinación de DGC seguida de swim-
up como forma de prevenir la infección de parejas femeninas no infectadas.(361, 362), pero también existen
otros métodos validados(363). Estos procedimientos se desarrollaron para separar células no espermáticas
de espermatozoides
infectadas por virus y plasma seminal (en el sobrenadante de gradiente de densidad) de espermatozoides
móviles libres de VIH en el swim-up (del sedimento de gradiente de densidad). Las muestras preparadas
deben analizarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) antes de
su uso, y solo se deben utilizar muestras libres de VIH para el TAR. Si bien los resultados hasta el momento
son alentadores, todavía no hay pruebas suficientes de la eliminación del riesgo de infección por VIH mediante
la preparación de esperma.
Nota:Esta técnica debe utilizarse únicamente en instalaciones seguras para

minimizar el riesgo de contaminación cruzada de muestras libres de VIH.(364).
Evidencia reciente (365-368)demostró que en parejas discordantes, donde se logra
la supresión viral, hay poca o ninguna transmisión del VIH a la pareja.
5.8 Preparación de los espermatozoides testiculares y epididimarios

8. Apéndices
Los espermatozoides recuperados del tejido testicular y del epidídimo requieren una
preparación especial. La indicación típica para la aspiración del epidídimo es la azoospermia
obstructiva más que la disfunción testicular. En consecuencia, se pueden recolectar cantidades
relativamente grandes de espermatozoides con fines terapéuticos. epidídimo
9. Referencias
167
1. Introducción
Los aspirados a menudo se pueden obtener con una contaminación mínima de glóbulos rojos y
células no germinales, lo que hace que el aislamiento y la selección de espermatozoides epididimarios
móviles sean relativamente sencillos. Si se obtienen grandes cantidades de espermatozoides del
epidídimo, la DGC es un método eficaz para prepararlos para su uso posterior.Sección 5.4 en la
página 165). Si el número de espermatozoides es bajo, se puede realizar un lavado simple (Sección
examen
2. Básico
5.3 en la página 164).
Los espermatozoides testiculares se pueden recuperar mediante biopsia abierta (con o sin
microdisección) o mediante biopsia con aguja percutánea. Las muestras testiculares siempre están
contaminadas con células no germinales y una gran cantidad de glóbulos rojos, por lo que se
necesitan pasos adicionales para aislar una preparación limpia de espermatozoides. Para liberar las
espermátidas alargadas unidas a los túbulos seminíferos (“espermatozoides testiculares”), se
examen
3. Extendido
necesitan métodos enzimáticos o mecánicos. Los espermatozoides testiculares están preparados para
la ICSI, ya que el número de espermatozoides es bajo y su motilidad es deficiente.
5.8.1 Método enzimático
1. Incubar el tejido testicular con colagenasa (por ejemplo, 0,8 mg deClostridium

exámenes
4. Avanzado
histolyticum,tipo 1A por ml de medio) durante 1,5 a 2 horas a 37 °C, agitando cada 30

minutos.
Nota:Las enzimas pueden causar daño a los espermatozoides y, si se usan, deben ser
adecuadas para uso terapéutico.
2. Centrifugar a 100 g durante 10 minutos y examinar el sedimento.

técnicas
5.8.2 Método mecánico
1. Macerar el tejido testicular en medio de cultivo con cubreobjetos de vidrio hasta que se produzca
una fina suspensión de tejido disociado.
2. Como alternativa, extraiga las células de los túbulos seminíferos utilizando agujas finas
de espermatozoides
(unidas a jeringas de tuberculina desechables) dobladas paralelas a la base de la placa de

cultivo.
5.8.3 Procesamiento de suspensiones de espermatozoides para inyección intracitoplasmática de espermatozoides
1. Lavar las muestras obtenidas añadiendo 1,5 ml de medio de cultivo.

2. Centrifugar a 300 g durante 8 a 10 minutos.
3. Retire el sobrenadante y resuspenda el sedimento en 0,5 ml de medio de cultivo

fresco.
4. Calcule la motilidad y el número de espermatozoides en el sedimento. (Es posible que sea necesario
8. Apéndices
resuspender algunas muestras con una cantidad baja de espermatozoides en un volumen menor
de medio).
5. Coloque una gota de 5 a 10 µl de medio de cultivo en una placa de cultivo.
6. Cúbralo con aceite mineral (preequilibrado con CO). 2

9. Referencias
168
1. Introducción
7. Introduzca de 5 a 10 µl de la suspensión de esperma en el medio de cultivo.
8. Aspire con cuidado los espermatozoides móviles que se encuentran en la interfaz entre el
medio de cultivo y el aceite con una pipeta ICSI.
examen
2. Básico
9. Transfiérelos a una gotita de solución viscosa, por ejemplo, polivinilpirrolidona (7–10%

(100 g/L) en medio).
5.9 Preparación de muestras de eyaculación retrógrada
En algunos hombres, el semen pasa a la vejiga durante la eyaculación, lo que produce aspermia (sin
examen
3. Extendido
eyaculación aparente). La confirmación de esta situación se obtiene examinando una muestra de orina
posorgásmica para detectar la presencia de espermatozoides. Si el tratamiento farmacológico no es
posible o no tiene éxito, se pueden recuperar espermatozoides de la orina. La alcalinización de la orina
mediante la ingestión de bicarbonato de sodio, por ejemplo, aumentará la probabilidad de que
cualquier espermatozoide que pase a la orina conserve sus características de motilidad.(369).
exámenes
4. Avanzado
5.9.1 No se administrará ningún tratamiento de alcalinización antes de la recolección de esperma.
En el laboratorio se le debe pedir al hombre que:
• orinar sin vaciar completamente la vejiga;

técnicas
• producir una eyaculación mediante masturbación en un recipiente para muestras; y
• orine nuevamente en un segundo recipiente para muestras que contenga medio de cultivo (para alcalinizar
aún más la orina).
5.9.2 Tratamiento de alcalinización administrado antes de la recolección de esperma

de espermatozoides
La alcalinización de la orina se puede lograr bebiendo agua con cloruro de sodio y bicarbonato
de sodio 1 a 2 horas antes de intentar recolectar la eyaculación. Esto se puede combinar con un
tratamiento con estimulador del receptor alfa-1.
En el laboratorio se le debe pedir al hombre que:
•
producir una eyaculación mediante masturbación en un recipiente para muestras; y
• orinar después del orgasmo en un segundo recipiente (volumen mínimo de 500 ml)
5.9.3 Análisis de eyaculados anterógrados y orina postorgásmica
Se deben analizar tanto el eyaculado, si lo hubiera, como las muestras de orina. Debido a que se
8. Apéndices
puede producir un gran volumen de orina, a menudo es necesario concentrar la muestra mediante
centrifugación (500 g durante 8 minutos). La muestra retrógrada, una vez concentrada, y la muestra
anterógrada, si se produce, se pueden procesar más eficazmente utilizando el densificador. método
de preparación de gradiente (Sección 5.5 en la página 166).
9. Referencias
169
1. Introducción
5.10 Preparación de muestras de eyaculación asistida
El semen de hombres con problemas de eyaculación o que no pueden eyacular, puede recolectarse
mediante estimulación vibratoria directa del pene o estimulación eléctrica rectal de los órganos
accesorios. Los eyaculados de pacientes con lesión de la médula espinal con frecuencia tendrán altas
examen
2. Básico
concentraciones de espermatozoides, disminución de la motilidad de los espermatozoides y

