MONOGRÁFICO

Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

El diagnóstico de certeza de la La tuberculosis humana es una enfermedad producida

tuberculosis es microbiológico. La por bacterias del género Mycobacterium, y dentro de
importancia de realizar un buen éste por tres especies que pertenecen al complejo M.
tuberculosis: M. tuberculosis es la especie aislada con
diagnóstico y seguimiento microbiológico
más frecuencia, M. bovis produce una enfermedad in-
de la tuberculosis está claramente distinguible clínicamente de la producida por M. tuber-
reconocida y consensuada en todos los culosis y M. africanum causa enfermedad en África
programas de control de la tuberculosis. tropical, pudiendo ser considerada como una forma in-
Obviamente, la estrategia fundamental termedia entre M. tuberculosis y M. bovis1,2.
para el control de la enfermedad
tuberculosa debe ser el rápido y
Características bacteriológicas del género
correcto diagnóstico de los casos de
Mycobacterium
tuberculosis activa y, sobre todo, de los
enfermos bacilíferos. Son bacilos delgados de forma recta o ligeramente cur-
vada, de tamaño de 1-10 µ de largo por 0,2-0,6 µ de an-
cho. Ocasionalmente forman ramificaciones verdaderas
M.L. Pérez del Molino, V. Tuñez Bastida, observadas en cultivos enriquecidos y en frotis de gan-
M.R. García Ramos y F.L. Lado Lado glios linfáticos. Son bacilos aerobios estrictos, inmóvi-
Complejo Hospitalario Universitario de Santiago. les, sin cápsula, que no forman esporas y se tiñen con
Santiago de Compostela. La Coruña
dificultad con la tinción de Gram (irregularmente gram-
positivos) (fig. 1).
La estructura de su gruesa pared celular, responsable de
su característica coloración ácido-alcohol resistente,
presenta en su lado interno una capa de polímeros de
arabinosa y galactosa, seguida de otra formada por áci-
dos micólicos (ácidos grasos de gran importancia en la
taxonomía del género Mycobacterium, y otra superfi-
cial formada por lípidos, como los sulfolípidos y micó-

Fig. 1. Tinción de Ziehl-Neelsen positiva (×100). Cord-factor de

M. tuberculosis en tuberculosis renal.

Med Integral 2002;39(5):207-15 207

Pérez del Molino ML, et al. Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

sidos, lo que hace que presenten un alto contenido en Líquidos orgánicos

lípidos. Es probable que los ácidos grasos y los lípidos
En los líquidos cefalorraquídeos, pleurales, sinoviales,
sean los responsables de su gran resistencia a la deseca-
pericárdicos o ascíticos es necesario enviar al laborato-
ción y a la acción de los descontaminantes poderosos,
rio la mayor cantidad posible, ya que la concentración
tanto ácidos como alcalinos. Son sensibles al calor hú-
de micobacterias en este tipo de muestra es muy baja.
medo y se destruyen a temperatura de pasteurización.
Es muy importante recordarlo cuando existe una alta
El crecimiento bacteriano es lento; en condiciones ópti-
sospecha de meningitis tuberculosa, dada la gravedad
mas de cultivo (temperatura 37 °C, pH = 7) el tiempo
de la enfermedad y la relevancia de la realización de un
de duplicación es de 15-18 h, tardando de una a 3 se-
diagnóstico microbiológico de certeza.
manas en aparecer colonias visibles en medios de culti-
vo sólidos3,4.
La tuberculosis más frecuente es la pulmonar, por lo que Biopsias
la mayoría de las muestras procederán del aparato respi-
Siempre que se biopsie un órgano en el que exista sos-
ratorio; pero la tuberculosis puede afectar a casi todos los
pecha de tuberculosis deberá enviarse una muestra al
órganos. En la actualidad la tuberculosis extrapulmonar
laboratorio de microbiología y para evitar su deseca-
representa 22-39%, por lo que se puede recibir en el la-
ción se debe añadir unas gotas de agua destilada. En el
boratorio un gran diversidad de muestras4,5. La calidad,
caso de sospecha de tuberculosis intestinal se debe re-
cantidad y representatividad de la muestra condicionarán
currir, si es posible, a biopsiar la lesión, ya que la renta-
la posibilidad de realizar el diagnóstico.
bilidad del procesamiento de las heces es muy baja.

