Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Vicerrectoría de Docencia
Dirección General de Educación Superior Facultad de Ciencias Biológicas

PLAN DE ESTUDIOS (PE): Licenciatura en Biología

ÁREA: Biología Animal y Zoología

ASIGNATURA: Manual de laboratorio de la asignatura Biología de Organismos

Unicelulares

CÓDIGO: BIOM-008

CRÉDITOS: 8

Fecha de elaboración: enero del 2017

Fecha de actualización: febrero 2022.

Trabajo colegiado de los profesores

DRA. DALIA MOLINA ROMERO

BIÓL. RAÚL ROJAS GARCÍA
DR. DANIEL SIHUANCA MENDOZA
Protocolos de ingreso, estancia y seguridad en el laboratorio

A. Ingreso y permanencia personal

1) Bata de laboratorio
2) Zapato cerrado.
3) Pantalón largo.
4) Cabello recogido.
5) Uñas cortas.
6) Libre de accesorios corporales expuestos (anillos, arete largo, pulseras,
reloj).

B. Conducta
✓ Mantenga el área de trabajo libre de alimentos, bebidas u otro elemento
ajeno a la práctica.
✓ Concéntrese en su trabajo individual, de colaboración en equipo y grupal.
✓ Comunique a tiempo sus dudas, comentarios y advertencias.
✓ Use su celular exclusivamente como apoyo durante la práctica.

C. Contingencia covid-19
✓ Portar en todo momento el cubrebocas
✓ Mantener en lo posible la sana distancia
✓ Si necesita acercarse, evite la comunicación oral de frente
✓ Realice el lavado de manos y uso de gel antibacterial en la frecuencia y
momentos que así lo considere
 PRÁCTICA I

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACIÓN

Los microorganismos requieren nutrientes apropiados, así como condiciones

ambientales que favorecen su proliferación. En el laboratorio se han diseñado los
medios de cultivo formulados con nutrientes necesarios para el desarrollo de
diversos microorganismos. Estas soluciones contienen una fuente de carbono,
necesaria para generar el esqueleto de las biomoléculas básicas; la fuente de
nitrógeno, que contribuye a la composición de proteínas, ácidos nucleicos y otros
constituyentes celulares; otro componente de los medios de cultivo son los
macronutrientes como fósforo, azufre, potasio, magnesio, calcio, sodio y hierro; y
los micronutrientes como el cobalto, níquel, molibdeno, manganeso, estos son
metales que forman parte del centro catalítico de algunas enzimas.
Algunos medios deben ser suplementados con vitaminas, aminoácidos u otras
nutrientes extra a la formulación estándar del medio, estos medios son identificados
como medios enriquecidos y están dirigidos para el cultivo de organismos
nutricionalmente exigentes.
En base a los requerimientos nutricionales, se emplean dos tipos generales de
medios de cultivo: los químicamente definidos y los complejos (o no definidos). En
los medios complejos no se aprecia exactamente los componentes que cumplan
como fuente de carbono, fuente de nitrógeno, macronutrientes y micronutrientes,
una ventaja importante de este tipo de medios es el proveer los nutrientes para el
crecimiento de cualquier género bacteriano.
En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas:
sin embargo, para el estudio o el trabajo en el laboratorio de una especie en
particular, se requiere del aislamiento de dicha especie, cultivadas en medios
desprovistos de cualquier otra forma de vida contaminante. Para lograr estas
condiciones de trabajo se requiere realizar procesos como la esterilización y
desinfección, métodos esenciales empleados en los laboratorios de Microbiología,
el objetivo de la esterilización es eliminar toda forma de vida vegetativa y esporas,
mientras que la desinfección se encarga de reducir las poblaciones microbianas
presentes en diferentes objetos de laboratorio, utilizando algunos compuestos
orgánicos para la eliminación de contaminantes.

Existen diversos métodos para lograr la esterilización, la mayoría se fundamenta en

la desnaturalización de proteínas celulares y destrucción de la membrana celular o
inhibir el funcionamiento celular.

Los procesos de esterilización se clasifican como físicos y químicos. Los agentes

físicos más utilizados para la esterilización son el calor, la radiación y la filtración.
En la esterilización por calor húmedo, se emplea la presión de vapor de agua para
alcanzar temperaturas de 120oC que equivalen a 15 libras de presión, condiciones
que permiten la desnaturalización de proteínas y la lisis de cualquier tipo de célula.
Para realizar este proceso, se emplea la autoclave, equipo que permite alcanzar la
temperatura y la presión suficiente que altera la estructura y función de cualquier
forma de vida.

PROPÓSITO:

El alumno seguirá los protocolos de preparación de medios de cultivo microbiano.

MATERIAL
Lista de materiales requeridos
Alumnos Almacén
Por grupo: Utensilios y dispositivos
Cinta testigo 1 vaso de precipitados 500 ml
1 rollo de papel aluminio 1 probeta graduada 500ml
Jabón líquido para manos 1 agitador de vidrio
Por equipo: 1 balanza granataria
2 paquetes de gasa 1 autoclave
1 cinta adhesiva (masking-tape) 1 plancha de calentamiento
1 plumón indeleble Acceso a Campana de flujo laminar y Estufa de
2 bolsas de Cajas Petri estériles y cultivo
desechables 2 mecheros Bunsen
1 paquete de algodón de 250 g. 16 tubos de 15 ml
1 atomizador 1 gradilla para tubos
1L de etanol 96o 1 pipeta de vidrio de 10 ml
1 paquete de papel desechable 1 propipeta para pipeta de cristal
1 jabón líquido para manos Reactivos
2 frascos vidrio (mayonesa 190 ml) Agua destilada
1 rollo de plástico kleen pack Medios de cultivo deshidratados:
Agar Mac Conkey
Sal manitol
Agar sangre
Eosina azul de metileno
Agar Luria Bertani
Agar papa y dextrosa
Caldo lauril sulfato de sodio
Medio de transporte de StuarD
Caldo Luria Betani