contaminación de glóbulos rojos y blancos. Las muestras obtenidas mediante electroeyaculación
pueden procesarse de forma más eficaz mediante DGC (Sección 5.5 en la página 166).
Independientemente del método de preparación, estos tipos de eyaculados suelen contener un alto
porcentaje de espermatozoides inmóviles.
examen
3. Extendido
exámenes
4. Avanzado
técnicas
de espermatozoides
8. Apéndices
9. Referencias
170
1. Introducción
Capítulo 6:
Criopreservación de
examen
2. Básico
espermatozoide
6.1 Introducción................................................. ................................................. ......171
examen
3. Extendido
6.2 Razones para la criopreservación de espermatozoides........................172

6.3 Evaluación de riesgos de la criopreservación y
almacenamiento de semen humano................................................. ..........................174
6.4 Protocolos de criopreservación de semen................................................. .177
6.5 Vitrificación................................................. ................................................. ........182
exámenes
4. Avanzado
6.1 Introducción
La criopreservación de espermatozoides es una parte importante del trabajo de muchos laboratorios

de análisis de semen, particularmente los asociados con clínicas de infertilidad.
La historia de la criobiología del esperma humano se remonta a finales de la década de 1940. El

descubrimiento de que el glicerol protegía a los espermatozoides contra los daños causados por la
técnicas
congelación llevó al uso de espermatozoides humanos almacenados en hielo seco a –79 °C.(370-372).
Posteriormente se utilizó nitrógeno líquido y la criopreservación de semen se desarrolló rápidamente
en muchos países con el establecimiento de bancos comerciales de esperma o servicios nacionales
coordinados.(373-377).
La supervivencia celular después de la congelación y

de espermatozoides
descongelación depende en gran medida de la minimización de
la formación de cristales de hielo intracelulares.
Actualmente se utilizan diversos protocolos de criopreservación con diferentes crioprotectores y

procedimientos de congelación. La supervivencia celular después de la congelación y descongelación

depende en gran medida de la minimización de la formación de cristales de hielo intracelulares. Esto
se logra mediante el uso de crioprotectores apropiados y la aplicación de velocidades de enfriamiento
y calentamiento que minimicen la cantidad de agua intracelular sujeta a la formación de hielo.(
378-380). Si los espermatozoides pasan períodos de tiempo significativos por encima de –130 °C (la
temperatura de transición vítrea), particularmente durante el proceso de descongelación, puede
ocurrir una recristalización, con el crecimiento de cristales de hielo intracelulares potencialmente
8. Apéndices
dañinos. Hay dos categorías de crioprotectores: permeables, como el dimetilsulfóxido (DMSO) y el

glicerol, e impermeables, como las albúminas, los dextranos y el citrato de yema de huevo.
Los espermatozoides humanos toleran una variedad de velocidades de enfriamiento y calentamiento. No son
muy sensibles al daño causado por el rápido enfriamiento inicial (choque de frío), posiblemente debido a la
alta fluidez de la membrana debido a los ácidos grasos insaturados en el lípido.

9. Referencias
171
1. Introducción
bicapa(381). También pueden ser más resistentes que otras células al daño de la
criopreservación debido a su bajo contenido de agua (alrededor del 50%). Sin embargo, la
criopreservación tiene un efecto adverso sobre la función del esperma humano,
particularmente la motilidad. Tras la criopreservación, el porcentaje de espermatozoides
móviles puede disminuir del 50,6% al 30,3%, según los estudios.(382). La optimización del
examen
2. Básico
proceso de criopreservación probablemente minimizará este daño.
Las tasas de embarazo después de la inseminación artificial con semen de donante criopreservado
suelen estar relacionadas con la calidad del esperma después de la descongelación, el momento de la
inseminación y, en particular, factores del receptor, como la edad, embarazos previos con
inseminación de donante y trastornos ovulatorios y de las trompas uterinas.(383). Si el semen se
almacena en condiciones apropiadas, no hay un deterioro evidente en la calidad del esperma con el
examen
3. Extendido
tiempo; Los niños han nacido tras una fecundación con semen almacenado durante más de 28 años.(
384, 385). En casos seleccionados (por ejemplo, cuando hay altos niveles de leucocitos en el semen), la
selección de fracciones de espermatozoides altamente móviles (Capítulo 5 en la página 161) se
recomienda, ya que puede proporcionar una mejor recuperación(386).
6.2 Razones para la criopreservación de espermatozoides

exámenes
4. Avanzado
Se pueden identificar dos áreas amplias de criobancos de semen humano: para uso
futuro propio (TAR autólogo) y banco de donantes (TAR homólogo).
Los espermatozoides pueden almacenarse para su uso futuro por diversas razones según las
directrices nacionales.(371). En particular, según la Sociedad Estadounidense de Oncología Clínica, los
proveedores de atención médica siempre deben ofrecer la criopreservación de esperma a todos los
técnicas
varones pospúberes en edad reproductiva que reciben tratamiento contra el cáncer, ya que es el único
tratamiento eficaz para estos pacientes.(387). También se debe advertir a los hombres sobre un
posible mayor riesgo de daño genético en el esperma recolectado después del inicio de la
quimioterapia o radioterapia, y se debe realizar un banco de esperma antes. En algunos casos, es
posible que sea necesario modificar el procedimiento de criopreservación (Sección 6.2.2).
Los datos actuales no encuentran ninguna diferencia importante en el uso de esperma fresco o
de espermatozoides
criopreservado durante el TAR(388-390), pero cabe mencionar que existen datos que reportan una
mayor fragmentación del ADN después de la criopreservación.(391).
6.2.1 Esperma de donante
Los eyaculados de donantes sanos que se sabe o se presume que son fértiles pueden almacenarse
para uso futuro. En muchos países, el esperma de un donante debe ser puesto en cuarentena durante
6 meses para permitir realizar pruebas al donante para detectar infecciones de transmisión sexual y
determinar que los eyaculados donados no contienen microorganismos como el VIH. Los donantes
pueden ser reclutados por una clínica o un banco de esperma, y sus espermatozoides utilizados de
forma anónima o no de acuerdo con las directrices y legislaciones nacionales. Los espermatozoides de
donantes se pueden utilizar para inseminación artificial, IIU, FIV o ICSI, por ejemplo:
8. Apéndices
• para la pareja de un hombre infértil sin espermatozoides vivos o espermátidas alargadas adecuadas
para ICSI, o cuando el tratamiento ha fracasado o es demasiado costoso;
• para prevenir la transmisión de un trastorno hereditario;