Obtención y transporte de muestras Hemocultivos

clínicas
Normalmente sólo deben ser utilizados en pacientes in-
Es necesario enviar las muestras en frasco estéril, trans- munodeprimidos en los que se sospeche enfermedad di-
portarlas lo más rápido posible al laboratorio y siempre seminada, fundamentalmente en pacientes con sida con
que sea posible conservarlas a 4 °C. En caso de pacien- un número de CD4 inferior a 50/µl. Generalmente su
tes ambulatorios se puede almacenar las 3 muestras en rentabilidad es superior en el diagnóstico de otras infec-
una nevera (esputos/orinas) y remitirlas juntas al labo- ciones por micobacterias (especies del complejo M.
ratorio3,4. avium-intracellulare, M. genavense) que para la tuber-
culosis. Los sistemas utilizados con mayor rentabilidad
Muestras respiratorias son los de lisis centrifugación y el BACTEC 460TB
(viales BACTEC13A). También se han comunicado
El esputo es la muestra más frecuente y epidemiológica- buenos resultados con el sistema automatizado ESP
mente la más importante. Se enviarán al laboratorio Culture II-Myco6.
3 esputos recogidos en 3 días consecutivos por la maña- Todas las muestras recibidas para estudio de tuberculo-
na, en ayunas, y en cantidad de 5-10 ml; volúmenes infe- sis se deben manipular como si contuvieran micobacte-
riores pueden disminuir la rentabilidad de la muestra. rias. Los Centers for Disease Control and Prevention
Cuando el enfermo no puede espectorar se podrá recurrir (CDC) y los National Institutes of Health recomiendan
a inducir el esputo (aerosol de solución salina, durante el empleo de prácticas de bioseguridad de nivel 2 para
15-20 min) o a la realización de una fibrobroncoscopia, la preparación de frotis acidorresistentes y el cultivo de
que permite realizar broncoaspirados selectivos, lavados las muestras7.
broncoalveolares y biopsias de las lesiones bronquiales.
Es importante procesar los esputos obtenidos tras la
broncoscopia, ya que tienen una buena rentabilidad. Técnicas de diagnóstico
El estudio del jugo gástrico puede ser útil en el diag- Observación microscópica
nóstico de la tuberculosis pediátrica; se debe obtener
matinalmente en 3 días consecutivos y procesarse con Las técnicas utilizadas para la observación de las mico-
rapidez. Si se va a tardar más de 2 h se debe neutralizar bacterias se basan en su ácido-alcohol resistencia; es
con carbonato sódico. necesario recordar que esta característica es compartida
parcialmente por otras bacterias, como especies de No-
cardia, Legionella micdadei, Rhodococcus sp. y quistes
Orinas
de Cryptosporidium sp., Isospora sp., Cyclospora sp. y
Se debe enviar 3 orinas matinales completas durante Microsporidea, aunque presentan menos estabilidad en
3 días consecutivos, cuya cantidad no debe ser inferior la coloración. Las 2 tinciones más utilizadas son la clá-
a 70 ml. sica de Zhiel-Neelsen y la tinción con fluorocromos

208 Med Integral 2002;39(5):207-15

Pérez del Molino ML, et al. Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

(auramina 0). Esta última permite una lectura más rápi- Independientemente del resultado de la observación mi-
da (2-3 min) y se recomienda cuando el número de croscópica, se debe siempre efectuar el cultivo de las
muestras a examinar es superior a diez diarias; también muestras clínicas para realizar un diagnóstico de certe-
hay que tener en cuenta que los frotis teñidos por aura- za de tuberculosis.
mina pueden reteñirse por Zhiel-Neelsen, lo que posibi-
lita la diferenciación de la morfología bacteriana. Esta
Cultivo e identificación del complejo M. tuberculosis
tinción permite distinguir ciertas características morfo-
lógicas, pero no permite diferenciar con certeza las es- La técnica de cultivo es más sensible que la microsco-
pecies de micobacterias. M. Kansasii puede sospechar- pia para el diagnóstico, ya que permite detectar 10 bac-
se por su mayor tamaño y apariencia de bandas terias/ml de muestra concentrada. Asimismo, asegurar
cruzadas. Algunas micobacterias de crecimiento rápido la negativización de los cultivos es imprescindible para
(cepas del complejo M. fortuitum) pueden teñirse mal el seguimiento de la enfermedad y el control de la
con auramina 0, teniendo que recurrir a la tinción clási- eficacia del tratamiento. La realización del cultivo es
ca4. fundamental para el aislamiento de la bacteria, que
Las recomendaciones internacionales más utilizadas permitirá, si fuera necesario, estudios de resistencia a
para la emisión de resultados se exponen en la tabla 18. fármacos y/o estudios de tipificación genética6.
Esta cuantificación es importante, ya que la reducción Las muestras remitidas para su estudio al laboratorio de
del número de bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR) micobacterias se pueden dividir en dos grupos3,4,10:
orienta sobre la eficacia del tratamiento antitubercu-
loso. 1. Muestras procedentes de lugares estériles, como lí-
El hallazgo de BAAR en las muestras clínicas es la pri- quidos cefalorraquídeos, pleurales, peritoneales, peri-
mera evidencia de la presencia de una micobacteria. Es cárdicos y biopsias de tejidos. Éstas pueden sembrarse
el procedimiento más fácil y rápido que permite un directamente en los medios de cultivo. Si el volumen es
diagnóstico presuntivo y el reconocimiento de los pa- grande pueden requerir una concentración previa.
cientes bacilíferos, lo que le confiere un gran valor epi- 2. Muestras procedentes de lugares en los que existe
demiológico. Una tinción negativa nunca excluye una flora comensal (esputos, orinas etc.) que se multiplica
tuberculosis. Para que una tinción sea positiva es nece- más rápido que las micobacterias, por lo que puede
sario que el número de BAAR en el esputo sea de impedir el crecimiento de las micobacterias. Este tipo
5.000-10.000/ml, lo que hace que la sensibilidad de la de muestras debe ser sometido a un proceso de homo-
técnica sea limitada, del 22-80% según las series4, y se geneización (descontaminación y posterior neutraliza-
encuentre influida por diversos factores (tipo de mues- ción-concentración). Los métodos más utilizados
tra, población estudiada, etc.). En tuberculosis prima- son el de Tacquet y Tison (laurilsulfato sódico), el de
rias y extrapulmonares, su sensibilidad es muy baja9. NALC-NaOH y el que utiliza ácido oxálico, que elimi-
Dado que la eliminación de bacilos puede ser disconti- na P. aeruginosa, para enfermos con fibrosis quísti-
nua, se recomienda el procesamiento de varias muestras ca2,10. El concentrado final puede utilizarse para tincio-
para aumentar la sensibilidad de la observación micros- nes ácido alcohol-resistentes, para cultivo o, si fuera
cópica directa6. necesario, para la amplificación de ácidos nucleicos. La
La especificidad de la tinción de BAAR es bastante ele- elección de cualquiera de estos sistemas dependerá so-
vada; la presencia de micobacterias no tuberculosas en bre todo del tipo de medio de cultivo líquido a utilizar
el agua con la que se realiza la tinción puede ser causa y/o de la posible realización de técnicas molecula-
de falsos positivos. También puede existir transferen- res, ya que algunos reactivos pueden retrasar el creci-
cia de micobacterias entre distintos frotis, así como miento de las micobacterias o interferir en las reaccio-
contaminación en el aceite de inmersión2. nes de amplificación11.

