Tesis 9

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS
SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
ESCUELA DE BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTOS
PROGRAMA DE GRADUADOS EN BIOTECNOLOGÍA
TEC de Monterrey
DEL SISTEMA TECNOLÓGICO DE MONTERREY
"Evaluación de la actividad anti-inflamatoria de flavonoides
recuperados con un tratamiento alcalino presentes en Opuntia
ficus indica variedad J a l p a "
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA
OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS CON

ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA
POR:
BEATRIZ EUGENIA MORENO GARCÍA
MONTERREY, N. L. DICIEMBRE DE 2011

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DE MONTERREY
CAMPUS MONTERREY
ESCUELA DE BIOTECNOLOGÍA Y ALIMENTOS
PROGRAMA DE GRADUADOS EN BIOTECNOLOGÍA
TECde Monterrey
DEL SISTEMA TECNOLÓGICO DE MONTERREY
"Evaluación de la actividad anti-inflamatoria de flavonoides recuperados con un

tratamiento alcalino presentes en Opuntia ficus indica variedad Jalpa"
TESIS
PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO

ACADÉMICO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS CON ESPECIALIDA
POR:
BEATRIZ EUGENIA MORENO GARCÍA
MONTERREY, N. L. DICIEMBRE DE 2011

"Evaluación de la actividad antiinflamatoria de flavonoides recuperados con un tratamiento alcalino presentes en
Opuntia flcus indica variedad Jalpa"
Resumen
El nopal Opuntia ficus indica es un vegetal que pertenece a la familia de las
Cactaceae. Es considerado uno de los principales cultivos en México, y forma
parte de las tradiciones religiosas, medicinales y alimentarias del país.
Ancestralmente ha sido estudiado en el tratamiento de enfermedades crónico
degenerativas, y dentro de sus principales propiedades se encuentra que posee
actividad antioxidante, hipocolesterolemica, hipoglucemiante y antiinflamatoria. Se
ha reportado que es un alimento con alto contenido en fibra dietética, lo que le
brinda gran parte de sus propiedades. Sin embargo, también se ha reportado la
presencia de compuestos fenólicos entre ellos, algunos flavonoides,
principalmente la quercetina, el kaempferol y la isorhamnetina. Estos son
compuestos antioxidantes que ayudan a la prevención de enfermedades, por
ejemplo en la inhibición de la producción de óxido nítrico durante el proceso de
inflamación crónica.
Es por ello, que uno de los principales objetivos de este trabajo fue
determinar el perfil de compuestos fenólicos (flavonoides glicosilados) presentes
en la harina de nopal mexicano Opuntia ficus indica variedad Jalpa, teniendo como
hipótesis principal que una hidrólisis alcalina permitiría obtener mayor cantidad de
flavonoides. Adicionalmente, a través de un estudio in vitro, se logró observar el
efecto que tienen estos compuestos sobre la producción de óxido nítrico (NO).
Para ello se utilizaron células de macrófago RAW 264.7 con el fin de determinar si
los extractos poseen capacidad antiinflamatoria.
Medíante esta investigación realizada en harina de nopal Opuntia ficus

indica variedad Jalpa, se logró probar que un tratamiento alcalino favoreció la
extracción de flavonoides glicosilados ligados a la matriz. Particularmente en el
extracto obtenido a los 60 minutos de tratamiento alcalino se encontraron 5 veces
más flavonoides que los recuperados en un extracto metanólico. El proceso de
tratamiento alcalino que recibieron las muestras fue más selectivo, permitiendo
I
'Evaluación de la actividad antiinflamatoria de flavonoides recuperados con un tratamiento alcalino presentes en
Opuntiaficusindica variedad Jalpa"
una mayor liberación de flavonoides principalmente en forma glicosilada (90 %). El

flavonoide isorhamnetina fue el que mostró mayor presencia, constituyendo junto
con sus derivados glicosilados casi el 95 % del total de los flavonoides presentes,
el resto fue debido a la presencia de kaempferol y sus derivados. Fue posible
encontrar cuatro nuevos compuestos glicosilados que no habían sido reportados,
los cuales fueron denominados KG1, KG2, K G 3 E IG7, y correspondieron a
moléculas di, tri, y tetraglicosiladas, lo que las convirtió en moléculas de gran
tamaño y peso molecular.
Por otro lado, la cuantificación de fenólicos totales mostró que a los 60 y

150 minutos de tratamiento alcalino se obtuvieron los mayores valores (16.98 y
16.37 ugEAG/g de muestra, respectivamente), lo cual significó que la cantidad de
fenólicos se vio incrementada conforme el tiempo de tratamiento alcalino, esto al
compararlo con los valores que dio el extracto metanólico (9.16 ugEAG/g).
Posterior a la hidrólisis ácida que recibieron éstos mismos extractos sometidos a
0, 60, 120 y 150 minutos de tratamiento alcalino, los valores de fenólicos totales
incrementaron. En éste caso, el mayor incremento se dio en el extracto de 120
minutos, aumentando más del 100 % el valor obtenido de los fenólicos totales
mientras que los presentes en el extracto metanólico sólo se vio incrementado un
65 %.
En cuanto a la actividad antioxidante, el extracto que recibió 120 minutos de

tratamiento alcalino mostró los mayores valores (12.21 umolET/g de muestra) y
contrario a lo que se ha reportado, los valores posteriores a la hidrólisis ácida
disminuyeron. El flavonoide que mayor contribución tuvo en la actividad
2
antioxidante fue el KG1 (R de 0.71, p < 0.05). Además, en general no se observó
correlación entre fenólicos totales y actividad antioxidante.
Por otra parte, se midió la actividad antiinflamatoria de los extractos que

recibieron el tratamiento alcalino a diferentes tiempos, mediante la capacidad de
inhibición de la producción de NO en células de macrófagos RAW 264.7. Los
resultados que se obtuvieron mostraron que a bajas concentraciones del extracto
II
Opuntia ficus indica variedad Jalpa"
que recibió 60 minutos de tratamiento alcalino (0.4 y 0.04 u.g/ml), se obtuvo una
mejor inhibición de la producción de óxido nítrico (NO) (67 y 55.7 %,
respectivamente) que la aglicona isorhamnetina 20 uM (43.26 %). La inhibición fue
debido a los compuestos presentes, y no a consecuencia de una citotoxicidad, lo
cual se comprobó mediante la viabilidad celular que mostraron (90 %).
III
Agradecimientos
"El agradecimiento es la memoria del corazón"
Lao-Tse
Primeramente a Dios, por permitirme llegar a este momento tan especial en mi vida. Por los
triunfos y los momentos difíciles que me han enseñado a valorarte cada día más. Gracias por
acompañarme todos los días.
A mis padres, que son mi mayor orgullo. Gracias por el apoyo, por sus consejos y motivación
constante. Por confiar en mi (incluso cuando ni yo misma lo hago), pero sobre todo, gracias por su
amor infinito. Les debo lo que soy, por lo tanto, este logro es de ustedes también. Los quiero
mucho.
A Joako, gracias por ser mi sigiloso guardián y compañero, ¡eres el mejor hermano! Gracias por tu
paciencia.
A Fá, porque desde que naciste me enseñaste el valor de un equipo, de la amistad y la

complicidad. Gracias por compartir conmigo un sueño más.
A mis tíos y primos, que me han enseñado el valor de la familia. Por su apoyo constante e
incondicional, pero sobre todo, por ser un ejemplo y un estímulo a querer vivir y sacarle todo el
jugo a la vida. Gracias, porque no han dejado que el significado de familia se quede sólo en 4
personas.
A mis abuelos presentes y los que se adelantaron en el camino. Gracias especialmente a ti, porque
dentro de una de tus sonrisas eternas, aprendí que la vida está llena de satisfacciones no
materiales.
A ti, que a pesar de estar a 8000 km de distancia, te siento cerca. Gracias por esa alegría
contagiante y la actitud positiva ante la vida que te caracteriza, Ich liebe dich.
Este documento es el resultado del trabajo realizado con ilusión y esfuerzo, un documento que
nunca hubiera visto la luz sin el acompañamiento educativo, generoso y sin condiciones de mi
asesora, la Dra. Janet Gutiérrez, y de todos aquellos compañeros y amigos que compartieron
conocimientos, pláticas y diversión sin esperar nada a cambio. Especialmente Víctor, Marco,
Daniel, Keila, Kike, Bertha, Lily, Marysol, Ulises, Chuy, Karla, Dulce y Lau. ¡Gracias a todos!
Al Dr. Sergio Serna, por permitirme formar parte de su equipo de trabajo y al Dr. Daniel Jacobo,
por sus valiosas aportaciones.
Al Conacyt por el apoyo de beca otorgado.
"La felicidad es la suma de los pequeños momentos que tienes el privilegio

de compartir con personas especiales"
IV
índice general
Resumen I
Agradecimientos IV
índice general V
índice de tablas IX
índice de figuras X
Lista de Abreviaturas XII
Capítulo 1: Introducción 1
Capítulo 2: Antecedentes 3
2.1 Alimento funcional 3
2.2 Generalidades de Opuntia spp. 3
2.2.1 Descripción e información taxonómica de la planta 4
2.2.2 Composición química del nopal 7
2.3 Compuestos fenólicos 10
2.3.1 Flavonoides 11
2.3.2 Absorción y biodisponibilidad de flavonoides 13
2.3.3 Ingesta de flavonoides 17
2.3.4 Extracción de flavonoides ligados 18
2.3.5 Propiedades de los flavonoides 20
2.3.5.1 Capacidad antioxidante 21
2.3.6 Estudios previos que relacionan el nopal y los

flavonoides 22
V
2.4 Inflamación 24
2.4.1 Óxido nítrico y su relación en la inflamación 25
2.4.2 Flavonoides e inflamación 26
2.4.3 Flavonoides y producción de óxido nítrico 27
2.5 Justificación 30
2.6 Objetivos 31
Capítulo 3: Materiales y métodos 32
3.1 Reactivos y materiales 32
3.2 Extracción de compuestos 33
3.2.1 Extracción de compuestos solubles en metanol 33
3.2.2 Optimización del procedimiento de extracción de

flavonoides totales 33
3.3 Extracción en fase sólida 34
3.3.1 Extracción en fase sólida de los extractos metanólicos 34
3.3.2 Extracción en fase sólida de los extractos alcalinos 35
3.4 Hidrólisis ácida de los extractos 36
3.5 Caracterización de los extractos de harina de nopal Opuntia ficus

Indica variedad Jalpa 36
3.5.1 Detección y cuantificación de los compuestos mediante

HPLC 36
3.5.2 Identificación de flavonoides glicosilados mediante

HPLC-MS-TOF 37
3.5.3 Cuantificación de fenólicos totales en los diferentes

extractos de harina de nopal 38
3.5.4 Determinación de la actividad antioxidante [Oxygen

Radical Absorbance Capacity (ORAC)] 38
VI
3.6 Bioensayo de producción de óxido nítrico (NO) en la línea celular

Raw 264.7 de macrófagos de ratón 39
3.6.1 Mantenimiento de la línea celular 39
3.6.2 Bioensayo de producción de óxido nítrico (NO) 39
3.6.3 Ensayo de viabilidad celular 41
3.7 Análisis estadístico 42
Capítulo 4: Resultados y discusiones 43
4.1 Optimización del procedimiento de extracción de flavonoides totales 43
4.2 Identificación de flavonoides presentes en los extractos de harina

de nopal 45
4.2.1 Análisis de los espectros de absorción de los flavonoides

encontrados en los extractos de harina de nopal 45
4.2.2 Análisis de los espectros de masas de los flavonoides

encontrados en los extractos de harina de nopal 47
4.3 Cuantificación de flavonoides presentes en los extractos de harina

de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa 52
4.3.1 Cuantificación de flavonoides presentes en los extractos

alcalinos y metanólicos 52
4.3.2 Cuantificación de flavonoides presentes en los extractos de

harina de nopal, posterior a una hidrólisis ácida 55
4.4 Cuantificación de fenólicos y actividad antioxidante en los extractos

obtenidos de harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa 58
4.4.1 Cuantificación de fenólicos 58
4.4.2 Determinación de la capacidad antioxidante (ORAC) 61
VII
4.5 Evaluación in vitro de la capacidad antiinflamatoria de los compuestos

presentes en los extractos alcalinos de la harina de nopal Opuntia
ficus indica variedad Jalpa 63
4.5.1 Viabilidad celular 63
4.5.2 Bioensayo de producción de óxido nítrico 64
Capítulo 5: Conclusiones 68
Referencias 71
Anexos 79
VIII
índice de tablas
Tabla 2.1 Información de la taxonomía del nopal 5
Tabla 2.2 Comparación física entre diferentes especies de Opuntia spp. 6
Tabla 2.3 Análisis bromatológico de cladodios de Opuntia spp. en tres especies

diferentes 8
Tabla 2.4 Clasificación de flavonoides en base a su estructura química

ejemplificado con el miembro más representativo de cada grupo 12
Tabla 2.5 Parámetros farmacocinéticos obtenidos después de la ingesta de

glicósidos de quercetina (311 uM) en 9 sujetos de estudio 16
Tabla 2.6 Concentración de flavonoles (ug/g de muestra en base seca) en frutos

de diferentes especies de Opuntia spp. 22
Tabla 3.1 Gradiente de solventes utilizado para la separación de compuestos

flavonoles mediante HPLC-PDA 37
Tabla 4.1 Características espectrales de los flavonoides identificados en el

extracto obtenido con un tratamiento alcalino durante 60 minutos 49
Tabla 4.2 Concentración de flavonoides de Opuntia ficus indica variedad Jalpa en

un extracto metanólico y en extractos obtenidos a diferentes tiempos de
tratamiento alcalino 53
Tabla 4.3 Concentración de flavonoides presentes en harina de nopal Opuntia ficus

indica variedad Jalpa posterior a una hidrólisis ácida, que recibieron los
extractos metanólicos y los extractos alcalinos obtenidos a diferentes
tiempos 57
Tabla 4.4 Cuantificación de fenólicos y actividad antioxidante en los extractos

obtenidos de harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa 59
Tabla A1: Correlación entre actividad antioxidante y flavonoides totales 82
IX
Índice de figuras
Figura 2.1 Estructura básica de los flavonoides 11
Figura 2.2 Estructuras químicas de los flavonoides más comunes en la dieta 12
Figura 2.3 Estructuras químicas presentes en los suplementos proporcionados en

el estudio. l)Estructura de quercetina aglicona, ll)quercetina-4-0-β-D-glucósido
presente en cebollas, lll)estructura de quercetina-3-O-p-galactósido
presente en manzanas, IV)quercetina-3-0-p-rutinósido o rutina 15
Figura 2.4 Estructura de un flavonol glicósido de kaempferol identificado en cladodios

de Opuntia dillenii. (Kaempferol-7-O-p-glucopiranosil-p-D-glucopiranósido) 23
Figura 2.5 Efecto en la producción de óxido nítrico (NO) en células Raw 264.7
posterior a una Incubación con flavonoides activados con lipopolisacáridos
LPS (50ng/ml) 28
Figura 3.1 Procedimiento para enriquecer la fracción de flavonoides de interés

obtenidos en los extractos de harina de nopal, mediante una extracción
en fase sólida 34
Figura 3.2 Procedimiento seguido para la preparación de placas con células

Raw 264.7 de macrófagos de ratón en el bioensayo de medición de NO 40
Figura 4,1 Cromatogramas de flavonoides obtenidos a 365 nm de los extractos de

harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa con diferentes tiempos
de tratamiento alcalino, a) 30 y 60 min b) 90,120 y 150 minutos 44
Figura 4.2 Espectros de absorción en el rango UV-Vis de: a) estándar de isorhamnetina

b) isorhamnetina presente en el extracto a los 60 minutos de tratamiento
alcalino, c) estándar de kaempferol, d) kaempferol presente en el extracto
a los 60 minutos de tratamiento alcalino 46
Figura 4.3 Espectro de masas de isorhamnetin-glucosil-ramnosil-ramnósido

obtenido mediante LC-MS-TOF 47
Figura 4.4 Cromatograma típico obtenido mediante HPLC a 365 nm de los diversos
flavonoides presentes en una muestra de harina de nopal Opuntia ficus
indica variedad Jalpa hidrolizada con álcali por 60 minutos 50
Figura 4.5 Cromatograma típico obtenido mediante HPLC a 365 nm de los diversos
flavonoides presentes en una muestra de harina de nopal Opuntia ficus
indica variedad Jalpa obtenidos a partir de una extracción metanólica 51
X
Figura 4.6 Contenido de flavonoides totales (cuantificados según su correspondiente

aglicona) a diferentes tiempos de tratamiento alcalino en harina de Opuntia
ficus indica variedad Jalpa, comparados con un extracto metanólico (E.M) 54
Figura 4.7 Contenido de flavonoides totales posterior a una hidrólisis ácida de los
extractos con diferentes tiempos de tratamiento alcalino de harina de
Opuntia ficus indica variedad Jalpa comparados con los de un extracto
metanólico (E.M) 58
Figura 4.8 Porcentaje de viabilidad en células RAW 264.7 expuestas a diferentes con
centraciones de extractos obtenidos de harina de nopal Opuntia ficus indica
variedad Jalpa. Los extractos fueron previamente obtenidos de la matriz
mediante un tratamiento alcalino a diferentes tiempos 64
Figura 4.9 Porcentaje de inhibición de la producción de óxido nítrico en células RAW