9. Referencias
172
1. Introducción
Capítulo 6: Criopreservación de espermatozoides
• después de abortos espontáneos recurrentes, cuando la inseminación con espermatozoides de donantes puede dar
como resultado un embarazo exitoso;
• para mujeres que desean concebir pero no tienen pareja masculina, en aquellos países
donde esté permitido.
examen
2. Básico
Siempre se debe cumplir con la legislación local y nacional sobre detección

genética y de infecciones.
6.2.2 Preservación de la fertilidad

examen
3. Extendido
Los eyaculados se pueden obtener y almacenar antes de que un hombre se someta a un

procedimiento o exposición que pueda afectar su fertilidad, como:
• vasectomía (en caso de un futuro cambio de situación de pareja o deseo de tener más hijos);
• tratamiento con agentes citotóxicos o radioterapia, que probablemente afecte la

espermatogénesis de forma permanente(387);
exámenes
4. Avanzado
• servicio activo en una ocupación peligrosa, por ejemplo en fuerzas militares, en países donde la
procreación póstuma es aceptable o pueden ocurrir lesiones genitales;
• adultos y adolescentes transgénero de hombre a mujer(392);
• Trauma testicular (en algunas circunstancias después de la extracción de esperma testicular,

técnicas
TESE)(393).
Nota 1:Para la preservación de la fertilidad o el tratamiento de la infertilidad, lo ideal es

almacenar suficientes muestras normales para 10 o más inseminaciones, para garantizar
una buena probabilidad de embarazo.
Nota 2:Como solo se necesita un espermatozoide para la ICSI de cada ovocito, vale
la pena criopreservar cualquier espermatozoide vivo.
de espermatozoides
Nota 3:El almacenamiento del semen recolectado antes de un procedimiento

potencialmente esterilizante a menudo tiene un valor psicológico significativo, porque da
la esperanza de una paternidad futura. En pacientes que van a someterse a terapia con
agentes alquilantes o radioterapia, el semen debe recolectarse antes de iniciar la terapia,
debido al riesgo de mutagénesis en los espermatozoides. Todos los pacientes que
requieran quimioterapia o radioterapia, incluidos los adolescentes.(394), se le debe
ofrecer la posibilidad de almacenamiento de espermatozoides.
6.2.3 Tratamiento de la infertilidad
Los espermatozoides se pueden almacenar para el tratamiento utilizando el esperma del individuo en IIU, FIV o ICSI,
por ejemplo, en casos de:

8. Apéndices
• oligozoospermia severa o presencia intermitente de espermatozoides móviles en el semen (como

respaldo para ICSI)(395), o sujetos Klinefelter (en la pubertad) cuando se puede recolectar una
muestra de semen(396);
• tratamiento de infertilidad que puede no persistir, como cirugía para la obstrucción del tracto
genital o tratamiento con gonadotropinas para el hipogonadismo hipotalámico-pituitario;
9. Referencias
173
1. Introducción
• la necesidad de recolección especial, como eyaculación asistida para pacientes con lesión de
la médula espinal, espermatozoides de eyaculación retrógrada en orina o recolección
quirúrgica del tracto genital;
• pacientes que no pueden proporcionar semen fresco el día de un procedimiento ART

examen
2. Básico
como:
• hombres que no pueden estar presentes en el laboratorio de ART el día de la inseminación o que
tienen dificultades para recolectar semen por razones psicológicas;
• hombres con azoospermia no obstructiva que requieren extracción de esperma testicular;*

examen
3. Extendido
• hombres con lesión de la médula espinal que requieren extracción de esperma testicular;*
• hombres sometidos a vasovasostomía o vasoepdidimostomía por azoospermia

obstructiva con aspiración microquirúrgica del epidídimo o extracción de esperma
testicular para preservar la fertilidad.*
* En estos casos, el procedimiento descrito enSección 6.4.2 en la página 180debe ser

exámenes
4. Avanzado
seguido.
También ha surgido la preocupación de que en parejas con un factor masculino grave, la ART
con esperma de la pareja puede tener mucho menos éxito que la ART con esperma de un
donante.(397).
técnicas
6.2.4 Minimizar la transmisión de enfermedades infecciosas
Para los hombres con VIH controlado con terapia antirretroviral, se pueden almacenar muestras con una
carga viral indetectable para IIU, FIV o ICSI, para intentar concebir y al mismo tiempo reducir el riesgo de
transmisión del VIH a la pareja femenina. De manera similar, en el caso de los hombres que desean
criopreservar el esperma mientras son seropositivos para la hepatitis B o C, por ejemplo, se debe controlar la
carga viral.
de espermatozoides
6.3 Evaluación de riesgos de la criopreservación y almacenamiento

de semen humano
La criopreservación y posterior almacenamiento de espermatozoides humanos es un

proceso muy complejo que impone una responsabilidad especial y potencial al personal
del laboratorio. Al evaluar los riesgos asociados con la criopreservación y el
almacenamiento de semen, se deben considerar las siguientes cuestiones.
6.3.1 Recursos
• Seguridad física de los recipientes, muestras y sala de almacenamiento, para reducir el riesgo de
pérdida por robo o incendio, falla de pajitas, ampollas y recipientes de criopreservación, suministro
8. Apéndices
de nitrógeno líquido.
• Idoneidad del equipo para el uso propuesto
• Sistema de contención y eliminación de nitrógeno.

9. Referencias
174
1. Introducción
• Los tanques deben recibir una alarma cuando el nivel de nitrógeno esté por debajo de un determinado
umbral o la temperatura por encima de un determinado umbral. El nivel de alarma debe configurarse de
modo que avise antes de que se produzca una situación crítica y debe conectarse a un centro de llamadas
que luego avisará al personal del banco de esperma.

examen
2. Básico
6.3.2 Seguridad y protección del personal
• El equipo de protección personal siempre debe estar disponible en el banco. Si es posible,

dos personas deberían estar presentes simultáneamente en el banco; en caso contrario se
deberá avisar al personal externo antes de entrar.
examen
3. Extendido
• Se recomiendan sistemas de alarma para la detección de niveles bajos de oxígeno

atmosférico y acciones correctivas asociadas a estos.
6.3.3 Riesgo de contaminación cruzada
Para reducir el riesgo de contaminación cruzada con agentes infecciosos entre muestras almacenadas
exámenes
4. Avanzado
(por ejemplo, transmisión del VIH o del virus de la hepatitis B (VHB) o C (VHC) a través de un recipiente
de criopreservación), considere:
• tipo de contención de almacenamiento: viales o pajitas y método de sellado de las pajitas (calor o
polímero) y uso de una funda secundaria (pajita dentro de pajita);
• naturaleza del recipiente de almacenamiento: nitrógeno líquido o vapor;

técnicas
• protocolo y método de almacenamiento de muestras de alto riesgo (muestras que se sabe que
contienen o se sospecha que contienen virus). En estos casos, se recomienda y, en algunas zonas,
es obligatorio el uso de tanques separados para cada virus positivo;
• realizar la criopreservación de cada paciente por separado y desinfectar toda la superficie al

finalizar cada procedimiento.
de espermatozoides
Otras precauciones que se pueden tomar para evitar o limitar la contaminación si no se pueden tomar
las precauciones anteriores:
• Esterilización de nitrógeno líquido para evitar la contaminación: útil en caso de

vitrificación donde la muestra se sumerge directamente en nitrógeno líquido.(398);
• recarga periódica de matraces o tanques de almacenamiento Dewar con nitrógeno líquido estéril y
descontaminación anual de los criotanques;
• descontaminación de muestras congeladas antes de calentarlas;
• realizar las pruebas de virus e infecciones de transmisión sexual a todos los hombres al momento de
realizar la banca de la siguiente manera (o de acuerdo con las regulaciones nacionales):

