Quitinasa App

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA
MOLECULAR
FACULTAD DE FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SEVILLA
“PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A PARTIR DE

SUBPRODUCTOS DE LA INDUSTRIA ALIMENTARIA:
Aplicación a los Hongos comestibles y Crustáceos”.
Memoria presentada para optar al grado de Doctor en

Farmacia por:
ANABELL DEL ROCÍO URBINA SALAZAR
Sevilla, 2019
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Facultad de Farmacia
Prof. Dr. José Luis Venero Recio

C / Profesor García González, 2.
41012 Sevilla (España)
Teléfono: 954 55 3803
e-mail: [email protected]
José Luis Venero Recio, Catedrático de Universidad de Bioquímica y

Biología Molecular de la Universidad de Sevilla (NRP: A0500-
0880376924), Director del Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular, de la Facultad de Farmacia, de la Universidad de Sevilla.
Informa:
Que la tesis doctoral titulada “PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A

PARTIR DE SUBPRODUCTOS DE LA INDUSTRIA ALIMENTARIA:
Aplicación a los Hongos comestibles y Crustáceos”, presentada por
la doctoranda Anabell Del Rocío Urbina Salazar, para optar por el
título de Doctor en Farmacia por la Universidad de Sevilla, ha sido
realizada en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la
Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla, bajo la dirección de
los Drs.: Juan Dionisio Bautista Palomas y Juan Parrado Rubio,
reuniendo todo los requisitos necesarios para presentarse a su defensa.
Fdo: José Luis Venero Recio

(Director del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular).

Juan Dionisio Bautista Palomas, Catedrático de Universidad de

Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Sevilla (NRP:
A0500-5159678268), y Juan Parrado Rubio, Catedrático de
Universidad de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de
Sevilla (NRP: A0500-2729451168), adscritos al Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular, de la Facultad de Farmacia, de la
Universidad de Sevilla.
Informan:
Que la Tesis Doctoral titulada “PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A

PARTIR DE SUBPRODUCTOS DE LA INDUSTRIA ALIMENTARIA:
Aplicación a los Hongos comestibles y Crustáceos”, realizada por
Anabell Del Rocío Urbina Salazar para optar al título de Doctor en
Farmacia por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada bajo nuestra
dirección en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
(Facultad de Farmacia), Universidad de Sevilla. Y que dicha tesis reúne
todos los requisitos académicos y experimentales necesarios para
proceder a su presentación y defensa.
Fdo.: Dr. Juan Dionisio Bautista Palomas Fdo.: Dr. Juan Parrado Rubio
(Director de Tesis) (Director de Tesis)
PUBLICACIONES
Parte de los resultados presentados en esta Tesis doctoral, han sido

publicados en los siguientes artículos:
Urbina-Salazar A.R., Inca-Torres A.R., Falcón-García G., Carbonero-

Aguilar P., Rodríguez-Morgado B., del Campo J.A., Parrado J., Bautista
J., (2018). Chitinase Production by Trichoderma harzianum Grown on a
Chitin-Rich Mushroom Byproduct Formulated Medium. Waste and
Biomass Valorization. https://doi.org/10.1007/s12649-018-0328-4.
Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., Falcón-García G., Carbonero-

Aguilar P., Rodríguez-Morgado B., Parrado J., Bautista J., (2018).
Hydrolytic enzymes production by Bacillus licheniformis growth on
fermentation media formulated with sewage sludge. Journal of Biotech
Research, 9:14-26.
Parte de los resultados presentados en esta tesis doctoral han sido

presentados en los siguientes Congresos y Jornadas:
Urbina-Salazar A.R., Inca-Torres A.R., Carbonero-Aguilar P., Falcón-

García G., and Bautista J., (2017). Production of chitinases by
submerged fermentation in media formulated with colloidal chitin of fungi.
Póster en Congreso. XIII EUCHIS & VIII SIAQ. Sevilla, Mayo 2017.
Urbina-Salazar A.R, Inca-Torres A.R., Carbonero-Aguilar P., Cremades

O., and Bautista J., (2018). Mushroom ergothioneine enriched aqueous
extracts (M-ERG-EAE) suppress TNF-α and MMP-1 expression in UV-
irradiated human dermal fibroblasts. Póster en Congreso. IV JORNADAS
DOCTORALES DE LA UNIVERSIDAD DE MURCIA. Murcia, Mayo
2018.
Urbina-Salazar A.R., Inca-Torres A.R., and Bautista J., (2018).

Preparation of fungal- nano chitin crystals: aplication to mushroom
(Agaricus bisporus) by - products. Póster en Congreso. IPAP18
INNOVATIONS IN PHARMACY (ADVANCES & PERSPECTIVES).
Salamanca, Septiembre 2018.
Urbina-Salazar A.R., (2018). Producción de quitinasas a partir de los
subproductos de la industria agroalimentaria: Aplicación a los Hongos
comestibles y Crustáceos. Comunicación Oral. III JORNADAS
DOCTORALES DE FARMACIA. Sevilla, Julio 2018.
Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., Falcón-García G., Carbonero-

Aguilar P. and Bautista J., (2017). Preparation of fungal chitin from
agroindustrial by-products: Aplication to edible mushrooms (Agaricus
bisporus) by-products. Póster en Congreso. XIII EUCHIS & VIII SIAQ.
Sevilla, Mayo 2017.
Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., Falcón-García G., Cremades O.

and Bautista J., (2018) “In vitro” study of mushroom ergothioneine
enriched aqueous extracts (M-ERG-EAE) against oxygen activated
substances. Póster en Congreso. IV JORNADAS DOCTORALES DE LA
UNIVERSIDAD DE MURCIA. Murcia, Mayo 2018.
Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., and Bautista J., (2018).

Preparation of nanochitin from crawfish (Procambarus clarkii) by-
products. Póster en Congreso. IPAP18 INNOVATIONS IN PHARMACY
(ADVANCES & PERSPECTIVES). Salamanca, Septiembre 2018.
Carbonero-Aguilar P., Falcón-García G., Urbina-Salazar A.R., Inca-

Torres A.R., and Bautista J., (2017). Use of crayfish (Procambarus
clarkii) chitin as carbon source for the production of chitinases by
submerged fermentation. Póster en Congreso. XIII EUCHIS & VIII SIAQ.
Sevilla, Mayo 2017.
Falcón-García G., Carbonero-Aguilar P., Inca-Torres A.R., Urbina-

Salazar A.R., and Bautista J., (2017). Production of Crawfish
(Procambarus clarkii) chitin enriched fractions by enzymatic procedures
for fermentation uses and chitin-oligosaccharides production. Póster en
Congreso. XIII EUCHIS & VIII SIAQ. Sevilla, Mayo 2017.
Rodríguez-Morgado B., Caballero Jiménez P., Inca-Torres A.R., Urbina-

Salazar A.R., Parrado J., Tejada M., (2016). Obtaining a soil
biostimulant from sewage sludge: Effect on soil biochemistry. Póster en
Congreso. 5th International Conference Enzymes in the Environment.
Ecology, Activity and Application. Bangor, Gales, Reino Unido. 2016.

Esta Tesis se ha realizado gracias a la financiación de los siguientes

Proyectos de Investigación:
Proyecto: Aumento del contenido de vitamina D en champiñón

fresco (CHAMPI-D). (Ref.: RTC2015-4039-2), Ministerio de Economía y
Competitividad, del gobierno de España.
Proyecto: Valorización de fibras celulósicas y de quitina obtenidas

de subproductos de la industria agroalimentaria mediante el
desarrollo de biocomposites poliméricos (VALORIZAGRO). (Ref.:
PRJ201702958), FIUS, Universidad de Sevilla
Un viaje de miles de kilómetros
comienza con un solo paso…
Es hora de partir, nos debemos ir,
ahora nos toca volar, y las alas desplegar,
emprender el vuelo, en busca de la verdad,
hacer una carrera y muy alto llegar…
Estamos preparados, de eso no quede duda,
para eso fuimos educados para llegar a las alturas,
no dudes jamás adonde quieres llegar,
sigue tus instintos y nunca perderás…
Extiende bien las alas y seguro llegarás
solo es cuestión de seguir al viento
y planear sin titubear, poco a poco
y sin miedo, llegarás al vuelo final…
Seguro en poco tiempo, los frutos llegarán,
y serás en el firmamento una estrella más,
habrás cumplido tu sueño… Y la meta alcanzarás,
¡de ser un grande, y exitoso profesional!
Magali Sauceda
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS
La gratitud es la clave que convierte los problemas en bendición y lo inesperado en regalos.
Hoy es uno de esos días en el que me siento muy agradecida de tener personas tan increíbles
y maravillosas en mi vida.
Primeramente agradezco al Profesor Juan D. Bautista Palomas por confiar en mí y abrirme

las puertas de su laboratorio brindándome todas las facilidades para poder desarrollar este
trabajo de investigación, gracias por todo tu tiempo, por el apoyo, por tus consejos y por
todo lo que me has enseñando… en fin me siento muy agradecida debido a que sin tu
apoyo no hubiese sido posible cumplir cada una de mis metas propuestas. A mis
compañeros del grupo de investigación y demás compañeros del departamento también un
sincero agradecimiento.
Sonrío, no porque mi vida es perfecta sino porque aprecio lo que tengo y a quien tengo a
mi lado gracias Renato por ser una persona muy importante en vida, por ser mi esposo,
amigo, compañero, colega y compi de piso, gracias por estar conmigo en los buenos y
sobretodo en los malos momentos, gracias por ser mi apoyo incondicional y darme las
fuerzas para seguir adelante siempre diciéndome “ya falta poco”, gracias por estar conmigo
en esos momentos difíciles cuando en poco tiempo perdí a mis abuelitos y sin poder hacer
nada ni poder estar allí en esos momentos fuiste tú quien me dio las fuerzas necesarias para
poder reponerme y seguir. Gracias por todo tu amor, cariño, comprensión y sobretodo tu
paciencia. Yo sé que juntos lograremos llegar al final y cumplir todas las metas planteadas.
Solo tú y yo sabemos lo que nos ha costado esto.
Estoy tan agradecida de ser quien soy y estar donde estoy, esto se los debo a mis padres
Méntor y Juanita quienes desde muy pequeñita me han enseñado buenos valores como el
respeto, humildad, honestidad, la responsabilidad y sobretodo la gratitud, quienes a pesar
de estar muy lejos bastaba con unas palabras de ánimo para seguir adelante, gracias por
apoyarnos en este camino y por confiar en nosotros, siempre estaré muy agradecida con
ustedes………
A mis hermanos Geovanny, Jeanette y Anthony los llevo siempre en mi corazón, gracias por
brindarme todo su cariño y por apoyarnos ……
A mis sobrinos Naye, Dennis, Pame, Andy, Majo, Samy y Renata soy una tía muy
afortunada cada uno de ustedes tiene un lugar muy importante en mi corazón.
A Dn Walter, Myriam y Vale por estar siempre pendientes de nosotros.
Me siento muy agradecida con Dios por darme unos padres que son mi orgullo, un esposo
increíble, hermanos, sobrinos y demás familiares que han aportado de cierta manera para
cumplir con cada uno de mis objetivos, gracias por guiarme siempre por el buen camino y
por darme la Salud y la vida.
Sabiendo que no existirá una forma de agradecer una vida de sacrificio y esfuerzo, quiero
que sientan que el objetivo logrado también es de ustedes y que la fuerza que me ayudo a
conseguirlo fue su apoyo.
Anabell
ÍNDICE
Índice
RESUMEN ............................................................................................. iii
ABSTRACT ............................................................................................ v
GLOSARIO ............................................................................................ xi
1. INTRODUCCIÓN .............................................................................. 3
1.1 Quitinasas...................................................................................................... 3
1.1.1 Generalidades .............................................................................. 3
1.1.2 Clasificación de las quitinasas .................................................... 6
- Clasificación según la Comisión de Enzimas de la IUPAC.......... 7
- Clasificación basada en la secuencia aminoacídica y

ordenamiento espacial (arquitectura de dominios) ....................... 7
- Clasificación basada en el mecanismo ........................................ 10
1.1.3 Importancia y Aplicaciones de las Quitinasas .......................... 12
1.3.1.1 Quitinasas y Agronomía ........................................................ 15
1.1.3.2 Quitinasas en la Industria Alimentaria ................................... 19
1.1.3.3 Otras Aplicaciones de Quitinasas .......................................... 20
1.1.4 Producción de Quitinasas por Fermentación ............................ 20

a) Fermentación en Medio Sólido ................................................... 21
b) Fermentación en Estado líquido o Sumergida ............................ 23
c) Fermentación Discontinua .......................................................... 24
d) Fermentación Continua ............................................................... 24
1.1.4.1 Microorganismos ................................................................... 25
1.1.4.2 Factores extrínsecos de Cultivo ............................................. 27
1.4.3 Medios de cultivo (Sustratos) ................................................... 28

1.2 Subproductos Agroindustriales ricos en Quitina como fuente de
fermentación para la producción de quitinasas. ............................................. 30
1.2.1 Subproductos de la Industria de Hongos y Setas Comestibles . 32
1.2.2 Subproductos de la Industria de Crustáceos ............................. 40
2. OBJETIVOS ..................................................................................... 49
2.1 Objetivo General................................................................................... 49
2.2 Objetivos Específicos............................................................................ 49
3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................ 53

3.1. Reactivos, Materiales y Equipos ................................................................ 53
3.1.1 Reactivos ................................................................................... 53
3.1.2. Materiales ................................................................................. 57
3.1.3 Equipos ..................................................................................... 59

3.2. Microorganismos ....................................................................................... 61
3.3. Subproductos.............................................................................................. 62
3.4 Estabilización de los subproductos y generación de sustratos .................. 64
3.4.1 Secado y molienda .................................................................... 64
3.4.2 Preparación de la Fracción enriquecida de Quitina/Glucano

de champiñones ........................................................................... 67
3.5 Caracterización de los Sustratos ................................................................ 69
3.5.1 Humedad ................................................................................... 69
3.5.2 Cenizas .............................................................................. 70
3.5.3 Grasas ................................................................................ 70
3.5.4 Nitrógeno Total ................................................................. 70
3.5.5 Cuantificación de Proteínas en Subproductos y Sustrato . 71
3.5.6 Hidratos de Carbono ......................................................... 71

3.6 Fermentaciones........................................................................................... 72
3.6.1 Fermentación sumergida (FS) ................................................... 73
a) Microorganismos y preparación del Inóculo ............................. 73
b) Preparación de la fuente de carbono (Quitina coloidal)............ 74
c) Medios de cultivo y condiciones de crecimiento ......................... 75
 Condiciones de crecimiento de Bacillus licheniformis ATCC

21415........................................................................................... 78
 Condiciones de crecimiento de Trichoderma ............................. 78
3.6.2 Fermentación en estado sólido (FES) ....................................... 78

3.7 Caracterización de las fermentaciones ...................................................... 81
3.7.1 Determinación de la Biomasa ................................................... 81
3.7.2 Ensayos Enzimáticos ........................................................ 82
a) Ensayo de Actividad Quitinasa ................................................... 83
b) Ensayo de Actividad Celulasa..................................................... 85
c) Ensayo de Actividad Xilanasa .................................................... 86
d) Ensayo de Actividad Proteasa ..................................................... 87
e) Cálculo de actividades enzimáticas en UI/mL ............................... 88
3.7.3 Cuantificación de Proteínas solubles ........................................ 89
3.8 Concentración por Ultrafiltración ................................................ 91

3.9 Estudio del secretoma ................................................................................. 93
3.9.1 Análisis electroforético (PAGE-SDS) ............................... 93
 Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida (PAGE-SDS) .. 95
3.9.2 Tinción por afinidad (Zimografía) ............................................ 98
3.9.3 Análisis proteómico .......................................................... 98

3.10 Estabilización de Quitinasas................................................................... 102
3.11 Producción de quitinasas en un reactor tipo tambor rotativo (escala
semi-piloto). ..................................................................................................... 102
3.12 Análisis de datos...................................................................................... 103
4. RESULTADOS Y DISCUSIONES ............................................... 107

4.1. Subproductos y sustratos ......................................................................... 107
4.1.1. Recopilación de subproductos ............................................... 108
4.1.2. Preparación de los sustratos ................................................... 109
4.1.3. Caracterización de los sustratos ............................................. 112

4.2. Fermentaciones........................................................................................ 114
4.2.1. Fermentación sumergida (FS) ................................................ 115
4.2.2. Fermentación en estado sólido (FES) .................................... 124
4.2.3 Análisis de la producción relativa (UI/L/día) ......................... 130
4.2.4 Análisis de la producción total (UI) ........................................ 135

4.3 Aproximación al secretoma de T. harzianum CEC-T24 crecido en medios
ricos en quitina................................................................................................ 141
4.4 Producción de hidrolasas ......................................................................... 174
4.5 Producción de quitinasas a escala semi-piloto. ....................................... 181
5. CONCLUSIONES .......................................................................... 185
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................ 191
ANEXOS.............................................................................................. 214
INDICE DE FIGURAS
Figura I.1. Diferentes formas de la quitina.

Figura I.2. Organismos que en su estructura contienen quitina.
Figura I.3. Clasificación de las quitinasas bacterianas de acuerdo con su
mecanismo de acción y forma del centro activo.
Figura I.4. Hidrólisis Enzimática de la Quitina.
Figura I.5. Principales aplicaciones actuales de las quitinasas según su
mecanismo de acción.
Figura I.6. Morfología de Agaricus bisporus.
Figura I.7. Producción mundial de Hongos y setas comestibles. Adaptado
de datos FAO STAT 2018a.
Figura I.8. Producción de Hongos y setas comestibles en Europa en el
2016. Adaptado de datos FAO STAT 2018a.
Figura I.9. Consumo de Hongos y setas comestibles en España en el
2016. Adaptado de datos FAO STAT 2018b.
Figura I.10. Subproductos obtenidos del cultivo del champiñón.
Figura I.11. Morfología de Procambarus clarkii.
Figura I.12. Distribución mundial de Procambarus clarkii. Tomado de
IUCN Red List guiding conservation 2014.
Figura I.13. Producción mundial de Procambarus clarkii.
Figura M.1. a) Agaricus bisporus, b) Procambarus clarkii.

Figura M.2. a) Estufa de secado estático, b) Estufa de secado con aire
forzado.
Figura M.3. a) Molino de rotor, b) Diferentes tamaños de tamices
utilizados para la preparación de los subproductos.
Figura M.4. a) Harina de Tallos de Champiñón (HTCH), b) Harina de
Cangrejo (HC).
Figura M.5. Esquema de la obtención de la fracción enriquecida de
Quitina/Glucano, mediante un tratamiento enzimático con proteasas.
Figura M.6. Fracción enriquecida en Quitina/Glucano.
Figura M.7. Espectrofotómetro utilizado.
Figura M.8. Curva de calibración de Glucosa.
Figura M.9. Esquema del proceso de Fermentación Sumergida.
Figura M.10. a) Quitina pura en polvo, b) Quitina coloidal.
Figura M.11. Medios de cultivo utilizados para FS.
Figura M.12. Medios de cultivo utilizados en FES para la producción de
Quitinasas.
Figura M.13. Proceso de fermentación para la obtención de quitinasas.
Figura M.14. Recta %T vs mg biomasa/mL para B. licheniformis ATCC
21415. (Muestras diluidas 1:5, v/v)
Figura M.15. Recta conversión ergosterol vs biomasa (T. harzianum
CEC-T24).
Figura M.16. Recta conversión ergosterol vs biomasa (T. atroviride CEC-
T23).
Figura M.17. a) Baño con control de temperatura, b) Muestras para
determinación de actividad quitinasa.
Figura M.18. Curva de calibración de N-acetilglucosamina.
Figura M.20. Curva de calibración de Xilosa.
Figura M.21. Estructura del colorante Coomasie Brillian Blue G250.
Figura M.22. Curva de calibración de BSA.
Figura M.23. a) Concentración por ultrafiltración, b) Tubos Vivaspin de
ultrafiltración.
Figura M.24. Esquema del diseño experimental utilizado para el análisis
proteómico del secretoma de T. harzianum CEC-T24.
Figura M.25. Esquema del reactor tipo tambor rotatorio utilizado para la
producción de quitinasas en medios ricos en quitina.
Figura R1. Sustratos utilizados para la producción de quitinasas: a)

HTCH, b) F-Q/G y c) HC.
Figura R2. Curva de hidrólisis de la HTCH con Alcalasa®.
Figura R.3. Producción de biomasa (línea discontinua con triángulo) y
producción quitinasa (línea continua con cuadrado) de: a) T. harzianum
CEC-T24, b) T. atroviride CEC-T23 y c) B. licheniformis ATCC 21415,
crecidos en el medio F-Q/G.
crecidos en el medio HTCH.
Figura R.5. Comparación de la producción de quitinasas por T.
harzianum CEC-T24 crecido en medios formulados con diferentes
sustratos con aireación (+A) y sin aireación (-A). a) Fermentación
Sumergida (FS) y b) Fermentación en estado sólido (FES).
Figura R.6. Comparación de la producción relativa de quitinasas por T.
harzianum CEC-T24, en medios formulados con diferentes sustratos, al
sexto día de cultivo. a) Cultivos con aireación y b) Cultivos sin aireación.
Figura R.7. Producción de quitinasa en diferentes medios formulados con
sustratos ricos en quitina (F-G/Q, HTCH y HC) mediante FS y FES con y
sin aireación. [A) Análisis porcentual. B) Análisis por producción total
(UI)].
Figura R.8. Perfil proteico del caldo de cultivo antes de inocular (línea
azul O días) y del caldo de cultivo tras 6 días de crecimiento de T.
harzianum CEC-T24 en FES (línea verde).
Figura R.9. Separación electroforética por PAGE-SDS de proteínas
secretadas por T. harzianum CEC-T24 crecido en un medio de cultivo
formulado HTCH. [a: marcadores; b: tinción con azul de Coomassie; c:
tinción de plata y d: tinción de la actividad (zimograma)].
Figura R.10. Número de proteínas (totales y específicas de T. harzianum
CEC-T24) detectadas por n-LC-MS/MS en el secretoma de T. harzianum
CEC-T24 crecido en medios formulados con HTCH, F-Q/G y HC.
Figura R.11. Número de proteínas específicas de T. harzianum CEC-T24
detectadas por n-LC-MS/MS en el secretoma de T. harzianum CEC-T24
crecido en medios formulados con HTCH, F-Q/G y HC.
Figura R.12. Número de proteínas secretadas en el medio formulado con
HTCH.
HTCH clasificadas según su función biológica.
F-Q/G.
F-Q/G clasificadas según su función biológica.
HC.
HC clasificadas según su función biológica.
Figura R.18. Actividad quitinasa producida en el medio HTCH utilizando
FS y FES.
Figura R.19. Actividad celulasa producida en el medio HTCH utilizando
FS y FES.
Figura R.20. Actividad xilanasa producida en el medio HTCH utilizando
FS y FES.
Figura R.21. Actividad proteasa producida en el medio HTCH utilizando
FS y FES.
INDICE DE TABLAS
Tabla-M.1. Reactivos utilizados.

Tabla-M.2. Materiales utilizados.
Tabla-M.3. Equipos utilizados.
Tabla-M.4. Microorganismos utilizados.
Tabla-M.5. Subproductos y sus orígenes.
Tabla-M.6. Composición de los medios de cultivo utilizados para la FS.
Tabla-M.7. Composición de los medios de cultivo utilizados para la FES.
Tabla-M.8. Composición de los geles discontinuos de poliacrilamida.
Tabla-M.9. Protocolo de tinción de proteínas con Plata.
Tabla-R.1. Materias primas y/o sustratos utilizados en la producción de

quitinasas.
Tabla-R.2. Composición básica de los sustratos utilizados en la
producción de quitinasas por fermentación. (Datos expresados en % p.s.)
Tabla-R.3. Producción de biomasa en los diferentes medios de cultivo
después de 14 días de crecimiento en fermentación sumergida.
Tabla-R.4. Producción de quitinasas por T. harzianum CEC-T24, T.
atroviride CEC-T23 y B. licheniformis ATCC 21415 crecidos en
fermentación sumergida en un medio formulado con F-Q/G y HTCH.
Tabla-R.5. Producción de quitinasas tras 6 días de Fermentación en
estado sólido.
Tabla-R.6. Producción de quitinasas tras 6 días de Fermentación tanto
en FS como FES.
Tabla-R.7. Producción relativa de quitinasas de Trichoderma harzianum
CEC-T24 crecido en FS y FES en diferentes medios, tras 6 días de
fermentación.
Tabla-R.8. Producción total de quitinasas obtenidas en FS y FES tras 6
días de fermentación.
Tabla R.9. Número de Proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24
con actividad hidrolítica.
Tabla R.10. Proteínas específicas secretadas por T. harzianum CEC-T24
crecido en FES en un medio formulado con HTCH.
crecido en FES en un medio formulado con F-Q/G.
crecido en FES en un medio formulado con HC.
Tabla R.13. Ensayo de actividades enzimáticas.
Tabla R.14. Producción y producción relativa de actividad quitinasa en
un reactor tubular rotatorio a escala semi-piloto.
RESUMEN
Resumen
RESUMEN
La quitina, es un polímero lineal β-1,4 de N-acetil-D-glucosamina

(GlcNAc), es un importante componente estructural de la mayoría de los
crustáceos, insectos, algas y hongos. Las quitinasas son enzimas que
degradan la quitina a quitino-oligosacáridos y acetil glucosamina y son
sintetizadas principalmente por bacterias y hongos.
Estas enzimas tienen aplicaciones potenciales en la industria

farmacéutica, alimentaria y agronómica donde podrían desempeñar un
importante papel en biocontrol y en el tratamiento de enfermedades de
las plantas, debido a que no son tóxicas, son biodegradables y
biocompatibles.
En este trabajo se ha estudiado la producción de quitinasas por

Bacillus licheniformis ATCC 21415, Trichoderma atroviride CEC-T23 y
Trichoderma harzianum CEC-T24 crecidos en diferentes medios de
cultivo formulados con subproductos agroindustriales ricos en quitina
procedentes de hongos comestibles (Agaricus Bisporus) y crustáceos
(Procambarus clarkii) como fuente principal de carbono en un intento de
producir estas enzimas de una manera económicamente viable, y darle
un uso práctico a estos subproductos, además del de poder utilizarse
como fuente de partida para obtener quitina. Lo que es habitual en el
caso de los subproductos de crustáceos pero, hasta la fecha, no lo es
para los subproductos de la industria de los hongos y setas comestibles.
Este trabajo es uno de los primeros, sino el primero, que aborda de

manera sistemática la utilización de los subproductos ricos en quitina de
la industria de los hongos y setas comestibles para obtener productos de
P á g i n a | iii
Resumen
alto valor añadido, diferentes de la quitina y el quitosano. Concretamente

nos hemos centrado en el estudio de la producción de enzimas
hidrolíticas, fundamentalmente quitinasas.
Para ello se ha procedido de la siguiente manera:
 Estudio de la preparación y caracterización de la fuentes de

fermentación a partir de subproductos agroindustriales (harina de tallos
de champiñón, HTCH, Fraccion enriquecida de quitina y glucano, F-Q/G,
y harina de cangrejo, CFM).
 Estudio de la producción de quitinasas por fermentación en estado
sólido (FES) y fermentación sumergida (FS)
 Estudio de la extracción, concentración/fraccionamiento y
estabilización de enzimas (quitinasas).
 Estudio de la secreción de proteínas (secretoma) de B. licheniformis
ATCC 21415 o T. harzianum CEC-T24 crecido en los diferentes medios
de cultivo, mediante técnicas electroforéticas y proteómica.
 Estudio de la producción de quitinasas a escala semi-piloto.
 Estudio de la estabilización y/o inmovilización de concentrado de
quitinasas en forma de nano/micropartículas para su uso como
plaguicida alternativo al uso de productos químicos altamente tóxicos
para el medio ambiente.
De nuestros resultados podemos concluir que todos los

microorganismos produjeron una mayor producción de actividad
quitinasa en un medio formulado con HTCH y F-Q/G como fuente de
carbono en comparación con los medios formulados con Qp o Qc. De
los tres microorganismos utilizados en este estudio, T. harzianum CEC-
P á g i n a | iv
Resumen
T24 mostró la mayor productividad de quitinasa (873,98 UI L-1día-1) en el

medio HTCH+A en Fermentación en estado sólido.
La producción de quitinasa se controló mediante la medida de actividad

y de proteína y el perfil de enzimas/proteínas secretadas al medio de
cultivo se ha seguido, en un principio, por PAGE-SDS. El análisis
electroforético permitió la detección de 25 proteínas diferentes entre
ellas cinco quitinasas con masas moleculares 82, 65, 48, 31 y 25 kDa,
respectivamente. Sin embargo, cuando se estudian las proteínas
secretadas por T. harzianum CEC-T24 en los diferentes medios, es
decir, cuando analizamos su secretoma, mediante técnicas proteómicas
el número de enzimas/proteínas detectadas es mucho mayor: 183 en
medios formulados con HTCH, 161 en medios formulados con F-Q/G y
91 en medios formulados con HC.
Además cuando se crece T. harzianum CEC-T24 en un reactor tipo

tambor rotatorio, a escala semi-piloto (1 Kg de medio de cultivo), bien
controlado, la productividad es 4,63 veces superior a la descrita para
medios aireados en matraces.
Estos resultados muestran que el cultivo de T. harzianum CEC-T24

por fermentación en estado sólido, en un medio de fermentación, en un
reactor tipo tambor rotatorio, con buen control de aireación y humedad,
basado en el uso de subproductos ricos en quitina (HTCH), procedente
de la industria del champiñón, barato y abundante representa un buen
procedimiento para la producción a gran escala de quitinasas.
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ABSTRACT
Abstract
ABSTRACT
(Pendiente de Traducción)
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Abstract
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Abstract
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GLOSARIO
Glosario
GLOSARIO
ACN: Acetonitrilo. KDa: Kilodaltons.

