TB 2023

Lineamientos técnicos para el diagnóstico
y control de la tuberculosis en el laboratorio clínico
San Salvador, El Salvador 2023
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San Salvador, El Salvador 2023
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2023 Ministerio de Salud
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forma tal que sugiera que usted o su uso tienen apoyo de la licencia.
La documentación oficial del Ministerio de Salud, puede Consultarse en el Centro Virtual de

Documentación Regulatoria en: http://asp.salud.gob.sv/regulacion/default.asp
Ministerio de Salud
Calle Arce No. 827, San Salvador. Teléfono: 2591 7000
Página oficial: http://www.salud.gob.sv
3
Autoridades
Dr. Francisco José Alabi Montoya

Ministro de Salud Ad honorem
Dr. Carlos Gabriel Alvarenga Cardoza

Viceministro de Gestión y Desarrollo en Salud Ad honorem
Dra. Karla Marina Díaz de Naves

Viceministra de Operaciones en Salud Ad honorem
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Equipo técnico
Dr. Julio Garay Ramos Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y
Lic. René Guevara Hernández Enfermedades Respiratorias
Dr. Carlos Roberto Torres Dirección de Regulación
Dra. Mayra Sáenz de Hernández
Licda. Yanira Emperatriz Meléndez Cortez Sección de Micobacterias. Laboratorio Nacional de
Lic. José Nelson Linares Rosales Salud Pública
Licda. Norma Iris Pérez de Rodríguez
Licda. Johanna Vanessa Acuña Durán
Lic. Francisco Alberto Gutiérrez Blanco
Licda. Mirna Guadalupe Godoy Rodríguez
Licda. Ana Mirtala Velásquez Hernández Región Central de Salud
Licda. Rosaura Guadalupe Sánchez Estrada Hospital Nacional Rosales
Licda. Patricia Beatriz Marroquín García Instituto Salvadoreño del Seguro Social (ISSS)
Licda. Patricia Leonor Marroquín Rodas Instituto Salvadoreño del Seguro Social (ISSS)
Licda. Marlin Cristabel Renderos SECOMISCA
Comité consultivo
Lic. Oscar Ernesto Mena Colocho
Región Occidental de Salud
Licda. Laura Lissette Arévalo Ávila
Licda. Jaqueline Jiménez Región Central de Salud
Licda. Ana María de Mendoza
Región Metropolitana de Salud
Lic. Manuel Enrique García Sandoval
Licda. Herminia Vásquez
Región Paracentral de Salud
Licda. Ana Gloria Martínez de Cerna
Lic. Carlos Esaú Viera Ascencio
Región Oriental de Salud
Licda. Xiomara Iveth Chávez
Licda. María de los Ángeles López Salazar Dirección General de Centros Penales
Licda. Celina del Carmen Herrera Casco
Oficina de Laboratorio Clínico. MINSAL
Licda. Joselin Flores
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Índice
Acuerdo 7
I. Introducción 8
II. Objetivos 8
III. Ámbito de aplicación 9
IV. Red de laboratorios 9
V. Contenido técnico: 10
1. Baciloscopía 10
2. Cultivo 24
3. Pruebas moleculares 40
4. Prueba LF-LAM 56
5. Bioseguridad 60
6. Control de calidad 66
7. Sistema de registro 72
VI. Disposiciones finales 74
VII. Vigencia 74
VIII. Abreviaturas y siglas 75
IX. Bibliografía 77
X. Anexos 79
6
San Salvador, 5 de mayo de 2023
Ministerio de Salud
Acuerdo n.º1047
El Órgano Ejecutivo en el Ramo de Salud
Considerando
I. Que la Constitución de la República, en su artículo 65, determina que la salud de los

habitantes constituye un bien público. El Estado y las personas están obligados a velar
por su conservación y restablecimiento;
II. Que el Reglamento Interno del Órgano Ejecutivo, en el artículo 42, numeral 2), define
que compete al Ministerio de Salud: Dictar las normas y técnicas en materia de salud y
ordenar las medidas y disposiciones que sean necesarias para resguardar la salud de la
población;
III. Que la Ley del Sistema Nacional Integrado en Salud , en los artículos 3 y 13 establecen
que “El Sistema”, está constituido por las instituciones públicas y privadas que de manera
directa e indirecta se relacionan con la salud, siendo el Ministerio de Salud, el ente rector
del mismo, por lo que está facultado para coordinar, integrar y regular el mismo;
IV. Que con fecha 15 de octubre del año 2019, se emitieron Lineamientos técnicos para el
Diagnóstico y Control de la Tuberculosis en el Laboratorio Clínico, cuyas disposiciones
técnicas requieren ser actualizadas para mejorar la toma de las diferentes pruebas de la-
boratorio clínico, a fin de contribuir al diagnóstico, control y tratamiento oportuno de la
tuberculosis.
POR TANTO, en uso de las facultades legales, ACUERDA emitir los siguientes

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I. Introducción
El Ministerio de Salud, implementa la actualización de documentos regulatorios que permitan
potenciar el trabajo y estandarizar las técnicas que el personal de salud, desarrolla con el fin de
mejorar la calidad del servicio brindado a la población.
El trabajo desarrollado en los laboratorios, es importante no solo por su rol en el diagnóstico de

las enfermedades transmisibles como la tuberculosis, sino también en el control de la evolución
del tratamiento de los pacientes, así como la evaluación epidemiológica y operacional. Tiene
como función principal, la detección de fuentes de infección tuberculosa a través de métodos
como pruebas moleculares, cultivo, baciloscopía y prueba de flujo lateral para
lipoarabinomanano (LF-LAM).
La elección de la técnica más conveniente y su estandarización permite la obtención de

resultados comparables a lo largo de todo el país, además de facilitar la capacitación, así como
la ampliación de la cobertura.
El propósito de los presentes lineamientos, es proporcionar al personal de laboratorio clínico del

Sistema Nacional Integrado de Salud (SNIS) y de otras instituciones prestadoras de servicios de
salud, información sobre los procedimientos técnicos aplicables para el diagnóstico
bacteriológico de la tuberculosis.
II. Objetivos
General
Establecer los criterios estandarizados para la realización de las diferentes pruebas de laboratorio
clínico, a fin de contribuir al diagnóstico y control de la tuberculosis.
Específicos
1. Proporcionar al personal de laboratorio clínico los criterios técnicos administrativos que
establezcan los procedimientos para la realización de las pruebas con estándares de
calidad.
2. Estandarizar el informe de análisis de las pruebas y su notificación oportuna en los
diferentes sistemas de información en los niveles correspondientes.
3. Fortalecer el cumplimiento de la normativa vigente de bioseguridad en el manejo y
proceso de las muestras como medidas de control de infecciones para la protección del
personal de salud y del medio ambiente.
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III. Ámbito de aplicación
Están sujetos al cumplimiento de los presentes lineamientos técnicos, el personal del Sistema
Nacional Integrado de Salud (SNIS).
IV. Red de laboratorios

Los servicios de laboratorio son más eficaces, cuando se integran en una red nacional de
laboratorios de tuberculosis que debe involucrar a laboratorios del Sistema Nacional Integrado
de Salud, incluyendo a los que prestan servicios en centros penitenciarios, laboratorios privados
y de organizaciones no gubernamentales.
La conducción de esta red debe estar integrada en el nivel de programación de decisión de la

Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias (UPCTYER), la
que, a su vez, debe hacer las gestiones necesarias para sostener la organización y el
funcionamiento de esta red de apoyo al diagnóstico y control de tratamiento de la tuberculosis,
en coordinación con la Oficina de laboratorio clínico del MINSAL. Ver cuadro 1.
Cuadro 1. Número de laboratorios que realizan diferentes metodologías (Estos se

ilustran por nivel de atención en la figura 1)
Dirección
Método de Establecimientos Establecimientos General de Sector
Total
diagnóstico del MINSAL del ISSS Centros Privado
Penales
Baciloscopía 194 18 1 5 218
Cultivo Ogawa
3 0 0 0 3
Kudoh
Cultivo Löweinsten
6 4 0 0 10
Jensen
Prueba molecular
12 0 1 0 13
para TB
Prueba LF-LAM 20 0 0 0 20
Fuente: Sección de micobacterias – LNSP, 2021
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Figura 1. Organización de la red para diagnóstico de tuberculosis
Vigilancia Todas las pruebas

Métodos de realizadas en el primer y
referencia segundo nivel
Cultivos utilizando
Diagnóstico
medios líquidos
DST fenotípico
LNSP PDS 2da. línea
Búsqueda de casos Todas las pruebas

realizadas en el primer
Diagnóstico nivel
Cultivos en medios
Tratamiento sólidos
Prueba LF-LAM.
Segundo y tercer nivel de
Referencia de
atención muestras.
Búsqueda de casos
Microscopia de
Diagnóstico frotis.
Tratamiento *Xpert MTB/RIF
Ultra.
Recolección de Primer nivel de atención
muestras Referencia de
muestras a otros
niveles
* Solamente un establecimiento de primer nivel.

Fuente: adaptado del Documento Método de diagnóstico rápido para detectar la tuberculosis; Manual
Operativo de la OMS sobre la tuberculosis, 2020
V. Contenido técnico
1. Baciloscopía
Esta técnica se basa en la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su pared a la
fucsina fenicada (de color fucsia) y retenerla aún con la acción de decolorantes, como la mezcla
de ácido y alcohol, propiedad conocida como ácido alcohol resistencia. Esta característica se
debe al alto contenido en lípidos, particularmente del ácido micólico, que poseen en la pared
celular.
La baciloscopía detecta del 70 al 80% de los casos, por lo que es recomendada en los países con
escasos recursos económicos. La baciloscopía es utilizada para realizar diagnóstico y control de
tratamiento; el equipo, materiales y reactivos que se utilizan para el procesamiento se enlistan en
el cuadro 2.
10
Equipo, materiales y reactivos
Cuadro 2. Equipo, materiales y reactivos para baciloscopía
Descripción Cantidades
Equipo
Microscopio binocular. Ver anexo 1 1
Reloj marcador de tiempo 1
Materiales
Mechero de alcohol. 1
Bandeja metálica o varilla para coloración con soporte para láminas. 1
Frascos de vidrio ámbar para colorantes de 1,000 mililitros 3
Frascos gotero tapa esmerilada vidrio ámbar de 100 mililitros 3
Gradilla para láminas. 3
Envases plásticos de 35-50 mililitros. 1
Pinza o asa metálica para antorcha. 1
Embudos plásticos. 2
Frascos lavadores de 250 mililitros 3
Caja de baquelita de 100 porta láminas 2
Aplicadores de madera. 2 por BK
Lámina portaobjeto 3 x 1 pulgada esmerilada. 1 por BK
Plumón indeleble negro o azul. 1 por mes
Caja o pliegos de papel filtro. 2 por mes
Rollos de papel toalla o periódico. 2 por mes
Lapicero azul, negro y rojo. 3 por mes
1 al año o según
Libro de registro de actividades de laboratorio - PCT- 4 (anexo 2).
necesidad
Paquete de fósforos. 2 por mes
Libreta de papel limpia lentes. 3 por mes
Galón de jabón para manos. 1 por mes
Algodón (libras) 1 cada 3 meses
Lápiz grafito 1 cada dos meses
Equipo de protección personal

Respiradores N-95 o N-100 de BFE (filtro de eficiencia de filtración bacteriana) 1 diario por persona
Caja de guantes descartables 3 mensual
Gabachas descartables 30 mensual
Gorro 30 mensual
Lentes protectores 3
Reactivos
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Fucsina fenicada 0.3%, mililitros 5 por BK
Alcohol ácido 3%, mililitros 5 por BK
Azul de metileno 0.1%, mililitros 5 por BK
Lejía comercial al 0.5%, galón 1 mensual
Alcohol 90%, litro 1 mensual
Aceite de inmersión. (Índice de refracción = 1.515-1.517. Viscosidad = 100-120),
1 gota = 0.05 por BK
mililitros
Fuente: Equipo técnico. Lineamientos técnicos para el diagnóstico y control de la tuberculosis por el
laboratorio clínico, MINSAL, 2019.
Las cantidades a solicitar de forma trimestral, semestral o anual, dependerá de la producción de

cada establecimiento de salud y de la estructura organizativa institucional.
1.1. Recolección de la muestra

Para la baciloscopía, la muestra ideal es el esputo, por lo que cualquier otro tipo de muestra que
no sea esputo, debe ser procesada con pruebas moleculares o cultivo.
Se requiere una adecuada recolección de la muestra en relación a calidad y cantidad,

recolectada en el envase recomendado, correctamente identificado; conservada en las
condiciones requeridas y transportada al laboratorio en el tiempo oportuno, con el objetivo de
asegurar la confiabilidad de resultados.
Es recomendable que se lleve el registro de la calidad de muestra recibida para realizar la

baciloscopía.
Saliva Mucosa Mucopurulenta Sanguinolenta
Fuente: Manual de capacitación en Gene Xpert. Módulo 3: Toma y transporte de muestras de esputo.
OPS/OMS 2016
El envase debe cumplir las siguientes características:

a) Plástico transparente: que permita observar el volumen y la calidad de la muestra sin
abrir el envase; para prevenir accidentes y facilitar su adecuado descarte.
b) Libre de partículas de polvo u otros contaminantes: no necesariamente estéril.

c) Boca ancha: para que el paciente pueda expectorar cómodamente dentro del envase
sin contaminar el exterior.
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d) Tapa de rosca: a fin de asegurar un cierre hermético, que permita al menos dos vueltas
de cierre y reducir el riesgo de derrames durante el transporte.
e) Capacidad: de treinta y cinco a cincuenta milímetros de diámetro para que el paciente

pueda depositar el esputo con facilidad dentro del envase, sin ensuciar sus manos o las
paredes del frasco.
f) Fácil de rotular: lo que permitirá una identificación indeleble o la colocación de una

viñeta.
El personal de salud que da indicaciones para la recolección de la muestra, debe rotular el frasco
con la siguiente información: nombre completo del paciente, número de identificación
correspondiente del paciente [expediente, Documento Único de Identidad (DUI), Sistema de
Información Penitenciaria (SIPE), Número Único Previsional (NUP), ficha familiar, afiliación
dependiendo de la institución o establecimiento de procedencia], tipo de muestra (esputo),
número de muestra.
Para diagnóstico, se deben tomar dos muestras por persona catalogada como sintomático
respiratorio. La primera muestra tomada en el momento de la consulta al identificar al
sintomático respiratorio. La segunda la debe recolectar el paciente en su casa, por la mañana al
despertar (muestra matinal). Es más probable que se eliminen bacilos en las muestras matinales.
Para control de tratamiento, dos muestras recolectadas por la mañana, en días consecutivos (ver
Norma técnica para la prevención y control de la tuberculosis).
Para obtener una muestra de esputo de calidad, debe proporcionar las indicaciones al paciente:
a) Recolectarla en un área con ventilación (preferentemente al aire libre) y no en lugares
encerrados como el baño. En el caso de pacientes hospitalizados, en la medida de lo
posible se deben desplazar a un lugar ventilado.
b) Evitar el uso de lápiz labial al momento de recolectar la muestra.
c) Enjuagarse la boca con agua antes de dar la muestra, con el objetivo de eliminar restos
alimenticios.
d) Sonarse la nariz antes de obtener la muestra para evitar que la secreción nasal sea
proporcionada como flema.
e) El paciente debe inspirar profunda y lentamente, luego retener por un instante el aire en
los pulmones, y después debe toser con fuerza y expectorar dentro del frasco que tiene
listo en la mano, repetir este proceso hasta obtener suficiente muestra (5 mililitros).
f) Cerrar el frasco procurando que el esputo no contamine el exterior del mismo.
g) Entregarlo al personal de salud.
h) La muestra recolectada deberá ser enviada lo más pronto posible al laboratorio en triple
embalaje y en cadena de frío. (Ver anexo 3)
i) Si el establecimiento no cuenta con laboratorio, debe coordinar el trasporte y referir las
muestras según su red, mientras tanto debe conservarlas en refrigeración de 2 a 8°C por
un tiempo máximo de dos días.
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1.2. Recepción, conservación y transporte de las muestras
El personal del laboratorio que recibe las muestras debe:
a) Aplicar las medidas de bioseguridad.
b) Abrir la caja sobre una mesa en el área de recepción de laboratorio o donde procesa la
muestra, inspeccionando si se han producido derrames.
c) En caso de confirmar el derrame, retener la muestra, desinfectar el exterior de los
envases utilizando algodón humedecido con hipoclorito de sodio al 0.5%, evaluar la
magnitud del derrame y emplear motivo de rechazo, si aplica.
d) Revisar el llenado completo y correcto del formulario de la solicitud del examen para
diagnóstico y seguimiento de casos de tuberculosis (PCT-3) (anexo 4), que cumpla con
toda la información requerida y con letra legible de acuerdo a lo establecido en los
lineamientos técnicos para los laboratorios clínicos vigentes.
e) Verificar que los frascos estén herméticamente cerrados y que la información haya sido
escrita en el cuerpo y no en la tapa del mismo.
f) Cotejar la información de la viñeta del frasco con la información de la PCT -3
g) Notificar al servicio o establecimiento que refiere, si se han observado inconvenientes de
rechazo, utilizando el formulario de notificación de muestras rechazadas descrito en el
POE de recepción de muestras. Las muestras podrán ser rechazadas según los criterios
descritos en anexo 5. Motivo de rechazo de muestras.
h) La recepción de muestras será de acuerdo al horario de atención del establecimiento de
salud que las procesa.
i) En caso de recibir una muestra directa del paciente, se debe insistir en las instrucciones
para la toma de la segunda muestra.
Casos especiales
a) Si el laboratorio que recibe las muestras, no realiza todas las pruebas solicitadas, deberá
enviar la muestra a su laboratorio de referencia de la red.
b) Los establecimientos que no tienen laboratorio, no deben referir al paciente, se debe
enviar las muestras cuanto antes, después de su obtención (24 a 48 horas), si no puede
evitarse que el traslado se retrase, las muestras deben refrigerarse o mantenerse en un
lugar lo más fresco posible y protegidas de la luz, para evitar el desarrollo de
microorganismos contaminantes (no dejar transcurrir más de 5 días entre la recolección
del esputo y el procesamiento de la muestra); por lo que el laboratorio clínico, rechazará
toda muestra que excede los 5 días de recolectada.
c) En vacaciones prolongadas, si los establecimientos de FOSALUD captan un sintomático
respiratorio, deberán coordinar con el laboratorio clínico de segundo nivel de atención
de su red, la recepción y procesamiento de la muestra.
Procedimiento
Lugar de trabajo
La baciloscopía puede ser realizada en laboratorios de cualquier complejidad, que posean un
microscopio, con lente de inmersión en buenas condiciones, algunos insumos de bajo costo e
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instalaciones simples en el laboratorio. Deben seguir normas básicas sencillas que aseguren
calidad y minimicen los riesgos.
Los requisitos mínimos a cumplir son:

a) El área de trabajo debe estar alejada de la entrada, para evitar corrientes de aire, así
como el movimiento de personal alrededor, durante el procesamiento de las muestras.
b) Buena iluminación.
c) La mesa de trabajo para colocar las muestras que se reciban, y realizar los extendidos
debe estar en lo posible cubierta con material liso y resistente a soluciones germicidas
(fórmica, acero inoxidable o materiales similares).
d) Ventilación natural de laboratorio (a través de ventanas) o mecánica (mediante un
extractor de aire), con un caudal aproximado de 6 a 12 cambios del volumen de aire del
laboratorio por hora. Si se trata de un extractor de pared, éste debe contar con una
salida al exterior hacia un área poco transitada del servicio y a una altura de al menos 2
metros y medio del piso. En todos los casos se debe asegurar que la corriente de aire no
esté dirigida a la mesa en la que se preparan los extendidos.
e) Paredes pintadas, sin desprendimientos y pisos lavables, que puedan ser desinfectados
con hipoclorito de sodio al 0.5% (Anexo 6)
f) Un lavabo con fuente de agua y desagüe, en el que se pueda lavar las manos y realizar la
tinción.
g) Una alacena para los reactivos, portaobjetos y demás materiales.
h) Área para el microscopio.
i) Una mesa de trabajo para escribir los informes y los registros del laboratorio.
j) Un lugar para almacenar los frotis.
1.3. Preparación del extendido

Antes de empezar el trabajo, los técnicos deben lavarse las manos y colocarse el equipo de
protección personal requerido. Cada serie de muestras a procesar, no debe ser superior a doce.
Las láminas deben estar nuevas y en buen estado, si es necesario desengrasarlas previamente
con alcohol al 70%.
Fuente: Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias Laboratorio