8. Apéndices
• VIH, tipos 1 y 2 (mediante pruebas de ácido nucleico (NAT), que también analizan anticuerpos del
grupo O);
• Prueba del VHB para detectar el antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg), anticuerpo total contra
el antígeno central de la hepatitis B (anti-HBc) (IgG e IgM) y un ensayo NAT para el VHB o una
combinación que incluya el VHB;

9. Referencias
175
1. Introducción
• VHC utilizando anti-VHC y un ensayo NAT para VHC;
• treponema pallidum (es decir, sífilis);
• Chlamydia trachomatis (utilizando un diseño de prueba para detectar en poblaciones

examen
2. Básico
asintomáticas de baja prevalencia);
• neisseria gonorrea (utilizando un diseño de prueba para detectar en poblaciones

asintomáticas de baja prevalencia);
• virus linfotrópico T humano (HTLV), tipos I y II utilizando anti-HTLV I/II;

examen
3. Extendido
• citomegalovirus (CMV) utilizando anti-CMV (total e IgG e IgM).
Nota:Para los donantes de esperma, es posible que se requieran otras pruebas según la
legislación nacional.
6.3.4 Seguridad de las muestras congeladas

exámenes
4. Avanzado
• Divida las muestras y guárdelas en criovasos separados y/o en diferentes sitios para reducir el
riesgo de pérdida total.
• Verifique dos veces la identidad de las muestras en cada paso.
• Utilice etiquetas robustas y códigos de identificación.

técnicas
• Contar con procedimientos para auditorías periódicas del uso del material y de las muestras que quedan
almacenadas.
• Después de un uso prolongado, los tanques de crioalmacenamiento pueden contaminarse. Por

tanto, conviene descontaminarlos periódicamente con soluciones que no reaccionen con el
aluminio o el acero. Se sugiere la descontaminación al menos una vez al año.
• Todos los tanques deben contener alarmas de sensor de bajo nivel para monitorear la temperatura
de espermatozoides
y el nivel de nitrógeno líquido. Los sensores deben estar conectados a una alarma para alertar al
personal del laboratorio de posibles problemas.
Fuentes: (364, 377, 399, 400).
Nota 1:El almacenamiento en fase de vapor en lugar de en el propio nitrógeno líquido puede
reducir el riesgo de contaminación cruzada. Sin embargo, pueden existir grandes gradientes de
temperatura en los recipientes de almacenamiento de vapor, dependiendo de la forma, la carga

de la muestra y el tipo de recipientes de muestra. Si se utiliza almacenamiento en fase de vapor,
asegúrese de que esté en un recipiente diseñado para ese propósito y ratificado según los
estándares internacionales de dispositivos médicos.
Nota 2:Hay disponibles pajitas seguras hechas de resina ionomérica termosellable

para almacenamiento en nitrógeno líquido (pajitas de alta seguridad). Son
8. Apéndices
resistentes a fugas, bacterias y virus y son mecánicamente resistentes a –196 °C.

(364, 377, 400).
9. Referencias
176
1. Introducción
6.4 Protocolos de criopreservación de semen
Se encuentran disponibles varios protocolos de congelación y gestión de bancos de esperma.(377).

Hay varios crioprotectores disponibles comercialmente. Los crioprotectores se clasifican en
permeables (entre los cuales, el glicerol es el más utilizado) y penetrantes o no permeantes (como las
examen
2. Básico
moléculas de azúcar y la yema de huevo). Se pueden utilizar crioprotectores que contengan o no yema
de huevo (como extensores de semen)(377). A continuación se detallan los detalles de un crioprotector
de uso común (glicerol, yema de huevo y citrato (GEYC)) y los procedimientos de congelación por
vapor o controlados por máquina.
Teniendo en cuenta que los espermatozoides criopreservados pueden usarse para generar
embriones, todos los procedimientos deben, si es posible, realizarse bajo una campana de clase A en
examen
3. Extendido
una sala clasificada (al menos D) de acuerdo con las directrices internacionales de buenas prácticas de
fabricación. Los métodos y el entorno de congelación deben documentarse si están por debajo de este
estándar, pero si son legales, no son motivo para negarse a realizar el almacenamiento.
6.4.1 Procedimiento estándar

exámenes
4. Avanzado
6.4.1.1 Preparación del crioprotector GEYC
Nota:Aunque los crioprotectores se pueden preparar en el laboratorio, cabe señalar que

el rendimiento de la solución y su seguridad no se pueden controlar con precisión.
Generalmente se espera que, cuando estén disponibles, se utilicen crioprotectores
fabricados comercialmente, certificados y aprobados para uso terapéutico.Esto es
técnicas
particularmente un problema para los crioprotectores a base de yema de huevo, ya que

podrían estar presentes contaminantes provenientes del alimento para pollos o del
medio ambiente. Los procedimientos que se describen a continuación son muy difíciles
de estandarizar a un nivel adecuado para el uso terapéutico de ART en los laboratorios
locales.
Preparando el GEYC:
de espermatozoides
1. A 65 ml de agua purificada estéril añadir 1,5 g de glucosa y 1,3 g de citrato de sodio

tribásico dihidrato.
2. Agregue 15 ml de glicerol y mezcle bien.
3. Añadir 1,3 g de glicina. Cuando se disuelva, filtrar la solución a través de un filtro de poro de 0,45
µm.
4. Añadir 20 ml de yema de huevo fresca (preferiblemente obtenida de huevos libres de patógenos

específicos), lavar el huevo y quitarle la cáscara. Perforar la membrana que rodea la yema y recoger
con una jeringa (se obtendrán aproximadamente 10 ml de yema por huevo).
5. Colocar toda la suspensión en un baño de agua a 56 °C durante 40 minutos y agitar

ocasionalmente.
8. Apéndices
6. Verifique el pH de la solución. Si está fuera del rango 6,8–7,2, deseche la solución y prepare
una nueva, en caso de que se hayan agregado ingredientes o cantidades incorrectas.
7. En esta etapa se puede realizar un cultivo bacteriano para pruebas de esterilidad.