TABLA 1
Evaluación e informe de los frotis para bacilos ácido-alcohol resistentes (BAAR)
TINCIÓN DE FUCSINA: TINCIÓN CON FLUOROCROMO: INFORME
NO DE BAAR OBSERVADO A ×1.000 NO DE BAAR OBSERVADO A ×250

0 0 No se observaron BAAR
1-2/300 campos 1-2/30 campos No concluyente, repetir envío por favor
1-9/100 campos 1-9/10 campos 1+
1-9/10 campos 1-9/campo 2+
1-9/campo 10-90/campo 3+
> 9/campo > 90/campo 4+

Med Integral 2002;39(5):207-15 209

Pérez del Molino ML, et al. Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

La gran variedad de medios permite a cada laboratorio una mezcla antibiótica selectiva PANTA (polimixina B,
elegir los que mejor se adapten sus necesidades y a la azlocidina, ácido nalidíxico, trimetroprim y anfotericina
población atendida. Existen 2 grupos de medios de cul- B) y un suplemento de enriquecimiento de estearato de
tivo: sólidos y líquidos. En general, se admite que el polioxietileno (POES). El medio contiene ácido palmíti-
uso combinado de un medio sólido y otro líquido es co marcado con 14C radiactivo del que las micobacte-
idóneo para la realización de aislamientos primarios, rias, al crecer, liberan 14CO2. Éste es detectado en el
buscando rapidez y sensibilidad. En condiciones nor- BACTEC 460TB y traducido a un índice de crecimiento
males, los cultivos deben incubarse a 35-37 °C e incu- (escala 0-999), que es proporcional a la cantidad de mi-
barse durante 6-8 semanas. Se acepta como control de cobaterias que se están multiplicando. Este sistema es
calidad de buen funcionamiento de un laboratorio una más sensible que los tradicionales6,12,13. Presenta como
contaminación entre el 3-5% de los cultivos en medio inconveniente la utilización de isótopos radiactivos y
sólido. Un rango menor indicaría una descontamina- que se pueden producir falsos positivos por contamina-
ción demasiado severa y un rango superior al 5% sería ción de los frascos a partir de las agujas del aparato de
debido a una descontaminación suave. No existe con- lectura deficientemente esterilizadas14. En la actualidad,
senso en cuanto a posibles rangos de contaminación en está comercializado el sistema Mycobacteria Growth In-
los distintos medios líquidos utilizados en la actua- dicator (MGIT), que utiliza el medio de Middlebrook
lidad3. 7H9 y la mezcla antibiótica PANTA, con un suplemento
de enriquecimiento OADC (ácido oleico, albúmina,
Medios de cultivos sólidos dextrosa y catalasa); como sustrato utiliza un compuesto
Los más comúnmente usados son los que utilizan como de rutenio. Durante el crecimiento bacteriano se consu-
base huevo coagulado, como el Löwenstein-Jensen y el me oxígeno y el compuesto de rutenio emite fluorescen-
de Coletsos. Este último facilita el crecimiento de M. cia, que se detecta en una lámpara de Wood. Tiene me-
bovis y de cepas disgónicas de M. tuberculosis. Tam- nor sensibilidad que el anterior, pero es una buena
bién se puede utilizar medios con base de agar (Midd- alternativa para laboratorios pequeños15,16.
lebrook 7H10, 7H11). Si se dispone de estufas con at-
mósfera de 5-10% de CO2, es conveniente mantener los Medios de lectura automática (fig. 2). En los últimos
tubos al menos 5-7 días (esto es importante en los me- años se han diseñado sistemas de cultivo líquido no ra-
dios con agar). Los tubos deben leerse, al menos una diométricos. Todos ellos son métodos no invasivos (no
vez por semana, aunque es deseable realizar 2 lecturas utilizan agujas en la detección), con escasa manipula-
semanales. Una ventaja de estos medios es que permi- ción de viales (una vez inoculados se almacenan en un
ten apreciar la morfología colonial, por lo que se puede incubador específico) y lectura continua totalmente au-
observar características de la colonia (rugosidad, pig- tomatizada. La principal diferencia está en el sistema
mentación, etc.) que son ya datos orientativos para su de detección. Los más utilizados son: BACTEC
posterior identificación10. En el medio de Löwenstein- 9000MB System (la base de la detección es la descri-
Jensen las colonias de M. tuberculosis empiezan a ob- ta en el sistema MGIT)7,18, ESPII-Myco (detección ba-
servarse a las 2-3 semanas de incubación. La mayor sada en la disminución de presión por el consumo de
desventaja de estos medios es la lentitud de crecimiento
de las micobacterias, por lo que en los últimos años han
tenido un gran desarrollo los medios líquidos.

Medios de cultivos líquidos

Su mayor ventaja es que acortan en 2-3 semanas la de-
tección de las micobacterias, y permiten un mayor nú-
mero de aislamientos de algunas micobacterias no tu-
berculosas, como las pertenecientes al complejo M.
avium-intracellulare. Actualmente los medios líquidos
se pueden dividir en dos grupos, que exponemos a con-
tinuación.