264.7 con flavonoles puros a 20 y con extractos alcalinos de Opuntia ficus
indica variedad Jalpa obtenidos a diferentes tiempos y en 3 concentraciones
distintas 65
Figura A1 a) Cromatograma del extracto metanólico de harina de nopal Opuntia ficus

indica variedad Jalpa a 365nm. (K) Kaempferol, (KG3) Kaempferol-glucosil-
ramnosil-ramnosa + hexosa, (KG4) Kaempferol-glucosil-ramnósido, (IG1)
Isorhamnetin-glucosil-ramnosil-ramnósido, (IG2) Isorhamnetin-ramnosil-
pentósido, (IG3) Isorhamnetin + 1 hexosa + 1 metilpentosa + 1 pentosa, (IG4)
Isorhamnetin-glucosil-pentósido, (IG5) Isorhamnetin-glucosil-ramnósido. b)
Cromatograma del extracto metanólico posterior a la hidrólisis ácida. (I)
Isorhamnetina, (NI) Compuesto no identificado 80
Figura A2 Cromatogramas obtenidos de los extractos de harina Opuntia ficus indica

variedad Jalpa. A) A los 0 min de tratamiento alcalino. B) A los 120 minutos
de tratamiento alcalino. 80
Figura A3 Cromatogramas obtenidos de los extractos de harina Opuntia ficus indica

variedad Jalpa posteriores a una hidrólisis ácida, a) 120 minutos de
tratamiento alcalino previo, b) a los 60 min de tratamiento alcalino previo 81
Figura A4 Cromatograma obtenido mediante MS-TOF para el extracto de harina de

nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa a los 0 min de hidrólisis alcalina 82
XI
Lista de abreviaturas
Abreviatura Significado
α Alfa I1 lsorhamnetina-3-O-
°c Grados centígrados glucosil-rhamnosil-
% Porcentaje rhamnósido
λmax Longitud de onda de 12 Isorhamnetina-glucosil-
máxima absorción rhamnosil-xilósido o
μg Microgramo arabinósido
μL Microlitro 13 Isorhamnetina-glucosil-
μm Micrómetro rhamnosil-rhamnosido
μM Micromolar 14 lsorhamnetina-3-O-
μmol Micromol glucosil-rhamósido
AA Ácido araquidónico IC50 Concentración inhibitoria
AAPH 2,2'-Azobis (2- del 50%
metilpropionamidina)dihi iNOS Óxido nítrico sintetasa
drocloruro inducida
AcOH Ácido acético K Kaempferol
bs Base seca K1 Kaempferol-glucosil-
cm Centímetro xilósido o arabinósido
Cmáx Concentración máxima K2 Kaempferol-3-O-
COX Ciclooxigenasa glucosil-rhamnósido
C0 2
Dióxido de Carbono kg Kilogramo
DNS Ácido dinitrosalicílico kPa Kilopascales
EAG Equivalentes de ácido LDL Lipoproteína de baja
gálico densidad
EM Extracto metanólico L Litro
eNOS Óxido nítrico sintetasa LOX Lipooxigenasa
endotelial LPS Lipopolisacárido
ET Equivalentes de Trolox M Molar
EtOH Etanol MeOH Metanol
9 Gramo mg Miligramo
h Hora min Minutos
Ha Hectáreas mL Mililitro
H2O Agua mm Milímetro
HCI Ácido clorhídrico mM Milimolar
HPLC High MS Espectrometría de
Performance/Pressure masas
Liquid Chromatography mta. Muestra
I Isorhamnetina
m/v Masa/Volumen
XII
Abreviatura Significado
N Normalidad TNF Factor de necrosis

NaOH Hidróxido de sodio tumoral
NAD Nicotinamida adenina Ton Toneladas
dinucleótido UV-Vis Ultravioleta-visible
NADPH Nicotinamida adenina var. Variedad
dinucleótido fosfato v/v Volumen/Volumen
ND Dato no disponible/no
detectable
NED N-1-naftilendiamina
NF-KB Factor nuclear Kappa-β
ng Nanogramo
nm Nanómetro
nNOS Óxido nítrico sintetasa
neuronal
NO Óxido nítrico
NOS Óxido nítrico sintetasa
NSAID Antiinflamatorios no
esteroideos
OFI-J O. fícus-indica var. Jalpa
ORAC Oxygen Radical
Absorbance Capacity
PBS Buffer de fosfatos
PDA Detector de arreglo de
fotodiodos
PLA 2 Fosfolipasa A 2
ppm Partes por millón
Q Quercetina
ROS Especies reactivas de
oxígeno
rpm Revoluciones por minuto
SAID Anti-inflamatorios
esteroideos
SBF Suero bovino fetal
Tmáx Tiempo máximo
TMB 3,3,5,5-
Tetrametilbenzidina
XIII
Opuntia flcus indica variedad jalpa"
Capítulo 1: Introducción
Recientemente, el consumo de alimentos funcionales ha aumentado debido
a que mejoran la salud humana. Se ha demostrado que estos alimentos ayudan
en la prevención de enfermedades relacionadas con el estrés oxidativo como el
cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares e inflamación (Kim et al., 2006;
Riezzo et al., 2005; Shi y Mazza, 2002).
México, cuenta con una amplia diversidad de especies de plantas y las

cactáceas son del grupo más abundante. El cactus Opuntia ficus indica,
vulgarmente llamado nopal, es una planta que se asocia a la cultura mexicana
desde tiempos prehispánicos (Betancourt et al., 2006), y que ha sido utilizado con
fines medicinales, alimentarios, ornamentales y de agricultura (Pimienta, 1994;
Ramírez et al., 2007; Stintzing y Carie, 2005).
Existen estudios relacionados con flavonoides que se encuentran en nopal

y que le han atribuido por ejemplo, capacidad antioxidante (Lee et al., 2002) y anti
inflamatoria (Cho et al., 2006). La inflamación es un proceso involucrado en el
desarrollo de disturbios patológicos como aterosclerosis, diabetes, enfermedades
neurodegenerativas y cáncer; y se han propuesto algunos mecanismos de cómo
los flavonoides pueden afectar este proceso; destacando, la actividad antioxidante
que poseen, o la inhibición de algunas enzimas pro-inflamatorias como el óxido
nítrico (NO) (Moneada era/., 1991; Kroncke era/., 1998).
Un gran porcentaje de los flavonoides se localizan en las vacuolas celulares

de las plantas (Markham et al., 2000), y se encuentran unidos a azúcares;
principalmente glucosa. S e han reportado diferentes métodos para tratar de
extraer éstos compuestos (Cai et al., 2010; Ginestra et al., 2009; Qiu et al., 2002;
Santos-Zea et al., 2011), como el uso de extracciones metanólicas e hidrólisis
acidas.
i
Sin embargo, estos métodos no extraen la mayor cantidad de flavonoides

que pudieran existir en la matriz; ya que no son capaces de romper los enlaces de
ligados a la pared celular y a su vez unidos covalentemente a otras moléculas
como azúcares (Krygier et al., 1982; Bunzel etal., 2001; Nuutila et al., 2002).
La extracción de estos flavonoides glicosilados es importante, con el fin de

conocer qué azúcares se encuentran unidos y de qué manera éstos pudieran
modificar su biactividad. Por lo que se pensó que una forma de extracción
diferente como lo es una hidrólisis alcalina permitiría extraer mayor cantidad de
flavonoides en sus formas glicosiladas, y que a su vez, éstos serían capaces de
inhibir la producción de óxido nítrico.
Por lo tanto, basándonos en un estudio previo (Santos-Zea et al., 2011), se

decidió trabajar con harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa; ya que
esta harina mostró la mayor cantidad de flavonoides al comparársele con otras
nueve variedades. El presente trabajo, tuvo como objetivo determinar el efecto de
una hidrólisis alcalina para la extracción de flavonoides glicosilados ligados a la
pared celular. Para ello, se realizó una optimización del tiempo de extracción con
el fin de obtener la mayor cantidad de flavonoides y evaluar los diferentes perfiles
de glicósidos. Se comparó la actividad antioxidante de los extractos en diferentes
perfiles de glicosilación, y por último, se comparó la actividad anti-inflamatoria de
los extractos en células de macrófagos (RAW 264.7) mediante la producción de
óxido nítrico y efectos citotóxicos.
2
Opuntia ficus indica variedad falpa"
Capítulo 2: Antecedentes
2.1 Alimento funcional
Los alimentos funcionales se definen como aquellos que en su estado

natural o forma elaborada contienen, además de los componentes nutritivos,
pequeñas cantidades de otros compuestos bioactivos que aportan más beneficios
para la salud (Shi et al., 2002; Riezzo et al., 2005; Kim et al., 2006). Las plantas
naturales se consideran una alternativa de fuente de alimento, ya que se ha
demostrado que ayudan a mantener la salud de las personas. En las últimas
décadas, numerosos estudios se han centrado principalmente en los alimentos
ricos en fitoquímicos y propiedades funcionales.
Existe una relación positiva entre el consumo de alimentos de origen

vegetal y la reducción del riesgo de padecer ciertas enfermedades; principalmente
crónico degenerativas, como el cáncer, enfermedades cardiovasculares o diabetes
(Block et al., 1992; Ness y Powles, 1997; Youdim y Joseph, 2001). En la mayoría
de los casos ésta relación es atribuida a la presencia de compuestos con actividad
antioxidante. El nopal es una planta natural considerada alimento funcional debido
a su composición de fibra dietética y perfil fitoquímico.
2.2 Generalidades de Opuntia spp.
En el mundo, 12 son los países que cuentan con la mayor biodiversidad de

plantas y México ocupa el cuarto sitio. La biodiversidad de México es fuertemente
afectada por el alto porcentaje de cactáceas (Cruz er al., 2006). De las 200
especies de cactus conocidas, más del 50% se encuentran en México. Sin
embargo, sólo 10 ó 12 especies hasta ahora son utilizadas por el hombre (Sáenz
et al., 2006; Betancourt er al., 2006). Dentro de las especies utilizadas se
encuentran Opuntia ficus-indica, O. amyclaea, O. xoconostle, O. megacantha y O.
streptacantha, como especies cultivadas, y dentro del grupo de especies silvestres
destacan principalmente O. hyptiacantha, O. leucotricha y O. robusta (Sáenz et al.,
2006).
3
De todas las especies anteriores, el cactus más conocido y utilizado es

Opuntia fícus-indica. Su uso se documenta desde los tiempos prehispánicos,
donde los pueblos indígenas lo utilizaban principalmente como alimento o como
remedio para enfermedades (Betancourt et al., 2006). Actualmente, también es
utilizado como forraje para ganado (Ramírez eí al., 2007), materia prima en la
elaboración de cosméticos (cremas, shampoo, jabones), y en la elaboración de
productos para adelgazar (Stintzing y Carie, 2005).
El "nopal" (Opuntia ficus indica) es una planta que pertenece a la familia de

las Cactaceae junto con la especie Nopalea. Su presencia se distribuye a lo largo
del continente Americano; aunque también se pueden encontrar cultivos en
lugares como África, Australia y el Mediterráneo (Piga, 2004; Sáenz eí al., 2006).
En México, se localiza principalmente en las regiones semiáridas del centro del
país (Pimienta, 1994), donde se observan menos de 250-450mm de precipitación
al año (Stintzing eí al., 2005). Los estados de Guanajuato, Jalisco, Aguascalientes,
San Luis Potosí, Zacatecas, Durango, Chihuahua, Coahuila, Nuevo León,
Tamaulipas y Sonora son los que cuentan con mayor presencia de cactáceas; por
lo que es considerada una planta que ha evolucionado en respuesta a la escasez
de agua y a las variaciones extremas de temperatura.
2.2.1 Descripción e información taxonómica de la planta
Los nopales son plantas suculentas arborescentes, arbustivas o rastreras,

generalmente espinosas, que poseen un tallo bien definido. Los tallos,
botánicamente llamados cladodios y vulgarmente pencas, son muy carnosos o
leñosos dependiendo de la edad. Se encuentran protegidos por una cutícula
gruesa y cerosa que les permite almacenar agua y soportar periodos largos de
sequía (de la Rosa y Santana, 1998). Contienen órganos especializados llamados
areolas, de las cuales se producen flores, frutos y espinas, principalmente en las
areolas superiores y en general es una planta que puede alcanzar los 5 m de
altura.
4
Los cladodios miden aproximadamente 30-60cm de largo, 20-40 cm de

ancho y 1.9 a 2.8cm de ancho (Medina er a/., 2008). Se consideran jóvenes los
que tienen de 3-4 semanas de edad y son utilizados principalmente como
alimento; mientras que los que tienen entre 2-3 años de edad se consideran
cladodios viejos y su uso es principalmente como forraje para rumiantes,
especialmente en largas temporadas de sequía (LeHouerou, 1996). Su taxonomía
se ilustra en la tabla 2.1.
Tabla 2.1 Información de la Taxonomía del Nopal

REINO Vegetal
SUBREINO Embryophíta
DIVISIÓN Angiospermae
CLASE Dycotyiedonea
SUBCLASE Dialipetalas
ORDEN Opuntiales
FAMILIA Cactaceae
SUBFAMILIA Opuntioideae
GÉNEROS Opuntia y Nopalea
Adaptado de Helia Bravo (1978).
Existen algunas diferencias físicas entre especies, como puede observarse

en la tabla 2.2, donde básicamente Opuntia ficus indica se distingue de los otros
miembros del género por su forma de cladodios; la cual es elíptica, de gran talla, y
casi no tienen espinas. En cuanto a sus frutos, son grandes, dulces y carnosos, y
puede encontrarse en ambientes diversos; por lo que se considera la especie más
conocida y cultivada (Reyes et al., 2005)
5
Tabla 2.2 Comparación física entre diferentes especies de Opuntia spp.
Característica 0. ficus-indica O. amyclae O. megacantha O. streptacantha

CLADODIO
Principalmente Oblongas a Obovados a
Forma elípticas elípticas Obovados circular
Largo (cm) 27 a 63 30 a 40 30 a 60 20 a 35
Ancho (cm) 14 a 31 15 a 20 18 a 19.5 12 a 23
Grosor (cm) la3 — 1.5 a 2.5 2a4
AREOLAS
Longitud (mm) 2a8 — 2a4 3a5
ESPINAS Casi Ausente Presente Presente Presente

N ú m e r o por 0a 1 la4 la7 la6
areola
Longitud (mm) 3 a 10 a 30 20 a 35 20 a 40
Color Blanco Blanco Blanco y café Blanco
FLOR
Longitud d e
3.8-7.5 3a4 3a4
...
pericarpio (cm)
FRUTO
Color d e cascara Amarilla, Roja Amarilla-roja Amarilla o Roja-morada y
Amarilla-roja a veces amarilla
Longitud (cm) 5 a 10 — 4.5 a 11 4a6
D i á m e t r o (cm) 4a7 — 3a4 4 a 5.5
Adaptado de Reyes (2005).
Es considerado uno de los principales cultivos del país; por ejemplo,

durante el año 2010 los estudios mostraron estadísticamente que el nopal ocupó 3
millones de hectáreas de terreno en México. La superficie sembrada de nopalitos
fue de 12,472.59 Ha, se cosecharon 12,201.11 Ha., y se generó una producción
de 723,815.42 Ton. El rendimiento final fue de 59.32 Ton/Ha durante el año (SIAP,
2011). Su cultivo está influenciado por factores como el agua, vientos fuertes y
secos, cambios climáticos y la disponibilidad de nutrientes en el suelo (Rodríguez
et al., 2007).
6
Al ser uno de los principales cultivos en el país, su consumo es común entre

los diferentes sectores de la población. El consumo per cepita diario de nopal en
México es de aproximadamente (10-17 gramos) (Ávila er al., 2003).
2.2.2 Composición química del nopal
Se ha llegado a considerar que gran parte del efecto protector que

proporcionan los vegetales y frutas puede ser atribuido principalmente a sus
constituyentes antioxidantes, incluyendo vitamina C (ácido ascórbico), vitamina E
(a-tocoferol), carotenoides, flavonoides y ácidos fenólicos (Sies y Stahl, 1995).
Dentro de los compuestos bioactivos con los que cuenta el nopal se encuentran
los compuestos fenólicos particularmente flavonoides, aunque también cuenta
con carotenos, ácido ascórbico, fitoesteroles y clorofila (Gallegos er al., 2009).
Los nopalitos son considerados como una buena fuente de p-caroteno o

provitamina A (11.3-53.5 u.g/100g de muestra fresca) y ácido ascórbico o vitamina
C (7-22mg/ 100g de muestra fresca) (Rodríguez y Cantwell, 1988). Estas dos
importantes vitaminas son conocidas por disminuir significativamente los riesgos
de ciertos tipos de cáncer, enfermedades cardiovasculares y enfermedades
crónico degenerativas asociadas con el envejecimiento (Ruíz er al., 2005;
Rodríguez y Cantwell, 1988).
En lo que respecta a la composición química de la porción comestible del

cladodio y los frutos de Opuntia ficus indica se pueden encontrar principalmente
azúcares, proteínas y lípidos; algunos minerales incluyendo calcio, potasio y
magnesio (Muñoz et al., 1995), fibra dietética e importantes fitoquímicos (Ayadi et
al., 2009; Hernández era/., 2011; Rodríguez y Cantwell, 1988).
7
Rodríguez y Cantwell (1988), reportaron los constituyentes de los cladodios

de tres diferentes especies de Opuntia; (Opuntia amyclaea, Opuntia ficus indica y
Opuntia inermis). Los resultados se muestran en la tabla 2.3 y concuerdan con los
de Feugang er al., (2006) que reportaron 88-95g de agua, 3-7g de carbohidratos,
1-2g de fibra, 0.5-1 g de proteína y 0.2g de lípidos / 1 0 0 gramos de muestra fresca.
Tabla 2.3 Análisis bromatológico de cladodios Opuntia spp. en tres especies

diferentes.
O. amyclaea O. ficus indica O. inermis

g/1 OOg muestra seca
a
Agua 92.0 a
91.5 a
91.7
a b b
Proteína 1.58 1.20 1.22
a b a
Lípidos 0.22 0.27 0.23
a c b
Fibra 1.43 1.29 1.38
a b
Carbohidratos 5.26 c
5.81 5.55
Letra distinta por renglón indica diferencia estadísticamente significativa.
Adaptado de Rodríguez y Cantwell (1998).
Los importantes beneficios que se asocian al nopal son debido a la

presencia de un alto contenido de fibra, sobre todo cuando éste no se encuentra
en etapas jóvenes. Su presencia se encuentra influenciada por condiciones de
clima, suelo y estado de madurez de la penca. La fibra se considera uno de los
principales componentes del nopal y durante mucho tiempo ha centrado la
atención de diferentes investigadores, principalmente por la relación que tiene con
la aminoración de síntomas de diabetes.
8
Un estudio realizado por Hernández et al., (2010) en Opuntia ficus indica