9. Referencias
177
1. Introducción
8. En esta etapa se pueden realizar pruebas de toxicidad del esperma.
9. Dispensar la solución en alícuotas de 2 ml en un gabinete de trabajo estéril y almacenar a –70 °C.
10. Usar dentro de los 3 meses.

examen
2. Básico
Se encuentran disponibles comercialmente crioprotectores similares al GEYC.
6.4.1.2 Agregar crioprotector al semen
1. Descongele el crioprotector, caliéntelo a temperatura ambiente y mezcle. El calentamiento inicial a 37 °C

examen
3. Extendido
puede ser beneficioso.
2. Las altas concentraciones de glicerol son perjudiciales para los espermatozoides. Por tanto,
es vital tener especial cuidado al añadir y mezclar el crioprotector con el semen.
3. Agregue un volumen de crioprotector GEYC a dos volúmenes de semen, ya sea gota a gota con
agitación, o pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, o gradualmente en cinco adiciones
exámenes
4. Avanzado
con mezcla suave durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Después de agregar todo el crioprotector GEYC, incube la mezcla a 30–35 °C durante 5

minutos.
6.4.1.3 Llenado de pajitas de semen

técnicas
1. Las pajitas de plástico de 0,5 ml son populares debido a sus propiedades de transferencia de calor y su facilidad de
almacenamiento. Se pueden utilizar viales de plástico para almacenar volúmenes mayores.
2. Aspire la mezcla crioprotectora de semen y GEYC en pajitas de plástico para semen de 0,5 ml
o colóquelas en crioviales. Algunas pajitas comerciales cuentan con una “punta de llenado”
desechable que evita que el extremo de la pajita se contamine directamente con semen. Las
pajitas se pueden llenar con un colector en un dispositivo de vacío o un adaptador para
de espermatozoides
colocar sobre el extremo de la pajita. Se llenan hasta que el líquido toca el tapón de algodón,
lo que impedirá que la pajita se vacíe al retirar la succión.
6.4.1.4 Sellado de pajitas de semen
1. Deje un espacio de aire de 1 cm en el extremo inferior golpeando la pajita en el costado del

recipiente. Si utiliza una punta de llenado, este será automáticamente el caso.
2. Selle con calor las pajitas en ambos extremos usando un sellador térmico.
3. Seque el exterior del recipiente con un paño y luego esterilice con alcohol al 70 % (v/v) u otro
descontaminante microbiano.
8. Apéndices
4. Asegúrese de que las pajitas estén etiquetadas con los datos correctos del paciente/donante y de
que estén correctamente selladas en ambos extremos en esta etapa o antes (Sección 6.4.3 en la
página 181).
9. Referencias
178
1. Introducción
6.4.1.5 Enfriamiento y congelación del semen en congeladores programables

Hay congeladores programables disponibles que controlan la inyección de vapor de nitrógeno
líquido en la cámara de congelación.
1. Coloca las pajitas o crioviales en un congelador programable y sigue las

examen
2. Básico
instrucciones del fabricante para activar el programa.
2. Un programa común es enfriar las pajitas a 1,5 °C por minuto desde 20 °C hasta
– 6 °C y luego a 6 °C por minuto hasta –100 °C. Esto lleva unos 40 minutos. Luego, la máquina
mantendrá la cámara a –100 °C durante 30 minutos para permitir retrasos antes de que las
pajitas se transfieran al nitrógeno líquido.
examen
3. Extendido
3. Se pueden utilizar otros procedimientos más complicados, dependiendo de la experiencia de

cada laboratorio.(401).
6.4.1.6 Enfriamiento y congelación del semen manualmente
Los métodos manuales son menos controlables y estandarizados que los congeladores programables,
exámenes
4. Avanzado
pero pueden dar resultados adecuados. Hay muchas alternativas a este procedimiento.
1. Coloque las pajitas en el frigorífico congelador (–20 °C) durante 30 minutos, luego en hielo seco (–79
°C) durante 30 minutos antes de colocarlas en nitrógeno líquido (–196 °C).
2. Las pajitas se pueden trasladar del congelador a –20 °C a otro congelador a –70 °C, o a una cesta o
copa en una mezcla de vapor de nitrógeno líquido y aire en el cuello de un pequeño recipiente de
técnicas
nitrógeno líquido a –80 °C a –100 °C durante 10 a 15 minutos, antes de colocarlo en nitrógeno

líquido. También se pueden colocar en una rejilla de 10 a 20 cm por encima del nitrógeno líquido en
un recipiente grande y dejar durante 1 hora para que desarrolle un gradiente de temperatura por
encima del nitrógeno líquido.
6.4.1.7 Congelación rápida del vapor

de espermatozoides
La congelación rápida manual de vapor también puede dar resultados adecuados.
1. Coloque las pajitas en vapores de nitrógeno líquido a unos 10 cm por encima del nivel de N (–80 °C)2
durante 8 a 10 minutos para permitir una congelación lenta inicial. Para estandarizar el proceso, se
pueden utilizar cajas disponibles comercialmente con rejillas flotantes para pajitas o crioviales, que
mantienen una distancia fija entre las pajitas y el nitrógeno.
2. Sumerja las pajitas en nitrógeno líquido inmediatamente después.
6.4.1.8 Almacenamiento de semen congelado
1. Coloque las pajitas congeladas en tubos de almacenamiento de plástico (por ejemplo, minivasos, tubos sobre
8. Apéndices
bastones o casetes de pajitas) e insértelos en copas de almacenamiento más grandes.
2. Guarde las copas con las pajitas en matraces o tanques de vacío de nitrógeno líquido
(Dewar).
9. Referencias
179
1. Introducción
6.4.1.9 Transporte de semen congelado

Los espermatozoides congelados se pueden transportar en tanques secos disponibles
comercialmente y enfriados con nitrógeno líquido. Dependiendo del tamaño del transportista, se
pueden mantener temperaturas adecuadamente bajas durante varios días a varias semanas, mientras
el nitrógeno líquido se evapora.
examen
2. Básico
Nota:Asegúrese de que se cumplan las regulaciones locales, nacionales e internacionales

sobre el envío de nitrógeno líquido y muestras biológicas humanas.
6.4.1.10 Descongelación del semen congelado
1. Antes de su uso, retire tantas pajitas o crioviales como sea necesario del tanque de nitrógeno
examen
3. Extendido
líquido o vapor y colóquelos inmediatamente a 37 °C (en una incubadora, o mejor aún, en un

bloque de calor seco para calentamiento por contacto, que pueda descontaminarse
fácilmente entre usos).
2. Después de la descongelación completa, corte el extremo de la pajita con unas tijeras esterilizadas y cargue el
dispositivo de inseminación (para uso terapéutico) o expulse el contenido para determinar la motilidad post-
descongelación (para comprobar el proceso de congelación).

exámenes
4. Avanzado
3. Retire el crioprotector añadiendo el medio de cultivo antes de la centrifugación durante