METODOLOGÍA

Formulación de los medios de cultivo

1. Para preparar el volumen solicitado, calcule los gramos necesarios de los

medios deshidratados de acuerdo con las indicaciones establecidas en la
etiqueta de cada medio de cultivo. Considere incluir los gramos que
corresponde al porcentaje de error (5%) del cálculo realizado.
 2. Colocar el medio en el vaso de precipitado de 500 ml y agregar el agua
destilada requerida, tomando en cuenta no exceder las tres cuartas partes
del volumen total del vaso.
3. Si el medio no incluye agar, agregarlo en la cantidad necesaria para solidificar
(16 g/l).
4. Calentar el medio de cultivo hasta ebullición por 3 minutos, depende de las
indicaciones de cada medio de cultivo.
5. Colocar al matraz un tapón de algodón envuelto en gasa, cubrir el tapón de
algodón con una doble capa de papel aluminio, rotular el matraz con el
nombre del medio que se preparó, volumen y fecha de preparación.

Esterilización de los medios en autoclave

6. Coloque el matraz en la autoclave

7. Agregue la cantidad de agua necesaria a la autoclave para realizar la
esterilización.
8. Tape correctamente la olla, colocar sobre la fuente de calor y encender el
dispositivo.
9. Espere el inicio de la ebullición. Cuando empiece a liberar vapor de agua
coloque la válvula de seguridad.
10. Cuando la autoclave registre una presión de 15 libras a 121°C mantenga
esas condiciones durante 20 minutos.
11. Regule la temperatura o flama de la fuente para mantener la presión
indicada durante 20 minutos.
12. Al concluir el tiempo de esterilización, apague la flama y permitir que la
presión de la olla baje completamente a cero libras.
13. Permitir que el medio se enfríe hasta 45oC (aproximadamente)
14. Destape con cuidado la olla del lado contrario al borde que esté para evitar
quemarse con el vapor que sea liberado.

Llenado de las cajas de Petri y prueba de esterilidad

15. Transporte los matraces en una rejilla o charola a la zona de trabajo con
esterilidad.
16. Verter los medios en las cajas Petri en zona de esterilidad de la campana de
flujo laminar o en la zona de esterilidad de dos mecheros Bunsen. El llenado
debe ser a la mitad del volumen de la placa.
17. Se debe homogenizar cuidadosamente el matraz durante el proceso de
vertido, debido a que el agar del medio tiende sedimentar.
18. Al terminar de verter cada caja se tapa y desliza suavemente sobre la mesa,
evitar que el medio no toque la tapa de la caja de Petri y que la superficie de
este quede lisa al gelificar.
19. Cuando el medio haya solidificado, llevar las cajas de Petri con cultivo a
prueba de esterilidad: colocar las placas invertidas en la estufa de cultivo a
27°C por 24 horas. Deseche las cajas de cultivo que muestren
contaminación.
ACTIVIDADES
Llene la siguiente tabla con los datos requeridos:

TABLA 1. MEDIOS DE CULTIVO ELABORADOS

Identificar la Fuente
Investigar que Anotar el color del
Nombre del de carbono, fuente Anotar el número de
géneros bacterianos medio de cultivo
medio de de nitrógeno, placas obtenidas en
se pueden cultivar en con pH 7 (sin
cultivo macronutrientes y la práctica
el medio inocular)
micronutrientes

DOCUMENTO EVIDENCIAL DE APRENDIZAJE

Inicio del reporte compuesto por:

1. Hoja de presentación con los datos requeridos de los integrantes del equipo
de trabajo.
2. Tabla 1 de datos de los medios de cultivo elaborados.
3. Una página tamaño carta con la secuencia de actividades desarrolladas en
la práctica, empleando imágenes numeradas y con descripción breve.
4. Comentarios, preguntas e impresiones sobre el contenido temático y las
actividades realizadas (una hoja con el aporte de cada integrante).
5. Referencias consultadas.

EVALUACIÓN

Especificaciones de aprendizajes evaluados por niveles en una rúbrica global.

Nota. El reporte será exactamente el mismo para todos los integrantes del equipo, por lo que se
evaluará solo uno y corresponderá la misma calificación.
Los resultados generados en esta práctica: las placas de los medios de cultivo formulados se
emplearán para la práctica de RECOLECCIÓN E INOCULACIÓN DE MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS.
REFERENCIAS

Madigan M. T., Martinko J. M. & Parker J. (2015): Brock: Biología de los Microorganismos.
13a edición. Pearson Educación.
Tórtora G. J. Funke B. & Case C. L. (2014). Introducción a la Microbiología. 12a edición.
Editorial Médica Panamericana. E.U.A.
 PRÁCTICA II

RECOLECCIÓN E INOCULACIÓN DE MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS

Se denomina muestra microbiológica a la porción de líquido o sólido, de origen

corporal (clínico), ambiental o alimenticio donde esperamos encontrar
microorganismos.
Las muestras deben cumplir con los siguientes requisitos indispensables:

A) La representatividad de la muestra considera la cantidad adecuada de la

muestra, y se requiere como cantidad mínima de 10 g o 10 ml en muestras
sólidas y un máximo de 100 g a 100 ml para muestras líquidas.
B) La toma de la muestra y el tiempo de la siembra de la misma debe realizarse
en un lapso máximo de 1.5 horas.
C) El método de conservación de la muestra, cuando la toma de la muestra está
distante al laboratorio donde se analizará, se debe recurrir a un método de
conservación, donde se emplea el almacenamiento de la muestra a 4oC y
también se puede emplear los medios de transporte donde se deposita la
muestra y es transportada al laboratorio.
D) Para realizar la recolección de la muestra, se requiere aplicar un proceso de
limpieza en el área física donde se tomará la muestra con un algodón
impregnado con alcohol al 70% en forma de círculos de adentro hacia afuera.
Por otra parte, el recipiente donde se depositará la muestra debe estar estéril,
esta medida tiene como finalidad evitar la contaminación de la muestra al
momento de almacenar y transportar.
E) El etiquetado de la muestra requiere anotar los siguientes datos: nombre de
la persona que tomo la muestra, lugar de la toma de muestra, si la muestra
es clínica registrar el nombre del paciente, hora y fecha de la toma de
muestra. Anexar información que pueda resultar relevante para el examen
como si la persona está enferma y que padecimiento cursa.