Medios de lectura semiautomática. Estos sistemas re-

quieren una gran manipulación de los viales durante
todo el proceso y la lectura se realiza de forma manual.
El más ampliamente utilizado es el sistema BACTEC Fig. 2. Análisis automatizado. Dendograma representativo del es-
tudio mediante RFLP-IS6110 de 13 cepas de M. tuberculosis. Las
460TB, comercializado a finales de los años setenta, cepas V10 y V20, así como la V1 y V52, presentan patrones idén-
que emplea viales de medio líquido Middlebrook 7H12, ticos.

210 Med Integral 2002;39(5):207-15

Pérez del Molino ML, et al. Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

oxígeno debido al crecimiento de las bacterias)19 y sis- (5-8 h). Estas técnicas presentan problemas en su eva-
tema MB-BacT (detección mediante colorimetría de la luación, siendo necesaria, en la actualidad, una estrecha
producción de CO2 del crecimiento bacteriano). relación entre el clínico y el microbiólogo para concre-
tar las situaciones en las que se debe utilizar estas
Identificación del complejo M. tuberculosis técnicas de amplificación. Es importante conocer con
Tradicionalmente, las micobacterias aisladas en cultivo precisión las ventajas y limitaciones de cada sistema de
se han identificado sobre todo por sus características amplificación6.
morfológicas en el medio de Löwenstein-Jensen (velo- En general, todas la técnicas de amplificación de ácidos
cidad de crecimiento, rugosidad y pigmentación) y me- nucleicos comportan 3 pasos fundamentales.
tabólicas. Se confirma mediante pruebas bioquímicas,
el test de la niacina, que pone de manifiesto la capaci- Preparación de la muestra
dad para producir ácido nicotínico y es la prueba funda- Este paso está dirigido a eliminar posibles inhibidores
mental para la identificación de M. tuberculosis, aun- existentes en las muestras clínicas, así como a conse-
que ésta no debe basarse nunca exclusivamente en esta guir una extracción eficiente de los ácidos nucleicos de
prueba10. Las pruebas bioquímicas necesarias para la las micobacterias. La lisis puede ser mecánica (sonica-
correcta identificación del complejo M. tuberculosis se ción), física (calor) y química (detergentes, proteasas);
exponen en la tabla 2. pueden utilizarse uno o varios procedimientos, ya que
El desarrollo de la biología molecular ha permitido la pared celular de las micobacterias es difícil de lisar.
identificar secuencias de ácido desoxirribonucleico
(ADN) y de ácido ribonucleico (ARN) específicas de Amplificación
las distintas especies de micobacterias. Para hibridar Proceso en el que se producen numerosas copias del
con estas secuencias se han preparado sondas genéticas ácido nucleico diana. Existen técnicas que amplifican el
marcadas con sustancias cromógenas, que proporcio- ARN, y otras el ADN, utilizando diversas dianas de
nan resultados en menos de una hora. Actualmente dis- amplificación (IS 6110, rRNA 16s) y distintas enzimas
ponemos de sondas frente al complejo M. tuberculosis, (transcriptasa inversa/ARN-polimerasa/Taq polimera-
M. avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae sa/ADN-ligasa/ADN-polimerasa). Según el protocolo
(Accuprobe.Gen-Probe Inc.) que se pueden utilizar utilizado variarán el número de ciclos y las condiciones
tanto sobre colonias crecidas en medios sólidos como de temperatura.
sobre cultivos positivos en medios líquidos. El límite
de detección de estas sondas es de, aproximadamente, Detección del producto amplificado
106 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml20. El Se puede realizar mediante electroforesis en geles de
principal inconveniente de la sonda para el complejo agarosa (generalmente con menor especificidad), técni-
M. tuberculosis es que no diferencia entre las 3 espe- cas de hibridación en distintos tipos de soporte (tipo en-
cies del complejo. La sonda tiene una alta especifici- zimoinmunoanálisis), etc.6.
dad, pero se han descrito falsos positivos con M. terrae Los primeros ensayos utilizaban muy diversos protoco-
y M. celatum3. los, con reactivos de muy distinta fabricación y con va-
riedad de controles de calidad, y obtuvieron resultados
heterogéneos según los distintos laboratorios21,22. Esto
Técnicas de amplificación de ácidos nucleicos
hizo imposible la realización de análisis globales sobre
Los problemas inherentes a la lentitud del cultivo de las la utilización de estas técnicas en el diagnóstico de la
micobacterias han hecho que las técnicas de biología tuberculosis. En la actualidad disponemos en el merca-
molecular que permiten la amplificación de secuencias do de una gran variedad de técnicas que permiten traba-
de ADN y de ARN específicas del complejo M. tuber- jar de forma estandarizada. Las más utilizadas y, por
culosis se desarrollen ampliamente en el diagnóstico tanto, de las que existe más experiencia en el diagnósti-
de la tuberculosis, permitiendo un diagnóstico rápido co clínico son las que se citan a continuación.