10 minutos a 500 g. Retire el sobrenadante y diluya el sedimento de esperma en medio
de cultivo hasta el volumen adecuado.(402).
En caso de que los pacientes decidan desechar su semen criopreservado, se deberán

retirar y/o crioviales las pajitas y/o crioviales en presencia de un testigo para confirmar
técnicas
que se trata del material correcto.
6.4.2 Protocolos de congelación modificados para oligozoospermia y espermatozoides
recuperados quirúrgicamente
El semen que contiene sólo unos pocos espermatozoides móviles y las suspensiones de esperma obtenidas
del tracto genital o de una biopsia testicular se pueden almacenar para una ICSI posterior.
de espermatozoides
• Si se van a criopreservar muy pocos espermatozoides, se requieren estrategias

individuales, dependiendo de la muestra.
• Hay dispositivos especiales disponibles comercialmente para criopreservar incluso un solo

espermatozoide, aunque muchos de ellos requerirán micromanipulación.(403). Luego,
dichos dispositivos se colocan en criotubos y se almacenan en nitrógeno líquido según las
recomendaciones del fabricante.
• En ausencia de tales dispositivos, se recomienda una estrategia de congelación en un

volumen mínimo.
• Líquido de aspirado epidídimo o testicular que contiene espermatozoides y suspensiones de

espermatozoides seleccionadas mediante swim-up o DGC a partir de semen completo (
8. Apéndices
Sección 5.4 en la página 165y Sección 5.5 en la página 166) y resuspendido en un medio de
preparación de esperma con HEPESEl tampón y HSA (4 mg/ml) se pueden criopreservar con
crioprotector de glucosa y glicerol (TGG) de Tyrode o con un crioprotector comercial según
las instrucciones del fabricante.
9. Referencias
180
1. Introducción
• La congelación de tejido testicular intacto para tener espermatozoides para uso futuro requiere protocolos
desarrollados específicos.
6.4.2.1 Crioprotector modificado (TGG)

examen
2. Básico
1. A 40 ml de estériltirodoA la solución se añaden 5 ml de albúmina humana estéril (100

mg/ml), 0,9 g de glucosa y 5 ml de glicerol. Filtrar la solución a través de un filtro de
poros de 0,45 µm.
2. Conservar en alícuotas de 2 ml a –70 °.

examen
3. Extendido
Ver nota enSección 6.4.1.1 en la página 177para la preparación en laboratorio de crioprotector.
1. Si el volumen de la muestra es superior a 2,0 ml y hay pocos espermatozoides móviles,

centrifugue a 1 500 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
exámenes
4. Avanzado
2. Aspirar el sobrenadante hasta dejar aproximadamente 1,0 ml y resuspender los

espermatozoides en él. Determinar el porcentaje de espermatozoides móviles (PR+NP); Si hay
muy pocos espermatozoides móviles, estime el número de células móviles debajo de cada
cubreobjetos.
3. Descongele una alícuota de 2 ml de TGG o tampón de yema de prueba (TYB).

técnicas
4. Agregue un volumen de TGG o TYB a un volumen de preparación final de esperma, gradualmente,

mezclando.
5. Empaque en pajitas o crioviales y congélelo como se indica arriba. Si alguna pajita no está
llena, tape la minicopa para evitar que flote cuando se congele.
de espermatozoides
6.4.3 Etiquetado de pajitas/crioviales y registros
Es esencial contar con un sistema de codificación sólido para etiquetar pajitas o viales. Utilice el código
en todas las hojas de datos de laboratorio y bases de datos informáticas para mantener el anonimato
de los donantes. Guarde la clave del código con la identidad del donante por separado y de forma
segura. Hay muchos sistemas de codificación potenciales; el requisito importante es tener un código
único para cada donante o cliente de almacenamiento. En el caso de clientes/pacientes, es importante
identificar cada pajita/criovial con el nombre, fecha de nacimiento, número de hospital y fecha de
almacenamiento y cualquier otro requisito según la legislación nacional. El siguiente sistema de
codificación funciona satisfactoriamente.
• A cada nuevo donante anónimo se le asigna un código de dos letras (AA, AB, AC, BA, BB, etc., que
termina en ZZ, después del cual se necesita un nuevo método).
8. Apéndices
• Para pacientes y donantes conocidos se utiliza un sistema de código de tres letras: AAA, AAB, etc.
• Cada muestra de un donante particular está indicada por un número después de su código
personal. Por ejemplo, la octava donación realizada por el donante BT lleva la etiqueta BT-8.
9. Referencias
181
1. Introducción
• El código de letras y el número de muestra deben escribirse en cada pajita o vial utilizando un
marcador negro indeleble. Alternativamente, utilice una etiqueta impresa con el nombre y fecha de
nacimiento del paciente y la fecha de almacenamiento. Esta etiqueta debe estar diseñada para su
uso en nitrógeno líquido. Se debe considerar debidamente si alguna etiqueta elegida podría verse
comprometida con el tiempo.
examen
2. Básico
• Los minivasos (o alternativas) en los que se almacenan las pajitas también deben tener una
etiqueta adhesiva transparente con el código y el número de muestra, y solo deben contener
muestras de ese paciente en esa ocasión.
• La codificación por colores de copas más grandes con múltiples muestras en ellas y mini copas también
puede ser útil para una identificación rápida.

examen
3. Extendido
• A medida que se utilizan los espermatozoides almacenados, el recuento de pajitas o viales se ajusta en la base de
datos.
Nota:Todos los procedimientos relacionados con la identidad de muestras de donantes o

pacientes, incluida la recepción de muestras, la preparación y el etiquetado de pajitas, la
colocación en tanques y la descongelación de pajitas para su uso o descarte, deben ser
exámenes
4. Avanzado
verificados dos veces por más de una persona y la evidencia de esta verificación debe ser
presenciada. en los registros del laboratorio. Lo ideal es que un técnico procese sólo una
muestra de semen a la vez.
Todas las muestras deberán disponer de un código que permita su identificación durante su almacenamiento
y traslado desde el banco de semen al centro receptor.

técnicas
6.5 Vitrificación
La evidencia emergente indica que la vitrificación puede ser un método valioso para criopreservar los
espermatozoides eyaculados.(404). El principio del método es la congelación ultrarrápida de un
pequeño volumen de muestra en contacto directo con nitrógeno líquido libre de contaminantes, lo
que debería evitar la formación de hielo y reducir el daño osmótico. También es posible la vitrificación
con paja (vitrificación aséptica), que utiliza un sistema cerrado y no requiere nitrógeno líquido estéril.
de espermatozoides
La vitrificación se puede realizar para semen completo o espermatozoides seleccionados mediante el

uso de diluyentes permeables e impermeables y se puede utilizar para criopreservar un solo
espermatozoide o un número reducido de espermatozoides.
(405). Sin embargo, en la actualidad, la evidencia de mejores parámetros post-descongelación después
de la vitrificación con respecto a los métodos convencionales es limitada.(406), y, como tal, la
vitrificación de esperma debe considerarse un procedimiento experimental.
6.5.1.1 Protocolo de vitrificación directa
La vitrificación, junto con los dispositivos llamados "abiertos", requiere la exposición directa de
la muestra al nitrógeno líquido, y esta exposición plantea riesgos de contaminación adicionales.
Siempre se recomienda el uso de nitrógeno líquido estéril. El procedimiento también puede
resultar peligroso para el operador, que siempre debe utilizar el equipo de protección
8. Apéndices
adecuado.
Materiales
• Crioprotectores
• Nitrógeno líquido estéril