Unidad de Salud San Vicente.
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a) Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel, humedecida con la solución
de hipoclorito de sodio al 0.5%. Esta hoja de papel constituye el área contaminada,
porque sobre ella deben realizarse las etapas más peligrosas de todo el procedimiento,
desde la apertura y preparación del extendido hasta el cierre del frasco.
b) Colocar las muestras sobre la mesa de trabajo, en el área delimitada en línea horizontal.
Si las muestras han estado en movimiento, dejar reposar los frascos por lo menos 20
minutos antes de abrirlos.
c) Para cada muestra, numerar en el esmeril de una lámina portaobjeto, con lápiz de grafito
el mismo número asignado de la boleta y al frasco; para el caso del ISSS la identificación
de la lámina se hará acorde al lineamiento institucional emitido por el centro de
referencia de control de calidad de baciloscopía. Se debe tener la precaución de no
tocar con los dedos la parte destinada al extendido porque puede engrasarse.
d) Destapar cuidadosamente sólo el frasco de la muestra que se va a procesar, cerca del
mechero encendido, el cual estará colocado entre la persona y la muestra, como medio
de protección; el frasco se coloca sobre el papel junto a la lámina correspondiente,
comprobando que ambos tengan el mismo número.
e) Quebrar el aplicador de madera en dos, utilizando el extremo astillado para mezclar y
tomar la partícula útil purulenta, este es uno de los pasos más importantes para
aumentar la probabilidad de identificar los bacilos de tuberculosis mediante la
baciloscopía.
f) Si la muestra es saliva, se debe mezclar bien y colocar mayor cantidad de muestra.
(Anotar en la PCT-4 el tipo de muestra que se procesa).
g) Tomar la lámina con los dedos en la parte correspondiente al número. Colocar la
partícula de muestra sobre la lámina, extendiéndola con el aplicador realizando
movimientos suaves circulares, tratando de dispersarla en forma homogénea en el
centro de la lámina, dibujando un óvalo de 2 centímetros de largo por un centímetro de
ancho, sin llegar a los bordes de la lámina para evitar que el operador se contamine al
manipularla.
h) Para que la película sea realmente homogénea, es necesario tomar una partícula de
muestra grande, eliminando el sobrante con el mismo aplicador. Nunca debe calentarse
la lámina mientras se está haciendo el extendido, pues se forman aerosoles, existiendo el
riesgo de infectarse a través de las vías respiratorias, también en el extendido se forman
círculos concéntricos y precipitados granulosos, la película pierde su homogeneidad
dificultando la lectura.
i) Al terminar el extendido, se deben desechar los aplicadores en un recipiente con
hipoclorito de sodio al 0.5%, los extendidos se dejan secar a temperatura ambiente. Las
muestras ya procesadas sólo deben ser descartadas después de la observación
microscópica, colocándoles a cada frasco 10 gotas de hipoclorito de sodio al 0.5%.
j) Una vez secos los frotis, fijar la lámina con el extendido hacia arriba, pasándola
rápidamente sobre la llama tres veces, cuidando que no se caliente demasiado. El
extendido nunca debe ser calentado a la llama mientras esté húmedo, pues el calor
fuerte altera la estructura de los bacilos y su posterior tinción, además puede generar
aerosoles.
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k) Colocar los extendidos en un soporte a medida que se van fijando y de inmediato
realizar la técnica de coloración ya que algunos bacilos pueden permanecer vivos
después de fijados con calor hasta que se incorpora la fucsina.
l) Al finalizar el trabajo, deben ser cuidadosamente descartados en el depósito de material
bioinfeccioso, el papel, aplicadores y otros materiales utilizados.
Preparación del extendido
1. Ordenar y enumerar las 2. Enumerar los portaobjetos 3. Quebrar el aplicador

muestras
4. Seleccionar y 5. Depositar la 6. Extender la 7. Fijar el extendido

mezclar la partícula muestra en el muestra cuando esté totalmente
más purulenta portaobjetos uniformemente (ver seco, pasando la lámina
anexo 7) rápidamente tres veces
sobre la llama del
mechero de arriba
hacia abajo
Fuente: Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias /Laboratorio

Clínico, Unidad de Salud de San Vicente
Coloración
El personal de laboratorio debe utilizar la técnica de Ziehl-Neelsen con los siguientes pasos:
a) Identificar y filtrar los colorantes antes de utilizarlos.
b) Filtrar los colorantes en cantidad necesaria a utilizar.
c) Colocar la serie de láminas fijadas (no superior a 12) sobre la bandeja metálica o varilla
que está en el lavabo, con el extendido hacia arriba separadas una de otra como mínimo
un centímetro y con el número hacia el operador. No olvidar colocar las láminas de
control positivo y negativo de muestras conocidas, previamente preparadas.
d) Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con fucsina fenicada.
e) Improvisando una pequeña antorcha (algodón impregnado con alcohol en una pinza),
pasarla lentamente por debajo de las láminas hasta que se produzca emisión de vapores;
en este momento inician los 5 minutos de coloración, cuando los vapores sean visibles
17
dejar de calentar. Al cesar la emisión de vapores se calienta nuevamente, se repite este
paso una vez más hasta completar tres emisiones sucesivas. La fucsina no debe hervir (la
pared de los bacilos puede destruirse y colorearse inadecuadamente) y si disminuye por
evaporación o derrame, hay que reponerla porque el extendido debe estar cubierto
constantemente durante el calentamiento.
f) Eliminar la fucsina, tomando el portaobjetos por el extremo numerado, inclinándolo
hacia adelante y lavar dejando caer una corriente de agua de chorro a baja presión sobre
la parte esmerilada de la lámina (donde no hay extendido), la que escurrirá suavemente
sobre la película.
g) Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con alcohol ácido por dos minutos
haciendo un movimiento de vaivén de modo que el alcohol vaya decolorando y a la vez
arrastrando suavemente la fucsina. Se considera decolorado el extendido cuando sus
partes más gruesas conservan solo un ligero tinte rosado. Si las partes más densas
quedan mal decoloradas, se pueden observar estructuras teñidas que no son
micobacterias.
h) Una vez eliminado el alcohol ácido, lavar las láminas cuidando de no desprender la
película.
i) Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con azul de metileno y dejarlo que
actúe por un minuto.
j) Lavar tanto el extendido como la cara inferior del portaobjetos.
k) Limpiar la parte posterior de la lámina (donde no hay extendido), con un algodón
humedecido con alcohol, para quitar los restos de colorante.
l) Colocar cada lámina en la gradilla hasta que se seque a temperatura ambiente.
Los reactivos para coloración serán proporcionados por el Laboratorio Nacional de Salud
Pública (LNSP), ya que cuenta con el control de calidad respectivo; en el caso del ISSS serán
proporcionados por el laboratorio de la Unidad Médica Atlacatl. (Anexo 8. Preparación de
colorantes)
18
Tinción de Ziehl-Neelsen
2. Calentar hasta obtener 3

emisiones de vapor. Apagar 3. Lavar con agua
1. Cubrir con fucsina antorcha y esperar completar
5 minutos
filtrada
6. Cubrir con
azul de metileno
durante 1 minuto
4. Cubrir con decolorante 5. Lavar con agua

durante 2 minutos nuevamente
8. Limpiar la parte posterior 9. Secado al aire

7. Lavar con agua de la lámina
Fuente: Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades

Respiratorias /Laboratorio Clínico, Unidad de Salud de San Vicente.
Examen microscópico
Observación microscópica y lectura del extendido.
La observación microscópica debe cumplir principalmente dos objetivos:
a) Determinar si en el extendido hay BAAR.
b) Cuantificar el número de bacilos por campo, si los hay.
Los bacilos ácido alcohol resistentes tienen entre 1 y 10 micras de largo y 0.2 a 0.6 micras de
ancho. Con la coloración de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente
curvos, fucsia, destacándose claramente contra el fondo azul.
En la muestra de esputo pueden presentarse aislados, apareados o agrupados. Es muy difícil

distinguir el bacilo de la tuberculosis de otras micobacterias por examen microscópico. Algunas
micobacterias que no son M. tuberculosis, pueden aparecer como bastones muy largos o como
cocobacilos.
19
Otros microorganismos pueden presentar distintos grados de ácido alcohol resistencia, como:
a) Rhodococcus sp.
b) Nocardia sp.
c) Legionella sp.
d) Ooquistes de Cryptosporidium spp.
e) Ooquistes de Isospora spp.
Se pueden observar en forma de cocos, bacterias con formas variadas (pleomórficas), filamentos
que a veces están cortados, o como esferas de gran tamaño si se les compara con las bacterias.
Es importante considerar que resulta poco frecuente encontrar más de diez microorganismos
ácido alcohol resistente diferentes a M. tuberculosis en las muestras de esputo de los SR.
Cuando el personal de laboratorio observa algún microorganismo que no tiene forma de bastón
debe consultar al supervisor.
Lectura de extendidos coloreados por Ziehl Neelsen:

a) Depositar una gota de aceite de inmersión, sin tocar el preparado con el gotero.
b) Enfocar el extendido donde ha colocado la gota de aceite, con la lente 100 X de
inmersión.
c) Observar cada campo microscópico en superficie y profundidad, moviendo
permanentemente el tornillo micrométrico, antes de desplazarse al campo contiguo.
Seguir el recorrido en línea recta sistemáticamente para recorrer el extendido, evitando
repetir la lectura de algunos campos. Ejemplo: de izquierda a derecha.
Fuente: Unidad de Prevención y Control de la

Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias
d) Observar la calidad del extendido y de la coloración. Si no fuesen buenas, repetir

nuevamente la baciloscopía de esa muestra.
e) Para el examen es necesario un microscopio binocular con objetivo de inmersión (100x)
y oculares de aumento moderado.
f) Examinar un mínimo de 100 campos microscópicos.
g) Se considera campo microscópico útil, aquel en el cual se observan elementos celulares
de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y células). Los campos en los que no
aparezcan dichos elementos, no deben contabilizarse en la lectura.
h) Cuando no se encuentren bacilos ácido alcohol resistente (BAAR), en 100 campos; se
debe hacer una nueva búsqueda más cuidadosa en otros 100 campos.
i) Se debe calcular el número de bacilos vistos por campo.
20
j) Al finalizar el examen, se debe separar el objetivo de la lámina, retirarla y verificar la
identificación con el número grabado en la lámina y anotar el resultado en el libro de
registro de actividades de laboratorio (PCT- 4, anexo 2), posteriormente, se deben anotar
los resultados en la solicitud de examen bacteriológico de tuberculosis (PCT-3) (anexo
4).
k) Antes de examinar un nuevo frotis, se debe limpiar el lente de inmersión con papel para
limpiar lentes o algodón impregnado con alcohol al 70%.
l) Posteriormente, se debe limpiar el aceite de la lámina y guardarla para su envío al control
de calidad.
Informe de resultados
El número de bacilos encontrados es muy importante como elemento de información, dada su
relación con el nivel de contagio del paciente, la severidad de la enfermedad y la evolución del
paciente bajo tratamiento. Por esta razón el informe debe ser cualitativo y cuantitativo; debe
reportarse en un máximo de 3 días hábiles desde el momento de recepción de la muestra en el
laboratorio Lineamientos técnicos para los laboratorios clínicos, MINSAL,
Se deben seguir las pautas descritas en el cuadro 3 para la presentación del informe de los
resultados:
Cuadro 3. Informe de resultados de BK
Campos de
Número de bacilos
inmersión Reporte Población bacilar
encontrados
observados
a
No se observan BAAR en 100 campos Negativo
Número exacto de b
De 1 a 9 BAAR en 100 campos bacilos observados
en los 100 campos c
* De 10 - 99 BAAR 100 campos +
De 1 - 10 BAAR por d
50 campos ++
campo en
Más de 10 BAAR por

20 campos e +++
campo en
* Para reportar una baciloscopía como positiva una cruz (+), debe de haber visualizado más de 10 bacilos en los 100
campos observados.
Fuente: Equipo técnico “Lineamientos técnicos para el diagnóstico y control de la tuberculosis por
laboratorio clínico, MINSAL, 2019”. a: Sección Micobacterias, Laboratorio Nacional de Salud Pública. b:
Wikimedia Commons. c, d y e: Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis, OMS Parte 1:
Manual de actualización de Baciloscopía, edición 2018.
21
Todo resultado positivo, debe informarse inmediatamente al personal del establecimiento de
salud correspondiente, para iniciar tempranamente el tratamiento del paciente y la identificación
de los contactos. Las causas de error en la BK se describen en el cuadro 4.
Es responsabilidad del establecimiento de salud correspondiente, el retiro de los resultados de

pruebas bacteriológicas solicitadas.
Cuadro 4. Causas de error en la baciloscopía

Falsos Falsos
Motivos
positivos negativos
Inheren- ∞ No representativa del lugar de la lesión. X
tes a la ∞ Muestra inadecuada. X
muestra ∞ Mal conservada X
Mala selección de la partícula de muestra. X
Defectos en la realización del extendido:
∞ Extendidos finos, gruesos o poco homogéneos. X
∞ Fijación de extendido húmedo o a temperatura superior
X
a 60 °C
Defectos en la realización de la coloración:
∞ Calentamiento deficiente o excesivo. X
∞ Decoloración insuficiente X X
∞ Precipitación de cristales por uso de reactivos no filtra-
X
dos o calentamiento excesivo.
Inheren- ∞ Decoloración excesiva. X
tes al Defectos en la lectura:
operador
∞ Uso de microscopios en mal estado X X
∞ Lectura de un número insuficiente de campos X
∞ Poca capacidad para diferenciar bacilos de artificios de
X X
coloración.
∞ Observación de un solo nivel del extendido X
∞ Transferencia de bacilos de un extendido a otro (varilla
X
de aceite de inmersión)
∞ Confusión de muestras y/o extendidos. X X
∞ Errores en trascripción de resultados. X X
∞ Hay 1 a 9 bacilos en 100 campos X
∞ Límite de sensibilidad 5,000 -10,000 bacilos/ml de
Inheren- muestra
X
tes a la
∞ Especificidad: se detectan BAAR que pueden ser no pa-
técnica X
tógenos y nocardias.
Fuente: Equipo técnico Lineamientos técnicos para el diagnóstico y control de la tuberculosis por
22
1.4. Indicadores de calidad
Cuadro 5. Indicadores operacionales de apoyo del laboratorio
Indicador Construcción del indicador Fuente
Número de BK de diagnóstico + número de BK de (M 40 + M 42 + M 41)
Carga de trabajo
control de tratamiento V.E.= definir a nivel local
(M 40 + M 42)
Concentración de Total de BK de diagnóstico/SR investigados por el
M 40
baciloscopía por S.R. laboratorio
V.E.=2
M40(BK+) + M42(BK+) X100
Porcentaje de BK de Total de BK de diagnóstico positivas al SR X 100/
M40 + M42
diagnóstico positivas Total de BK de diagnóstico realizadas al SR
V.E.= 5%
Total de BK de diagnóstico realizadas al SR/*Total de
Nº de baciloscopía Registro de actividades de
casos BK (+) (nuevos y de retratamiento
realizadas por caso laboratorio (PCT-4)
diagnosticados en el laboratorio)
Porcentaje de BK de Número de BK de control de tratamiento positivas x M 41(BK +) X 100
control de tratamiento 100/Total de BK de control de tratamiento. M41(BK + y neg)
positivas V.E. =5 – 10%
Porcentaje de BK de
diagnóstico positivas de Número de BK de diagnóstico positivas de bajo Registro de actividades de
bajo grado (positivas + y grado x 100/Total de BK de diagnóstico positivas. laboratorio (PCT-4)
contables)
* En el denominador serán tomados los casos diagnosticados, solo por baciloscopía, propios de su
establecimiento (tengan o no laboratorio).
Interpretación de indicadores de laboratorio:

∞ Carga de trabajo: mide el número total de baciloscopías realizadas
∞ Concentración de baciloscopía por SR: mide el número de baciloscopías
realizadas en promedio, por cada sintomático respiratorio.
∞ Porcentaje de baciloscopías de diagnóstico positivas: mide el porcentaje de
baciloscopías (+) del total de baciloscopías de diagnóstico realizadas .
∞ Número de baciloscopías realizadas por caso: se obtiene el número de BK
realizadas para encontrar un caso baciloscopía positiva, sea nuevo o de retratamiento .
∞ Porcentaje de baciloscopías de control de tratamiento positivas: permite
identificar si la negativización está siendo adecuada al tratamiento.
∞ Porcentaje de baciloscopías de diagnóstico positivas de bajo grado
(positivas + y contables): permite identificar si el diagnóstico es temprano o tardío.
23
2. Cultivo
Es el método bacteriológico más sensible y específico de los conocidos en la actualidad, ya que
puede detectar entre 10 a 100 BAAR por mililitro en una muestra determinada, si se ha realizado
cumpliendo los lineamientos, además permite estudiar los bacilos vivos por técnicas de
identificación.
Es un método de mayor complejidad y costo que la baciloscopía, cuyos resultados se obtienen

entre 20 y 60 días después del procesamiento de la muestra.
Mediante el cultivo, es posible incrementar la confirmación de diagnóstico de tuberculosis en
aproximadamente 15 a 20% del total de casos y en 20 a 30% de los casos de tuberculosis
pulmonar.
Entre los casos con tuberculosis extrapulmonar el aporte del cultivo al diagnóstico es variable,
según la localización de la enfermedad y aun con un resultado negativo del cultivo, es posible
que se establezca o se mantenga el diagnóstico de tuberculosis.
El cultivo para diagnóstico más la tipificación y sensibilidad está indicado en los siguientes casos:
1. Alta sospecha de TB y dos baciloscopías negativas
2. Sospecha de tuberculosis infantil
3. Sospecha de tuberculosis extrapulmonar
4. Personas con VIH y con sospecha de TB
5. Fracaso
6. Pérdida en el seguimiento
7. Recaída
8. Contacto de caso TB-MDR o TB-RR
9. Antecedente o estancia actual en centro penitenciario o bartolinas
10. Coinfección TB/VIH
11. No negativizan al segundo, cuarto o quinto mes de tratamiento
12. Baciloscopías con uno a nueve bacilos en cien campos
13. Migrante nacional o extranjero
14. Paciente con tratamiento antituberculoso que no mejora clínicamente, aunque las BK de
control sean negativas
15. Micobacteriosis
16. Personas con diabetes
17. Caso TB-RR, TB-MDR, TB-DR
18. Personal de salud
19. Poblaciones originarias
20. Población en situación de calle
21. SR con inmunodeficiencias
22. Otros (especificar)
24
El personal de laboratorio, mediante el cultivo, debe asegurar que los bacilos en las muestras de
los pacientes se multipliquen in vitro, hasta que se visualicen formando colonias en un medio
sólido, para ello en cada una de las etapas del proceso del cultivo, debe verificarse:
a) Persistencia del bacilo en muestra de la lesión
b) Se debe tener en cuenta que la probabilidad de recuperación aumenta
proporcionalmente con la rapidez con que se siembre la muestra.
c) El tiempo de demora en la reproducción del bacilo, ya que esta etapa es muy crítica
cuando el número de bacilos es escaso o cuando el pH de la muestra es desfavorable
para la sobrevivencia del bacilo como en el caso de lavados gástricos y orinas.
d) Verificar factores claves como la exposición a la luz solar, desecación y el calor ya que
son condiciones micobactericidas.
e) Vigilar la conservación de la muestra previa al cultivo: de 1 a 5 días, preservarla entre 2 a
8 °C y de 6 a 15 días a - 20 °C.
2.1. Preparación de medios de cultivo

Cuadro 6. Medios a base de huevos
Löwenstein Ogawa Kudoh

Stonebrink Ogawa
Jensen (ácido)
Fosfato monopotásico
g 2.4 3.5 6 12
KH2 PO4
Fosfato disódico
g 1.6
HNa2 PO4
Sulfato de magnesio
g 0.24
SO Mg. 7H2O
Citrato de magnesio g 0.6 0.6

Solución
salina Glutamato de sodio g 6 3
Piruvato de sodio g 6.25
L-asparagina g 3.6
Glicerol ml 12 36 24
Agua destilada c.s.p. ml 600 500 600 600
Huevos ml 1000 1000 1200 1200
Verde de malaquita 2% ml 20.0 20.0 36 24
pH aproximado 6.8 6.8 6.8 6.2

Fuente: Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis Normas y Guía Técnica Parte II Cultivo.
OPS. 2008
El área debe estar limpia y libre de corrientes de aire, deberá crearse un campo de trabajo con el
mechero y papel embebido con el desinfectante.
25
Cuadro 7. Equipos y materiales para la preparación de medios de cultivo
Descripción Cantidad
Equipos
Balanza analítica 1
Mechero Bunsen 1
Agitador 1
Medidor de pH 1
Refrigerador 1
Reloj marcador de tiempo 1
Coagulador Depende de la cantidad de medio a preparar
Autoclave 1
Licuadora 1
Materiales
Espátula 1
Papel para pesar 1
Erlenmeyer para preparar la solución de sales 1
Erlenmeyer para mezcla de sales y huevos 1
Erlenmeyer para solución de verde de malaquita 1
Probeta para agua destilada 1
Probeta para huevos 1
Probeta para glicerol 1
Algodón Una lb para 3 meses
Embudo de 200 mm de diámetro 1
Beaker para quebrar huevos 3
Gaza para forrar el embudo 4 yardas por cada lote preparado
Tubos de 20 x 150 mm Depende de la cantidad de medio a preparar
Dispensador de medio 1
Gradillas Depende de la cantidad de medio a preparar
Beaker para medir el pH (uno para cada buffer) 4
Varilla agitadora 1
Bolsas plásticas para almacenar el medio de cultivo Depende de la cantidad de medio a preparar
Magnetos de diferentes tamaños 2
Balón fondo plano para dispensar el medio de cultivo 2
Fuente: Sección de micobacterias - LNSP , Ministerio de Salud.
26
Conservación:
a) Las sales y los huevos deberán almacenarse a temperatura ambiente.
b) Preparar la solución de verde de malaquita al 2% un día antes cada vez que se prepare
medio de cultivo, protegiéndola de la luz para evitar su degradación, asegurándose de su
completa disolución.
Desarrollo del procedimiento:

Deberá utilizarse gabacha y mascarilla para evitar contaminar el medio de cultivo.
Día 1
a) Una vez pesadas las sales disolverlas en los 600 ml de agua destilada (para 1000 ml de
base de huevos).
b) Calentarlas suavemente hasta su disolución total.
c) Agregar el glicerol.
d) Esterilizarlas en la autoclave por 15 minutos a 121 °C.
e) Dejar enfriar.
f) Preparar la solución de verde de malaquita al 2%.
g) Limpiar y desinfectar los huevos. Deberán limpiarse de la siguiente forma:
∞ Mantenerlos en una mezcla de agua de chorro con detergente en polvo (agua
jabonosa) por un período de 15 minutos.
∞ Estregar uno a uno con un algodón embebido en agua jabonosa
∞ Enjuagar con abundante agua de chorro hasta eliminar por completo la espuma.
∞ Colocarlos en un recipiente limpio.
∞ Limpiar uno a uno con un algodón embebido con una solución de alcohol al 70%
∞ Colocarlos en un recipiente limpio y cubrirlos con papel toalla
Día 2
a) Encender el coagulador previamente hasta lograr una temperatura interna de 85 °C.
b) Con las manos cuidadosamente lavadas, quebrar los huevos uno a uno, en un pequeño
beaker y observar que no se encuentre en mal estado.
c) Vaciar los huevos uno a uno en la probeta hasta completar un litro.
d) Verter los huevos en el vaso de la licuadora y mezclarlos a baja velocidad durante unos
segundos.
e) Filtrar el homogenizado de huevos haciéndolo pasar a un erlenmeyer a través de un
embudo cubierto con 4 capas de gaza estéril.
f) Agregar inmediatamente la solución de verde de malaquita al 2%, lavando el frasco con
una porción de la solución de sales, verificando que no quede ningún grumo de verde
de malaquita.
g) Agregar la totalidad de la solución de sales al homogenizado de huevo.
h) Mezclar en el agitador eléctrico (si cuenta con el equipo) o de forma manual hasta que el
medio se encuentre homogéneo.
i) Dispensar en cada tubo una cantidad suficiente como para que al inclinarlo en el estante
del coagulador forme un pico de flauta desde la base del tubo hasta unos 2 cm por
debajo del borde de la rosca.
27
Tubos de 20 x 150 mm 10 ml
Tubos de 20 x 125 mm 8 ml
2 cm 1 cm
j) Identificar cada tubo con el nombre del medio de cultivo, número de lote asignado y
fecha de vencimiento (el vencimiento para el medio de Löwenstein Jensen, es de dos
meses).
k) Romper las burbujas que se hayan formado al dispensar el medio de cultivo.
l) Ubicar los tubos en el estante del coagulador de modo que se logre formar el pico de
flauta y cerrar el coagulador para evitar la pérdida de calor y dejar coagular por un
tiempo aproximado de una hora.
m) Separar 15 ml de medio y medir su pH.
n) Una vez coagulados, sacar los tubos del coagulador y colocarlos en una bandeja para
esperar a que se enfríen a temperatura ambiente.
o) Guardar los tubos en bolsas plásticas debidamente rotuladas con el número de lote
correspondiente, en el refrigerador entre 2 °C a 8 °C con sus tapones bien ajustados
evitando la desecación y contaminación.
p) Registrar en el formulario para preparación de medios de cultivo con la información
requerida (ver anexo 9).
Control de calidad de medios

La calidad de los lotes de medio de cultivo, es imprescindible para garantizar el desarrollo de los
bacilos, por lo que, a cada lote de medio, se le deberá realizar un control de calidad.
2.2. Equipo, materiales y reactivos para cultivo

La elección del método a utilizar depende del presupuesto, entrenamiento del personal,
equipamiento y de la asistencia técnica.
Cuadro 8. Equipo, materiales y reactivos según método

Método Petroff Ogawa
Descripción
modificado Kudoh
Equipo
Estufa o incubadora X X
Cronómetro X X
Equipo de protección personal X X
Refrigeradora X X
Cabina de seguridad biológica clase II tipo 2 X
Centrifuga Refrigerada X
28
Materiales
Mechero X X
Bandeja metálica inclinada X X
Dos tubos de medio de cultivos X X
Gradilla para láminas X X
Gradilla para tubos de 20 x 125 milímetros X X
Recipiente para descarte de desechos bioinfecciosos X X
Láminas porta objeto esmeriladas X X
Aplicadores de madera X X
Basurero con tapadera y con sus respectivas bolsas plásticas

X X
(roja y negra)
Jabón para lavado de manos X X
Papel X X
Plumón permanente X X
Lápiz de grafito X X
Lapicero X X
Papel toalla X X
Fósforos X X
Hoja de solicitud del examen (PCT-3) X X
Libro para registro de cultivo X X
Goteros estériles X
Gradilla para tubo cónico de 50 mililitros X
Dos hisopos de poliéster o de algodón estériles de quince

X
milímetros de longitud en promedio
Descarte de objetos punzocortantes X X
Reactivos
Hipoclorito de sodio al 0.5% X X
NaOH al 4% estéril X
Un tubo de vidrio estéril conteniendo tres mililitros de X

solución de NaOH al 4% por cada muestra a procesar
Buffer fosfato pH 6.8 estéril X
Agua destilada estéril X

Fuente: Equipo técnico, Lineamientos técnicos para el diagnóstico y control de la tuberculosis en el
29
Recolección de la muestra
∞ Esputo: Ver proceso de recolección para baciloscopía.
∞ Otros tipos de muestras: Todas las muestras extrapulmonares deben procesarse a

través de prueba molecular y en aquellos casos en el que el resultado no sea
concluyente o la muestra sea de difícil recolección considerar procesarla por cultivo. En
el cuadro 9 se describe la cantidad requerida, almacenamiento, conservación y el tipo de
recipiente a utilizar, según el tipo de muestra a procesar.
Cuadro 9. Muestras extrapulmonares
Tipo de Almacenamiento y Tipo de
Cantidad requerida
muestra conservación recipiente
Aspirado y 5-10 mililitros De 2 a 8 °C, sin sobrepasar las 24 horas. Frasco de tapón de
lavado gástrico Estabilizar con bicarbonato de sodio (ver rosca capacidad de 35 a
anexo 6) 50 ml
Lavado y 5-10 mililitros De 2 a 8 °C, sin sobrepasar las 24 horas. Frasco de tapón de
aspirado rosca estéril capacidad
bronquial de 35 a 50 ml
Orina No menos de 50 mililitros, De 2 a 8 °C, sin sobrepasar las 24 horas. Frasco de tapón de
recolectar la primera micción de la rosca estéril, capacidad
mañana, utilizando la técnica de de 35 a 50 ml
medio chorro, previo aseo.
Recolectar de 3 a 6 muestras en
días diferentes.
Líquido De 1 a 3 mililitros por tubo (todos De 2 a 8 °C. No más de 12 horas. Tubo estéril con tapa de
cefalorraquídeo los que el médico crea rosca y cierre
conveniente, según las pruebas hermético, capacidad
requeridas) de 10 - 15 mililitros, sin
anticoagulante.
Líquidos: De 2 a 3 mililitros por tubo (todos Se debe procesar inmediatamente o Tubo estéril, tapón
ascítico, los que el médico crea almacenarlo de 2 a 8 °C. No sobrepasar las hermético de rosca con
pericárdico, conveniente, según las pruebas 24 horas. capacidad de 10 a 15
articular, requeridas) Utilizar anticoagulante, Citrato de sodio al mililitros.
pleural, otros. 10% (3 gotas por cada 10 ml de muestra)
Tejidos y Será tomada por el personal De 2 a 8 °C. Sin sobrepasar las 24 horas. Utilizar frasco estéril.
material médico, la cantidad que éste Agregar 1 o 2 mililitros de solución salina o
resecado considere conveniente. agua destilada estéril o la cantidad
requerida según el tamaño de la muestra,
para evitar la desecación. No agregar
formol para el estudio bacteriológico
porque es letal para el bacilo.
Médula ósea De 1 a 3 mililitros. De 2 a 8 °C. No más de 12 horas. Utilizar frasco estéril.
Sangre 10 mililitros en sangre completa. De De 2 a 8 °C. No más de 12 horas. Tubo estéril con tapa
2 a 3 muestras tomadas en Colocar 2 gotas de anticoagulante de de rosca y cierre
diferentes días heparina. hermético, capacidad
de 10 - 15 mililitros, sin
anticoagulante.
Pus y De 1 a 3 mililitros o de 2 a 4 De 2 a 8 °C. Utilizar frasco estéril

secreciones hisopos humedecidos previamente
con solución fisiológica o agua
destilada estéril.
Nota: Las heces no son muestras adecuadas para el diagnóstico de tuberculosis, debido a las metodologías
que actualmente son utilizadas por la red.
Manual de procedimientos para el estudio de tuberculosis y otras micobacterias. Instituto Nacional de
Microbiología Carlos G. Malbran. Argentina, 1993.
30
Recepción, conservación y transporte de muestras
Ver información citada previamente en baciloscopía.
Cuanto antes se procese la muestra, mayor será la posibilidad de encontrar en ella el M.
tuberculosis. La temperatura ambiente y el transcurso del tiempo, favorecen la multiplicación de
los microorganismos que son causantes de contaminación en los medios inoculados,
disparando así los índices de contaminación en los cultivos.
Procedimiento
Lugar de trabajo
La estructura del laboratorio, la forma en que se asignan los espacios funcionales y su relación
entre sí, repercute de manera esencial en el flujo de trabajo y en la seguridad. Cada laboratorio
que realiza cultivo, debe hacer una evaluación de riesgo de acuerdo a su infraestructura y
capacidad instalada.
Elección del método de cultivo según los recursos disponibles

Las micobacterias son microorganismos aerobios estrictos, por lo que las necesidades básicas
de nutrientes de las especies cultivables son en general sencillas: el glicerol o la glucosa como
fuente de carbono, y una sal de amonio como fuente de nitrógeno. Aquellas muestras que
provienen de sitios no estériles (por ejemplo, esputos, orina), deben descontaminarse
previamente.
Mediante la decontaminación de la muestra se eliminan otros microorganismos que impiden el
desarrollo adecuado del bacilo.
La muestra debe homogenizarse, especialmente el esputo, con el fin de lograr su licuefacción y

liberar el bacilo del moco, así como material celular y tejido que puedan acompañarlo.
El empleo de decontaminantes adecuados, además de homogenizar la muestra, permite la

destrucción de los microorganismos asociados, conservando la viabilidad del bacilo.
Consideraciones generales
a) De preferencia se debe procesar la totalidad de cada muestra para no perder material
que pueda contener bacilos.
b) Procesar por separado cada muestra del mismo paciente sin mezclarlas, esto incrementa
la posibilidad de recuperar bacilos, en especial en el caso que alguna de las muestras se
contamine. A la vez permite verificar si se reitera el aislamiento a partir de distintas
muestras del paciente y así resolver dudas que ocasionalmente se pueden presentar en
el diagnóstico de tuberculosis o discernir si se está frente a un caso de micobacteriosis.
c) Evitar la contaminación cruzada, ordenando de tal forma que al inicio queden las
muestras estériles, seguidas de las muestras contaminadas, y según su motivo de
indicación de diagnóstico a control de tratamiento.
d) Aplicar distintos procedimientos antes de la siembra según la consistencia, volumen y
contaminación de la muestra. El tipo de muestra predominante, será seguramente el
esputo producido por expectoración espontánea.
31
2.3. Método de Petroff modificado
a) Debe utilizarse en la homogenización/decontaminación de muestras y su inoculación se
realiza en medios a base de huevos con pH cercano al neutro.
b) Es el más conveniente, por ser de bajo costo y se obtiene buena recuperación del BAAR
c) El profesional de laboratorio debe de tener en cuenta que el tiempo de contacto con el
decontaminante no debe de exceder los 30 minutos, de manera tal que normalmente no
es posible procesar series de más de 12 muestras.
Muestras pulmonares (ver anexo 10)

a) Utilizar el equipo de protección personal.
b) Colocar el material a utilizar y encender la cabina de seguridad biológica 5 minutos antes
de iniciar el procedimiento.
c) Verificar los datos de la muestra del paciente con la PCT-3 y asignar el número
correlativo.
d) Identificar los tubos con el medio de cultivo, con los datos correspondientes.
e) En un tubo cónico de 50 mililitros, estéril, transferir de 1 a 2 mililitros de muestra.
f) Proceder de la misma manera con las siguientes muestras de una en una. No abrir el
siguiente tubo si antes no se ha cerrado el anterior.
g) Agregar de 1 a 2 mililitros de NaOH al 4% a cada tubo.
h) Mezclar cada tubo, manualmente o con ayuda de un vortex, cada 5 minutos hasta que
completen 15 minutos, sin sobrepasar los 20 minutos.
i) Agregar buffer fosfato pH 6.8, a cada tubo, hasta completar la marca de 50 mililitros y
mezclar hasta homogenizar.
j) Centrifugar los tubos a 3,000 gravedades y temperatura entre 4 a 12 °C por 15 minutos.
k) Dejar reposar 5 minutos, sacar las camisas de la centrífuga y llevarlas a la cabina de
seguridad biológica (CSB).
l) Dentro de la CSB sacar los tubos de uno en uno.
m) Destapar y decantar el sobrenadante, limpiando la boquilla del tubo con un algodón
humedecido con hipoclorito de sodio al 0.5% o alcohol al 70%, luego taparlo hasta
completar la serie de 12 tubos.
n) Volver a destapar el tubo y re-suspender el sedimento con 4 o 5 gotas de buffer fosfato
pH 6.8.
o) Proceder de la misma manera con los tubos restantes.
p) Inocular los tubos con medio de cultivo Löwenstein Jensen (LJ), agregando de 4 a 5
gotas del sedimento y dispersar de manera tal que quede en toda la superficie del medio.
q) Con la última gota, preparar el frotis para realizar una baciloscopía.
r) Colocar en bandeja inclinada los tubos inoculados, con el bisel hacia arriba, dejando
flojos los tapones, e incubar de 35 a 37 °C.
s) A las 48 horas, enroscar bien los tapones, revisarlos cada semana hasta observarse
crecimiento o que cumplan las 8 semanas de incubación.
32
Muestras extrapulmonares
Procedimiento para líquido cefalorraquídeo y otros líquidos estériles
b) Colocar el material a utilizar y encender la cabina de seguridad biológica, 5 minutos
antes de iniciar el procedimiento.
correlativo.
e) Inocular de 2 a 3 tubos de medio de Löwenstein Jensen con 3 a 5 gotas de muestra.
f) Dispersar sobre la superficie del medio.
g) Colocar en bandeja inclinada los tubos inoculados, con el bisel hacia arriba, dejando
h) A las 48 horas revisar en busca de contaminación y si no se observa enroscar bien los
tapones, revisarlos cada semana hasta observarse crecimiento o que cumplan las 8
semanas de incubación. En caso de observarse contaminación proceder a realizar la
decontaminación con la técnica de Petroff modificada.
Las muestras de líquidos estériles de volumen menor a un mililitro deben sembrarse

directamente y en su totalidad distribuyéndolas en los tubos con medios de cultivo.
Las muestras de volumen mayor a cuatro mililitros deben:

a) Ser trasvasadas en su totalidad a un tubo cónico de 50 ml volcando suavemente el
contenido del envase dentro del tubo.
b) Centrifugar quince minutos a 3000 gravedades.
c) Esperar que se detenga completamente la centrífuga.
d) Retirar el tubo cuidando de no re-suspender el sedimento, trasladarlo a la cabina. Dejar
reposar cinco minutos antes de abrir.
e) Abrir el primer tubo centrifugado, descartar su sobrenadante en el recipiente dedicado a
este fin con un movimiento suave, sin salpicar, sin tocar la boca del frasco.
f) Limpiar el exterior del tubo con un algodón impregnado en hipoclorito de sodio al 0.5%
o alcohol al 70%, si se hubiere salpicado la pared. Cerrar la tapa del tubo.
g) Proceder de igual forma con los siguientes tubos.
h) No abrir el siguiente tubo sin haber cerrado el anterior.
i) Inocular en los medios de cultivo
Las muestras de nódulos linfáticos, biopsias y otros líquidos, requieren homogenización,

concentración o decontaminación, previo a ser procesadas para cultivos. Estos procedimientos
se hacen de forma habitual pero dentro de una cabina de seguridad biológica tipo II A2 y en un
laboratorio de contención.
33
Procedimiento para maceración de muestras de tejidos tomadas por biopsia
a) Trasladar la muestra lentamente a un mortero estéril de porcelana u otro material
autoclavable, sin salpicar. Puede ser necesario utilizar una pinza estéril para realizar esta
operación. Descartar la pinza en el recipiente para material contaminado.
b) Agregar un mililitro de agua destilada y arena estéril dentro del mortero, disgregar el
tejido presionando con la mano del mortero y homogenizar el tejido.
c) Si el tejido es normalmente estéril y ha sido tomado con asepsia, recoger con una pipeta
todo el material macerado, distribuirlo en los medios de cultivo identificados con el
número de la muestra.
d) Si el tejido contiene contaminantes, recoger con una pipeta transfer o gotero estéril todo
el material macerado, transferirlo al tubo de centrífuga identificado con el número de la
muestra que está siendo procesada, ubicar el tubo en el orden que le corresponde en la
serie de muestras que serán descontaminadas para que sea procesado mediante la
técnica de Petroff modificado.
e) Si se trata de una muestra normalmente estéril, pero se ignora si fue tomado y
mantenido en esterilidad, utilizar la mitad del macerado para la siembra directa y el resto
para descontaminar.
f) Ubicar el mortero dentro del papel o bolsa donde fue previamente esterilizado y
descartarlo dentro del recipiente destinado a esterilizar en el autoclave el material que se
va a reciclar.
g) Inocular de 2 a 3 tubos de medio de Löwenstein Jensen con 3 a 5 gotas de muestra.
h) Dispersar sobre la superficie del medio.
i) Colocar en bandeja inclinada los tubos inoculados, con el bisel hacia arriba, dejando
j) A las 48 horas revisar en busca de contaminación y si no se observa enroscar bien los
semanas de incubación.
Procedimiento para cultivo de muestra de orina

a) Procesar toda la muestra de la micción o un mínimo de 50 mililitros.
b) Centrifugar toda la muestra a 3000 gravedades por 15 minutos. Decantar los
sobrenadantes y depositar en un tubo cónico de 50 mililitros todos los sedimentos
obtenidos.
c) Decontaminar con el método de Petroff.
d) Inocular de 2 a 3 tubos de medio de Löwenstein Jensen con 3 a 5 gotas de sedimento.
e) Dispersar sobre la superficie del medio.
f) Colocar en bandeja inclinada los tubos inoculados, con el bisel hacia arriba, dejando
flojos los tapones, e incubar de 35-37 °C.
g) A las 48 horas, revisar en busca de contaminación y si no se observa enroscar bien los
semanas de incubación.
34
2.4. Método Ogawa – Kudoh
Debe utilizarse para procesar esputos en laboratorios sin equipamiento adecuado o suficiente
para aplicar la técnica de Petroff (anexo 11). Si no se dispone de cabina de seguridad biológica,
deben aplicarse las prácticas y medidas de bioseguridad recomendadas para la realización de la
baciloscopía
Procedimiento
b) Preparar la mesa de trabajo.
correlativo.
e) Proceder a hacer un extendido con la lámina ya identificada utilizando un palillo.
f) Abrir el envase. Elegir y recolectar con el hisopo, las partículas útiles mucopurulentas del
esputo, adhiriéndolas al hisopo estéril. Cerrar el envase.
g) Sumergir el hisopo estéril en un tubo con tres mililitros de solución de NaOH al 4%
durante dos minutos exactos.
h) Retirar el hisopo sin escurrir y sembrar en un tubo con medio de Ogawa acidificado,
realizar movimientos de rotación y presión. Descartar el hisopo.
i) Repetir el procedimiento utilizando el mismo NaOH al 4% e inocular el segundo tubo en
medio de Ogawa.
j) Descartar los hisopos en un recipiente destinado a ser esterilizado en el autoclave.
k) Colocar en bandeja inclinada los tubos inoculados, con el bisel hacia arriba, dejando
l) A las 48 horas, enroscar bien los tapones, revisarlos cada semana hasta observarse
crecimiento o que cumplan las 8 semanas de incubación.
Revisión y lectura de las muestras cultivadas