TABLA 2
Identificación de las especies del complejo M. tuberculosis
TEST M. TUBERCULOSIS M. AFRICANUM M. BOVIS

Niacina + - -
Reducción de nitratos + V -
Catalasa a 68 °C - - -
Resistencia a TCH R S S
Resistencia a pirazinamida - - +

Med Integral 2002;39(5):207-15 211

Pérez del Molino ML, et al. Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

Amplificación mediada por transcripción (TMA). tentan justificarse con valoraciones clínicas. Sin embar-
(AMTD-2. Gen–Probe Inc). Utiliza un proceso isotér- go, aparece en casi todos los estudios un 1-5% que
mico y autocatalítico, diseñado para amplificar el ARN debe ser asumido como falsos positivos6.
ribosomal 23S micobacteriano (utiliza ARN-polimera- En la actualidad, las técnicas de amplificación de áci-
sa/transcriptasa inversa). La detección específica se re- dos nucleicos son un apoyo en el diagnóstico de la tu-
aliza mediante una sonda ADN marcada con un ester berculosis, pero no desplazan a las técnicas clásicas.
de acridina quimioluminiscente. A través de un proceso Las limitaciones y el elevado coste de esta tecnología
químico (que protege la hibridación) se eliminan las está siendo un obstáculo para su introducción en la ruti-
sondas no hibridadas. Los híbridos ARNr-ADN, espe- na de los laboratorios de micobacterias.
cíficos de complejo M. tuberculosis, son detectados en
un luminómetro. Es un sistema manual de fácil aplica-
Técnicas serológicas
ción en cualquier laboratorio clínico23,24.
Los principales tipos de antígenos de micobacterias uti-
Reacción en cadena de la ligasa (LCR) (LCx.Abbot lizados para el diagnóstico serológico mediante técni-
Lab). La LCR utiliza 4 iniciadores diseñados para aco- cas de enzimoinmunoanálisis son de naturaleza proteica
tar la región a amplificar; así, las sondas pueden unirse (PPD, antígeno 5) o de naturaleza lipídica (PGL-tb 1,
enzimáticamente (mediante la ADN-ligasa) previa ac- SL I, SL IV)3. Existe comercializado un equipo que uti-
tuación de la ADN-polimerasa, para formar el producto liza el denominado antígeno 60, que es un complejo
amplificado. Se utiliza como diana el gen que codifica proteínico-lipopolisacárido procedente del citoplasma y
para la proteína antigénica b, específica del complejo de la membrana celular de M. bovis BCG y es común a
M. tuberculosis. La detección de los amplicones tiene M. tuberculosis, M. bovis y otras micobacterias3. Estas
lugar mediante un enzimoinmunoanálisis de micropar- técnicas serológicas, que parecían prometedoras en los
tículas (MEIA), tras generar el producto amplificado estudios preliminares, resultaron ser finalmente decep-
una molécula fluorescente. Es un sistema semiautoma- cionantes en la práctica clínica. En la actualidad no se
tizado23,25,26. reconoce utilidad diagnóstica clara a ninguna determi-
nación serológica.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Amplicor©
(Roche Systems). La diana de amplificación es un seg-
mento de 584 pares de bases (pb) ubicado en el gen que
Estudios de sensibilidad a fármacos
codifica para el ARNr 16s, común a todo el género antituberculosos
Mycobacterium. La detección se lleva a cabo con sondas
Es bien sabido que en el genoma de M. tuberculosis se
específicas para el complejo M. tuberculosis que, una
producen mutaciones espontáneas con relativa frecuen-
vez unidas al producto amplificado, darán lugar a una
cia. La incidencia natural de mutantes dentro de una
reacción colorimétrica. Esta técnica incluye controles in-
población bacteriana varía para los diferentes quimiote-
ternos para detectar inhibidores de la amplificación27,28.
rápicos: para rifampicina aparece una mutante resisten-
te entre 108 bacilos, para isoniacida sería entre105-106
Las evaluaciones de todas estas técnicas sobre muestras
bacilos. Para evitar la selección de cepas resistentes el
clínicas con tinción de auramina positiva ofrecen muy
tratamiento de la tuberculosis se realiza con al menos
buenos resultados en cuanto a la sensibilidad (> 98%) y
3 quimioterápicos4,5. Los fármacos de primera línea
la especifidad (> 98%). En las muestras de origen respi-
utilizados en el tratamiento de la tuberculosis son: iso-
ratorio, cuando la tinción de auramina es negativa exis-
niacida (H), rifampicina (R), etambutol (E), pirazina-
te una mayor variabilidad en los estudios; en general
mida (Z) y estreptomicina (S). Los de segunda línea
presentan mayor sensibilidad las técnicas que ampli-
son: ácido p-amino-salicílico, etionamida, cicloserina,
fican ARN (80-85%) que las que amplifican ADN (53-
capreomicina, kanamicina, amikacina, ofloxacino y ri-
72%)23-27.
fabutina4.
En las series que estudian muestras extrapulmonares
La detección de cepas resistentes es otra de las funcio-
aún es mayor la dispersión de resultados, obteniéndose
nes importantes de los laboratorios de micobacterias.
sensibilidades entre el 71-78% con las técnicas que am-
Las pruebas de sensibilidad se realizan con dos finali-
plifican ADN y entre el 65-77% con las que amplifican
dades distintas:
ARN23,24,26,28,29.
Estos datos indican que una amplificación negativa en 1. Estudios con fines epidemiológicos, cuyo objetivo es
una muestra con tinción de auramina negativa no des- el conocimiento de las resistencias primarias; se rea-
carta el diagnóstico de tuberculosis. lizan periódicamente y se coordinan desde los progra-
Existe una dificultad añadida en la interpretación de las mas de control de tuberculosis correspondientes a cada
amplificaciones positivas con cultivo negativo, que in- zona.