Para el caso de muestras de alimentos, es importante tomar nota cualitativa de sus

condiciones, datos de su ubicación u origen (local abierto, cerrado, exhibición,
refrigeración, a la intemperie), la fecha, la hora de la toma y el tiempo de almacenaje
desde la adquisición hasta la toma.

Para las muestras ambientales, se debe anotar la ubicación y las condiciones físicas
del lugar. Para la toma de muestra de suelos y agua se requieren 30 cm de
profundidad mínima, además de determinar el número de muestras a analizar, con
el correspondiente etiquetado.

Los organismos coliformes son frecuentemente encontrados en aguas residuales y

en suelo. Estos son indicadores de la calidad ambiental y de alimentos. Sin
embargo, se pueden encontrar microorganismos que forman parte de la microbiota
de dichos ambientes.
En el caso de muestras de aire, es muy importante anotar las condiciones que
prevalecen en el ambiente en el momento de la toma (lluvia, viento, humedad,
intensidad de luz solar, etc.).

PROPÓSITO:

El alumno seguirá un protocolo de toma de muestras de tipo clínico, ambiental,

de alimentos y de inoculación de medios de cultivo para la observación macro
y microbiológica de bacterias.

MATERIAL

Alumnos Almacén
Por equipo: Utensilios y dispositivos
Vaso estéril con muestra de orina 1 vaso de precipitados 500 ml
2 hisopos estériles 1 probeta graduada 500ml
2 cajas Petri estériles desechables 1 bisturí
Cintha adhesiva(masking-tape) 1 balanza granataria
Plumón indeleble 2 mecheros bunsen
2 hojas de bisturí 1 micropipeta 1000µL
2 tijeras Campana de flujo laminar
3 muestras Estufa de cultivo
Puntas azules estériles
Reactivos
Etanol al 70%
Placas de agar sal y manitol
Placas de Agar Mac Conkey
Placas de Agar Luria Bertani
Placas de Agar papa y dextrosa
Medio de transporte de StuarD
Tubo con Caldo Luria Betani
Placa de agar eosina azul de metileno
Solución de sulfato de magnesio al 10 mM,
estéril

METODOLOGÍA

A) La toma de muestras
A continuación, una breve descripción de los pasos necesarios para la toma de
muestras de diversos tipos.
Muestras clínicas superficiales

a) Piel. Realizar un raspado con hisopo en la zona indicada, si hay lesión se

debe profundizar hasta donde sea posible.
b) Pelo. Realice un raspado con hisopo en la superficie del cuero cabelludo.
c) Uñas. Si hay lesión en la superficie ungueal, lavar con agua destilada estéril
y tomar la muestra con un ligero raspado de la zona con ayuda de un hisopo,
si es por micosis, tomar parte de la uña cortando con tijera o bisturí. Para
cualquiera de los casos, una parte de la muestra se colocará en el tubo con
medio de transporte de Stuart y la otra en caja Petri estéril.
d) Cavidad bucal (exudado faríngeo).
INDICACIONES ESPECIALES. Para tomar la muestra el paciente debe abrir la boca. Con un
abatelenguas presione la lengua cuidadosamente hacia abajo. Utilizar dos hisopos estériles
largos para deslizar sobre la faringe posterior y amígdalas. Si hay lesiones con inflamación o
secreción, tomar muestra de las zonas inflamadas y donde esté presente la secreción.
Colocar un hisopo impregnado con la muestra en un tubo seco y el otro en medio de
transporte.
e) Orina.
INDICACIONES ESPECIALES. Se solicita previamente al donante de la muestra que realice
el aseo genital con agua y jabón. La colecta se realiza a partir de la porción media del
chorro de la micción, en un frasco estéril.

Muestras de alimentos
f) Se requiere llevar la pieza completa del alimento y colocar en un recipiente
estéril para su transporte. Una opción es tomar la mitad del alimento y
depositarla en un recipiente o bolsa estéril.

Muestras ambientales

g) Agua: La colecta se realiza utilizando un frasco o tubo estéril (con la

capacidad para contener 10 a 100 ml), usar guantes para evitar la
contaminación de la muestra durante la toma. También es importante
considerar si la muestra es estancada o de un afluente, así como si es
superficial o profunda y si contiene restos visibles de algún material.
h) Suelo: Generalmente se requiere tomar la muestra a una profundidad
mínima de 30 cm, por lo que primero se realizará una excavación,
posteriormente se toma el suelo con espátula y se deposita en la caja de Petri
estéril o bolsa (10 a 100 g).
i) Aire: Generalmente se abre la caja con medio de cultivo en el sitio donde se
realizará la colecta durante unos 60 segundos, se tapa perfectamente.

B) Inoculación de los medios de cultivo

1. Para la siembra de las muestras clínicas tomadas con hisopo realizar la

siembra por la técnica de estría cruzada (fig. 1A) empleando el hisopo como
asa de inoculación, se utilizan los siguientes medios: Eosina Azul de metileno
 (EMB), Mac Conkey, Luria Bertani (LB), agar sangre, sal y manitol. Para las
muestras de uñas sembrar también en agar papa dextrosa.

2. Para la siembra de las muestras de orina: incinerar y enfriar el asa

bacteriológica calibrada de 0.01 ml, posteriormente sumergir el asa y
homogenizar 10 veces la muestra, enseguida realizar la siembra por estría
en toda la superficie de la placa (fig. 1B), formar líneas paralelas, se utilizan
los siguientes medios: EMB, Mac Conkey, LB y agar sangre.

Figura 1. Técnicas de siembra de bacterias.

A) por estría cruzada y B) por estría
generalizada en la superficie de la placa. Los
números y flechas indican el orden de las
estriaciones en cada caso.

