Fundamentos de la clonación y expresión de genes virales en Escherichia coli: producción de la

proteína-P del virus de la rabia como ejemplo práctico.

Fundamentals of viral gene cloning and expression in Escherichia coli: production of the rabies virus as a
practical example.

Nadia Yadira Castañeda1, Jaime E. Castellanos2, Jacqueline Chaparro-Olaya3*.

1. Unidad de Formación. Vicerrectoría de Investigaciones. Universidad El Bosque. Bogotá, Colombia.

2. Grupo de Virología. Vicerrectoría de Investigaciones. Universidad El Bosque. Bogotá, Colombia.
3. Laboratorio de Parasitología Molecular. Vicerrectoría de Investigaciones. Universidad El Bosque. Bogotá,
Colombia.

RESUMEN
La virología molecular estudia mecanismos moleculares de procesos virales fundamentales como la infección,
la replicación viral, el ensamblaje de nuevas partículas virales, la liberación desde las células hospederas y la
interacción de proteínas virales con las maquinarias celulares. El presente documento detalla los fundamentos
de la clonación y expresión de un gen viral en Escherichia coli, y está dirigido a estudiantes de ciencias básicas
o biomédicas, quienes necesiten entender los fundamentos teóricos de las técnicas de ADN recombinante. Se
describen aquí la amplificación por PCR del gen que codifica para la proteína-P de RABV (gen-p), la clonación
del gen-p en un vector de clonación, su sub-clonación en un vector de expresión y la producción de una
proteína-P recombinante. Se eligió como modelo a la proteína-P porque es un componente esencial de la
maquinaria de replicación y patogénesis de los virus de la familia Rhabdoviridae (que incluye a RABV), la cual
se ha postulado como un blanco importante para diseñar inhibidores de la replicación viral. Las técnicas de
ADN recombinante son actualmente fundamentales para mejorar las condiciones de salud mediante el
desarrollo de nuevas vacunas y productos farmacéuticos, además de que permiten diseñar mejores estrategias
de diagnóstico y nuevos enfoques terapéuticos.
Palabras clave: ADN recombinante, vectores de clonación, virus de la rabia, proteína P, proteínas
recombinantes.
ABSTRACT
Molecular virology studies the mechanisms of essential viral processes and contributes to understand
theoretical foundations and practical implications of viral pathogenesis. This manuscript aims to detail the basis
of viral gene expression in bacterial cells, using the gene coding for the rabies virus (RABV) phosphoprotein
(P-protein) as an example. This guide is intended for health sciences students who need to understand the
foundations of recombinant DNA techniques, a technology playing a vital role in biomedicine by direct
manipulation of genes and by improving the production of crucial proteins for research, diagnosis and
therapeutics. Because P-protein is essential for replication and pathogenic mechanisms in viruses of the
Rhabdoviridae family (which includes RABV), it has been considered as a key target for the design of viral
replication inhibitors. This guide describes the PCR amplification of the P-protein gene of RABV (p-gene) for its
insertion into a cloning vector, sub-cloning into an expression vector and the production of a recombinant P-
protein. These methodological approaches are central in the study of diseases caused by viruses and the
starting point in diagnostics, developing strategies for vaccines production, and treatments for different
conditions.
Key words: Recombinant DNA, Cloning Vectors, Rabies Virus, P-Protein, Recombinant Proteins

INTRODUCCION
Las herramientas de biología molecular, incluyendo la bioinformática y las ciencias “omicas” (genómica,
transcriptómica, proteómica, metabolómica, epigenómica, metagenómica, etc.), son fundamentales para
enfrentar muchos desafíos de la investigación biomédica. De hecho, la medicina no se practicaría como se hace
actualmente si no fuera por los avances en estas disciplinas. Dentro de las técnicas de biología molecular, una
de las más empleadas es la producción de proteínas recombinantes, las cuales son herramientas valiosas en
la investigación básica de los virus con relevancia clínica. Este documento está dirigido a estudiantes de
ciencias básicas y ciencias biomédicas, a quienes serán presentados los fundamentos de las técnicas de ADN
recombinante a través de uno de los modelos estudiados por los autores [1-4]. El manuscrito describe en
detalle la producción de una proteína recombinante del virus de la rabia (RABV), el cual causa en humanos

1
una enfermedad neurológica aguda con una tasa de letalidad del 100% [5-6]. La proteína modelo es la
proteína-P, la cual ha sido propuesta como un blanco prometedor para el desarrollo de estrategias antivirales
debido a que es esencial durante la replicación viral y la evasión viral de la respuesta inmune del hospedero
[7].