212 Med Integral 2002;39(5):207-15

Pérez del Molino ML, et al. Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

2. Estudios de sensibilidad individualizados. Se reali- alert/BACTEC-MGIT 960) están en avanzada fase de

zan en cepas procedentes de pacientes pertenecientes a aprobación6.
grupos concretos previamente definidos en los progra- La aparición de cepas multirresistentes ha aumentado la
mas de control. Aunque la elección de estos grupos de- necesidad de disponer de métodos más rápidos para de-
pende de cada país y de su problemática respecto a la tectar la resistencia a los fármacos de primera línea31.
tuberculosis, en general se admite la realización del an- Se están estudiando técnicas que detecten genes de re-
tibiograma en los siguientes casos: sistencia, por tanto independientes del crecimiento bac-
–Pacientes previamente tratados. teriano. Los estudios más avanzados están realizados
–Pacientes en los que el esputo con baciloscopia positi- sobre la detección de resistencia a rifampicina, ya que
va tras una inicial negativización vuelve a positivizarse. las mutaciones se encuentran principalmente en un
–Cuando el examen microscópico no se negativiza tras solo gen (rpoB). Existe un sistema ya comercializado
los 2-3 primeros meses de tratamiento. (INNO-lipa) que utiliza una PCR y posterior hibrida-
–Cuando el cultivo de esputo no se negativiza a los ción en tiras de nitrocelulosa que llevan incorporadas
6 meses de tratamiento. sondas que cubren la totalidad del gen rpoB, informan-
–Pacientes infectados por cepas resistentes a algún fár- do hasta del 86% del total de las mutaciones responsa-
maco. bles de la resistencia a rifampicina, en caso de existir.
–Todos los pacientes infectados con el VIH en zonas de Es una técnica rápida, que se correlaciona bien con los
alta incidencia de infección por el VIH3. métodos tradicionales y que permite sospechar que la
–Todos los pacientes menores de 15 años. cepa es multirresistente, ya que el 90% de las cepas re-
sistentes a rifampicina lo son también a isoniacida30. En
El programa de control de la tuberculosis de la Comu-
los últimos años se han descrito y reconocido genética-
nidad Autónoma Gallega incluye también a los pacien-
mente mutaciones de resistencia a otros fármacos (H,
tes ingresados en penitenciarias, inmigrantes, contactos
E, Z, S), por lo que es posible que surjan nuevas técni-
con infectados por cepas resistentes, usuarios de drogas
cas rápidas6.
por vía parenteral y todos los infectados por el VIH5,6.

Tipificación molecular. Técnicas de

Métodos de antibiograma de M. tuberculosis
restricción-hibridación (RFLP)
Se pueden realizar a partir de la muestra recibida en el
laboratorio, cuando en ella se observen abundantes ba- En el estudio de la epidemiología de la tuberculosis
cilos acidorresistentes en el examen microscópico (mé- puede ser importante comparar cepas de M. tuberculo-
todo directo), o a partir de la cepa aislada en el cultivo sis aisladas de los enfermos (y en su caso del ambien-
(método indirecto). Los resultados del método directo te). Históricamente, los únicos sistemas para subtipifi-
son más rápidos, pero sólo son orientativos, debiéndose car aislamientos de M. tuberculosis eran marcadores
confirmar por el método indirecto5,9. fenotípicos, como la resistencia a antimicrobianos y la
El método de referencia clásico es el de las proporcio- fagotipificación, ambos sistemas de bajo poder discri-
nes4,10, realizado sobre medios sólidos como el Löwens- minativo32. Actualmente disponemos de marcadores ge-
tein-Jensen o en el medio de base de agar 7H10, a los notípicos más eficaces que estudian directamente el ge-
que se incorporan los antibióticos en concentraciones noma bacteriano. Se considera que un marcador tiene
críticas previamente definidas. Para la lectura es nece- un buen poder discriminativo cuando la probabilidad de
saria la visualización de colonias, por lo que, dado el que 2 cepas no relacionadas sean consideradas como
metabolismo lento de M. tuberculosis, los resultados idénticas sea menor del 5%. Además, un marcador debe
tardan de 21 a 28 días. Esta lentitud es un gran inconve- ser rápido, simple, estable, reproducible y debe ser
niente para su aplicación en casos clínicos concretos. capaz de tipificar la práctica totalidad de las cepas estu-
La dificultad al trasladar este método a medios líqui- diadas. El marcador genético de referencia en la actua-
dos, más rápidos, es la necesidad de redefinir todos los lidad es la técnica RFLP-IS611033.
parámetros del método: inóculo bacilar, concentración Las técnicas de restricción-hibridación consisten en una
crítica del fármaco y tiempo de lectura3,6. extracción y la restricción del ADN de las cepas con
En la actualidad, de los medios líquidos semiautomati- una enzima de alta frecuencia de corte, separación por
zados, sólo el sistema radiométrico BACTEC 460 per- electroforesis de los fragmentos en función de su peso
mite obtener resultados concordantes con los sistemas molecular, transferencia a una membrana e hibridación
de referencia, para los fármacos de primera línea, en un con una sonda complementaria de uno de los elementos
tiempo muy inferior (5-10 días) y es el único aprobado repetidos. De este modo se obtienen patrones con un
por la FDA4,30. Otros sistemas líquidos más automati- número discreto de bandas, que son fácilmente compa-
zados y de más sencillo manejo (ESP II/ MBBact- rables entre sí34,35. Para comparar un número elevado de