AOAC: Método oficial de análisis LB: CALDO LURIA (Luria Bertani).
(Association of Official Analytical LTQ-FT:
Chemists). mA: miliamperios.
APS: Persulfato amónico. Mm: Medio mínimo.
ATCC: Colección Americana de mM: milimolar.
Cultura Tipo (American Type Culture MO: Materia orgánica.
Collection). nm: nanómetros.
BSA: Seroalbúmina bovina. Nt: Nitrógeno total.
CAZy: Carbohydrate-Active enzymes. p.s: peso seco.
CID: Dominio de inserción de quitina. p/p: Peso/Peso.
DNS: Ácido dinitrosalicílico. p/v: Peso/Volumen.
FAO STAT: Organización de las PAGE: Polyacrilamide gel
naciones unidas para la alimentación electroporesis.
y la agricultura, división de PB: Potato Broth = Extracto de
estadística. Patata.
FAO: Organización de las naciones PDA: patata-dextrosa-agar.
unidas para la alimentación y la PM: Peso Molecular.
agricultura. Qc: Quitina Coloidal.
FES: Fermentación en estado sólido. QOS: Quitinoologosacáridos.
F-Q/G: Fracción de quitina/ glucano. Qp: Quitina en Polvo.
FS: Fermentación Sumergida. rpm: revoluciones por minuto.
g: ges o fuerza centrífuga relativa SDS: Dodecilsulfato sódico.
(RCF). Sm: Serratia marcescens.
GH: Glicosil-hidrolasas o TCA: Ácido tricloroacético.
Glicohidrolasas. TEMED: Tetrametiletilendimina.
GlcNAc: N-Acetilglucosamina. Agente polimerizador de la
HC: Harina de Cangrejo. acrilamida.
HC: Hidratos de Carbono. TIM: dominio barril (β / α) 8 de la
HTCH: Harina de Tallos de triosfosfato isomerasa.
Champiñón. Tm: Toneladas métricas.
IUCN: Unión internacional para la UI: Unidad Internacional de actividad
conservación de la naturaleza. enzimática.
IUPAC: International Union of Pure v/v: Volumen/Volumen.
and Applied Chemistry/ Union %T: Transmitancia.
Internacional de Química Pura y +A= Con Aireación.
Aplicada. -A= Sin Aireación.
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Glosario
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INTRODUCCIÓN
Introducción
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Quitinasas
1.1.1 Generalidades
Las quitinasas (E.C. 3.2.2.14) representan una clase o grupo de

enzimas con un amplio rango de aplicaciones prácticas debido al papel
clave que desempeñan en la degradación de polímeros cristalinos. Las
quitinasas catalizan la degradación o rotura de enlaces β-14 en la
quitina (C8H13O5N)n, segundo polímero más abundante en la naturaleza
después de la celulosa. La quitina es un componente estructural de la
pared de los hongos [Langner y Göhre, 2016], del exoesqueleto e
intestino de los insectos y el caparazón de los crustáceos
[Merzendorfer, 2003; Hamed y col., 2016]. Enormes cantidades de
éste polímero se sintetizan en la biosfera, y alrededor de 10 11 toneladas
métricas se producen anualmente solo en la biosfera acuática [Tsujibo
y col., 1998]. El quitosano se produce tras la desacetilación de este
polímero.
La quitina puede aparecer de tres formas distintas, que difieren en la

orientación de las cadenas polisacarídicas en las microfibrillas, siendo
estas: α-, β- y γ-quitina (Figura-I.1) [Fortuna-González, 2010]. La α-
quitina es la más abundante, tiene una configuración antiparalela,
presenta una estructura cristalina altamente ordenada causada por un
fuerte enlace de H lo que conduce a ser una estructura muy rígida,
intratable e insoluble. Las extremidades de cangrejos y conchas de
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Introducción
camarón así como las paredes celulares de hongos están constituidas

por este tipo de quitina [Beier y Bertilsson, 2013]. La β-quitina presenta
una configuración paralela y un débil enlace de H, es inestable y soluble
en agua, y mientras que la γ-quitina presenta una configuración paralela
y antiparalela [Sastoque, 2005]. Las dos últimas tienen propiedades
mecánicas más flexibles y son fácilmente degradadas por enzimas
especialmente quitinasas.
Figura I.1. Diferentes formas de la quitina.
La quitina juega un papel muy importante en el esqueleto de ciertos

organismos como crustáceos, moluscos, insectos, y hongos
constituyendo el 75% del peso de estos organismos (Figura-I.2), siendo
estos los necesarios para la producción de quitinasas.
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Introducción
Figura I.2. Organismos que en su estructura contienen quitina.
La hidrólisis enzimática de la quitina a N-acetil-D-glucosamina se

lleva a cabo mediante un sistema que implica la participación de dos
tipos de hidrolasas: Quitinasas y Quitobiasas.
Las quitinasas constituyen un grupo o clase de enzimas con

estructuras y mecanismos de acción diversos que
determinan/condicionan su utilización/aplicación en los diferentes
campos, tales como control de enfermedades de plantas, y plagas de
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Introducción
insectos [Patil y col., 2000], síntesis de quitinooligosacáridos (QOS)

[Yang y col., 2016a] para su uso en la industria alimentaria y química
(síntesis de drogas/fármacos), aprovechamiento de residuos y
subproductos marinos y agroalimentarios ricos en quitina, y en la
producción de bio-fuel [Swiontek y col., 2014; Ramírez y Calzadíaz,
2016].
Aunque la clasificación, características y las aplicaciones de las

quitinasas han sido tratadas en numerosas revisiones por diferentes
autores [Patil y col., 2000; Swiontek y col., 2014; Herrera-Estrella y
Chet, 1999; Hartl y col., 2012; Singh y col., 2014; Rathore y Gupta,
2015; Stoykov y col., 2015], ninguno ha discutido detalladamente la
diversidad de las quitinasas como posible causa de sus aplicaciones
prácticas. Por ello en la presente introducción pretendemos discutir
estos temas haciendo especial énfasis en la diversidad de las fuentes,
características estructurales y propiedades mecanicistas de las
quitinasas, como principal factor limitante en el desarrollo y utilización de
esta clase de enzimas en el campo industrial.
1.1.2 Clasificación de las quitinasas
Bernard en 1911 observó por primera vez una fracción quitinolítica

termoestable y difusible (quitinasas) al aislarlas a partir de pulpa de
orquídea. Posteriormente fue confirmada por Karrer y Hoffman quienes
obtuvieron enzimas quitinolíticas a partir de caracoles [Felse y Panda,
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Introducción
1999]. Actualmente las quitinasas se clasifican siguiendo diferentes

criterios.
- Clasificación según la Comisión de Enzimas de la IUPAC
De acuerdo con las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de

la Union Internacional de Bioquímica y Biología Molecular
(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and
Molecular Biology NC-IUBMB), de acuerdo con la reacción que catalizan
las quitinasas son hidrolasas que rompen enlaces glicosídicos en
moléculas de quitina, es decir, se encuentran agrupadas dentro de la
clase tres, correspondiente a las Glicosil-hidrolasas (GH) o
Glicohidrolasas (GH) y les corresponde por tanto como números del
código de clasificación: EC 3.2.1.x., donde x representaría el número de
catálogo u orden.
- Clasificación basada en la secuencia aminoacídica y

ordenamiento espacial (arquitectura de dominios)
Las quitinasas según su secuencia aminoacídica, en la base de datos

CAZy, se agrupan dentro de las siguientes tres familias: familia 18, 19 y
20 [Lombard y col., 2013] como se muestra esquemáticamente en la
Figura-I.3.
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Introducción
Figura I.3. Clasificación de las quitinasas bacterianas de acuerdo con

su mecanismo de acción y forma del centro activo.
Las quitinasas, aunque catalizan el mismo tipo de reacción, difieren

notablemente en sus secuencias aminoacídicas y propiedades
catalíticas [Vocadlo y col., 2008], y aunque hay una ambigüedad
inherente en esta taxonomía [Duo-Chuan, 2006], estas tres familias han
sido validadas bioquímicamente como enzimas con actividad
quitinolíticas.
Las familias GH-18 y GH-19 se consideran quitinasas ya que

catalizan la degradación de polímeros de quitina. La familia GH-20
incluye la quitobiasa y β-N-acetil-hexosaminidasa que catalizan la
degradación del disacárido quitobiosa (N-acetilglucosamina)2, y N-
acetilgalactosamina o glucosamina de glicoconjugados [Patil y col.,
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Introducción
2000; Vaaje-Kolstad y col., 2013].
En la familia 18 se encuentran quitinasas de organismos como

bacterias, hongos, virus, animales y algunas plantas; que han
desarrollado mecanismos de degradación de quitina altamente eficientes
debido a que secretan quitinasas con propiedades sinérgicas probadas
experimentalmente con Serratia marcescens que tiene la capacidad de
secretar hasta cuatro enzimas quitinolíticas cuya función es actuar
durante el desarrollo y como mecanismo de defensa [Brurberg y col.,
1996; Suzuki K y col., 2002; Rathore y Gupta, 2015].
Toda la familia GH-18 se caracteriza por contener en su zona

catalítica una estructura consistente con un dominio tipo barril (β/α) 8 TIM
[Umemoto y col., 2015; Perrakis y col., 1994; Takuo, 1999; Yang y
col., 2010].
Las quitinasas de la familia GH-19 se describieron por primera vez en

plantas superiores y más tarde en Streptomyces [Ohno y col., 1996;
Shimosaka y col., 2001], los miembros de esta familia se producen
como un mecanismo de defensa frente a hongos patógenos. La primera
quitinasa de esta familia se ha aislado a partir del hongo Nosema
bombycis [Han y col., 2016], además varios genes de estas quitinasas
se han encontrado en Caenorhabditis elegans con actividad nematicida
[Chen y col., 2017].
El dominio catalítico en la familia GH-19 está formado por un dominio

rico en α-hélices tipo lisozima, caracterizado por la existencia de una
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Introducción
hendidura profunda [Kezuka y col., 2006]. La familia GH-20 comprende

a la β-N-acetilhexosaminidasa que ha sido descrita en Streptomyces y
en humano [Polaina, 2004].
- Clasificación basada en el mecanismo
De acuerdo con el mecanismo, las quitinasas se clasifican en dos

grandes categorías: Endoquitinasas (E.C. 3.2.1.14) y Exoquitinasas
(E.C. 3.2.1.200 y E.C. 3.2.1.201). Las primeras degradan aleatoriamente
en los sitios internos del extremo reductor de la cadena, formando así la
di-acetil-quitobiosa dimérica y multímeros solubles de baja masa
molecular tales como la quitotriosa, la quitotetraosa y la quitopentosa.
Las Exoquitinasas actúan sobre el extremo no reductor de la cadena y
se dividen en 2 subcategorías: quitobiosidasas (EC 3.2.1.29),
involucradas en la catálisis de la liberación progresiva de di-acetil-
quitobiosa desde el extremo no reductor de la cadena y la N-
acetilglucosaminidasa (EC 3.2.1.52), que escinde los productos
oligoméricos de endoquitinasas y quitobiosidasas generando
monómeros de GlcNAc. Logrando de esta manera la lisis completa del
polímero (Figura-I.4) [Di Rosa y col., 2016; Sahai y Manocha, 1993].
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Introducción
Figura I.4. Hidrólisis Enzimática de la Quitina.
Datos recientes indican que la forma endo se activa en sustratos

solubles como el quitosano y la forma exo se activa en la degradación
de sustratos cristalinos debido a que tiene una mejor accesibilidad a los
extremos de la cadena [Horn y col., 2006; Sikorski y col., 2006].
La clasificación de las quitinasas depende principalmente de la

naturaleza del sustrato. Por ejemplo en el exoesqueleto de los insectos
predomina quitina y proteína mientras que las paredes celulares de los
hongos contienen quitina y glucanos y su estructura es más fácil de ser
degradada.
Las quitinasas son sintetizadas principalmente por bacterias y

hongos, tienen un peso molecular que varía entre 20 kDa y 90 kDa
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Introducción
aproximadamente, tienen un pH óptimo entre 5 y 8, y son estables a una

temperatura entre 37 - 50 ˚C [Zhang y col., 2018]. Su tamaño varia de
350 hasta más de 800 aminoácidos, dentro de estas se encuentran
proteínas modulares que contienen cadenas de 250 a más de 400
aminoácidos [Warren, 1996].
1.1.3 Importancia y Aplicaciones de las Quitinasas
Las quitinasas desempeñan papeles importantes en diversos

organismos, entre los que cabe destacar a) Ayudan a regenerar o
renovar la estructura de ciertos organismos que poseen un esqueleto
duro, lo que le confiere su tamaño y forma, b) en organismos que atacan
a otros organismos que contienen quitina facilitando el uso de ésta como
fuente carbonada, degradando el polímero en metabolitos absorbibles,
permitiendo su uso como fuente de energía, y c) en caso de infección
por microorganismos con recubrimientos de quitina, ayudará a degradar
su estructura proporcionando inmunidad y defensa frente a patógenos
infecciosos.
En las Bacterias las quitinasas están implicadas en la nutrición debido

a que suministran nitrógeno y carbono como fuente de nutrientes y
además secretan quitinasas durante la patogénesis en huéspedes que
contienen quitina, de esta manera juegan un papel importante en el
parasitismo [Dahiya y col., 2006; Adrangi y col., 2010; Cohen-Kupiec
y Chet, 1998; Busby y col., 2012; Nakanishi y col., 2001].
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Introducción
Las quitinasas fúngicas cumplen un papel importante en la nutrición,

autolisis, defensa, parasitismo y morfogénesis en diferentes fases
durante su desarrollo. Los hongos entomopatógenos están implicados
en el control biológico y actúan como agentes para controlar insectos y
plagas. Además la proteína específica de unión quitinasa/quitina puede
ser utilizada para la detección en casos de infección fúngica invasiva en
pacientes inmunodeprimidos [Gooday y col., 1992; Fang y col., 2012;
Lupetti y col., 2011; Yang y col., 2010; Yu y col., 2015; Hartl y col.,
2012; Xia y col., 2001].
Las quitinasas de los insectos están involucradas en la degradación

de la cutícula vieja y síntesis de una nueva, en caso de que sea
necesario regenerar su cutícula, para ello los insectos producen
diferentes tipos de quitinasas específicas, de modo que puedan actuar
durante la metamorfosis evitando así una inhibición en su desarrollo.
Además ciertos insectos contienen quitinasas en su veneno y saliva con
el fin de degradar la cutícula del huésped [Zhang y col., 2011; Zhu y
col, 2008].
Las quitinasas de las plantas son generalmente endoquitinasas y su
peso molecular es menor que las quitinasas de insectos, las quitinasas
son proteínas que se encuentran relacionadas con la patogénesis,
actúan como autodefensa frente a un ataque de fitopatógenos [Gooday,
1999; Al-Ahmadi y col., 2008].
En los vertebrados las quitinasas pueden encontrarse en el tracto

digestivo y gastrointestinal actuando como una enzima quitinolítica, por
lo que las quitinasas en los mamíferos juegan un papel muy importante
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Introducción
proporcionando inmunidad innata y en la digestión de alimentos. En

humano, se ha encontrado niveles altos de quitinasas en pacientes con
malaria, enfermedad causada por el protozoo Plasmodium falciparum. El
aumento en la secreción de quitinasas en el organismo está relacionado
con ciertas afecciones fisiopatológicas dominadas por las células Th2
que incluyen infección, fibrosis, alergia y asma. Puede ser utilizado
como un biomarcador en casos de asma, al aumentar la secreción de
quitinasa durante la inflamación a través de un mecanismo dependiente
de interleucina, de modo que al inhibir la proteína se reduzca la
inflamación, permitiendo ser una alternativa en la terapia del asma
[Oshima y col., 2002; Shen y col., 2013; Renkema y col., 1995;
Suzuki y col., 2001; Muzzarelli, 2010; Komi y col., 2016; Shuhui y
col., 2009; Nagpure y col., 2014; Duru y col., 2013; Komi y col.,
2018].
Las quitinasas en general son importantes debido a que tienen varias

aplicaciones industriales, agrícolas y además pueden ser utilizadas en
agronomía para el control de enfermedades y plagas de insectos en
plantas. La capacidad que tienen las quitinasas para degradar la quitina
las hace muy valiosas en la gestión de residuos, especialmente en el
manejo de desechos marinos y además pueden ser utilizadas para la
producción de biocombustibles [Yang y col., 2016a; Swiontek
Brzezinska y col., 2014; Ramírez y Calzadíaz L, 2016].
Las quitinasas desempeñan un papel importante en la generación

de: i) protoplastos fúngicos utilizados para estudiar la síntesis de la
pared celular; ii) la producción de proteínas unicelulares que pueden
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Introducción
ser utilizadas como un alimento o un complemento alimenticio; iii) la

producción de quitooligosacáridos, N-acetilglucosaminas y
glucosaminas que tienen amplias aplicaciones en la industria
farmacéutica, etc. Además, pueden usarse en la atención de la salud
humana, en la terapia de enfermedades fúngicas y como aditivos en
cremas antimicóticas [Dahiya y col., 2006]. En la Figura-I.5 se muestra
esquemáticamente el amplio espectro de usos de las quitinasas.
Figura I.5. Principales aplicaciones actuales de las quitinasas según

su mecanismo de acción.
1.3.1.1 Quitinasas y Agronomía
Las quitinasas presentan una serie de aplicaciones biológicas

importantes en agronomía debido a su efecto beneficioso sobre las
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Introducción
plantas, tales como: i) mejoran el crecimiento y desarrollo, mejoran la

capacidad de germinación, la longitud y actividad de la raíz, altura y
tamaño de las plántulas, y floración [Falcón-Rodríguez y col., 2012]; ii)
proporcionan inmunidad innata [Subha Narayan y col., 2015], brindan
una mejor respuesta fisiológica [Katiyar y col., 2015], facilitan la
acumulación de minerales durante su crecimiento [Schultze y
Kondorosi, 1996; Chatelain y col., 2014], y ademas podrían funcionar
como una posible vacuna frente a las enfermedades de las plantas [Yin
y col., 2010].
Las plantas al ser sésiles han desarrollado mecanismos para

adaptarse a variaciones tanto bióticas como abióticas, los
quitooligosacáridos actúan directamente frente a cada una de estas
variaciones proporcionándoles un mecanismo de defensa. Las
quitinasas de la familia 19 son utilizadas en el control biológico y como
fitopatógenos fúngicos, debido a que estas producen un mecanismo de
defensa frente al ataque contra hongos patógenos [Kawase y col.,
2006].
El control biológico es un método de control de plagas y

enfermedades de las plantas que consiste en utilizar otros organismos
vivos como mecanismo de defensa frente a fitopatógenos. Se desarrolla
de manera intencional, directa por parte del hombre o indirecta mediante
el manejo de interacciones existentes en el ecosistema agrícola [Flint y
Dreistadt, 1998].
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Introducción
El control biológico puede llevarse a cabo de distintas maneras:

utilizando sustancias y compuestos obtenidos a partir de la misma planta
y en algunos casos usando otras plantas que actuarían como control
biologico (alelopatía, plaguicidas botánicos, cultivos trampa, etc.),
además de depredadores, parasitoides y patógenos. Entre los
microorganismos patogénicos se incluyen bacterias, hongos y virus, que
tienen la capacidad de matar o debilitar a sus huéspedes [Huffaker y
col., 1984].
Las bacterias usadas como control biológico infectan a los insectos

por vía digestiva, entre estos los más utilizados son Bacillus
thuringiensis que controla mariposas, polillas, escarabajos, moscas y
otros insectos plaga, se utiliza además en los cultivos para
proporcionarle más resistencia frente a estas plagas y evitar el uso de
otros plaguicidas [Lemaux, 2008].
Los hongos denominados como hongos entomopatógenos son

aquellos organismos que producen una patogénesis letal en insectos o
arácnidos, excluyendo aquellos hongos facultativos que pueden crecer
sobre insectos o sustratos que contengan quitina. Estos hongos tienen
la capacidad de atacar al insecto a través de la cutícula externa que está
formada por una capa delgada que contiene lípidos y otra más gruesa
que contiene quitina [Evans y col., 1988]. Dentro de este grupo se
encuentran 89 especies de Trichoderma que son utilizados contra
fitopatógenos [Fry William, 2012].
P á g i n a | 17
Introducción
Entre los virus capaces de producir quitinasas y que comúnmente se

utilizan como insecticida biológico destacan los baculovirus.
Los beneficios de la utilización de controles biológicos en los cultivos

es proporcionar sostenibilidad a los cultivadores, disminuyendo la
contaminación del agua y además no perjudican la estructura del suelo y
son de gran importancia económica en la agricultura. Actualmente el
mercado de bioplaguicidas representa sólo una pequeña parte del
mercado global, pero se espera que crezca muy rápidamente para el
2022 con tasa de crecimiento de 15,34 % [Chen, 2017].
Desde 1980 la quitina en polvo de ciertos crustáceos se ha utilizado

para los cultivos como bioplaguicidas, biofertilizantes y en forma de
biofilm [Ha y Huang, 2007; El Hadrami y col., 2010; Trouvelot y col.,
2014]. Las quitinasas son de especial interés para los investigadores
debido a que tienen varias características que determinan su actividad y
su idoneidad para aplicaciones de campo. Entre estas cabe destacar: su
aplicación en el control biológico de las plantas permitiendo de esta
manera su uso como un pesticida alternativo, evitando el uso de
pesticidas químicos que son caros, contaminan el medio ambiente y
producen resistencia a ciertos patógenos, además de que no son
tóxicos, son biodegradables, biocompatibles y tienen selectividad frente
a una plaga [Barboza-Corona y col., 2008; Patil y col., 2000; Czaja y
col., 2015].
P á g i n a | 18
Introducción
1.1.3.2 Quitinasas en la Industria Alimentaria
Uno de los problemas más comunes para la industria hortofrutícola es

el deterioro de frutas y hortalizas en post-cosecha, ya que representa
pérdidas económicas importantes. Se estima que alrededor del 20-25%
de las cosechas se deterioran por patógenos durante el manejo post-
cosecha [Alkan y Fortes, 2015].
Recientemente se está viendo que la quitinasas por sí solas o en

combinación con otras enzimas, fundamentalmente proteasas, podrían
tener un gran papel en la industria alimentaria; donde además de poder
utilizarse como aditivo y potenciador del sabor [Hamed y col., 2016;
Jung y Park, 2014], también podrían utilizarse en la elaboración de
envases activos (antimicrobianos) utilizables para la conservación,
protección y comercialización de los alimentos frescos con el objetivo de
extender su vida media manteniendo su calidad nutricional y seguridad
alimentaria [Ozdemir y Floros, 2010], debido a que los alimentos
frescos pueden contener microorganismos que podrían deteriorar los
alimentos. Por ello esta aplicación emergente de las quitinasas, bien en
forma de sprays o en películas, es de gran interés, ya que su uso podría
prolongar la vida media de alimentos frescos perecederos [da Silva,
2019], evitando el desarrollo de hongos y bacterias que afectan al
alimento fresco, como por ejemplo manzanas, naranjas, peras,
mandarinas etc., e incluso los champiñones.
P á g i n a | 19
Introducción
1.1.3.3 Otras Aplicaciones de Quitinasas
Actualmente las quitinasas son de gran interés a nivel industrial

debido a su uso directo o más frecuentemente al uso de los productos
obtenidos a partir de su acción sobre sustratos ricos en quitina. De esta
manera las quitinasas y/o sus productos (quitino-oligosacáridos) son
utilizados en diversas aplicaciones en la industria medico-farmacéutica,
debido a que tienen propiedades hipoalergénicas, hipocolesterolémicas,
antitumorales, antibacterianas, antifúngicas, antioxidantes y de
cicatrización de heridas, el desarrollo de sistemas de administración de
fármacos, fabricación de materiales quirúrgicos e implantes y además en
la preparación de suplementos dietéticos para mejorar el sistema
inmunológico [Martínez y col., 2012; Askolin y col., 2001; Howard y
col., 2003; Nguyen-Thi y Doucet, 2016].
1.1.4 Producción de Quitinasas por Fermentación
Las quitinasas se pueden producir mediante varios tipos o procesos

biotecnológicos de fermentación, tales como: fermentación en estado
sólido, o fermentación sumergida, bien bajo la modalidad de
fermentación discontinua, fermentación semicontinua o fermentación
continúa [Joshi y col., 1989]. Normalmente estos procesos de
fermentación suelen llevarse a cabo en medios formulados con
productos ricos en quitina [Bautista y col., 1986], ya que la quitina
externa presente en el medio de cultivo, induce la expresión de
quitinasas extracelulares. Los organismos que son capaces de producir
quitinasas extracelulares consumen quitina como fuente potencial de
P á g i n a | 20
Introducción
carbono y nitrógeno [Dahiya y col., 2006].
Se entiende por fermentación al proceso en el que los

microorganismos tienen la capacidad de producir metabolitos o biomasa
mediante el uso de sustancias orgánicas en ausencia o presencia de
oxígeno [Hernández, 2013]. Los microorganismos obtienen su energía y
fuente de carbono a través de la degradación de los compuestos
orgánicos, en este caso de la quitina, y producen ciertas enzimas, entre
estas quitinasas [Ward, 1989].
A escala industrial la producción de quitinasas, aunque relativamente