FUNDAMENTOS
En su definición más simple, los clones son un conjunto de fragmentos de ADN idénticos, obtenidos a partir de
una secuencia original. Sin embargo, como un gen aislado no puede auto-multiplicarse, debe ser introducido
(clonado) en una molécula transportadora que sí tiene capacidad de replicarse. A esa molécula se le conoce
con el nombre de vector, palabra que significa "el que transporta". Una vez que el gen de interés ha sido
clonado en el vector, la molécula resultante (denominada constructo o plásmido recombinante) es introducida
en una célula (generalmente una bacteria) para multiplicar el material clonado y en algunos casos, iniciar la
expresión de la proteína codificada por ese gen. A este proceso de expresar material genético de un organismo
en otro, se le conoce como expresión heteróloga.
Material genético a clonar
Actualmente hay una gran variedad de métodos y kits comercializados por diferentes fabricantes para extraer
y purificar material genético (ADN genómico, ADN de organelos, ADN de plásmidos o diferentes tipos de ARN)
de tejidos, cultivos celulares, organismos aislados o muestras biológicas. También hay protocolos clásicos de
extracción de ADN y ARN que por lo general involucran la eliminación de proteínas y la posterior precipitación
etanólica de los ácidos nucleicos [8]. Otros protocolos convencionales purifican los ácidos nucleicos con base
en características fisicoquímicas como la afinidad a moléculas inmovilizadas en matrices, su densidad diferencial
(que permite separarlos de otras moléculas por centrifugación) o sus dinámicas de denaturación y solubilidad
(que los precipita o no en diferentes soluciones) [9].
Reacción en cadena de la polimerasa: PCR
El gen-p de RABV tiene aproximadamente 900 nucleótidos y está dentro de un genoma de casi 12.000
nucleótidos. Para tener copias suficientes del gen-p, y solo de este gen, se hace una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR por sus siglas en inglés), la cual actúa como una “fotocopiadora molecular” y produce millones
de copias de la secuencia de interés [10]. Por otro lado, el genoma de RABV es una cadena de ARN y la PCR
solo puede usar ADN como plantilla. Así, el primer paso es extraer el ARN de la muestra y someterlo luego a
una transcripción reversa para obtener ADN complementario (ADNc). Para este proceso se usan unas enzimas
denominadas transcriptasas reversas, ya que contrario al clásico proceso de transferir la información genética
del ADN al ARN, estas polimerasas usan plantillas de ARN para sintetizar moléculas de ADN [11].
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son “tijeras moleculares” que reconocen secuencias específicas sobre el ADN y de
ese modo, hacen cortes sólo en el lugar en el que se presenta una determinada secuencia de nucleótidos [12].
Por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de corte de la enzima Eco RI es 5’GAATTC 3’ y, por tanto, Eco RI
solo puede cortar el ADN si encuentra esos seis nucleótidos en ese orden exacto. Algunas de estas enzimas
cortan la cadena doble de ADN en posiciones equivalentes generando extremos romos; es decir, extremos en
donde todas las bases están apareadas. Otras en cambio, cortan la doble hélice dando lugar a extremos en los
que sobresale una de las cadenas. Estos extremos de ADN con hebras sencillas “sobresalientes”, son conocidos
como extremos cohesivos. Como se verá adelante, las enzimas de restricción son fundamentales en el proceso
de clonación.
Vectores genéticos
Una vez amplificado el fragmento de ADN de interés, este debe insertarse en un vector. Por esta razón, a ese
ADN se le conoce como “inserto”. El proceso de unir inserto y vector de manera covalente se denomina ligación
y se lleva a cabo mediante una enzima ADN-Ligasa. Dentro de los vectores que pueden usarse están los
plásmidos (pequeñas moléculas circulares de ADN de origen bacteriano), los bacteriófagos (virus que infectan
naturalmente bacterias), los cósmidos (híbridos constituidos por ADN de un plásmido y de un bacteriófago),
los cromosomas artificiales bacterianos o BAC (que pueden recibir insertos de hasta 300.000 pares de bases)
y los cromosomas artificiales de levadura o YAC (que aceptan insertos de hasta un millón de pares de bases)
[13]. Este documento se centrará en el uso de los plásmidos, los cuales son los vectores más frecuentemente
usados en los procesos de clonación.
Los plásmidos pueden ser vectores de clonación y vectores de expresión. Los primeros se usan para obtener
grandes cantidades de un ADN de interés, mientras que los vectores de expresión se usan para producir
proteínas recombinantes. Como parte de su estructura, todos los vectores tienen un origen de replicación (lo