Es importante recalcar que se debe asignar un día de la semana para realizar la lectura y revisión
de los cultivos. En caso de que se identifique colonias sugestivas al complejo Mycobacterium
tuberculosis u otras micobacterias, referir al LNSP, el aislamiento acompañado de la hoja de
referencia de cepa (anexo 12), para su identificación.
Pasos:
a) Revisar periódicamente los tubos inoculados.
b) Mantener los tubos en incubación hasta las ocho semanas en el caso de medios de
cultivo a base de huevos.
c) Revisarlos bajo una fuente de luz que permita observar con claridad hasta las colonias
más pequeñas.
d) Verificar si se encuentran indicios de mala neutralización de la muestra.
e) Reportar si se detecta contaminación.
f) Verificar si la siembra está absorbida y el líquido se ha evaporado.
35
g) Registrar si quedan restos de hidróxido de sodio en el inóculo, esto se verifica si los
medios a base de huevos se aclaran hacia un tono amarillento, que lo diferencia del
resto de los tubos con siembras.
h) Debe registrarse en el libro del laboratorio si se detecta contaminación en toda la
superficie de un tubo del medio sólido, descartar el tubo y continuar el proceso hasta
emitir un resultado.
i) El personal de laboratorio debe producir de inmediato, el informe para comunicar si
detecta contaminación o pH inadecuado (viraje hacia al amarillo o verde intenso) en
todos los tubos sembrados con la muestra de un paciente.
j) Toda muestra extrapulmonar, debe ser resguardada, un máximo de 3 a 5 días, previo a la
verificación que el tubo no se haya contaminado.
k) Si la siembra está absorbida, ajustar la tapa para evitar la desecación del medio.
l) Solicitar y procesar una nueva muestra del paciente, toda vez que sea posible, cuando se
ha detectado contaminación o pH inadecuado del medio en todos los tubos sembrados.
Período de lectura a los siete días post siembra y luego una vez por semana
a) Identificar tubos contaminados y proceder como se ha descrito anteriormente (anexo
13).
b) Identificar los tubos con desarrollo de complejo Mycobacterium tuberculosis o de otras
micobacterias.
c) Registrar el desarrollo en el momento en que se observa y seguir los procedimientos
para producir el informe con la menor demora posible.
d) Repetir la lectura cada semana hasta emitir un resultado.
Selección de los cultivos positivos para identificación y prueba de sensibilidad

Los cultivos en medios sólidos deben reportarse de la siguiente manera:
a) Seleccionar los cultivos positivos para su identificación y prueba de sensibilidad.
b) Derivar al LNSP todos los tubos positivos, para prueba de sensibilidad y tipificación, en
triple embalaje y cadena de frio. Los cuales deben ir acompañados de la hoja de
referencia de cepas para prueba de sensibilidad y tipificación. (Ver anexo 12) y la hoja de
solicitud de examen bacteriológico para tuberculosis (PCT-3).
c) Transcribir el resultado obtenido de los registros del laboratorio en la PCT-3, utilizando la
escala descrita en el cuadro 10, cuantificar los resultados positivos.
d) Informar los cultivos positivos y los totalmente contaminados en el mismo día que son
detectados.
e) Cuando la lectura es visual, informar los cultivos negativos al finalizar la octava semana
de incubación de los medios a base de huevos.
36
Cuadro 10. Registro de resultados de cultivo
Registrar Si se observa Registrar Si se observa
Todos los tubos

Contaminado inoculados con la + 20 a 100 Colonias
muestra colonias separadas
contaminados
Colonias
Sin desarrollo luego separadas
Negativo Más de 100
de la inspección de ++ colonias
la octava semana
de incubación.
Colonias
confluentes
El número de Entre 1 y 19
colonias exacto colonias en el total +++ Colonias
de medios incontables
sembrados.
Fuente: Equipo técnico Lineamientos técnicos para el diagnóstico y control de la tuberculosis en el

laboratorio clínico, MINSAL, 2019/Sección Micobacterias de Laboratorio Nacional de Salud Pública (LNSP)
Descarte de tubos inoculados

Descartar los tubos, resultantes de la lectura, en un recipiente donde serán esterilizados en
autoclave durante una hora a 121 °C.
Riesgo biológico inherente a los procedimientos

El personal de laboratorio respecto a la técnica del cultivo BAAR, debe cumplir estrictamente las
disposiciones de medidas de bioseguridad, durante la agitación y centrifugación de tubos los
cuales generan aerosoles infecciosos; ya que el riesgo es mayor cuanto mayor sea la carga de
bacilos que contenga la muestra.
Contaminación cruzada
El personal de laboratorio debe evitar situaciones que pueden dar una contaminación cruzada,
entre ellas, la transferencia de microorganismos, de una muestra a otra al ser procesadas en
serie en el laboratorio.
Son condiciones propicias para este tipo de contaminación en el laboratorio: sobrecarga de

trabajo, alta frecuencia de muestras con baciloscopía positiva en la rutina, procedimientos poco
rigurosos, utilización de reactivos no alicuotados.
Organización del material y muestras del cultivo BAAR

El personal de salud debe sistematizar el trabajo para:
37
a) Minimizar el riesgo biológico y de transferencia de bacilos entre distintos materiales.
b) Evitar errores en el procesamiento de la muestra.
c) Permitir la trazabilidad de la muestra durante los procedimientos en caso que se
presenten dudas sobre los resultados.
d) Repetir los procedimientos siempre en el mismo orden en cada día de trabajo.
e) Ordenar los envases de las muestras, tubos y portaobjetos según su numeración.
f) Mantener todo el material ordenado durante todo el proceso.
Morfología de las colonias

Las colonias de Mycobacterium tuberculosis son habitualmente rugosas, secas, sin
pigmentación y con aspecto de migas de pan, además son de crecimiento lento.
Los medios sólidos evidencian el desarrollo de las micobacterias con cierto retardo con relación
a los líquidos, pero en cuanto se detecta el desarrollo es posible diferenciar las colonias con
características de M. tuberculosis; si se tiene experiencia, es posible orientar con mucho acierto
si se ha aislado el bacilo de la tuberculosis.
Cuando el medio de cultivo está muy húmedo, las colonias de cualquier micobacteria aparecen
lisas. Si las colonias se desarrollan lentamente, no tienen pigmentación, son lisas, pequeñas o
brillantes, se presenta la duda acerca si lo que se ha aislado es una micobacteria no tuberculosa.
Sin duda alguna es una micobacteria no tuberculosa si se detectan colonias de BAAR con algún
tipo de pigmentación (desde ligeramente amarilla hasta anaranjada fuerte) o con abundante
desarrollo en medios a base de huevos durante la primera semana de incubación. Muy
excepcionalmente Mycobacterium tuberculosis puede aparecer tan precozmente si el inóculo
es muy alto.
Si se sospecha el diagnóstico de Micobacteriosis, se deben enviar al LNSP todos los aislamientos

obtenidos con distintas muestras del paciente. Está fuera del alcance de este lineamiento la
identificación de micobacterias diferentes a las del complejo Mycobacterium tuberculosis.
2.5. Indicadores de calidad

Dependiendo de la carga de trabajo y de la incidencia de casos con bacteriología positiva, el
análisis mensual, trimestral o semestral del registro del laboratorio permite detectar errores
sistemáticos y sostenidos en el tiempo.
Resulta de interés para controlar la calidad del cultivo, clasificar a los pacientes adultos que se
hayan diagnosticado con tuberculosis pulmonar confirmada bacteriológicamente, en alguna de
las siguientes categorías:
A. Baciloscopía (+) y cultivo (+)
B. Baciloscopía (+) y cultivo no realizado
C. Baciloscopía (-) y cultivo (+)
D. Baciloscopía (+) y cultivo (-)
E. Baciloscopía (+) y cultivo contaminado
38
F. Baciloscopía no realizada y cultivo (+)
Con el total de casos clasificados en cada una de estas categorías, se podrán calcular los
indicadores descritos en el cuadro 11.:
Cuadro 11. Indicadores de calidad de cultivo

Valor
Indicador Calculo según categorías Fuente
esperado
3 – 5% en medios Libreta de
Porcentaje de contaminación N° de tubos contaminados x 100 sólidos registros de
N° total de tubos sembrados 8 – 10% en medios cultivos
líquidos
Relación de resultados entre A x 100 >95 – 98% Libreta de

baciloscopía y cultivo: A+B+D+E registros de
Proporción de muestras cultivos
baciloscopía positiva con cultivo
positivo
Aporte del cultivo al diagnóstico C x 100 15-20% Libreta de
Total de Casos registros de
cultivos
Tiempo para emisión de informes N° de Informes emitidos a x 100 Al menos el 95% Libreta de
de muestras procesadas por término (< a 3 días) registros de
cultivo en medio solido N° Total de informes cuando se utiliza Cultivos e
medio solido informe de
entrega de
resultados
Fuente: Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis, Normas y Guía Técnica Parte II Cultivo.
OPS. 2008
Cuadro 12. Interpretación de indicadores

Señales de alarma
Método de Petroff modificado y Valor normal
Ogawa Kudoh (%) Si es mucho mayor Si es mucho menor
investigar investigar
Aporte del cultivo al diagnóstico
bacteriológico de tuberculosis. 20 A ByC
Porcentaje muestras BK (+) Cultivo (-) 2-3 CyD No hay problema
Porcentaje de cultivos con positividad 3 CyE

menor a la de la baciloscopía. No hay problema
Porcentaje de tubos contaminados 3-5 F G
Errores de lectura de baciloscopías: «falsos negativos».

A Se está investigando un alto porcentaje de casos de tuberculosis pulmonar poco avanzada, incluyendo
pediátricos (no indica problema técnico de laboratorio).
B Deficiente solicitud de cultivos (se están investigando pacientes que no son SR)
39
Excesiva demora entre la toma y procesamiento de las muestras decontaminación muy enérgica de las
muestras (excesiva concentración y/o tiempo de contacto con el decontaminante).
Baja velocidad o sobrecalentamiento en la centrífuga
C
Baja sensibilidad de los medios (falta de homogeneidad, sobrecalentamiento al coagular, exceso de verde
de malaquita, pH excesivamente ácido)
Incubación a temperaturas muy altas u oscilantes
D Errores de lectura de baciloscopías: «falsos positivos»
E Tendencia a asignar a la baciloscopía una positividad mayor a la real
Muestras conservadas sin refrigeración

Demora entre la toma y procesamiento de las muestras
Concentración de decontaminante más baja que lo normalizado
Escaso tiempo de contacto de la muestra con el decontaminante;
F
Defectos en el proceso de esterilización
Descuidos en procedimientos que requieren esterilidad (mal uso de mechero y/o de la cabina de seguridad
biológica, excesivo movimiento de gente en el área de trabajo, generación de corrientes de aire por
ventiladores o equipo de aire acondicionado, otros.)
Concentración de decontaminante más alta que lo normalizado

G Excesivo tiempo de exposición de la muestra con el decontaminante
Concentración de verde de malaquita en el medio más alta que lo normalizado
Fuente: Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis. Normas y Guía Técnica Parte II Cultivo.
OPS. 2008
Es importante recalcar que se debe asignar un día de la semana para realizar la lectura y revisión
de los cultivos.
3. Pruebas moleculares
3.1. Xpert MTB/RIF Ultra
Es una prueba molecular que permite detectar ácidos nucleicos del gen rpo B específica del
complejo Mycobacterium tuberculosis y mutaciones asociadas con resistencia a rifampicina
Se realiza en forma directa, es decir, a partir de muestras tanto pulmonares como

extrapulmonares, sin necesidad de esperar el resultado del cultivo.
Principios de la prueba
a) Es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real (amplificación y
detección al mismo tiempo).
b) Sistema completo de control interno de los reactivos, por lo que no tiene la necesidad
de utilizar controles externos positivos y negativos por separado.
c) Ultrasonido integrado para la rápida lisis de la célula para liberar el Ácido
desoxirribonucleico (ADN).
d) Los motores son dirigidos por el software para realizar el movimiento de las válvulas y
accionadores hidráulicos acoplados.
40
e) Cuenta con tecnología de fluido inteligente, ya que los líquidos fluyen directamente por
micro válvulas y permite el uso de cantidades mínimas de los componentes de la
reacción.
f) La interpretación de los resultados y análisis de los datos ocurre de manera automática.
Ventajas
a) Es adecuado para todos los niveles de laboratorios con una infraestructura apropiada y
con una carga de trabajo acorde a la capacidad del equipo.
b) Detecta el Complejo M. tuberculosis y resistencia a rifampicina en el mismo cartucho.
c) Puede ser usada como prueba diagnóstica independiente.
Desventajas
a) Requiere suministro de electricidad estable e ininterrumpida.
b) Calibración anual de los módulos.
c) Ambiente con temperaturas entre 15 a 30 °C.
d) Los cartuchos y reactivos deben ser almacenados entre 2-28 °C.
e) La prueba no debe ser utilizada para monitorizar el control del tratamiento.
f) La prueba de sensibilidad a drogas (PSD) es aún requerida para la detección de
resistencia a otras drogas diferentes a rifampicina.
Motivos para indicar la prueba molecular rápida

1. SR con 2 BK (-) y con TB presuntiva
2. Persona con VIH con signos y síntomas sugestivos de TB
3. Personas privadas de libertad, o con antecedente; con signos y síntomas sugestivos
de TB
4. SR con diabetes.
5. SR con inmunodeficiencias
6. Caso TB que no negativiza al segundo, cuarto o quinto mes de tratamiento; o en el
noveno mes, en caso de retratamiento.
7. Antes tratados (recaídas, fracasos, pérdida en el seguimiento)
8. Sospecha de TB extrapulmonar
9. Contactos de caso con TB-MDR, TB-RR O TB-DR
10. Niños con TB presuntiva
11. Personal de salud
12. Otros (especificar)
13. Indicación por resultado previo (en caso que el resultado de error o inválido, se
procesa la muestra nuevamente o se solicita nueva muestra).
El equipo, materiales y reactivos necesarios para realizar el procesamiento de las muestras, se

describe en el cuadro 13.
41
Cuadro 13. Equipo, materiales y reactivos
Equipo Materiales
∞ Refrigeradora ∞ Kits de cartuchos de la prueba rápida
∞ Equipo para la prueba rápida molecular molecular mediante amplificación de
mediante amplificación de ácido nucleico con ácido nucleico
computadora (laptop o PC) y lector de código ∞ Kits de cartuchos de calibración
de barras ∞ Reactivo inactivador para muestras
∞ Aire acondicionado (Buffer): frascos de 8 ml, 1 por prueba.
∞ Autoclave ∞ Pipetas estériles del kit, descartables 1
∞ Cronómetro por prueba
∞ Vortex ∞ Equipo de protección personal
∞ Cabina de seguridad biológica tipo II A2 ∞ Tubos cónicos de 15 o 50 mililitros
(necesaria para muestras extrapulmonares) (opcional)
∞ Centrífuga a 3,000 gravedades ∞ Papel toalla
∞ Algodón
∞ Alcohol al 70%
∞ Mechero
∞ Fósforos
∞ Hipoclorito de sodio al 0,5%
∞ Papel
∞ Buffer Fosfatos
∞ Solución salina fisiológica estéril
∞ Descarte para desechos bioinfecciosos
∞ Mortero con pistilo estériles
∞ Bisturí o tijera estéril
∞ Pinza con garra estéril
∞ Plumón o marcador permanente
∞ Agua esterilizada
∞ Bicarbonato de sodio al 1%
Fuente: Equipo técnico MINSAL, 2019
Recepción, conservación y transporte de las muestras

Ver información citada previamente en baciloscopía y cuadro 9 en sección de cultivo.
Preparación de la muestra
Esputo
a) Abrir el frasco de esputo cuidadosamente.
b) Añadir directamente en el frasco de la muestra, 2 volúmenes de buffer para un volumen
de muestra (proporción 2:1), evitando la formación de aerosoles
c) Si la muestra supera el volumen recomendado: pasar un aproximado de 2 ml de esputo a
otro recipiente, adicionar el buffer para lograr la proporción recomendada 2:1 (1 mililitro
de esputo es la cantidad mínima, pero de 3-4 mililitros es la cantidad requerida ideal).
d) En el caso de muestras demasiado viscosas: mezclar bien (de preferencia en mezclador
tipo vórtex) y esperar hasta que la muestra alcance la consistencia adecuada para ser
procesada.
e) Tapar y cerrar bien el frasco, agitar enérgicamente de 10 a 20 veces o utilizar un
mezclador tipo vórtex durante 10 segundos como mínimo.
f) Esperar a que la muestra se homogenice, mezclando cada 5 minutos por 15 minutos.
42
g) Después de homogenizada la muestra, esperar por 5 minutos e inocule 2.0 mililitros de
la muestra inactivada dentro del cartucho.
Muestras concentradas
a) Utilización de esputo procesado: se puede utilizar el sedimento resultante de la
decontaminación por el método de Petroff.
b) LCR y otros líquidos: pueden ser procesados de una manera similar a la del esputo; sin
embargo, la concentración de la muestra por centrifugación proporciona mejores
resultados en la prueba.
c) Se requiere un laboratorio con una cabina de seguridad biológica (CSB) para abrir las
camisas de la centrífuga y decantar el sobrenadante.
d) A 0.5 mililitros del sedimento de muestra concentrada o decontaminada, añadir 1.5
mililitros de buffer.
e) Cerrar la tapa del frasco y agitar enérgicamente de 10 a 20 veces o utilizar un mezclador
tipo vórtex durante 10 segundos como mínimo.
f) Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos.
g) Luego agitar nuevamente de 10 a 20 veces o utilizar un mezclador tipo vórtex, durante
10 segundos como mínimo.
h) Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
i) Transcurrido el tiempo de incubación, la muestra debe estar líquida antes de ser
procesada.
j) Verificar que se encuentra sin grumos visibles.
k) Después de homogenizada la muestra, esperar por 5 minutos e inocular 2.0 mililitros del
sedimento o concentrado dentro del cartucho.
Procesamiento de muestras extrapulmonares en cartucho Xpert MTB/RIF Ultra

Las guías actualizadas en el año 2021 de la OMS establecen que la prueba Xpert MTB/RIF
ULTRA se puede utilizar para procesar muestras de LCR y muestras de tejido homogeneizadas
(es decir, biopsias de ganglios linfáticos u otros tejidos), heces (en niños), orinas (en pacientes
VIH positivos) o muestras descontaminadas (si no se recolecta de manera estéril), si el cultivo se
realiza al mismo tiempo se mejora la sensibilidad de detección de los verdaderos positivos.
Las muestras deben transportarse y almacenarse entre 2 y 8 °C antes de su procesamiento.
Líquido cefalorraquídeo
El método óptimo para procesar LCR con Xpert MTB/RIF Ultra depende del volumen de la
muestra disponible para la prueba. Las muestras de LCR teñidas con sangre y xantocrómicas
pueden producir resultados falsos negativos debido a la inhibición de la PCR, por lo que, en la
medida de lo posible, este tipo de muestra debe cultivarse a la par de la prueba molecular Xpert
Ultra.
43
Si hay más de 5 ml de LCR disponible para la prueba:
a) Transferir la muestra de LCR a un tubo de centrífuga cónico y concentrar la muestra a
3,000 g durante 15 minutos.
b) Verter con cuidado el sobrenadante en otro tubo estéril. Asegurarse de dejar
aproximadamente 0.5 ml de sobrenadante en el tubo, para garantizar de que el
sedimento permanezca intacto.
c) El LCR concentrado debe decantarse en una cabina de seguridad biológica.
d) Resuspender el sedimento hasta un volumen final de 2 ml, agregando el reactivo de
muestra Xpert MTB/RIF Ultra.
e) Mezclar el sedimento con el buffer mediante agitación con mezclador tipo vórtex, para
garantizar que nada de la suspensión quede en los lados o en el fondo del tubo.
f) Después de siete a ocho minutos de incubación a temperatura ambiente, agitar la
muestra por segunda vez. Incubar de siete a ocho minutos adicionales (15 minutos en
total de incubación) a temperatura ambiente.
g) Etiquetar un cartucho Xpert MTB/RIF Ultra con el número de identificación de la
muestra.
h) Con una pipeta de transferencia nueva, transferir 2 ml de la muestra de LCR
resuspendida al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra.
i) Cargar el cartucho en el instrumento Gene Xpert siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Si hay de 1 a 5 ml de LCR disponible:

a) Agregar un volumen igual de buffer al LCR.
b) Mezclar la muestra y el buffer con agitación como se describió anteriormente.
c) Después de siete a ocho minutos a temperatura ambiente, agitar la muestra en un
mezclador tipo vórtex por segunda vez.
d) Incubar durante siete a ocho minutos adicionales (15 minutos de incubación total) a
temperatura ambiente.
e) Agregar 2 ml de la mezcla de la muestra directamente al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra.
f) Cargar el cartucho en el instrumento Gene Xpert siguiendo las instrucciones del
fabricante.
Si hay de 0.1 a 1 ml de LCR disponible:

a) Agregar suficiente buffer a la muestra de LCR para lograr un volumen final de 2 ml.
b) Mezclar la muestra y el buffer agitando en un mezclador tipo vórtex como se describió
anteriormente.
c) Después de siete a ocho minutos a temperatura ambiente, agitar la muestra por segunda
vez. Incubar de siete a ocho minutos adicionales (15 minutos en total incubación) a
d) Agregar los 2 ml de mezcla de muestra directamente al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra.
e) Cargar el cartucho en el instrumento Gene Xpert siguiendo las instrucciones del
fabricante.
44
Si hay menos de 0.1 ml de LCR disponible
Este es un volumen de muestra insuficiente para realizar pruebas con Xpert MTB/RIF Ultra, por lo
que es recomendable que la muestra solamente se cultive.
Ganglios linfáticos y otros tejidos (recolección estéril)