3. La muestra de alimento debe ser procesada: realizar cortes en fragmentos

menores a 0.5 cm y realizar una dilución del alimento 1:10 (5 g del alimento
cortado más 45 ml de la solución MgSO4 al 10 mM). Macerar esta
suspensión por 5 minutos. Medir 100 µL de la porción líquida del macerado
con una punta estéril (cortada en la punta) y depositar en los siguientes
medios sólidos EMB, Mac Conkey, LB y agar sangre, sal y manitol, agar
papa dextrosa dejar 10 minutos para que la muestra se absorba y realizar la
siembra por la técnica de estría cruzada.

4. Para la muestra de agua: homogenizar por 3 minutos y medir 1 ml del agua

e inocular en 9 ml de medio líquido LB. Otro procedimiento es medir 100 µL
de la muestra de agua con una punta estéril y depositar en los siguientes
medios sólidos EMB, Mac Conkey, LB y agar sangre, sal y manitol, agar
papa dextrosa dejar 10 minutos para que la muestra se absorba y realizar la
siembra por la técnica de estría cruzada.

5. Para la muestra de suelo. Metodología 1: pesar 0.5 g y depositar en 9 ml de

medio líquido LB, homogenizar por 10 minutos y tomar una alícuota de 1 ml
(con una punta estéril) e inocular otro tubo con 9 ml de medio líquido LB.
6. Para la muestra de suelo. Metodología 2: colocar granos de suelo de un
tamaño promedio de 5 mm en medio sólido con una pinza estéril, los
granos de suelo se mantuvieron a una distancia de un centímetro entre
ellos, hasta cubrir toda la superficie de los medios: Mac Conkey, LB, sal y
manitol, agar papa dextrosa.
C) Cultivo de los inóculos.

Incubar las siembras en los diferentes medios por un periodo comprendido entre
24 y 48 horas a 37°C.

ACTIVIDADES
Llene la tabla de registro con los datos requeridos de las primeras cinco columnas
del anexo 1.

EVIDENCIA DE APRENDIZAJE

1. Continúe el reporte de la práctica anterior con los datos requeridos del anexo
1 como parte de la metodología.
2. Agregue una página tamaño carta con la secuencia de actividades
desarrolladas en la práctica, utilizando imágenes numeradas y con
descripción breve.
3. Comentarios, preguntas e impresiones sobre el contenido temático y las
actividades realizadas (una hoja con el aporte de cada integrante).
4. Referencias consultadas.

REFERENCIAS

Kathleen Deska P y Timothy James P. (2006). Guía de pruebas diagnósticas y de

laboratorio. 5ª edición. Hartcourt Mosby. España. ISBN: 84-8174-556-1. pp. 887.
Gonzáles Alfaro J., Gonzáles Gonzáles B., Barrial Gonzáles T. (2004) Laboratorio de
Microbiología Instrumentación y principios básicos. Editorial Ciencias Médicas. La
Habana Cuba. ISBN: 959-212-131-1.
 PRÁCTICA III

OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE UN CULTIVO

BACTERIANO

Las células procariontes han sobrevivido desde su origen, el cual se ha calculado

hace 3600 millones de años hasta la actualidad del tiempo geológico. Su
persistencia actual con una gran diversidad implica enormes cambios evolutivos. Su
metabolismo ancestral se ha diversificado en rutas de biosíntesis con la utilización
de recursos disponibles, lo que ha permitido el desarrollo de la vida celular en
ambientes diametralmente distintos unos de otros. Se han diseminado en
prácticamente todos los rincones del planeta y así conocemos procariontes que se
desarrollan en ambientes amables para nosotros, hasta los que se desarrollan en
las más extremas condiciones de temperatura, pH, salinidad, presión, etc. La
evolución de los procariontes nos muestra cambios en estirpes estructural y
fisiológicamente distintas e independientes conocidas como el domino Archaea y
Bacteria. Dentro de Bacteria, es conocida la gran gama de interacciones orgánicas
que incluye casos de parasitismo, mutualismo y comensalismo. Evidencias
sorprendentes de simbiogénesis bacteriana con diversas interacciones filéticas
arqueanas explican el origen de la vida eucarionte.

El tamaño de las bacterias es variable, pueden medir desde 1 a 6 micrómetros hasta

40 o 50 µm, ejemplo de estas dimensiones son los filamentos y algunos espirilos.
La apariencia de las colonias (morfología colonial, o UFC: unidades formadoras de
colonia) de las bacterias que crecen sobre un medio de cultivo sólido presenta
características distintivas como el tamaño, color, textura, tipo de bordes y superficie,
entre otras. Estas características son particulares para el tipo de especie, sin
embargo, también están asociadas a la composición nutricional del medio de cultivo,
la morfología colonial es de utilidad para la identificación bacteriana preliminar.

Las células bacterianas presentan diversas formas, como los cocos que presentan
forma esférica, los bacilos son bacterias con forma de bastón, también hay bacterias
esféricas y alargadas denominadas cocobacilos, por otra parte, los vibrios
presentan forma de coma y las espiroquetas presentan forma ondulada.

La observación microscópica de un cultivo bacteriano requiere en la mayoría de las

veces, la aplicación de un colorante que permita resaltar las características y
estructuras de la célula. La tinción de Gram es la técnica más empleada para
diferenciar bacterias, y permite identificar a las bacterias Gram positivas, son
aquellas cuya pared permite que penetre el colorante cristal violeta, y las Gram
negativas, no se tiñen con este colorante y se tiñen con uno de contraste, la
safranina. La tinción de Gram es la técnica más empleada que permite orientar una
identificación inicial de las bacterias de interés
Las metodologías de tinción de bacteriana nos permiten hacer algunas
observaciones microscópicas sobre la forma que presentan, el modo en que se
agrupan y el grupo de tinción Gram al que pertenecen.
PROPÓSITO:

El alumno observará y describirá la macro morfología colonial de un cultivo

bacteriano, las características y micro morfología de las bacterias por tinción de
Gram.

