Universidad de Guayaquil

Facultad de Ciencias Químicas

Carrera: Química y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio
Práctica#1 Determinación de lipoproteínas de alta densidad HDL Colesterol
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Nombre: Melissa Becerra Chávez Grupo: 3
Docente: Q.F. Dolores Erazo Código: 092
10.1. Objetivos de la práctica de Laboratorio

 Describir el principio y las precauciones del procedimiento analítico, que se utiliza para la
determinación cuantitativa de HDL y LDL colesterol en suero.

10.2. Instrucciones o consideraciones previas

Las lipoproteínas plasmáticas son partículas esféricas que contienen cantidades variables de colesterol,
triglicéridos, fosfolípidos y proteínas. Estas partículas solubilizan transportan el colesterol en el torrente
sanguíneo.

La función principal de las lipoproteínas de alta densidad o HDL en el metabolismo es la captación y

transporte de colesterol desde los tejidos periféricos al hígado en un proceso conocido como transporte
reverso de colesterol.

El HDL colesterol bajo, está asociado con un alto riesgo de enfermedad cardiaca. Por este motivo la
determinación de HDL colesterol es una herramienta útil en la identificación de individuos de alto riesgo.

10.2.1. Fundamento del método

Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan precipitando selectivamente las lipoproteínas de baja y
muy baja densidad (LDL y VLDL), mediante el agregado de sulfato de dextrán de PM 50.000 en presencia
de iones Mg++.

En el sobrenadante separado por centrifugación, quedan las HDL y se realiza la determinación de colesterol
ligado a las mismas, empleando el sistema enzimático Colesterol oxidasa/Peroxidasa con colorimetría
según Tinder (Fenol/4-Aminofenazona).

10.2.2. Intervalo de referencia

 El panel de expertos del National Cholesterol Education Program (NCEP) provee los siguientes
valores de HDL colesterol:

40 – 60 mg/dl

 Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.

10.3. Reactivos de Laboratorio

  Solución de sulfato de dextrán (PM 50.000) 0,032 mmol/l (Reactivo A).
 Solución de cloruro de magnesio 1.5 M (Reactivo B).
 Standard: solución de colesterol 200 mg/dl.
 Reactivo de trabajo:
Lipasa ≥ 6000 U/l
CHOD ≥ 60 U/l
POD ≥ 400 U/l
4-aminofenazona (A) 1,25 mmol/l
Fenol (B) 2,75 mmol/l
pH 7.4 ± 0,1 (a t° amb)
Agua destilada

 Según el volumen de trabajo colocar en una probeta 50 partes de agua destilada, 5 partes de
reactivo A, 5 partes de reactivo B y llevar a 100 partes con agua destilada. Agregar 2 partes de
reactivo C previamente homogenizadas. Mezclar por inversión, sin agitar. Rotular y fechar.

 Reactivo Precipitante: (A + B) preparación: en el frasco provisto, medir 2,5 ml. de Reactivo A y 2,5
ml. de Reactivo B. Mezclar por inversión y colocar fecha de preparación. Pueden prepararse
cantidades menores de acuerdo a las necesidades, respetando la proporción 1 + 1 para ambos
reactivos

10.4. Materiales de Laboratorio

 Pipeta automática de volumen variable (5-50 µl).

 Pipeta automática volumen variable (100-1000 µl).
 Pipeta graduada de 10 ml.
 Tubos de ensayo (12 x 100 mm).
 Gradilla.
 3 Cubetas de caras paralelas (1 cm).
 Reloj cronómetro.
 Probeta de 100 ml.
 Auxiliar de macropipeteado (0,1 – 100 ml).
 Punta para pipeta color amarillo (2-200 µl).
 Punta para pipeta color azul (50-1000 µl).
 Papel absorbente.

10.5. Equipos de Laboratorio

 Espectrofotómetro Uv-vis.
  Centrífuga.
 Baño de agua a 37° C.

10.6. Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

 En un tubo de Kahn medir 250ul de muestra, y agregar 25 µl de Reactivo precipitante. Homogenizar

agitando, (sin invertir) durante 20 segundos y dejar 30 – 40 minutos en refrigerador (2 – 10° C) o 15
minutos en baño de agua a la misma temperatura. No colocar en congelador. Centrifugar 15
minutos a 3.000 r.p.m. Usar 50 ul del sobrenadante límpido como Muestra.

 En tres tubos o cubetas espectrofotométricas marcadas B(Blanco) , S(Standard) , y

D(Desconocido) , colocar:

 Mezclar e incubar 15 minutos a 37°C. Retirar del baño y enfriar. Leer a 505 nm en
Espectrofotómetro Uv-vis o en fotocolorímetro con filtro verde (490 – 530 nm), llevando el aparato a
cero con el Blanco.