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que les da capacidad de multiplicarse dentro de la célula que los aloja), una región de clonación múltiple o
“polylinker” (una pequeña región que contiene sitios de reconocimiento para varias enzimas de restricción) y
uno o más marcadores de selección (los cuales permiten identificar a las células que incorporaron el vector.
Puede ser por ejemplo un gen de resistencia a un antibiótico o un gen que conduzca a la producción de color
o fluorescencia). Si se trata de un vector de expresión, adicionalmente tendrá señales de iniciación de la
transcripción y de la traducción, para hacer posible la síntesis de la proteína recombinante [13]. Adicionalmente,
algunos vectores de expresión permiten inducir a voluntad la expresión de la proteína, lo cual se logra gracias
a que llevan secuencias conocidas como “promotores inducibles”. Un ejemplo son los promotores inducibles
con IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranósido). En estos sistemas, la expresión del gen de interés se mantiene
apagada debido a que un represor bloquea la región promotora de la transcripción del gen. Sin embargo,
cuando se agrega IPTG, este inductor se une al represor, el cual deja libre al promotor y le permite interactuar
con la ARN Polimerasa para iniciar la transcripción y dar lugar a la síntesis de la proteína recombinante [14].
Estrategia de clonación
Dentro de la gran oferta comercial de vectores de clonación y expresión, en este manuscrito se describe el uso
del vector de clonación pGEM-T (Promega) y del vector de expresión PinPointTMXa1 (Addgene). El vector pGEM-
T se aprovecha de una característica de ciertas ADN polimerasas, las cuales agregan una adenina desapareada
en los extremos 3’ del ADN amplificado en el PCR (fig. 1). A su vez, pGEM-T es una molécula lineal que contiene
una timina desapareada en los extremos 5’, lo cual proporciona una saliente complementaria para los extremos
3’ del ADN amplificado (fig. 1). Además, el vector contiene la secuencia del gen Ampr (en amarillo en la fig. 1),
el cual codifica para una enzima responsable de la resistencia a los antibióticos betalactámicos: la β-lactamasa.
De ese modo, si se adiciona ampicilina al medio de cultivo, solo crecerán las bacterias que incorporaron el
vector. Por otro lado, pGEM-T está diseñado para que el inserto interrumpa la secuencia del gen lacZ (en azul
en la fig. 1), el cual codifica para la enzima β-galactosidasa. Este sistema de selección funciona al agregar X-
gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-galactopiranósido) al medio de cultivo, ya que la β-galactosidasa lo hidroliza
y produce un precipitado azul que colorea a las bacterias. Así, si las colonias que crecen son blancas, se puede
establecer que no hay síntesis de β-galactosidasa porque el inserto interrumpió al gen lacZ. En el caso opuesto,
las colonias son azules porque no hay inserto y el gen lacZ es funcional; es decir, sintetiza la enzima.
Por su parte, el vector PinPointTMXa1 está diseñado para que la proteína de interés quede marcada con una
“bandera” (o “tag”) de biotina, la cual permite identificar a la proteína recombinante con conjugados de
estreptavidina/fosfatasa alcalina o de estreptavidina/peroxidasa. La estreptavidina se une con gran afinidad a
la biotina y las enzimas a las que está acoplada catalizan reacciones que liberan luz o forman precipitados
coloreados. Esto permite identificar a la proteína recombinante dentro de una mezcla compleja de proteínas.
Otra ventaja de la bandera de biotina es que la recombinante producida se puede purificar por cromatografía
de afinidad al usar perlas de agarosa cubiertas con proteínas que tienen gran afinidad por la biotina (como la
avidina). Esto hace que la proteína de interés se una a la superficie de las perlas y pueda ser fácilmente
purificada por centrifugación. De esta manera, aunque se tenga un extracto bacteriano muy complejo, se
puede recuperar solo a la proteína recombinante por su bandera de biotina.