MATERIALES

Alumnos Almacén
Utensilios y dispositivos
Por equipo: 2 asas bacteriológicas
1 regla 1 mechero bunsen
1 plumón indeleble 3 porta objetos
Preparaciones previas 3 cubreobjetos
Cultivos bacterianos de la práctica anterior 1 pizeta
1 tren de tinción
Reactivos
(kit de tinción de Gram)
Cristal violeta
safranina
Lugol
Alcohol cetona
Aceite de inmersión
Alcohol isopropílico
Agua destilada

METODOLOGIA

Observación macroscópica.

1. Tomar dos placas Petri con diferentes cultivos aislados y con un tiempo de
incubación de 24 horas.
2. Anotar el medio de cultivo en el que se encuentra la muestra.
3. Seleccionar una colonia (UFC: unidades formadoras de colonias) bien aislada
con tamaño promedio para realizar las siguientes observaciones.
4. Medir con la regla el tamaño de la colonia
5. Anotar el color que presenta, es importante ver si está asociado al color del
medio y si lo ha decolorado.
6. Observar la textura y consistencia (suave, mucoide o seca)
7. Tomar la placa y ponerla a contraluz para observar la luz transmitida
(translúcida u opaca).
8. Observar la superficie (lisa o verrucosa).
9. Anotar la forma de los bordes (enteros y continuos o irregulares).
10. Observar la elevación (elevada o plana).
11. Continuar las observaciones anteriores para la siguiente placa.

Tinción de Gram y observación microscópica

1. Preparación del frotis bacteriano: sobre un portaobjetos limpio y seco

colocar una gota de agua con la pizeta, después con el asa bacteriológica
estéril, tomar una porción de la colonia del cultivo, mezclar con cuidado,
hasta formar una monocapa de la masa celular y formar un rectángulo.
2. Para fijar la muestra, el portaobjetos con el frotis bacteriano es fijado con el
calor de la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen, por tres
ocasiones, hasta que el vidrio esté caliente, comprobar al tacto con el dorso
de la mano, evitar que la muestra se incinere.
3. Cubrir la muestra con cristal violeta e incubar por un minuto, posteriormente
enjuagar con agua destilada, el portaobjetos debe estar inclinado a 45º y el
agua debe fluir suavemente por la muestra hasta eliminar todo el colorante.
4. Agregar Lugol, incubar por un minuto, después lavar suavemente con el
chorro de agua.
5. Adicionar alcohol-acetona durante 10 segundos y enjuagar de inmediato.
6. Agregar safranina e incubar por un minuto, después lavar suavemente con
un chorro de agua hasta que todo el colorante sea eliminado.
7. Secar la preparación y observar al microscopio en los objetivos de 10, 45, y
100x (hay que recordar que para utilizar el objetivo de 100x previamente se
debe colocar una gota de aceite de inmersión sobre el cubreobjetos).
8. Describir la forma y la clase de bacteria de acuerdo con la tinción de Gram.
9. Documente con fotografías las bacterias teñidas.
10. Redacte en acuerdo con sus compañeros una descripción pertinente como
pie de figura para cada imagen.

EVIDENCIA DE APRENDIZAJE

En la sección de RESULTADOS recabe todos los datos de su tabla de registro (anexo

2) más la información pertinente documentada en imágenes con la redacción
discutida en equipo en los pies de figura.
Destine una sección de DISCUSIÓN, en donde redacte respuestas concretas sobre:
a) ¿Qué pudo haber influido en las diferencias de las características de
desarrollo de las colonias?
b) ¿Por qué las bacterias de sus cultivos en la tinción de Gram se tiñeron violeta
o bien rosa de acuerdo con los principios de este protocolo?

EVALUACIÓN GLOBAL DE LAS PRÁCTICAS 1, 2 Y 3

Se le entregará la rúbrica evaluativa de sus actividades y desempeño en estas

primeras tres prácticas.
REFERENCIAS

Kathleen Deska P y Timothy James P. (2006). Guía de pruebas diagnósticas y de

laboratorio. 5ª. Hartcourt Mosby. España. ISBN: 84-8174-556-1. pp. 887.
Tórtora G. J. Funke B. & Case C. L. (2014). Introducción a la Microbiología. (12 ed.).
E.U.A. Editorial Médica Panamericana
Arredondo G. J.L., Villicaña C.R. (2007) Atlas bacteriológico. Booksmedicos Org.
Comarketing Editorial, S.A. de C.V. México. ISBN 968
 PRÁCTICA V

DIVERSIDAD DE PROTOZOOS DE UN CUERPO DE AGUA DULCE

Los protozoos son organismos unicelulares eucariontes que han evolucionado de

una condición ancestral acuática de vida libre a todos los medios dulceacuícolas y
marinos. En su enorme diversidad los encontramos como simbiontes en
interacciones mutualistas, parasíticas y comensalistas con especies animales y
vegetales. Su diversidad constituye una parte numérica importante de taxones del
grupo de gran escala reconocido como dominio Eukarya. Exhiben gran cantidad de
formas y rutas evolutivas independientes.
Todos los protozoos están vinculados al agua, líquidos corporales de animales o a
ambientes superficiales en punto de saturación de humedad. Su nombre se
relaciona con la nutrición básicamente heterótrofa con variantes fagótrofas y
detritívoras, pero se incluyen autótrofos facultativos, mixótrofos, así como
depredadores. Como estructuras de locomoción muestran diversos tipos de
flagelos, cilios y pseudópodos. Las especies se reproducen por numerosas vías
asexuales como la bipartición, así como por vías de combinación genética como la
conjugación y la singamia de isogametos.

La investigación sobre estos organismos espera sorprendentes descubrimientos

sobre su biología, estructuras, metabolismo y relaciones evolutivas que tendrán
mucha influencia en la discusión sobre los esquemas globales de clasificación
contemporáneos, ecología, medicina y muchos otros campos de la ciencia.