 El color de reacción final es estable 2 horas, por lo que la absorbancia debe ser leída dentro de ese
lapso.

10.7. Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras,
fotos)

 CÁLCULOS DE LOS RESULTADOS:

C st V FE V ℜ V s
F= × × ×
A e V M V Rs V E

VFE = volumen final de extracto = 0,55 ml

VM = volumen de muestra procesada = 0,5 ml
VRE = volumen de reacción con extracto= 2,1 ml
VRS = volumen de reacción con Standard = 2,02 ml
Vs = volumen de Standard en la reacción = 0,020 ml
VE = volumen de extracto en la reacción = 0,1 ml

 Si se emplean volúmenes de Reactivo diferentes de 2 ml el factor varia y debe ser calculado

nuevamente reemplazando en la formula VRE y VRS.
 Descripción Resultado
Fecha 5 de agosto de 2019
Identificación de la muestra Verónica Jardines
Edad 39 años
Hora inicio ensayo 3:00pm
Abb del blanco 0.000
Concentración del estandar 200mg/dl
Abb del estandar 0.424
Abb de la muestra 0.411
Hora de finalización del ensayo 3:50pm
Analista Melissa Becerra

Abb Mt
X C Patrón X Factor de dilución=C muestra
Abb Standar

1,023
X 52 ,5 mg x 2=103 , 48 mg/dl
1,038

10.8. Conclusiones (escribir las conclusiones generales en base a los objetivos planteados en la
actividad).
El resultado de este análisis se determinó que la concentración de HDL en suero, está por encima
de los valores referenciales (103,48 mg/d).
10.9. Recomendaciones (escribir las recomendaciones necesarias para mejorar la práctica).

 Equilibrar reactivos y muestras a temperatura ambiente.

 Los reactivos son para uso diagnóstico “in vitro”.

 Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química
clínica.

 Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a las leyes ambientales vigentes.

 Los reactivos provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento
indicada en la caja.

 Suero, libre de hemólisis.

 Las muestras deben ser preferentemente frescas.

 Las muestras de suero pueden conservarse hasta 12 horas en refrigerador (2-10 °C).

 El nivel del agua en el baño no debe ser inferior a de los reactivos en los tubos.

 La reacción es lineal hasta 500 mg/dl. Para valores superiores, diluir ½ con el Blanco y repetir la
lectura multiplicando el resultado final por 2.
  No se observan interferencias por bilirrubina hasta 200 mg/dl, ni hemólisis ligera (450 mg/dl) y
lipemia con una concentración aproximada de triglicéridos de 2000 mg/dl.

 La exactitud y precisión de la determinación dependen fundamentalmente de la observación de las

condiciones de precipitación, por lo que los tiempos y temperaturas establecidos, si bien no
requieren un control riguroso, deben ser respetados.

 Manipular con precaución los equipos.

 Medir correctamente las alícuotas indicadas.

 Rotular los tubos donde va a realizar las determinaciones.

 Durante el procedimiento leer cuidadosamente el inserto.

 Usar el equipo de protección adecuado.

10.10. Bibliografía

 Wiener Laboratorios S.A.I.C. HDL Colesterol. Wiener lab. Rosario-Argentina.

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Facultad de Ciencias Químicas
Carrera: Química y Farmacia
Guía de Prácticas de Laboratorio
Lab11 Determinación de triglicéridos en suero
11.1. Objetivos de la práctica de Laboratorio

 Describir el principio y las precauciones del procedimiento analítico, que se utiliza para la
determinación cuantitativa de triglicéridos en suero.

11.2. Instrucciones o consideraciones previas

Los Triglicéridos forman parte de las lipoproteínas y se dividen en exógenos y endógenos. Los triglicéridos
son lípidos absorbidos en la dieta y también producidos en forma endógena a partir de los carbohidratos.

Su medición es importante en el diagnóstico y manejo de las hiperlipidemias. Estas enfermedades pueden

tener origen genético o ser secundarias a otras tales como nefrosis, diabetes mellitus y disfunciones
endocrinas. El aumento de triglicéridos se ha identificado como un factor de riesgo en enfermedades
ateroescleróticas.