9. Referencias
182
1. Introducción
• Una caja para nitrógeno líquido.
• Un pequeño colador para recoger esferas vitrificadas
• Criotubos.
examen
2. Básico
Método (de Isachenko et al.(404))

1. Después de la dilución con un volumen igual de diluyente,10El semen se sumerge directamente gota
a gota en nitrógeno líquido libre de contaminantes utilizando un recipiente desechable.
2. Las esferas obtenidas se envasan luego en crioviales, que inmediatamente se

sumergen y almacenan en nitrógeno líquido.
examen
3. Extendido
6.5.1.2 Protocolo de vitrificación en paja
Los métodos de vitrificación en paja (vitrificación aséptica) utilizan un sistema cerrado, en pajitas
dobles (una dentro de otra), completamente selladas, siendo asépticas sin contacto directo con el
nitrógeno líquido, vitrificando un mayor volumen de muestra (100 ul) con un número elevado de
exámenes
4. Avanzado
espermatozoide(404, 407, 408). Este procedimiento es menos peligroso para el operador.
Materiales
• Pajitas de 0,5 ml y 0,25 ml
• Medio de vitrificación
técnicas
• Una caja para nitrógeno líquido.
• Tubos cónicos de 10 ml.
• Medio de calentamiento.
Método
1. Preparar 1 ml de medio para vitrificación:
de espermatozoides
• Medio de lavado de esperma o HTF: 0,495ml
• Sacarosa 0,5 M disuelta en agua (p. ej. MP Biomedicals, Cat. 152584): 0,495ml
• Suplemento de suero de dextrano (p. ej., IrvineScientific, Cat. 9301): 0,010ml

2. Utilice espermatozoides seleccionados (libres de plasma seminal) mediante centrifugación en gradiente de
densidad o swim-up de acuerdo con los parámetros del esperma y los protocolos del laboratorio local.
3. Después de recuperar los espermatozoides seleccionados, realice un recuento de espermatozoides,
concéntrelos por centrifugación (8 a 10 minutos a 300 g), elimine el sobrenadante por completo y agregue
la cantidad adecuada de medio de vitrificación para resuspender el sedimento (calculado de la siguiente

8. Apéndices
manera):
• Volumen de suspensión a vitrificar por pajita (0,25 ml): 100 µl
• Concentración de esperma por pajita: 0,1–3,0 x106esperma
El tipo de diluyente, la temperatura del crioprotector y el tiempo que las células están expuestas al
10
crioprotector son críticos y pueden influir en la eficacia del proceso.

9. Referencias
183
1. Introducción
Ejemplo:
Esperma recuperado: 15 x106total de espermatozoides
Objetivo de preservación: 3 x106esperma/100 µl (volumen por pajita) 1

ml = 30 x106esperma
X volumen = 15x106esperma recuperado
examen
2. Básico
Por lo tanto, X = 0,5 ml de medio de vitrificación (con 0,5 ml de medio de

vitrificación resultarán 5 pajitas de 100 µl, cada una con 3 x106esperma).
4. Mezcle el sedimento de esperma con el medio de vitrificación sólo inmediatamente antes de

la vitrificación (temperatura ambiente). No es aconsejable exponer las células al medio de
vitrificación durante largos periodos de tiempo.
examen
3. Extendido
5. Se debe cortar una pajita de 0,25 ml a dos tercios de su longitud original. Luego se coloca
horizontalmente y se dispensa una alícuota de 100 µl, con ayuda de una pipeta, en el
extremo abierto. A través de las siguientes etapas es imperativo que se mantenga la posición
horizontal para que no se pierda la alícuota.
6. A continuación se introduce la pajita en una pajita de 0,5 ml, que se termosella por ambos extremos.
exámenes
4. Avanzado
La pajita debe sumergirse inmediatamente en nitrógeno líquido durante 5 segundos en posición

horizontal con la ayuda de unas pinzas y almacenarse en nitrógeno líquido.
Calentamiento después del procedimiento de vitrificación.
1. Prepare un medio para calentar.
2. Descongele el contenido de las pajitas/crioviales en un medio precalentado a 42–43 °C.

técnicas
de espermatozoides
8. Apéndices
9. Referencias
184
1. Introducción
Capítulo 7:
Garantía de calidad y
examen
2. Básico
control de calidad
7.1 Control de calidad en el laboratorio de andrología..............185
examen
3. Extendido
7.2 La naturaleza de los errores en el examen de la eyaculación..........................188

7.3 El programa de garantía de calidad................................................. ........................................190
7.4 Gráficos de control de calidad para valores numéricos................................................. ..........193
7.5 Gráficos de control de calidad para porcentajes................................................. ........................197
7.6 EvaluaciónXbar
ySgráficos................................................. ...................197
7.7 Procedimientos estadísticos para analizar y
informar la variabilidad entre técnicos........................................199
exámenes
4. Avanzado
7.8 Control de calidad externo y aseguramiento de la calidad........................204

7.9 Frecuencia y prioridad del control de calidad.................................205
7.10 Entrenamiento................................................. ................................................. .............206
El aseguramiento de la calidad (QA) es la base para que un servicio de laboratorio brinde servicios confiables
a los usuarios: los médicos y sus pacientes. El control de calidad (QC) es un conjunto de herramientas para
técnicas
determinar si las evaluaciones en sí mismas arrojan resultados confiables, mientras que el control de calidad
es un concepto más amplio: no se trata solo de los análisis. El control de calidad incluye todos los
procedimientos para que el laboratorio brinde servicios sólidos y confiables. Por lo tanto, el control de calidad
incluye, entre muchas cosas, procedimientos para compartir información con pacientes y médicos remitentes,
criterios para la aceptación de derivaciones, distribución de resultados y manejo de errores y quejas de todos
los aspectos del laboratorio.

de espermatozoides
El examen del semen es singularmente complicado y difícil de
estandarizar desde el punto de vista del procedimiento, lo que
puede dar lugar a grandes discrepancias en las evaluaciones

del recuento, la motilidad y la morfología de los
espermatozoides en diferentes laboratorios.
7.1 Control de calidad en el laboratorio de andrología

8. Apéndices
El examen de semen es excepcionalmente complicado y difícil de estandarizar desde el punto de vista del
procedimiento, lo que puede dar lugar a grandes discrepancias en las evaluaciones del recuento, la motilidad
y la morfología de los espermatozoides en diferentes laboratorios.(9, 409-413). Estas discrepancias pueden
abordarse mediante procedimientos estandarizados y medidas de control de calidad. Este último puede
detectar y corregir errores sistemáticos y reducir la variabilidad técnica de los resultados.