variedad Redonda mostró los contenidos de fibra a diferentes estados de madurez
del cladodio; los resultados muestran un incremento de la fibra cruda de 11 g a
23.3g/100g de muestra seca en un periodo de 40 a 135 días de edad
respectivamente. La fibra insoluble aumentó de 40.1g a 56.8g/100g de muestra en
el mismo periodo; y la fibra soluble se disminuyó, de 25.5g (40 días) a 9.8g (135
días). Los resultados concuerdan con otro estudio conducido previamente por
Ramírez eí al., (2007).
La fibra de nopal está integrada por diferentes componentes químicos que

son resistentes a las enzimas digestivas como la celulosa, hemicelulosa, pectina,
lignina, gomas, etc. (Periargo eí al., 1993). S e ha demostrado que el nopal tiene
efectos anti-hiperlipidémicos, anti-hipocolesterolémicos, hipoglicémicos, así como
efectos en el tratamiento de desórdenes gastrointestinales y enfermedades
asociadas con baja ingesta de fibra dietética (Ayadi eí al., 2009; Feugang eí al.,
2006; Gebremariam etal., 2006).
El consumo de cladodios puede ayudar a mejorar el control de la glucosa,

modular el agua renal y el manejo de sodio en pacientes con diabetes tipo 2
(Cárdenas eí al., 1998). Su contenido de fibra tiene la capacidad de absorber
grandes cantidades de agua y formar coloides viscosos o gelatinosos que ayudan
a la absorción de moléculas orgánicas. Su consumo también ayuda a controlar la
presión sanguínea, reducir triglicéridos y nivelar el colesterol total, lo cual le
permite ser utilizado en el tratamiento de la obesidad (Bwititi eí al., 2001; Cárdenas
etal., 1998; Sáenz, 2000)
9
También se ha demostrado que el nopal tiene cantidades importantes de

calcio, lo que le brinda un gran potencial para su uso en la prevención de
enfermedades que se asocian con su deficiencia. Sin embargo, como ya se ha
mencionado, el nopal sufre cambios en su composición química, dependiendo del
estado de madurez, las condiciones climáticas y del suelo. Algunos estudios
(Hernández er a/., 2011; Rodríguez et al., 2007; Sáenz, 2000) han demostrado que
la presencia del calcio se ve incrementada conforme el cladodio tuvo una mayor
madurez.
Por ejemplo, en el estudio realizado por Hernández er ai, (2010) se evaluó

la presencia de calcio a diferentes estados de madurez utilizando Opuntia ficus
indica variedad Redonda. Los resultados obtenidos mostraron que el contenido de
calcio se incrementó cuando el estado de madurez cambió de 40 a 135 días de
edad, aumentando de 17 a 35mg/g de muestra. Pero a su vez, otros minerales,
como el potasio y el fósforo no mostraron cambios que sugieran que su contenido
cambie significativamente dependiendo de la edad.
2.3 Compuestos fenólicos
En años recientes, los compuestos fenólicos pasaron a ser de atractivo

interés para las investigaciones, principalmente por su poder antioxidante, que
brinda protección al cuerpo humano de los radicales libres (Bors y Michel, 2002;
Manach er al., 2004). Estos compuestos no pueden ser producidos por el cuerpo
humano y por eso deben ser ingeridos en la dieta diaria o en forma de
suplementos.
Los compuestos fenólicos se encuentran ampliamente distribuidos en

plantas, frutas, verduras y diversas bebidas como el té y el vino rojo (Hertog er al.,
1996; McDonald et al., 1998). Son importantes metabolitos secundarios que son
sintetizados por las plantas como un resultado de la adaptación de éstas a las
condiciones de estrés biótico (bacterias y hongos) y abiótico (infecciones, falta de
agua, temperaturas bajas, exceso de luz) (Harborne y Williams, 2000; Pichersky y
Gang, 2000; Awika y Rooney, 2004).
10
2.3.1 Flavonoides
Los flavonoides están formados por un esqueleto común de difenilpiranos

(C6-C3-C6), compuesto por dos anillos de fenilos (A y B) que se encuentran
ligados a través de un anillo C de pirano (Figura 2.1), y se consideran compuestos
de bajo peso molecular. Los flavonoides se clasifican de acuerdo a la posición de
los grupos químicos en la molécula (Martínez etal., 2002). En la tabla 2.4, y en la
figura 2.2 se representan las estructuras de los flavonoides más ingeridos en la
dieta (Rui, 2004).
Figura 2.1: Estructura básica de los flavonoides. Adaptada de Martínez (2002).
11
Tabla 2.4 Clasificación de flavonoides en base a su estructura y miembros más

representativos de cada grupo.
Compuesto más
Clasificación Grupo y ubicación
estudiado del grupo
Un hidroxilo en la posición
Flavanos 3 del anillo C
Catequina
Un carbonilo en la posición
Quercetina
Flavonoles 4 y un hidroxilo en la
posición 3 del anillo C Kaempferol
Flavonas Un carbonilo en la posición

4 del anillo C Diosmetina
Un hidroxilo en la posición
Antocianidinas 3 y un doble enlace entre el Cianidina
carbono 3 y 4 del anillo C
Adaptado de Martínez (2002).
Diosmetina Cianidina
Figura 2.2: Estructuras químicas de los flavonoides más comunes en la dieta.

Adaptado de Martínez (2002).
12
Los flavonoides se sintetizan en el retículo endoplásmico y posteriormente

son trasladados a diferentes sitios, principalmente a las vacuolas celulares. La
solubilidad que tienen depende de la polaridad y la estructura química de la
molécula (grado de hidroxilación, glicosilación, acetilación, etc.). Algunos de estos
compuestos, pueden estar ligados a los componentes de la pared celular
(polisacáridos, lignina) (Markham er al., 2000).
Las estructuras de flavonoles y flavonas normalmente tienen unidos

azúcares, lo cual ocurre casi siempre en la posición C3 y raramente en la posición
C7, por lo que éstos compuestos se encuentran en las plantas como O-
p-glicósidos (Kühnau, 1976; Hollman er al., 1999). El residuo de azúcar más
frecuente es la D-glucosa, pero también pueden ser residuos de D-galactosa, L-
ramnosa, L-arabinosa o D-xilosa. La unión de azúcares puede modificar la
hidrofobicidad de la molécula, sus propiedades biológicas e incrementar el peso
molecular (McDonald et al., 1998). La parte sin azúcares de la molécula flavonoide
se denomina aglicona. Los glicósidos son más solubles en agua y menos reactivos
frente a radicales libres en comparación con su aglicona (Martínez er al., 2002).
2.3.2 Absorción y biodisponibilidad de flavonoides
En un principio, los flavonoides eran considerados como compuestos

pobremente absorbidos en el lumen intestinal, debido a que se encuentran ligados
a azúcares (Kühnau, 1976). Dicho enlace es resistente a la hidrólisis por las
enzimas pancreáticas. Es por ello que se pensaba que sólo la aglicona era la que
podía atravesar las membranas de las células epiteliales del intestino. Hay
algunos estudios realizados con el fin de investigar la absorción y biodisponibilidad
de los flavonoides, entre ellos, el realizado por el grupo de Hollman et al., (1995).
En dicho estudio cuantificaron la absorción de varias formas de quercetina.
13
Para determinar los porcentajes de absorción de quercetina; en el modelo

incluyeron 100 mg de quercetina libre, quercetina glucosilada que se encuentra en
cebollas (el equivalente a 89 mg de aglicona) y quercetina-rutinósido que se
encuentra en el té negro (el equivalente a 100 mg de aglicona). Los nueve sujetos
de estudio siguieron una dieta libre de quercetina durante 12 días; a los 4, 8 y 12
días recibieron los suplementos (como parte de un extracto) en orden aleatorio.
Los resultados muestran que la quercetina aglicona tuvo una absorción de 24%, la
quercetina glucosilada de las cebollas una absorción de 52% y la quercetina
rutinosido de 17%. Sugiriendo con ello que los glucósidos de quercetina de las
cebollas son mejor absorbidas que las agliconas, e incluso que la quercetina unida
a un rutinosido (Hollman et al., 1995). Lo cual puede ser debido a la diferente
estructura química entre los dos azúcares.
De Vries eí al., (1998) reportó resultados similares; el estudio constó de

quince individuos saludables, los cuales recibieron té negro (1600 ml/día) o
cebollas fritas (129 g/día) durante 3 días. El té proporcionó 49 mg de quercetina-
rutinósido y la cebolla 13 mg de quercetina-glucosilada. Los resultados reportaron
que ambas quercetinas fueron absorbidas, pero que la quercetina-rutinósido del té
fue menor absorbida que la quercetina-glucosilada. Y a que los datos de la
excreción en orina después del consumo de cebollas fue de 1.1% y después de
consumir el té fue de 0.5%. Por lo tanto se confirma que la quercetina de las
cebollas es mejor absorbida.
Hollman et al., (1997), midieron los niveles plasmáticos de quercetina en

nueve individuos sanos. El estudio constó de 3 periodos de experimentos de 5
días cada uno, y 9 días de descanso entre períodos. El suplemento que se les
proporcionó al cuarto día de experimento de cada periodo, contenía quercetina en
diferentes formas (Figura 2.3), y fueron proporcionados al azar. Los suplementos
fueron 225 umol de cebollas (que son 68 mg equivalentes de quercetina) para ver
los niveles que aporta la quercetina-4-O-B-glucósido, 325 umol de quercetina de
un puré de manzana con cascara para ver la quercetina-galactósido y por último
una cápsula que contenía 331 umol de quercetina-3-O-p-rutinósido.
14
Los resultados mostraron que la biodisponibilidad de la quercetina, tanto del

puré de manzana (quercetina-galactósido) como de la quercetina-3-rutinósido fue
sólo el 30% comparado con el de la cebolla. Los niveles máximos de quercetina
en plasma también variaron; con un máximo de 0.7 h tras la ingestión de cebollas,
2.5 h después de las manzanas y 9 h después del rutinósido. Sugiriendo que
cuando la quercetina se encuentra unida a un glucósido su absorción se lleva a
cabo en el intestino delgado, por lo cual, la absorción es más rápida y las
concentraciones plasmáticas mayores. En cambio, cuando es un galactósido o
rutinósido, la absorción se lleva a cabo en el colon y por lo tanto es más lenta ya
que tienen que ser previamente degradados por los microorganismos presentes
(Hollman, 2004). Además, la vida media de eliminación fue de 23 h para las
manzanas, y 28 h para las cebollas, el valor del rutinósido no se reporta.
Sugiriendo con ello, que un consumo repetido de alimentos que contengan
quercetina, pueden ayudar a que esta se acumule en sangre; y que la conjugación
con glucosa, mejora la absorción en el intestino delgado, debido a la larga vida de
eliminación.
Flg. 2.3: Estructuras químicas presentes en los suplementos proporcionados. I)

Estructura de quercetina aglicona, II) estructura de quercetina-4-0-/?-D-glucósido
presente en cebollas, III) estructura de querretina-3-0-/?-D-galactósido presente
en manzanas y IV) quercetina-3-0-/?-rutinósido o rutina. Adaptado de Hollman etai.,
(1997)
15
Hollman et al., (1999a) realizaron un estudio en humanos en el cual

compararon la capacidad de absorción de la quercetina ligada a un glucósido y
quercetina ligada a un rutinosido y concluyeron que la mejor tasa de absorción se
observó con la quercetina-p-glucósido.
Por lo que sugieren que los azúcares son importantes determinantes en el

proceso de absorción. En la tabla 2.5 se observan los resultados, que muestran el
incremento de quercetina en plasma después de la ingesta de glucósido,
comparándolo con el obtenido después de la ingesta del rutinosido. A su vez, la
biodisponibilidad del rutinosido fue menor, aproximadamente 20% de la que se
obtuvo con la forma glucosidada.
Tabla 2.5 Parámetros farmacocinéticos obtenidos después de la ingesta de

glicosidos de quercetina (311 u.M) en 9 sujetos de estudio.
Parámetro Suplemento Suplemento

Quercetina-4 '-O-p-D- Quercetina-3-O-p-
Glucósido Rutinósido
3.5 +/- 0.6 0.18+/-0.04

C áx (uM)
m
Tmáx (h) <0.5 6.0 +/-1.2
Vida V2 de eliminación 21.6 +/-1.9 28.1 +/-6.4

(h)
A U C (uM*h) 18.8+/-2.4 3.7 +/- 0.7
Adaptado de Hollman (1999)
Cmáx= Concentración máxima

Tmáx= Tiempo máximo
AUC= Área bajo la curva
16
A partir de estos resultados, se comenzó a especular sobre cómo son éstos

flavonoides absorbidos. El glucósido se absorbe en el intestino delgado mientras
que el rutinósido puede transitar a través de él sin ser absorbido hasta llegar al
colon y ahí absorberse. Esta forma debe previamente hidrolizarse en el intestino
delgado a su forma aglicona (Manach et al., 1998). Los autores también
mencionan que la naturaleza del azúcar es lo que puede influir más en el proceso
de absorción y no la posición en la que se encuentre el azúcar unido.
Por lo tanto, las estructuras son las que determinan en qué lugar puede
llevarse a cabo la absorción de los flavonoides. La cual puede ser en el intestino
delgado o atravesar hasta el colon, donde los microorganismos rompen las
moléculas de los flavonoides hasta formas agliconas y posteriormente se lleva a
cabo la absorción. Se ha reportado que los glucósidos son los únicos glicosidos
que pueden ser absorbidos directamente en el intestino delgado, y que éste tipo
de absorción produce mayores concentraciones de los compuestos en plasma.
Después de la absorción, los flavonoides son conjugados con ácido glucurónico,
O-metilaciones o sulfataciones, es por ello, que las agliconas no pueden ser
encontradas en plasma u orina. Las concentraciones plasmáticas debido a una
dieta normal, pueden ser menores a 1 jaM (Hollman, 2004; Manach era/., 1998).
2.3.3 Ingesta de flavonoides
De la gran gama de flavonoides, los flavonoles en su forma glicosílada son

los predominantes. Las variaciones en los niveles de éstos durante el crecimiento
y desarrollo de cereales y vegetales, no son homogéneos como los reportados
para frutas. Debido principalmente a la naturaleza del órgano (hoja, tubérculo,
grano) y su localización subcelular (vacuolas o ligados a la pared celular) (Pinelo
et al., 2008).
17
La ingesta de flavonoides en el mundo es muy diversa, ya que los hábitos

alimenticios son muy diferentes entre países, por lo que se estima que el valor
promedio es de 23 mg/día (Hertog eí a/., 1996). La ingesta de flavonoides excede
a la de otros antioxidantes de la dieta, entre los que se encuentran el beta-
caroteno (2-3mg/día) y vitamina E (7-10mg/día) y es equivalente
aproximadamente a un tercio del consumo de la vitamina C (70-100 mg/día)
(Hertog eí a/., 1996). Por lo tanto, los flavonoides representan una contribución
importante al potencial antioxidante de la dieta humana.
Cao eí a/., (2010), reportó el contenido de flavonoides totales en frutas, por

ejemplo en las manzanas red delicious (344.4mg/kg de muestra), pina
(66.9mg/kg), durazno (48.2mg/kg), pera sin cascara (26.4mg/kg), fresa
(10.9mg/kg), naranja (20mg/kg) y plátano (16.9mg/kg). Los flavonoides que
predominaron fueron la quercetina, kaempferol, isorhamnetina y luteolina. Para los
vegetales reporta que la zanahoria sin cascara contuvo el mayor contenido de
flavonoides (367.5mg/kg de muestra) seguido de la cebolla (93.2mg/kg), tomate
(77.1mg/kg), coliflor (67.9mg/kg), espinaca (8.9mg/kg) y lechuga (46.6mg/kg).
Fernández eí al., (2010) y Kuti eí al., (2004) reportaron para la tuna Opuntia
ficus indica valores de 155.6u.g/g y 69.5ug/g de muestra, respectivamente. En
general éstos compuestos se localizan principalmente en las hojas, flores y partes
externas de la planta como la cascara (Aherne eí al., 2002). En cuanto a cereales,
Adom y Liu, (2002) reportaron los valores de flavonoides para trigo y avena, los
cuales fueron de 1.24 y 1.16 umoles equivalentes de catequina/g de grano,
respectivamente.
2.3.4. Extracción de flavonoides ligados
Estudios principalmente en granos han demostrado que los contenidos

fitoquímicos han sido subestimados principalmente porque los fitoquímicos que se
encuentran ligados a la pared celular no son incluidos en la cuantificación. Las
frutas y vegetales tienen gran parte de sus fitoquímicos en forma libre o soluble
18
como conjugados glucósidos, pero también una parte de ellos se pueden

encontrar enlazados a la pared celular (Vinson et al., 1998; Vinson er al., 2001) y
tampoco son cuantificados.
Por ejemplo, en arroz y maíz el 74 % y 69 %, respectivamente, del total de

flavonoides se encuentran en formas ligadas insolubles. El material de las paredes
celulares es difícil de digerir y la mayoría de los estudios previos han reportado los
niveles de flavonoides usando soluciones acuosas de metanol, etanol y acetona
logrando sólo la extracción de compuestos solubles. (Velioglu er al., 1998; Miller et
al., 2000; Zielinski er al., 2000). Estos estudios muestran largos periodos de
extracción y aún con esto, no es posible obtener los compuestos ligados.
Krygier et al., (1982) realizaron uno de los primeros trabajos con

tratamientos alcalinos, con el fin de separar los fenólicos ligados-insolubles
mediante un rompimiento del enlace de éster. Los autores reportaron un método
eficiente, y obtuvieron mayores cantidades de fenólicos (768-1196 mg/100g de
muestra) en semillas de colza. El tratamiento con hidróxido de sodio a diferentes
tiempos y concentraciones ha demostrado ser eficaz en la liberación de estos
compuestos (Adom er al., 2002; Barberousse et al., 2008).
Por ejemplo, en el estudio realizado por Adom et al., (2002) se demuestra