PROPÓSITO

Integrará un reporte de resultados y discusión en formato de artículo científico sobre

la diversidad de protozoos del lago de arquitectura.

MATERIALES PARA COLECTA DE MUESTRAS DE AGUA DULCE

Se describen en el protocolo del anexo 2

ACTIVIDADES PROTOCOLARIAS DE CAMPO Y LABORATORIO

1. Siga el protocolo metodológico generalizado descrito en el anexo 2 para la

recolección de muestras de agua, etiquetado y registro de datos en la libreta de
campo.

2. Identifique una especie de protozoo por su unicelularidad y asigne un código

numérico único con el que va a reconocerla inicialmente como morfoespecie. Ese
código le servirá en adelante para identificar dicha especie en todas las
preparaciones en fresco que realice y observe de las distintas muestras. Como va
a encontrar otros organismos, solicite la ayuda del profesor para identificar
protozoos. Será de mucha ayuda si consulta la referencia de Patterson (1996)
previamente a la práctica.

3. Obtenga imágenes lo más nítidas posibles de la morfoespecie y haga un conteo

de individuos presentes en la muestra, tal como se describe en el anexo 3.

4. Realice el mismo protocolo para cada especie de protozoo que considere distinta
en el mismo portaobjetos.

5. Repita el protocolo del anexo 3 para dos preparaciones en fresco de cada

muestra.

6. Organice sus datos en una hoja Excel con el despliegue de los datos de la tabla
del anexo 4. Para llenar los datos de morfoespecie y microambiente se indican a
continuación las opciones.

MORFOESPECIE
Subcolumnas:
No. de morfoespecie (DATO NUMÉRICO)
No. de individuos (DATO NUMÉRICO)
MICROAMBIENTE
Subcolumnas:
Punto de recolección No. (DATO ALFANUMÉRICO)
Tipo (OPCIONES: CANAL/CUERPO MASIVO/OTRO)
Profundidad (UNIDADES EN cm)
Vegetación asociada (OPCIONES: VASCULAR SUMERGIDA/ VASCULAR FLOTANTE/ ALGAL
SUPERFICIAL/ ALGAL SUMERGIDA/ SIN VEGETACIÓN)
Exposición solar (OPCIONES: PARCIAL / A LA SOMBRA)

ACTIVIDADES POSTERIORES

7. Los datos de IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA de cada morfoespecie en la tabla

del anexo 4 los asumirá posteriormente a las actividades presenciales del día de la
práctica. Para realizar la identificación, utilice las claves proporcionadas de
Patterson (1996) y confirme sus identificaciones con el profesor en clase.

Con una breve descripción que aterrice en esta tabla comenzará la sección de
RESULTADOS de su reporte.

8. Realice la descripción de la diversidad de protozoos bajo los siguientes subtítulos:

Diversidad total de especies. Descripción breve (complemente con una lista de
especies del muestreo total)
Abundancia de individuos por especie. Descripción breve (complemente con un
gráfico de barras de especies en el eje X y de número de individuos en el eje Y)
Porcentaje de especies por microambiente. Descripción breve (Complemente
con tres gráficas de pastel para: 1) punto de recolección, 2) profundidad y 3)
vegetación asociada).

9. Elabore un collage con las mejores imágenes obtenidas. Incluya solo una de cada
especie con la identificación taxonómica de cada una de ellas y un pie de figura
general descriptivo del collage.

10. Redacte una sección de DISCUSIÓN con la guía de las siguientes dos preguntas.
¿Qué pudo haber influido en la diferencia o similitud en la diversidad de protozoos
por microambiente?
Complemente la discusión comparando sus resultados con los de otro equipo.
¿Sus resultados fueron iguales o distintos a los de otro equipo? Indique cuales
factores pueden estar determinando la similitud o la diferencia de la diversidad de
protozoos.

DOCUMENTO EVIDENCIAL DE APRENDIZAJE

Documento de reporte de RESULTADOS, DISCUSIÓN Y COLLAGE en formato de
revista científica.
Libreta de campo con datos

EVALUACIÓN
Su reporte se evaluará con una rúbrica que estará disponible en los documentos de
la sección en Microsoft Teams. En tiempo y forma se consultarán las dudas que
tenga sobre los elementos evaluativos.

REFERENCIAS

Adl SM, Simpson AG, Lane CE, Lukeš J, Bass D, Bowser SS, Brown MW, Burki F,
Dunthorn M, Hampl V, Heiss A, Hoppenrath M, Lara E, Le Gall L, Lynn DH,
McManus H, Mitchell EA, Mozley-Stanridge SE, Parfrey LW, Pawlowski J,
Rueckert S, Shadwick L, Schoch CL, Smirnov A, Spiegel FW. (2012). The
revised classification of eukaryotes. Journal of Eukaryot Microbiology
59(5):429-93.

Patterson D.J. (1996). Free-Living Freshwater Protozoa: A Colour Guide. John Wiley
& Sons, Manson Publishing. UNSW Press Sydney
ANEXOS
 Anexo 2

Protocolo para la colecta de muestras con protozoos de cuerpos de agua

dulce

Se describe un procedimiento de recolección de microorganismos con un contenido

representativo de los habitantes de cuerpos de agua dulce. Los organismos
recolectados pueden ser utilizados para la observación directa de la diversidad de
protozoos, para la obtención de muestras formales o bien como fuente de inóculos
con los cuales es posible iniciar cultivos de grupos específicos.