limitada en comparación con otras enzimas hidrolíticas, se suele llevar
acabo bien en fermentación sumergida o en fermentación en estado
sólido, utilizando sustratos ricos en quitina como inductor, generalmente
derivados de crustáceos, procedentes del procesamiento industrial o de
restos marinos [Rojas-Avelizapa y col., 1999]. Sin embargo, el uso de
sustratos ricos en quitina procedentes de otros orígenes, hasta la fecha,
se han utilizado mucho menos e incluso en algunos casos no se han
utilizado nunca. Este sería el caso de los subproductos del cultivo de
hongos comestibles, particularmente del cultivo del champiñón.
a) Fermentación en Medio Sólido
La fermentación en medio sólido tiene sus orígenes desde nuestros

ancestros, estos procesos tradicionales se desarrollaban en diversas
partes del mundo, uno de estos ejemplos es el Koji y el Tempeh,
alimentos preparados por el cultivo de hongos filamentosos (Rhizopus
P á g i n a | 21
Introducción
oligosporus) sobre materiales sólidos que posteriormente las personas

lo consumían y al igual forma los quesos Camembert y Roquefort en
Europa. Tanto en Asia como Europa en la actualidad estos productos se
siguen produciendo de la misma manera o ligeramente modificados
[Pandey, 1992].
Este tipo de fermentaciones se suele utilizar para la obtención de

enzimas fúngicas, debido a que el sustrato con una cantidad limitada de
agua pueda utilizarse como soporte para el crecimiento de los hongos,
evitando de esta manera el crecimiento de otros microorganismos como
bacterias y levaduras. Los hongos tienden además a adaptarse de mejor
manera a los sustratos sólidos húmedos, permitiendo de esta forma la
obtención de productos únicos [Viniegra, 2000] gracias a la secreción
de enzimas hidrolíticas que les permite obtener el alimento y la energía
necesaria para su desarrollo.
Las ventajas de utilización de este tipo de fermentación es que el

costo de inversión, coste energético y volumen de agua residual
producida es menor [Ward, 1989]. Además de que se obtienen cultivos
con alta estabilidad y alta eficiencia biosintética, tienen mejor contacto
con el sustrato y por lo tanto mejor difusión de oxígeno, poco gasto de
energía, y menor susceptibilidad al estrés osmótico, esto se debe a que
el crecimiento del microorganismo en este tipo de cultivos se presenta
de forma heterogénea con la posibilidad de encontrar diferentes
gradientes de concentración [Viniegra y col., 2003]. Aunque, este tipo
de cultivo tiene como desventaja que no se puede controlar fácilmente el
pH, y la temperatura y además la esterilización del sustrato, cuando esto
P á g i n a | 22
Introducción
sea necesario, no suele ser tan fácil como en el caso de las

fermentaciones sumergidas, debido a la naturaleza heterogénea de éste
[Raimbault, 1998].
Existen escasos artículos sobre la producción de quitinasas mediante

fermentación en estado sólido. Normalmente el cultivo suele llevarse a
cabo mediante el sistema de bandejas o en tanques rotatorios utilizando
como sustratos diversos subproductos agroindustriales suplementados
con quitina colidal [Suresh y Chandrasekaran, 1998; Suresh y
Chandrasekaran, 1999]. Sin embargo, el uso de subproductos ricos en
quitina directamente como sustrato no se ha estudiado.
b) Fermentación en Estado líquido o Sumergida
Se conoce como fermentación sumergida aquella en la que todos los

nutrientes se encuentran disueltos formando una única fase, y se suele
llevar a cabo mediante el control de determinados parámetros
fisicoquímicos (pH, temperatura, agitación, oxígeno disuelto, etc.)
[Vásquez Cárdenas, 2010].
Este método posee varias ventajas como: obtención de un producto

más homogéneo, se puede controlar la temperatura, aireación, agitación
y pH, la biomasa se puede medir directamente es por ello que es uno de
los métodos más usados en la Industria Biotecnológica [Raimbault,
1998].
Las fermentaciones sumergidas pueden llevarse a cabo de diferentes
P á g i n a | 23
Introducción
maneras o procedimientos, entre los que destacan: la fermentación

discontinua, y la fermentación continua. Si bien también se pueden
desarrollar mediante diversos tipos de fermentaciones semicontinuas.
c) Fermentación Discontinua
Se conoce también como fermentación discontinua o por lotes (batch)

donde los nutrientes o sustratos se suministran a un biorreactor de
acuerdo a la cantidad requerida, se esterilizan, inoculan y el proceso se
desarrolla bajo control de temperatura, pH, aireación y tiempo, logrando
de esta manera controlar fácilmente la concentración del sustrato y la
producción de los productos de interés [Yamane y Shimizu, 2005]. Una
vez finalizada la fermentación se cosecha el caldo de fermentación y
procede a la recuperación del producto a la vez que se reinicia el ciclo,
limpieza, carga de nutrientes, esterilización, inoculación, etc.
Una manera de aumentar la productividad es mediante la técnica de

repeated batch o semi-continua en la que no se cosecha el volumen
completo del fermentador si no una parte (normalmente el 90%) dejando
el restante 10% como inóculo y reponiendo el restante 90% con caldo
fresco estéril. De esta manera se aumenta la productividad ya que se
eliminan los tiempos de limpieza y esterilización del fermentador y del
medio cuando este se hace en el fermentador [Bautista y col., 1986].
d) Fermentación Continua
Las fermentaciones contínuas se realiza en biorreactores altamente

equipados con controles sofisticados, donde el sustrato es suministrado
P á g i n a | 24
Introducción
de manera controlada y de forma contínua. El proceso se realiza de

manera tal que el volumen extraído es repuesto a la vez por medio de
cultivo estéril, de manera continua. Este sistema permite la producción
en continuo de los productos de interés (enzimas), por ejemplo,
quitinasas. Este procedimiento requiere de un sistema de control
altamente sofisticado si bien permite obtener altos rendimientos y
productividad. [Fenice y col., 1998].
En relación con el sistema de producción, para la producción de

quitinasas se requiere de una buena elección del medio de cultivo. En la
mayoría de los casos las quitinasas se producen con una baja
concentración de enzima, por lo que en cultivos en estado sólido, al
utilizar volúmenes de medio de extracción más pequeños que los
volúmenes utilizados en fermentaciones sumergidas, la concentración
de la enzima es mayor. Este es el motivo por el que a veces se elige
esta modalidad de cultivo, ya que en el caso de las fermentaciones
sumergidas se requerirá de más pasos en los procesos de recuperación
y purificación, pudiendo convertirse en un problema a la hora de la
producción [Stoykov y col., 2015].
1.1.4.1 Microorganismos
Las quitinasas son producidas en un amplio abanico de

microorganismos, siendo los mayores productores de quitinasas
microbianas: Serratia marcescens, Serratia liquefaciens, Vibrio
vulnificus, Streptomyces spp., Myrothecium verrucaria, Trichoderma
P á g i n a | 25
Introducción
harzianum y T. atroviride [Horwitz y col., 1984; Joshi y col., 1988;

Wortman y col., 1986; Ueno y col., 1990; Ridout y col., 1988; Vyas y
Deshpande, 1989].
Trichoderma harzianum además de ser utilizado para producir

quitinasas ha sido empleado también para la recuperación de materiales
bioactivos como quitina/quitosano y quitino-oligosacáridos con actividad
antioxidante, utilizando como sustrato residuos o subproductos de
crustáceos, pero hasta la fecha no se han utilizado subproductos ricos
en quitina de origen fúngico. También se ha utilizado para combatir
infecciones de plantas por hongos patógenos y/o insectos ya que su
actividad quitinolítica permite que degrade la estructura de la pared
celular de los hongos fitopatógenos y los exoesqueletos de insectos,
pudiendo de esta manera ser utilizado como un control biológico [Nava,
2009].
Las bacterias utilizan la quitina como única fuente de carbono y
energía; logrando de esta manera secretar un coctel de quitinasas
durante la patogénesis en el hospedador o durante la hidrólisis de los
desechos quitinosos, lo que facilita su acción [Nakanishi y col., 2001].
Las quitinasas se expresan en varios organismos incluidos aquellos

que en su estructura no contienen quitina como plantas, bacterias, y
virus, pero se ha demostrado que para la producción en grandes
cantidades de esta enzima se requiere de sustratos específicos que
contengan quitina debido a que son utilizados como un inductor. La
producción de quitinasas está ampliamente distribuida en todos los
reinos vivos; siendo las bacterias y hongos los principales degradadores
P á g i n a | 26
Introducción
de quitina, y son importantes en el reciclaje biogeoquímico del carbono y

nitrógeno favoreciendo la hidrólisis de la quitina para uso propio o de
otros microorganismos [Adrangi y Faramarzi, 2013; Karasuda y col.,
2003; Shinoda y col., 2001].
1.1.4.2 Factores extrínsecos de Cultivo
La producción de quitinasas, como de cualquier otra enzima, viene

condicionada por una serie de factores extrínsecos tales como son la
naturaleza del sustrato (tipos de nutrientes), humedad, actividad del
agua, cantidad de CO2, O2, pH, temperatura, concentración, inóculo, y
tipo o sistema de cultivo. Pero de todos ellos, el medio de cultivo o
sustrato sobre el que se va a llevar a cabo el crecimiento y por tanto la
producción de quitinasas, es de especial interés tanto técnico como
económico [Smith y col., 1990; Byrne y Ward, 1989; Jüsten y col.,
1996; Oldshue, 1966; Einsele, 1978], como se discutirá más abajo.
En relación con los parámetros físico-químicos del cultivo, existen

trabajos en los que se indica que las quitinasas se expresan de pH
neutro a básico [Leger y col., 1998]. El pH de un cultivo puede cambiar
debido a ciertas actividades metabólicas por razones como: secreción
de ácido acético o láctico, la asimilación de ácidos orgánicos presentes
en ciertos medios, utilización de fuentes de nitrógeno y modificaciones
del sustrato. Por este motivo en el caso de cultivos en medio sólido hay
que considerar que el microorganismo a utilizarse tenga un amplio rango
de pH [Huerta, 2000].
P á g i n a | 27
Introducción
En cuanto a la temperatura, esta depende del microorganismo, si

bien, generalmente están sobre los 30 ˚C, aunque el uso de cepas
termoestables son grandemente deseables, sobre todo por las ventajas
que presenta trabajar a altas temperaturas, ya que desde el punto de
vista de posibles contaminaciones trabajar bajo estas condiciones de
altas temperaturas minimiza grandemente el riesgo [Mohamed y col.,
2019].
La aireación y agitación son parámetros fundamentales, sobre todo,

en cultivos en medio líquido, ya que una aireación y agitación
adecuadas facilitan la solubilidad del oxígeno y por lo tanto mejoran la
productividad; mientras que en un cultivo sólido la agitación puede tener
efectos negativos debido a que puede provocar la ruptura del micelio y
por lo tanto una disminución en la productividad [Smith y col., 1990; Cui
y col., 1997]. En el caso de los cultivos sólidos una buena aireación es
necesaria para lograr una buena oxigenación del cultivo, y por lo tanto
para el desarrollo del cultivo [Liu y col., 2003].
1.4.3 Medios de cultivo (Sustratos)
Si bien los parámetros físico-químicos, como hemos indicado más

arriba, son esenciales para la producción de quitinasas, como de
cualquier enzima, la naturaleza del sustrato, su disponibilidad y coste,
son fundamentales a la hora de su desarrollo e implantación. Estos han
de ser abundantes, no depender de estacionalidades, baratos y
contener cantidades importantes de quitina en su composición; ya que
tanto en fermentación en medio sólido como en medio líquido la
P á g i n a | 28
Introducción
producción de quitinasas, además de producirse constitutivamente, son

inducibles. Esto quiere decir que la utilización de una fuente rica en
quitina podría actuar como inductor para aumentar la producción de
quitinasas.
En general los sustratos, utilizados para producir quitinasas, son en

su mayoría subproductos derivados de crustáceos (industriales o
naturales) [Tengerdy, 1985; Pandey, 1992]. Sashiwa en 2002 fue el
primero que informó sobre la producción de quitinasas a partir de quitina
del caparazón de cangrejo con Aeromonas hydrophila H2330 [Sashiwa
y col., 2002]. A partir de ahí se han obtenido varias quitinasas de
diferentes organismos en sustratos que contienen quitina [Wang y col.,
2006; Suresh y Anil, 2012; Wang y col., 2012; Zhang y col., 2016;
Yang y col., 2016a; Yang y col., 2016b; Krolicka y col., 2018; Kumar
y col., 2017; Liu y col., 2013; Fu y col., 2016].
Sin embargo, también los subproductos agrícolas y derivados de la

industria agroalimentaria podrían ser de interés. Estos sustratos deben
tener en su composición importantes cantidades de nutrientes que
puedan ser utilizados como fuente carbonada y nitrogenada utilizables
como fuente de energía para el crecimiento y producción de las
enzimas, pero además deben contener quitina para que pueda actuar
como inductor de la síntesis de las quitinasas [Urbina-Salazar y col.,
2018]. Esto solo puede lograrse suplementándolos con quitina de
crustáceo coloidal o utilizando subproductos agroalimentarios ricos en
quitina por sí, como por ejemplo los subproductos del cultivo industrial
de setas y hongos comestibles.
P á g i n a | 29
Introducción
1.2 Subproductos Agroindustriales ricos en Quitina como

fuente de fermentación para la producción de quitinasas.
Desde de un punto de vista realista los dos principales subproductos

ricos en quitina son: el exoesqueleto de crustáceos procedente del
procesamiento industrial o de los grandes depósitos existentes en la
Antártida, y los subproductos agroindustriales procedentes de la
industria de setas y hongos comestibles [Urbina-Salazar y col., 2018] y
de la producción de ácido cítrico [Muñoz y col., 2015].
La quitina al presentar una estructura resistente, inflexible e insoluble

es difícil de eliminar o degradar, ocasionando de esta manera la
contaminación del medioambiente donde se deposita. Dependiendo del
origen de la quitina, la quitina de crustáceos se almacena en regiones
costeras y/o zonas industriales de procesamiento de mariscos y la
quitina de hongos comestibles (quitina fúngica) procedentes de las
Industrias conserveras del champiñón y producción de ácido cítrico.
En relación con los subproductos ricos en quitina procedentes de la

industria agroalimentaria, a pesar de la gran cantidad de
residuo/desecho que se generan anualmente hasta hoy en día no se
está desarrollando métodos o procedimientos adecuados para la
utilización de estos subproductos para su valorización como fuente de
compuestos de interés industrial y de alto valor añadido. Estos residuos,
debido a su composición, al ser procesados podrían generar
compuestos de gran interés, tales como: quitosano, quitooligosacáridos
P á g i n a | 30
Introducción
y glucosamina, que podrían tener diversas aplicaciones industriales

[Buruleanu y col., 2018].
El quitosano, obtenido por desacetilación de la quitina, bien por vía

química o por vía enzimática, se ha utilizado como materiales
funcionales en los campos de la alimentación, la salud o la agricultura
debido a su biocompatibilidad, no toxicidad y disponibilidad de biomasa
abundante y económica [Baranwal y col., 2018].
Los quitooligosacáridos, obtenidos bien por vía química o enzimática

tienen aplicaciones de gran interés en el campo de la Biotecnología. Los
quitooligosacáridos, obtenidos mediante procesos enzimáticos tienen un
mejor control del grado de polimerización y del grado de acetilación,
además no tienen efectos secundarios perjudiciales, a diferencia de los
obtenidos mediante procesos químicos que forman compuestos tóxicos
que son difíciles de eliminar y producen un efecto negativo para el medio
ambiente [Lodhi y col., 2014].
La N-acetil-glucosamina obtenida por degradación química o

enzimática de la quitina, tiene diversas aplicaciones tanto en la industria
alimentaria y como en la industria farmacéutica entre estas aplicaciones
está: la producción de ácido siálico [Ogata y col., 2009], bioetanol
[Inokuma y col., 2016], y proteínas unicelulares [Vyas y Deshpande,
1989], y como una terapia farmacéutica para trastornos de la inflamación
gastrointestinal [Salvatore y col., 2000], y artrosis [Shikhman y col.,
2005].
P á g i n a | 31
Introducción
Como hemos indicado, existen varios subproductos agroindustriales

ricos en quitina procedentes de la industria de hongos y setas
comestibles, residuos de la industria del ácido cítrico, residuos de
crustáceos y moluscos.
1.2.1 Subproductos de la Industria de Hongos y Setas

Comestibles
Agaricus bisporus es uno de los hongos comestibles cultivados en

gran escala a nivel mundial por lo que se considera de gran importancia
económica. El cultivo de champiñon nació por casualidad en Francia en
el siglo XVII al haber abonado su cultivo con estiércol de caballo y
utilizando como agua de regadío el agua que se usó para el lavado de
champiñones silvestres, observaron después de unos días que creció
una nueva variedad de champiñones. De esta manera se inició el cultivo
del champiñón usando tres componentes básicos: un sustrato orgánico
(estiércol de caballo) utilizado como medio de cultivo del hongo, un
inóculo (agua de lavado de champiñones) que contiene pequeños
residuos de tejido de champiñones y un microambiente adecuado
(temperatura, humedad y aireación) [Labarère, 1994].
Desde Francia se expandió el cultivo de champiñón hacia el resto de

Europa. En Estados Unidos aparece en 1880 tras ser introducido por
unos emigrantes españoles, en 1893 Costantin y Matruchot lograron
obtener el inóculo a partir de cultivos puros de Agaricus bisporus crecido
sobre un compost esterilizado (exento de patógenos) evitándose de esta
manera la propagación de enfermedades. Posteriormente se realizaron
P á g i n a | 32
Introducción
otros estudios en los que se indicaron que el champiñón requería

además de otros nutrientes esenciales como lignina, celulosa y
hemicelulosa [Hayes, 1977].
En España el cultivo de champiñón se inicia a principios de los años

cincuenta de manera artesanal, y se realizaba en cuevas, bodegas,
principalmente en la Rioja y Castilla - la Mancha. En la actualidad el
cultivo de champiñón se sigue realizando por el método del compostaje
pero con procesos más controlados [Pardo, 1994]; existiendo tres
métodos o procedimientos: el método francés, el método holandés y el
método americano.
En cuanto a la clasificación taxonómica el champiñón común,

champiñón de París -cuyo nombre científico es Agaricus bisporus- es
una especie de hongo basidiomiceto de la familia Agaricales nativo de
Europa y América del norte, cultivado extensamente para su uso
alimentario.
Descripción Taxonómica de Agaricus bisporus

Reino: Fungi
División: Basidiomycota
Clase: Agaricomycetes
Subclase: Agaricomycetidae
Orden: Agaricales
Familia: Agaricaceae
Género: Agaricus
Especie: Agaricus bisporus [Lange, 1926; Imbach, 1946]
Nombre Común: Champiñón
Nombre Científico: Agaricus bisporus
P á g i n a | 33
Introducción
Como puede observarse en la Figura-I.6, en la parte visible del

champiñón, o cuerpo fructífero, se pueden distinguir 2 partes principales:
el sombrero o píleo, y el pié, tallo o estípite, y en la parte subterránea del
champiñón se encuentra el micelio, cuyas células poseen una estructura
externa y rígida denominada pared celular que está protegida por la
membrana plasmática cuya función es la de mantener la forma y
protegerle de daños mecánicos, químicos y osmóticos.
Figura I.6. Morfología de Agaricus bisporus.
Estas paredes celulares contienen un alto porcentaje de

polisacáridos, seguidos de proteínas, lípidos, pigmentos y sales
minerales [Bartnicki-García, 1968]. Siendo el polisacárido más
importante la Quitina que se presenta en forma microfibrilar unida
covalentemente a un 1,3-1,6 β-glucano, a las que se asocian pequeñas
proporciones de glicanos y otros componentes de naturaleza fibrilar
como el mucílago [García Mendoza y col., 1987], formando de esta
manera un complejo fibrilar insoluble en álcali [López, 2003].
P á g i n a | 34
Introducción
Además de los polisacáridos, existen también ciertas proteínas que

juegan un papel importante en la estructura de la pared celular y otras
con funciones plásticas como el caso de las enzimas degradativas y
biosintéticas encargadas en el proceso de crecimiento y morfogénesis.
Los polisacáridos y proteínas contenidas en las paredes celulares son
digeridas por sus correspondientes enzimas degradativas ya sea para
cambios morfogenéticos durante su ciclo biológico o como parasitismo.
A este respecto, en los hongos y en particular en Agaricus bisporus ha
podido demostrarse la presencia de enzimas como glucanasas,
quitinasas y proteasas [Zhang y col., 2019].
La demanda de hongos comestibles ha incrementado drásticamente

en los últimos años debido al desarrollo de nuevos métodos de cultivo
mecanizados y al incremento en la aceptación de este tipo de productos
por parte de los consumidores, ya que cada vez se conocen más las
propiedades nutricionales y saludables de éste alimento [Atila y col.,
2017; Muszyńska, y col., 2017].
Según los datos obtenidos de la FAO la producción en el año 2016

fue de aproximadamente 10.790.859 Tm [FAO STAT, 2018a], de los
cuales Asia se encuentra en el primer lugar con un 76% de producción,
seguido por Europa (18%), América (5%); Oceanía y África con menos
del 1% (ver Figura-I.7).
P á g i n a | 35
Introducción
Figura I.7. Produccion mundial de Hongos y setas comestibles.

Adaptado de datos FAO STAT 2018a.
De la producción total correspondiente al continente europeo en el

año 2016 (Figura-I.8) el 9% corresponde a la producción de España
(197.010 Tm), siendo la Rioja el mayor productor y líder del país,
seguido de Castilla-La Mancha (La manchuela, Albacete). En Europa el
90% de la venta de hongos comestibles corresponde a la especie
Agaricus bisporus, sea esto para consumo en fresco o procesado en
forma de conservas [Fletcher, 2001]. Debido a su agradable sabor y
valor nutricional son muy apreciados por el consumidor, aunque tienen
como desventaja su corta vida media, unos 15 días a 4 ˚C, ya que son
altamente perecibles en fresco, debido al pardeamiento enzimático y
degradación.
P á g i n a | 36
Introducción
Figura I.8. Producción de Hongos y setas comestibles en Europa en

el 2016. Adaptado de datos FAO STAT 2018a.
Agaricus bisporus al conservarse en refrigeración (2 - 4 ˚C) reduce su

actividad microbiana que es el principal responsable de su deterioro y
puede permanecer así por un período de vida de hasta 13-15 días
utilizando películas plásticas y/o atmósferas especiales [Devece y col.,
1999; Kotwaliwale y col., 2007; Beelman y col., 1989; Burlo y col.,
2004].
La producción de hongos y setas comestibles en España en fresco es

del 75% (147.757 Tm), mientras que la comercialización actual en
conserva es del 25% (49.253 Tm) siendo un poco más alto en
comparación con años anteriores debido a la alta demanda
experimentada por los productos listos para el consumo,
específicamente en forma de conserva (ver Figura-R.9). El champiñón
en forma de conserva pasa por un tratamiento denominado escaldado,
que consiste en someter al champiñon a una temperatura adecuada que
tiene por objetivo reducir el pardeamiento enzimático, los champiñones
P á g i n a | 37
Introducción
se envasan en un recipiente de hojalata y son cerrados herméticamente

evitando cualquier tipo de contaminación [Biekman y col., 1997].
Figura I.9. Consumo de Hongos y setas comestibles en España en el

2016. Adaptado de datos FAO STAT 2018b.
Esta gran producción de hongos y setas comestibles genera 3 tipos

diferentes de subproductos o material de desecho: 1) compost agotado,
2) residuos de champiñón (tallos y champiñones no comercializables) y
3) el líquido de escaldado (Figura-I.10), representando un desafío
medioambiental para las Industrias del ramo, ya que su eliminación no
adecuada podría y puede generar graves problemas medioambientales
[Buruleanu y col., 2018].
Descartando el compost agotado, que no se tratará en este trabajo,

los otros dos subproductos generados en la producción y procesamiento
del champiñón son: los tallos y champiñones no comercializables
generados tanto en el procesamiento para fresco como en el
procesamiento de conservas, y el líquido de escaldado, generado
P á g i n a | 38
Introducción
únicamente en el procesamiento de conservas.
La mayor parte de estos residuos actualmente no se utiliza y en

algunos casos son utilizados como alimento animal o como abono,
fundamentalmente los tallos y champiñones no comercializables. Sin
embargo al ser un alimento rico en quitina y proteína podría ser utilizado
como fuente para la producción de quitinasas y de otros compuestos de
interés para las diferentes Industrias.
Figura I.10. Subproductos obtenidos del cultivo del champiñón.
En cuanto al líquido de escaldado, generalmente es vertido a la red,

en unos casos previo tratamiento en depuradoras y otros directamente.
P á g i n a | 39
Introducción
1.2.2 Subproductos de la Industria de Crustáceos
Los Crustáceos son un extenso grupo de artrópodos que se

caracterizan por tener un exoesqueleto formado principalmente por
quitina. Pertenecen a éste grupo las langostas (Palinurus elephas),
langostinos (Dendrobranchiata), percebes (Pollicipes pollicipes) y
cangrejos, que pueden habitar en distintos sitios como el mar, agua
salobre y agua dulce dependiendo de la especie.
En relación con nuestra ubicación (Sevilla, España), la principal

fuente de subproductos ricos en quitina se localiza en la zona de los
arrozales de las Marisma del río Guadalquivir, donde desde los años
1970 se ha desarrollado una importante industria basada en el
procesamiento del cangrejo rojo de río (Procambarus clarkii) (Figura-
I.11). Esta industria genera una importante cantidad de subproductos
(cabeza, tórax y pinzas) que prácticamente no se utiliza o infrautiliza y
que en la mayoría de los casos se esparce por el campo. Lo que
potencialmente supone un grave problema medioambiental debido a su
fácil podredumbre y deterioro.
Figura I.11. Morfología de Procambarus clarkii.
P á g i n a | 40
Introducción
Procambarus clarkii es una especie nativa del sureste de Estados