que un alto contenido de flavonoides se encuentran en forma ligada. Los autores
compararon maíz, trigo, avena y arroz; de estos 4, el que mayor cantidad de
flavonoides libres presentó fue la avena y el de menor cantidad fue el maíz, el
rango entre ellos fue de 0.45-0.16 umol/g. En cuanto a los flavonoides ligados, el
maíz tuvo la mayor presencia y la avena la menor, el rango fue de 1.52-
1.16umol/g respectivamente. Por lo tanto, la mayoría de los flavonoides se
encontraron en la fracción ligada. El rango de porcentaje de contribución de los
flavonoides libres fue (9-39 %) para el maíz y la avena, respectivamente, y el de
ligados (61-93 %) para la avena y trigo, respectivamente.
19
La extracción de los compuestos bioactivos que se encuentran presentes

en plantas es el primer paso para poder utilizarlos; ya sea para la preparación de
suplementos dietarios, nutracéuticos, ingredientes de alimentos, productos
farmacéuticos y productos cosméticos. Por lo tanto, para incrementar la liberación
de fenólicos ligados, se han utilizado una serie de procedimientos, entre ellos la
utilización de procesos enzimáticos, y actualmente los tratamientos alcalinos
también se consideran eficaces para lograr la liberación de éstos compuestos
(Arranz eí a/., 2009).
2.3.5 Propiedades de los flavonoides
El creciente interés en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia

actividad farmacológica; ya que tienen excelentes propiedades de quelación del
hierro (Hollman y Katan, 1999) y otros metales de transición como cobre y zinc
(Martínez eí ai, 2002), que les aporta gran capacidad antioxidante. Estudios
epidemiológicos han indicado los efectos benéficos de los compuestos
antioxidantes en la prevención de múltiples enfermedades, incluyendo cáncer,
enfermedades cardiovasculares, y desordenes neurodegenerativos (Hollman y
Katan, 1999).
La propiedad que tienen de ser anti-radicales libres se dirige

fundamentalmente hacia los radicales de hidroxilo y superóxido, los cuales son
especies altamente reactivas que están relacionadas con la peroxidación lipídica
(Pace eí ai, 1995; Yang eí ai, 2000; Igura eí ai, 2001; Geleijnse eí ai, 2002).
Además de las propiedades antioxidantes, también presentan acciones antivirales,
antialergénicas (Vrijsen eí ai, 1988), y antiinflamatorias (Pace et ai, 1995; Yang eí
ai, 2000; Igura etal., 2001).
20
2.3.5.1 Capacidad antioxidante
Los flavonoides son moléculas que poseen actividad antioxidante, ya que

previenen del daño que provocan los radicales libres a las moléculas biológicas,
como lípidos, proteínas y DNA, los cuales pueden provocar enfermedades
neurodegenerativas. Los mecanismos involucrados, son la quelación de metales,
la inhibición de enzimas que producen radicales libres y la capacidad de atrapar
radicales libres; ya que los flavonoides estabilizan las especies reactivas de
oxígeno (ROS) al reaccionar con el componente reactivo del radical haciéndolo
más estable (Pietta et al., 2000).
Las estructuras que tienen los flavonoides han demostrado influir en la

actividad antioxidante que presentan. Por ejemplo, la estructura plana, el número y
la posición de los grupos hidroxilo, la presencia del doble enlace entre el C =C , así 2 3
como la presencia de un grupo catecol han demostrado que le brindan una mayor
actividad antioxidante a éstos compuestos. Por ejemplo, la quercetina es un
flavonol que ha demostrado tener buena capacidad antioxidante y cumple con
todas las características estructurales descritas anteriormente (Soobrattee er al.,
2005; Heim et al., 2002). Wang et al., (2006) comparó los ICso de quercetina,
kaempferol y mirecitina, mediante el método de 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl
(DPPH), obteniendo 8.05u.M, 25.70uM y 12.29u.lv1 respectivamente. Lo cual indica,
que la mirecitina y quercetina que contienen 3'-4'-di-OH en el anillo B (catecol),
tuvieron mayor actividad que el kaemfperol (4'-OH).
También se han reportado que otras modificaciones estructurales, como

glicosilaciones y O-metilaciones de los grupos hidroxilos de flavonoides, afectan
su actividad antioxidante principalmente porque no permiten el intercambio de
protones y electrones con las especies reactivas de oxígeno (Soobrattee et al.,
2005). Cai et al., (2006), reportaron que los flavonoides agliconas tienen un mayor
potencial antioxidante que sus contrapartes glicosiladas. Por ejemplo, la
quercetina, luteolina, mirecitina y kaempferol tienen mayor capacidad antioxidante
que aquellos flavonoides conjugados, como la quercetina-3-glucósido, quercitrina
21
y rutina (Noroozi eí al., 1998). loku etal., (1995) mostraron que la actividad de los
glicósidos de quercetina era menor que los de la quercetina aglicona en un
sistema de membrana artificial.
2.3.6 Estudios previos que relacionan el nopal y los flavonoides
Hay algunos estudios que indican que las plantas de la familia de las
Cactaceae producen flavonoles 3-O-glicósidos (quercetina, kaempferol e
isorhamnetina) (Burret eí al., 1982; Ginestra eí al., 2009; Kuti eí al., 2004; Qiu eí
al., 2002; Santos-Zea eí al., 2010). Por ejemplo, el estudio realizado por Kuti eí al.,
(2004) realizado en frutos de cuatro diferentes variedades de cactus, mostró la
presencia de flavonoides. La forma predominante., como puede observarse en la
tabla 2.6 fue la quercetina, la cual es una de las más consumidas y estudiadas
debido a sus probados beneficios en la salud (Kandaswami eí al., 1994).
Tabla 2.6. Concentración de flavonoles (uxj/g de muestra en base seca) en frutos

de diferentes especies de Opuntia spp.
Especies Opuntia Kaempferol" Quercetina" Isorhamnetina 01

Total"
O. ficus-indica 2.2 +/- 0.3 43.2 +/- 2.5 24.1+/- 1.0 69.5
O. lindheimeri 1.1 +/- 0.4 90.5+/-11.5 1.9 +/- 0.5 93.5
O. strepthacantha 3.8 +/- 0.5 51 +/- 4.6 ND 3.8
O. stricta ND 9.8 +/- 3.0 ND 9.8
a= Indica concentración (microgramo de flavonoide por gramo de muestra en base

seca)
Adaptada de Kuti eí al., (2004).
22
Caí et al., (2010) hicieron la extracción, purificación y caracterización de

flavonoides presentes en la cascara de Opuntia fícus indica variedad Milpa alta.
Utilizaron varios métodos de extracción con solventes y el extracto etanólico a
90°C fue con el que lograron obtener la mayor cantidad de flavonoides (5.55 mg/g
de peso seco); y los resultados de LC-MS indicaron que los principales
compuestos del extracto fueron isorhamnetina 3-0-(2,6-dirhamnosil) glucósido e
isorhamnetina 3-O-D-rutinósido.
En la especie dilleni de Opuntia, Qiu et al., 2002 identificaron la presencia

de un flavonol glicósido de kaempferol, y lograron elucidar su estructura (Figura
2.4).
Fig. 2.4 Estructura de un flavonol glicósido de kaempferol identificado en cladodios

de Opuntia dillenii. (Kaempferol 7-0-/?-D-glucopiranosil-/?-D-glucopiranosido) (Qiu
er al., 2002)
Uno de los trabajos más actuales fue desarrollado por Ginestra et al.,
(2009); en el cual se investigó la composición de los cladodios de Opuntia ficus
indica. Se realizaron extracciones seriadas de etanol al 70% y 100% para obtener
cuatro fracciones (E70-I, E-70-II, E100-I, E-100-II) y sus residuos. Con éste tipo de
extracción obtuvieron los mismos flavonoides en los cuatro extractos pero a
diferentes concentraciones.
23
Con la fracción de E70-I lograron obtener la mayor cantidad de flavonoides,

de los cuales, el predominante fue isorhamnetina y sus derivados y en menor
proporción kaempferol y quercetina. Dentro de los compuestos que identificaron
destacan los glicósidos, entre ellos la isorhamnetina glucosil-ramnosil-ramnósido y
una mezcla de dos flavonoides, isorhamnetina glucosil-ramnosil-xilosido o
arabinósido. Realizaron una extracción etanólica extra a los residuos, lo que
permitió observar que aún había presencia de flavonoides (72-85%). Por lo tanto,
es posible decir que algunos componentes de la estructura de la pared celular de
los cladodios afecta la solubilidad de estos compuestos de bajo peso molecular, y
por lo tanto no se logre obtener la máxima cantidad de ellos con solventes polares.
Otro estudio del género Opuntia realizado por Santos-Zea eí al., (2011), con
harina de nueve variedades de cactus mexicano, mostró resultados similares a los
obtenidos previamente (Cai etal., 2010; Ginestra eí al., 2009); ya que el flavonoide
predominante en los extractos metanólicos fue isorhamnetina. Los resultados
mostraron que la variedad influye, ya que el rango de isorhamnetina fue de 99.58-
762.2 ug/g. También se reporta la presencia de kaempferol, aunque en menores
cantidades que la isorhamnetina con un rango de 12.9-119 u.g/g. En este estudio
se identificaron seis formas glicosiladas del flavonol isorhamnetina y una de
kaempferol las cuales concuerdan con las previamente reportadas por Ginestra eí
al., (2009).
2.4 Inflamación
La inflamación es la principal respuesta del cuerpo para hacer frente a las

lesiones y está clínicamente definida como un proceso fisiopatológico,
caracterizado por enrojecimiento, fiebre, dolor, edema y pérdida de función (Liang
eí al., 1999). La inflamación es un proceso complejo, regulado con precisión para
prevenir daños al hospedero. Por lo tanto, cuando su regulación no es la
adecuada se convierte en un estado crónico de inflamación.
24
Opuntia ficus indica variedad jalpa"
La inflamación excesiva es considerada un factor crítico en muchos

padecimientos, incluyendo cáncer, obesidad, diabetes tipo 2, enfermedades
cardiovasculares y neurodegenerativas; por lo que la morbilidad y mortalidad a
nivel mundial principalmente causada por enfermedades infecciosas ha sido
reemplazada por este tipo de enfermedades crónicas (Benavente ef a/., 2008;
Schewe et al., 2002). Actualmente, se conocen fármacos como los anti
inflamatorios esteroideos (SAID) y no esteroideos (NSAID); pero aún y con éstos,
se requiere de otros compuestos que puedan estar presentes por ejemplo en la
dieta diaria y que ayuden a prevenir o mejorar las enfermedades provocadas por
una inflamación crónica.
La inhibición de las enzimas involucradas en los procesos inflamatorios,

como la óxido nítrico sintetasa (NOS), la ciclooxigenasa (COX), fosfolipasa A 2
(PLA ) y lipooxigenasas (LOX) ayuda a disminuir la producción de ácido

2
araquidónico, óxido nítrico, leucotrienos y prostaglandínas que son mediadores

cruciales en mecanismos de inflamación (Kim et al., 2004).
2.4.1 Óxido nítrico y su relación en la inflamación
El óxido nítrico es uno de los implicados en procesos inflamatorios. Es un

mediador celular de procesos fisiológicos y patológicos (Moneada er al., 1991;
Nathan, 1992). Altos niveles de óxido nítrico (NO) han sido descritos por una
variedad de procesos patológicos incluyendo varias formas de shock circulatorio
(Kroncke et al., 1998), inflamación (MacMicking et al., 1997) y carcinogénesis
(Oshima era/., 1994).
Hay tres tipos de isoformas de óxido nítrico sintetasa (NOS), la neuronal

(nNOS) y endotelial (eNOS) las cuales son expresadas constitutivamente (Yun er
al., 1996), y la tercera es la inducible (¡NOS) la cual es en respuesta al interferón-y,
lipopolisacárido (LPS) y a una gran variedad de citoquinas pro-inflamatorias,
bacterias y virus (Kroncke et al., 1992).
25
La isoforma inducible ¡NOS es responsable de la sobreproducción de NO en

inflamación, expresada por estímulos inflamatorios en ciertas células como los
macrófagos. El NO es bioquímicamente sintetizado de L-arginina por N O S . La
óxido nítrico sintetasa juega un rol importante en la regulación del tono vascular,
neurotransmisión, muerte de microorganismos, células tumorales y otros
mecanismos homeostáticos (Mayer eí a/., 1997). Es importante mencionar que
solo una pequeña cantidad de NO sintetizado por la eNOS y nNOS es esencial
para mantener la función normal del cuerpo (homeostasis).
Un incremento significativo de NO sintetizado por la ¡NOS participa en el

proceso de inflamación y actúa sinérgicamente con otros mediadores inflamatorios
convirtiéndolo en un proceso crónico (Nathan, 1992). Es importante mencionar
que ¡NOS no es detectable en tejidos saludables, se expresa después de lesiones
en varios tipos celulares incluyendo células musculares, macrófagos, hepatocitos,
y astrocitos solo después de estar expuestos a estimulantes específicos como
citoquinas (Busse y Mulch, 1990; Zhang y Morrison, 1993).
Hay diferentes mecanismos que tienen los flavonoides para producir efectos
antiinflamatorios. Entre ellos destacan la actividad antioxidante, modulación de
células inflamatorias, modulación de enzimas y mediadores proinflamatorios y
modulación de genes proinflamatorios (García eía/., 2009).
2.4.2 Flavonoides e Inflamación
Se ha demostrado que algunos flavonoides inhiben la inflamación crónica,

éste tipo de estudios donde se evalúa la actividad anti-inflamatoria son
importantes, no sólo para establecer los mecanismos de la enfermedad, sino
también para desarrollar nuevas clases de agentes que favorezcan su inhibición
(Guardia eía/., 2001).
26
El primer inhibidor natural de P L A encontrado fue la quercetina el cual

2
inhibía ésta enzima en neutrófilos humanos (Lee et al., 1982). Se encontró

repetidamente que la quercetina inhibía esta enzima en un estudio donde se
trabajó con neutrófilos peritoneales de ratón obteniendo un IC o de 57-100 uM 5
(Lanni y Becker, 1985). También los flavonoles como el kaempferol, quercetina y

mirecitina inhiben considerablemente PLA , moléculas que poseen un doble anillo
2
entre el carbono 2 y 3 (Welton et al., 1986). Los valores de I C 50 de estos

flavonoles fueron de 75 a 115 pM.
Un estudio in vivo referente a los flavonoides y su capacidad

antiinflamatoria fue realizado con el propósito de investigar la capacidad de la
quercetina, rutina y hesperidina para inhibir la inflamación crónica y aguda en la
artritis (Guardia et al., 2001). La rutina fue bastante efectiva en reducir los edemas
y nodulos un 100 %, mientras que la quercetina 50 % y la hesperidina un 33 %.
La rutina difiere de la quercetina solo en la presencia del azúcar rutinosa en la
posición 3. En base a esto es posible que los factores farmacocinéticos
contribuyan a mejorar la actividad de los glucósidos.
2.4.3 Flavonoides y producción de óxido nítrico
Las células fagocíticas, especialmente los macrófagos, están implicados en

desordenes inmunopatológicos relacionados al estrés oxidativo, el cual se define
como un desequilibrio entre la generación y eliminación de especies reactivas de
oxígeno (ROS) derivados del metabolismo de oxígeno en sistemas aerobios),
incluyendo inflamación y enfermedades. Por lo tanto, los macrófagos son
considerados un excelente modelo para estudiar la inhibición de NO (Saha et al.,
2004; So era/., 1999).
En el estudio realizado por Liang et al., (1999) se probó el efecto que tenían
seis flavonoides en la producción de NO en macrófagos RAW 264.7 activados con
LPS. Los resultados (Figura 2.5), indican que los flavonoides apigenina,
quercetina, kaempferol, genisteína y epigalocatequina-3-galato a una
27
concentración de 25 u.M y en ése orden disminuyeron la producción de nitritos. La

mirecitina, en este estudio no demostró actividad inhibitoria.
Fig. 2.5: Efecto en la producción de óxido nítrico (NO) en células RAW 264.7
posterior a una incubación con flavonoides activados con lipopolisacáridos (LPS
50 ng/ml).
* Indica diferencias estadísticamente significativas.
Adaptado de Liang Yu etal., (1999).
El grupo de Kim eí al., (2005), investigó los efectos que presentaban

flavonoides como genisteína, genistina, quercetina y kaempferol en macrófagos
RAW 264.7 activados con L P S en la producción de NO. Los autores reportaron
valores de IC o, 13.6, 20.1, 26.81, y 70.3 uM respectivamente. Para confirmar los
5
efectos inhibitorios examinaron la expresión de ¡NOS, y observaron que todos los

flavonoides excepto la genisteína la suprimieron de una manera dosis-
dependiente; a una concentración no citotóxica de 5 uM. A 50 u.M todos los
flavonoides mostraron una total o significativa supresión de iNOS. Los resultados
difieren con los reportados por Olszanecki eí ai, (2002) donde los I C 50 de
kaemperol y quercetina fueron de 5.8 y 92.1 u.M respectivamente;
probablemente la diferencia se debe a las condiciones y los tipos celulares, así
como a las dosis.
28
Otro estudio realizado por Wang er al., (2006), utilizando la misma línea
celular y estimuladas igualmente por LPS, reportó resultados sobre los flavonoides
kaempferol, quercetina, firesetina, mirecitina, los cuales fueron dosis-dependiente
y mostraron una inhibición de 72% y 71% a 10 u.M. En este estudio, la mirecitina y
morina no mostraron efectos. También reportan que a esa concentración no
mostraron citotoxicidad, incluso arriba de los 10 \iM.
Cheon ef al., (2000), reportó que la inhibición en células RAW 264.7

inducidas con L P S por algunos flavonoides se asocian con citotoxicidad en
concentraciones mayores a 50 uM. Pero, las opiniones sobre esto difieren, ya que
algunos trabajos reportan concentraciones mayores a 50 uM y no muestran
citotoxicidad. Por ejemplo, en el estudio realizado por Sheu ef al., (2001),
evaluaron isoflavonas genisteína, daidzeína y gliciteína, para evaluar los efectos
en la producción de NO.
En éste estudio se observó un 67.7 % de reducción en la producción de

nitritos debido al tratamiento de genisteína a una concentración de 100 uM. La
genisteína mostró un IC50 de 50 uM, mientras que la daidzeína y la gliciteína
mostraron un IC50 de 100 uM. La viabilidad celular se mantuvo en 90%, por lo que
la inhibición de la producción de nitritos no fue por muerte celular, sino por el
flavonoide en cuestión. Puede ser que los resultados también impliquen la
estructura, ya que la genisteína a diferencia de las otras dos moléculas tiene un
OH en el carbono 5; lo que le puede contribuir a su mayor actividad.
Wang ef al., (2002) reportaron los efectos de varios flavonoides agliconas y