Para la recolección de organismos en campo, es recomendable trabajar con ropa

cómoda, lo más ligera posible, pero que cumpla con ciertos requerimientos como:
pantalón de mezclilla, camisa de manga larga de material fresco (algodón, por
ejemplo). Prefiera los colores verde, azul, marrón, blanco y evite el color negro, rojo
y amarillo de la camisa, pues resultan llamativos para insectos hematófagos o
pueden provocar reacciones agresivas de mamíferos o de ganado local. Es básico
utilizar un repelente orgánico de insectos. El calzado debe también ser cómodo y
de acuerdo con el sitio que se visita. Si el terreno es plano, con tenis o botas de
cuero con suelas de buen agarre al terreno son suficientes. Tome en cuenta que es
muy probable que tenga que introducir intencional o accidentalmente sus pies en el
agua, para lo cual sería recomendable utilizar botas de hule. Un paliacate, un
sombrero o gorra y bloqueador solar nos ayuda a evitar la insolación y quemaduras.
Para la recolección de muestras de agua que contienen protozoos requerirá lo
siguiente:

Materiales
ALUMNOS ALMACEN
Por equipo 5 pipetas de plástico con bulbo
1 cubeta pequeña (5 litros)
Cucharón de plástico
Tijeras escolares
Libreta de campo de pasta dura y lápiz de
grafito
Cinta masking tape o cinta aislante blanca
o de color claro
Plumón indeleble de color oscuro
Frascos de transporte de boca ancha de
unos 150 ml (por lo menos 6 o más)
Dispositivo para foto y video (cámara
digital o celular)
Palo de madera con un clavo en el
extremo
Procedimientos formales de colecta de protozoos.

Todo lo que realice respecto a la formalidad descriptiva que acompañe en

correspondencia real a sus muestras en su libreta de campo, será de gran utilidad
en la organización de sus observaciones y hará sus resultados comparables y
analizables. Tome fotos panorámicas generales del lugar y de las actividades que
se realicen.

A Registro del lugar

Asigne una hoja inicial de descripción de la colecta en la libreta de campo con:

a) Fecha y hora de inicio de trabajo.
b) Los datos de la localidad (Estado, municipio, nombre del embalse o río).
c) Los nombres y apellidos completos de los miembros del equipo que asistieron a
la colecta.
d) Las condiciones de luminosidad ambiental general, de la transparencia y color
general del cuerpo de agua.
e) Tipo de vegetación local circundante al cuerpo del agua.

Se describe a continuación lo que debe de realizar en cada punto de colecta

B Selección y datos del punto de colecta

En un recorrido por las orillas seguras, seleccione su primer punto de muestreo

preferentemente con vegetación flotante, vegetación acuática periférica y/o raíces
donde le sea cómodo tomar muestras de agua. Tome una o varias fotos de cada
punto de colecta. Si el número de frascos es limitado, es importante tomar
decisiones sobre la cantidad de los que va a utilizar en cada punto de muestreo para
llevar un conjunto de muestras representativas de la diversidad de protozoos.
En su libreta de campo asigne un número inicial para el punto de recolección, anote
la hora y las características particulares en estilo telegráfico, por ejemplo:
Punto 001
09:00 horas. Bejucos y algunas masas algales flotantes, terreno lodoso
Completamente asoleado
Orilla norte. Fondo lodoso, pendiente ligera
3 fotos de Bertha Méndez, 1 de Francisco López

C Recolección de muestras con cucharón

1. Con el cucharón de plástico, haga un raspado enérgico local de las

superficies debajo del nivel del agua en un rango longitudinal de raspado de
20 cm aproximadamente. Si la profundidad no cubre el cucharón, tome
directamente el agua agitada y vacíe en uno de los frascos. Si la
 profundidad es considerable (10 cm o más de profundidad), luego del
proceso de agitación mantenga el cucharón en el fondo en la parte media
del rango de acción de agitación, pegado al sustrato durante 10 segundos
para que terminen de caer los sedimentos de la suspensión adentro del
cucharón.
2. Lentamente saque el cucharón y vacíe el agua con los sedimentos
recuperados en una cubeta pequeña.

D Registro y etiquetado de las muestras

Con la cinta de aislar o masking y el plumón indeleble, elabore y pegue una etiqueta
con el número del punto de colecta y otro número de identificación de la muestra
que se vació al frasco. Esos números serán el código de la muestra, por ejemplo:
Si es posible, haga una etiqueta de papel escribiendo el
Punto 001 mismo código de identificación en lápiz y agréguelo dentro del
frasco
001
En la libreta de campo deberá registrar la muestra con su
código y los elementos descriptivos que considere pertinentes.

Punto 001
09:00 horas. Bejucos y algunas masas algales flotantes, terreno lodoso
Completamente asoleado
Fondo lodoso, pendiente ligera (5 cm de profundidad)
3 fotos de Berta Méndez, 1 de Francisco López

001. raspado de superficie solo líquido Código P001/001

002. Masa de cianobacterias flotantes Código P001/002

E Muestras complementarias

En el punto de colecta puede haber vegetación flotante (masas algales de diferentes

tipos), vegetación sumergida, hojas caducas en el fondo, basura diversa (unicel,
plásticos y basura en general). Incluya unos cuantos pedazos o cortes de estos
materiales orgánicos e inorgánicos en la cubeta. Puede requerir el uso del palo con
el clavo en el extremo para tomar muestras de materiales flotantes o sumergidos
lejos de su alcance.
Si hubiese rocas lisas con capa de material orgánico notorio haga un raspado de
estas dentro de la cubeta con unos 250 ml de agua superficial del mismo cuerpo de
agua. Deje reposar el agua durante 30 segundos. Luego con la pipeta con bulbo,
recupere 10 ml de la muestra de agua del fondo de la cubeta y vacíe en el frasco de
transporte. Agregue aproximadamente 100 ml de agua “limpia” del medio.
Los datos de las muestras complementarias se deben indicar en la libreta de campo
y deberían ir en frascos diferentes, pero si no es posible por el número de frascos
de transporte disponibles integre el material a un solo frasco. Asigne frascos con
muestras, registros en libreta de campo y etiquetas conforme considere en cada
punto de colecta.
Deberá repetir los mismos procedimientos en cada uno de los puntos de muestreo
que seleccione
Los procedimientos A - E le permitirán obtener muestras generales de protozoos,
pero los objetivos de colecta pueden requerir concentrarse en ciertos hábitats para
obtener grupos de organismos más específicos. A continuación, hacemos algunas
precisiones que le ayudarán a dirigir su muestreo según lo requieran los objetivos
de la práctica o del proyecto particular.