Figura 1. Estrategia de clonación en el vector

pGEM-T
Vectores como pGEM-T tienen una timina
desapareada en los extremos 5’, la cual proporciona
una saliente complementaria para la adenina
desapareada que algunas polimerasas agregan en los
extremos 3’ durante el PCR (en rojo). El gen Ampr (en
amarillo) codifica para una enzima responsable de la
resistencia a ampicilina y permite hacer selección de
las bacterias en medios con este antibiótico. El vector
está diseñado para que el inserto interrumpa la
secuencia del gen lacZ (en azul), el cual codifica para
la enzima β-galactosidasa y hace posible la
discriminación de bacterias transformadas por
selección de colonias blancas y azules.

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Transformación de Escherichia coli
Dependiendo del objetivo que se persiga, los plásmidos pueden ser introducidos en bacterias (proceso conocido
como transformación) o en células eucariotas (proceso conocido como transfección). En el caso de las
bacterias, una condición obligatoria para la transformación es la “competencia”, término que hace referencia
a la capacidad de las bacterias de interiorizar ADN foráneo. Para E. coli, la especie bacteriana más usada en
los ensayos de clonación, su competencia natural es muy baja y hay que hacer un tratamiento químico previo
para producir bacterias competentes (que permitan la entrada del plásmido). Posterior a ese proceso, la
transformación se puede hacer por choque térmico o por electroporación y en ambos casos, el objetivo es
crear poros transitorios en la membrana celular [15-17].

MATERIALES Y MÉTODOS
Extracción de ARN viral y síntesis de ADNc
Se extrajo y purificó ARN de cerebro de ratón infectado con RABV (cepa CVS-11) usando Trizol (Tiocianato de
guanidinio-fenol-cloroformo) (Invitrogen) (fig. 2A). Luego, el ARN extraído se usó en una reacción de
transcripción reversa usando un “primer” oligo-d (T) y la transcriptasa reversa M-MLV RT (Promega) (fig. 2B).
Ensayo de PCR para amplificar el gen-p
Las condiciones de la reacción de PCR fueron 2 mM de MgCl2; 0,2 mM de dNTPs; 1 µM de cada “primer” y 0,5
unidades de ADN polimerasa (GoTaq® DNA Polymerase. Promega). Como plantilla se usó el ADNc obtenido.
El programa de amplificación para el gen-p consistió de una denaturación inicial de 2 minutos a 94°C, seguido
de 30 ciclos de amplificación (45 segundos a 94°C; 1,5 minutos a 65°C y 1 minuto a 72°C) y una extensión
final de 3 min a 72°C (fig. 2C). Los oligonucleótidos o “primers” usados se diseñaron con el programa
bioinformático Primer3 (https://primer3.ut.ee/), con base en la secuencia del gen-p de RABV (cepa CVS-11)
(NCBI, X55727) y se le añadió a cada uno una secuencia de 6 nucleótidos (en negrita abajo) para el
reconocimiento de las enzimas de restricción seleccionadas. Los “primers” sintetizados por IDT (Integrated
DNA Technologies. Iowa, Estados Unidos) fueron nombrados PF-KpnI: 5’- C-GGTACC-ATG-AGC-AAG-ATC-
TTT-GTT-AAT-C-3’ (“primer” sentido) y PR-SmaI: 5’-AT-CCCGGG-TCG-GGT-TAG-CAG-GAT-GTA-TAG-C-3’
(“primer” antisentido). Las secuencias KpnI y SmaI se usaron para poder liberar el inserto del pGEM-T y luego
dirigir la subclonación en el vector de expresión.
Clonación: Construcción del vector recombinante pGEM/gen-p
El producto de PCR obtenido fue sometido a electroforesis en agarosa y purificado desde el gel con el kit
QIAquick Gel Extraction (QIAGEN). A continuación, el producto fue cuantificado por espectrofotometría y
clonado en el vector pGEM-T (Promega). La reacción de ligación se hizo con la enzima ADN-Ligasa (Promega)
(fig. 2D) y se incubó a 4ºC durante 16 horas. Al producto de ligación obtenido (el plásmido pGEM-T más el
inserto) se le mencionará de aquí en adelante como constructo pGEM/gen-p.
Transformación de Escherichia coli
El constructo pGEM/gen-p obtenido fue usado para transformar bacterias E. coli de la cepa JM109 por choque
térmico (fig. 2E). Inmediatamente después, las bacterias fueron incubadas una hora a 37°C en medio LB (Luria-
Bertani) al que se añadió ampicilina a una concentración final de 100 µg/ml (de aquí en adelante, LB/Amp).
Luego, la suspensión bacteriana se sembró en cajas de Petri con LB/Amp agar al que se añadió 80 µg/mL de
X-gal e IPTG (100 µM). Al día siguiente, se seleccionaron diez colonias blancas y se hizo repique (copia) de
cada una de ellas en una nueva caja de Petri con LB/Amp agar.