Unidos y del Noreste de México [Rodríguez y col., 2005], y
posteriormente fue introducido en los demás continentes [Hoobs, 1984;
Gherardi y Holdich, 1999; Gil-Sánchez y Alba, 2006; Souty-Grosset y
col., 2006], (ver Figura-I.12).
Figura I.12. Distribución mundial de Procambarus clarkii. Tomado

de IUCN Red List guiding conservation 2014.
Descripción Taxonómica de Procambarus clarkii
Reino: Animal
Rama: Antrópodos
Clase: Crustacea
Subclase: Malacostraca
Superorden: Eucarida
Orden: Decapoda
Familia: Astacidae
Género: Procambarus
Especie: Procambarus clarkii (Girard, 1852)
Nombre Común: Cangrejo de río
Nombre Científico: Procambarus clarkii
P á g i n a | 41
Introducción
Los astacidae o cangrejo de río son crustáceos decápodos que

presenta un rostro estrecho y alargado, la pinza bien definida, un
saliente muy fuerte en el carpopodito, y un cefalotórax característico de
color rojo y rugoso [Girard, 1852; Arrignon, 1985].
Producción y comercialización de Procambarus clarkii
La producción mundial de Procambarus clarkii en el año 2016 ha sido

de aproximadamente 920.000 toneladas (Figura-I.13). La mayor
producción de esta especie, hasta 2002 tuvo lugar en los Estados
Unidos, pero actualmente la mayor producción proviene de China
seguida por Estados Unidos. Hasta el 2005 en la FAO sólo fueron
reportados los datos estadísticos de producción de Estados Unidos y
China. Aunque se conoce que existen otros países como Costa Rica,
México, España y Zambia que también son productores de esta especie
[FAO FishStat, 2016]
En España actualmente la producción es de unas 5000 toneladas al

año localizándose su procesamiento prácticamente en la zona de la
Marisma del Guadalquivir.
P á g i n a | 42
Introducción
Figura I.13. Producción mundial de Procambarus clarkii.
En el año 2000 en la región Andaluza se procesó 3700 toneladas de

cangrejo vivo, de las cuales el 65,89% se comercializaron enteros y el
31,21% se procesan para obtener colas [Mediterranean Business
Consulting. S.L. 2001]. Actualmente en Andalucía se generan 1.500
toneladas al año de desecho de Procambarus clarkii (cefalotórax y
pinzas, fundamentalmente) que prácticamente no se utilizan o mal
utilizan, constituyendo un foco contaminante grande, sobre todo en la
Marisma (Isla Mayor, Sevilla), donde están ubicadas las principales
plantas procesadoras de este crustáceo.
Durante el procesamiento del marisco se produce enormes

cantidades de residuos de caparazón y parte del esqueleto (cefalotórax
y pinzas) de cangrejo, generándose de esta manera entre el 75 y 85%
de residuo, convirtiéndose así en un problema no solo para la industria
P á g i n a | 43
Introducción
del procesamiento de productos marinos sino también para el

medioambiente [Russ y Meyer-Pittroff, 2004], debido a que su
eliminación es bastante compleja y costosa [Gildberg y Stenberg,
2001]. Estos residuos o subproductos ricos en quitina (pueden contener
del 25 al 30% de quitina en peso seco) debido a su alto contenido en
quitina podrán utilizarse para obtener productos de interés industrial de
alto valor añadido, tales como nanoquitina, quitosano, oligo-quitino-
oligosacáridos, etc. [Tsujibo y col., 1998; Meruvu y Donthireddy,
2014; Krishnaveni y Ragunathan, 2015].
Estos residuos, habitualmente, no son tratados adecuadamente y

frecuentemente son eliminados mediante métodos convencionales
como: el vertido en el océano, la incineración y el relleno de la tierra
provocando de esta manera una contaminación ambiental y biológica, lo
que ha llevado a nuevas búsquedas de eliminación de estos residuos
[Brzezinska y col., 2013].
Estos residuos o subproductos no solo contienen quitina sino también

proteínas y sales minerales, por lo que además de sustancias derivadas
de la quitina, también podrían utilizarse para obtenerse hidrolizados
proteicos de alto valor nutritivo [Cremades y col., 2001,2003]. En
relación con esto, existen tratamientos químicos con alcali fuerte y
ácidos para su desproteinización y desmineralización utilizados para la
obtención de quitina y quitosano, sin embargo este procedimiento tiene
una serie de inconvenientes como la gran cantidad de aguas residuales
con concentraciones altas de alcali que se generan. Es por ello que se
necesitan de procesos alternativos biotecnológicos para la obtención de
P á g i n a | 44
Introducción
quitina y sus derivados. Así la desmineralización podría llevarse a cabo

mediante procesos de fermentación láctica [Bautista y col., 2001], y la
desproteinización se podría llevar a cabo mediante procesos de
fermentación con microorganismos proteolíticos, que es un
procedimiento menos costoso, menos contaminante y más compatible
con el medio ambiente [Wang y Liang, 2017; Wang, 2012; Kaur y
Dhillon, 2015; Younes y Rinaudo, 2015; Younes y col., 2016;
Ghorbel-Bellaaj y col., 2011].
Actualmente son pocos los usos de este subproducto, salvo su

aplicación como alimento de gallinas y pollos [Goméz, 2014],
generalmente no se utiliza o mal-utiliza dispersándolo por el campo,
constituyendo focos de contaminación importantes. Si bien, debido a su
composición, podría utilizarse como fuente de partida para la obtención
de productos de alto valor añadido, como son la quitina y nano-quitina,
las astaxantina (antioxidante carotenoide: 3,3′-dihidroxy-β, β-caroteno-
4,4′-diona) y carotenoproteínas [Cremades y col., 2001, 2003].
Además, este subproducto tiene un gran potencial en el campo

biotecnológico relacionado con la producción de enzimas, ya que debido
a su composición podría ser utilizado como sustrato en la fermentación
para la obtención de hidrolasas, destacando en especial la producción
de quitinasas, proteasas y otros materiales bioactivos de alto valor
añadido que son muy demandados industrialmente, como por ejemplo la
industria farmacéutica, cosmética, química y en agronomía [Liang y
col., 2016; Wang y col., 2009a; Kuo y col., 2011; Wang y col., 2016;
P á g i n a | 45
Introducción
Wang y col., 2009b; Nguyen y col., 2017; Nguyen y Wang, 2017;

Nguyen y Wang, 2018; Wang y col., 2008].
De lo discutido más arriba, queda claro que los subproductos

agroindustriales ricos en quitina, debido a su composición, constituyen
materias primas de partida, con un alto potencial de valorización para la
obtención de diferentes materiales bioactivos de alto valor añadido
aplicables de distintos sectores industriales. Hasta la fecha
prácticamente, la gran mayoría de los trabajos se han centrado en el uso
de los subproductos procedentes de la industria del procesamiento de
los crustáceos y en los grandes depósitos existentes en la Antártida. Si
bien, esta fuente, con el tiempo, se ha revelado finita, y actualmente
tiende al agotamiento. Por otro lado, la industria del procesamiento de
crustáceos no sería capaz de suministrar toda la materia prima
demandada actualmente y sobre todo en el futuro. Es por ello que es
necesario investigar nuevas fuentes de quitina que cubra o ayude a
cubrir estas necesidades. Entre estas fuentes, las materias primas ricas
en quitina de origen fúngico, por su carácter altamente renovable, y las
cantidades manejables, en particular la procedente del cultivo
mecanizado de setas y hongos comestibles, constituye un material
idóneo para dichos fines.
Por ello, en el presente trabajo de Tesis nos centraremos en el

estudio de los subproductos procedentes de la industria del champiñón
como fuente de fermentación para la producción de enzimas hidrolíticas
y en particular de quitinasas, como una de las alternativas posibles para
la valorización de este tipo de subproducto.
P á g i n a | 46
OBJETIVOS
Objetivos
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
 Producir quitinasas en medios baratos ricos en quitina, utilizando

subproductos de la industria alimentaria como medio de fermentación:
Aplicación a los hongos comestibles y crustáceos.
2.2 Objetivos Específicos
 Preparación y caracterización de las fuentes de fermentación a partir

de subproductos industriales (harina de tallos de champiñón, HTCH, F-
Q/G y harina de cangrejo, HC).
 Producción de quitinasas por fermentación:

 Sumergida
 Estado sólido
 Estudio de la secreción de proteínas (secretoma) crecido en los

diferentes medios de cultivo, mediante técnicas electroforéticas y
proteómica.
 Extracción, concentración/fraccionamiento y estabilización de

enzimas (quitinasas).
P á g i n a | 49
Objetivos
 Producción de quitinasas a escala semi-piloto.
 Inmovilización de concentrado de quitinasas en forma de

nano/micropartículas.
P á g i n a | 50
MATERIALES Y MÉTODOS
M&M
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Reactivos, Materiales y Equipos
3.1.1 Reactivos
Todos los reactivos utilizados en el presente trabajo de Tesis han sido

de calidad analítica, y se muestran en la Tabla-M.1.
Tabla-M.1. Reactivos utilizados.
Reactivo Fórmula Casa Comercial

Sigma-Aldrich,
Acetato de sodio C2H3NaO2
España
Labbox,
Acetona C3H6O
Barcelona-España
Sigma-Aldrich,
Ácido acético CH3COOH
España
Labbox,
Ácido Bórico H3BO3
Barcelona-España
Sigma-Aldrich,
Ácido Cítrico C6H8O7
España
Panreac,
Ácido clorhídrico HCl
Barcelona-España
Sigma-Aldrich,
Ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) C7H4N2O7
España
Merck,
Ácido fórmico CH2O2
Darmstadt-Alemania
Sigma-Aldrich,
Ácido fosfórico H3PO4
España
Sigma-Aldrich,
Ácido Maleico C4H4O4
España
Sigma-Aldrich,
Ácido sulfúrico conc. H2SO4
España
Sigma-Aldrich,
ACN (Acetonitrilo) C2H3N
España
P á g i n a | 53
M&M
Bio-rad,
Acrilamida C3H5NO
California-USA
Merck,
APS (Persulfato amónico) (NH4)2S2O8
Darmstadt-Alemania
Avicel PH-101 Sigma-Aldrich,
(C6H10O5)n
(Celulosa microcristalina) España
Azocaseína Sigma-Aldrich,
(Sulfanilamida azocaseína) España
Sigma-Aldrich,
Azul de bromofenol C19H10Br4O5S
España
Sigma-Aldrich,
Bicarbonato de amonio NH4HCO3
España
Bio-rad,
Bis-acrilamida C7H10N2O2
California-USA
Thermo Fisher
BSA (Seroalbúmina bovina) Scientific,
Madrid-España
Sigma-Aldrich,
Citrato de sodio Na3C6H5O7
España
Merck,
Cloruro de calcio dihidratado CaCl2·2H2O
Darmstadt-Alemania
Sigma-Aldrich,
Cloruro de Cobalto (II) dihidratado CoCl2·2H2O
España
Sigma-Aldrich,
Cloruro de Cobre (II) dihidratado CuCl2·2H2O
España
Sigma-Aldrich,
Cloruro de magnesio MgCl2
España
Cloruro de manganeso (II) Sigma-Aldrich,
MnCl2·4H2O
tetrahidratado España
Panreac,
Cloruro de Potasio KCl
Barcelona-España
Panreac,
Cloruro de sodio NaCl
Barcelona-España
Sigma-Aldrich,
Cloruro de Zinc ZnCl2
España
Bio-Rad
Coomassie Brilliant Blue G-250 C45H44N3NaO7S2 Laboratories,
California-USA
Coomassie Plus-the better Thermo Fisher
(Bradford assay reagent) Scientific,
P á g i n a | 54
M&M
Madrid-España
Sigma-Aldrich,
Dihidrógeno fosfato de potasio KH2PO4
España
Sigma Aldrich,
Ergosterol C28H44O
España
Panreac,
Etanol C2H5OH
Barcelona-España
Merck,
Extracto de levadura
Darmstadt-Alemania
Sigma-Aldrich,
Fenol C6H5OH
España
Sigma-Aldrich,
Fosfato de potasio dibásico K2HPO4
España
Panreac,
Fosfato disódico Na2HPO4
Barcelona-España
Sigma-Aldrich,
Glicerol C3H8O3
España
Sigma-Aldrich,
Glicina C2H5NO2
España
Sigma-Aldrich,
Glucosa C6H12O6
España
Merck,
Hexahidrato de Cloruro de hierro (III) FeCl3·6H2O
Darmstadt-Alemania
Labbox,
Hexano C6H14
Barcelona-España
Panreac,
Hidróxido de sodio NaOH
Barcelona-España
GE Healthcare,
Kit de tinción de plata
España
Sigma-Aldrich,
Molibdato de sodio dihidratado Na2MoO4·2H2O
España
N-acetilglucosamina Sigma-Aldrich,
C8H15NO6
(N-Acetyl-D-Glucosamine) España
Sigma-Aldrich,
Nitrato de sodio NaNO3
España
Labbox,
Peptona
Barcelona-España
P á g i n a | 55
M&M
Sigma-Aldrich,
p-nitrofenil-β-glucopiranóside C12H15NO8
España
Merck,
p-nitrofenol C6H5NO3
Darmstadt-Alemania
Sigma Aldrich,
Quitina polvo
España
Sigma Aldrich,
SDS NaC12H25SO4
España
Sigma-Aldrich,
Serva Blue G Dye
España
Sigma-Aldrich,
Sulfato de amonio (NH4) 2SO4
España
Sigma-Aldrich,
Sulfato de Magnesio heptahidratado MgSO4.7H2O
España
Merck,
Sulfato Ferroso heptahidratado FeSO4.7H2O
Darmstadt-Alemania
Sigma-Aldrich,
Sulfito Sódico Na2SO3
España
Sigma Aldrich,
Tartrato de Sodio y Potasio C4H4KNaO6.4H2O
España
Sigma-Aldrich,
TEMED
España
Labbox,
Tinción de rojo congo C32H22N6Na2O6S2
Barcelona-España
Labbox,
Tricloroacético (TCA) C2HCl3O2
Barcelona-España
Promega,
Tripsina porcina
Madrid-España
Sigma Aldrich,
Tris NH2C(CH2OH)3
España
NH2C(CH2OH)3.HC Sigma Aldrich,
Tris-HCl
l España
Sigma Aldrich,
Xilano (beechwood) (C5H8O4)n
España
Sigma Aldrich,
Xilosa C5H10O5
España
Merck,
Yodoacetamida C2H4INO
Darmstadt-Alemania
P á g i n a | 56
M&M
Panreac,
β-mercaptoetanol C2H6OS
Barcelona-España
3.1.2. Materiales
Los materiales utilizados en el presente trabajo de Tesis se muestran

en la Tabla-M.2.
Tabla-M.2. Materiales utilizados.
Nombre Especificaciones Casa Comercial

Asa de platino con mango
metálico con mordaza y zona
Asa de platino IBDCiencia S.L.
aislante. Dimensiones (mm):
0,1 x 135.
Frasco de laboratorio de
Botellas de Vidrio de Fisher Scientific,
vidrio transparente con tapón
diferentes volúmenes Madrid-España
de rosca.
Porcelaines
Avignon™ 10804,
Cápsulas de porcelana Haldenwanger™
Fisher Scientific,
Madrid-España
Crisoles esmaltados,
diferentes tamaños, utilizados
QuercusLab,
Crisol para incinerar o calcinar
España
sustancias. Admiten
temperaturas hasta 1050 ºC.
Cubetas de poliestireno para
Deltalab,
Cubetas de poliestireno espectrofotometría visible 2 y
Barcelona-España
3 mL.
Cubetas MultiSUB Midi, 10 x Cleaver Scientific
Cubetas de
7cm & 10 x 10cm UV tray, 2 x LTD, Warwickshire-
electroforesis
16 sample combs. Reino Unido
Brand™ Embudo de vidrio de Fisher Scientific,
Embudos
borosilicato. Madrid-España
P á g i n a | 57
M&M
Matraces Erlenmeyers
Policarbonato cuello estrecho Fisher Scientific,
de vidrio de diferentes
Nalgene. Madrid-España
volúmenes
Matraces Erlenmeyers DURAN,
Policarbonato boca ancha
de vidrio de 2L Main-Alemania
Espátula cuchara plana,
Labbox,
Espátula longitud 120 mm, SPSS-120-
Barcelona-España
005.
Bastidores Labcon 96-Place
Labcon,
Gradillas de eppendorf Storage System 2500-229-
California-USA
000.
I.C.T, S.L.
Gradilla rectangular para Instrumentación
Gradilla para tubos
tubos Falcon, chapa acero Científica Técnica,
Falcon
inoxidable AISI 304, 24(8 x 3) S.L., San Sebastian-
España
Guantes para examinación
Deltalab,
Guantes de nitrilo sin polvo, Ref. 4020NP
Barcelona-España
calidad estándar.
Safelock-Cap microcentrifuge
Nerbe plus,
Microtubos de 1,5 y 2 tube PP, 1,5/2mL, attached
Winsen (Luhe)-
mL cap, boil-proof, transparent,
Alemania
graduated.
Papel de filtro, hojas de 50 x
Papel filtro Deltalab,
50 cm, tamaño de poro ± 30-
convencional Barcelona-España
40 micras.
Bemis,
Parafilm M Parafilm M (Laboratory Film)
Wisconsin-USA
PIPETMAN Neo® 1-10μL / GILSON®,
Pipeta P10/P100/ P1000
10-100μL / 100-1000μL. Wisconsin-USA
Pipeta serológica de 5/10/25
mL, poliestireno transparente SARSTEDT,
Pipeta serológica con escala impresa positiva y Nümbrecht-
negativa, envasadas de forma Alemania
estéril unitaria.
ENDO Plasticware,
Piseta Frasco lavador de 1000 mL. TecnyLab,
Valencia-España
Probetas de vidrio de Probeta graduada base Labbox,
diferentes volúmenes hexagonal, clase a, glassco. Barcelona-España
P á g i n a | 58
M&M
Probetas de
Probeta graduada PP, 1000 TecnyLab,
plástico de diferentes
mL ENDO. Valencia-España
volúmenes
Thermo Fisher
Puntas de pipeta
Pipette Tips. Scientific,
automática
Madrid-España
Filter Tip PP natural 0,5–
10μL/10-100μL/100-1000μL, Nerbe plus,
Puntas de pipeta short, graduated 96 tips/rack, Winsen (Luhe)-
P10/P100/P1000 Gilson type, premium surface, Alemania
RNase/DNase/DNA/pyrogenfr
e, sterile RCE/IVD.
SARSTEDT,
Petri dish 60x15mm with
Placa de petri Nümbrecht-
cams.
Alemania
Termómetro amarillo -10/150 QuercusLab,
Termometro
˚C. España
Centrifuge tube PP with screw

Nerbe plus,
Tubos Falcon de 15 y cap PE, 15/50 mL, Ø17x120
Winsen (Luhe)-
50 mL mm, conical bottom, tube
Alemania
transparent, cap.
Vasos de precipitados Duran™ Vaso de precipitados
Fisher Scientific,
de diferentes de vidrio de perfil bajo con
Madrid-España
volúmenes boquilla.
3.1.3 Equipos
Los equipos utilizados se indican en la Tabla-M.3.
Tabla-M.3. Equipos utilizados.
Nombre Especificaciones Casa Comercial

ARE Heating
Agitador magnetico Snaker magnetic stirrer,
Singapore
Agitador orbital MaxQ 4000,
Agitador orbital Barnstead
MaxQ 5000.
P á g i n a | 59
M&M
Fisherbrand,
Agitador vortex Mezclador vórtex
Madrid-España
Analizador de imágenes Equipo Imager 600 GE Healthcare,
quimioluminiscencia (Amersham Imager 600. España
Autoclave 75 L Autoclave 4002518 - Autester JP Selecta,
(Presoclave II 80) ST DRY PV-lll 150. Barcelona-España
Balanza de precisión modelo Denver Instrument,
Balanza de precisión
BD BC 200. NY-USA
Balanza Analitica modelo BC Denver Instrument,
Balanza analítica
BC 100. NY-USA
Baño Termostático Analógico Nahita, La Rioja-
Baño de agua
5L España
Microbarra agitadora Fisher scientific,
Barra de agitación
magnética de PTFE. Madrid-España
Campana de flujo Cabina de flujo laminar Telstar,
laminar modelo mini H. Madrid-España
Ductless Fume Hood CRUMA CRUMA,
Campana de gases
870. Barcelona-España
Eppendorf,
Centrífuga Eppendorf centrifuges.
Madrid-España
Avanti J-26 X Beckman Coulter,
Centrifuga diferencial
(JLA-10500, JLA-8100) Nyon-Switzerland
New Brunswick
Congelador (-40 ˚C, -80 Congelador -80 ˚C Modelo Scientific,
˚C) ULT-1786-V. Fisher scientific,
Madrid-España
Cubeta de Celda de electrophoresis Bio-Rad,
electroforesis Criterion. California-USA
Desecador de vidrio pyrex con
tapa y disco de porcelana, QuercusLab,
Desecador de vidrio
diámetro 100 mm y capacidad España
1 L.
GE Healthcare,
Espectrofotómetro Ultrospec 2100pro UV/Visible.
España
Estufa para desecacion y
Estufa Secado estático esterilización modelo IDL Indelab, España
AI80.
Memmert,
Estufa de Secado con Estufa de aire forzado modelo
Schwabach-
aire forzado UF 260.
Alemania
P á g i n a | 60
M&M
Soxhlet Labolan,
Extractor de Grasa
Extractor ser 148/3. Navarra-España
Frigorifico Frigorifico LKUv 1610. Liebherr, España
Pharmacia,
Electrophoresis power supply
Fuente de alimentación LabTrader Inc.,
EPS 500/400.
California-USA
Jasco, Madrid-
HPLC HPLC de columna SuperdexTM
España
KjeltecTM 840 equipado con Foss Iberica S.A.,
KjeltecTM 840
digestor y destilador. Barcelona
Telstar,
Liofilizador Liofilizador Cryodos -80 ˚C
Madrid-España
Molino de fresado modelo SM Retsch SM 100,
Molino de fresado
100. Alemania
Nannetti,
Mufla de incineración Modelo Termocontroller ST.
Faenza-Italia
Crison,
pHmetro pH-meter BasiC20.
Barcelona-España
Pipeta volumen variable HTL Lab Solutions,

Pipetas automáticas
labmate pro. Marszawa-Polonia
Sartorious Stedium,
Reactor Reactor Biostat A Goettingen-
Alemania
Savant Instruments.
Savant Speed Vac SVC 100 Inc. Farmingdale,
NY.
3.2. Microorganismos
Los microorganismos utilizados en el presente trabajo de Tesis han

sido: Trichoderma harzianum CEC-T24, Trichoderma atroviride CEC-
T23 y Bacillus licheniformis ATCC 21415, como se muestra en la Tabla-
M4.
P á g i n a | 61
M&M
Tabla-M.4. Microorganismos utilizados.
Nombre científico Cepa Colección

American Type Culture
Collection (Georgetown
Bacillus licheniformis ATCC 21415
University, Washington,
USA)
Spain Type Culture
Collection (Burjasot,
Trichoderma atroviride CEC-T23
Universidad de Valencia,
España).
Spain Type Culture
Collection (Burjasot,
Trichoderma harzianum CEC-T24
Universidad de Valencia,
España).
3.3. Subproductos
Los subproductos utilizados en este trabajo han sido subproductos

procedentes de la industria del champiñón, tanto los procedentes de la
producción para consumo en fresco (tallos y champiñones no
comercializables) como de la industria conservera (tallos) (Figura-M.1a).
También se ha utilizado un subproducto procedente de la industria del
procesamiento del cangrejo de río (Procambarus clarkii), constituido
fundamentalmente por el cefalotórax (cabeza y pinzas) y el
exoesqueleto de las colas (Figura-M.1b), que se ha utilizado como
control de subproductos ricos en quitina de origen crustaceo. En la
Tabla-M.5 se muestran los diferentes subproductos y su origen.
P á g i n a | 62
M&M
Tabla-M.5. Subproductos y sus orígenes.
Producto
Subproducto Origen
estabilizado
Industria del
champiñón,
Tallos de champiñón y Harina de tallos de fresco y
champiñones defectuosos. champiñón (HTCH) conservas.
Grupo Riberebro
(Haro, La Rioja).
Industria del
Cefalotórax y Harina de cangrejo cangrejo de río.
exoesqueleto de las colas. HC) Alfocan S.A. (Isla
Mayor, Sevilla)
Figura M.1. a) Agaricus bisporus, b) Procambarus clarkii.
P á g i n a | 63
M&M
3.4 Estabilización de los subproductos y generación de

sustratos
Una vez recibidos los subproductos, debido a su naturaleza y alto

contenido en agua, éstos se han estabilizado, para evitar su deterioro y
pérdida. Procesos que se han llevado a cabo mediante secado,
molienda, conservación en vacío y temperatura ambiente en almacén
(22-23 °C).
3.4.1 Secado y molienda
Para estabilizar los subproductos procedentes de la industria del

champiñón, se ha utilizado una estufa de secado estático y otra de aire
forzado a 90 °C (Figura-M.2a y 2b). Una vez secos se molieron en un
molino de rotor, equipado con un tamiz de 0,5 mm (Figura-M.3a), y
posteriormente fueron tamizados en un tamiz de 355 µm (Figura-M.3b),
obteniéndose un producto al que se denominó harina de tallos de
champiñón (HTCH) (Figura-M.4a). Los residuos de cangrejo siguieron un
procedimiento análogo y al producto molido, en este caso, se le
denominó harina de cangrejo (HC) (Figura-M.4b).
Los productos así obtenidos se guardaron en bolsas de plástico, a

las que se hizo el vacío, y se guardaron en almacén a temperatura
ambiente (22-23 °C), manteniéndose así durante el tiempo necesario
para su uso. El producto es estable durante varios meses (6 a 8 meses),
no observándose peroxidación lipídica ni generación de olores durante
este tiempo de conservación.
P á g i n a | 64
M&M
Figura M.2. a) Estufa de secado estático, b) Estufa de secado con aire

forzado.
P á g i n a | 65
M&M
Figura M.3. a) Molino de rotor, b) Diferentes tamaños de tamices

utilizados para la preparación de los subproductos.
Figura M.4. a) Harina de Tallos de Champiñón (HTCH), b) Harina de

Cangrejo (HC).
P á g i n a | 66
M&M
3.4.2 Preparación de la Fracción enriquecida de

Quitina/Glucano de champiñones
Para la preparación de la fracción enriquecida en quitina y glucano (F-

Q/G) se ha seguido el procedimiento descrito por Cremades y col.
[Cremades y col., 2012]. El procedimiento seguido se muestra
esquemáticamente en la Figura-M.5. Brevemente, una vez resuspendida
la HTCH al 10% en agua (p/v), se ajusta el pH a 8,5 y se procede a su
hidrólisis con la proteasa Alcalasa® utlizando una relación E/S de 0,3
(p/v), siguiendo el procedimiento del pH-stat [Adler-Nissen, 1986;
Parrado et al., 1993]. El hidrolizado obtenido se centrifugó a 10.000 × g,
a 4 °C durante 15 min, obteniéndose por una parte un sobrenadante
(material soluble o hidrolizado) y un precipitado (material insoluble, o
fracción bruta enriquecida en quitina y glucanos). Seguidamente, el
precipitado se ha lavado tres veces con 10 L de agua corriente, se ha
resuspendido en 1 L de agua, y se esterilizó en autoclave a 121 °C
durante 20 min, una vez enfriado a temperatura ambiente se centrifugó
durante 15 min a 10.000 x g, desechándose el sobrenadante y nos
quedamos con el precipitado, que una vez secado en la estufa de aire y
tamizado, se utilizó como F-Q/G (Figura-M.6).
P á g i n a | 67
M&M
Figura M.5. Esquema de la obtención de la fracción enriquecida de

Quitina/Glucano, mediante un tratamiento enzimático con proteasas.
Figura M.6. Fracción enriquecida en Quitina/Glucano.
P á g i n a | 68
M&M
3.5 Caracterización de los Sustratos
Una vez obtenidos los sustratos se procedió a la caracterización de

los mismos.
La caracterización se ha llevado a cabo mediante la determinación de
los siguientes parámetros: humedad, materia orgánica (MO), grasa
bruta, nitrógeno total (Nt), proteínas, hidratos de carbono totales, quitina,
etc., y pH.
El contenido de humedad, ceniza, grasa bruta se determinó

gravimétricamente de acuerdo con los métodos estándar de AOAC.
Como se detallan a continuación [A.O.A.C, 1995; A.O.A.C, 2006].
3.5.1 Humedad
La Humedad se determinó gravimétricamente siguiendo el

procedimiento estándar de la A.O.A.C. [A.O.A.C, 1995]. Para ello se
pesó en una cápsula vacía 2 g de muestra, se secó en estufa a 100 °C
durante 24 horas; una vez transcurrido este tiempo se retira y enfría en
un desecador. Finalmente se pesa la muestra seca y se calcula el
contenido de humedad mediante la siguiente fórmula:
(𝑃𝑖 − 𝑃𝑓 )
% 𝑑𝑒 𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = 𝑥 100
𝑃𝑖
Dónde:
Pi = Peso inicial Pf = Peso final
P á g i n a | 69
M&M
3.5.2 Cenizas
El contenido de cenizas se determinó gravimétricamente siguiendo el

procedimiento de la A.O.A.C. [A.O.A.C, 1995]. Brevemente, se taran los
crisoles a peso constante en la mufla por 15-30 min a 550-600 °C. Luego
se enfrian los crisoles en un desecador, pesamos nuevamente los
crisoles y colocamos 2 g de muestra en cada crisol e incinerar la
muestra en la mufla durante 8 horas a temperatura entre 550-600 °C,
una vez transcurrido este tiempo sacamos los crisoles y dejamos enfriar
y finalmente se pesa cada crisol con las cenizas.
Las cenizas se calculan mediante la siguiente fórmula:

Peso de Cenizas x 100
% 𝑑𝑒 𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎 =
Peso de la muestra
3.5.3 Grasas
El contenido en grasa total se determinó por gravimetría tras la

extracción de la muestra con hexano durante 12 horas en un extractor
Soxhlet. Una vez terminada la extracción, el solvente se destila y el
residuo graso se pesa [Clemente y col., 1997].
3.5.4 Nitrógeno Total
El nitrógeno total se determinó mediante el método Kjeldahl

establecido por la A.O.A.C. 2006 [AOAC, 2006], en un equipo
automático KjeltecTM 840 (Foss Iberica S.A., Barcelona) equipado con
digestor y destilador.
P á g i n a | 70
M&M
3.5.5 Cuantificación de Proteínas en Subproductos y Sustrato
Las proteínas totales en los subproductos y sustratos se ha

determinado multiplicando el nitrógeno total por el correspondiente factor
de conversión en proteína: Nt x 5,45 para la HTCH y Nt x 6,24 para la
HC.
3.5.6 Hidratos de Carbono
Los carbohidratos totales se calcularon utilizando el método

colorimétrico de Dubois, usando un reactivo de ácido fenólico sulfúrico
[Dubois y col., 1956]. Los carbohidratos totales solubles fueron
medidos partiendo de 0,5 g de muestra que se resuspendió en 10 mL de
una mezcla H2O/fenol (80% v:v)/ácido sulfúrico concentrado (2:1:40). La
muestra resuspendida se incubó durante 10 min a temperatura ambiente
(22-23 °C) y se calentó lentamente hasta 95 °C, manteniendo esta
temperatura durante 60 min, seguidamente se enfrió lentamente hasta
alcanzar la temperatura ambiente. Se tomó una muestra, se centrifugó a
6000 x g y se midió la absorbancia a 575 nm utilizando un
espectrofotómetro Ultrospec 2100pro UV/Visible (GE Healthcare,
Barcelona, Spain) (Figura-M.7). La concentración de hidratos de
carbono totales se determinó por interpolación en una curva patrón
trazada con glucosa como se observa en la Figura-M.8.
P á g i n a | 71
M&M
Figura M.7. Espectrofotómetro utilizado.
3.6 Fermentaciones
Se estudió la producción de quitinasas mediante dos sistemas de

fermentación: Fermentación Sumergida (FS) y Fermentación en estado
Sólido (FES), utilizando como sustratos la HTCH, F-Q/G y HC, este
último utilizado como control de sustrato rico en quitna.
P á g i n a | 72
M&M
3.6.1 Fermentación sumergida (FS)
Las fermentaciones sumergidas se han llevado a cabo en matraces

de 500 mL con 150 mL de medio de cultivo, tal y como se muestra
esquemáticamente en la Figura-M.9.
Figura M.9. Esquema del proceso de Fermentación Sumergida.
a) Microorganismos y preparación del Inóculo
Los microorganismos utilizados han sido: Bacillus licheniformis ATCC

21415, T. atroviride CEC-T23 y T. harzianum CEC-T24 (ver Tabla-M.4).
Bacillus licheniformis ATCC 21415, se obtuvo de la American Type

Culture Collection (Georgetown University, Washington, USA), fue
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M&M
almacenado en forma liofilizada a - 80 °C y mantenido en LB/Agar a 28

°C, replicándose cada 2 semanas. 24 h antes de la inoculación una
porción de biomasa cogida con el asa de platino se refresca en 15 mL
medio LB (10 g L–1 peptona, 5 g L−1 extracto de levadura y 10 g L−1
NaCl, ajustado a pH 7), y se crece a 37 °C, utilizándose como inóculo en
matraces de 500 mL con 150 mL de medio de cultivo.
T. atroviride CEC-T23 y T. harzianum CEC-T24 se obtuvieron de la

Colección de cultivo tipo España (Spain Type Culture Collection)
(Burjasot, Universidad de Valencia, España). El microorganismo fue
almacenado en forma liofilizada a - 80 °C y se mantuvo en PDA (patata-
dextrosa-agar) replicándose cada 4 semanas. Las esporas procedentes
de una placa, resuspendidas en una solución acuosa (tampón fosfato
0,1 M pH 7,0, MgCl2 0,1 M, Tween 20 al 2%) con una concentración de
esporas de aproximadamente 1 x 107 esporas mL−1, se ha utilizado
como inóculo de los respectivos cultivos.
b) Preparación de la fuente de carbono (Quitina coloidal)
La Quitina coloidal (Qc) se preparó según el método descrito por

Ramírez y col. [Ramírez y col., 2004] con ligeras modificaciones.
Brevemente, se mezcla 10 g de quitina en polvo (Figura-M.10a) con 200
mL de HCl (37%) previamente enfriado, manteniendo agitación
constante y vigorosa durante 24 h a 4 °C. A continuación, se agrega
etanol al 96% hasta un volumen final de 2 L y se agita vigorosamente.
Después de 24 h de incubación a -20 °C, la suspensión se centrifugó a
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M&M
5000 × g durante 20 min. Finalmente se lavó el precipitado con agua

destilada hasta que el pH del sobrenadante alcance un valor de 7±0,1, y
éste se resuspende en tampón fosfato 0,1 M (Figura-M.10b).
Figura M.10. a) Quitina pura en polvo, b) Quitina coloidal.
c) Medios de cultivo y condiciones de crecimiento
Se han preparado diferentes medios de cultivo para las FS, cuya

composición se muestra en la Tabla-M.6.
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M&M
Tabla-M.6. Composición de los medios de cultivo utilizados para la FS.
Medios
H2O Mm
de Qp Qc Czapeck PB F-Q/G HTCH
(mL) (mL)
Cultivo
H2O/Qp 150 - 1% - - - - -
H2O/Qc 150 - - 1% - - - -
Mm/Qp - 150 1% - - - - -
Mm/Qc - 150 - 1% - - - -
Czapeck/ - - - 1% 150 - -
Qc
PB/Qc - - - 1% - 150 - -
F-Q/G 150 - - - - - 2% -
HTCH 150 - - - - - - 2%
(Qp: Quitina en polvo, Qc: Quitina coloidal, Mm: Medio mínimo, PB: (Potato Broth = Extracto de Patata, F-
Q/G: Fracción enriquecida de Quitna/Glucano de champiñón, HTCH: Harina de Tallos de Champiñón).
El medio (H2O/Qp, H2O/Qc), contiene únicamente quitina ya sea en

forma de polvo o coloidal, y agua.
El medio mínimo (Mm) tiene los siguientes componentes: 8,2 g L−1

Na2HPO4, 3,8 g L−1 KH2PO4, 0,4 g L−1 NaCl, 2 g L−1 (NH4)2SO4, peptona
de champiñones 10 g L−1 y 10 ml L−1 de la solución de elementos traza;
la composición de la solución de elementos traza es (g L −1): 0,55 g
CaCl2·2H2O, 1,67 g de FeCl3·6H2O, 0,10 g MnCl2·4H2O, 0,17 g ZnCl2,
0,043 g CuCl2·2H2O, 0,06 g CoCl2·2H2O y 0,06 g Na2MoO4·2H2O, y se
ha suplementado con Qp o Qc.
P á g i n a | 76
M&M
El medio Czapeck esta constituido por los siguientes componentes:

0,3% NaNO3, 0,1% K2HPO4, 0,005% MgSO4.7H2O, 0,005% KCl, 0,001%
FeSO4.7H2O, 4% de glucosa y 1% de Quitina coloidal.
Además se estudió la producción de quitinasas en medios ricos en

quitina, como es el medio PB/Qc, que contiene extracto de patata y Qc, y
los medios F-Q/G y HTCH que debido a su contenido en quitina se
utilizaron directamente sin adición alguna de otras formas de quitina.
Una vez preparado los medios de cultivo se dispensaron en matraces

de 500 mL y se esterilizaron en autoclave durante 30 min a 121 °C
(Figura-M.11), posteriormente se inocularon los microorganismos y se
cultivaron como se describen mas adelante. Cada medio de cultivo se
realizó por triplicado.
Figura M.11. Medios de cultivo utilizados para FS.
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M&M
 Condiciones de crecimiento de Bacillus licheniformis ATCC

21415
Una vez esterilizados los medios de cultivos, éstos se inocularon con

15 mL de inóculo de Bacillus licheniformis ATCC 21415 previamente
crecido en LB, a 37 °C y pH 7 hasta que el caldo de fermentación
alcance un 30% de transmitancia (aproximadamente por 18 h); y se
dejaron crecer durante 14 días a 37±1 °C con agitación mecánica (150
rpm), tomándose muestras (aproximadamente 2,5 mL) periódicamente y
se almacenaron a -20 °C hasta ser usada para los diferentes análisis.
 Condiciones de crecimiento de Trichoderma
Una vez esterilizados los medios de cultivos, éstos se inocularon con

2 mL de una suspensión acuosa (0,1 M MgCl2 / Tween 20 al 2%) de
esporas 1 x 107 esporas mL−1 de T. atroviride CEC-T23 o T. harzianum
CEC-T24 y se crecieron durante 14 días a 28 ±1 °C con aireación (30
L/min), y sin aireación (cultivo estático); tomándose muestras
(aproximadamente 2,5 mL) periódicamente y se almacenaron a -20 °C
hasta ser usada para los diferentes análisis.
3.6.2 Fermentación en estado sólido (FES)
En la siguiente Tabla-M.7 se describen los medios de cultivo

utilizados para la FES. En este caso se han utilizado como medios de
cultivo: la F-Q/G, la HTCH y la HC, y se han preparado de modo que el
P á g i n a | 78
M&M
sustrato tenga la humedad suficiente para promover el crecimiento y

desarrollo del microorganismo.
Tabla-M.7. Composición de los medios de cultivo utilizados para la

FES.
Medios de cultivo Sustrato Inóculo
F-Q/G-A 2% 5 107 esporas*
F-Q/G+A 2% 5 107 esporas
HTCH-A 2% 5 107 esporas
HTCH+A 2% 5 107 esporas
HC-A 2% 5 107 esporas
HC+A 2% 5 107 esporas
HTCH: Harina de tallos de champiñón, HC: Harina de Cangrejo, A: Aireación

(*15 mL x 3.3 106 esporas/mL = 5 107 esporas)
Una vez colocado el sustrato (F-Q/G, HTCH o HC) en el

correspondiente matraz de 250 mL, éste se ha humedecido de manera
tal que el medio de cultivo sólido esté bien y uniformemente húmedo
pero no haya fase acuosa visible. Los medios de cultivo una vez
preparados se esterilizaron a 121 °C durante 30 min (Figura-M.12), y
posteriormente se inoculó el microorganismo (2 mL de una suspensión
acuosa (0,1 M MgCl2 / Tween 20 al 2%) de esporas (1 x 107 esporas
mL−1), y se cultivó durante 14 días a 28±1 °C con aireación (30 L/min), y
sin aireación (cultivo estático). Cada ensayo se realizó por triplicado.
P á g i n a | 79
M&M
En la Figura-M.13 se muestra como se realizó el proceso de

fermentación para la producción de enzimas específicamente quitinasas.
Figura M.12. Medios de cultivo utilizados en FES para la producción de

Quitinasas.
Figura M.13. Proceso de fermentación para la obtención de quitinasas.
P á g i n a | 80
M&M
3.7 Caracterización de las fermentaciones
3.7.1 Determinación de la Biomasa
La biomasa se determinó directamente en las muestras descongeladas.
En el caso de B. licheniformis ATCC 21415, crecido en fermentación

sumergida el crecimiento o biomasa producida se determinó mediante la
medición directa de la transmitancia (%T) de las muestras diluidas con
agua (1:20, v/v). La concentración de biomasa, en mg/mL, se determinó
por interpolación a partir de una curva estándar de biomasa vs %T
(Figura-M.14).
Figura M.14. Recta %T vs mg biomasa/mL para B. licheniformis ATCC

21415. (Muestras diluidas 1:5, v/v)
Para T. harzianum CEC-T24 y T. atroviride CEC-T23, la biomasa se

estimó indirectamente mediante la cuantificación del ergosterol. La
P á g i n a | 81
M&M
concentración de biomasa se calculó por interpolación en una curva

estándar de ergosterol vs biomasa [Görs y col., 2007] (Figura-M.15 y
M.16).
Figura M.15. Recta conversión ergosterol vs biomasa (T. harzianum

CEC-T24).
Figura M.16. Recta conversión ergosterol vs biomasa (T. atroviride

CEC-T23).
3.7.2 Ensayos Enzimáticos
Para la determinación de las actividades enzimáticas excretadas al

medio por cada microorganismo, las muestras se centrifugaron a 12.000
P á g i n a | 82
M&M
× g durante 20 min, y los sobrenadantes obtenidos se usaron para los

ensayos enzimáticos y análisis electroforéticos.
a) Ensayo de Actividad Quitinasa
La actividad quitinasa se determinó midiendo la cantidad de azúcares

reductores producidos utilizando quitina coloidal como sustrato,
mediante el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) [Miller, 1959].
Brevemente, la mezcla de reacción, que consta de 0,25 mL de quitina
coloidal al 1% (p/v) y 0,25 mL de muestra (enzima), se incubó a 37 °C
durante 30 min (Figura-M.17a). La reacción se detuvo mediante la
adición de 1 mL de solución acuosa de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) y
la mezcla se calentó durante 10 min en un baño de agua hirviendo.
Después de enfriar (Figura-M.17b), se determinó la absorbancia de la
solución a 575 nm utilizando un espectrofotómetro Ultrospec 2100pro
UV / Visible (GE Healthcare, Suecia). En paralelo, el mismo volumen de
agua desionizada se utilizó, en lugar de la muestra, como control
negativo. Una unidad de actividad quitinasa se definió como la cantidad
de enzima que produce 1 mg mL-1 de azúcar reductor, en las
condiciones de ensayo, a 37 °C.
o Preparación de la solución acuosa de ácido dinitrosalicílico

(DNS)
La solución de DNS se preparó disolviendo 10 g de DNS en 200 mL

en una solución 2 M de NaOH. Posteriormente, se agregaron 300 g de
P á g i n a | 83
M&M
tartrato de sodio y potasio, 2 g de fenol y 0,5 g de sulfito Sódico

previamente disueltos en unos 700 mL de agua desionizada caliente. Se
mezclan cuidadosamente las dos soluciones y se enrrasa con agua
destilada hasta 1000 mL.
Figura M.17. a) Baño con control de temperatura, b) Muestras para

determinación de actividad quitinasa.
La concentración del azúcar reductor liberado se determinó por

interpolación en una recta estándar preparada con GlcNAc (Figura-
M.18).
Figura M.18. Curva de calibración de N-acetilglucosamina.
P á g i n a | 84
M&M
b) Ensayo de Actividad Celulasa
La actividad celulasa extracelular se determinó incubando 0.25 mL de

celulosa microcristalina soluble (Avicel PH-101, Sigma-Aldrich) al 2% en
tampón acetato 0.1 M (pH 5) junto con 0.25 mL de muestra, durante 2
horas a 37 °C. Para detener la reacción se añadió 1 mL de solución DNS
[Bernfeld, 1955]. A continuación se calentó la mezcla a 95 °C durante
15 min, se enfriaron las muestras a temperatura ambiente y se midió la
absorbancia a 575 nm.
La concentración del azúcar reductor liberado se determinó por

interpolación en una recta estándar preparada con glucosa (Figura-
M.19). Una unidad de actividad celulasa se define como la cantidad de
enzima que libera 1 mg/mL de azúcares reductores en las condiciones
de ensayo.
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M&M
c) Ensayo de Actividad Xilanasa
La actividad xilanasa se determinó incubando 0.20 mL de muestra

con 1,8 mL de sustrato (Solución de Xilano de beechwood, Sigma
Aldrich ref. X4252) al 0,2 % en tampón Citrato de Sodio 50 mM (pH 5,3),
incubar a 50 °C durante 5 min. Para detener la reacción se añadió 1,5
mL de solución DNS. Se calentó la mezcla a 95 °C durante 15 min. A
continuación se enfriaron las muestras a temperatura ambiente y se
midió las absorbancias a 540 nm. A su vez, se realizó una curva patrón
empleando Xilosa 0,01 M (Figura-M.20).
Una unidad de actividad xilanasa se define como la cantidad de

enzima que libera 1 mg/mL de azúcares reductores en las condiciones
de ensayo.
Figura M.20. Curva de calibración de Xilosa.
P á g i n a | 86
M&M
d) Ensayo de Actividad Proteasa
La actividad proteásica se ha determinado mediante el método de la

Azocaseina [Jones y col., 1998].
Mezcla de reacción:
 0,1 g. azocaseína (Sigma Aldrich 11610)
 0,2 mL etanol
 4,8 mL tampón fosfato 0,1 M pH 7
Mezclar completamente la disolución hasta que sea homogéneo, se

puede calentar para favorecer la mezcla. Si se forma espuma,
centrifugar brevemente.
Método:
Mezclar 250 µL de muestra con 250 µL de mezcla de reacción.
Incubar durante 10 min a 40 °C, una vez alcanzado este tiempo parar la
reacción con 2,5 mL de TCA (ácido tricloroacético) al 5% (p/v).
Centrifugar durante 1 min a 10 000 x g, y medir la absorbancia a 440
nm.
Una unidad de actividad proteasa se define como la variación de

0,001 unidades de absorbancia por cada mL de muestra y min. También
es posible realizar una recta de calibrado y extrapolar los datos
obtenidos usando una proteasa de actividad conocida.
Los valores de absorbancia se transformaron en actividad proteasa,
P á g i n a | 87
M&M
(μmol/mL/min = UI/mL= UI/L), mediante la siguiente ecuación:
Actividad (μmol/mL/min) = Absorbancia *1000*10/10
e) Cálculo de actividades enzimáticas en UI/mL
Según la Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de

Bioquímica (NC-IUB, 1981), define a: “Una unidad internacional (1 UI) de
actividad enzimática a la cantidad de enzima que cataliza la formación
de 1 μmol de producto por minuto bajo unas condiciones definidas (1 UI
= µmol/min)”.
Actividad Quitinasa
Cantidad de enzima que libera 1 µmol de N-acetilglucosamina/min,
bajo las condiciones de cada ensayo.
Actividad Celulasa
Cantidad de enzima que libera 1 µmol de glucosa/min, bajo las
condiciones de cada ensayo.
Actividad Xilanasa
Cantidad de enzima que libera 1 µmol de xilosa/min, bajo las
condiciones de cada ensayo.
Así por ejemplo, para la actividad quitinasa que produce 1,6 mg/mL
de GlcNAc en un volumen total de reacción de 1,5 mL (0,25 mL de
P á g i n a | 88
M&M
muestra + 0,25 mL de Qc + 1 mL de solución DNS), esto implica que la

cantidad de GlcNAc contenida en 0,25 mL de muestra es de 2,4 mg, tras
30 minutos de reacción:
𝟐,𝟒 𝒎𝒈 𝟏𝟎𝟎𝟎 µ𝒎𝒐𝒍 𝑮𝒍𝒄𝑵𝑨𝒄

UI= 𝟎,𝟐𝟓 𝒎𝑳* = 43,39 µmol/mL
𝟐𝟐𝟏,𝟐𝟏 𝒎𝒈
𝟒𝟑,𝟑𝟗 µ𝒎𝒐𝒍/𝒎𝑳
UI= = 1,45 µmol/mL/min
𝟑𝟎 𝒎𝒊𝒏
UI= 1,45 UI/mL ó 1450 UI/L
3.7.3 Cuantificación de Proteínas solubles
Las proteínas solubles se han cuantificado mediante el método de

Bradford utilizando albúmina de suero bovino como estándar [Bradford,
1976]. Este método permite cuantificar proteínas, en un rango
comprendido entre 0,1 y 0,001 mg/mL, o entre 100 y 1 µg/mL. El método
se fundamenta en la interacción de las proteínas con el colorante
Coomasie Brillian Blue G250 (Figura-M.21), dando lugar a la formación
de un complejo de color azulado que presenta un máximo de
absorbancia a 595 nm.
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M&M
Figura M.21. Estructura del colorante Coomasie Brillian Blue G250.
Reactivos:
 Serva Blue G Dye (Coomasie Brillian Blue G250)
 BSA (Bovine Serum Albumin, Albúmina sérica bovina) 100 µg/mL
 Etanol 96%
 Ácido fosfórico 88%
Solución Stock de Bradford:

 100 mL Etanol 96%
 200 mL ácido fosfórico 88%
 350 mg Serva blue G
Reactivo de Bradford:
 425 mL H2O Destilada
 15 mL Etanol 96%
 30 mL ácido fosfórico 88%
 30 mL Solución Stock de Bradford
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M&M
Protocolo:
A 100 µL de muestra se añade 1 mL del Reactivo de Bradford, se
agita y se incuba a temperatura ambiente durante 10-20 min. Se mide la
absorbancia a 595 nm inmediatamente y se lee las muestras de menor a
mayor concentración. A su vez se realiza una curva patrón con BSA de
una concentración conocida de proteínas (de 1 µg/mL a 100 µg/mL)
(Figura-M.22), y se interpolan las absorbancias de las muestras para
obtener la concentración en µg/mL.
Figura M.22. Curva de calibración de BSA.
3.8 Concentración por Ultrafiltración
Las muestras de caldo de fermentación, cuando ha sido necesario, se

han concentrado por ultrafiltración, tal y como se muestra
esquemáticamente en la Figura-M.23a, utilizando para ello tubos
Vivaspin (Sartorious, Göttingen, Alemania) Figura-M.23b de 20 mL,
equipados con una membrana de ultrafiltración de 10 o 50 kDa, y
P á g i n a | 91
M&M
operados en una centrífuga a 6 000 x g durante 20 min.
Figura M.23. a) Concentración por ultrafiltración, b) Tubos Vivaspin de

ultrafiltración.
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M&M
3.9 Estudio del secretoma
El estudio de las proteínas secretadas al medio de cultivo por

Tichoderma harzianum CEC-T24 se ha llevado a cabo mediante
técnicas proteómicas basadas en la separación de proteínas por
electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de sodio-dodecil-
sulfato sódico, PAGE-SDS.
3.9.1 Análisis electroforético (PAGE-SDS)
El perfil de proteína extracelular se ha estudiado mediante PAGE-

SDS, utilizando el método de Laemmli [Laemmli, 1970], adaptado por
Blacksheak [Blackshear, 1984]. Los geles de poliacrilamida se
realizaron en condiciones desnaturalizantes para analizar las proteínas
secretadas en los distintos medios de cultivo, formulados con sustratos
ricos en quitina.
La preparación de los geles (gel de concentración o

empaquetamiento y gel de separación o corrido) se muestra en la
siguiente Tabla-M.8. Una vez cargado el gel de separación, se añade
una capa fina de agua:isobutanol (1:2, v/v) para evitar el intercambio de
oxígeno con el medio, facilitando la polimerización y haciendo que se
forme una superficie completamente lisa. Una vez que se ha
polimerizado se retira la capa de agua: isobutanol y seguidamente se
carga el gel de empaque y se coloca el peine, para formar los pocillos.
Se espera a que polimerice por completo, se retira el peine, y se lavan
los pocillos con el tampón de electroforesis 1X. De esta manera el gel
P á g i n a | 93
M&M
queda preparado para cargar las muestras.
Tabla-M.8. Composición de los geles discontinuos de poliacrilamida.
 Gel de concentración o empaque 5%
Solución A (Acrilamida 30%-

1,67 mL
Bisacrilamida 1%)
Solución C (Tampón de empaque 4x
1 mL
pH 6,8 )
H2O 7,33 mL
TEMED 25 µL
APS (Persulfato amónico 50% p/v) 40 µL
Volumen final 10 mL
 Gel de Separación o corrido 12%
Acrilamida 30% 6 mL
Bis-acrilamida 1% 2,37 mL
Tampón de Separación 4X (pH 8,8) 3,81 mL
H2O 2,82 mL
TEMED 30 µL
APS (Persulfato amónico 50% p/v) 30 µL
Volumen final 15 mL
NOTA: El protocolo de la preparación de los diferentes tampones se

encuentra en el apartado de ANEXOS.
P á g i n a | 94
M&M
Las muestras previamente centrifugadas, se resuspenden en tampón

de muestra 4X y se hirvieron durante 5 min para desnaturalizar las
proteínas y facilitar la acción reductora del β-mercaptoetanol sobre los
puentes di-sulfuro. Se enfrían y se centrifugan a 12.000 x g durante 5
minutos. Seguidamente se cargan las muestras (20-30 μL/pocillo,
aproximadamente 40-50 μg de proteína). La electroforesis se corrió a
intensidad constante (25 mA) utilizando un sistema de tampón Tris-
glicina que contenía SDS al 0.1% hasta que el bromofenol sale por el
frente del gel. Terminada la electroforesis se desmontan los geles, se
lavan, y se tiñen con azul de Coomassie o por plata, según proceda.
 Tinción de proteínas en geles de poliacrilamida (PAGE-SDS)
 Tinción con Azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250)
Brevemente, se añaden unos 100 mL de solución Coomassie/gel de

manera que cubra totalmente el gel, y se mantiene en agitación
¨overnight¨. Una vez transcurrido este tiempo se retira la solución de
tinción y se procede a desteñir en una solución de ácido
acético/metanol, 10:35, v/v, hasta que se observan claramente las
bandas de color azul.
 Tinción con Plata (Plus One TM Silver Staining Kit, GE Healthcare)
Este tipo de tinción es unas 10 veces más sensible que la tinción con
P á g i n a | 95
M&M
Azul de Coomasie, el rango de detección de proteínas es de 10-100

ng/banda. Debido a la elevada capacidad reductora del ion plata (Ag+),
es capaz de formar complejos con las proteínas con mayor afinidad que
con la poliacrilamida, siendo estos complejos reducidos mucho más
rápido que cuando el ión Ag+ esta libre. El método utilizado en el
presente trabajo ha sido el método descrito por Heukeshoven y Dernick
[Heukeshoven y Dernick, 1985]. Brevemente, terminada la
electroforesis, si la muestra contiene baja concentración de proteínas se
tiñe el gel directamente por plata, o bien primero se tiñe con Azul de
Coomasie, se destiñe y tras desteñirlo se procede a la tinción por plata.
La tinción por plata consta de las siguientes etapas: Fijación,