glicosilados (kaempferol, kaempferol-3-glucosido, kaempferol-3-rutinosido,
quercetina, quercetina-3-glucosído y quercetina-3-rutinósido). Las dosis de
flavonoides utilizadas fueron de 16, 63, 125, 250 y 500 uM. Los resultados
obtenidos indicaron que el kaempferol fue el único flavonoide que presentó
citotoxicidad a concentraciones menores de 500 uM. Por otra parte, la quercetina
inhibió un 56 % la producción de NO. En cuanto a los glicosilados, se observa una
29
menor capacidad inhibitoria, ya que, mientras para la quercetina a 250 uM el

efecto inhibitorio fue de 63%, para la quercetina-3-glucósido y la quercetina-3-
rutinósido fue de 36 y 22%, respectivamente. La diferencia entre flavonoides
glicosilados se observa en cuanto a tipo de azúcar unido a la molécula, ya que se
presentó una mejor inhibición cuando se encontraban unidos a un glucósido que
cuando se encontraban unidos a un rutinosido.
A la fecha, los mecanismos moleculares de los flavonoides en muchos

efectos biológicos no han sido elucidado, pero las propiedades antioxidativas son
consideradas como su mayor acción farmacológica. La estructura química
(posiciones y números de grupos hidroxilos, los dobles enlaces, o el grupo catecol)
pueden influir en el efecto inhibitorio en la producción de NO.
2.5 Justificación
El nopal es una planta que brinda beneficios a la salud, es abundante en

nuestro país y por lo mismo es accesible a diferentes sectores de la población.
Pocos son los estudios que se han realizado para caracterizar los flavonoides
presentes en esta planta. A la fecha, son necesarios mejores métodos que nos
permitan evaluar la cantidad total de flavonoides presentes en la matriz vegetal,
como un paso preliminar para evaluar su biodisponibilidad. Basándonos en los
resultados previamente reportados por Santos-Zea eí al., (2011), en el que
compararon la cantidad de flavonoides totales presentes en nueve extractos de
harina de diferentes especies de nopal mexicano; y siendo Opuntia ficus indica
variedad Jalpa la cual mostró la mayor cantidad de éstos compuestos, el objetivo
general de esta tesis fue la evaluación de la actividad anti-inflamatoria de
flavonoides presentes en harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa
recuperados mediante tratamiento alcalino.
30
2.6 Objetivos
• Probar que con una hidrólisis alcalina se favorece la extracción de

flavonoides en la matriz.
• Obtener el perfil de glicósidos en los extractos.
• Caracterizar los extractos de nopal en cuanto a contenido de compuestos

fenólicos totales y su actividad antioxidante.
• Comparar la actividad anti-inflamatoria de extractos de nopal enriquecidos

en flavonoides con diferentes perfiles de glicosilación usando células de
macrófagos RAW 264.7.
31
Capítulo 3: Materiales y métodos
3.1 Reactivos y materiales
Reactivos
Grado Reactivo
Acetato de etilo, ácido clorhídrico, hexano, hidróxido de sodio, metanol. (DEQ,

Monterrey, N.L., México)
Ácido gálico, reactivo Folin-Ciocalteau's, fluoresceína, fosfato monobásico de

sodio, fosfato dibásico de sodio, sal sódica, 2,2'- Azobis(2-metilpropionamidina),
trolox (-6-hidróxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-ácido carboxílico (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, USA).
Grado HPLC
Agua, metanol (Honeywell, Morristown, N J , USA), ácido fórmico. Estándares:

isorhamnetina, kaempferol y quercetina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
Material biológico
Se utilizó una muestra de harina de nopal mexicano Opuntia ficus indica

variedad Jalpa, cosechada a los 7 meses de edad en marzo del 2011, en el estado
de Nuevo León, en la región conocida como "El Peñuelo".
Para obtener la harina, el nopal fresco se sanitizó en agua clorinada (200-

400 ppm) por un periodo de 10 minutos, se cortó en tiras, y se prosiguió al secado
en charolas durante 8-9 horas., utilizando un secador con aire a 60 °C hasta
decrementar la humedad al 8 %. El nopal deshidratado finalmente se molió en un
molino de martillos. La harina obtenida consistió en un polvo fino, color verdoso
claro, con olor característico a nopal.
32
3.2 Extracción de compuestos
3.2.1 Extracción de compuestos solubles en metanol
La extracción de compuestos fitoquímicos del nopal Opuntia ficus indica

variedad Jalpa se realizó en base al procedimiento reportado en un trabajo previo
(Santos-Zea etal., 2011) con algunas modificaciones. Las muestras de harina (5g)
se mezclaron con 50 mi de metanol al 80%. Se agitaron a 150 rpm (Innova 4000,
New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) durante un periodo de 3 horas.
Al finalizar, se realizó una centrifugación (Centra MP4R, International

Equipment Company, Chattanooga, T N , USA) por 10 minutos a 3000 rpm y se
recuperaron los sobrenadantes los cuales se mantuvieron en congelación a -20°C
hasta su uso y análisis. A éstos extractos se les denominó extractos metanólicos
(E.M).
3.2.2 Optimización del procedimiento de extracción de flavonoides totales
El protocolo que se siguió para la extracción de los flavonoides totales de la

harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa, es en base a una hidrólisis
alcalina reportada anteriormente por Krygier et al., (1982). Dicha extracción fue
empleada para extraer compuestos fenólicos libres, esterificados e insolubles en
cereales y harinas de papa y colza. Por lo que para adaptarlo a los objetivos de la
presente tesis, se realizaron algunas modificaciones.
Se pesaron 5 g de harina y se realizó una hidrólisis alcalina con 50 mi de

hidróxido de sodio (NaOH) 4N, a 25°C, con una agitación de 3000 rpm (Innova
4000, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA), a diferentes tiempos (0, 30, 60,
120 y 150 minutos) con el propósito de analizar la cinética del proceso. Al finalizar
la agitación se realizó una acidificación con ácido clorhídrico (HCI) 6N, hasta un
pH de 5. S e centrifugaron (Centra MP4R, International Equipment Company,
Chattanooga, T N , USA) a 3000 rpm a 25 °C. Posteriormente se recuperó el
sobrenadante y se guardó a -20 °C para estudios posteriores. A estos extractos se
les llamó extractos alcalinos.
33
3.3 Extracciones en fase sólida
3.3.1 Extracción en fase sólida de los extractos metanólicos
A los sobrenadantes que se recuperaron de las extracciones metanólicas

se les realizó por medio de un cartucho Cis-Aq (Grace-Davison, Deerfield, IL,
USA) una extracción en fase sólida. El protocolo seguido se reportó anteriormente
por Santos-Zea er a/., (2011). En la figura 3.1 se resume la metodología que se
siguió y se indican los solventes utilizados.
Fig. 3.1: Procedimiento para enriquecer la fracción de flavonoides de interés

obtenidos en los extractos de harina de nopal, mediante una extracción en fase
sólida.
34
Básicamente el procedimiento inició con un acondicionamiento de la

columna, primeramente se hizo pasar 5 mi de metanol seguido de 5 mi de agua
destilada, ambos grado reactivo. Posteriormente, se pasaron los extractos
metanólicos al 80 % a través de la columna (aproximadamente 50 mi), y se realizó
un lavado con 5 mi de metanol al 40 %, ambas fracciones se desecharon.
La fracción de interés que se recuperó fue la elución de 5 mi de metanol al

100 % grado HPLC. Posteriormente, las fracciones obtenidas se llevaron a
sequedad mediante un rotavapor a una temperatura de 65 °C (aproximadamente
45 min), y finalmente se resuspendieron en 500 ul de metanol grado HPLC. Se
colocaron en un vial y se guardaron a -20 °C para sus posteriores análisis.
3.3.2 Extracción en fase sólida de los extractos alcalinos
Los sobrenadantes recuperados de las hidrólisis alcalinas fueron lavados

con hexano tres veces y de cada uno se desechó la parte lipofílica.
Posteriormente, fueron lavados tres veces con acetato de etilo y se desechó. Las
fracciones finales fueron puestas en relación 1:1 con agua destilada con el fin de
diluir las muestras. El proceso se continuó con una extracción en fase sólida, con
un cartucho C i - A q (Grace-Davison, Deerfield, IL, USA.) de 6 mi, el proceso fue
8
realizado en un colector de vacío conectado a una bomba (GE, Fairfield, EUA) con
una presión de -65 kPa.
El procedimiento seguido se ilustra en la figura 3.1. Las fracciones de

interés fueron las que se obtuvieron de la elución con MeOH al 100%; las cuales
posteriormente se concentraron llevándolas a sequedad en un rotavapor (Buch R-
210, Heathing Bath B-491) a una temperatura de 65°C. S e resuspendieron con
500 uL de MeOH grado HPLC y se guardaron a -20°C para estudios posteriores.
35
3.4. Hidrólisis acida de los extractos
Se realizó una hidrólisis acida a las fracciones enriquecidas en flavonoles

(metanólicos y alcalinos) mediante el método utilizado y descrito por Nuutila et al.,
(2002). Para su realización se tomaron 400 ^1 de los extractos previamente
obtenidos y se agregaron 400 pl de HCI 2.4N, se calentaron durante 25 minutos a
80°C y al finalizar se dejaron equilibrar a 25°C. S e guardaron a -20°C para sus
estudios posteriores.
3.5 Caracterización de los extractos de harina de nopal Opuntia fícus indica

variedad Jalpa
3.5.1 Detección y cuantificación de los compuestos mediante High

Performance/Pressure Liquid Chromatography (HPLC)
Los extractos metanólicos y los obtenidos mediante hidrólisis alcalina y

acida fueron analizados por cromatografía líquida de alta precisión HPLC (Agilent,
Santa Clara, C A , EUA) acoplado a un detector de arreglo de fotodiodos (PDA)
para la detección de los compuestos presentes.
La detección se realizó a 365 nm, y para la identificación de los compuestos

se utilizaron estándares de isorhamnetina, kaempferol y quercetina. La curva de
calibración utilizada partió de una concentración de 5 hasta 100 ppm. Se empleó
la columna Zorbax SB-C18 (Waters Corporation, Milford, MA, EUA) de 3.0x1 OOmm
y 3.5 uní.
El volumen de inyección tanto de las muestras como de los estándares fue

de 2 ui y se manejó un flujo de 0.4 ml/min con una temperatura de columna de
25°C. Los solventes utilizados para la corrida fueron (A) agua con 0.1 % de ácido
fórmico grado HPLC y (B) metanol al 100 % grado HPLC. El gradiente que se
manejó para la separación de compuestos se detalla en la tabla 3.1
36
Tabla 3.1: Gradiente de solventes utilizado para la separación de compuestos

flavonoles mediante HPLC-PDA.
%A (Agua + 0.1% de
Tiempo (min) %B (Metanol)
ácido fórmico)
0 70 30
5 70 30
20 40 60
25 10 90
En total el tiempo de corrida fue de 25 minutos. El flavonoide isorhamnetina
tiene una longitud de onda máxima (X.máx) de 267,375 nm, el kaempferol y la
quercetina de 265,365 y 258,375 nm, respectivamente.
3.5.2 Identificación de los flavonoides glicosilados mediante HPLC-MS-TOF
Los extractos obtenidos de la hidrólisis alcalina a diferentes tiempos fueron

inyectados al HPLC-MS-TOF (Agilent, Santa Clara, CA, USA), con el fin de
determinar el peso molecular de los picos que predominaban y hacer una correcta
identificación en base a sus iones y masa. Las condiciones de separación
empleadas fueron las mismas descritas anteriormente para el análisis realizado en
HPLC sección 3.5.1.
El volumen de inyección fue de 1 u.l y se utilizó una fuente de ionización por

electro-spray en modo positivo (ESI+), temperatura del gas a 350°C, velocidad de
flujo de secado 13 ml/min, presión de 50 psig, voltaje capilar 4000V, voltaje de
fragmentación 70V, Rango m/z 100-1500, y los iones se extrajeron considerando
la masa sobre carga (m/z) de las agliconas, utilizando el software Analyst Q S
(Applied Biosystems Carlsbad, C A , USA).
37
3.5.3 Cuantificación de fenólicos totales en los diferentes extractos de harina

de nopal
Se determinaron los fenólicos totales mediante el método de Folin-Ciocalteu

previamente descrito (Jacobo-Velázquez ef a/., 2011; Swain y Hillis, 1959). Se
utilizó ácido gálico como estándar y la curva de calibración se preparó desde 10
hasta 300 mg/L. Se colocaron 15 pL de los extractos en placas de 96 pozos
transparentes. A cada muestra se agregaron 240 uL de agua destilada para diluir,
seguido de la adición de 15 pL de reactivo Folin-Ciocalteu 0.25N. Se incubaron
durante 3 minutos, y por último se hizo la adición de 30 pL de Na2CÜ3 1N. Se
dejaron incubando por un periodo de 2 horas a temperatura ambiente y protegido
de la luz, para finalmente leerse en el lector de microplatos (Synergy, HT, Bio-Tek,
Winooski, V.M) a 725 nm. El resultado fue expresado como jxg equivalentes de
ácido gálico por gramo de muestra seca. El mismo procedimiento se realizó para
los extractos metanólicos y los extractos posteriores a la hidrólisis acida.
3.5.4 Determinación de la actividad antioxidante [Oxygen Radical

Absorbance Capacity (ORAC)]
La determinación de la capacidad antioxidante para los extractos

metanólicos y los extractos con hidrólisis alcalina y acida se realizó por el ensayo
de O R A C , con algunas modificaciones al método previamente reportado (Wu ef
al., 2004). Se colocaron 25uL de muestra, blanco (PBS) o estándar de Trolox (el
cual fue utilizado para la curva de calibración con concentraciones desde 25-100
uM), en placas oscuras de 96 pozos (Corning, Corning NY, EUA). La placa se
colocó en el lector de microplatos (Synergy HT, Bio-Tek, Winooski, VT, USA). Las
soluciones utilizadas fueron A A P H , la cual se preparó disolviendo 207 mg de
A A P H en 5 mi de P B S para obtener una solución de 153 mM y la solución de
fluoresceína 0.1 pM aforada con P B S a 25 mi. El P B S se preparó con una
solución de fosfatos 75 mM a un pH de 7.4. Los resultados se expresaron como
pmoles equivalentes de Trolox por gramo de muestra seca.
38
3.6 Bioensayo de producción de óxido nítrico (NO) en la línea celular RAW

264.7 de macrófagos de ratón
3.6.1 Mantenimiento de la línea celular
Se evaluó la capacidad antiinflamatoria del contenido de flavonoides

glicosidados de los extractos obtenidos con hidrólisis alcalina, y se utilizó la línea
celular RAW 264.7 (ATCC). Son células de macrófagos murinos que crecen de
manera adherente las cuales en presencia de toxinas pueden producir metabolitos
y proteínas involucradas en la inflamación. En este estudio se empleó L P S
(lipopolisacáridos) para inducir el proceso inflamatorio. Los lipopolisacáridos son
moléculas encontradas en la membrana externa de bacterias Gram negativas. El
LPS utilizado para la activación de las células fue el de Salmonella entérica
serotipo typhimurium (Sigma Aldrich, L7261).
Las células fueron matenidas en Dulbecco's Modified Eagle Médium:

Nutrient Mixture F-12 (D-MEM-F12) (Gibco Invitrogen, Carlsbad, C A , EUA)
complementado con suero bovino fetal al 5% (HyClone, Thermo Scientific,
Waltham, EUA), manteniéndose en incubación a 37°C y 5% de C 0 (NuAir, 2
Plymouth MN, EUA). Posteriormente, para levantar las células se eliminó el medio
lavando con P B S y 1 mi de tripsina al 0.25% (Hyclone, Thermo Scientific,
Waltham, EUA). Se dejó incubar por un periodo de 5 minutos y se continuó con un
raspador celular (Corning, Corning, NY, EUA).
3.6.2 Bioensayo de producción de óxido nítrico (NO)
El óxido nítrico es considerado altamente reactivo, y en presencia de

oxígeno genera nitritos y nitratos, por lo que su cuantificación se basa en estos
productos. El óxido nítrico se cuantificó mediante la prueba de Griess (Promega,
Madison, EUA) y el protocolo seguido fue de acuerdo a lo reportado por Kim eí al.,
(2005) con algunas modificaciones. El procedimiento para la preparación de la
placa con células se observa en la figura 3.2.
39
Figura 3.2: Procedimiento seguido para la preparación de placas con células

RAW 264.7 de macrófagos de ratón en el bioensayo de medición de óxido nítrico
Las muestras se llevaron a una concentración de 1, 10 y 100 ug/ml; tanto