Med Integral 2002;39(5):207-15 213

Pérez del Molino ML, et al. Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

aislamientos se han desarrollado sistemas automatiza- genesis, protection and control. Washington, DC: ASM, 1994;
p. 85-110.
dos (fig. 1). 10. Gernoch PL, Enns RK, Sanbolle MA, Wallace RJ. Laboratory
El genoma de M. tuberculosis contiene, en general, un diagnosis of the mycobacterioses. Cumitech 16 AAS. In: Weiss-
número elevado y variable (5-20) de copias de la se- feld CO, editor. Washington, DC: ASM, 1994.
11. Pfluffer GE, Welscher HM, Kissling P, Cieslak C, Casal M, Gu-
cuencia de inserción IS6110, las cuales se encuentran tierrez J, et al. Comparison of the Mycobacteria growth indicator
en posiciones variables, lo que proporciona a este mar- tube (MGIT) with radiometric and solid culture for recovery of
acid-fast bacilli. J Clin Microbiol 1997;35:364-8.
cador un poder discriminativo elevado. Existe un proto- 12. Middleton AM, Chadwick MV, Gaya H. Evaluation of a comer-
colo estandarizado, y aceptado internacionalmente, que cial radiometric system for primary isolatión of mycobacteria
permite comparar los resultados obtenidos en diferentes over a fifteen-year period. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1997;
16:166-70 .
laboratorios, por lo que las bases de datos a gran escala 13. Casal M. Pruebas de resistencias a las drogas. En: Microbiología
permiten seguir la diseminación de todo el mundo36. En de las enfermedades por micobacterias (tuberculosis, lepra y
cepas con menos de 6 copias de IS6110 el poder es me- micobacteriosis). Córdoba: Ed. Universidad de Córdoba. 1991;
p. 133-50.
nor. Este marcador genético tiene como inconveniente 14. Vannier AM, Tarrand JJ, Murray PR. Mycobacterial cross conta-
la complejidad de la técnica y la necesidad de una can- mination during radiometric culturing. J Clin Microbiol 1988;26:
1867-8 .
tidad apreciable de ADN, por lo que se realiza sobre 15. Pfyffer GE, Welscher HM, Kissling P, Cieslak C, Casal MJ, Gu-
cultivos de micobacterias32. tierrez J, et al. Comparison of the Mycobacteria Growth Indica-
Las principales aplicaciones de la genotipificación de tor Tube (MGIT) with radiometric and solid culture for recovery
of acid-fast bacilli. J Clin Microbiol 1997;35:364-8 .
cepas de M. tuberculosis34-36 son: a) estudios epidemio- 16. Palaci M, Mizuka SY, Sato DN, Da Silva MA, Curcio M, Mat-
lógicos poblacionales; b) diferenciación entre recidiva heus EA. Evaluation of Mycobacteria Growth Indicator Tube for
recovery and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuber-
y reinfección exógena; c) control de la diseminación de culosis isolated from respiratory specimens. J Clin Microbiol
cepas multirresistentes, y d) detección de contamina- 1996;34:762-4 .
ciones cruzadas y otros errores del laboratorio. 17. Pfyffer GE, Cieslak C, Welscher HM, Kissling P, Rüsch-Gerdes
S. Rapid detection of mycobacteria in clinical specimens by
En la actualidad se están estudiando técnicas comple- using the automated BACTEC 9000 MB system and comparison
mentarias y alternativas, estudios de polimorfismo de la with radiometric and solid-culture systems. J Clin Microbiol
región DR mediante el análisis de los oligonucleótidos 1997;352:229-34 .
18. Zanetti S, Ardito F, Sanguinetti M, Molicotti P, Delogu G, Pinna
espaciadores (spoligotyping) y las técnicas de PCR ba- MP, et al. Evaluation of a nonradiometric (BACTEC 9000 MB)
sadas en iniciadores complementarios de secuencias re- for detection of mycobacteria in human clinical samples. J Clin
Microbiol 1997;35:2072-5 .
petidas, con el fin de encontrar técnicas más simples y 19. Tortoli E, Cichero P, Chirillo MG, Gismondo MR, Bono L, Gesu
que se puedan aplicar directamente sobre muestras clí- G, et al. Multicenter comparison of ESP Culture System II with
nicas38. BACTEC 460TB and with Löwenstein-Jensen medium for reco-
very of mycobacteria from different clinical specimens, inclu-
ding blood. J Clin Microbiol 1998;36:1378-81 .
Bibliografía 20. Reisner BS, Garson AM, Woods GL. Usxe of Gen-Probe Accu-
Probes to identify Mycobacterium avium complex, Mycobacte-
1. Laszlo A. Tuberculosis laboratories: the centerpiece of national rium tuberculosis complex, Mycobacterium kansasii, and Myco-
tuberculosis control programs. In: Reichman LB, Hershfield ES, bacterium gordonae directly from BACTEC TB broth cultures. J
editors. Tuberculosis. A comprehensive international approach, Clin Microbiol 1994;32:2995-8 .
2000; p. 95-105. 21. Folgueira L, Delgado R, Palenque E, Noriega AR. Detection of
2. Cañedo T. Cultivo e identificación de M. tuberculosis. En: Cañedo Mycobacterium tuberculosis DNA in clinical samples by using a
T, Gil A, Gómez E, Ortega A, editores. Madrid: ED9. Tuberculo- simple lysis method and polymerase chain reaction. J Clin Mi-
sis. Laboratorio y clínica. Publicaciones AEFA, 1986; p. 69-84. crobiol 1993;31:1019-21.
3. Casal M, Guerrero A, Martín N, Moreno S, Nogales MC. Diag- 22. Noordhoek GT, Kolk AHJ, Bjune G, Dale JW, Fine PEM, God-
nóstico microbiológico de las infecciones por micobacterias. En: frey-Fausse P, et al. Sensitivity and specificity of PCR for de-
Picazo J, editor. Madrid: Procedimientos en microbiología clíni- tection of Mycobacterium tuberculosis: a blind comparison
ca. Recomendaciones de la SEIMC, 1999. study among seven laboratories. J Clin Microbiol 1994;32:
4. Metchock BG, Nolte FS, Wallace RJ. Mycobacterium. In: Mu- 277-84.
rray PR, editor. Manual of Clinical Microbiology. Washington, 23. Piersimoni C, Callegaro A, Scarparo C, Penati V, Nista D, Bor-
DC: ASM, 1999; p. 399-437. nigia S, et al. Comparative evaluation of the new Gen-Probe
5. Martín Casabona N, González Fuente T. Control bacteriológico Mycobacterium tuberculosis amplified direct test andthe se-
del tratamiento. En: Vidal Pla R, March Ayuela P, editor. Trata- miautomated Abbott LCx Mycobacterium tuberculosis assay for
miento de la infección y enfermedad tuberculosa. Barcelona: direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in
Doyma, 1992; p. 85-92. respiratory and extrapulmonary specimens. J Clin Microbiol
6. Ausina V, Manterola JM, Padilla E. Nuevas perspectivas en el 1998;36:3601-4.
diagnóstico bacteriológico. En: Sauret Valet J, editor. Tuberculo- 24. Gamboa F, Fernández G, Padilla E, Manterola JM, Lonca J, Car-
sis.Visión actual, Barcelona: Grupo Aula Médica, 2001; p. 23-57. dona PJ, Matas L, et al. Comparative evaluation of initial and
7. Warren NG, Body BA. Bacteriología y diagnóstico. En: Ross- new versions of the Gen-Probe Amplified Mycobacterium Tu-
man MD, MacGregor RR, editor. Tuberculosis: asistencia clínica berculosis Direct Test for direct detection of Mycobacterium tu-
y nuevos desafíos. México: McGraw Hill Interamericana, 1996; berculosis in respiratory and nonrespiratory specimens. J Clin
p. 35-56. Microbiol 1998;36:684-9 .
8. Kent PT, Kubica GP. Public health mycobacteriology: a guide 25. Ausina V, Gamboa F, Gazapo E, Manterola JM, Lonca J, Matas
for the level III laboratory. Atlanta: US Centers for Disease Con- L, et al. Evaluation of the semiautomated Abbot LCx Mycobac-
trol, 1985. terium tuberculosis Assay for direct detection of Mycobacterium
9. Heifets LB, Good RC. Current laboratory methods for the diag- tuberculosis in respiratory specimens. J Clin Microbiol 1997;35:
nosis of tuberculosis. In: Bloom BR, editor. Tuberculosis. Patho- 1996-2002 .