Todas las manipulaciones deben realizarse en una cabina de seguridad biológica
a) Cortar la muestra de tejido en trozos pequeños en un mortero, homogeneizador o
triturador de tejidos estéril utilizando pinzas con garra, bisturís y tijeras (si se tienen
disponibles).
b) Agregar aproximadamente 2 ml de solución salina estéril.
c) Triturar el tejido y solución salina estéril con un mortero (u homogeneizador o triturador
de tejidos) hasta obtener una suspensión homogénea.
d) Colocar aproximadamente 0.7 ml de la suspensión homogénea en un tubo cónico con
tapón de rosca estéril, utilizando una pipeta de transferencia.
e) Evitar transferir cualquier grumo de tejido que no se haya homogeneizado
correctamente.
f) Utilizar una pipeta de transferencia para duplicar el volumen de la muestra con el buffer
Xpert MTB/RIF Ultra (es decir, agregar 1.4 ml de buffer por 0.7 ml de suspensión
homogénea).
g) Agitar el tubo vigorosamente de 10 a 20 veces o agitarlo en un mezclador tipo vórtex
durante al menos 10 segundos.
h) Incubar el tubo con la preparación de la muestra durante 10 minutos a temperatura
ambiente y luego agitar la muestra de nuevo, durante otras 10–20 veces o agitar en
mezclador tipo vórtex durante al menos 10 segundos.
i) Incubar el tubo con la preparación de la muestra a temperatura ambiente, durante 5
minutos más.
j) Con una pipeta de transferencia nueva, transferir 2 ml de la muestra procesada al
cartucho Xpert MTB/RIF Ultra.
k) Cargar el cartucho en el instrumento Gene Xpert siguiendo las instrucciones del
fabricante.
l) Para las muestras no recolectadas de manera estéril, el manual de la OMS sugiere una
decontaminación/protocolo de concentración similar al utilizado para el esputo.
Muestras de huesos (seguir instrucciones del macerado de tejido) y articulaciones

a) Obtener 1 ml de muestra purulenta y mezclar con 2 ml de buffer.
b) Agitar la muestra en el mezclador tipo vórtex durante, al menos, 10 segundos, luego
incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Mezclar con mezclador tipo vórtex
otros 10 segundos e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.
c) Agregar 2 ml de la mezcla al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra y cargar el cartucho en el
instrumento siguiendo las instrucciones del fabricante.
45
Aspirados bronquiales o lavados bronco alveolares obtenidos por
fibrobroncoscopias
a) Descontaminar la muestra con NaOH al 4% (el mismo procedimiento realizado con el
esputo) y concentrar la muestra por centrifugación a 3000 g durante 20 minutos.
Desechar el sobrenadante dejando aproximadamente 0.5 ml del sobrenadante y
resuspender el sedimento.
b) Agregar buffer en una proporción de 2: 1 al sedimento re suspendido.
c) Mezclar la muestra y el buffer agitando con mezclador tipo vórtex
d) Después de siete a ocho minutos a temperatura ambiente, realizar un segundo paso de
agitación.
e) Incubar de siete a ocho minutos adicionales (15 minutos en total incubación) a
f) Agregar 2 ml de la muestra tratada con el buffer al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra y cargar
el cartucho en el instrumento siguiendo las instrucciones del fabricante.
Muestras de heces
(Recomendación de las guías consolidadas de la OMS. Módulo 3: Diagnóstico de tuberculosis)
En niños con signos y síntomas de TB pulmonar, Xpert MTB/RIF Ultra, debe usarse como prueba
diagnóstica inicial, para la detección de la TB y de la resistencia a la rifampicina en muestras de
esputo, aspirado nasofaríngeo y heces en lugar de la baciloscopía, el cultivo y las PSF fenotípicas.
Método SOS (Simple one-step) de procesamiento de heces

En el método de procesamiento de heces SOS, se realiza un paso para liberar M. tuberculosis de
las heces. Las partículas se sedimentan por gravedad, y se supone que esto permite que los
bacilos de la TB floten en la parte superior de la solución acuosa, debido a su pared celular
lipídica.
Requisitos de bioseguridad
En el método SOS de procesamiento de heces, estas se añaden directamente al frasco de
reactivo para muestras que se proporciona en el kit Xpert; esto provoca la inactivación inmediata
de las bacterias. Por lo tanto, el método SOS de procesamiento de heces, se puede realizar en
un espacio abierto y bien ventilado, con prácticas adecuadas de reducción de formación de
aerosoles y el uso apropiado de equipo de protección personal.
Procedimiento
a) Antes de procesar las heces, se evalúa la consistencia de la muestra mediante la escala de
heces de Bristol. (Ver figura 2.)
46
Figura 2. Escala de Bristol de clasificación de las heces
Fuente: Practical manual of processing stool samples for diagnosis of childhood TB.Geneva: World Health
Organization; 2022. Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO
b) En el caso de las heces con aspecto de tipo 1 a 5 en la escala de Bristol (heces consistentes),
se transfieren directamente 0,8 g de heces o una cantidad del tamaño de la uña del pulgar del
recipiente que contiene la muestra de heces, al frasco con buffer usando una varilla de
madera o un aplicador. (Figura 3)
47
Figura 3. Procesamiento de heces consistentes
Fuente: Practical manual of processing stool samples for diagnosis of childhood TB. Geneva: World Health
c) En cuanto a las heces con aspecto de tipo 6 y 7 en la escala de Bristol (heces líquidas), se
extraen 2 ml de buffer del frasco de buffer y se descarta, se transfieren 2 ml de heces al frasco
de buffer con una pipeta de transferencia. (Figura 4.)
Figura 4. Procesamiento de heces líquidas
Fuente: Practical manual of processing stool samples for diagnosis of childhood TB. Geneva: World Health
d) Con todos los tipos de heces, el buffer se agita enérgicamente durante 30 segundos y luego
se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
e) Este paso se repite una vez.
f) Después de comprobar cuidadosamente que las partículas y los restos sólidos se han
asentado, se transfieren 2 ml del sobrenadante del frasco de buffer al cartucho Xpert MTB/RIF
Ultra.
48
g) A continuación, el cartucho se introduce en el instrumento Gene Xpert.
h) El uso del instrumento Gene Xpert y la interpretación de los resultados de la prueba se
realizan conforme a las instrucciones del fabricante.
Aspirados gástricos
a) Neutralizar 5 ml de aspirado gástrico con un volumen igual de bicarbonato de sodio
estéril al 1%.
b) Almacenar congelado en ≤ -20 °C si la muestra no se va a analizar inmediatamente.
c) Descongelar la muestra (si se ha congelado previamente), homogeneizar y digerir en
NaOH al 4% y agitar durante 30 segundos.
d) Incubar la muestra durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido de
neutralización con Buffer fosfato, luego centrifugar a 3000 g durante 15 minutos.
e) Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 2 ml de buffer fosfato.
f) Para realizar la prueba en Xpert MTB/RIF Ultra, agregar 1.5 ml de buffer a 0.5 ml del
sedimento concentrado.
g) Mezclar la muestra y el buffer agitando con mezclador tipo vórtex. Después de siete a
ocho minutos a temperatura ambiente, agitar la muestra por segunda vez.
h) Incubar de siete a ocho minutos adicionales (15 minutos en total incubación) a
i) Añadir 2 ml de la muestra tratada con el buffer al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra y
cargarlo en el instrumento siguiendo las instrucciones del fabricante.
Muestras de orina
Alternativa 1:
a) Obtener 1 ml de orina sin procesar y sin diluir.
b) Agregar el buffer en una proporción de 2: 1 a la orina y mezclar vigorosamente o agitar
en mezclador tipo vórtex .
c) Después de siete a ocho minutos a temperatura ambiente, agitar la muestra por segunda
vez.
d) Incubar la muestra durante siete a ocho minutos adicionales (15 minutos de incubación
total) a temperatura ambiente.
e) Agregar 2 ml de la muestra tratada con el buffer, al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra y
cargar el cartucho en el instrumento.
Alternativa 2:
a) Obtener 2 ml de orina sin procesar y sin diluir.
b) Centrifugar la orina a 3000 g durante 15 minutos, retirar el sobrenadante y resuspender
el sedimento en 0.75 ml de buffer fosfato.
c) Agregar el buffer en una proporción de 2: 1 al sedimento de orina.
d) Mezclar la muestra y el buffer agitando con mezclador tipo vórtex .
49
e) Después de siete a ocho minutos a temperatura ambiente, agitar la muestra por segunda
vez. Incubar de siete a ocho minutos adicionales (15 minutos en total incubación) a
f) Añadir 2 ml de la muestra tratada con el buffer al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra y cargar
Alternativa 3:
a) Centrifugar de 2 a 20 ml de orina a 3000 g durante 15 minutos. Desechar el
sobrenadante, dejando aproximadamente 0.5 ml del sobrenadante y resuspender el
sedimento de la muestra de orina en 1 ml de buffer fosfato.
b) Agregar buffer en una proporción de 2: 1 a la orina resuspendida.
c) Mezclar la muestra y el buffer en el mezclador tipo vórtex.
d) Después de siete a ocho minutos a temperatura ambiente, realizar un segundo paso de
agitación con mezclador tipo vórtex .
e) Incubar de siete a ocho minutos adicionales (15 minutos de incubación total) a
f) Añadir 2 ml de la muestra tratada con el buffer al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra y cargar
Alternativa 4:
a) Para orina congelada (volumen 30-40 ml), descongelar y centrifugar la muestra a 3000 g
durante 15 minutos.
b) Retirar el sobrenadante con cuidado asegurándose de retener el sedimento; dejando 1.0
ml de sobrenadante.
c) Tomar el sedimento y resuspenderlo en 0.75 ml del sobrenadante guardado.
d) Agregar buffer en una proporción de 2: 1 a la orina resuspendida.
e) Mezclar la muestra y el buffer agitando con mezclador tipo vórtex.
f) Después de siete a ocho minutos a temperatura ambiente, agitar la muestra por segunda
vez.
g) Incubar de siete a ocho minutos adicionales (15 minutos total de incubación) a
h) Añadir 2 ml de la muestra tratada con el buffer al cartucho Xpert MTB/RIF Ultra y cargar
Estabilidad de la muestra ya inactivada

Las muestras inactivadas son estables a temperatura ambiente por 5 horas; si no es posible
procesarlas, pueden mantenerse hasta 12 horas en refrigeración a temperatura entre 2 y 8
grados centígrados.
Preparación del cartucho

a) Preparar el número de muestras de acuerdo a la cantidad de módulos disponibles en el
instrumento Gene Xpert (o sea, solo los que se encuentren en funcionamiento).
50
b) Iniciar la preparación de las muestras dentro de los 30 minutos antes que un módulo
esté disponible.
c) Los cartuchos deben estar a temperatura ambiente al momento de usarlos, por lo que
debe esperar al menos 15 minutos luego de sacarlos de refrigeración.
d) No abrir el cartucho hasta estar próximo a realizar la prueba.
e) Utilizar el cartucho dentro de 30 minutos después que haya sido abierto.
f) Tomar el cartucho sólo por los lados.
g) No tocar el código de barras o el tubo de reacción en la parte trasera.
h) Identificar el cartucho con el número de muestra, escribiendo al lado del cartucho o
pegar la etiqueta de identificación.
i) No colocar la identificación en la cubierta del cartucho ni obstruir el código de barras
2D.
j) Abrir el cartucho y depositar 2 mililitros de la muestra preparada usando la pipeta plástica
de transferencia (suministrada en el kit).
k) Introducir la muestra cuidadosamente.
l) Cerrar la tapa firmemente.
m) Iniciar la prueba.
Cuidados
a) Evitar pipetear cualquier partícula sólida de la muestra al cartucho.
b) Evitar la formación de burbujas al pipetear la mezcla de la muestra al cartucho.
c) No utilizar el cartucho si la fecha de uso ha caducado, la tapa de cierre está rota o ha
sido accidentalmente abierta, se encuentre húmedo, se ha caído o sacudido el cartucho
después de haber agregado la muestra preparada.
d) Evitar usarlo si el tubo de reacción en la parte posterior, parece haber sido dañado.
e) Cada cartucho es para un solo uso, y no se puede volver a utilizar una vez que ha sido
escaneado.
Inicio de la prueba
a) El instrumento de la prueba molecular rápida mediante amplificación de ácido nucleico,
ya debe estar encendido (una pequeña luz azul aparece en el panel frontal).
b) Iniciar sesión en Windows como:
c) Nombre de usuario: Cepheid, contraseña: cphd.
d) Hacer doble click en el icono «Gene Xpert Dx» en el escritorio.
e) Acceder con la cuenta de usuario.
f) Hacer click en «no» en el cuadro de diálogo «Gestión de base de datos» para empezar el
día de trabajo.
g) Hacer click en « Check Status» para confirmar que todos los módulos están disponibles.
h) Hacer click en «Creat test».
i) Abrir una ventana solicitando escanear el código de barras del cartucho.
51
j) Tomar el lector de código de barras y escanearlo manteniendo presionado el botón
amarillo, si el escáner no funciona se puede introducir manualmente el código de barras
escribiendo los números que aparecen en las dos líneas del cartucho.
k) Después de haber escaneado el código de barras, aparecerá una ventana en la que se
introducirá el nombre de identificación del paciente y la identificación (ID) de la muestra.
l) De forma predeterminada, el software en pantalla muestra el tipo de prueba a realizar.
m) El módulo donde se coloca el cartucho se selecciona automáticamente, pero puede ser
seleccionado de forma manual.
n) Hacer click en « start test».
o) Abrir completamente la puerta del módulo elegido, el cual estará indicado por una luz
verde parpadeante por encima del módulo seleccionado.
p) Insertar el cartucho cuidadosamente con el código de barras hacia adelante.
q) Al cerrar la puerta del módulo con el cartucho, la prueba se iniciará automáticamente.
Es recomendable que exista un punto de red para establecer comunicación con el proveedor del
equipo para correcciones, mantenimiento o fallo del equipo.
Manejo de desechos
Se lleva a cabo siguiendo las normas vigentes en el país para el manejo de desecho biológico
infeccioso.
Informe de resultados
Cuadro 14. Posibles resultados de prueba molecular

Resultado del equipo Reportar
CMTB Not Detected CMTB No detectado
CMTB Detected Rif Resistance
CMTB detectado resistencia a rifampicina no detectada
Not Detected
CMTB Detected Rif Resistance CMTB detectado resistencia a rifampicina detectada
Detected Solicitar una muestra adicional para realizar cultivo y PSD, para determinar
el perfil completo de resistencia a fármacos y confirmar TB-MDR y XDR
CMTB Trace Detected Rif CMTB detectado trazas resistencia a rifampicina indeterminada
Reportar tal como lo da el equipo y solicitar nueva muestra para cultivo y
Resistance Inderterminate
PSD
Invalid Inválido
No se reporta este resultado del equipo hasta repetir la prueba con la
misma muestra*
Error Error
No se reporta este resultado del equipo hasta repetir la prueba con la
misma muestra*
No resultado
Not Result No se reporta este resultado del equipo hasta repetir la prueba con la
misma muestra*
*Si persiste el resultado inválido, error, no resultado se reporta tal cual y se solicita nueva muestra.
Fuente: Manual del operador del equipo Gene Xpert.
52
Cómo interpretar un resultado “Traza”
Traza significa que se han detectado niveles muy bajos de CMTB, por lo tanto, no se puede
detectar resistencia a rifampicina.
Este resultado es suficiente para iniciar tratamiento.
Indicadores de calidad
Cada equipo debe ser monitoreado mensualmente usando el siguiente conjunto mínimo de
indicadores para evaluar el uso adecuado:
∞ Número de pruebas realizadas por mes.
∞ Número y proporción de CMTB detectado, resistencia a RIF no detectada.
∞ Número y proporción de CMTB detectado, resistencia a RIF detectada.
∞ Número y proporción de CMTB detectado, RIF indeterminada.
∞ Número y proporción de CMTB no detectado.
∞ Número y proporción de errores.
∞ Número y proporción de resultados inválidos.
∞ Número y proporción de ausencia de resultados.
Cuadro 15. Estimación de indicadores de desempeño, prueba molecular Xpert

MTB/RIF Ultra
Valor
Indicador Cálculo Fuente
Esperado
Número y porcentaje Número de CMTB detectado x 100 Libro de
10%*
de CMTB detectado Número de pruebas realizadas Registro de
Número y porcentaje Gene Xpert
Número de CMTB detectado RR detectada x 100
de CMTB detectado No aplica
Número de CMTB detectado
RR detectada
Número y porcentaje
Número de CMTB detectado trazas RR indeterminada
de CMTB detectado
x 100 No aplica
trazas RR
Número de pruebas realizadas
indeterminada
Número y Porcentaje Número de errores x 100
< 3%
de Errores Número de pruebas realizadas
Número y porcentaje Número de resultados inválidos x 100
< 1%
de resultados inválidos Número de pruebas realizadas
Número y porcentaje
Número de sin resultados x 100
de muestras sin < 1%
Número de pruebas realizadas
resultado
Porcentaje de
Número de informes emitidos a término x 100 Al menos
informes emitidos en
Número total de informes 95%
tiempo oportuno
* Cuando se utiliza el método molecular cerrado en muestras pulmonares.
Fuente: Manual para el Diagnóstico de la Tuberculosis Parte 4: Manual de Procedimientos de Evaluación
Externa de Calidad de los Métodos Bacteriológicos aplicados al Diagnóstico y Control de Tratamiento de la
Tuberculosis. Febrero 2019.
53
3.2. Xpert MTB/XDR
Es una prueba in vitro de reacción en cadena de la polimerasa anidada en tiempo real (PCR),
realizado en el instrumento Gene Xpert, para la detección del complejo Mycobacterium
tuberculosis ampliamente resistente a los medicamentos (XDR), detecta ADN en muestras de
esputo no procesadas, sedimentos concentrados preparados a partir de esputo o tubos de
cultivo en MGIT.
En muestras donde se detecta CMTB, el ensayo Xpert MTB/XDR también puede detectar
resistencia a isoniazida (INH), Etionamida (ETH), mutaciones asociadas a la resistencia a la
fluoroquinolona (FLQ) y mutaciones asociadas a fármacos inyectables de segunda línea (SLID)
El ensayo Xpert MTB/XDR está diseñado para su uso como prueba refleja para una muestra, por
lo tanto, se debe tener una prueba Xpert MTB/RIF Ultra con un resultado de CMTB detectado.
No se puede realizar el ensayo Xpert MTB/XDR sin antes realizar Xpert MTB/RIF Ultra.
La prueba molecular XDR, se indicará en los casos siguientes:

a) Casos TB-RR
b) Antes tratados (recaídas, fracasos, pérdidas en el seguimiento)
c) Contacto de paciente TB-RR; TB-MDR
d) Pacientes que negativizan al segundo mes de tratamiento, pero en el control posterior,
nuevamente presentan bacteriología positiva.
e) Paciente que la PSD en medio sólido o líquido resulte con resistencia a un fármaco.
Aspectos a considerar para la solicitud de muestras para estudio Xpert

MTB/XDR
a) Siempre antes de “correr” el cartucho Xpert TB XDR se debe de hacer un Xpert MTB/RIF
Ultra.
b) Referir siempre una nueva muestra al establecimiento que tiene disponible la prueba
Xpert MTB/XDR, acompañada del formulario PCT-3.
c) Ante resultados RR solicitar nueva muestra y enviar para la prueba Xpert MTB -XDR, esto
aplica para los establecimientos que no cuentan con dicha prueba
d) Y en el caso que el resultado de la prueba XDR sea CMTB no detectado, se reporta y se
debe solicitar nueva muestra para cultivo BAAR y PSD.
La muestra debe ser enviada en triple embalaje y en cadena de frio de 2 a 8 °C , después de su

obtención en un tiempo de 24 a 48 horas como máximo.
54
Cuadro 16. Consideraciones generales para prueba Xpert MTB/XDR, en los
establecimientos que realizan la prueba
Muestras a procesar* Esputos, sedimentos de esputo
Tiempo para obtener resultados 90 minutos
El mismo procedimiento para la prueba Xpert