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 Figura 2. Estrategia de Clonación
(A) Se extrajo y purificó el ARN del cerebro
de un ratón infectado con RABV. (B) El ARN
obtenido se usó para hacer transcripción
reversa. (C) El ADN complementario
sintetizado se usó como plantilla en un
ensayo de PCR para amplificar el gen-p de
RABV. (D) El producto de PCR fue
purificado y se clonó en el vector pGEM-T
usando ADN-Ligasa. (E) El constructo
pGEM/gen-p fue usado para transformar
bacterias E. coli, que fueron luego
cultivadas en cajas de Petri con LB-agar en
presencia de ampicilina. (F) Finalmente, se
seleccionaron al azar algunas de las
colonias que crecieron y se confirmó la
presencia e identidad del inserto por PCR y
secuenciación.

Confirmación de la identidad del inserto por PCR y secuenciación

Una vez elegidas al azar colonias blancas de E. coli, una porción de cada una de ellas fue resuspendida en 50
µl de agua desionizada estéril e incubada a 98°C durante 10 minutos. Cinco microlitros de esta mezcla fueron
usados como plantilla para una reacción de PCR como se describió antes (usando los “primers” PFKpnI y
PRSmaI). Los productos de PCR fueron cargados en geles de agarosa, sometidos a electroforesis y visualizados
bajo luz ultravioleta después de sumergir el gel durante 15 minutos en una solución de bromuro de etidio. Una
colonia se identificó como positiva si en el gel se observaba un producto de PCR del tamaño esperado (914
pb). Una vez identificadas, una porción de cada colonia positiva se destinó para obtener un cultivo bacteriano
líquido, el cual se usó para extraer y purificar el ADN del constructo pGEM/gen-p por lisis alcalina (Wizard®
Plus SV Minipreps DNA Purification System. Promega). El ADN plasmídico de dos colonias elegidas al azar se
cuantificó por espectrofotometría y un alícuota se envió a MWG Biotech (Estados Unidos) para hacer
secuenciación en ambos sentidos (de la cadena sentido y de la cadena antisentido). El ADN restante se
almacenó a -20°C hasta su uso.
Subclonación: Construcción del vector recombinante PinPoint/gen-p
Como los “primers” usados para obtener copias del gen-p contenían las secuencias de corte de las enzimas
KpnI y SmaI, el producto de PCR que se clonó en pGEM-T tenía la secuencia de reconocimiento para KpnI en
un extremo y para SmaI en el otro. Por eso, el gen-p se liberó del constructo pGEM/gen-p cortando con estas
dos enzimas (fig. 3A) y se introdujo luego (subclonó) en el vector de expresión PinPointTM Xa-1, el cual había
sido previamente digerido también con KpnI y SmaI. Cortar vector e inserto con las mismas enzimas creó
extremos cohesivos que luego se unieron por complementariedad y se ligaron con ADN-Ligasa (fig. 3B). A este
nuevo constructo se le llamó constructo PinPoint/gen-p y fue usado para transformar bacterias E. coli JM109.
Las bacterias fueron sembradas en cajas de Petri con LB/Amp agar para seleccionar colonias positivas por PCR
como se describió antes para el constructo pGEM/gen-p (fig. 3C). Luego, para inducir la expresión de la

5
proteína-P, una de las colonias positivas fue cultivada en medio LB/Amp al cual se adicionó el inductor IPTG
(100 µM).
Expresión e identificación de la proteína-P recombinante
Cuatro horas después de la inducción con IPTG, 100 µl del cultivo bacteriano fueron transferidos a un microtubo
de 2 ml y se centrifugó a 10.000 x g durante 5 minutos. El precipitado o pellet de bacterias fue resuspendido
en 50 µl de buffer Laemmli (0.0625 M de Tris-HCl (pH 6.8); 2% de SDS; 10% de glicerol; 5% de 2-
mercaptoetanol y 0.01% de azul de bromofenol) y se incubó a 95°C por 5 minutos. Este tratamiento lisa las
células, elimina las estructuras protéicas tridimensionales causadas por puentes disulfuro y carga
negativamente a las proteínas, lo cual permite separarlas por su tamaño en el campo eléctrico que se genera
durante la electroforesis (fig. 3D). Luego, 5 µl de cada muestra fueron cargados en un gel de poliacrilamida
(12%) para un ensayo SDS-PAGE (por sus siglas en inglés sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis). Se cargó también un marcador de peso molecular, el cual consiste de una mezcla de proteínas
de tamaños conocidos que permite establecer el tamaño de la proteína de interés por comparación.