214 Med Integral 2002;39(5):207-15

Pérez del Molino ML, et al. Diagnóstico microbiológico de la tuberculosis

26. Tortoli E, Lavinia F, Simonetti MT. Evaluation of a commercial 32. Coll P, March F. Epidemiología molecular de la tuberculosis. En:
ligase chain reaction kit (Abbott LCx) for direct detection of My- Sauret Valet J, editor. Tuberculosis. Visión Actual, Barcelona:
cobacterium tuberculosis in pulmonary and extrapulmonary spe- Grupo Aula Médica, 2001; p. 59-70.
cimens. J Clin Microbiol 1997;35:2424-6 . 33. Struelens MJ and members of ESGEM of the ESCMID. Con-
27. Gamboa F, Manterola JM, Lonca J, Matas L, Cardona PJ, Padilla sensus guidelines for appropiate use and evaluation of micro-
E, et al. Comparative evaluatión of two comercia assays for di- bial epidemiologic typing systems. Clin Microbiol Infect 1996;
rect detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory spe- 2:2-11.
cimens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1998;17:151-7. 34. Small PM, Van Embden JDA. Molecular epidemiology of tuber-
28. Reischl U, Lehn N, Wolf H, Naumann L. Clinical evaluation of culosis. In: Bloom BR, editor. Tuberculosis. Patogenesis protec-
the automated Cobas Amplicar MTB assay for testing respira- tion and control. Washington, DC: ASM, 1994; p. 569-82.
tory and nonrespiratory specimens. J Clin Microbiol 1998; 35. Van Emben JDA, Cave MD, Crawford JW, Dal JW, Eisenach
36:2423-9. KD, Giquel B, et al. Strain identification of M. tuberculosis by
29. Gamboa F, Manterola JM, Viñado B, Matas L, Giménez M, Lon- DNA fingerprinting: recommendation for standardized methodo-
ca J, et al. Direct detection of Mycobacterium tuberculosis com- logy. J Clin Microbiol 1993;31:406-9.
36. Centers for Disease Control. Transmission of multidrug resistan-
plex in nonrespiratory specinmens by Gen-Probe Amplified My-
ce tuberculosis among immunocompromosided persons in a co-
cobacterium Tuberculosis Direct Test. J Clin Microbiol 1997;35:
rrectional system. MMWR, 1992;41:507-9.
307-10. 37. Small P, McClenny N, Singh SP, Schoonik GK, Tompkins LS,
30. Gamboa F, Cardona PJ, Manterola JM, Lonca J, Matas L, Padilla Mickelsen PA. Molecular stain typing of M. tuberculosis to con-
E, et al. Evaluation of a comercial probe assay for detection of ri- firm cross-contamination in the mycobacteriology laboratiry and
fampin resistance in M. tuberculosis directly from respiratory modification of procedures to minimize occurrence of false posi-
and nonrespiratory clinicas samples. Eur J Clin Microbiol Infect tive cultures. J Clin Microbiol 1993;31:1677-82.
Dis 1998;17:189-92. 38. March F, Coll P, Costa R, Rodríguez P, Moreno C, Garrigó M, et
31. Centers for Disease Control. Meeting the challenge of multidrug- al. Utilidad de DR, PGRS y spoligotiping en la tipificación de M.
resistant tuberculosis; summary of a conference. MMWR 1992; tuberculosis. Comparación con IS6110. Enf Infec Microbiol Clin
41:51-7. 1996;14:160-6.

Med Integral 2002;39(5):207-15 215