Ciliados, euglenas y otros flagelados.

La mayor parte de las especies de estos grupos son aerobias y se localizan en la
parte superficial del cuerpo de agua dulce hasta los 5 cm de profundidad. Son parte
de las comunidades que se establecen entre los filamentos algales, las hojas y las raíces sumergidas.
Ciertas especies se deslizan, son detenidas o se fijan por sí mismas sobre las superficies disponibles,
mientras que otras nadan y se desplazan entre los espacios. Concentre su muestreo en el material
de algas flotantes, vegetación y raíces sumergidas.
Lleve un poco de este material al montaje de la preparación en fresco para observar
la diversidad en el microscopio.

Ameboides
Por sus características celulares y de movimiento, será más frecuente
encontrarlos sobre el sustrato de las orillas de los cuerpos de agua dulce, ya que
se deslizan en los sustratos. El raspado o cepillado de las superficies asegura
mejor su recolección del fango, rocas, materiales orgánicos e inorgánicos.
Recupere el material por sedimentación en el cucharón y en la cubeta de
muestreo. Succione agua con un poco de sedimentos luego del reposo en el
frasco al momento de realizar la observación al microscopio.
Almacenamiento y transporte del material
Es muy importante que, en reposo o lugar fijo, la tapa solo esté sobrepuesta
cubriendo sin sellar la boca de los frascos transportadores en reposo (en campo,
en casa, en el aula o en el laboratorio). Durante el viaje a pie o en transporte al
laboratorio, se pueden cerrar para evitar derrames, pero se deben destapar cada
hora durante 10 segundos, de lo contrario la mayoría de los Protistas morirán por
el agotamiento de O2, acumulación de metano, fermentos y CO2.

Muestras en el laboratorio y durante las prácticas

Mantenga sus muestras de agua en los frascos de boca ancha con la tapa
sobrepuesta, lo que permitirá la circulación de aire y oxigenación superficial sin
contaminación externa excesiva. El uso de gasas y/o algodón como cubierta puede
alterar las condiciones del líquido de manera inconveniente. Si los usa tenga
cuidado de que no hagan contacto con el agua de la muestra.
Es muy importante que no se mezclen las muestras, sobre todo si su proyecto o
práctica requiere registros de biodiversidad con la distinción de las zonas
específicas de colecta (profundidad, microhábitat, vegetación, iluminación, etc.).
Sobre el mismo tema, es importante asignar una pipeta para cada muestra que se
va a manipular durante las prácticas, de manera que no se mezclen los líquidos al
realizar preparaciones de observación.
 Anexo 3

Preparaciones en fresco para observación microscópica y revisión por campo

Las preparaciones en fresco son montajes que se realizan en el dispositivo porta y
cubreobjetos con muestra líquida directa para observación microscópica. Son
efímeras debido a la evaporación del agua. Toda preparación en fresco y su
colocación en la platina debe ser realizada por una persona.
Si bien el procedimiento es sencillo, requiere de práctica para optimizar en rapidez
y evitar la formación de burbujas.

Montaje de la preparación (véase la figura)

1. Sostenga el portaobjetos limpio y seco por los bordes con una mano
2. Agregue una o dos gotas (no más) de la muestra sobre el portaobjetos
3. Tome un cubreobjetos por los bordes. Apoye y deslice uno de los bordes
sobre la superficie del portaobjetos, mantenga el ángulo agudo. Cuando haga
contacto con el líquido de la muestra deje caer el cubreobjetos.

Figura. Preparación de una muestra en fresco para observación en microscopía óptica.

Observación de preparaciones

Antes de comenzar:

a) Verifique que la superficie de la platina esté limpia y completamente seca.

b) Conecte y encienda la lámpara.
c) Mantenga una posición cómoda ya sea de pie o sentado durante la
exploración microscópica.
d) Acomode los tubos oculares a su distancia ocular.

Procedimiento.

1. Gire el tornillo macrométrico al nivel más bajo de la platina, seque la

superficie inferior del portaobjetos con la muestra y colóquelo sobre la
 platina. Asegure el portaobjetos con los clips de aseguramiento del
microscopio.
2. Ubique la muestra (área del cubreobjetos) sobre la luz del condensador con
los controles de desplazamiento del portaobjetos.
3. Coloque el objetivo 4X
4. Mientras observa a través de los oculares, gire el tornillo macrométrico para
acercar la muestra al objetivo hasta que reconozca partículas o la superficie
del cubreobjetos o de la capa de muestra en el campo visual.
5. Afine la nitidez del campo de la muestra con el tornillo micrométrico
6. Realice la búsqueda de organismos por campo como se describe a
continuación.

Búsqueda de organismos por campo.

Una vez logrado el enfoque de la muestra a 4X, deslice el portaobjetos para

colocar una de las esquinas en el campo visual.

Busque organismos de interés inspeccionando el campo visual de una esquina y

desplazando hacia nuevos campos a la derecha o la izquierda según la esquina
que haya colocado al inicio. Al terminar la línea horizontal, desplace hacia un
nuevo campo hacia abajo como en la ilustración para continuar la búsqueda en los
campos de una nueva línea.

Al encontrar un organismo de interés, se procede a centrarlo en el campo visual.

Para observar detalles de un

individuo fijo o de lento
desplazamiento primero
ubíquelo en el centro del
campo visual a 4X. Cambie los
objetivos de 10X, 20X, 40X,
pero en cada acercamiento
ubique al organismo en el
centro del campo. Solo si tiene
aceite de inmersión cambie
al objetivo de 100X.

En cada cambio de objetivo y

de centrado, ajuste el enfoque
Figura. Procedimiento de búsqueda de microorganismos por con el tornillo micrométrico
campo visual. Las flechas señalan la dirección y sentido de para mejorar la nitidez de las
búsqueda. estructuras del
microorganismo. Obtenga
imágenes y videos del campo visual sobre el ocular con cámara digital o con su
celular.