9. Referencias
185
1. Introducción
Para los laboratorios médicos, existe una norma internacional general, ISO 15189.(357), para
identificar procedimientos para la gestión de la calidad del laboratorio y brindar apoyo para la
acreditación del laboratorio por parte de un organismo de acreditación. Como complemento a
la norma ISO 15189, en la Organización Internacional de Normalización (ISO) se está
desarrollando una norma técnica basada en los mismos principios que este manual de la OMS
examen
2. Básico
para el examen básico de semen, cuya publicación se espera para 2021.
La garantía de calidad de un laboratorio implica el seguimiento y la evaluación sistemáticos de los

diversos aspectos de los servicios e instalaciones del laboratorio para maximizar la probabilidad de
que el programa alcance los estándares de calidad establecidos.
Algunas definiciones se presentan aquí.

examen
3. Extendido
• Objetivo del laboratorio (estándar de desempeño):El nivel de desempeño deseado para un

servicio específico, generalmente medible en términos de oportunidad y cantidad.
Indica lo que se espera que proporcione el servicio de laboratorio.
• Indicador:Variable que mide un aspecto de un servicio que está directamente

relacionado con los objetivos del laboratorio. Dice específicamente qué medir para
exámenes
4. Avanzado
determinar si se han logrado los objetivos.
• Mejora de calidad:Un enfoque estructurado para analizar el desempeño y aplicar

esfuerzos sistemáticos para mejorarlo.
• Control de calidad interno (IQC)Mide la variabilidad en los resultados de laboratorio.

Es útil para detectar variación aleatoria general (precisión), así como cualquier
técnicas
diferencia sistemática y aleatoria entre diferentes individuos que realizan análisis (

Sección 7.3.2 en la página 191).
• Control de calidad externo (CCE):Comparaciones entre diferentes laboratorios para

una o varias medidas. Es útil para detectar variaciones sistemáticas y evaluar la
precisión. También se conoce como prueba de competencia (PF) o evaluación o
aseguramiento externo de la calidad (EQA).
de espermatozoides
Los beneficios esperados de un programa de calidad de laboratorio sólo pueden lograrse si la

calidad es óptima en cada paso del proceso de diagnóstico.
Las actividades de control de calidad de un laboratorio comienzan con la implementación de

procedimientos de evaluación precisos y controlables, como se describe en este manual (Capítulo 2
en la página 9). Además de los aspectos técnicos, también hay que prestar atención a las
cualificaciones del personal implicado: seguimiento del rendimiento.
Todos los laboratorios que realicen exámenes de semen deben implementar un programa de garantía
de calidad (Sección 7.3 en la página 190), que describe objetivos en métodos y procedimientos para
garantizar que los resultados sean confiables, es decir, exactos y precisos. Debido a los
procedimientos de acreditación legal generalizados, los programas QA y EQA ya son obligatorios por
ley en algunos países. En otros, los sistemas de seguro de salud exigen una estandarización. Si bien
los recursos y capacidades locales disponibles pueden no permitir la implementación de toda la gama
8. Apéndices
de procedimientos, habría procedimientos de rutina básicos o estándar que deberían ser

monitoreados por procedimientos de control de calidad o garantía de calidad internos o, siempre que
sea posible, externos. Los procedimientos básicos de rutina (Capítulo 2 en la página 9) incluiría los
parámetros fundamentales de recuento o concentración de espermatozoides, morfología y motilidad.
9. Referencias
186

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Si se diagnostica una secuencia alterada de la eyaculación, existen técnicas quirúrgicas

3.9.1 Equipo – además del examen de rutina de la eyaculación

recolectar las fracciones de eyaculación en el orden en que son expulsadas.

Fig. 3.8 Dos ejemplos de dispositivos de recogida de eyaculación dividida

3.9.2 Procedimientos del paciente

Capítulo 3: Examen ampliado

3.9.3 Procedimientos de muestra

La evaluación del volumen, el recuento de espermatozoides, la motilidad y el zinc (marcador

Calcular la distribución relativa de volumen, espermatozoides, proporción de espermatozoides

luego la distribución relativa en cada fracción (figura 3.9).

Relación molar zinc/fructosa

Volumen Espermatozoide Progr. Zinc Fructosa Relación molar Zn/Fr

capacidad funcional de los espermatozoides.

espermatozoides y la motilidad progresiva, para identificar posibles fuentes de espermatozoides con

4.1 Estrés oxidativo seminal y oxígeno reactivo

4.4 Flujo y transporte de iones transmembrana en el esperma.................152

La infertilidad masculina a menudo se debe a una producción insuficiente de espermatozoides, una

un examen de eyaculación clásico.

Para obtener conocimientos más profundos sobre las

bases biológicas de la infertilidad por factor masculino, se

ha desarrollado una batería de pruebas funcionales

destinadas a evaluar la competencia de los

espermatozoides humanos para cumplir los procesos

fundamentales esenciales para la concepción.

campo de la infertilidad masculina es de fundamental importancia hoy en día, dada la literatura

La fertilización también es un espejo de la salud general y de si están influenciados por contaminantes

espermatozoides y la fertilidad.(278)(Sección 3.2 en la página 86).

4.1 Pruebas de estrés oxidativo seminal y especies reactivas

Durante décadas se ha sugerido la hipótesis de que un desequilibrio en las reacciones de reducción-

Capítulo 4: Exámenes avanzados

1. Prepare una solución madre de luminol (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindiona) 100 mM en 10 ml de

2. Soluciones de “sonda” de trabajo: luminol 5 mM en DMSO – mediante dilución de 20 µl de solución

3. Se debe permitir que el eyaculado se licue antes de la medición (menos de 30 minutos

4. Las mediciones en luminometría deben realizarse por duplicado (como mínimo

5. En todos los conjuntos de ensayos debe haber:

• espacios en blanco deDPBSo medios solos

• un control negativo de 390 µl de DPBS o medio + 10 µl de “sonda”

• controles positivos, ambos con adición de 50 µl de peróxido de hidrógeno (30%) + 10 µl de

• eyacular (340 µl) o

• DPBS o medio (340 µl).

6. Los datos deben tomarse en varias lecturas, espaciadas equidistantemente y en el

detección de un resultado significativo.

rango dinámico e incluso las unidades utilizadas varían ampliamente.

• Debido a la variación descrita entre máquinas y metodologías y a la baja calidad de los

4.1.3 Potencial de oxidación-reducción

el llenado de la cámara de referencia.

4.1.4 Capacidad antioxidante total

Capítulo 4: Exámenes avanzados

generalmente se expresa como micromoles de equivalente de Trolox. El ensayo se lee como

disponible en kits preenvasados de varios proveedores. Se deben seguir las

2. Se debe permitir que la eyaculación se licue completamente y luego se centrifuga a

5. Las mediciones deben realizarse por duplicado (como mínimo absoluto). La

concluyentes relacionados con el resultado reproductivo.

• Debido a la variación entre máquinas y metodologías y a la baja calidad de la evidencia para

• Lo ideal es que el ensayo se lea en un lector de microplacas debido a la cantidad de duplicados y

4.2 Evaluación de la reacción acrosómica

del porcentaje de espermatozoides que reaccionaron con el acrosoma después de la inducción

4.2.2 Evaluación del estado del acrosoma