Preparación de la muestra
MTB/RIF Ultra
Esputos sin procesar, temperatura ambiente hasta
Almacenamiento de muestras 7 días
Sedimentos de esputo 2 a 8 °C hasta 7 días
Temperatura ambiente, 2 horas. 30 min.
Muestras tratadas con buffer
2-8 °C, 4 horas.
Esputo sin procesar: 1.0 ml
Volumen mínimo de muestra
Sedimento de esputo: 0.5 ml
Esputo sin procesar: 136 UFC/ml
Límite de detección
Sedimento de esputo: 86 UFC/ml
Los recomendados por el fabricante, según la
Materiales y reactivos
metodología
*Se han generado resultados válidos con Xpert MTB/XDR utilizando cultivos positivos MTB de un MGIT.
Para probar aislados de MTB de las botellas de cultivo positivo MGIT, use al menos 1.0 ml de material de
cultivo.
Fuente: Manual de usuario Xpert MTB/XDR Cepheid. 2021
Cuadro 17. Blancos diana incorporados en el ensayo Xpert MTB/XDR para

identificar o inferir resistencia a los medicamentos.
Fármaco Blanco diana

inhA promotor
katG
Isoniazida fabG1
oxyR- ahpC region intergenetica
Etionamida inhA promotor
gyrA
Fluoroquinolonas
gyrB
Amikacina, kanamicina, rrs
capreomicina eis promotor
Fuente: Manual de usuario Xpert MTB/XDR Cepheid. 2021
55
Cuadro 18. Posibles resultados de la prueba Xpert MTB/XDR
Drogas Resultado
INVALID/ERROR/NO RESULT
N/A MTB DETECTED
MTB NOT DETECTED
Low INH Resistance DETECTED
INH Resistance DETECTED a
Isoniazida
INH Resistance NOT DETECTED
INH Resistance INDETERMINATE
Low FLQ Resistance DETECTED
FLQ Resistance DETECTED
Fluoroquinolonas
FLQ Resistance NOT DETECTED
FLQ Resistance INDETERMINATE
AMK Resistance DETECTED
Amikacina AMK Resistance NOT DETECTED
AMK Resistance INDETERMINATE
KAN Resistance DETECTED
Kanamicina KAN Resistance NOT DETECTED
KAN Resistance INDETERMINATE
CAP Resistance DETECTED
Capreomicina CAP Resistance NOT DETECTED
CAP Resistance INDETERMINATE
ETH Resistance DETECTED
Etionamidaa
ETH Resistance NOT DETECTED
Etionamidaa no dará indeterminado por diseño de ensayo

Fuente: Manual de usuario del Xpert MTB-XDR
4. Prueba LF-LAM para detección de antígeno de

lipoarabinomanano
4.1 Principios de la prueba

LF-LAM es una prueba mediante inmunocromatográfía para la detección cualitativa del antígeno
LAM a partir de micobacterias en muestras de orina humana. El LAM es un componente
lipopolisacárido importante de la pared celular externa de las micobacterias. En las personas con
infección por el VIH y enfermas de gravedad, la TB puede diseminarse a diversos órganos.
Puesto que el LAM es filtrado por los riñones, es detectable en la orina, particularmente en
pacientes con infección por el VIH en fase avanzada y TB diseminada.
La detección del LAM en la orina indica un cuadro grave, que requiere tratamiento inmediato.
Además, en pacientes inmunodeprimidos con TB, la respuesta inmunitaria habitual no logra
contener a los bacilos debido al nivel bajo de linfocitos CD4 y al deterioro de la respuesta del
paciente; por lo tanto, los bacilos de TB pueden ser degradados y excretados por procesos
56
corporales normales. En ambos casos, el antígeno micobacteriano LAM puede estar presente en
la orina, lo que posibilita su detección para el diagnóstico.
La prueba utiliza anticuerpos policlonales altamente purificados, para capturar moléculas de LAM
(el antígeno diana) con un análisis de inmunoadsorción enzimática de tipo “sándwich” de flujo
lateral.
La muestra se agrega a la tira reactiva y el flujo capilar desplaza el antígeno LAM a través de la tira
de modo que:
a) Se una a un anticuerpo conjugado con oro coloidal para formar un inmunocomplejo
b) El flujo capilar desplaza el inmunocomplejo más allá de la ventana de control y la
ventana del paciente donde es capturado por un anticuerpo anti-LAM fijado a la
membrana de nitrocelulosa,
c) La presencia de LAM será confirmada por la marca de oro coloidal.
Una banda gris violácea en la ventana del paciente indica un resultado positivo, y muestra que el
antígeno micobacteriano LAM, está presente en la muestra en el límite de detección de la
prueba o por encima de él.
Si no hay ninguna banda visible, el LAM no está presente, o posiblemente lo esté por debajo del
límite de detección y, por lo tanto, se presume que el resultado es negativo.
Se ha agregado una ventana de control para garantizar la validez de la prueba; debe haber una
línea visible en dicha ventana en todas las pruebas. La banda de control utiliza un anticuerpo con
especificidad por el oro coloidal.
Criterios de selección a quienes irá dirigida la prueba

a) Toda persona VIH confirmada en estado crítico, alta sospecha de tuberculosis pulmonar
o extrapulmonar y que no pueda producir esputo.
b) Pacientes con prueba positiva al VIH, independientemente de los signos y síntomas de
tuberculosis (pulmonar o extrapulmonar) y que tiene recuento de CD4 menor o igual a
200 células/ μl o estadios 3 y 4 de la OMS.
c) Personas con VIH positivos que están gravemente enfermos con sospecha de TB y que
no puedan dar una muestra de esputo.
d) Toda persona con VIH y que presenta un cuadro agudo de una o varias infecciones
oportunistas que haya abandonado la terapia antirretroviral y a quienes se les sospecha
tuberculosis.
No se utilizará en los siguientes casos:

a) Casos de TB en tratamiento antituberculosis con o sin tratamiento antirretroviral
b) Pacientes con tratamiento por infección latente por tuberculosis (ILTB)
Suministros necesarios para las pruebas

El kit de prueba LF-LAM contiene las tarjetas de pruebas, una tarjeta de escala de referencia y un
prospecto con instrucciones.
57
Otros elementos requeridos para las pruebas, pero que no se incluyen en el kit son:
a) Recipiente estéril para la obtención de la muestra de orina
b) Pipeta u otro dispositivo que permita transferir con precisión 60 μl de orina (podría ser
una micro pipeta calibrada de 100 μl de puntas con filtro)
c) Cronómetro
4.2 Procedimiento
El procedimiento básico se muestra en el anexo 14.
Es importante usar la tira reactiva dentro de las dos horas posteriores a la retirada de la lámina
protectora. Si se analiza más de una muestra, asegurarse de etiquetar correctamente cada tira
reactiva, para que se pueda vincular correctamente a la muestra de cada paciente.
Los materiales que no se utilicen en la prueba deben retirarse de la mesa de trabajo y la mesa se
debe limpiar con desinfectante.
Para garantizar la exactitud de la prueba, es importante seguir un flujo de trabajo organizado con
respecto a la realización de las pruebas y los tiempos.
Los pasos básicos son:

a) Retirar la lámina protectora de cada tira reactiva necesaria y asegurarse que estén debi-
damente etiquetadas para la muestra de cada paciente.
b) Agregar 60 μl de orina a la almohadilla destinada a la muestra utilizando una pipeta de
precisión u otro dispositivo.
c) Esperar 25 minutos y luego leer los resultados. Los resultados son estables durante 35
minutos. No leerlos pasados los 35 minutos.
d) Comprobar los resultados con la tarjeta de escala de referencia, incluida en el kit de la
prueba.
e) Lectura e interpretación
f) La prueba incorpora una ventana de control que actúa como una medida de control de
calidad interno. Para que la prueba sea válida, debe ser visible una banda de control en la
ventana correspondiente, cada vez que se realiza una prueba. Ver figura 5.
g) Si la banda de control no es visible, la prueba no es válida y la muestra debe analizarse
nuevamente.
h) Se incluye una tarjeta de escala de referencia en cada kit para ayudar a interpretar y cla-
sificar los resultados.
i) Para que la prueba se considere positiva, debe haber una banda gris violácea visible en la
ventana de control y en la ventana del paciente.
j) La intensidad de color de la banda del paciente, debe ser similar o más oscura que cual -
quiera de las bandas positivas en la tarjeta de escala de referencia.
k) Las bandas del paciente y de control pueden diferir en intensidad, pero ambas deben
estar presentes para que un resultado positivo de la prueba sea válido.
58
l) Las diferentes intensidades de color en la tarjeta de referencia, se vinculan a una clasifi -
cación de positividad, en la que el grado 1 es el menos intenso y representa la concen-
tración más baja de LAM.
m) Aunque no se trata de una prueba cuantitativa, en general la intensidad de la banda se
correlaciona con el nivel de LAM en la muestra.
n) Los niveles bajos de LAM que están cerca del límite de detección pueden ser difíciles de
interpretar. Ver figura 6.
o) LF-LAM está considerada como una prueba de diagnóstico que puede usarse en combi -
nación con las pruebas existentes para el diagnóstico de la TB asociada al VIH como
complemento del criterio clínico, no debe usarse como una prueba de reemplazo o de
triaje.
p) Si la prueba resulta negativa y persiste la sospecha de tuberculosis se sugiere la utiliza -
ción de métodos de diagnóstico molecular recomendado por la OMS. Todos los pacien -
tes con signos y síntomas de tuberculosis pulmonar que pueden producir esputo, deben
enviar al menos una muestra de esputo para Xpert MTB/RIF Ultra, como prueba de diag -
nóstico inicial.
Figura 5. Procedimiento de control interno de calidad para garantizar la validez

de la prueba.
Fuente: Directrices consolidadas de la OMS sobre la tuberculosis. Módulo 3: diagnóstico - diagnóstico

rápido para la detección de tuberculosis, actualización 2021.
59
Figura 6. Ejemplo de intensidad de banda poco clara o equívoca que a veces se
observa y que dificulta la interpretación de los resultados.
Fuente: Directrices consolidadas de la OMS sobre la tuberculosis. Módulo 3: diagnóstico - diagnóstico

rápido para la detección de tuberculosis, actualización 2021.
Los métodos diagnósticos serán indicados según corresponda, cumpliendo algoritmo

diagnóstico, descritos en anexo 15.
5. Bioseguridad
Los presentes lineamientos incorporan un enfoque de evaluación de riesgos, de acuerdo al
Manual de bioseguridad en el laboratorio de tuberculosis de la OMS (2012).
Prácticas de trabajo seguras

Los laboratorios presentan numerosos peligros para el personal, y no todos son inmediatamente
evidentes. Las prácticas de trabajo seguras están diseñadas para:
a) Reducir el riesgo de infección o lesiones para la persona, sus compañeros de trabajo y la
comunidad
b) Menos del 20% de las infecciones adquiridas en el laboratorio se pueden atribuir a un ac-
cidente reconocido. El resto no tiene una causa identificable, pero la formación de aero-
soles es la más probable.
Pilares de la bioseguridad
La bioseguridad tiene tres partes claves para la manipulación de bacilos de TB de manera segura:
a) Contención primaria
60
Prácticas de trabajo seguras, para minimizar los derrames y la creación de aerosoles in-
fecciosos, equipos idóneos, utilizados y mantenidos correctamente
b) Secundaria
Infraestructura y diseño para apoyar las actividades primarias
c) Terciaria
Edificios para albergar el laboratorio y sus actividades.
La combinación de los tres es necesaria para manipular los bacilos de TB con seguridad. Sin em-
bargo, la práctica de trabajo segura (figura 7), es esencial.
Figura 7. Práctica de trabajo segura
Fuente: Manual de seguridad en el laboratorio. Edición global Organización Panamericana de la Salud, 2022
Actividades generadoras de aerosoles

Son las actividades que aumentan el riesgo de producción de aerosoles debido a la fuerza
mecánica del procedimiento. Los aerosoles se producen más fácilmente a partir de fluidos
menos viscosos.
a) El esputo suele ser viscoso y es más difícil que genere aerosoles.
b) Los cultivos líquidos son fluidos y por lo tanto, generan aerosoles más fácilmente.
Algunos ejemplos son agitación vorticial, centrifugado, mezclado, pipeteo.
61
Las tareas con distinto nivel de riesgo deben ser ubicadas convenientemente para que se
direccione el material potencialmente infeccioso desde un área de riesgo mediano, a otra de
mayor riesgo (ver cuadro 19). Esta última área, debe estar muy bien separada y allí se intensificará
la extracción de aire, los cuidados en el trabajo cotidiano, las medidas de contención del riesgo y
de contingencia para accidentes.
Cuadro 19. Niveles de precaución, actividades de laboratorio asociadas y

evaluación de riesgos en los laboratorios de tuberculosis
Actividades en el
Nivel de riesgo Evaluación del riesgo
laboratorio
Riesgo bajo de generar aerosoles
Microscopia directa del esputo; infecciosos durante la
Riesgo bajo preparación de muestras para la manipulación de muestras;
prueba Xpert MTB/RIF Ultra concentración baja de partículas
infecciosas.
Procesamiento y concentración de
muestras para inoculación en Riesgo moderado de generar
medios de cultivo primarios; aerosoles infecciosos de las
Riesgo moderado
pruebas moleculares directas en muestras; baja concentración de
esputo procesado mediante una partículas infecciosas.
prueba con sondas lineales.
Riesgo alto de generar aerosoles
Manipulación de cultivos para
infecciosos de los cultivos;
Riesgo alto identificación, PSF fenotípicas o
concentración alta de partículas
LPA en cultivos.
infecciosas.
Fuente: Manual de seguridad en el laboratorio. Edición global Organización Panamericana de la Salud,
2022
Información y control médico del personal de laboratorio

a) Las personas inmunodeprimidas, tienen un riesgo mucho mayor de progresión de la in-
fección a la enfermedad. Los factores de riesgo incluyen coinfección por el VIH, diabe-
tes, quimioterapia, desnutrición, consumo de tabaco y enfermedades crónicas, pero no
se limitan a ellos.
b) Un trabajador de laboratorio inmunodeprimido, tiene un mayor riesgo que la infección
por TB progrese a enfermedad. Se debe obtener un certificado médico antes de trabajar
en un laboratorio de TB que realice cultivos y pruebas de sensibilidad a fármacos (PSF).
c) Apenas 10 bacilos ácido resistentes son suficientes para establecer la infección. Trabajar
con un gran número de bacilos ácido resistentes y realizar procedimientos generadores
de aerosoles, aumenta en gran medida el riesgo de infección por TB.
d) Cuando el personal presente síntomas respiratorios por más de quince días, deberá pa-
sar consulta médica, y disponer de exámenes, entre ellos baciloscopía, radiografía de tó-
rax, prueba molecular Xpert MTB/RIF Ultra y cultivo de muestras pulmonares.
e) En cada sección, deben estar expuestas las normas básicas de bioseguridad específicas
para cada tipo de tarea.
f) El personal debe informar a su jefe inmediato cualquier accidente de trabajo.
62
g) Realizar evaluación médica de los trabajadores de salud, de las áreas de mayor riesgo de
transmisión de M. tuberculosis y otras infecciones respiratorias., por lo menos una vez al
año.
5.1. Equipos de protección personal

a) El equipo de protección personal (EPP) proporciona una barrera física para minimizar el
riesgo de exposición a aerosoles, salpicaduras e inoculación accidental.
b) El EPP debe usarse en todo momento dentro del laboratorio.
c) El EPP mal ajustado, inadecuado o usado de forma incorrecta es menos eficaz y puede
crear una falsa sensación de seguridad.
d) La elección del EPP depende del tipo de trabajo que se realice y del riesgo que se quiera
minimizar.
e) Todos los EPP deben ser suministrados por el laboratorio.
f) Los artículos de EPP deben ser desechables y no reutilizables.
g) El personal no debe llevar a casa ningún EPP para lavar, eliminar o usar fuera del labora-
torio.
Limpieza de mesas de trabajo

Las mesas de laboratorio, se deben desinfectar con hipoclorito de sodio al 0.5%, o alcohol al
70%, antes y después de la rutina de trabajo. La desinfección de las mesas, debe ser hecha por el
personal técnico, no debe dejarse esta tarea al personal de limpieza.
Las diluciones de lejía, deben prepararse cada día, ya que éstas liberan cloro en forma gaseosa
con lo que se debilita su potencial germicida transcurrido el tiempo, además las soluciones de
hipoclorito de sodio son inactivadas en presencia de grandes cantidades de materia orgánica.
Cabina de seguridad biológica

Las malas técnicas de uso de una cabina de seguridad biológica, expondrán a una posible
infección.
Las acciones que realice el operador, siempre deben complementar el funcionamiento de la

cabina de seguridad biológica. La contaminación cruzada, se previene con el uso de prácticas de
trabajo seguras (ver figura 8).
Solo se debe permitir que un trabajador opere la cabina de seguridad biológica, más de una
persona, dañará la cortina de aire frontal y permitirá que se liberen aerosoles.
Cuando la cabina de seguridad biológica es pequeña, no habrá suficiente espacio para mantener
todos los materiales necesarios dentro de ella. En ese caso, guardar los artículos limpios en una
mesa, para que sean fácilmente accesibles sin interrumpir el trabajo.
La tarea que se esté realizando, determinará qué elementos se necesitan dentro de la cabina de
seguridad biológica. El almacenamiento de artículos adicionales en dicha cabina, aumenta el
riesgo de contaminación cruzada.
63
Figura 8. Zona de trabajo seguro
A Rejil la frontal
B Reji lla trasera
Zona de trabajo seguro
Fuente: Manual de seguridad en el laboratorio. Edición global Organización Panamericana de la