Sensibilización, Lavado, Reacción de Ag+, Lavado, Revelado, Parada,
Lavado, tal y como se muestra en la Tabla-M9.
Tanto los geles teñidos con Azul de Coomasie como los teñidos por
plata se han escaneado en un escáner (FUJIFILM FLA5100), equipado
con el sistema de imágenes Gel Doc ™ XR + (Bio-Rad Laboratories, CA,
USA).
P á g i n a | 96
M&M
Tabla-M.9. Protocolo de tinción de proteínas con Plata.
Paso Soluciones Tiempo
Etanol 100 mL
Fijación de
Acido acético glacial 25 mL
proteínas 30 min
Volumen final 250 mL
Etanol 75 mL
*Glutaraldehido 25% (p/v) Ɨ 1,25 mL
Sensibilización *Tiosulfato de sodio 5% (p/v) 10 mL
Acetato de sodio 17 g 30 min
Lavado Agua destilada 3 x 5 min
Solución de nitrato de plata 2,5% (p/v) 25 mL

Reacción de
&Formaldehido 37% (p/v) Ɨ 0,1 mL 20 min
Ag+
Lavado Agua destilada 2 x 1 min
Carbonato de sodio 6,25 g

̴ 2-5 min
Revelado Formaldehido 37% (p/v) Ɨ 0,05 mL
Solución EDTA-Na2-2H20 3,65 g

Parada
Lavado Agua destilada

*El glutaraldehido y el tiosulfato de sodio actúan como agentes complejantes uniéndose a las
proteínas. &Formaldehido se usa como agente reductor. ̴ Hasta que se observen la presencia de
bandas.
P á g i n a | 97
M&M
3.9.2 Tinción por afinidad (Zimografía)
Para la realización del zimograma de la actividad quitinasa, se utilizó

un gel de separación al 10% que contenía un 0,1% de quitina coloidal
como sustrato de quitinasa para detectar la actividad de quitinasa. Las
muestras se mezclaron con tampón de carga sin agente reductor y se
calentaron antes de cargarlas en el gel de electroforesis. Después de la
electroforesis, el gel se incubó en tampón de acetato de sodio 100 mM
(pH 5.0) a 4 °C durante 18 h. La actividad quitinasa se visualizó en el gel
mediante la tinción con rojo Congo al 0,1%, y se destiño con NaCl 1M.
La zona lítica en el gel observada a la luz del día sobre un fondo rojo
oscuro indicó la presencia de una enzima activa [Yamabhai y col.,
2008].
3.9.3 Análisis proteómico
Los análisis proteómicos se han realizado en el Gene Center de la

Ludwig Maximilian Universitä, Munich (Alemania), en el laboratorio del
Dr. Georg J. Arnold. Brevemente, los geles para el análisis proteómico
no se han teñido, utilizándose directamente tal cual se han extraído del
casette, se han lavado y estabilizado. El proceso global seguido en este
estudio se muestra esquemáticamente en la Figura-M.24.
Una vez cargado 50 μg de proteínas por carril, éstas se separaron

por PAGE-SDS al 12%. Terminada la electroforesis, extraído el gel,
separados los carriles, cortando con un bisturí, cada uno de los carriles
de gel, sin teñir, se dividió en tres partes y cada parte se colocó en un
tubo diferente. Seguidamente cada fragmento se procesó
P á g i n a | 98
M&M
individualmente, mediante "digestión triptica in gel", siguiendo el

protocolo descrito por Carbonero-Aguilar [Carbonero-Aguilar, 2012].
Cada parte se incubó en NH4HCO3 40 mM, 30% (v/v) de acetonitrilo a 30
°C durante 120 min. Las proteínas dentro de las piezas se redujeron con
ditiotreitol 10 mM durante 20 min. Después de lavar con NH 4HCO3 40
mM, los geles se alquilaron mediante incubación en yodoacetamida 20
mM durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
Las muestras alquiladas se lavaron con NH4HCO3 40 mM y se

deshidrataron con 100% de ACN. Las proteínas in gel se digirieron con
tripsina porcina modificada grado secuenciación (Promega, Madrid,
España) en NH4HCO3 40 mM, a 37 °C durante la noche.
Los péptidos trípticos, generados durante la digestión tríptica in gel,

se extrajeron dos veces, de las piezas de gel, con ACN al 50% (v/v), y se
secaron al vacío en una Savant. Los péptidos secos se guardaron a -80
°C hasta su análisis por nano-cromatografía líquida acoplada a
espectrometría de masas (nLC-MS/MS).
P á g i n a | 99
M&M
Figura M.24. Esquema del diseño experimental utilizado para el

análisis proteómico del secretoma de T. harzianum CEC-T24.
P á g i n a | 100
M&M
Brevemente, los digeridos peptídicos se resuspendieron en agua Milli-

Q ultrapura y se eliminaron las sales con un tampón A (H2O 99,9% +
0,1% de ácido fórmico) en una columna atrapadora de péptidos Zorbax
300 SB-C18, 5 × 0,3 mm, (Agilent, Madrid, España) durante 10 min. Los
péptidos unidos a la columna se eluyeron a una columna Picofrit
empaquetada con Microm Magic C18 AQ, de 10 cm x 75 µm, y se
eluyeron con un gradiente de tampón B (99,9% de acetonitrilo + 0,1% de
ácido fórmico) al 5% hasta un 50% de tampón B en 75 min, y luego del
50% de tampón B al 90% de tampón B en 80 min, usando para ello un
HPLC Themo Electron Surveyor. Eluyéndose los péptidos, a un flujo de
250 nL min-1, a un espectrómetro de masas Thermo Electron LTQ / FT
para su análisis.
Los espectros de MS y MS/MS se han obtenido en modo automático

con una resolución de 100.000, y los diez iones principales de cada ciclo
se sometieron a una autolisis por disociación inducida por colisión (CDI)
en una trampa lineal (LTQ). Para el análisis de iones en modo MS/MS,
los iones precursores fueron acelerados a 8 kV y seleccionados en la
puerta de entrada de iones de trampa. Los fragmentos generados por
colisión de los precursores con aire en la cámara de colisión CID, fueron
además acelerados a 15 kV en la 2ª fuente y sus masas fueron
analizadas después de pasar por el reflector de iones.
El análisis automático de los datos de masas se realizó usando una

tolerancia para los fragmentos de 0,80 Da (monoisotópica) y para los
precursores de 200 ppm (monoisotópica). Permitiéndose modificaciones
parciales y completas de restos aminoacídicos, así como mutaciones
P á g i n a | 101
M&M
puntuales y dos sitios de escisión perdidos. La validación probabilística

de las identificaciones de proteínas en el secretoma de T. harzianum
CEC-T24 (v. 2.0, DOE Joint Genome Institute) se ha llevado a cabo con
la versión Scaffol 01.07.00 (Proteome Software, Portland, Oregón),
utilizando para ello los algoritmos X-Tandem y Protein Prophet. [Craig y
Beavis, 2003; Nesvizhskii y col., 2003] Los criterios mínimos para la
identificación positiva se establecieron en al menos la identificación de
dos péptidos y con una probabilidad> 95%.
3.10 Estabilización de Quitinasas
El estudio de estabilidad de los preparados enriquecidos en

quitinasas se ha llevado a cabo en preparados liofilizados,
ultraconcentrados y ultraconcentrados + glicerol al 30%, así como
inmovilizada en micropartículas de alginato, midiendo la actividad de las
muestras al cabo de 1, 2, 4, 6 y 12 meses, previo almacenamiento a 4
°C, temperatura ambiente (22-23 °C) y 45 °C.
3.11 Producción de quitinasas en un reactor tipo tambor

rotativo (escala semi-piloto).
El cambio de escala de la producción de quitinasas en medios ricos

en quitina se ha llevado a cabo en un reactor tipo tambor rotatorio,
esquemádicamente descrito en la Figura M.25., de acuerdo con el
procedimiento descrito por Pérez-Rodriguez y colaboradores para la
producción de otras enzimas, xilanas y feruloil esterasa [Pérez-
P á g i n a | 102
M&M
Rodriguez y col., 2017].
Figura M.25. Esquema del reactor tipo tambor rotatorio utilizado para
la producción de quitinasas en medios ricos en quitina.
Para el seguimiento del proceso, medida de actividades, biomasa, etc.,

se han utilizado las mismas técnicas y procedimientos descritos más
arriba.
3.12 Análisis de datos
Los datos analíticos se compararon mediante el análisis de varianza

(ANOVA) utilizando SAS 9.3. Se ha utilizando la prueba de rango
múltiple de Duncan (DMRT), estableciendo el nivel de significancia en
0.05. Todas las pruebas se realizaron por triplicado.
En el caso del estudio proteómico, el análisis automático de los datos

de masas se ha realizado usando una tolerancia para los fragmentos de
0,80 Da (monoisotópica) y para los precursores de 200 ppm
(monoisotópica). Permitiéndose modificaciones parciales y completas de
P á g i n a | 103
M&M
restos aminoacídico, así como mutaciones puntuales y dos sitios de

escisión perdidos. La validación probabilística de las identificaciones de
proteínas en el secretoma de T. harzianum CEC-T24 (v. 2.0, DOE Joint
Genome Institute) se ha llevado a cabo con la versión Scaffol 01.07.00
(Proteome Software, Portland, Oregón), utilizando para ello los
algoritmos X-Tandem y Protein Prophet. [Craig y Beavis, 2003;
Nesvizhskii y col., 2003] Los criterios mínimos para la identificación
positiva se establecieron en al menos la identificación de dos péptidos y
con una probabilidad> 95%.
P á g i n a | 104
RESULTADOS
RESULTADOS Y DISCUSIONES
4. RESULTADOS Y DISCUSIONES
La producción de quitinasas a escala industrial requiere de medios

ricos en quitina, abundantes, fáciles de obtener y baratos.
La quitina es el segundo biopolímero más abundante en la Naturaleza

después de la celulosa. La fuente a partir de la que habitualmente se
obtiene la quitina son los residuos de la industria de los crustáceos y los
grandes depósitos de exoesqueletos almacenados en la Antártida [Yan,
2015]. Si bien, también existen otras fuentes, potencialmente utilizables,
tales como los hongos, insectos, etc. [Ospina-Álvarez y col., 2014;
McGavin, 2000].
Entre estas potenciales fuentes los hongos son de especial interés,

sobre todo los subproductos generados en la industria conservera de
hongos comestibles [Hassainia y col., 2018] y el micelio producido
durante la producción biotecnológica (fermentación) de ácido cítrico
[Tayel y col., 2011].
4.1. Subproductos y sustratos
En el presente trabajo nos hemos centrados en el estudio de los

subproductos ricos en quitina generados a lo largo del procesamiento de
hongos comestibles, concretamente del champiñón (Agaricus bisporus),
para conserva en comparación con los subproductos generados en el
procesamiento de crustáceos (cangrejo rojo de río, Procambarus clarkii).
P á g i n a | 107
4.1.1. Recopilación de subproductos
De acuerdo con el diseño experimental, lo primero en que nos

centramos fue en el acopio de materias primas (subproductos
agroindustriales) y de su estabilización, ya que debido a su naturaleza,
productos con alto contenido en humedad y nutrientes, son productos
fácilmente perecederos y degradables.
En la Tabla-R.1 se muestran las materias primas o subproductos

agroindustriales utilizados en este estudio, así como los sustratos
derivados de ellas y utilizados en los diferentes ensayos de fermentación
y/o cultivos. Como podemos observar, los subproductos utilizados
derivan, de la industria conservera del champiñón: tallos de champiñón y
champiñones no comercializables, y de la industria del procesamiento
del cangrejo de río (Procambarus clarkii): cefalotórax y pinzas. Que nos
permiten obtener los siguientes sustratos: harina de tallos de champiñón
(HTCH), fracción enriquecida en quitina y glucanos (F-Q/G) y harina de
cangrejo (HC).
Tabla-R.1. Materias primas y/o sustratos utilizados en la producción de

quitinasas.
Materia Prima Sustrato
Harina de Tallos de Champiñón (HTCH)

Tallos de Champiñón* Fracción enriquecida en quitina y Glucanos
(F-Q/G)
Subproductos cangrejos** Harina de cangrejo (HC)
*Industria conservera de champiñón, **Industria del procesamiento de cangrejos.
P á g i n a | 108
¿Por qué estos subproductos? La razón es porque son subproductos

con un alto contenido en quitina, muy abundantes y baratos, y a pesar
de que algunos (subproductos de la industria del procesamiento del
cangrejo) son temporales, es decir, se obtienen sólo durante un
determinado tiempo, se pueden obtener en grandes cantidades, que una
vez estabilizados y almacenados adecuadamente se pueden utilizar
durante un largo periodo. Los subproductos del champiñón (tallos y
champiñones no comercializables) no dependen de la temporalidad, se
producen a lo largo de todo el año.
4.1.2. Preparación de los sustratos
A partir de los dos subproductos ricos en quitina mencionados, se ha

procedido a preparar y estabilizar los correspondientes sustratos: HTCH
y F-Q/G, a partir del subproducto de la industria conservera del
champiñón y la HC a partir de la industria del procesamiento del
cangrejo rojo de río. Utilizándose este último como sustrato control
(quitina de crustáceo).
Los tallos de champiñón una vez lavados con agua fría abundante,
para eliminar restos de compost y tierra, se han escurrido y se han
secado con aire a 90 ºC en una estufa con ventilación forzada hasta
peso constante. El producto seco se molió en un molino de pistón
equipado con un tamiz de 2,5 mm de diámetro, obteniéndose un polvo
fino uniforme al que hemos denominado HTCH (ver Figura-R.1a).
P á g i n a | 109
Con el fin de obtener una fracción enriquecida en quitina, así como un

hidrolizado proteico, se ha procedido a la desproteinización parcial de la
HTCH mediante su tratamiento con la proteasa Alcalasa®.
Obteniéndose una fracción soluble (hidrolizado proteico) y una fracción
insoluble. Brevemente, la HTCH se ha resuspendido en agua en una
proporción del 10% y se ha tratado con la proteasa Alcalasa® en una
relación enzima/sustrato, E/S = 0,03 v/p, a 55 ºC durante 180 min
manteniendo el pH constante a 8,5, alcanzando un grado de hidrólisis
del 6,21±0,4% (Figura-R.2).
Figura R1. Sustratos utilizados para la producción de quitinasas: a)

HTCH, b) F-Q/G y c) HC.
P á g i n a | 110
Seguidamente el hidrolizado se ha centrifugado a 10.000 x g,

obteniéndose un sobrenadante (hidrolizado proteico), y un precipitado
que se ha secado en estufa con aire forzado a 55 ºC hasta peso
constante. El producto seco se molió en un molino de pistón equipado
con un tamiz de 2,5 mm. Obteniéndose un polvo fino uniforme que
hemos denominado fracción enriquecida en quitina/glucanos (F-Q/G)
(ver Figura-R.1b).
Figura R2. Curva de hidrólisis de la HTCH con Alcalasa®.
Los subproductos de la industria del procesamiento del cangrejo:

cefalotórax y pinzas, tratados con HCl 2M overnight, para
desmineralizar, se han lavado con abundante agua y una vez secados
con aire caliente (80ºC), fueron molidos en un molino de pistón y
tamizados a través de un tamiz de poro 2,5 mm de diámetro, tal y como
se describe en el correspondiente apartado de Materiales y Métodos.
Obteniéndose un polvo fino uniforme al que hemos denominado HC (ver
Figura-R.1c).
P á g i n a | 111
Los tres productos: HTCH, F-Q/G y HC, sustratos ricos en quitina, se

han utilizado para la formulación de medios de cultivo para producir
quitinasas, como más adelante describiremos.
4.1.3. Caracterización de los sustratos
La caracterización de los sustratos para la fermentación se ha llevado

a cabo mediante la determinación de los siguientes parámetros:
humedad, materia orgánica (MO), grasa bruta, nitrógeno total (Nt),
proteína (Nt x 5,45 para la HTCH y F-Q/G y Nt x 6,24 para la HC),
hidratos de carbono totales, quitina, y pH. En la Tabla-R.2 se resumen
los resultados obtenidos.
Tabla-R.2. Composición básica de los sustratos utilizados en la

producción de quitinasas por fermentación. (Datos expresados en % p.s.)
HTCH F-Q/G HC
(%) (%) (%)
Humedad& 7,3±1,2 7,4±0,5 7,0 ± 0,7
Peso seco* 92,7±1,2 92,6±0,5 93,0 ± 0,7
Cenizas* 8,8±2,3 7,6±0,7 35,5 ± 2,5
MO& 91,2±2,3 92,4±3,7 64,5 ± 2,5
Grasa* 3,2±0,4 n.d. 12,8 ± 0,9
Nt* 5,2±0,3 0,6±0,1 5,04 ±0,72
Proteína& 28,6±1,7 $
3,3±0,5 $
31,5 ± 4,5#
HC+Otros& 59,4±5,1 89,1±0,9 20,2±1,9
- Quitina* 22,1±1,9 33,5±2,4 16,1±1,7
pH* 6,9±0,3 7,9±0,4 7,2±0,3
&Datos calculados; *Datos experimentales; $factor 5,45 para HTCH; #factor 6,24 para HC.
P á g i n a | 112
Analicemos con algo más de detalle estos sustratos.
i) Harina de tallos de champiñón (HTCH)
Una vez secados y molidos los tallos de champiñón se obtiene una

harina de color marrón-oscuro, con un contenido de humedad del
7,3±1,2%, y peso seco del 92,7±1,2%; correspondiendo el 8,8±2,3%
(p.s.) a cenizas, y el 91,2±2,3% (p.s) a materia orgánica. Con un
contenido en grasa del 3,2±0,4%, p.s., en proteína del 28,6±1,7%, p.s., y
en hidratos de carbono más otros del 59,4±5,1%, p.s. (ver Tabla-R.2).
Del contenido en carbohidratos más de la mitad es quitina,
representando un 22,1±1,9% del peso seco. Contenido sumamente
interesante para utilizarse tanto como material de partida para obtener
sustratos ricos en quitina para producir quitinasas, como para obtener
nanoquitina [Liang y col., 2018; Wu y col., 2019].
ii) Fracción enriquecida en quitina y glucanos (F-Q/G)
Una vez tratada la HTCH con la proteasa Alcalasa®, el precipitado

desproteinizado enzimáticamente se ha secado y molido, obteniéndose
un polvo fino uniforme de color beige-blanco, que hemos denominado
fracción enriquecida en quitina/glucanos (F-Q/G) ya que está constituida
mayoritariamente por polisacáridos (glucanos insolubles y quitina,
fundamentalmente). Esta F-Q/G tiene un contenido de humedad del
P á g i n a | 113
7,4±0,5%, y peso seco del 92,6±0,5%; correspondiendo el 7,6±0,7%

(p.s.) a cenizas, y el 92,4±3,7% (p.s) a materia orgánica; con un
contenido en proteína del 3,3±0,5%, p.s., y en hidratos de carbono más
otros (fundamentalmente quitina y glucanos) del 89,1±0,9%, p.s.,
correspondiendo a quitina el 33,54±2,4 (ver Tabla-R.2).
iii)Harina de cangrejo (HC)
Una vez los subproductos de cangrejo, secos y molidos se obtiene

una harina de color marrón-claro con un contenido en humedad del
7,0±0,7% y peso seco del 93,0±0,7%, correspondiendo más de un tercio
del peso a cenizas (35,5±2,5%) y el 64,5±2,5% a materia orgánica, de la
que el 12,8±0,9 corresponde a grasa, el 31,5±4,5 a proteínas y el
20,2±1,9% a hidratos de carbono, correspondiendo un 16,1±1,7% a
quitina.
4.2. Fermentaciones
Una vez obtenido los sustratos ricos en quitina (HTCH, F-Q/G y HC)
se procedió a estudiar la producción de quitinasas, en medios de
fermentación formulados con los anteriores sustratos ricos en quitina por
diversas cepas productoras de esta enzima disponibles en nuestro
laboratorio (B. licheniformis ATCC 21415, T. harzianum CEC-T24 y T.
atroviride CEC-T23), y habitualmente utilizadas para la producción
industrial de esta enzima. Para ello se ha estudiado la producción de
quitinasas mediante dos sistemas: FS y FES.
P á g i n a | 114
4.2.1. Fermentación sumergida (FS)
En este primer estudio se analizó la producción de hidrolasas,

fundamentalmente quitinasas, β-glucanasas y proteasas secretadas por
B. licheniformis ATCC 21415, de T. harzianum CEC-T24 y T. atroviride
CEC-T23. Estos microorganismos se cultivaron en fermentación
sumergida (FS) en aerobiosis, con agitación mecánica, y temperatura
adecuada (28±1 ºC), durante 14 días, utilizando diferentes medios de
cultivo, tal y como se muestra en la Tabla-R.3. Los medios utilizados han
sido: medios con quitina (Qp o Qc) y H2O, medios con quitina (Qp o Qc) y
medio mínimo de sales y vitaminas, un medio mínimo utilizado para
cultivo de hongos (Czapeck) con Qc, y medios ricos (PB/Qc, HTCH y F-
Q/G).
Como puede observarse, inicialmente, los cultivos se han

desarrollado en medios que contienen únicamente agua y quitina, bien
en forma de polvo o en forma coloidal (H2O/Qp, H2O/Qc), con el fin de
analizar la capacidad de estos microorganismos para utilizar la quitina
como única fuente de energía. Como cabía esperar el desarrollo ha sido
escaso o pobre pero se pone de manifiesto claramente que tanto
Trichoderma como Bacillus pueden utilizar la quitina como fuente de
energía para su crecimiento y que necesariamente lo hacen a través de
la producción de quitinasas y otras hidrolasas que facilitan su uso como
fuente de carbono y de nitrógeno.
P á g i n a | 115
Tabla-R.3. Producción de biomasa en los diferentes medios de cultivo

después de 14 días de crecimiento en fermentación sumergida.
T. harzianum T. atroviride B. licheniformis

Biomasa CEC-T24 CEC-T23 ATCC 21415
Medios (mg mL-1) (mg mL-1) (mg mL-1)
de Cultivo
H2O/Qp 0.1±0.1 0.2±0.1 0.2±0.2
H2O/Qc 0.4±0.1 0.3±0.2 1.3±0.1
Mm/Qp 0.7±0.2 0.5±0.3 0.4±0.1
Mm/Qc 3.2±0.4 2.9±0.2 2.3±0.3
Czapeck/Qc 0.2±0.1 0.3±0.1 0.4±0.1
PB/Qc 4.6±0.5 3.7±0.3 2.6±0.2
HTCH 9.8±0.5 8.5±0.3 4.7±0.4
F-Q/G 8.2±0.6 7.4±0.4 2.7±0.4
(Qp: Quitina en polvo, Qc: Quitina coloidal, Mm: Medio mínimo, PB: (Potato Broth = Extracto de
Patata, F-Q/G: Fracción enriquecida de Quitina y Glucano).
El siguiente paso fue estudiar el efecto del aporte de minerales y

vitaminas, para ello se llevarón a cabo los cultivos en medios mínimos,
respecto al contenido mineral y vitamínico, suplementados con quitina
en forma de polvo o en forma coloidal (Mm/Q p, Mm/Qc), cuya finalidad,
básicamente, es la misma, testar el crecimiento de los tres
microorganismo, pero favorecido por la presencia del aporte mineral y
vitamínico mínimo. Estos resultados se han complementado con el
estudio del crecimiento en el medio Czapeck/Qc que es también un
medio mínimo para cultivo de hongos y levaduras [Gamazo y col.,
2009].
P á g i n a | 116
Como se observa de los resultados expuestos en la Tabla-R.3, en los

medios mínimos (Mm y Czapeck) suplementados con Q p o con Qc sí se
observa una ligera mejora en el crecimiento de los tres
microorganismos, si bien el crecimiento en el medio Czapeck/Qc es
prácticamente igual que el observado para los medios de H 2O/Q.
Además, estos resultados también muestran que tanto en el medio
formulado sólo con H2O y quitina (Qp o Qc), como en el medio mínimo
(Mm) y quitina (Qp o Qc), cuando se utiliza Qc el crecimiento de los
microorganismos es mayor, se obtiene mayor cantidad de biomasa/mL,
que cuando se utiliza Qp. Esto podría explicarse por la presencia de una
mayor proporción de quitina amorfa presente en la Q c que en la Qp
donde predomina la quitina cristalina. Lo que facilitaría el uso de la
quitina como fuente nutritiva por los microorganismos por ser más
fácilmente accesible a las quitinasas. Por ello, a partir de este punto se
ha utilizado Qc en el resto de los ensayos.
Con el fin de analizar el efecto de la quitina sobre el crecimiento de

estos microorganismos en un medio nutritivamente rico, se ha estudiado
el crecimiento en un medio rico suplementado con quitina, como es el
medio PB/Qc y en dos medios naturales ricos en quitina formulados con
HTCH o F-Q/G, respectivamente (ver Tabla-R.3).
En los medios ricos (PB/Qc, HTCH, F-Q/G), con fuentes de carbono,

nitrógeno, sales, y vitaminas fácilmente utilizables, se observa un mayor
crecimiento de los tres microorganismos.
P á g i n a | 117
En el medio PB/Qc la producción de biomasa es ligeramente superior

a la obtenida en el medio Mm/Qc, para los tres microorganismos, si bien
esta diferencia es más pronunciada en el caso de T. harzianum CEC-
T24 y T. atroviride CEC-T23 que en el caso de B. licheniformis ATCC
21415.
Sin embargo, en los medios formulados con HTCH o con F-Q/G, T.

harzianum CEC-T24 y T. atroviride CEC-T23 muestran claramente un
mayor crecimiento que Bacillus, lo que podría atribuirse a una mayor
eficiencia en la producción de enzimas hidrolíticas secretadas al medio
por parte de T. harzianum CEC-T24 y T. atroviride CEC-T23. También
se observa que tanto Trichoderma como Bacillus crecen mejor en
presencia de quitina fúngica (HTCH y F-Q/G) que en presencia de
quitina coloidal de crustáceo, probablemente a una mayor cantidad de
quitina amorfa en la quitina fúngica que en la quitina de crustáceo.
Con el fin de estudiar la producción de hidrolasas, y en particular de

quitinasas, a lo largo del cultivo, a la vez que el crecimiento se analizó
también la producción de actividad quitinasa. En la siguiente Figura-R.3
se muestran las curvas de crecimiento de T. harzianum CEC-T24, T.
atroviride CEC-T23 y B. licheniformis ATCC 21415 y las curvas de
producción de quitinasas (actividad quitinasa) en el medio de cultivo
formulado con F-Q/G, resultados análogos se han obtenido para los
cultivos en el medio formulado con HTCH (Figura-R.4).
De los resultados expuestos en la Figuras-R.3 y -R.4 se observa

claramente que la producción de quitinasas en el medio formulado con
P á g i n a | 118
HTCH es superior al obtenido en el medio formulado con la F-Q/G, lo

que probablemente se ha debido a la mayor riqueza del medio
formulado con HTCH, ya que además de la quitina fúngica y glucanos
insolubles, presentes también en la F-Q/G, se aportan proteínas,
péptidos, hidratos de carbono fácilmente hidrolizables (algunos
glucanos), minerales y vitaminas que no están presentes en la F-Q/G, ya
que se han eliminado durante la elaboración de esta fracción. En la
Tabla-R.4 se muestran las actividades quitinasa alcanzas al 6º día de
cultivo, para T. harzianum CEC-T24, y B. licheniformis ATCC 21415 y al
9º día para T. atroviride CEC-T23, crecidos en fermentación sumergida
en medios formulados con F-Q/G y HTCH.
P á g i n a | 119

crecidos en el medio F-Q/G.
P á g i n a | 120

crecidos en el medio HTCH.
P á g i n a | 121
Tabla-R.4. Producción de quitinasas por T. harzianum CEC-T24, T.