Figura 3. Estrategia de subclonación en el

vector de expresión.
(A) El inserto se liberó del constructo
pGEM/gen-p cortando con las enzimas KpnI y
SmaI. (B) El inserto liberado se subclonó en
el vector PinPointTM Xa-1, el cual había sido
digerido también con las enzimas KpnI y
SmaI. Esto creó extremos cohesivos
(complementarios) entre vector e inserto, los
cuales fueron ligados con ADN-Ligasa. (C)
Bacterias E. coli fueron transformadas con el
constructo PinPoint/gen-p y cultivadas en
presencia de ampicilina. Se eligieron algunas
colonias y se confirmó la presencia del inserto
por PCR. Una colonia positiva fue puesta en
cultivo y se indujo la expresión de la proteína-
P recombinante agregando IPTG. (D) Horas
después, una alícuota del cultivo se transfirió
a un tubo, se centrifugó y el pellet bacteriano
se trató con buffer Laemmli. (E) La muestra
se cargó en un gel de poliacrilamida y las
proteínas fueron separadas por SDS-PAGE y
transferidas a una membrana de PVDF. Se
incubó con estreptavidina/fosfatasa alcalina y
NBT-BCIP para revelar a la proteína-P
recombinante en la membrana como una
banda de color púrpura. (F) Finalmente, se
hizo un cultivo bacteriano a gran escala, se
indujo la expresión con IPTG, se recuperaron
las bacterias por centrifugación, se lisaron y la
proteina-P biotinilada se purificó por afinidad
usando la resina de avidina.

A continuación, las proteínas fueron transferidas a una membrana de fluoruro de polivinilideno (un polímero
termoplástico conocido como PVDF) haciendo un montaje de “sándwich” gel:membrana que se sometió a 30V
durante 16 horas. Para reconocer la proteína-P biotinilada sobre la membrana PVDF, se hizo primero una
incubación con estreptavidina acoplada a fosfatasa alcalina durante 30 minutos a temperatura ambiente, y
luego se agregó NBT (nitro azul de tetrazolio) y BCIP (5-bromo 4-cloro 3'-indolil fosfato). Estos dos compuestos
son sustrato y cromógeno para la enzima fosfatasa alcalina y permiten identificar a las proteínas biotiniladas

6
como bandas de color púrpura en la membrana (fig. 3E). Una vez que la proteína de interés fue detectada, se
procedió a hacer un cultivo bacteriano a gran escala (un litro de cultivo), se indujo la expresión de la proteína
recombinante con IPTG, se hizo lisis celular y finalmente purificación de la proteína-P biotinilada por afinidad
usando la resina de avidina (fig. 3F).