Salud, 2022
La cabina de seguridad biológica clase II, tipo A2, filtra y retiene a los bacilos que pueden quedar
suspendidos en las operaciones de mayor riesgo. Debe estar ubicada en un lugar donde la
circulación de personal sea la indispensable y lejos de puertas y ventanas que se abran. Conviene
dejar un espacio de aproximadamente treinta centímetros libres, alrededor del equipo para
poder acceder durante las tareas de control y mantenimiento.
Cuando se utilizan cabinas de seguridad biológica, no es indispensable tener un sistema de

extracción de aire, aunque lógicamente es conveniente. La extracción puede ser realizada por la
misma cabina mientras está en funcionamiento.
Consideraciones generales
a) Seleccionar para laboratorios de tuberculosis, mesas, sillas, armarios, estantes y mobilia-
rio que puedan ser decontaminados con hipoclorito de sodio al 0.5% o alcohol al 70%;
este mobiliario debe permanecer en el área, para evitar contaminación.
b) Para permitir la limpieza y desinfección, se debe dejar espacio alrededor de muebles y
equipos.
c) No se debe almacenar material directamente sobre el piso.
d) En la zona de riesgo mediano, deben ingresar el material de vidrio reciclado, medios de
cultivo y reactivos necesarios para el procesamiento de muestras.
e) Debe ser de acceso restringido al personal técnico y administrativo ajenos al área.
Los requerimientos mínimos para la etapa de mayor riesgo son:

a) Muros íntegros desde el piso hasta el techo, de manera que el aire no salga de esta área
cuando la puerta esté cerrada.
64
b) Puertas y ventanas con cierre hermético para evitar filtraciones de aire y extractores de
aire.
c) Debe contar con un panel de vidrio en puerta que permita visión desde afuera.
d) Superficies de pisos, paredes, techo y mesas de material no poroso, lisas y selladas, cu -
biertos con materiales y pinturas que resistan el tratamiento con solución de hipoclorito
de sodio al 0.5%.
e) Debe ser de fácil acceso al área de decontaminación de materiales.
f) Debe contar con excelente iluminación, agua corriente, gas y electricidad.
g) Debe contar con un lavabo para hacer coloraciones y otra para el lavado de manos (pre-
ferentemente ubicada cerca de la salida del área).
h) Debe contar con mobiliario necesario para realizar los procedimientos técnicos.
i) Espacio suficiente para ubicar el equipo necesario.
j) Aire acondicionado independiente.
k) Sistema de extracción de aire. Cada extractor debe ser ubicado a la mayor altura posible,
en la pared opuesta a la puerta de ingreso y deben expulsar el aire hacia un área abierta,
no transitada, lejos de edificios ocupados.
l) Al elegir el sistema de extracción de aire se debe considerar que debe renovar el aire al
menos seis veces por hora.
m) Las centrífugas de mesa deben estar a una altura cómoda para que pueda verse el rotor
y para operar sin dificultad.
n) Las áreas de mayor riesgo, deben contar con lámparas de luz ultravioleta ya que son úti-
les para completar la desinfección de superficies cercanas y de mayor riesgo de conta-
minación.
Área de esterilización de material contaminado
En ella se ubican los autoclaves utilizados para decontaminar: muestras, sobrenadantes que
deben ser desechados y el material de vidrio utilizado (potencialmente) infeccioso que debe ser
reciclado (tubos, pipetas, otros); debe reunir las siguientes características:
a) Fácilmente accesible desde el área de procesamiento de muestras, de manera que no
sea necesario transportar el material contaminado a grandes distancias o a través de es-
caleras o ascensores. Lo ideal es que esté en un cuarto contiguo al área de procesa -
miento de muestras, comunicado por una puerta distinta a la de ingreso de muestras y
material.
b) El material a ser reciclado y las muestras, deben seguir un recorrido en una única direc -
ción, de la siguiente manera: área de ingreso, área de procesamiento y área de decon-
taminación.
c) Posterior a la esterilización, el material desechable que no genera riesgo biológico,
debe descartarse según lo establecido en la normativa institucional vigente.
d) El material de vidrio reciclable, esterilizado y sin riesgo, debe ser trasladado al área de
lavado/preparación/esterilización la que debe estar ubicada en forma contigua a la de
esterilización de material.
e) En el área de lavado y reciclado de material de vidrio se requiere lavabo y mesas
amplias, autoclave y estufa (preferentemente de esterilización). Referirse a Manual de
65
bioseguridad en el laboratorio de tuberculosis, 2022. Organización Panamericana de la
Salud.
6.Control de calidad
Supervisión y control de calidad
La supervisión debe contar con técnicas operativas estándares. Para su realización es importante
tomar en cuenta lo siguiente; observación, coordinación, corrección, enseñanza, estímulo y
evaluación de la competencia técnica de las actividades del personal que se desempeña en el
área de tuberculosis de los laboratorios, con el propósito que el trabajo sea realizado en forma
eficiente.
Debe ser un proceso educativo recíproco, permanente, regular y planificado, que permita
desarrollar los conocimientos y la capacidad del personal, crear actitudes respecto al trabajo y
contribuir a mantener la eficacia de una red de servicios organizados, en este caso, los
laboratorios que efectúan técnicas bacteriológicas de tuberculosis.
Métodos de supervisión
a) Procedimientos indirectos
Son aquellos que se efectúan a distancia, basados en algunas de las siguientes modalidades:
a) Programa de evaluación externa de calidad
b) Envío de muestras o láminas de resultado conocido por el nivel supervisor al supervisa-
do, para comparar los resultados.
c) Envío de láminas del trabajo habitual desde el nivel local al nivel intermedio o al nivel su -
perior para comparar los resultados y evaluar la aplicación de la técnica baciloscópica.
Esta modalidad es la más aceptable desde el punto de vista operacional y constituye la
supervisión técnica indirecta.
d) Control de calidad externo de los medios de cultivo comparando la sensibilidad de los
medios preparados por la red y el Laboratorio Nacional de Referencia.
e) Control de calidad externo de la prueba molecular Xpert MTB RIF Ultra comparando la
concordancia de las pruebas realizadas por la red.
f) El análisis crítico, cuantitativo y cualitativo de la información estadística.
b) Procedimientos directos
Estos procedimientos se basan en la visita facilitadora por funcionarios del nivel superior y
regional a los servicios locales, lo que constituye la supervisión técnica y administrativa directa,
permitiendo que ésta sea más rápida, efectiva, para la toma de decisiones in situ. Sin embargo,
desde el punto de vista operacional, resulta difícil de llevar a cabo en forma regular y oportuna;
por las limitaciones de tiempo, movilización y factibilidad de cobertura del supervisor.
66
Control de calidad indirecto de las baciloscopías
Es un procedimiento que realizan en conjunto los distintos niveles de la red de laboratorios,
tiene como objetivo elevar y mantener la calidad de trabajo. No tiene carácter punitivo
(aplicación de sanciones) y se basa en la comparación y evaluación técnica indirecta de láminas
de baciloscopía preparadas en el día a día correspondiente al trabajo que se realiza en cada
laboratorio. Los aspectos a tomar en cuenta en esta evaluación son: el extendido, coloración,
calidad de la muestra, concordancia cualitativa y cuantitativa de las lecturas microscópicas.
El control de calidad permite:

a) Evaluar si la información producida por el laboratorio es precisa, reproducible y oportuna
b) Establecer un sistema de alarmas que permite prevenir, descubrir y corregir errores
c) Resulta más eficaz para detectar y asistir a los casos de tuberculosis para controlar la en-
fermedad.
Control de calidad interno

El responsable del área de tuberculosis en el laboratorio debe establecer un sistema de controles
regulares y continuos de los puntos críticos. Es un compromiso que se debe asumir en cada
laboratorio que realiza bacteriología de la tuberculosis.
El control de calidad interno comprende:

a) Evaluación de materiales, equipos y reactivos
b) Desempeño del personal
c) Procedimientos estandarizados
d) Informes precisos y oportunos
e) Oferta y aplicación adecuada de los métodos diagnósticos
f) Rendimiento de los métodos diagnósticos para detectar casos
g) Seguimiento de los resultados obtenidos
h) Medidas correctivas a aplicar cuando la imprecisión del resultado excede los límites con-
siderados aceptables o se producen demoras evitables.
Preparación de láminas para el control interno de la coloración

El personal debe cumplir los siguientes procedimientos:
a) Preparar extendidos de muestras positivas y negativas, tratadas previamente con 10 go-
tas de hipoclorito de sodio al 0.5%, por lo menos durante media hora. Preparar con ellas
tantos extendidos como sean necesarios, para que puedan ser utilizados durante dos
meses. Guardarlas en cajas con separaciones, diseñadas para guardar extendidos, o den-
tro de una caja envueltas en papel suave, bien acondicionadas en un lugar seco.
b) Controlar la calidad de la coloración en cada serie de extendidos a colorear, tiñendo una
lámina negativa y otra positiva. Registrar el resultado de este control de calidad en la
PCT- 4. (anexo 2).
c) Comprobar que los BAAR se vean completa e intensamente coloreados con fucsina y
que la coloración de fondo sea uniforme, del color esperado y que ofrezca buen
contraste.
d) Si se detectan defectos, repetir el control con otros extendidos para descartar un posible
error en la técnica de tinción. Si persiste el defecto, investigar la causa de error. Si se
67
realizan más de diez baciloscopías por día, se debe repetir el control arriba descrito
(coloración de un extendido positivo y uno negativo) una vez por semana.
e) Si se realizan menos de diez baciloscopías por día se deben incluir los frotis positivo y
negativo como control cada vez que realice la coloración
Control de registros e indicadores de la calidad de trabajo:

a) Verificar que las muestras estén siendo procesadas en el día en que fueron recibidas o al
día siguiente. Si el laboratorio no puede hacer baciloscopías todos los días o si recibe
muestras de centros periféricos, verificar que no transcurran más de cinco días desde
que las muestras fueron tomadas hasta que son procesadas e informadas.
b) Controlar que los resultados de las baciloscopías se estén entregando regularmente
como máximo tres días hábiles, después de procesada la muestra.
c) Verificar que los resultados sean recibidos por personal responsable, en las diferentes
instituciones, del Sistema Nacional Integrado de Salud (SNIS).
d) Comprobar que hayan sido derivadas para prueba molecular, cultivo y PSD las muestras
que lo requieren, de acuerdo a lo establecido en la normativa o al algoritmo diagnóstico.
e) Analizar y mantener un registro de los indicadores. Si estos valores se alejan significativa-
mente de los habituales, se deben investigar las causas.
f) Sucesión de resultados positivos en uno o unos pocos días de trabajo. Si se detectan, in -
vestigar si se ha producido contaminación cruzada (transferencia de bacilos desde una
muestra altamente positiva a las siguientes)
g) En el caso en que detecten anormalidades y no puedan ser identificadas las causas, con-
sultar al laboratorio de referencia.
Supervisión técnica indirecta de la baciloscopía

Consiste en el envío de láminas desde el laboratorio local (supervisado), al laboratorio supervisor
(centro de referencia de control de calidad de baciloscopía); se basa en la comparación de
resultados y la evaluación de la aplicación de la técnica baciloscópica en las láminas preparadas
por los laboratorios en su rutina de trabajo. Los laboratorios de los centros de referencia de
control de calidad, tendrán bajo su supervisión a la red local y el Laboratorio Nacional de
Referencia a los centros de referencia de control de calidad.
Conservación y envío de las láminas1

Todos los laboratorios de la red que realizan BK deben conservar adecuadamente la totalidad de
las láminas procesadas, incluidas las láminas utilizadas en el control de calidad interno de la
coloración. Para ello, se debe proceder de la siguiente manera:
a) Quitar el aceite de inmersión, luego de examinar los extendidos, dejando el portaobjeto
en posición vertical sobre un papel absorbente hasta la mañana siguiente.
b) Luego apoyar suavemente la cara del portaobjetos que tiene el extendido de las mues-
tras sobre otra tira de papel absorbente. Nunca intentar remover el remanente de aceite
por frotado del extendido.
c) No se debe rotular en el extendido, el resultado de su lectura.
1
Manual para procedimientos de evaluación externa de calidad pag. 35
68
d) Guardar los extendidos en cajas porta láminas en el mismo orden en que fueron proce-
sados, sin separar los positivos de los negativos.
e) Si no se dispusiera de cajas especiales, los extendidos pueden ser guardados en cajas de
cartón envueltos individualmente en papel, en paquetes que agrupen los de un día o de
una semana, rotulados con la fecha, en el orden en que se realizaron. No poner en este
rótulo el resultado de la lectura de cada una de las láminas.
f) Conservarlos en un lugar fresco y seco para evitar los efectos del calor y la humedad
sobre la coloración.
g) Para aquellos laboratorios en los que el muestreo de las láminas sea realizado sobre un
período en el año (por ej. un mes de cada trimestre), el laboratorio deberá conservar las
láminas al menos 2 meses después de haber sido reportadas, para el caso que el labora -
torio supervisor les solicite las láminas para su relectura.
h) Los laboratorios que han sido seleccionados deberán continuar conservando las láminas
de cada mes dentro del trimestre correspondiente, dado que, en caso que su desempe-
ño no fuera aceptable, es posible que les sean solicitadas las láminas procesadas durante
otro mes del mismo año/trimestre.
i) Para su envío al laboratorio supervisor, acondicionar la totalidad de los mismos en una
caja para envío agregando una copia del formulario para control de calidad indirecto de
baciloscopías debidamente lleno con la información acerca de si las láminas correspon-
den a una muestra de diagnóstico o de control de tratamiento. (Ver anexo 16)
6.1. Evaluación de resultados de supervisión de cada lámina
Cuadro 20. Clasificación de los extendidos según características de la muestra,

extendido y coloración
Calidad de la muestra (sólo para extendidos de esputo coloreados por ZN

Mucopurulenta La mayoría de los campos presenta leucocitos, además de mucus
Mucosa La mayoría de los campos presenta mucus y muy aislados leucocitos
Saliva En la mayoría de los campos se observan células epiteliales, escaso mucus y

muy escasos leucocitos
Calidad del extendido

Bueno Al ojo desnudo del supervisor, el extendido ocupa 2-3 cm de largo por 1-2 cm
de ancho. Está homogéneamente distribuido y la coloración de contraste no
es intensa. Microscópicamente, la mayoría de los campos presenta cantidad
suficiente de material, de manera que al mover el enfoque micrométrico a una
amplificación de 800- 1000x se observan entre 1 y 3 niveles.
Fino La mayoría de los campos microscópicos presenta escaso material.
Grueso Al ojo desnudo del supervisor, la apariencia de la lámina es de color azul o

marrón oscuro (según el colorante de contraste que se emplee).
Microscópicamente, la mayoría de los campos presenta abundante material y
al mover el enfoque micrométrico a una amplificación de 800-1000x se
observan más de 3 niveles. Al ojo desnudo del supervisor, la apariencia de la
lámina es de color azul o marrón oscuro (según el colorante de contraste que
se emplee). Microscópicamente, la mayoría de los campos presenta abundante
material y al mover el enfoque micrométrico a una amplificación de 800-
1000x se observan más de 3 niveles.
69
No homogéneo Presenta zonas finas y zonas gruesas.
Calidad de la coloración (sólo para extendidos teñidos por ZN que no han sido
recoloreados antes de la relectura)
Buena Se pueden leer 100 campos microscópicos con coloración buena en todo el
extendido. Se considera que los campos microscópicos tienen tinción buena
cuando la coloración de fondo no presenta artefactos rojo fucsia (precipitados
o cristales de fucsina) y el contraste es de color azul claro. En algunos casos, se
acepta que la coloración de fondo presente una leve tonalidad rosa. Si se
observan bacilos, estos deben aparecer de color rojo fucsia intenso.
Buena con Se pueden leer 100 campos microscópicos buenos, a pesar de que en el resto
del extendido se encuentren campos con cristales o precipitados de fucsina.
cristales/precipitad
os de fucsina)
Buena (con falta de Se pueden leer 100 campos microscópicos buenos, a pesar de que en el resto
del extendido se encuentren campos con decoloración insuficiente
decoloración) (coloración de fondo rosa intensa).
Deficiente La presencia de cristales/precipitados o la falta de decoloración no permiten
leer correctamente al menos 100 campos microscópicos.
Fuente: Manual Para el Diagnóstico Bacteriológico de la Tuberculosis. Parte 4: Manual de Procedimientos de
Evaluación Externa de Calidad de los Métodos Bacteriológicos Aplicados al Diagnóstico y Control de
Tratamiento de Tuberculosis/Programa “Fortalecimiento de la Red de Laboratorios de Tuberculosis en la
Región de las Américas” Lima: Oras - Conhu; 2019.
Toda la información generada en la supervisión técnica indirecta debe ser comunicada a los
laboratorios supervisados mediante la elaboración de un informe (anexo 17).
Supervisión administrativa indirecta

Consiste en el análisis y la evaluación crítica cuantitativa y cualitativa de la información
estadística mensual para poder evaluar:
a) Correlación cuantitativa y cualitativa con la información de meses anteriores.
b) Proporción de baciloscopías para diagnóstico y para el control del tratamiento.
c) Variaciones en la proporción de resultados positivos en las baciloscopías para diagnósti-
co.
d) Relación entre baciloscopías de diagnóstico positivo y casos diagnosticados.
e) Correlación entre baciloscopías de control de tratamiento y casos en tratamiento.
Es conveniente, que el equipo del programa de tuberculosis del nivel local, efectúe un análisis
global de la información mensual para establecer las relaciones pertinentes entre las diversas
actividades: localización de casos, exámenes bacteriológicos, notificación, pacientes en
tratamiento, entre otros.
La supervisión es una actividad prioritaria en la Unidad de Prevención y Control de la

Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias, a fin de mantener la calidad y eficiencia de la red de
laboratorios que efectúan técnicas bacteriológicas de tuberculosis, y es una responsabilidad
esencial de todos los niveles de gestión.
Durante la supervisión son requeridos los registros y los resultados de control de calidad interno
y externo, por lo que deben estar disponibles.
70
Control de calidad del cultivo BAAR
El encargado de laboratorio de tuberculosis, es el responsable de establecer y analizar los
resultados de los controles internos y externos, y de realizar las correcciones necesarias cuando
se detectan deficiencias.
Control de calidad interno de cultivo

Aspectos esenciales a tomar en cuenta cuando se realiza el control de calidad interno en
medios de cultivo:
a) Color del medio de cultivo: el color en tubos de un mismo lote que presentan distinta
intensidad de verde y que evidencian mala homogenización o residuos en los tubos. Un
verde muy oscuro evidencia exceso de verde de malaquita o pH muy ácido. Medios muy
amarillentos pueden indicar defecto de verde de malaquita o pH muy alcalino.
b) Consistencia: si el medio se desintegra fácilmente, la temperatura de coagulación no es
suficiente. Esto puede ser constatado golpeando sobre la mano uno o dos tubos extraí-
dos al azar del equipo de coagulación. Los tubos con poca consistencia no son adecua -
dos para hacer repiques.
c) Textura/homogeneidad: evitar la formación de burbujas al dispensar y si aparecen luego
de coagular, es posible que el medio haya estado sometido a temperatura excesiva y por
lo tanto haya perdido calidad. Tampoco deben verse grumos, indicadores de mala ho-
mogenización.
d) pH: valores de pH menores a 6.5 pueden afectar la calidad del medio.
e) Esterilidad: observar la esterilidad absoluta, después de incubar cuatro tubos de cada
nuevo lote al azar, a 35 a 37 °C durante cuarenta y ocho horas y luego dejarlos cuarenta
y ocho horas adicionales a temperatura ambiente.
En los laboratorios de la red que preparan medios de cultivo el control de sensibilidad consiste
en sembrar regularmente las muestras de esputo para diagnóstico con baciloscopía positiva,
aunque el cultivo no sea necesario para el paciente. La positividad del cultivo (en escala de
cruces) debe ser igual o mayor a la positividad de la baciloscopía (también en escala de cruces).
Los resultados de control de sensibilidad pueden evaluarse como satisfactorios hasta los veinte
días de incubación. Cuando los resultados no sean satisfactorios, se identificará el material
sembrado en él, desde que fue puesto en uso. Se anularán los resultados negativos que se
obtengan con ese lote y se repetirán los cultivos que quedaron comprometidos.
Registro de la preparación, recepción y consumo de medios de cultivo

Todos los laboratorios de la red que preparan medios de cultivo deben llenar el formulario para
mantener un registro actualizado que permita individualizar lotes deficientes y para descartarlos,
evaluar la calidad de los mismos y cuantificar el consumo del laboratorio (anexo 18).
El responsable del área una vez al mes controlará que se estén cumpliendo los procedimientos
adecuados en la preparación, conservación de reactivos y medios; además deberá controlar el
proceso de esterilización usando indicadores de temperatura.
71
Control interno de la calidad de los registros
El responsable del área de tuberculosis de cada laboratorio debe:
a) Disponer de un profesional no involucrado en la realización e informe del cultivo, para
que revise los datos y resultados consignados en los informes elaborados ese día, los
cuales deben coincidir exactamente con los registrados en el libro del laboratorio. Esto
puede ser realizado por el responsable del laboratorio, en el caso en que él mismo no
procese muestras y emita informe de resultados.
b) Verificar que se procesen las muestras los días establecidos en la rutina de trabajo para
ácido resistente y que no se detecten demoras mayores a los tres o cinco días de toma-
das las muestras.
c) Derivar los aislamientos de los pacientes que lo requieran, para identificación y prueba
de sensibilidad, de acuerdo a lo establecido en los presentes lineamientos técnicos y al-
goritmo diagnóstico.
d) Garantizar el control de calidad interno de los resultados del cultivo.
7. Sistema de registro
El registro del laboratorio se utiliza para documentar los resultados del examen bacteriológico
de las muestras; también aporta información que integrada a la producida por otros laboratorios,
es útil para evaluar la situación epidemiológica.
El laboratorio debe poder investigar en sus registros:

a) Sintomáticos respiratorios examinados.
b) Muestras recibidas y referidas para baciloscopía, prueba molecular rápida mediante am-
plificación de ácido nucleico, cultivo, prueba de sensibilidad y tipificación.
c) Resultado de las diferentes pruebas bacteriológicas de cada paciente.
d) Casos diagnosticados y controlados.
e) Reactivos e insumos recibidos y consumidos.
Los laboratorios de la red deben contar con los siguientes instrumentos estandarizados por la
Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias:
a) Norma técnica de prevención y control de la tuberculosis.
b) Lineamientos técnicos para el diagnóstico de la tuberculosis a través de pruebas de la-
boratorio clínico vigente.
c) Libro para el llenado del envío del control de calidad indirecto de baciloscopía.
d) Solicitud de examen bacteriológico de tuberculosis (PCT- 3).
e) Registro de actividades de laboratorio (PCT- 4).
f) Libro de registro de envío de cultivos BAAR (PCT-11) (anexo 19).
Los laboratorios que realizan otras pruebas deben de contar con:

a) Registro de resultados de prueba molecular rápida mediante amplificación de ácido nu-
cleico (anexo 20)
b) Registro de cultivos de esputo (anexo 21)
72
c) Registro de pruebas de tipificación y prueba de sensibilidad (anexo 22).
Los registros deben ser conservados por lo menos durante cinco años.
La precisión en la documentación es crítica para analizar resultados, evaluar y planificar
apropiadamente las actividades.
El personal de salud al llenar los instrumentos de registro debe cumplir lo establecido en los
instrumentos técnicos jurídicos del Programa de control de tuberculosis, estar completos y
contener información confiable y consistente.
73
VI. Disposiciones finales
a) Obligatoriedad
Es responsabilidad del personal técnico y administrativo que labora en el Sistema Nacional
Integrado de Salud, dar cumplimiento a los presentes lineamientos técnicos, caso contrario se
aplicarán las sanciones establecidas en la legislación administrativa respectiva.
b) De lo no previsto
Todo lo que no esté previsto en los presentes lineamientos técnicos, se debe resolver a petición
de parte, por medio de escrito dirigido a la Titular de esta Cartera de Estado, fundamentando la
razón de lo no previsto, técnica y jurídicamente.
c) Derogatoria
Dejase sin efecto los Lineamientos técnicos para el diagnóstico y control de la tuberculosis en el
laboratorio clínico, de octubre de 2019.
VII. Vigencia
Los presentes lineamientos técnicos entrarán en vigencia, a partir de la fecha de oficialización
por parte del Titular.
74
VIII . Abreviaturas y siglas
ADN: Ácido desoxirribonucleico
AMK: Amikacina
BAAR: Bacilo ácido alcohol resistente
BFE: Filtro de eficiencia de filtración bacteriana
BK: Baciloscopía
CAP: Capreomycina
CMTB: Complejo Mycobacterium Tuberculosis
CSB: Cabina de seguridad biológica
DGCP: Dirección General de Centros Penales
DR: Drogorresistente
DUI: Documento Único de Identidad
EPP: Equipo de protección personal
ETH: Ethionamida
FLQ: Fluoroquinolona
FOSALUD: Fondo Solidario para la Salud
INH: Isoniazida
ISSS: Instituto Salvadoreño del Seguro Social
KAN: Kanamycina
LCR: Líquido cefalorraquídeo
LNSP: Laboratorio Nacional de Salud Pública
M-40: Primera muestra del sintomático respiratorio
M-41: Baciloscopía de control de tratamiento
M-42: Baciloscopías sub - secuentes
MDR: Multidrogorresistente.
MINSAL: Ministerio de Salud
M. tuberculosis: Mycobacterium tuberculosis