atroviride CEC-T23 y B. licheniformis ATCC 21415 crecidos en
fermentación sumergida en un medio formulado con F-Q/G y HTCH.
GlcNAc GlcNAc
Microorganismo (mg/mL) (mg/mL)
F-Q/G HTCH
T. harzianum CEC-T24 1,6±0,1 2,2±0,3
T. atroviride CEC-T23 1,3±0,1 1,8±0,4
B. licheniformis ATCC 21415 0,4±0,1 0,6±0,2
Estos resultados ponen claramente de manifiesto, que en medios

formulados con HTCH o F-Q/G, y en fermentación sumergida,
Trichoderma excreta al medio mayor cantidad de enzimas hidrolíticas
que Bacillus, los que justificaría el menor crecimiento (producción de
biomasa) de Bacillus. Estos resultados también muestran que T.
harzianum CEC-T24 excreta mayor cantidad de quitinasas que T.
atroviride CEC-T23 tanto cuando se crecen en un medio formulado con
F-Q/G como en un medio formulado con HTCH. De acuerdo con la
Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica (NC-IUB,
1981), y como se indica en el correspondiente apartado de M&M las
actividades enzimáticas se han expresado como Unidades
Internacionales (UI, o Intenational Units, IU). Los resultados obtenidos
por interpolación en una curva patrón de N-acetilglucosamina se han
expresado como UI de actividad enzimática tras la correspondiente
transformación.
En relación con la producción de quitinasas, a partir de nuestros
P á g i n a | 122
datos, se observa que T. harzianum CEC-T24 presenta un máximo de

producción de quitinasas de 1,6±0,1 mg de N-acetil-glucosamina/mL,
equivalente a 1446,59 UI L−1 de actividad de quitinasa al 6º días de
cultivo en el medio formulado con F-Q/G y de 2,2±0,3 mg/mL
equivalente a 1989,06 UI L−1 de actividad de quitinasa también al 6º días
de cultivo, en el medio formulado con HTCH, mientras que T. atroviride
CEC-T23 presenta el máximo de producción de 1,3±0,1 y 1,8±0,4
mg/mL a los 9 días cuando se crece en un medio formulado con F-Q/G o
HTCH, respectivamente, mientras que B. licheniformis ATCC 21415
presenta el máximo de producción de 0,4±0,1 y 0,6±0,2 mg/mL, tras 6
días de cultivo, en un medio formulado con F-Q/G o HTCH,
respectivamente.
En todos los casos, a partir del punto de máxima producción de

actividad, se observa una importante reducción de la actividad quitinasa,
coincidiendo, con la inducción de la producción de proteasas, como más
adelante presentaremos. Este fenómeno, de pérdida de actividad
quitinasa por inducción de la actividad proteásica, ha sido también
observado por otros investigadores utilizando otros sustratos y
microorganismos [Parrado y col., 2014]. Por lo que es fundamental
determinar el punto de cosecha para minimizar la pérdida de actividad
quitinasa por proteolísis, que en el caso de T. harzianum CEC-T24, tanto
en medios de cultivo formulados con HTCH como con la F-Q/G, estaría
sobre los 6 días de cultivo. O bien monotorizar el cultivo, siguiendo la
producción de la actividad proteásica mediante el método de la
azocaseina, por ejemplo, a partir del 5º día cultivo midiendo dicha
P á g i n a | 123
actividad cada 2 horas y cosechando el cultivo en el momento de

iniciarse la inducción, lo que viene reflejado por un marcado incremento
en la actividad.
Una vez obtenido estos resultados, centramos el estudio en la

producción de quitinasas por Trichoderma harzianum CEC-T24 en
medios formulados con HTCH y/o F-Q/G. Los resultados obtenidos en
este estudio, mostrados en las Figuras-R.3, -R.4 y Tabla-R.4, son
similares a los descritos por otros grupos que utilizan sustratos ricos en
quitina, como las paredes celulares de los hongos [de Lima y col.,
2016] o quitina de crustáceos [Yang y col., 2019]. Estos resultados,
además sugieren que la regulación de la expresión de enzimas
hidrolíticas, como las quitinasas y β-glucanasas, en estos hongos puede
verse influida por la cantidad y complejidad de la quitina y β-glucanos
presentes en el medio de cultivo. Las paredes celulares fúngicas están
compuestas principalmente por β-1,3 y β-1,6-glucanos (polímeros de
glucosa) y quitina (polímero de Glc-NAc unidas a través de enlaces β-
1,4), y el grado de cristalinidad de esta última depende en gran manera
de la fuente, siendo más accesible, y probablemente más amorfa, la
quitina fúngica que la procedente de crustáceos que además de una
mayor cristalinidad presenta una mayor rigidez debido a restos del
componente mineral no siempre eliminado durante la desmineralización.
4.2.2. Fermentación en estado sólido (FES)
Identificado que T. harzianum CEC-T24 secreta eficientemente

quitinasas en medios de cultivo formulados con HTCH o con F-Q/G, el
P á g i n a | 124
siguiente paso fue estudiar que sistema de fermentación era mejor para
la producción de quitinasas en gran escala. Por lo que también se
estudió la producción de quitinasas en los mismos medios de cultivo
(ricos en quitina) pero utilizando la técnica de FES, ya que debido a
determinadas ventajas como: sencillez, mayor productividad, menores
costes en el downstrem, etc., actualmente hay una tendencia a la
sustitución de la FS por esta última [Abdul Manan y Webb, 2017].
Actualmente, existe un gran interés en mejorar la producción

industrial de proteínas y enzimas con potencial comercial, como
quitinasas e hidrolasas, que pueden tener importantes aplicaciones en la
industria farmacéutica, cosmética, biotecnología, biocontrol y
biorremediación [Askolin y col., 2001; Howard y col., 2003].
La fermentación en estado sólido, o también denominada

fermentación en medio sólido, se define como el crecimiento de
microorganismos en medios sólidos o semisólidos en ausencia de agua
libre [Blandino y col., 2005; Krishna, 2005]. Las fermentaciones de
estas características son aquellas en las cuales el sustrato no está
disuelto ni en suspensión en un gran volumen de agua. Es un proceso
microbiológico que ocurre comúnmente en la superficie de materiales
sólidos que tienen la propiedad de absorber y contener agua, con o sin
nutrientes solubles". El sustrato debe contener solo la humedad
suficiente para promover el crecimiento y el metabolismo de la actividad
del microorganismo [De Ory y col., 2007].
P á g i n a | 125
Esta técnica presenta ventajas y desventajas frente a la FS.
Entre las ventajas caben citar las siguientes: i) Los medios de cultivo
son simples, generalmente subproductos agrícolas que presentan un
alto contenido de los nutrientes necesarios. ii) La baja actividad del agua
es de gran ayuda para evitar las contaminaciones, especialmente de
bacterias y levaduras. iii) La aireación forzada es facilitada por la
porosidad del soporte, lo que permite una alta transferencia de oxígeno
al microorganismo. iv) el proceso de recuperación de los productos es
sencillo. Algunos productos son utilizados integralmente como alimento
animal, productos para el control biológico, etc.
Entre las principales desventajas podemos indicar las siguientes: i) Su

aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos contenidos
de humedad. ii) La extracción del calor metabólico puede ser un
problema, sobre todo cuando se trabaja a gran escala y no se controla el
proceso. iii) La naturaleza sólida del sustrato trae problemas al medir los
parámetros de la fermentación, tales como el pH, la temperatura, el
contenido de humedad y la concentración del sustrato y productos. iv)
Muchos aspectos ingenieriles como el diseño de reactores y el escalado
están muy poco caracterizados. v) El tiempo de fermentación es mayor
debido a que generalmente se utilizan microorganismos que presentan
bajas velocidades específicas de crecimiento.
A pesar de estos inconvenientes, que en la mayoría de los casos son

inevitables y en otros relativamente fáciles de solucionar, la FES se está
revelando como el procedimiento más adecuado para la producción de
P á g i n a | 126
enzimas cuando se usan como sustratos sub-productos agroindustriales,

como es la HTCH.
Por lo que, seguidamente, en el presente trabajo, estudiamos la

producción de quitinasas por T. harzianum CEC-T24 en FES con el fin
de comprobar cuál de los dos sistemas utilizados, FS o FES, era el más
adecuado para la producción de quitinasas en medios formulados con
sustratos ricos en quitina: HTCH, F-Q/G y HC como control. Teniendo en
cuenta que en FS T. harzianum CEC-T24 es el microorganismo que
muestra una mejor producción de quitinasa en los medios ricos en
quitina ensayados, en el caso de la FES, hemos centrado también el
estudio en este hongo; estudiando su crecimiento y la producción de
quitinasas en los medios indicados en la Tabla-R.5.
Tabla-R.5. Producción de quitinasas tras 6 días de Fermentación en

estado sólido.
Medios de Cultivos GlcNAc (mg/mL)
F-Q/G-A 1,7±0,2
F-Q/G+A 2,8±0,3
HTCH-A 3,5±0,3
HTCH+A 5,8±0,4
HC-A 1,0±0,2
HC+A 1,2±0,3
FES: Fermentación en estado sólido, F-Q/G: Fracción de quitina/glucano,
HTCH: Harina de Tallo de Champiñón, HC: Harina de Cangrejo, A: Aireación.
P á g i n a | 127
De los datos expuestos en la Tabla-R.5 se observa que la aireación

favorece la producción de quitinasas, probablemente debido a la mayor
cantidad de biomasa producida en estas condiciones. Si bien, en el caso
de la HC, prácticamente no se observa diferencia, lo que podría
atribuirse a un mayor apelmazamiento de la HC húmeda, que dificulta su
aireación y que constituye uno de los inconvenientes señalados para la
FES, pero que se podría solucionar con la inclusión de elementos
inertes (bolas o trozos de plástico) que evitaría el apelmazamiento del
sustrato [Costa y col., 2018].
Estos resultados también muestran que la producción de quitinasas

es mayor en un medio formulado con HTCH que un medio formulado
con F-Q/G, lo que puede atribuirse a una mayor presencia de proteínas
y péptidos, así como de azúcares, fácilmente disponibles por el
microorganismo, en la HTCH, y que han sido eliminados en parte a la
hora de preparar la F-Q/G. Por otro lado, el uso de HTCH en lugar de F-
Q/G resulta mucho más beneficioso, desde un punto de vista
económico, ya que su preparación es mucho más sencilla y barata, ya
que no precisa del uso de enzimas para su obtención y de ningún otro
procedimiento adicional, salvo el secado y la molienda. Lo que abarata
grandemente el proceso. Los resultados anteriores muestran que la
mayor concentración de quitinasas se obtiene en el medio formulado
con HTCH y llevado a cabo con aireación, seguido de la producción en
el medio F-Q/G y HC (5,8±0,4, 2,8±0,3 y 1,2±0,3 mg de GlcNAc/mL
respectivamente). Teniendo en cuenta estos resultados, parece lógico
utilizar HTCH antes que la F-Q/G, ya que el objetivo es producir
quitinasas en medios baratos y con mínimos pretratamientos.
P á g i n a | 128
Tabla-R.6. Producción de quitinasas tras 6 días de Fermentación tanto en FS como FES.
FS
GlcNAc
*mg GlcNAc mg GlcNAc/mL µMOL/mL UI/mL UI/L
(mg/mL)
F-Q/G-A 1,6 2,4 9,6 43,40 1,45 1446,59
F-Q/G+A 1,7 2,55 10,2 46,11 1,54 1537,00
HTCH-A 2,2 3,3 13,2 59,67 1,99 1989,06
HTCH+A 2,5 3,75 15 67,81 2,26 2260,30
HC-A 0,4 0,6 2,4 10,85 0,36 361,65
HC+A 0,5 0,75 3 13,56 0,45 452,06
FES
GlcNAc
*mg GlcNAc mg GlcNAc/mL µMOL/mL UI/mL UI/L
(mg/mL)
F-Q/G-A 1,7 2,55 10,2 46,11 1,54 1537,00
F-Q/G+A 2,8 4,2 16,8 75,95 2,53 2531,53
HTCH-A 3,5 5,25 21 94,93 3,16 3164,41
HTCH+A 5,8 8,7 34,8 157,32 5,24 5243,89
HC-A 1,0 1,5 6 27,12 0,90 904,12
HC+A 1,2 1,8 7,2 32,55 1,08 1084,94
*mgGlcNAc: Cantidad de GlcNAc en 1,5 mL de volumen final de reacción, del cual 0,25 mL corresponde a la cantidad de muestra.
4.2.3 Análisis de la producción relativa (UI/L/día)
Teniendo en cuenta que lo que nos interesa es conseguir la máxima

producción de nuestra enzima, se procedió al análisis de la producción
relativa (UI/L/día) del cultivo de T. harzianum CEC-T24 en los diferentes
medios, mediante los dos sistemas de fermentación utilizados: FS y
FES.
En la Figura-R.5 se muestra la producción de quitinasa de T.

harzianum CEC-T24 cultivada con diferentes sustratos (HTCH, F-Q/G y
HC) como principal fuente de carbono, cultivado en FS y FES. Estos
resultados muestran que T. harzianum CEC-T24 produjo más actividad
de quitinasa en el medio de HTCH+A, en FES obteniendo una producción
máxima de 5243,89 UI L-1 en el día 6 de fermentación, a partir de dicho
punto la actividad se reduce drásticamente siendo en el día 14 de
361,65 UI L-1 probablemente a una importante inducción de la
producción de proteasas, tal y como se ha discutido más arriba y ha sido
reportado por algunos autores para otros miroorganismos y medios de
cultivo [Orts Gómez y col., 2017].
P á g i n a | 130
Figura R.5. Comparación de la producción de quitinasas por T.

harzianum CEC-T24 crecido en medios formulados con diferentes
sustratos con aireación (+A) y sin aireación (-A). a) Fermentación
Sumergida (FS) y b) Fermentación en estado sólido (FES).
P á g i n a | 131
En la siguiente Figura-R.6 se muestra comparativamente la

producción de quitinasas por T. harzianum CEC-T24 crecido en en los
diferentes medios con aireación (Figura-6.a) y sin aireación (Figura-6.b).
Como se puede observar Figura-R.6 donde se compara la producción

de quitinasas por T. harzianum CEC-T24 crecido en los diferentes
medios con aireación (Figura-6.a) y sin aireación (Figura-6.b), la
producción máxima alcanzada al sexto día, es mayor en todos los casos
cuando el cultivo se lleva a cabo con aireación eficiente, que cuando no
hay aireación, lo cual es lógico ya que el oxígeno es necesario para el
normal desarrollo y metabolismo del microorganismo. En esta figura
también se observa claramente que la máxima producción se obtiene en
el medio de HTCH+A, poniendo de manifiesto que la aireación favorece
notablemente en la producción de enzimas como se observa en todos
los medios de cultivo ensayados.
P á g i n a | 132
Figura R.6. Comparación de la producción relativa de quitinasas por T.

harzianum CEC-T24, en medios formulados con diferentes sustratos, al
sexto día de cultivo. a) Cultivos con aireación y b) Cultivos sin aireación.
En cuanto a la producción relativa, los resultados obtenidos en los dos

sistemas de fermentación, FS y FES, se muestran en la Tabla-R.7.
Tabla-R.7. Producción relativa de quitinasas de Trichoderma
harzianum CEC-T24 crecido en FS y FES en diferentes medios, tras 6
-1 -1 -1 -1
Medios de UI L Día UI L Día
cultivos FS FES
F-Q/G-A 241,10 256,17
F-Q/G+A 256,17 421,92
HTCH-A 331,51 527,40
HTCH+A 376,72 873,98
HC-A 60,27 150,69
HC+A 75,34 180.82
FS: Fermentación Sumergida, FES: Fermentación en estado sólido, F-Q/G: Fracción de
quitina/glucano, HTCH: Harina de Tallo de Champiñón, HC: Harina de Cangrejo, A: Aireación.
P á g i n a | 133
Estos resultados muestran que, independientemente del medio de

cultivo, la producción relativa (UI L-1 día-1) es sistemáticamente mayor en
FES. Lo que podría ser debido a una utilización más eficiente de los
nutrientes por T. harzianum CEC-T24 en este sistema de cultivo. Estos
resultados también ponen de manifiesto que la aireación favorece la
producción de enzimas, (Figura-R.6a), probablemente debido a que al
crecer el microorganismo en superficie tiene un mayor acceso a los
sustratos y al oxígeno, mientras que en el caso de la FS esto depende
grandemente de la difusión de los sustratos y del oxígeno en el medio
de cultivo, además, a medida que crece el microorganismo la viscosidad
del medio va aumentando, lo que dificulta la difusión tanto de los
nutrientes como del oxígeno, dificultando por lo tanto la asimilación de
nutrientes, y consecuentemente el crecimiento, ocasionando que la
excreción de enzimas sea menor [Viniegra, 2003; Raimbault, 1998].
Como se observa en la Tabla-R.7, los mejores resultados se obtienen

en el medio formulado con HTCH(-A/+A) en FES donde la producción
relativa de quitinasas es de 527,40 UI L-1 día-1, y 873,98 UI L-1 día-1,
cuando se crece T. harzianum CEC-T24 sin aireación y con aireación,
respectivamente. Estos resultados también ponen de manifiesto que el
cultivo en el medio HTCH-A en FES produce 1,6 veces más cantidad de
quitinasas que en FS, y de igual manera el cultivo en el medio HTCH+A
produce 2,3 veces más cantidad de quitinasas en FES que en FS;
poniéndose de manifiesto que un mismo sustrato en diferentes tipos de
cultivo (fermentaciones) puede incrementar significativamente la
producción enzimática, en este caso la actividad quitinasa, debido a una
utilización más eficiente de los nutrientes.
P á g i n a | 134
En el caso de utilizar la HC como subproducto rico en quitina la

producción de quitinasas también se ve influenciada por el tipo de
fermentación: FS o FES, siendo esta mayor en FES que en FS, tanto sin
aireación como con aireación. Al comparar la producción relativa en los
medios formulados con HC+A con la obtenida al utilizar HTCH+A, en un
mismo sistema de fermentación esta es mucho menor (180,82 UI L-1 día-
1 y 873,98 UI L-1 día-1 respectivamente, esto se debe a que la HC está
constituido por una quitina más dura, resistente y más difícil de ser
degradada, por lo que se necesitaría de otros procedimientos previos a
la fermentación como es la desmineralización [Bautista y col., 2001].
Estos resultados ponen claramente de evidencia la ventaja de utilizar

FES con HTCH+A como sustrato para la producción de quitinasas en un
periodo relativamente corto (6 días). Además, al excretarse las enzimas
al medio de cultivo, su recuperación, mediante simples lavados, y
centrifugaciones es sencilla y barata, lo que facilita la pre-purificación de
las enzimas y hace más eficiente y viable el procedimiento/proceso,
como más adelante discutiremos con detalle.
4.2.4 Análisis de la producción total (UI)
Si bien, la producción relativa es importante, a la hora de la

producción de una enzima de manera práctica o industrial, lo más
importante es su producción total, es decir la cantidad de unidades
producidas al cabo de un periodo de tiempo dado y para unos
P á g i n a | 135
volúmenes de cultivos empleados.
Aplicando este análisis a los distintos cultivos llevados a cabo en el

presente estudio, en la Tabla-R8 se muestran los resultados obtenidos.
Como puede observarse, salvo en el caso del medio F-Q/G-A, en todos
los demás casos estudiados se obtiene una mayor producción total de
quitinasa en los cultivos realizados mediante FES que en FS.
Así, en los medios formulados con F-Q/G se observa que cuando el

cultivo se lleva a cabo sin aireación, es decir en el medio F-Q/G-A la
producción de quitinasas, paradójicamente, es mayor en FS que en
FES: 209.8 y 154,9 UI, respectivamente; es decir un 26,17% mayor en
FS que en FES. Esto podría ser debido a que el crecimiento en velo,
que tiene lugar en la FS sin aireación le permite una mejor toma de
oxígeno a T. harzianum CEC-T24 que en FES donde el microorganismo
crece tanto en superficie como en el interior del sustrato, además en FS
la toma de nutrientes también está favorecida al encontrarse una parte
importante de estos disueltos en el medio de cultivo.
En el caso de F-Q/G+A es decir cuando el mismo cultivo se lleva a

cabo con aireación la producción de quitinasas es un 8,89% mayor en
FES que en FS.
P á g i n a | 136
Tabla-R.8. Producción total de quitinasas obtenidas en FS y FES tras 6

Tipo de Volumen
MC SF UI/L/Día Día UI %
Extracción (L)
F-Q/G-A FS Sobrenadante 0,145 241,10 6 209,8 100

Extracción 1 0,068 256,17 6 104,5
F-Q/G-A FES Extracción 2 0,047 178,50 6 50,3
Total Extracción 154,9 73,83

F-Q/G+A FS Sobrenadante 0,144 256,17 6 221,3 100
Extracción 1 0,067 421,92 6 169,6
F-Q/G+A FES Extracción 2 0,048 247,90 6 71,4

HTCH-A FS Sobrenadante 0,15 331,51 6 298,4 100
Extracción 1 0,068 527,40 6 215,2
HTCH-A FES Lavado 1 0,051 470,75 6 144,0

HTCH+A FS Sobrenadante 0,15 376,72 6 339,0 100
Extracción 1 0,069 873,98 6 361,8
HTCH+A FES Lavado 1 0,05 794,23 6 238,3

HC-A FS Sobrenadante 0,15 60,27 6 54,2 100
Extracción 1 0,068 150,69 6 61,5
HC-A FES Lavado 1 0,049 57,54 6 16,9

HC+A FS Sobrenadante 0,15 75,34 6 67,8 100
Extracción 1 0,067 180,82 6 72,7
HC+A FES Lavado 1 0,047 105,20 6 29,7
MC: Medio de cultivo; SC: Sistema de cultivo; %: Porcentaje. Los resultados son valores medios
± SD de tres experimentos.
P á g i n a | 137
Sin embargo, en los medios formulados con HTCH, tanto en los

cultivos sin aireación como en los cultivos con aireación la producción de
quitinasa mediante FES es significativamente mayor que en FS: 359,2 y
298,4 UI respectivamente para los cultivos en un medio formulado con
HTCH-A y 600,1 y 339 UI, respectivamente, para los cultivos en un
medio formulado con HTCH+A, es decir, en este caso se obtiene un
20,40% más en las FES sin aireación y un 76,99% más en el caso de la
FES con aireación.
Resultados análogos se obtuvieron para los cultivos en medios

formulados con HC, si bien los valores de producción de quitinasas son
significativamente menores que los obtenidos en los cultivos formulados
con HTCH (ver Figura-R.6). Probablemente, esto sea debido a que
cuando T. harzianum CEC-T24 crece en un medio formulado con HTCH
o F-Q/G la utilización de la fuente carbonada es más eficiente, ya que la
quitina de la HTCH y F-Q/G presenta una estructura mucho menos
cristalina y con más zonas amorfas fácilmente atacable por las
quitinasas producidas por T. harzianum CEC-T24 en el medio de cultivo,
que la quitina presente en la HC.
El análisis conjunto de estos resultados se muestra de manera

resumida en la siguiente Figura-R7.
P á g i n a | 138
Figura R.7. Producción de quitinasa en diferentes medios formulados

con sustratos ricos en quitina (F-G/Q, HTCH y HC) mediante FS y FES
con y sin aireación. [A) Análisis porcentual. B) Análisis por producción
total (UI)].
P á g i n a | 139
A partir de estos resultados, como puede verse de los datos

expuestos en la Tabla-R.8 y resumidos en la Figura-R.7, se puede
concluir que el mejor medio de fermentación para la producción
industrial de quitinasas por T. harzianum CEC-T24 es el formulado con
HTCH+A cultivado en FES. Estos resultados también ponen de
manifiesto que la mayor producción de quitinasa, en cantidad, tiene
lugar en los medios formulados con HTCH, seguido de los medios
formulados con F-Q/G, que deriva de la HTCH, y donde la producción es
más baja es en los medios formulados con HC. Una posible explicación
a este hecho es, que como ya hemos indicado anteriormente, que la
quitina de la HC, al no estar probablemente completamente
desmineralizada y a que presenta una estructura más cristalina, sea
más difícil de atacar por las quitinasas secretadas al medio por T.
harzianum CEC-T24, y por tanto se liberen menos moléculas de
azúcares fermentables (N-acetil-glucosamina y/o glucosamina),
utilizables como fuente de C por el microorganismo. Además, tanto en la
HTCH como en la F-Q/G al poseer estas fuentes glucanos y T.
harzianum CEC-T24 además de secretar quitinasas al medio secreta
también glucanasas, como más adelante discutiremos, la liberación de
azucares utilizables como fuente de C, en estos medios, es bastante
mayor y por tanto el crecimiento y la producción, ya que ambos
fenómenos van parejos, al menos durante la fase de crecimiento
exponencial.
P á g i n a | 140
4.3 Aproximación al secretoma de T. harzianum CEC-T24

crecido en medios ricos en quitina
Una vez establecida la FES con aireación como mejor sistema para la
producción de quitinasas por T. harzianum CEC-T24 en un medio
formulado con un sustrato rico en quitina, la HTCH, el paso siguiente fue
estudiar el patrón de proteínas secretadas al medio por dicho
microorganismo, es decir, aproximarnos al secretoma de T. harzianum
CEC-T24 en dicho medio. Para lo que en una primera aproximación se
realizó un estudio cromatográfico y otro electroforético en geles de
PAGE-SDS, con el fin de obtener información sobre el perfil proteico del
caldo de fermentación libre de células.
4.3.1 Análisis cromatográfico
Para indagar si T. harzianum CEC-T24 consumia eficientemente las

proteínas del medio, se realizó un estudio cromatográfico, mediante
cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel, del caldo
fermentación inicial (0 días) y tras 6 días de cultivo (Figura-R.8).
P á g i n a | 141
Figura R.8. Perfil proteico del caldo de cultivo antes de inocular

(línea azul O días) y del caldo de cultivo tras 6 días de crecimiento de T.
harzianum CEC-T24 en FES (línea verde).
El análisis de las proteínas por cromatografía de exclusión o filtración

en gel pone claramente de manifiesto que las proteínas
P á g i n a | 142
correspondientes a la HTCH se han consumido durante el crecimiento

de T. harzianum CEC-T24 cuando se crece en FES, ya que el perfil
proteico del caldo de cultivo a los 6 días de crecimiento es totalmente
diferente al de la HTCH (ver Figura-R.8). Lo que nos indica que el
microorganismo está utilizando esta fuente de N para su metabolismo.
4.3.2. Análisis electroforético
El estudio de los caldos de fermentación libres de células, con el fin

de estudiar el tipo de proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24 al
medio, se ha llevado a cabo por PAGE-SDS. En la Figura-R.9 se
muestra un gel correspondiente al análisis electroforético realizado
mediante PAGE-SDS, donde se observan las proteínas secretadas por
T. harzianum CEC-T24 en el medio de cultivo rico en quitina (HTCH),
tras seis días de cultivo.
Como se observa en dicha figura, en el gel teñido con azul de