RESULTADOS
Amplificación del gen-p por PCR y clonación en el vector pGEM-T
El gen-p obtenido por PCR fue clonado en pGEM-T. Luego, se tranformaron bacterias con este constructo
pGEM/gen-p y tras cultivarlas en medio LB/Amp, se hizo selección de colonias positivas por PCR. Dos colonias
positivas fueron elegidas a la azar para hacer extracción de ADN plasmídico, el cual fue enviado a un servicio
de secuenciación (MWG Biotech). Las secuencias provenientes de las dos colonias fueron idénticas entre sí
(NCBI DQ011221), y al compararlas con la secuencia patrón (la secuencia del gen-p de RABV, cepa CVS-11.
NCBI, X55727), se confirmó que el inserto clonado era el gen-p de RABV.
Subclonación en el vector PinPointTMXa1
El gen-p fue liberado eficientemente del constructo pGEM/gen-p por restricción enzimática con Kpn I y Sma I.
La figura 4A muestra al constructo pGEM/gen-p antes de la restricción y la figura 4B el resultado de la digestión
en donde son evidentes la banda de  3000 pb que corresponde al vector pGEM y la banda de  900 pb que
corresponde al inserto (gen-p). A continuación, el inserto liberado fue ligado al vector de expresión
PinPointTMXa1 y bacterias E. coli (cepa JM109) fueron transformadas con este nuevo constructo PinPoint/gen-
p. Diez colonias fueron elegidas al azar para hacer PCR con los “primers” específicos PF-KpnI y PR-SmaI y
confirmar la presencia del inserto. La colonia que mostró el producto de PCR más evidente en el gel de agarosa
fue seleccionada para hacer el cultivo bacteriano y la inducción de la expresión de la proteína-P. Finalmente,
se hizo copia de esta colonia en medio LB y glicerol (20%) y fue almacenada a - 80ºC. De ese modo se
garantizó la disponibilidad permanente del material genético de interés.
Producción y detección de la proteína-P recombinante
Escherichia coli sólo sintetiza una proteína biotinilada que es detectada como una proteína de 22,5 kDa (La
proteína BCCP por sus siglas en inglés, “Biotin carboxy carrier protein”) [18]. Así, en los lisados de bacterias
que no fueron transformadas, solo se detectó la proteína BCCP (fig. 4D, carril 5), mientras que en el sistema
control en el que las bacterias se transformaron con el vector PinPointTMXa1 sin inserto, sólo se observó la
banda correspondiente a la proteína BCCP y la banda de 13 kDa del péptido biotinilado del vector (fig. 4D,
carril 1). Por otro lado, en los lisados de bacterias transformadas con el constructo PinPoint/gen-p, aparecieron
simultáneamente la proteína de 13 kDa, la de 22,5 kDa y la proteína recombinante biotinilada de  50 kDa (fig.
4D, carriles 2, 3 y 4). Esta última correspondía a la proteína de fusión conformada por la proteína-P de 37 kDa
y el péptido biotinilado de 13 kDa. Además de la proteína recombinante esperada, se detectaron otras proteínas
biotiniladas de menor tamaño (entre  35 kDa y 45 kDa), las cuales corresponden a lo que se conoce como
formas truncadas de la proteína-P (fig. 4D, carriles 2, 3 y 4).

7
Figura 4. Subclonación y detección de la proteína-P recombinante.
(A y B) Digestión del constructo pGEM/gen-p para liberar el inserto. Electroforesis en geles agarosa
(1,5%) teñidos con bromuro de etidio. (A) Carril 1: marcador de peso molecular (Invitrogen™ 1 Kb DNA
Extension Ladder). Carril 2: Constructo pGEM/gen-p sin digerir. (B) Carril 1: Marcador de peso molecular
(100bp DNA Ladder. Promega). Carril 2: digestión del constructo pGEM/gen-p con las enzimas KpnI y SmaI.
Se observa el vector vacío (flecha superior) y el inserto liberado (fecha inferior), el cual fue subclonado en
PinPointTMXa para dar lugar al constructo PinPoint/gen-p. (C) Detección de la proteína-P recombinante.
Después de transformar bacterias E. coli con el constructo PinPoint/gen-p, se indujo expresión de la proteína-
P recombinante. Las bacterias se lisaron y los extractos fueron sometidos a SDS-PAGE y transferencia a
membrana de PVDF. Carril 1: Lisado de bacterias transformadas con el vector PinPointTMXa1 vacío (sin
inserto). Carriles 2, 3 y 4: Lisado de bacterias transformadas con el constructo PinPoint/gen-p. La banda de 50
kDa corresponde a la proteína-P recombinante biotinilada, la banda de 22,5 kDa corresponde a la única proteína
naturalmente biotinilada de E. coli (proteína BCCP) y la banda de 13 kDa es la bandera biotinilada del vector.
Carril 5: Lisado de bacterias no transformadas.