11.2.1. Fundamento del método

El esquema de reacción es el siguiente:

triglicéridos lipoprotein lipasa glicerol +ácidos grasos

→

glicerol+ ATP glicerol kinasa glicerol 1 fostato+ ADP

→

glicerol 1 fosfato+O 2 GPO H 2 O 2 +dihidroxiacetonafosfato

→

2 H 2 O 2 + 4 aminofenazona+clorofenol POD quinonimina roja

→

11.2.2. Condiciones de la reacción

11.2.3. Intervalos de referencia

11.3. Reactivos de Laboratorio

 Standard: solución de glicerol 2,26 mmol/L (equivale a 2 g/l de trioleína).

 Reactivos:

o Goods 50 mmol/l; pH 7,5

o Lipoprotein lipasa ≥ 800 U/l
o Glicerolkinasa ≥ 500 U/l
o Glicerol fosfato oxidasa ≥ 1500 U/l
o Peroxidasa ≥ 900 U/l
o 4-aminofenazona 0,4 mmol/l
o Clorofenol 2 mmol/l
o ATP 2 mmol/l

 Preparación del Reactivo de trabajo:

Reconstituir el contenido de un vial de Enzimas con una porción de Buffer y luego transferir al frasco
de Buffer enjuagando varias veces. Homogeneizar y fechar. Estable 30 días en refrigerador (2-10
°C).

11.4. Materiales de Laboratorio

 Pipeta automática de volumen variable (5-50 µl).

 Pipeta automática de volumen variable (100-1000 µl)
 Tubos de ensayo (12 x 100 mm).
 Gradilla.
 3 Cubetas de caras paralelas (1 cm).
 Reloj cronómetro.
 Punta para pipeta color amarillo (2-200 µl).
 Punta para pipeta color azul (50-1000 µl).
 Papel absorbente
11.5. Equipos de Laboratorio

 Espectrofotómetro Uv-vis.
 Baño de agua a 37° C.
11.6. Actividades por desarrollar/ técnica operatoria

 Marcar 4 tubos con B (Blanco), St (estándar), No. de muestra y SC (suero control).

Blanco Standard Muestra

Muestra 10ul
Reactivo 1ml 1ml 1ml
Standard 10ul

 Mezclar, incubar 5 min en baño de agua a 37 °C o 20 minutos a temperatura ambiente (18-25 °C).
Enfriar y leer en espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro (490-530 nm), ajustando el
equipo a cero con agua destilada. El color de la reacción es estable 60 minutos.

11.7. Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras,
fotos)
Descripción Resultado
Fecha 5 de agosto de 2019
Identificación de la muestra Claudia Rodríguez
Edad 60 años
Hora inicio ensayo 3:00pm
Abb del blanco 0.000
Concentración del estandar 200mg/dl
Abb del estandar 0.424
Abb de la muestra 0.411
Hora de finalización del ensayo 3:50pm
Analista Melissa Becerra

Abb Mt
X C Patrón=C muestra
Abb Standar

0 , 411 mg
X 200 =193 , 86 mg/dl
0 , 424 dl

11.8. Conclusiones (escribir las conclusiones generales en base a los objetivos planteados en la
actividad).
Los resultados de este análisis indica un valor casi normal a dudoso con una concentración de
193, 86 mg/ dl (patológico).
11.9. Recomendaciones (escribir las recomendaciones necesarias para mejorar la práctica).

 La muestra de suero debe estar preferentemente libre de hemólisis y preferentemente frescas.

Pueden conservarse hasta 3 días en refrigerador (2-10 °C). No congelar.

 Equilibrar reactivos y muestras a temperatura ambiente.

 Los reactivos son para uso diagnóstico “in vitro”.

 Utilizar los reactivos guardando las precauciones habituales de trabajo en el laboratorio de química
clínica.

 Todos los reactivos y las muestras deben descartarse de acuerdo a las leyes ambientales vigentes.

 Los reactivos provistos son estables a temperatura ambiente hasta la fecha de vencimiento
indicada en la caja.

 Lecturas del blanco superiores a 0,160 de absorbancia o lecturas del standard anormalmente bajas,
son indicios de deterioro del reactivo. En tal caso desechar.

 La reacción es lineal hasta 1000 mg/dl. Para valores superiores, diluir 1:2 con solución fisiológica y
repetir la lectura multiplicando el resultado final por 2.

 Los sueros con hemólisis intensa o marcadamente ictéricos producen resultados erróneos, por lo
que no deben ser usados.

 Manipular con precaución los equipos.

 Medir correctamente las alícuotas indicadas.

 Rotular los tubos donde va a realizar las determinaciones.

 Durante el procedimiento leer cuidadosamente el inserto.

 Usar el equipo de protección adecuada.

11.10. Bibliografía

 Wiener Laboratorios S.A.I.C. TG Color GPO/PAP. Wiener lab. Rosario-Argentina.