NUP: Número Único Previsional
OMS Organización Mundial de la Salud
PCT: Programa de Control de la Tuberculosis
PCR: Cadena de polimerasa en tiempo real
UPCTYER: Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias
POE: Procedimiento operativo estandarizado
PSD: Prueba de sensibilidad a drogas
RIIS: Redes Integrales e Integradas de Salud
RPM: Revoluciones por minuto
RR: Resistencia a rifampicina
SLID: Drogas inyectables de segunda línea
SIPE: Sistema de Información Penitenciaria
75
SNIS: Sistema Nacional Integrado de Salud
SR: Sintomático respiratorio
TB: Tuberculosis
TB-MDR: Tuberculosis multidrogorresistente
TB-XDR: Tuberculosis extremadamente resistente
V.E: Valor esperado
VIH: Virus de inmunodeficiencia humana
XDR: Extremadamente drogorresistente
ZN: Ziehl Neelsen
76
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17 Manual para el diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis, OMS Parte 1: Manual de actualización de
Baciloscopía, edición 2018
18 Manual para el Diagnóstico Bacteriológico de la Tuberculosis Normas y Guía Técnica Parte II Cultivo.
OPS. 2008
19 Manual para el Diagnóstico de la Tuberculosis Parte 4: Manual de Procedimientos de Evaluación Externa
de Calidad de los Métodos Bacteriológicos aplicados al Diagnóstico y Control de Tratamiento de la
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26 Ministerio de Salud. Lineamientos técnicos para la prevención y control de la tuberculosis, El Salvador,
3ra. edición, septiembre 2020
27 Ministerio de Salud. Manual de toma, manejo y envío de muestras de laboratorio, 1ra. Edición, octubre
2013. El Salvador.
28 Ministerio de Salud. Manual de procedimientos de bioseguridad para los laboratorios clínicos, diciembre
2008. El Salvador.
29 Mok Y, et al. Do we need transbronchial lung biopsy if we have bronchoalveolar lavage XpertR MTB/RIF
Int J Tuberc lung Dis 2016, 20: 619-624.
30 Organismo Andino de Salud - Convenio Hipólito Unanue. Manual para el diagnóstico bacteriológico de
la tuberculosis. Parte 1: Manual de actualización de la baciloscopía. Programa “Fortalecimiento de la red
de laboratorios de tuberculosis en la región de las Américas”. Lima: ORAS – CONHU, 2da. edición junio
2018.
31 Organización Panamericana de la Salud. Normas y Guía Técnica, Manual para el Diagnóstico
Bacteriológico de la Tuberculosis. Parte 2 cultivo, 2008.
32 Organización Panamericana de la Salud, Manual de bioseguridad en el laboratorio de tuberculosis, 2013
33 Organismo Salvadoreño de Reglamentación Técnica (OSARTEC), Reglamento técnico salvadoreño
11.01.01:13, de Buenas Prácticas de Laboratorio Clínico, Especificaciones, El Salvador.
34 OSN. Norma técnica para el manejo de los desechos bioinfecciosos. NSO 13.25.02:07. El Salvador.
35 Pang Y, et al. Evaluation of the Xpert MTB/RIF assay in gastric lavage aspirates for diagnosis of smear-
negative childhood pulmonary tuberculosis. Pediatr Infect Dis J 2014, 33: 1047-1051.
36 Peter Jg, et al. The diagnostic accuracy of urine-based Xpert MTB/RIF in hIV-infected hospitalized
patients who are smear-negative or sputum scarce. PloS one 2012, 7: e39966.
http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039966
37 Porcel JM, et al. XpertR MTB/RIF in pleural ﬂuid for the diagnosis of tuberculosis. Int J Tuberc lung Dis
2013, 17: 1217-1219.
38 Singh S, et al. Xpert MTB/RIF assay can be used on archived gastric aspirate and induced sputum
samples for sensitive diagnosis of paediatric tuberculosis. BMC Microbiol 2015, 15: 191.
http://bmcmicrobiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12866-015-0528-z
39 Theron g, et al. Accuracy and impact of Xpert MTB/RIF for the diagnosis of smear-negative or sputum-
scarce tuberculosis using bronchoalveolar lavage ﬂuid. Thorax 2013, 68: 1043-1051
40 Who. Xpert MTB/RIF implementation manual: technical and operational ‘how-to’; practical
considerations. ed. geneva: world health organization 2014.
http://www.who.int/tb/publications/xpert_implem_manual/en/
78
X. Anexos
Anexo 1. Microscopio
Es el instrumento fundamental en el trabajo de microscopia directa del laboratorio.
Su función principal es magnificar los objetos dentro del campo microscópico a un tamaño que
pueda ser visto por el ojo humano.
El microscopio que se utiliza en el laboratorio para el examen microscópico de las baciloscopías,

es el microscopio compuesto de campo claro.
El microscopio de campo claro, consta de parte mecánica y óptica.
1. Parte mecánica:
Base o soporte del microscopio, platina, carro mecánico, tornillo macrométrico, tornillo
micrométrico, brazo.
2. Parte óptica:
Oculares, objetivos, condensador, fuente de luz, prismas (dentro del tubo binocular.)
Oculares
Cabezal
Brazo
Revólver
Carro
Objetivos
Macrométrico
Platina
Micrométrico
Lámpara Condensador
Base
Fuente: Unidad de Prevención y Control de la

Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias, LNSP
79
Uso correcto del microscopio:
a) Revisar que la fuente de iluminación esté bien regulada y centrada.
b) Asegurar que las lentes, y otras superficies que transmiten luz estén bien limpios.
c) Ajustar la luz, el condensador y el diafragma a fin de que llegue un haz de luz potente a
la lente del objetivo.
d) Colocar adecuadamente el portaobjetos en la platina.
e) Girar los tornillos de ajuste lentamente hasta que la imagen se vea clara.
f) Al utilizar el objetivo 100x bajarlo lentamente hasta que entre en contacto con el aceite
de inmersión, girar el tornillo micrométrico de ajuste fino para enfocar.
Cuidados
a) Verificar su buen estado óptico y mecánico.
b) Colocar una cubierta plástica o de tela preferentemente para protegerlo del polvo.
c) No debe estar ubicado en un sitio donde existan vibraciones o esté expuesto a sustan-
cias químicas o corrosivas.
d) Evitar que los objetivos de uso seco y la platina entren en contacto con el aceite de in-
mersión, si esto sucede se deben limpiar inmediatamente.
e) Para quitar el aceite del objetivo de inmersión, debe utilizarse papel lente o algodón con
alcohol al 70%.
f) Al término de cada jornada de trabajo, se debe limpiar cuidadosamente, en especial el
objetivo de inmersión y dejarlo con papel lente o algodón; para eliminar el exceso de
aceite.
g) Al cambiar el microscopio de lugar, se debe tomar del brazo para no arrastrarlo, evitando
daños posteriores.
h) Cada microscopio debe ser manipulado cuidadosamente y dar el mantenimiento indica-
do; de observar algún defecto, debe someterlo a revisión por el técnico competente.
El poder de resolución del microscopio dependerá de su buen uso y mantenimiento.
80
Anexo 2. Registro de actividades de laboratorio (PCT-4)
81
Anexo 3. Triple embalaje
2
1
Fuente: Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias,

LNSP
1. Envase primario: contiene la muestra

2. Envase secundario: contiene el frasco con la muestra
3. Envase terciario: contiene el envase secundario
4. Cadena de frío: termo con paquetes refrigerantes en el cual se ubica el envase terciario.
82
Anexo 4. Solicitud de examen para diagnóstico y seguimiento de
casos de tuberculosis (PCT-3)
83
84
Anexo 5. Motivo de rechazo de muestras
Motivo de rechazo de muestras
Nombre y/o apellido no coincide

Muestra mal rotulada
Identificación de muestra ilegible
Muestra sin rotular No tenga nombre ni apellido
Solicitud ilegible Datos en formulario ilegibles
Llenado incompleto de formulario PCT-3

Solicitud incompleta Especialmente: Fecha y hora de recibido en el
laboratorio, Motivo de solicitud de examen
Muestra inadecuada Muestra no corresponde a la prueba indicada
Parte o la totalidad de la muestra se haya

derramado fuera de su contenedor primario.
Muestra derramada
(Evaluar la magnitud del derrame para rescatar la
muestra y procesarla)
Cuando no cumpla las condiciones de triple
Muestra no cumple la condición de transporte
embalaje y cadena de frío
Fuente: Sección de Tuberculosis – Laboratorio Nacional de Salud Pública.
85
Anexo 6: Preparación de reactivos
,Preparación de lejía:
Utilizar la fórmula: Vi x Ci= Vf x Cf → Vi= Vf x Cf

Ci
Dónde:
Vi = Volumen inicial
Ci= Concentración inicial
Vf= Volumen final
Cf= Concentración final
Ejemplo: Preparar 500 ml de solución desinfectante al 0.5% de hipoclorito de sodio, partiendo

de hipoclorito comercial al 10%
Vi= 500 ml x 0.5%

10%
Vi= 25 ml
Se deben agregar 25 ml de hipoclorito comercial al 10% y aforar hasta 500 ml de agua destilada,
para realizar una solución desinfectante al 0.5%
Preparación de buffer fosfato

Fosfato disódico anhidro NHa2 g 9.46
Solución 1
Agua destilada c.s.p ml 1000
Fosfato monopotásico KH2PO4 G 9.08

Solución 2
Agua destilada c.s.p ML 1000
 Preparar la solución 1 y la 2, calentando ligeramente cada una por separado hasta lograr
completa disolución de las sales.
 Mezclar igual volumen de la solución 1 y 2
 Controlar el pH
 Para procesar muestras, fraccionar el buffer así preparado en botellas o frascos conteniendo
no más de 200 ml cada uno.
 Esta cantidad es adecuada para el procesamiento de 12 muestras
 Esterilizar las botellas en autoclave 15 minutos a 1 atmósfera
 Rotular con el nombre del buffer y fecha de preparación.
 Guardar en heladera
Preparación de bicarbonato de sodio al 10%.

 Pesar 10 gramos de bicarbonato de sodio.
 Colocarlo en un frasco volumétrico de 100 mililitros.
 Disolver el bicarbonato con agua destilada, aforando hasta la marca.
 Proceder a esterilizar en autoclave y guardar en refrigeración en frasco limpio.
86
Anexo 7. Calidad del extendido y coloración de láminas
Fino
Grueso
No homogéneo
Homogéneo
Tamaño adecuado
Fuente: Sección de micobacterias – Laboratorio Nacional de Salud

Pública.
87
Anexo 8. Preparación de colorantes
1) Fucsina fenicada 3%.

 Tres gramos de fucsina básica.
 Cien mililitros de alcohol de 95º.
 55 mililitros de fenol acuoso. *
Se agita y se agrega agua destilada hasta completar un litro, se deja reposar veinticuatro horas y
se filtra.
(*) Fenol acuoso: 100 gramos de fenol cristalizado y 10 mililitros de agua destilada, se calienta en
baño de María hasta completa disolución, luego se enfría.
2) Azul de metileno 1%.

 1 gramos de azul de metileno.
 100 mililitros de alcohol de 95º.
 Se disuelve por agitación y se agrega agua destilada hasta completar un litro. Se deja reposar
veinticuatro horas y se filtra.
3) Solución decolorante
30 mililitros de ácido clorhídrico para análisis.
970 mililitros de alcohol de 95º.
Con una pipeta: Se deja escurrir por las paredes el ácido clorhídrico en el matraz que contiene el
alcohol, luego se agita nuevamente.
Cada vez que los colorantes se utilizan deben filtrarse previamente.
Conservación
Los colorantes deben conservarse en frascos de color ámbar por un tiempo no mayor de un
mes.
88
Anexo 9. Formulario de preparación de medios de cultivo sin
fármacos
Formulario de preparación de medios de cultivo sin fármacos

Sección de micobacterias
Preparación solución de medios para Löwenstein-Jensen Ogawa

Stonebrink
Fecha de
Cantida N° de
Reactivos Marca caducida Balanza
d lote
d
Analítica-
Fosfato monopotásico anhidro – KH2 PO4
Sartorius
Sulfato de magnesio – Mg-SO4 7H2O Analítica-Sartorius
Fosfato Disódico (HNa2PO4) Analítica-Sartorius
Citrato de magnesio – C12H10Mg3O14-14H2O Analítica-Sartorius
L-Asparagina – C4H8N2O3H2O Analítica-Sartorius
Glutamato de Sodio (C3H803) AND
Piruvato (CH3COCO2Na) AND
Analítica-
Glicerol (ml) – C3H8O3
Sartorius
Agua destilada (ml)
Volumen de huevos totales
Verde de malaquita C48H5ON4O4- Analítica-

2C2H2O4 Sartorius
Agua destilada (ml)
No. de lote: ______________ pH: ____________

Tiempo de coagulación: ___________ T°: ____________
Fecha de preparación de medio: _________________________
Fecha de preparación sales: _____________________________
Fecha de caducidad del medio: __________________________
Control de calidad: ___________________________________
Responsables sales:
__________________________________________________________
Responsables medio:
________________________________________________________
89
Anexo 10. Flujograma del método de Petroff con buffer fosfatos
Fuente: Sección de micobacterias – Laboratorio Nacional de Salud Pública
90
Anexo 11. Flujograma del método Ogawa Kudoh
Adherir a un hisopo
estéril las partículas
útiles del esputo Sumergir en un tubo con 3
ml de NaOH 4% durante 2
minutos exactos.
Tomar en cuenta que se
debe utilizar un tubo de
NaOH al 4% por muestra
Sin escurrir el hisopo
Inocular con movimiento de rotación y presión

el hisopo en un tubo con medio de Ogawa.
Sumergir en el mismo tubo con 3 ml de NaoH

4% un segundo hisopo durante 2 minutos
exactos
Inocular con movimiento de rotación y presión

el hisopo en otro tubo con medio de Ogawa.
Incubar los tubos inoculados en bandeja inclinada, a 36 °C
Hacer frotis para coloración

de Ziehl Nelseen
Fuente: Sección de micobacterias – Laboratorio Nacional de Salud Pública
91
Anexo 12. Hoja de referencia de cepas para prueba de sensibilidad y
tipificación. Versión 2022
92
Anexo 13. Características de colonias contaminantes
Las colonias contaminantes pueden presentar las siguientes características: pigmentadas,
cremosas, lisas.
Fuente: Sección de micobacterias – Laboratorio Nacional de Salud Pública.
93
Anexo 14. Procedimiento para LF-LAM
Fuente: Lineamientos técnicos para el uso de la prueba de Lipoarabinomanano (LAM) como apo-
yo diagnóstico en pacientes con VIH y sospecha de tuberculosis. UPCTYER/MINSAL San Salva-
dor, El Salvador, año 2020.
94
Anexo 15. Algoritmo para el diagnóstico y seguimiento de casos de
tuberculosis
Fuente: Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias/Sección

de micobacterias - LNPS
95
96
Fuente: Unidad de prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias/Sección
97
98
Anexo 16. Envío de Control de calidad indirecto de baciloscopía
99
100
Anexo 17. Informe de resultado control de calidad indirecto de
baciloscopías
Ministerio de Salud
Control de calidad indirecto de baciloscopías
Realizadas en la red de laboratorios clínicos de tuberculosis
Establecimiento: __________________________________________________________
Región: ____________________________ SIBASI:
_______________________________
Baciloscopías correspondientes mes: _________________ año:
________________
Número de baciloscopías enviadas:
_____________________________________________
Número de baciloscopías supervisadas:
_________________________________________
Fecha de recepción:
_________________________________________________________
Resultados de calidad de muestra, extendidos y coloración

Resultado % Valor esperado
Muestras de esputo con calidad adecuada
Extendidos buenos
Coloración buena
Discordancias encontradas:
Observaciones:
Recomendaciones:
Nombre y firma de responsable: _____________________________________________
Sello: ______________________ Fecha de reporte: _____________________
101
Anexo 18. Control de calidad y consumo de medios de cultivo
Control
Fechas de Control de sensibilidad
N° Tubos esterilidad
de prepa PH Desarrollo a 20 días Desarrollo a 60 días
Se Cepa
lote rados Elaboración Se Se detectó (colonias) (colonias)
comenzó muestra
o recepción terminó desarrollo Lote Lote Lote Lote
a utilizar sembrada
referente preparado referente preparado
102
Anexo 19. Libro de registro de envío de cultivos BAAR (PCT-11)
103
Anexo 20. Registro de resultados de prueba Xpert MTB/RIF Ultra
104
Anexo 21. Registro de cultivos de esputo
105
Anexo 22. Registro de pruebas de tipificación y prueba de sensibilidad
106

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Fuente: Sección de micobacterias – LNSP, 2021

Vigilancia Todas las pruebas

Búsqueda de casos Todas las pruebas

* Solamente un establecimiento de primer nivel.

Equipo de protección personal

Las cantidades a solicitar de forma trimestral, semestral o anual, dependerá de la producción de

1.1. Recolección de la muestra

Se requiere una adecuada recolección de la muestra en relación a calidad y cantidad,

Es recomendable que se lleve el registro de la calidad de muestra recibida para realizar la

Saliva Mucosa Mucopurulenta Sanguinolenta

El envase debe cumplir las siguientes características:

b) Libre de partículas de polvo u otros contaminantes: no necesariamente estéril.

e) Capacidad: de treinta y cinco a cincuenta milímetros de diámetro para que el paciente

f) Fácil de rotular: lo que permitirá una identificación indeleble o la colocación de una

Los requisitos mínimos a cumplir son:

1.3. Preparación del extendido

Fuente: Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias Laboratorio

Preparación del extendido

1. Ordenar y enumerar las 2. Enumerar los portaobjetos 3. Quebrar el aplicador

4. Seleccionar y 5. Depositar la 6. Extender la 7. Fijar el extendido

Fuente: Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias /Laboratorio

2. Calentar hasta obtener 3

4. Cubrir con decolorante 5. Lavar con agua

8. Limpiar la parte posterior 9. Secado al aire

Fuente: Unidad de Prevención y Control de la Tuberculosis y Enfermedades

En la muestra de esputo pueden presentarse aislados, apareados o agrupados. Es muy difícil

Lectura de extendidos coloreados por Ziehl Neelsen:

Fuente: Unidad de Prevención y Control de la

d) Observar la calidad del extendido y de la coloración. Si no fuesen buenas, repetir

* De 10 - 99 BAAR 100 campos +

Más de 10 BAAR por

Es responsabilidad del establecimiento de salud correspondiente, el retiro de los resultados de

Cuadro 4. Causas de error en la baciloscopía

Interpretación de indicadores de laboratorio:

Es un método de mayor complejidad y costo que la baciloscopía, cuyos resultados se obtienen

2.1. Preparación de medios de cultivo

Löwenstein Ogawa Kudoh

Citrato de magnesio g 0.6 0.6

Piruvato de sodio g 6.25

Agua destilada c.s.p. ml 600 500 600 600

Huevos ml 1000 1000 1200 1200

Verde de malaquita 2% ml 20.0 20.0 36 24

pH aproximado 6.8 6.8 6.8 6.2