éstas como el L P S fueron diluidos en medio de cultivo D-MEM/F-12
complementado con 5% de suero bovino fetal y 1% de antibiótico (Gibco,
Invitrogen, Carlsbad, C A , EUA). El mismo procedimiento se llevó a cabo para los
estándares utilizados (quercetina e isorhmanetina), ambos añadidos a una
concentración de 20 uM.
Después de la incubación, se trasladaron 100 ul de cada pozo a una placa

nueva. La curva de calibración utilizada se preparó desde 0 uM a 50 uM con una
solución de nitritos que contiene el kit de Griess (Promega, Madison W l , EUA).
Para llevar a cabo la reacción se agregaron 20 ul de la solución de sulfanilamida a
cada pozo de la placa y se dejó incubando a temperatura ambiente y protegida de
la luz durante 10 min. Después se agregaron 20 ul de dihidrocloruro de N-
1 naftiletilendiamina (NED) y se dejó reposando bajo las mismas condiciones.
40
Finalmente se leyó la placa a una longitud de onda de 550 nm en el lector

de microplatos (Bio Tek, Synergy HT KC4, Winooski VT, EUA). Lo que hace el kit
de Griess, es que la sulfanilamida reacciona con los nitritos que se encuentran
presentes en la muestra y cuando se agrega la solución NED, se genera un
azocompuesto. Los resultados se analizaron calculando el porcentaje de
producción relativa de la siguiente manera:
LPS= Lipopolisacáridos
3.6.3 Ensayo de viabilidad celular
Para estos ensayos se siguió el mismo procedimiento que se muestra en la

figura 3.2. Utilizando los 100 restantes de la placa se procedió a la medición de
la viabilidad celular, utilizando 10 |al del kit CelITiter 96@ AQueous One Solution
Cell Proliferation Assay (Promega, Madison Wl, EUA). Se dejó incubando a una
temperatura de 37 °C y 5 % de C O 2 durante 30 minutos. Posteriormente se leyó a
490 nm en el lector de microplatos (Bio Tek, Synergy HT KC4, Winooski VT, EUA).
El kit consta de una sal de tetrazolio, 3-(4,5-diemtiltiazol-2-il)-5-(3-

carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-Tetrazolio (MTS) y un acoplador de
electrones llamado etosulfato de fenazina (PES). La reacción que se lleva a cabo
es la reducción del MTS a formazán debido a la presencia de NAD o NADPH que
se produce por las deshidrogenasas de las células viables. Lo que se cuantifica es
el formazán en base a la absorbancia, lo que indica que el número de células
vivas es proporcional a la absorbancia que presenten.
41
3.7 Análisis estadístico
Todas las mediciones se realizaron al menos por triplicado en cada ensayo,

y los resultados se expresaron como la media de las mediciones ± desviación
estándar. El análisis estadístico se realizó en el paquete J P M versión 5.0 (SAS
Institute Inc. Cary, N C , EUA). Se analizaron los datos por la metodología de
ANOVA, y se realizó la comparación de medias de Tukey, con un nivel de
significancia p<0.05.
42
Capítulo 4: Resultados y discusiones

4.1 Optimización del procedimiento de extracción de flavonoides totales
Los resultados de las pruebas preliminares para observar la liberación y

degradación de los flavonoides se muestran en la figura 4.1. Como se observa en
los cromatogramas de los extractos obtenidos a diferentes tiempos de tratamiento
alcalino en la harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa, el perfil de
flavonoles varió considerablemente. Por una parte los extractos de 30 y 60
minutos de tratamiento alcalino (Figura 4.1 a) presentaron predominancia de los
picos de con tiempo de retención alrededor de los 4 minutos. Por otro lado, los
extractos obtenidos a los 90, 120 y 150 minutos de tratamiento alcalino tuvieron
como componente predominante a un flavonoide con tiempo de retención
alrededor de 7 minutos (Figura 4.1 b)
La extracción alcalina durante un periodo de 60 minutos aumentó hasta 2.5

veces más el área de los picos de flavonoides presentes en el extracto obtenido a
los 30 minutos (Figura 4.1 a). Por otra parte, la extracción con tratamiento alcalino
durante 120 minutos mostró mayores niveles de extracción de flavonoides que a
los 90 minutos de tratamiento alcalino (Figura 4.1 b). Sin embargo, al incrementar
el tiempo de tratamiento alcalino a 150 minutos, dichos compuestos mostraron
picos o concentraciones más pequeñas (Figura 4.1 b).
Debido a que el objetivo de la presente investigación fue probar el efecto

antiinflamatorio de extractos con diferentes perfiles de flavonoides obtenidos de
harina de nopal, se eligieron los tiempos de tratamiento alcalino con perfiles más
contrastantes. Por lo que los tratamientos alcalinos durante 60, 120 y 150 minutos
fueron los elegidos para realizar la caracterización y cuantificación de los
flavonoides presentes antes de probarlos en el bioensayo de inhibición de síntesis
de óxido nítrico.
43
Fig. 4.1: Cromatogramas obtenidos a 365 nm de flavonoles de los extractos de

harina Opuntia ficus indica variedad Jalpa con diferentes tiempos de hidrólisis
alcalina, a) 30 y 60 minutos, b) 90, 120 y 150 minutos.
44
4.2 Identificación de flavonoides presentes en los extractos de harina de

nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa
4.2.1 Análisis de los espectros de absorción de los flavonoides encontrados

en la harina de nopal
Primeramente, se identificaron los flavonoides en su forma de aglicona de

acuerdo a los tiempos de retención y espectros de absorción comparándolos con
los obtenidos por los estándares. En base a estas comparaciones se identificó que
los extractos contuvieron isorhamnetina y kaempferol como lo reportó previamente
Santos-Zea ef al., (2011). Los tiempos de retención que se obtuvieron para los
estándares de isorhamnetina y kaempferol fueron de 23.05 min y 22.38 min,
respectivamente. En la figura 4.2 se muestran los espectros de absorción
obtenidos de los estándares de isorhamnetina y kaempferol, los cuales se
compararon con los espectros de éstos mismos compuestos que se obtuvieron en
el extracto con 60 minutos de tratamiento alcalino de harina Opuntia ficus indica
variedad Jalpa. Las longitudes de onda máxima para los estándares de
isorhamnetina y kaemfperol fueron de 253,370 nm y 263, 366 nm,
respectivamente.
45
Opuntiaflcusindica variedadJalpa"
Fig. 4.2: Espectros de absorción en el rango UV-Vis de: a) estándar de

isorhamnetina, b) isorhamnetina presente en el extracto a los 60 minutos de
tratamiento alcalino c) estándar de kaempferol, d) kaempferol presente en el
extracto a los 60 minutos de tratamiento alcalino.
Se ha reportado, en base a los tiempos de retención obtenidos mediante

HPLC, que la especie Opuntia undulata y Opuntia stricta contienen quercetina,
kaempferol e isorhamnetina (Fernández eí al., 2010). Estos compuestos también
han sido reportados en Opuntia dillenii (Qiu eí al., 2002), Opuntia ficus indica
(Medina eí al., 2011), Opuntia ficus indica variedad Saboten (Lee eí al., 2003) y en
Opuntia ficus indica Mili (Ginestra eí al., 2009). Debido a lo anterior, también se
esperaba la presencia de quercetina en los diferentes extractos, lo cual fue
descartado después de realizar un análisis de espectrometría de masas. Estos
hallazgos claramente demuestran que la especie y variedad de Opuntia influyen
en la presencia o ausencia de éstos fitoquímicos.
46
4.2.2 Análisis de los espectros de masas de los flavonoides encontrados en

los extractos de la harina de nopal
La mayoría de los picos que se obtuvieron de los extractos de harina a

diferentes tiempos de hidrólisis alcalina correspondieron a flavonoides glicosilados,
los cuales fueron comparados con los previamente reportados por Ginestra ef al.,
(2009) y Santos-Zea et al., (2011). La figura 4.3 muestra un ejemplo de la
identificación de un compuesto a través de su correspondiente espectro de masas.
Las señales que se muestran en dicha figura comprueban que el método de
ionización empleado permitió observar la señal de masa/carga (m/z) del flavonoide
770.7 Daltones (Da), su adición con sodio (792.7 Da), los fragmentos debido a la
pérdida de azúcares (624.8 y 478.8 Da) y finalmente la correspondiente aglicona
(316.8 Da).
Fig. 4.3: Espectro de masas de Isorhamnetin-glucosil-ramnosil-ramnósido

obtenido mediante LC-MS-TOF
47
En la tabla 4.1 se presenta un listado de las características de los

flavonoides encontrados en los extractos, haciendo referencia a los previamente
reportados por Ginestra eí a/., (2009) y Santos-Zea et al., (2011). El extracto con
60 minutos de tratamiento alcalino fue el que mostró mayor diversidad de
flavonoides como se puede observar en el cromatograma de la figura 4.4 En dicho
cromatograma se observó el orden de elución y los tiempos de retención de todos
los glicósidos de isorhamnetina (IG1-7) y kaempferol (KG1-4) reportados en la
tabla 4.1, así como también las agliconas de estos flavonoles (K e I).
48
Tabla 4.1 Características espectrales de los flavonoides identificados en el extracto
obtenido con tratamiento alcalino durante 60 minutos
TIPO DE GLICÓSIDO AGUCONA Abrev. UV/VISXmáx. m/z fragmentos REF.
287 [K + H*]
- Kaempferol K 265,364
309 [K + Na*]
1,2
317 [1 + H*]
- Isorhamnetina 1 253,369
339 [1 + Na*]
1,2
317 [1 + H*]
Glucosil (GLU) - 479 [(1 + GLU) + H*]
ramnosil (RHA) - 625 [(l + GLU + RHA) + H*]
Isorhamnetina IG1 254,354 1
ramnósido 771 [{1 + GLU + RHA + RHA) + H*]
793 [(1 + GLU + RHA + RHA) +
Na*]
317 [1 + H*]
479 [(1 + GLU) + H*]
Glucosil-ramnosil-
625 [(1 + GLU + RHA) + H*]
pentósido (PEN) Isorhamnetina IG2 253,354 1,2
757 [(1 + GLU + RHA + PEN ) + H*]
779 [(1 + GLU + RHA + PEN ) +
Na*J
1 hexosa +1 317 [1 + H*]
metilpentosa Isorhamnetina IG3 253,354 779 [(1 + GLU + MetilPen) + PEN 2
(Metilpen) +1 pentosa + Na*]
317 [1 + H*]
Glucosil-pentósido Isorhamnetina IG4 254,354 479 [{1 + GLU) + H*] 1
633 [(1 + GLU + PEN) + Na*]
317 [1 + H*]
479 [(1 + GLU) + H*]
Glucosil-ramnósido Isorhamnetina IG5 253,354 2
625 [(1 + GLU + RHA) + H*]
647 [(1 + GLU + RHA) + Na*]
317 [1 + H*]
1 hexosa + 1 pentosa Isorhamnetina IG6 251,363 339 [1 + Na*] 2
633 [(1 + GLU + PEN) + Na*]
317 [1 + H*]
479 [(1 + GLU) + H*]
Glucosil-ramnosil + 625 [(1 + GLU + RHA) + H*]
Isorhamnetina IG7 254,368 NIP
hexosa 647 [(1 + GLU + RHA) + Na*]
829 [(1 + GLU + RHA + HEX) +
Na*]
287 [K + H*]
2 Hexosa + 2 Metil-
Kaempferol KG1 255,356 449 l(K + GLU) + H*] NIP
pentosa
763 [(K + GLU) + PEN + Na*]
287 [K + H*]
449 [(K + GLU) + H*]
Glucosil-ramnsoil- 595 [(K + GLU + RHA) + H*]
Kaempferol KG2 254,355 NIP
ramnosido 741 [(K + GLU + RHA) + RHA]
763 [(K + GLU + RHA) + RHA +
Na*]
287 [K + H*]
449 [(K + GLU) + H*]
595 [(K + GLU + RHA) + H*]
617 [(K + GLU + RHA) + Na*]
Glucosil-ramnosil-
Kaempferol KG3 265,350 741 [(K + GLU + RHA) + RHA] NIP
ramnosa+hexosa
763 [(K + GLU + RHA) + RHA +
Na*]
924 [(K + GLU + RHA) + RHA +
HEX + Na*]
287 [K + H*]
449 [(K + GLU) + H*]
Glucosil-ramnosido Kaempferol KG4 262,350 2
595 [(K + GLU + RHA) + H*]
617 [(K + GLU + RHA) + Na*]
1. Ginestra e í ai, (2009); 2. Santos-Zea et ai, (2010)

No identificado previamente (NIP) 49
Opuntiaflcusindica variedad Jalpa"
Fig. 4.4: Cromatograma típico obtenido mediante HPLC a 365nm de los diversos
flavonoides presentes en una muestra de harina de nopal Opuntia ficus indica
variedad Jalpa hidrolizada con álcali por 60 minutos.
El tratamiento alcalino que recibieron las muestras permitió la recuperación

de cuatro flavonoles que se encuentran en la harina de nopal Opuntia ficus indica
variedad Jalpa que no habían sido reportados en trabajos anteriores. De los
cuales, tres de ellos corresponden a glicósidos de kaempferol denominados K G 1 ,
KG2 y KG3, y uno, que corresponde a un glicósido de isorhamnetina denominado
IG7 (Tabla 4.1). Como se puede observar en el cromatograma de la figura 4.5
para el extracto metanólico no se observaron picos para los mencionados
flavonoles. Por lo tanto, se comprobó que el tratamiento alcalino para la extracción
de flavonoides permitió recuperar aquellos que se encontraban unidos a la pared
celular.
50
Fig. 4.5: Cromatograma obtenido mediante HPLC a 365nm de los diversos

flavonoides presentes en una muestra de harina de nopal Opuntia ficus indica
variedad Jalpa obtenidos a partir de una extracción metanólica al 80 %.
Los flavonoides glicosilados que fueron identificados en los extractos,

contuvieron di, tri y tetrasacáridos, lo que los convierte en moléculas de mayor
peso molecular e hidrosolubilidad. Galati er al., (2003), menciona que Opuntia
ficus indica es una buena fuente de glicósidos, especialmente de triglicósidos de
isorhamnetina, concordando con los resultados del presente trabajo. Donde los
conjugados de flavonoles que se identificaron correspondieron a triglicósidos (IG1,
IG2, IG3 IG7 y KG2), aunque también se obtuvo la presencia de tetraglicósidos de
kaempferol (KG1 y KG3).
51
4.3 Cuantificación de flavonoides presentes en los extractos de harina de

nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa
4.3.1 Cuantificación de flavonoides presentes en los extractos alcalinos y

metanólicos
El flavonoide que estuvo presente en mayor proporción en los extractos de

harina de nopal a diferentes tiempos de tratamiento alcalino fue el flavonol de
isorhamnetina con sus diferentes grados de glicosilación, y en menor proporción el
kaempferol. Estos resultados fueron sustentados con los previamente reportados
para diferentes variedades de Opuntia. Por ejemplo, Cai etal., (2010) lo reportó en
Opuntia ficus indica variedad Milpa alta, Muhammad eí al., (2006) en Opuntia ficus
indica variedad Saboten, Ginestra eí al., (2009) en Opuntia ficus indica Mili y
Santos-Zea eí al., (2011) lo reportó para Opuntia ficus indica variedad Jalpa.
Los compuestos IG1, IG2, IG4, e IG5 fueron los que presentaron mayor
concentración en los diferentes extractos (Tabla 4.2). En términos generales, los
derivados de isorhamnetina constituyeron el 95% del total de flavonoides
presentes; el resto correspondió a los derivados de kaempferol. Tan sólo
comparando la concentración del compuesto IG1 obtenido por extracción
metanólica contra el obtenido a los 60 min de tratamiento alcalino, esta equivale
sólo a un 18% del recuperado en el extracto de 60 minutos. El extracto metanólico
liberó los compuestos fenólicos libres, mientras que la extracción con tratamiento
alcalino permitió la obtención de los compuestos ligados a la pared celular. Al
hacer una comparación entre la cantidad de flavonoides obtenidos mediante el
extracto metanólico y los extractos con tratamiento alcalino, los porcentajes
indicaron que el 77.7, 82.5, 79.7 y 72.7 % del total de los flavonoides presentes en
los extractos alcalinos correspondió a flavonoides ligados. Este efecto ya había
sido reportado en cereales previamente por Adom y Liu, (2002). En maíz, el
porcentaje de flavonoides en forma ligada correspondió a un 90 % del total y en
trigo en un 93 %.
52
"Evaluación de la actividad antiinflamatoria deflavonoidesrecuperados con un tratamiento alcalino presentes en
Tabla 4.2: Concentración de flavonoides de Opuntia ficus indica variedad Jalpa en

un extracto metanólico y en extractos obtenidos a diferentes tiempos con
tratamiento alcalino.
Concentración (umol de flavonoide/lOOg muestra)

Flavonoide Extracto EXTRACTOS ALCALINOS
metanólico 0 min 60 min 120 min 150 min
a
KG1 ND 19.21 +0.81 b
26.46 + 1.35 a
27.81 +1.37 14.82 + 0 . 7 8 °
b
KG2 ND 20.37 +1.65 a
17.82 +_2.32 a b
17.09 + 1 . 4 8 ab
15.22 +0.73
bc
KG3 11.31+ 0.20 c
18.59 + 0 . 8 3 ab
22.41 + 0.69 a
16.21 + 4.30 6 0
16.36 + 2 . 1 1
b
KG4 20.80 + 0.65 c
34.07+1.04 b
43.96 +4.22 a
40.76 + 2.59 a b
34.67 + 2.24
3
K 40.75 +0.52 a
37.28+ 2 . 9 6 3
38.26 + 0 . 9 1 a
36.93+ 3.69 3
40.60+ 5.64
TOTAL
72.86 129.52 148.91 138.8 121.67
K+GLC
a b
IG1 181.76 + 6.37° 788.85 + 60.29 a
933.729 +111.39 a
856.24 +90.55 379.27 +51.13
b
IG2 139.99 + 2.46 a
711.61+ 28.55 b
890.13 + 38.95 a
777.01+ 32.92 523.73 + 70.81°
d
IG3 29.45 + 1.16 e
110.49 + 3.86" 139.90 +7.03 a
73.99 + 5 . 2 1 87.00 + 3 . 7 9 °
b
IG4 83.68+1.67 d
412.70 +9.86 b
580.86 + 29.66 a
463.39 +29.51 352.49 + 1 6 . 8 4 °
b
IG5 111.75 + 2.75° 423.26 + 6.72 b
600.80+ 63.81 a
443.83+52.99 492.03 + 24.45 b
b
IG6 ND 29.55 +1.53 b
41.31 + 0.90 a
32.74 +3.63 41.27+ 4.37 3
b
IG7 ND 26.59+1.08 b
44.88 + 5.98 3
33.52 + 1.60 32.04 +3.14 b
3
1 ND 146.86 +13.57 c
169.45 +11.50 ^ 229.45 + 15.25 205.06 + 1 8 . 1 2 ab
TOTAL
546.63 2649.91 3401.05 2910.17 2112.89
l+GLC
TOTAL 619.49 2779.43 3549.96 3048.97 2234.56