DISCUSION
Muchos estudios básicos y desarrollos biotecnológicos dependen de la producción de proteínas recombinantes
en sistemas de expresión heterólogos (células eucariotas, levaduras y bacterias). Dentro de ellos, el más usado
sigue siendo E. coli, debido a que esta bacteria es de muy fácil manipulación, se multiplica en corto tiempo y
su mantenimiento es económico. Además, por lo general, muchas de las proteínas recombinantes pueden ser
expresadas en altos niveles sin que esto sea tóxico para la bacteria. Aun así, el sistema tiene limitaciones como
por ejemplo la formación de cuerpos de inclusión (la sobre expresión de proteínas en la bacteria hace que
ocasionalmente estas formen complejos insolubles que se precipitan y de los cuales es difícil purificar la proteína
recombinante), la eventual toxicidad y la falta de modificaciones postraduccionales que puede llevar a la
inactividad de las proteínas producidas. Sin embargo, los constantes desarrollos biotecnológicos han llevado a
la producción de cepas de E. coli genéticamente modificadas para contrarrestar esas dificultades [19-21].
En el presente trabajo, E. coli fue un sistema de expresión económico, sencillo y eficiente para la producción
de la proteína-P recombinante de RABV. Aunque se obtuvieron también varias proteínas-P truncadas (fig. 4C,
carriles 2, 3 y 4), esto no fue inesperado pues se sabe que los genes P de rabdovirus codifican para más de
una proteína [22]. Específicamente para RABV, hay cuatro formas truncadas de la proteína-P conocidas como
P2, P3, P4 y P5 [22]. Estas proteínas más cortas son sintetizadas desde cuatro codones de inicio alternos y
tienen diferente ubicación celular. Las proteínas P3, P4 y P5 están localizadas en el núcleo, mientras que las
proteínas P-completa y P2 tienen una distribución citoplasmática que obedece a una señal de exportación
nuclear [23]. La función de estas proteínas aún no está completamente definida, pero se ha visto que las
formas P3, P4 y P5 interactúan con cuerpos nucleares que podrían participar en un mecanismo de defensa
celular contra la infección viral [24]. Recientemente, se ha propuesto que P5 tiene un papel en la modulación
de la replicación de RABV [25].

Por otro lado, la secuencia del gen-p clonado permitió obtener la secuencia teórica de la proteína-P
recombinante y confirmar que era casi idéntica a la de la proteína-P patrón (NCBI, X55727). Entre ellas, sólo
hubo cambio de aminoácidos en cinco posiciones, lo cual representó menos del 1% de diferencia entre ambas
secuencias. Una posible explicación para esta divergencia podrían ser mutaciones causadas por los múltiples
pasajes en cerebro de ratón a los que el virus fue sometido en el laboratorio antes de hacer estos experimentos.
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Es posible entonces que la diferencia encontrada en los cinco aminoácidos mencionados anteriormente, haya
sido favorecida por el modelo biológico que se usó (ratón) para obtener y multiplicar el virus.
Finalmente, cabe mencionar que aunque BCCP es una proteína de 16,7 kDa, se observó como una proteína de
22kDa (fig. 4C). Este comportamiento ha sido descrito por otros autores y parece deberse a la riqueza de
residuos prolina y alanina [18]. Señalamos este aspecto porque subraya la necesidad de conocer, hasta donde
sea posible, las características básicas de la proteína en estudio; no sólo para interpretar correctamente los
resultados, sino también para hacer elecciones críticas sobre las estrategias metodológicas que permitirán
producir una proteína recombinante de interés.

Este documento mostró la utilidad que la tecnología del ADN recombinante puede tener en el estudio de
agentes causantes de enfermedades humanas. A partir de la aplicación de este protocolo de clonación y
expresión de un gel viral, se hizo la expresión de una proteína-P recombinante que fue usada en estudios
posteriores para producir un anticuerpo [26] y evaluar la expresión y distribución de esta proteína en neuronas
sensoriales infectadas con RABV [27] Otro uso de las proteínas-P recombinantes nació al observar que la
disfunción mitocondrial podía generar especies reactivas de oxígeno (ROS), las cuales promovían las lesiones
neuronales que suceden durante la infección por RABV [28]. El estudio diseñó varias proteínas recombinantes
que correspondían a distintas regiones de la proteína-P y descubrió que una región específica, interactuaba
directamente con el Complejo I mitocondrial y desempeñaba un papel importante en la generación de ROS.
Este descubrimiento llevó a plantear que los avances en la terapia de otros trastornos causados por disfunción
mitocondrial, también podrían resultar aplicables a la infección por RABV [29].

AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a Laura Navarro-Saiz del Grupo IBAPO (Investigaciones Básicas y Aplicadas en Odontología) de
la Universidad Nacional de Colombia, por el diseño y elaboración de las figuras 2 y 3 del presente artículo.
Agradecemos también a Liliana Morales del Laboratorio de Parasitología Molecular de la Universidad El Bosque,
por el diseño y preparación de las figuras 1 y 5.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran no tener conflicto de intereses relacionado con el trabajo aquí presentado.

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