Las medias con diferentes letras por renglón indican diferencias estadísticamente
significativas. ND= No detectable
La figura 4.6 muestra el comportamiento de la concentración total de

flavonoles que siguieron los extractos a los diferentes tiempos de tratamiento
alcalino, comparados con el obtenido en un extracto metanólico. En ésta figura se
puede observar que la concentración de flavonoides a los 60 min de tratamiento
alcalino fue de casi cinco veces más que la que mostró el extracto metanólico. La
mayor concentración de flavonoides se presentó a los 60 min de tratamiento
alcalino, seguido de la muestra a los 120 min, la cual mostró un 14 % menos. En lo
53
que respecta al extracto de 150 min, se notó una considerable disminución en la

concentración total de flavonoides, aproximadamente un 36 % menos que la que
se obtuvo en el extracto de 60 min. Lo anterior pudo ser como consecuencia de la
degradación de algunos compuestos complejos, ocasionada por someter la
muestra al tratamiento alcalino durante un periodo de tiempo mayor. S e ha
reportado que los tiempos prolongados de tratamiento alcalino pueden provocar
una degradación de los compuestos por la apertura del anillo A (Laks y
Hemingway, 1987).
Fig. 4.6: Contenido de flavonoides totales (cuantificados según su correspondiente

aglicona) a diferentes tiempos de hidrólisis alcalina en harina de Opuntia ficus
indica variedad Jalpa, comparados con un extracto metanólico (E.M). Letras
distintas indican diferencias estadísticamente significativas.
De acuerdo a los resultados que se obtuvieron, se cumplió la primera

hipótesis de que el tratamiento alcalino mejoró la obtención de flavonoides
glicosilados. Se ha reportado un efecto positivo en la recuperación de flavonoides
con tratamiento alcalino en diversas matrices. White ef al., (2010) reportaron la
cantidad de procianidinas (flavanoles) presentes en extractos de la pulpa de
arándanos. En los extractos alcalinos se obtuvo un 76 % de procianidinas,
54
mientras que con los extractos obtenidos a partir de acetona:agua:ácido acético se

obtuvo un 24 %. Por lo tanto, el mecanismo por el cual el hidróxido de sodio
permite la extracción de los compuestos puede ser debido a su capacidad que
tiene de solubilizar material de la pared celular, por ejemplo, la hemicelulosa, lo
cual puede conducir a la liberación de los compuestos atrapados o esterificados a
la pared celular (Doner y Hicks, 1997).
4.3.2 Cuantifícación de flavonoides presentes en los extractos de harina de

nopal, posterior a una hidrólisis acida
Los extractos de harina mostraron un aumento de las agliconas kaempferol

e isorhamnetina posterior a la hidrólisis acida. Al igual que antes de la hidrólisis, la
isorhamnetina fue el flavonol predominante representando aproximadamente un
93 % del total (Tabla 4.3). Santos-Zea er al., (2011) reportó 119.8 ug/g de
kaempferol y 726.2 pg/g de isorhamnetina. En el presente estudio la concentración
de kaempferol fue 3 veces mayor que lo previamente reportado, mientras que la
isorhamnetina aglicona se vio disminuida un 16 % (Tabla 4.3). Esto indica que la
fecha de recolección influyó en la concentración de flavonoles.
Con las condiciones que se emplearon para la hidrólisis acida en el

presente estudio, no todos los glicósidos lograron convertirse en agliconas (Tabla
4.3). Los flavonoles glicosilados que siguieron apareciendo posterior al tratamiento
ácido, fueron IG5 e IG7, los cuales son flavonoides con di y trisacáridos. Santos-
Zea er al., (2011) reportó las concentraciones de algunos flavonoides glicosilados
que también siguieron presentes en los extractos después de la hidrólisis acida,
los cuales fueron K G 1 , IG5 e IG6. La concentración de IG5 obtenida mediante el
presente estudio fue 97.96 % veces mayor que lo reportado por Santos-Zea et al.,
(2011), lo cual implica que la concentración real de aglicona de isorhamnetina
debe ser mayor que se observa en la tabla 4.3. Las diferencias entre los
resultados a pesar de tratarse de la misma variedad de Opuntia, pudieron ser
principalmente debido a las diferencias entre los tiempos de cosecha, condiciones
empleadas y edad de los cladodios utilizados para la obtención de la harina.
55
La mayor cantidad de flavonoides (3398 umol/100g) se obtuvo con el

extracto de 120 minutos (Fig. 4.7), a pesar de que a éste tiempo no se presentó la
mayor concentración de flavonoides en los extractos sin hidrolizar (Fig. 4.6). Esto
ocurrió porque en los extractos alcalinos pudieran encontrarse compuestos que
por su nivel de glicosilación no fueron detectados ya que los coeficientes de
extinción se ven disminuidos conforme más cantidad de azúcares se encuentren
unidas a la molécula.
En el extracto de 60 minutos la concentración de flavonoles correspondió a

sólo un 64.14 % de lo encontrado antes de la hidrólisis acida. Probablemente esta
disminución se debió a las diferentes concentraciones y tipo de flavonoides
presentes. S e ha demostrado que a mayores tiempos de tratamiento con ácido
(superiores a 2 horas) se produce una rápida degradación de quercetina lo cual
coincide con Hertog ef al., (1992) quienes analizaron cebollas. Estos autores
también reportaron que la quercetina y mirecitina recuperados de arándanos
comienzan a perderse a tiempos mayores de 30 minutos, mientras que el
kaempferol se pierde cuando el tratamiento se realiza por más de cuatro horas.
Por lo que los tiempos de hidrólisis y degradación están influenciados con el tipo
de flavonoide y la matriz de la que están asociados.
56
Opuntiaflcusindica variedad Jalpa"
Tabla 4.3: Concentración de flavonoides presentes en harina de nopal Opuntia

ficus indica variedad Jalpa posterior a una hidrólisis acida que recibieron los
extractos metanólicos y alcalinos obtenidos a diferentes tiempos.
Concentración (u.mol de flavonoide/lOOg muestra)
Flavonoide
Extractos EXTRACTOS Á C I D O S
Metanólicos 0 min 60 min 120 min 150 min
K 350.35 + 1.75 a
94.01 + 6.52" 137.28 + 6 . 9 2 ° 316.27 +8.69 a
295.80 + 8.93"
TOTAL K 350.35 94.01 137.28 316.27 295.80
IG1 165.49 +6.50 a

ND ND ND ND
a
IG5 570.22 + 30.14 71.25 + 5 . 4 ° 85.23 + 7 . 5 7 ° 126.78 +5.75 b
113.21 + 3.32"
IG7 ND 25.82 +_1.74 ° 45.01 + 5 . 8 1 b

88.17 + 4.45 a
87.95 +2.52 a
b b
1 609.13 + 8.17° 1209.17 + 19.07 ° 2008.91 + 121.18 3183.07 +24.75 a
2032.39 + 62.37"
TOTAL
1344.8 1306.24 2139.15 3398.02 2233.55
l+Glc
TOTAL 1695.15 1400.25 2276.43 3714.29 2529.35
Las medias con diferentes letras por renglón indican diferencias estadísticamente
significativas. ND= No detectado.
Santos-Zea, (2010) reportó los tiempos óptimos de hidrólisis acida de los

flavonoides de kaempferol e isorhamnetina para dos diferentes variedades de
Opuntia (Opuntia ficus indica variedad Jalpa y Opuntia robusta variedad Gavia).
En ambas variedades la exposición a tiempos prolongados de hidrólisis acida
significó decremento de la presencia de compuestos debido a degradación.
57
Fig. 4.7: Contenido de flavonoides totales posterior a una hidrólisis acida de los
extractos con diferentes tiempos de tratamiento alcalino de harina de Opuntia ficus
indica variedad Jalpa. Comparados con la hidrólisis acida de un extracto
metanólico (E.M). Letras distintas indican diferencias estadísticamente
significativas.
4.4 Cuantificación de fenólicos y actividad antioxidante en los extractos

obtenidos de harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa
4.4.1 Cuantificación de fenólicos
En la tabla 4.4 se concentran los resultados obtenidos de fenólicos totales

en el extracto metanólico, en los extractos alcalinos a diferentes tiempos (0,
60,120 y 150 min) y su posterior hidrólisis acida. Al comparar los resultados de los
extractos alcalinos, el extracto de 60 min tuvo la mayor cantidad de fenólicos
(16.98 + 1.14 pgEAG/g), igual que lo que se observó para flavonoides. El
resultado fue mayor que el que mostró el extracto metanólico (9.16 + 0.95
pgEAG/g). Comparando los resultados se puede decir que la extracción de
fenólicos se mejoró con el tratamiento alcalino.
58
"Evaluación de la actividad antiinflamatoria deflavonoidesrecuperados con un tratamiento alcalino presentes en
Los resultados posteriores a la hidrólisis acida que recibieron los extractos

alcalinos, mostraron que la cantidad de fenólicos se incrementó en todos los
extractos. En general, los valores obtenidos posterior a la hidrólisis acida
mostraron incrementos entre 20.45 y 109.95 % en el contenido de fenólicos de las
fracciones ricas en flavonoides. El menor incremento fue en el extracto de 0
minutos de tratamiento alcalino y el mayor en el de 120 minutos (Tabla 4.4)
Tabla 4.4: Contenido de fenólicos totales y actividad antioxidante de los extractos

Opuntia ficus indica variedad Jalpa a diferentes tiempos de hidrólisis alcalina y su
posterior hidrólisis acida comparados con un extracto metanólico y su posterior
hidrólisis acida.
FOLIN ORAC
Muestra Extractos Extractos % Extractos Extractos
con H. con H. con H. con H.
Alcalina" Acida" Alcalina" Acida"
0 min c
12.81 + 1.59 15.43+ 1.90° (20.45) 4.40 +0.11 d
1.07 + 0.06"
60 min 16.98+1.14 a
27.90+1.55 b
(64.31) 8.27 + 0.25 b
1.29 + 0.13"
120 min 13.07 tise?* 29.65+2.12 ab

(126.24) 12.21 + 0.67 a
1.31+0.19"
150 min 16.37 +1.23 ab

34.37 + 0.98 a
(109.95) 3.75 + 0.13 d
1.89 +0.09 a
SIN H. SIN H.
Alcalina Alcalina
EM 9.16 + 0.95 d
15.09 + 2.13 C
(64.73) 5.94 +0.17 C
1.46 + 0.22"
*Las medias con diferentes letras dentro de cada columna indican diferencias
estadísticamente significativas. EM= Extracto metanólico.
a= Resultados expresados como microgramos equivalentes de ácido gálico
recuperados en la fracción enriquecida en flavonoides por gramo de muestra seca.
P= Resultados expresados como micromoles equivalentes de trolox por gramo de
muestra.
% = Indica el porcentaje de aumento que mostró el contenido de fenólicos totales
posterior a la hidrólisis acida al compararse con los obtenidos en los extractos con
tratamiento alcalino.
59
Los resultados se vieron incrementados ya que en sus formas agliconas

han demostrado que tienen mayor capacidad de reaccionar con el reactivo de
Folin (Everette ef a/., 2010). La reacción que se lleva a cabo mediante el método
de Folin es una transferencia de un electrón al complejo Mo (VI), para reducirlo a
Mo (V) (Everette et al, 2010), presumiblemente las moléculas con azúcares
ligadas, tienen mayor dificultad de transferir el electrón y por lo tanto tienen menor
reacción con el reactivo. Es importante señalar también que la cuantificación de
los fenólicos se llevó a cabo en los extractos después de pasarlos por columna
C18. Y a que al compararlos con otros que han sido reportados, estos se
encontraron con cantidades menores. Por ejemplo, Santos-Zea et al., (2011), para
esta misma variedad reportó 318ug EAG/g de muestra, pero el ensayo fue
realizado en un extracto metanólico crudo, sin realizar ningún proceso de
fraccionamiento o purificación.
Otros trabajos que han reportado fenólicos totales en diferentes especies de

Opuntia spp. muestran resultados muy variados entre ellos, principalmente por los
métodos de extracción utilizados, así como las variedades empleadas. Por
ejemplo, Bensadón ef al., (2010) reportaron para Opuntia ficus indica variedad
Milpa Alta 2690 ugEAG/g, la primera extracción fue con metanol-agua (50:50)
seguida de una segunda extracción con acetona-agua (70:30). Por otro lado,
Medina ef al., (2011), reportaron para cladodios de Opuntia ficus indica valores de
17.34 gEAG/kg mientras que Fernández ef al., (2010) reportó para frutos O.
undulata 1646 pgEAG/g de muestra en base seca y para Opuntia ficus indica
variedad Saboten 2044 pgEAG/g, Lee ef al., (2002) reportó para un extracto de
Opuntia ficus indica 180 mgEAG/g de muestra en base seca y Sergeira (2009)
reportó valores de fenólicos libres de 600 pgEAG/g.
Las diferencias entre los resultados obtenidos en la presente investigación

con los reportes anteriores, varió principalmente por el método de extracción, y por
el hecho de que la cuantificación fue realizada en un extracto rico en flavonoides,
contrario a lo que realizaron los anteriores autores, que utilizaron un extracto
crudo. Se han reportado otras moléculas que pueden reaccionar con el reactivo de
60
Folin aparte de los compuestos fenólicos, entre ellas, proteínas y vitaminas, lo que
pudo generar valores más altos en los extractos crudos (Everette er al., 2010). Sin
embargo para fenólicos, el único compuesto que mostró correlación fue IG6 (p <
0.05)
4.4.2 Determinación de la actividad antioxidante (ORAC)
El extracto hidrolizado por 120 minutos mostró la mayor actividad

antioxidante (12.21 + 0.67 umol ET/g de muestra), seguido por el de 60 minutos
(8.27 + 0.25 umol ET/g) (Tabla 4.4). A estos dos tiempos de hidrólisis se observó
mayor actividad en comparación con la contraparte de 0 minutos (4.40 + 0.25 umol
ET/g) y el extracto metanólico, ya que éste último mostró aproximadamente el 50
% de actividad antioxidante que mostró el extracto de 60 minutos de tratamiento
alcalino. Los flavonoles que se obtuvieron mediante el tratamiento alcalino fueron
los ligados, mientras que en el extracto metanólico se obtuvieron los libres. Por lo
tanto, se puede concluir que la actividad antioxidante se vio influenciada por el
tratamiento alcalino y el tiempo de hidrólisis.
Adom y Liu (2002), reportaron valores de actividad antioxidante de maíz,

trigo, avena y arroz. Los valores reportados indicaron que la actividad antioxidante
debido a los fenólicos libres varió en un rango de 10 al 42 %, mientras que el
rango de aportación por parte de los flavonoides ligados fue de aproximadamente
58 al 90 %, aproximadamente. Por su parte, Madhujith y Shahidi (2009),
reportaron la actividad antioxidante de los fenólicos libres y ligados obtenidos de
fracciones de cebada, los cuales indicaron que la actividad antioxidante debido a
los fenólicos libres varió en un rango de 24 al 27 %, mientras que el rango de
aportación por parte de los flavonoides ligados fue de 72 al 75 %. Gutiérrez-Uribe
et al., (2010), reportaron los valores de la actividad antioxidante de diferentes
variedades de maíz en grano, masa y nejayote. Éste último mostró los mayores
valores de actividad antioxidante, de los cuales obtuvieron para fenólicos libres un
rango de 3 al 5 %, mientras que de la fracción de los ligados de un 94 al 96 %. Los
porcentajes del presente estudio fueron mayores por la fracción de los flavonoides
61
Opuntía ficus indica variedad Jalpa"
ligados (53 %), mientras que de los libres un 47 %. Con ello, se comprueba que un
tratamiento alcalino permite obtener mayor actividad antioxidante debido a la
presencia de los fenólicos ligados.
Los resultados de la actividad antioxidante posterior a la hidrólisis acida se

vieron disminuidos, contrario a lo que sucedió en el contenido de fenólicos totales.
En éste caso, la mayor actividad antioxidante se alcanzó a los 150 minutos con
1.89 + 0.09 nmol ET/g de muestra. Kahkónen et al., (1999) indicó que no existe
una correlación entre la cantidad de fenólicos totales y la actividad antioxidante,
como se observó en el presente trabajo. La disminución pudo ser como una
consecuencia del tiempo y concentración del ácido utilizados. Lo que pudo
generar un rompimiento de la molécula aglicona que a su vez haya ocasionado
una separación del anillo C del flavonoide (el cual contiene dos grupos hidroxilo), y
por lo tanto se disminuyó la actividad antioxidante.
Es importante señalar que en la presente investigación la cuantificación de

la actividad antioxidante se llevó a cabo en las fracciones enriquecidas con
flavonoles y no en un extracto completo, por lo que se esperaban valores menores
de actividad antioxidante. Por ejemplo, Kuti et al., (2004) reportaron para extractos
de tuna O. ficus indica 26.3 |amolTE/g de muestra, para tuna O. streptacantha 25.2
(imolET/g y para tuna O. stricta 15.8 nmolET/g. Mientras que Corral et al., (2008)
reportaron para extractos de papaya, aguacate, mango, y tuna 50.2, 21.82, 28.72
y 38.52 nmolET/g de muestra, respectivamente, y para Opuntia ficus indica 770.4
^molET/g de muestra.
Al realizar una correlación de cada flavonoide presente en los diferentes

extractos, para ver cuál de ellos aportó más a la actividad antioxidante y utilizando
el criterio reportado por Jacobo-Velázquez y Cisneros-Zeballos (2009) en el cual
2
reportan que R debe ser >0.75 para poder considerar que existe una correlación
significativa, sólo se encontró correlación con el kaempferol-2 hexosa+2 metil-
2
pentosa (KG1) (R = 0.7177, p < 0.05). Posterior a la hidrólisis acida que recibieron
62
los extractos, el flavonoide que contribuyó mayormente en la actividad antioxidante

2
fue la isorhamnetina (R = 0.6239, p < 0.05).
Jacobo-Velázquez y Cisneros-Zeballos (2009), mencionan que la actividad

de un compuesto está relacionado con los grupos hidroxilos disponibles, y que
además, la manera en que estos compuestos pueden neutralizar radicales libres
puede depender de las concentraciones presentes en la muestra. En base a lo
anterior, el hecho de que isorhamnetina haya mostrado mayor relación en la
actividad antioxidante pudo deberse a que su concentración es mayor en los
extractos que la del kaempferol, y no por el número de grupos hidroxilos.
4.5 Evaluación in vitro de la capacidad antiinflamatoria de los compuestos

presentes en los extractos alcalinos de la harina de nopal Opuntia ficus
indica variedad Jalpa
4.5.1 Viabilidad celular
El tratamiento de 120 min a 0.4 pg/ml y 0.04 pg/ml fomentó el crecimiento

de las células de macrófago mientras que el tratamiento de 0 min fue el único
ligeramente citotóxico ya que redujo a 80% la viabilidad cuando se probó a una
concentración de 0.4 pg/ml (Figura 4.8). Éste mismo tratamiento, a una
concentración de 0.04 pg/ml presentó una viabilidad celular del 85%. El resto de
los tratamientos alcalinos a las diferentes concentraciones no mostraron
citotoxicidad, y se mantuvieron en un rango de 90 a 105 % de viabilidad celular.
Estos resultados indicaron que los efectos en la producción de óxido nítrico por
parte de los extractos probados fueron como consecuencia de los compuestos
flavonoides presentes y no debido a una muerte celular.
63
Fig. 4.8: Porcentaje de viabilidad en células RAW 264.7 expuestas a diferentes

concentraciones de extractos obtenidos de harina de nopal Opuntia ficus indica
variedad Jalpa. Los extractos fueron previamente obtenidos de la matriz mediante
un tratamiento alcalino a diferentes tiempos.
4.5.2 Bioensayo de producción de óxido nítrico
El estándar de isorhamnetina disminuyó la producción de óxido nítrico en un

43.2 %, mientras que la quercetina la disminuyó en un 77 % (Figura 4.9). Estos
resultados obtenidos de los estándares son similares a los reportados en el trabajo
de Wang et al., (2006), en el que compararon varios flavonoides en formas
agliconas. Los resultados que reportaron estos autores indicaron que la quercetina
a 10 uM (3 ug/ml) inhibió 71 % la producción de óxido nítrico resultando mejor
que el kaempferol y mirecitina.
64
No se encontraron reportes científicos de isorhamnetina en cuanto a la

inhibición de la producción de óxido nítrico, pero con los resultados obtenidos en la
presente investigación se observó que la quercetina propició una mayor inhibición
de óxido nítrico que el flavonoide isorhamnetina. Esto probablemente debido a las
diferencias estructurales que poseen y a la metilación de uno de los hidroxilos en
la isorhamnetina.
Fig. 4.9: Porcentaje de inhibición de la producción de óxido nítrico en células RAW

264.7 con flavonoles puros a 20pM y con extractos alcalinos de Opuntia fícus
indica variedad Jalpa obtenidos a diferentes tiempos y en 3 concentraciones
distintas.
Letras distintas indican diferencias estadísticamente significativas.
En cuanto a los resultados obtenidos con los extractos a diferentes tiempos

de hidrólisis alcalina, se observó que a una concentración de 0.4 pg/ml a 0, 60 y
120 minutos se mostró mayor inhibición en la producción de óxido nítrico que el
que mostró la isorhamnetina aglicona. La inhibición que mostraron los extractos
fueron de 57 %, 67 % y 51 %, respectivamente. Por lo tanto, al comparar éstos
porcentajes con el 43.26 % de inhibición que mostró el estándar de isorhamnetina,
65
"Evaluación de ia actividad antiinflamatoria de flavonoides recuperados con un tratamiento alcalino presentes en
se demostró que el tratamiento con los extractos de harina de nopal Opuntia ficus
indica variedad Jalpa que recibieron tratamiento alcalino por 0, 60 y 120 minutos a
una concentración de 0.4 ug/ml fue efectivo.
De los tres extractos que presentaron inhibición en la producción del óxido

nítrico el de 60 min fue el mejor (67 %), y se puede comparar con el 67.7 % de
inhibición en la producción de nitritos por un tratamiento de genisteína 100 \xM
(que equivale a 27 ug/ml) reportado por Sheu eí al., (2001), y con los reportados
para cilantro (62 %), apio (63 %), espinaca (63 %), papa (68 %) y arroz (66 %),
presentes en extractos a una concentración de 200 ug/ml, reportados por Jung et
al., (2006).
En cuanto a la concentración de 0.04 Lig/ml, sólo el extracto de 60min logró

inhibir un 55.7 % la producción de óxido nítrico, el resto de extractos a ésta
concentración produjeron una menor inhibición que el estándar de isorhamentina.
Al hacer una comparación de las inhibiciones que produjo el extracto de 60 min de
tratamiento alcalino a dos concentraciones (0.4 y 0.04 ug/ml), se pudo observar
que la inhibición se disminuye un 11 % entre una concentración y otra,
respectivamente, por lo tanto, el tratamiento fue dosis-dependiente. En cuanto a la
potencia que mostró el extracto de 60 minutos, éste resultó 5800 veces más
potente que la isorhamnetina aglicona.
En el trabajo realizado por Wang y Mazza, (2002), se reportó el efecto en la

producción de NO que produjeron los flavonoides kaempferol y quercetina
agliconas, así como el efecto que produjeron éstos mismos flavonoides cuando se
encontraban en formas glicosiladas con rutinosa y cuando se encontraban unidos
a una glucosa. Las concentraciones que utilizaron los autores fueron de 16, 31,
63, 125, 250 y 500 uM. Sus resultados mostraron que el kaempferol a 31 uM
(equivale a 8.9 ug/ml), disminuyó la producción de óxido nítrico en un 44%, pero
en el resto de las concentraciones mostró una citotoxicidad significativa. En cuanto
a sus glicósidos, se observó que la inhibición de NO fue menor; ya que el
kaempferol-3-glucósido, a una concentración de 500 uM (233.5 ug/ml) produjo una
66
inhibición de un 16 %, mientras que el kaempferol-3-rutinósido inhibió un 20 %

(Wang y Mazza, 2002). La quercetina mostró valores mayores en cuanto a
inhibición de óxido nítrico en las células, ya que en forma aglicona inhibió un 62 %,
mientras que la quercetina-3-glucósido y la quercetina-3-rutinósido sólo inhibieron
un 35 y 22 %, respectivamente. Lin et al., (2005), también reportaron que los
flavonoides agliconas mostraron mayor efecto inhibitorio que los flavonoides
glicosilados. Por lo tanto, contrario a lo que reportaron éstos autores acerca de
que la glicosilación de los flavonoides, los resultados que se obtuvieron en el
presente trabajo indicaron que a pesar de que el extracto que recibió 60 minutos
de tratamiento alcalino (el cual contuvo la mayor cantidad de flavonoides totales
en su mayoría en formas glicosiladas), mostró efectos significativos en cuanto a la
inhibición de la producción de óxido nítrico. Estos hallazgos pueden estar
relacionados a efectos sinérgicos entre los mismos flavonoides presentes en el
extracto. Y a pesar, de que se ha reportado que los flavonoides en forma aglicona
tienen mayor bioactividad que sus contrapartes glicosiladas (Kim eí al., 1999), es
importante mencionar que estos datos son reportados de compuestos aislados y
no de extractos, por lo que los efectos pueden ser diferentes.
En cuanto a la correlación entre flavonoides presentes en los extractos y el

porcentaje de inhibición de óxido nítrico, se encontró que los flavonoides IG1, IG2
IG4 y K fueron los que aportaron más a esta capacidad de inhibición en las
concentraciones de 0.04 y 0.004 ug/ml (p < 0.05), mientras que a la concentración
de 0.4 u.g/ml fue la isorhamnetina aglicona presentes en los extractos (p < 0.05).
Los mecanismos propuestos asociados con la reducción de la producción de NO
son atrapamiento de radicales de NO, una inhibición directa de la actividad de la
enzima ¡NOS, y/o la inhibición de la expresión del gen de iNOS (Jung eí al., 2006;
Kim, eí al., 1999; Sheu eí al., 2001).
67
Capítulo 5: Conclusiones
Con los resultados obtenidos en la presente investigación se comprobó la
hipótesis de que un tratamiento alcalino previo realizado a la harina de nopal
Opuntia fícus indica variedad Jalpa permite extraer mayor cantidad de flavonoides
ligados. El extracto que recibió 60 minutos de tratamiento alcalino fue el que
contuvo la mayor cantidad de flavonoides (3550 pg/100g), de los cuales el 90 % se
encontraron en formas glicosiladas. El flavonoide isorhamnetina y sus derivados
constituyeron aproximadamente el 95 % del total de los flavonoides presentes en
los extractos, el resto correspondió a kaempferol. Adicionalmente, el método de
extracción permitió identificar cuatro compuestos los cuales no habían sido
reportados previamente. Estos flavonoides fueron denominados KG1, KG2, KG3 e
IG7, los cuales fueron compuestos di, tri y tetraglicósidos,
Por otro lado, la cuantificación de fenólicos totales se realizó en las

diferentes fracciones enriquecidas en flavonoides obtenidas a partir del tratamiento
alcalino que recibió la harina de nopal a diferentes tiempos. Los resultados
mostraron que el extracto que recibió 60 minutos de tratamiento mostró los
mayores valores de fenólicos (16.98 pgEAG/g). Posteriormente se les realizó una
hidrólisis acida lo cual promovió la liberación de la molécula aglicona. En todos los
extractos se observó un incremento de la cantidad de fenólicos, pero el extracto
que recibió 120 minutos de tratamiento aumento más de un 100 % (29.65
pgEAG/g). Los valores de ambos tratamientos fueron comparados con un extracto
metanólico, el cual mostró valores menores que los extractos alcalinos, por lo
tanto, éste tipo de extracción alcalina también mejoró la obtención de fenólicos. En
cuanto a la actividad antioxidante, los valores obtenidos en el extracto antes de la
hidrólisis tuvieron mejor actividad antioxidante que los resultados obtenidos
después de la hidrólisis acida, contrario a lo que se ha reportado, principalmente
debido al tiempo y concentración del ácido que fueron utilizados, lo que provocó
una disminución por degradación de compuestos.
68
En cuanto a los bioensayos realizados en los extractos obtenidos de la

harina de nopal mediante tratamiento alcalino a diferentes tiempos, los resultados
mostraron que los extractos que recibieron 60 y 120 minutos de tratamiento a una
concentración de 0.4 ug/ml tuvieron un alto porcentaje de inhibición en la
producción de NO (67 y 50.98 %, respectivamente), al compararse con la que
mostró el estándar de isorhamnetina (43.36 %). Al probarse en concentraciones
menores, sólo el extracto de 60 minutos a una concentración de 0.04 ug/ml mostró
inhibición significativa (55.7 %).
En base a éstos resultados se consideró que las fracciones obtenidas

mediante tratamiento alcalino, las cuales estuvieron enriquecidas con flavonoides,
tuvieron efectos significativos en la inhibición de la producción de óxido nítrico, lo
cual pudo ser principalmente por los efectos sinérgicos entre los mismos
compuestos presentes en los extractos, lo que también potenció el efecto de
inhibición que presentaron. Contrario a lo que se ha reportado en cuanto a que los
flavonoides al encontrarse unidos a azúcares presentan menor actividad, aquí se
comprobó que el extracto que recibió 60 minutos de tratamiento alcalino mostró
mejor inhibición de óxido nítrico, y que incluso éste fue el que contuvo la mayor
concentración de flavonoides totales. Por último, éste mismo extracto fue
aproximadamente 5800 veces más potente que la isorhamnetina estándar.
Por lo tanto, el nopal constituye una importante fuente de alimento que

posee la presencia de compuestos que puede beneficiar en procesos inflamatorios
y al ser considerada una planta de fácil acceso entre la población mexicana, es
necesario seguir haciendo estudios con el fin de conocer más de los beneficios
que pueda aportar a la mejora de la salud de las personas. Es por ello, que como
dirección futura a este proyecto se recomienda hacer algunas conjugaciones del
extracto de harina de nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa obtenido a los 60
minutos de tratamiento alcalino con concentraciones conocidas de flavonoides
agliconas (isorhamnetina). Posteriormente, probarlos en la misma línea celular,
con el fin de esperar una mayor inhibición de la producción de NO así como aislar
69
cada flavonoide presente, y probarlos por separado para ver cuál tiene mayor
aportación a ésta inhibición. Incluso, una comparación con otra variedad de harina
de nopal Opuntia, sería interesante, con el fin de observar cómo cambia la
respuesta entre una especie y otra, dependiendo de su perfil químico. Por último
se recomienda la realización de un ensayo in vivo para ver cómo se correlacionan
los datos obtenidos mediante los ensayos in vitro y poder decir que los flavonoides
glicosilados presentes en los extractos de harina de nopal obtenidos mediante un
tratamiento alcalino efectivamente presentan efectos antiinflamatorios en
mamíferos.
70
Referencias
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suggest that polyphenol contents of plant foods have been underestimated. J. Agrie. Food Chem. 2009, 57,
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78
Anexos
Fig. A1: A) Cromatograma del extracto metanólico de harina de nopal Opuntia ficus
indica variedad Jalpa a 365nm. (K) Kaempferol, (KG3) Kaempferol-glucosil-ramnosil-
ramnosa + hexosa, (KG4) Kaempferol-glucosil-ramnósido, (IG1) Isorhamnetin-glucosil-
ramnosil-ramnósido, (IG2) Isorhamnetin-ramnosil-pentósido, (IG3) Isorhamnetin + 1
hexosa + 1 metilpentosa + 1 pentosa, (IG4) Isorhamnetin-glucosil-pentósido, (IG5)
Isorhamnetin-glucosil-ramnósido. B) Cromatograma del extracto metanólico posterior a la
hidrólisis acida. (I) Isorhamnetina, (NI) Compuesto no identificado.
79
Fig. A2: Cromatogramas obtenidos de los extractos de harina Opuntia fícus indica
variedad Jalpa. A) A los 0 min de tratamiento alcalino. B) A los 120 min de tratamiento
alcalino. Los compuestos identificados se encuentran en la sección de resultados, tabla
4.1.
80
Fig. A3: Cromatogramas obtenidos de la harina de nopal Opuntia ficus indica

variedad Jalpa posteriores a una hidrólisis acida, a) A los 120 min de tratamiento
alcalino previo, b) A los 60 min de tratamiento alcalino previo. Los compuestos
identificados se encuentran en la sección de resultados, tabla 4.1
81
Fig. A4: Cromatograma obtenido mediante MS-TOF para el extracto de harina de

nopal Opuntia ficus indica variedad Jalpa a los 0 min de hidrólisis alcalina.
Tabla A1: Correlación entre actividad antioxidante y flavonoide total a los diferentes
tiempos de hidrólisis alcalina y su posterior hidrólisis acida.
Hidrólisis Hidrólisis
alcalina acida
2 2
Flavonoide R R
KG1 0.7177
KG2 0.0002
KG3 0.0356
KG4 0.3454
K 0.4707 0.0222
IG1 0.3535
IG2 0.2848
IG3 0.1425
IG4 0.1575 0.1350
IG5 0.0266 0.3269
IG6 0.1170
IG7 0.0296 0.2698
I 0.3543 0.6239
82

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INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS

"Evaluación de la actividad anti-inflamatoria de flavonoides

recuperados con un tratamiento alcalino presentes en Opuntia

ficus indica variedad J a l p a "

MAESTRA EN CIENCIAS CON

MONTERREY, N. L. DICIEMBRE DE 2011

"Evaluación de la actividad anti-inflamatoria de flavonoides recuperados con un

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO

MAESTRA EN CIENCIAS CON ESPECIALIDA

BEATRIZ EUGENIA MORENO GARCÍA

MONTERREY, N. L. DICIEMBRE DE 2011

Medíante esta investigación realizada en harina de nopal Opuntia ficus

una mayor liberación de flavonoides principalmente en forma glicosilada (90 %). El

Por otro lado, la cuantificación de fenólicos totales mostró que a los 60 y

En cuanto a la actividad antioxidante, el extracto que recibió 120 minutos de

Por otra parte, se midió la actividad antiinflamatoria de los extractos que

A Fá, porque desde que naciste me enseñaste el valor de un equipo, de la amistad y la

Al Conacyt por el apoyo de beca otorgado.

"La felicidad es la suma de los pequeños momentos que tienes el privilegio

Lista de Abreviaturas XII

2.1 Alimento funcional 3

2.2 Generalidades de Opuntia spp. 3

2.2.1 Descripción e información taxonómica de la planta 4

2.2.2 Composición química del nopal 7

2.3 Compuestos fenólicos 10

2.3.2 Absorción y biodisponibilidad de flavonoides 13

2.3.3 Ingesta de flavonoides 17

2.3.4 Extracción de flavonoides ligados 18

2.3.5 Propiedades de los flavonoides 20

2.3.5.1 Capacidad antioxidante 21

2.3.6 Estudios previos que relacionan el nopal y los

2.4.1 Óxido nítrico y su relación en la inflamación 25

2.4.2 Flavonoides e inflamación 26

2.4.3 Flavonoides y producción de óxido nítrico 27

Capítulo 3: Materiales y métodos 32

3.1 Reactivos y materiales 32

3.2 Extracción de compuestos 33

3.2.1 Extracción de compuestos solubles en metanol 33

3.2.2 Optimización del procedimiento de extracción de

3.3 Extracción en fase sólida 34

3.3.1 Extracción en fase sólida de los extractos metanólicos 34

3.3.2 Extracción en fase sólida de los extractos alcalinos 35

3.4 Hidrólisis ácida de los extractos 36

3.5 Caracterización de los extractos de harina de nopal Opuntia ficus

3.5.1 Detección y cuantificación de los compuestos mediante

3.5.2 Identificación de flavonoides glicosilados mediante

3.5.3 Cuantificación de fenólicos totales en los diferentes

3.5.4 Determinación de la actividad antioxidante [Oxygen

3.6 Bioensayo de producción de óxido nítrico (NO) en la línea celular

3.6.1 Mantenimiento de la línea celular 39

3.6.2 Bioensayo de producción de óxido nítrico (NO) 39

3.6.3 Ensayo de viabilidad celular 41

3.7 Análisis estadístico 42

Capítulo 4: Resultados y discusiones 43

4.1 Optimización del procedimiento de extracción de flavonoides totales 43

4.2 Identificación de flavonoides presentes en los extractos de harina

4.2.1 Análisis de los espectros de absorción de los flavonoides

4.2.2 Análisis de los espectros de masas de los flavonoides

4.3 Cuantificación de flavonoides presentes en los extractos de harina