Coomassie, se distinguen claramente un importante número de bandas
(más de 25 bandas), mientras que en el gel teñido con plata se detectan
un número de bandas mayor, lo que no es de sorprender ya que la
tinción de plata es unas 10 veces más sensible que la de azul de
Coomassie. Cuando estos geles se tiñen por actividad (zimograma) se
detectan cinco bandas, con masa molecular 82, 65, 48, 31 y 25 kDa, con
actividad quitinasa, lo que podrían corresponder a quitinasas secretadas
por T. harzianum CEC-T24 al medio.
P á g i n a | 143
Figura R.9. Separación electroforética por PAGE-SDS de proteínas

secretadas por T. harzianum CEC-T24 crecido en un medio de cultivo
formulado HTCH. [a: marcadores; b: tinción con azul de Coomassie; c:
tinción de plata y d: tinción de la actividad (zimograma)]. Marcadores de
peso molecular: miosina 201 kDa, β galactosidasa 114 kDa, Albúmina de
suero bovino 74 kDa, ovoalbúmina 48 kDa, Anhidrasa carbónica 34 kDa,
inhibidor de la tripsina de soja 27 kDa, lisozima 17 kDa, Aprotinina 6
kDa.
Sin embargo, esto no quiere decir que este sea el número total de
enzimas y/o proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24, ya que en
el medio de cultivo además de las proteínas y enzimas secretadas por el
P á g i n a | 144
microorganismo también están presente las proteínas del medio de

cultivo no digeridas por el microorganismo durante su crecimiento.
Además, en una banda de una electroforesis PAGE-SDS no hay una
única proteína sino que puede haber varias, pudiendo en algunos casos
haber más de 100 proteínas o péptidos diferentes de pesos moleculares
muy próximos [Fröhlich y Arnold, 2006]. Por otro lado la tinción con
azul de Coomassie únicamente detecta proteínas en el gel si estas
están en cantidades del orden del microgramo y la tinción con plata,
unas 10 veces más sensible que la tinción de azul de Coomassie,
únicamente detecta proteínas en el gel si estas están en cantidades del
orden de 0,1 µg. Por lo que proteínas presentes en cantidades más
bajas no son detectadas en el gel por estas tinciones. Para detectar
estas proteínas y/o enzimas presentes a concentraciones muy bajas es
necesario utilizar técnicas más sensibles, sobre todo aquellas basadas
en la espectrometría de masas. Por ello, basándonos en la
disponibilidad de técnicas proteómicas altamente sensibles, una vez
separadas las proteínas por electroforesis en PAGE-SDS, se llevó a
cabo un análisis proteómico de dichos geles tras su digestión triptica in
gel, como más adelante discutiremos.
4.3.3. Análisis proteómico
Separadas las proteínas, secretadas por T. harzianum CEC-T24 al

medio, por PAGE-SDS, los carriles se cortaron longitudinalmente y
seguidamente cada carril se fraccionó en tres partes, sometiendo cada
una de las facciones a una digestión in gel con tripsina [Shevchenko y
P á g i n a | 145
col., 2006], tal y como se describe detalladamente en el correspondiente

apartado de Materiales y Métodos. Las muestras digeridas, una vez
eliminadas las sales y componentes no deseables, se sometieron a un
análisis proteómico mediante la técnica de nLC-MS/MS; análisis llevado
a cabo en el Gene Center, de la Universidad Ludwig Maximilian
Universität, de Munich (Alemania), y en la Unidad de Proteómica de la
Universidad de Córdoba; si bien los resultados han sido analizados e
interpretados por nosotros. De esta manera se han identificado 183
proteínas específicas de T. harzianum CEC-T24 cuando se crece en un
medio formulado con HTCH, 161 proteínas cuando se crece en un
medio formulado con F-Q/G y 91 proteínas cuando el cultivo se lleva a
cabo en un medio formulado con HC o quitina coloidal de crustáceo
[Urbina-Salazar y col., 2018] (ver Tabla-R.10,-R.11 y –R.12).
Figura R.10. Número de proteínas (totales y específicas de T.

harzianum CEC-T24) detectadas por n-LC-MS/MS en el secretoma de T.
harzianum CEC-T24 crecido en medios formulados con HTCH, F-Q/G y
HC.
P á g i n a | 146
Esta diferencia en el número de proteínas podría deberse, a como ya

hemos mencionado más arriba, a la presencia de glucanos en los
medios formulados con HTCH y F-Q/G, que podrían inducir la
producción de glucanasas en estos medios, mientras que en los medios
formulados con HC o quitina coloidal de crustáceos los glucanos están
ausentes. Y efectivamente el número de glucanasas detectadas en los
medios formulados con HTCH y F-Q/G es mayor que el encontrado en
los medios formulados con HC o quitina coloidal de crustáceos (ver
Tabla-R.10,-R.11 y –R.12 y Figura-R.11).
Figura R.11. Número de proteínas específicas de T. harzianum CEC-

T24 detectadas por n-LC-MS/MS en el secretoma de T. harzianum CEC-
T24 crecido en medios formulados con HTCH, F-Q/G y HC.
P á g i n a | 147
Como se observa en la figura-R.11 existe un 43,89% de similitud

entre las proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24 en los medios
HTCH Y F-Q/G, y un porcentaje mas bajo (31,38%) cuando se compara
las proteínas secretadas en HTCH y HC. De igual forma al comparar las
proteínas en F-Q/G y HC se obtiene un 30,95%. Es decir como se
observa el número de proteínas obtenidas en los medios HTCH y F-Q/G
es mayor que en HC, debido a que estas tienen en común la presencia
de glucanos lo que induce a la mayor producción de glucohidrolasas
secretadas al medio. Mientras que al comparar entre los tre medios de
fementación (HTCH, F-Q/G y HC) el porcentaje de similitud es mínima
(17,01%).
En el análisis por nLC-MS/MS de las proteínas secretadas en el

medio formulado con HTCH se identificaron un total 423 proteínas en el
sobrenadante, 183 proteínas específicas de Trichoderma (Tabla-R.10 y
Figura-R.12) y el resto (240 proteínas) correspondientes a fragmentos
proteolíticos de las proteínas específicas, probablemente generadas por
la secreción de proteasas y peptidasas en el medio de cultivo, así como
a proteínas propias del medio de cultivo y contaminaciones
medioambientales (fundamentalmente queratinas). Dentro de las 183
proteínas específicas de Trichoderma (secretoma) se identificaron 103
proteínas (56,3% del total de proteínas detectadas) con señales de
secreción dependientes de Sec N-terminal. Las restantes 80 proteínas,
correspondiente al 43,7% de las proteínas secretadas, carecían de
señales de secreción que indican una posible lisis celular, muerte celular
o mecanismos secretores no clásicos.
P á g i n a | 148
Figura R.12. Número de proteínas secretadas en el medio formulado

con HTCH.
Tabla R.9. Número de Proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24

con actividad hidrolítica.
Actividad hidrolítica HTCH F-Q/G HC

Total proteínas secretadas 183 161 91
Glicohidrolasas 107 98 54
Lipasas 6 3 2
Proteasas/Peptidasas 13 7 4
Número de proteínas con
126 108 60
actividad hidrolítica
% Proteínas de proteínas
68,8 67,08 65,93
con actividad hidrolítica
Número de Glicohidrolasas 107 98 54
% Glicohidrolasas 84,92 90,74 90
Las proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24 en HTCH se

agruparon de acuerdo con su función biológica (Fig-R.13), se
identificaron 126 proteínas (68,8% de las proteínas secretadas totales)
con actividad hidrolítica, el 84,9% de ellas con actividad glucolítica
P á g i n a | 149
(celulasa, hemicelulasa, glucanasa, quitinasa, pectinasas y enzimas

degradadas del almidón) relevantes para la degradación de celulosa,
hemicelulosa, glucano y quitina.

con HTCH clasificadas según su función biológica.
El estudio de las proteínas secretadas en el medio formulado con F-

Q/G permite la identificación de un total 357 proteínas en el
sobrenadante, 161 proteínas específicas de Trichoderma (Tabla-R.11 y
Figura-R.14) y el resto (196 proteínas) correspondientes a fragmentos
proteolíticos de las proteínas específicas, probablemente generadas por
la secreción de proteasas y peptidasas en el medio de cultivo, así como
a proteínas propias del medio de cultivo y contaminaciones
medioambientales (fundamentalmente queratinas). Dentro del
secretoma, específico de T. harzianum CEC-T24, se identificaron 85
proteínas (52.8% del total de proteínas detectadas) con señales de
secreción dependientes de Sec N-terminal, correspondientes a T.
P á g i n a | 150
harzianum CEC-T24. El 47,2% de las proteínas secretadas (76

proteínas) carecían de señales de secreción que indican una posible
lisis celular, muerte celular o mecanismos secretores no clásicos.

con F-Q/G.
Las proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24 en F-Q/G se

identificaron 108 proteínas (67.08% de las proteínas secretadas totales)
con actividad hidrolítica, el 90,74% de ellas con actividad glucolítica
P á g i n a | 151

con F-Q/G clasificadas según su función biológica.
Cuando se estudiaron las proteínas secretadas por T. harzianum

CEC-T24 crecido en un medio formulado con HC se identificación un
total 188 proteínas en el sobrenadante, de las que 91 proteínas eran
específicas de Trichoderma (Tabla-R.12 y Figura-R.16) y el resto (97
proteínas) correspondian a fragmentos proteolíticos de las proteínas
específicas, probablemente generadas por la secreción de proteasas y
peptidasas al medio de cultivo, así como a proteínas propias del medio
de cultivo y contaminaciones medioambientales (fundamentalmente
queratinas). Dentro del secretoma, específico de T. harzianum CEC-
T24, se identificaron 53 proteínas (58.2% del total de proteínas
detectadas) con señales de secreción dependientes de Sec N-terminal,
correspondientes a T. harzianum CEC-T24. El 41,8% de las proteínas
secretadas (38 proteínas) carecían de señales de secreción que indican
una posible lisis celular, muerte celular o mecanismos secretores no
clásicos.
P á g i n a | 152

con HC.
Las proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24 en HC se

identificaron 60 proteínas (65,93% de las proteínas secretadas totales)
con actividad hidrolítica, el 90% de ellas con actividad glucolítica
P á g i n a | 153

con HC clasificadas según su función biológica.
P á g i n a | 154
Tabla R.10. Proteínas específicas secretadas por T. harzianum CEC-T24 crecido en FES en un medio
formulado con HTCH.
gi number Protein name Family

G9MLT2 Cutinase; Carbohydrate Esterase Family 5 protein Carbohydrate Esterase
G9MW33 Esterase; Carbohydrate Esterase Family 16 protein Carbohydrate Esterase
G9MJQ6 Esterase; Carbohydrate Esterase Family 4 protein Carbohydrate Esterase
G9N0G0 Esterase; Carbohydrate Esterase Family 1 protein Carbohydrate Esterase
G9N3Y9 Acetyl xylan esterase; Carbohydrate Esterase Family 5 protein Carbohydrate Esterase
G9MMP9 Pectinesterase; Carbohydrate Esterase Family 8 protein Carbohydrate Esterase
G9MYG2 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 16 protein Glycoside Hydrolase
G9MIE9 β-1,3-glucanase;Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9N962 NAG1; Glycoside Hydrolase Family 20 protein Glycoside Hydrolase
G9NAU7 candidate β-1,3-glucanosyltransferase; Glycoside Hydrolase Family 72 protein Glycoside Hydrolase
G9N4L5 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 24 protein Glycoside Hydrolase
G9MUY4 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9N118 β-1,6-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 30 protein Glycoside Hydrolase
G9N451 endo -1,4-β-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MM35 chitinase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9NCT3 β-1,3-glucanosyltransferase; Glycoside Hydrolase Family 72 protein Glycoside Hydrolase
G9MZE3 endo-1,3- β-glucanase ; Glycoside Hydrolase Family 81 protein Glycoside Hydrolase
G9NBU7 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 75 protein Glycoside Hydrolase
G9MRV6 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 17 protein Glycoside Hydrolase
G9MWQ7 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MFN2 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MSH8 β-glucosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9N8J2 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 75 protein Glycoside Hydrolase
G9MF62 endo-1,3(4)- β-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 16 protein Glycoside Hydrolase
G9MGP3 chitinase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MQD4 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 25 protein Glycoside Hydrolase
G9MVG5 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9ML80 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 16 protein Glycoside Hydrolase
G9NCD8 β-1,3-exoglucanase; Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9MRP4 α-amylase; Glycoside Hydrolase Family 13 protein Glycoside Hydrolase
G9MM76 glucoamylase; Glycoside Hydrolase Family 15 protein Glycoside Hydrolase
G9N4F2 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MQS0 α-glucosidase; Glycoside Hydrolase Family 31 protein Glycoside Hydrolase
G9N4W6 α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 28 protein Glycoside Hydrolase
G9MWB3 candidate chitinase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9N0T9 CHT1.1; candidate chitinase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
NAG2; candidate N-acetylglucosaminidase; Glycoside Hydrolase Family 20
G9MXZ5 Glycoside Hydrolase
protein
G9MR60 α-1,3-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 71 protein Glycoside Hydrolase
G9N5J3 α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 92 protein Glycoside Hydrolase
G9MZY7 candidate chitinase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9N8G8 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 17 protein Glycoside Hydrolase
G9NCJ4 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 16 protein Glycoside Hydrolase
G9MXF0 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MZT6 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 12 protein Glycoside Hydrolase
G9MFK5 α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 27 protein Glycoside Hydrolase
G9MYA5 β-glucosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein (not annotated by verena) Glycoside Hydrolase
G9N0U8 β-1,3-exoglucanase; Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9MLE1 α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 92 protein Glycoside Hydrolase
G9MXG9 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 64 protein Glycoside Hydrolase
G9MQ83 candidate α-1,3-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 71 protein Glycoside Hydrolase
G9MNF6 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 92 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ53 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 92 protein Glycoside Hydrolase
G9N0W8 candidate β-1,3-glucanosyltransferase; Glycoside Hydrolase Family 72 protein Glycoside Hydrolase
G9MS92 candidate α-galactosidase; Glycoside Hydrolase Family 27 protein Glycoside Hydrolase
G9MX26 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 39 protein Glycoside Hydrolase
G9MWV6 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 71 protein Glycoside Hydrolase
G9N4X2 candidate β-1,6-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MVK7 candidate α-1,2-mannosidase; Glycoside Hydrolase Family 47 protein Glycoside Hydrolase
G9N047 candidate β-1,6-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 30 protein Glycoside Hydrolase
G9MRB7 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 2 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ65 α-L-arabinofuranosidase B; Glycoside Hydrolase Family 54 protein Glycoside Hydrolase
G9N1C8 β-1,3-glucanosyltransferase; Glycoside Hydrolase Family 72 protein Glycoside Hydrolase
G9MK64 candidate β-mannosidase; Glycoside Hydrolase Family 2 protein Glycoside Hydrolase
G9MZV2 exo- β-D-glucosaminidase ; Glycoside Hydrolase Family 2 protein Glycoside Hydrolase
G9MY26 candidate cellobiohydrolase; Glycoside Hydrolase Family 7 protein Glycoside Hydrolase
G9MV70 candidate glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 93 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ09 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 17 protein Glycoside Hydrolase
G9MSS0 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 76 protein Glycoside Hydrolase
G9N9E3 candidate β-glucosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9MS91 candidate β-mannosidase; Glycoside Hydrolase Family 2 protein Glycoside Hydrolase
G9MHW8 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 16 protein Glycoside Hydrolase
G9ML76 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 92 protein Glycoside Hydrolase
G9MLE5 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 79 protein Glycoside Hydrolase
G9MMQ0 candidate β-mannanase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9N9X8 candidate xylanase; Glycoside Hydrolase Family 11 protein Glycoside Hydrolase
G9N8R7 CHT1.2; candidate chitinase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MJ83 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 76 protein Glycoside Hydrolase
G9N171 candidate b-1,3-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9MJY8 xylanase; Glycoside Hydrolase Family 11 protein Glycoside Hydrolase
G9N168;REV__G9
β-mannosidase; Glycoside Hydrolase Family 2 protein Glycoside Hydrolase
MGP3
G9MVW6 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 95 protein Glycoside Hydrolase
G9MFS8 candidate endo-1,4-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
candidate endo- β-1,6-galactanase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein; C-type
G9MWQ6 Glycoside Hydrolase
lectin
G9MUM1;G9NCA9 candidate β-glucosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9MUN0 cellobiohydrolase; Glycoside Hydrolase Family 6 protein Glycoside Hydrolase
G9N626 α-galactosidase; Glycoside Hydrolase Family 27 protein Glycoside Hydrolase
G9MGZ6 candidate β-glucosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9N7Q9 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9N4S9 xyloglucanase; Glycoside Hydrolase Family 74 protein Glycoside Hydrolase
G9NBD2 xylanase; Glycoside Hydrolase Family 10 protein Glycoside Hydrolase
G9MQX4 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9MV09 α-L-arabinofuranosidase; Glycoside Hydrolase Family 54 protein Glycoside Hydrolase
G9MSH9 β-xylosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9MUP6 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ60 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9MK43 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MU59 TVC6; candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
candidate β-galactosidase/ galacto- β-D-galactanase; Glycoside Hydrolase
G9N7I4 Glycoside Hydrolase
Family 35 protein
G9N4X9 candidate endo-1,4-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9N2S7 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9MY65 α-L-arabinofuranosidase; Glycoside Hydrolase Family 62 protein Glycoside Hydrolase
G9MT58 candidate endoglucanase; Glycoside Hydrolase Family 12 protein Glycoside Hydrolase
G9MX23 polygalacturonase; Glycoside Hydrolase Family 28 protein Glycoside Hydrolase
G9MV41 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 27 protein Glycoside Hydrolase
G9MM38 Glycosyl hydrolase catalytic core; This family is probably a glycosyl hydrolase Glycoside Hydrolase
G9MWB0 Glycosyl hydrolase catalytic core Glycoside Hydrolase
G9N8M5 Glycoside Hydrolase superfamily Glycoside Hydrolase
G9MY63 candidate α-1,3-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 71 protein Glycoside Hydrolase
G9MF19 Glycosyl hydrolase catalytic core Glycoside Hydrolase
G9NB68 Concanavalin A-like lectin/glucanases superfamily Glycoside Hydrolase
G9MQD2 336aa; 11cys; hypothetical hypothetical
G9MPV7 982aa; hypothetical hypothetical
G9MSJ3 314aa; 3cys; hypothetical hypothetical
G9MEP9 392aa; hypothetical hypothetical
G9N2F3 782aa; hypothetical hypothetical
G9MMP1 548aa; contains WSC domain; hypothetical hypothetical
G9MQ14 409aa hypothetical hypothetical
G9MTV2 YciI-like protein; Dimeric alpha+beta barrel superfamily hypothetical
G9MKR4 236aa hypothetical hypothetical
G9MKY0 719aa; hypothetical hypothetical
G9N3V6 226aa; no cys; hypothetical hypothetical
G9N1K1 207aa; 2cys; hypothetical hypothetical
G9MSU0 277aa hypothetical hypothetical
G9N0W0 292aa; hypothetical hypothetical
G9MFM3 227aa; 2cys; Family 9 carbohydrate-binding modules (CBM9) hypothetical
G9NA60 298aa hypothetical hypothetical
G9MWA9 Hypothetical hypothetical
G9N553 474aa ; hypothetical hypothetical
G9MI01 164aa; 6cys hypothetical
G9MU60 Secretory Lipase Lipase
G9N0P8 Patatin-like phospholipase Lipase
G9MFB0 Putative phospholipase C; putative phospholipase C Lipase
G9MUE2 putative Glycosylphosphatidylinositol-specific phospholipase C Lipase
G9MGZ5 Predicted lipase Lipase
G9MNR4 Lipase; Alpha/beta hydrolase Lipase
G9N475 Manganese and iron superoxide dismutase Oxidoreductase
G9MLB5 Soluble quinoprotein glucose dehydrogenase Oxidoreductase
G9N7N4 Superoxide dismutase, copper/zinc binding Oxidoreductase
G9N3Y5 Haem peroxidase Oxidoreductase
G9MV18 Glucose-methanol-choline oxidoreductase Oxidoreductase
G9NDF2 Putative Glyoxal oxidase Oxidoreductase
G9MK38 FAD dependent oxidoreductase Oxidoreductase
G9MKH2 Pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase Other
G9MNX1 Arylsulphatase Other
G9NA55 S-adenosylmethionine synthetase Other
CHAP domain containing protein; This domain corresponds to an amidase
G9MHR1 Other
function.
G9MTV5 Pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase, class-II; Aromatic-ring hydroxylase Other
G9MNB2 putative endoribonuclease L-PSP Other
G9N074 Protein-arginine deiminase (PAD) Other
G9MMH1 FAD-binding-4 domain Other
G9N5H1 Ribonuclease Other
G9N2U2 laccase Other
G9N456 FAD-binding-4 domain; Berberine/berberine-like Other
G9N2D8 Ribonuclease T2 Other
G9N875 S-adenosylhomocysteine hydrolase Other
G9MEP1 Amidase Other
G9MFQ7 Cuperdoxin Other
G9N380 Metallophosphoesterase Other
G9N609 Tyrosinase Other
G9MJN2 Putative glutaminase Other
G9N109 Gamma-glutamyltransferase Other
G9NAA9 Phosphesterase Other
G9MG46 contains sugar transporter domain; alpha/beta-Hydrolases superfamily Other
G9N561 Carboxylesterase Other
G9N7D3 acid phosphatase Other
G9NBG3 flavin containing polyamine oxidase, putative Other
G9N7T0 Metallophosphoesterase Other
G9MFM5 Peptidase S28 proteolysis and peptidolysis
G9MRS1 Peptidase S8 and S53, subtilisin, kexin, sedolisin proteolysis and peptidolysis
G9MEQ7 Peptidase T2, asparaginase 2 proteolysis and peptidolysis
G9MES4 Peptidase M, neutral zinc metallopeptidases, zinc-binding site proteolysis and peptidolysis
G9MNF3 Peptidase M14, carboxypeptidase A proteolysis and peptidolysis
G9MWZ0 Peptidase aspartic, active site; Peptidase A1, pepsin proteolysis and peptidolysis
G9MY25 Peptidase G1, eqolisin proteolysis and peptidolysis
G9NBQ3 Peptidaze M20 proteolysis and peptidolysis
G9NBT0 Peptidase S53, propeptide proteolysis and peptidolysis
G9MX31 Peptidase S8 and S53, subtilisin, kexin, sedolisin proteolysis and peptidolysis
G9ML58 Peptidase G1, eqolisin proteolysis and peptidolysis
G9MS88 Peptidase aspartic proteolysis and peptidolysis
G9NBG4 Peptidase S28 proteolysis and peptidolysis
formulado con F-Q/G.

G9MLT2 Cutinase; Carbohydrate Esterase Family 5 protein Carbohydrate Esterase
G9MW33 Esterase; Carbohydrate Esterase Family 16 protein Carbohydrate Esterase
G9MIE9 β-1,3-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9N962 Glycoside Hydrolase
protein
G9N4L5 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 24 protein Glycoside Hydrolase
G9N451 endo-1,4- β-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MM35 chitinase; CHT2; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9NBU7 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 75 protein Glycoside Hydrolase
G9MWQ7 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MGP3 chitinase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MRP4 α-amylase; Glycoside Hydrolase Family 13 protein Glycoside Hydrolase
G9N0T9 CHT1.1; candidate chitinase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MXZ5 NAG2; Glycoside Hydrolase Family 20 protein Glycoside Hydrolase
G9N5J3 α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 92 protein Glycoside Hydrolase
G9MZY7 candidate chitinase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MXF0 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MQ83 candidate a-1,3-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 71 protein Glycoside Hydrolase
G9MNF6 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 92 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ53 candidate α-glycosidase ; Glycoside Hydrolase Family 92 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ65 Alpha-L-arabinofuranosidase B; Glycoside Hydrolase Family 54 protein Glycoside Hydrolase
G9MV70 candidate glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 93 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ09 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 17 protein Glycoside Hydrolase
G9MSS0 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 76 protein Glycoside Hydrolase
G9N9E3 candidate β-glucosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9MS91 candidate β-mannosidase; Glycoside Hydrolase Family 2 protein Glycoside Hydrolase
G9MHW8 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 16 protein Glycoside Hydrolase
lectin
G9N4S9 xyloglucanase; Glycoside Hydrolase Family 74 protein Glycoside Hydrolase
G9NBD2 xylanase; Glycoside Hydrolase Family 10 protein Glycoside Hydrolase
G9MQX4 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9MSH9 β-xylosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9MUP6 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ60 β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9MK43 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MU59 TVC6; candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
candidate β-galactosidase/ galacto- β-D-galactanase; Glycoside Hydrolase
G9N7I4 Glycoside Hydrolase
Family 35 protein
G9N4X9 candidate endo-1,4-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9N2S7 candidate β-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 55 protein Glycoside Hydrolase
G9MY65 α-L-arabinofuranosidase; Glycoside Hydrolase Family 62 protein Glycoside Hydrolase
G9MT58 candidate endoglucanase; Glycoside Hydrolase Family 12 protein Glycoside Hydrolase
G9MX23 polygalacturonase; Glycoside Hydrolase Family 28 protein Glycoside Hydrolase
G9MV41 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 27 protein Glycoside Hydrolase
G9MM38 Glycosyl hydrolase catalytic core; This family is probably a glycosyl hydrolase Glycoside Hydrolase
G9MWB0 Glycosyl hydrolase catalytic core Glycoside Hydrolase
G9N8M5 Glycoside Hydrolase superfamily Glycoside Hydrolase
G9MY63 candidate α-1,3-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 71 protein Glycoside Hydrolase
G9MF19 Glycosyl hydrolase catalytic core Glycoside Hydrolase
G9NB68 Concanavalin A-like lectin/glucanases superfamily Glycoside Hydrolase
G9MGP3 β-mannosidase; Glycoside Hydrolase Family 2 protein Glycoside Hydrolase
G9NCA9 candidate b-glucosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9MQD2 336aa; 11cys; hypothetical hypothetical
G9MPV7 982aa; hypothetical hypothetical
G9MEP9 392aa; hypothetical hypothetical
G9N2F3 782aa; hypothetical hypothetical
G9MKR4 236aa hypothetical hypothetical
G9N553 474aa ; hypothetical hypothetical
G9MUE2 putative Glycosylphosphatidylinositol-specific phospholipase C Lipase
G9MLB5 Soluble quinoprotein glucose dehydrogenase Oxidoreductase
G9MK38 FAD dependent oxidoreductase Oxidoreductase
CHAP domain containing protein; This domain corresponds to an amidase
G9MHR1 Other
function.
G9MTV5 Pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase, class-II; Aromatic-ring hydroxylase Other
G9N2U2 Laccase Other
G9N2D8 Ribonuclease T2 Other
G9MG46 contains sugar transporter domain; alpha/beta-Hydrolases superfamily Other
G9N561 Carboxylesterase Other
G9NBG3 flavin containing polyamine oxidase, putative Other
G9N7T0 Metallophosphoesterase Other
G9MJC2 putative phosphoglycerate mutase family protein Other
G9MKI6 Putative isomerase YbhE Other
G9MUI5 candidate polysaccharide lyase; Polysaccharide Lyase Family 7 protein Other
G9N4F0 S1/R1 nuclease Other
G9MEQ7 Peptidase T2, asparaginase 2 proteolysis and peptidolysis
G9MWZ0 Peptidase aspartic, active site; Peptidase A1, pepsin proteolysis and peptidolysis
G9N3S5 Peptidase aspartic proteolysis and peptidolysis
G9MUE5 Peptidase aspartic, active site; Peptidase A1, pepsin proteolysis and peptidolysis
formulado con HC.

G9N962 Glycoside Hydrolase
protein
G9N451 endo-1,4- β-glucanase; Glycoside Hydrolase Family 5 protein Glycoside Hydrolase
G9MM35 chitinase; CHT2; Glycoside Hydrolase Family 18 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ53 candidate α-glycosidase; Glycoside Hydrolase Family 92 protein Glycoside Hydrolase
G9MZ65 α-L-arabinofuranosidase B; Glycoside Hydrolase Family 54 protein Glycoside Hydrolase
lectin
G9MGP3 β-mannosidase; Glycoside Hydrolase Family 2 protein Glycoside Hydrolase
G9NCA9 candidate β-glucosidase; Glycoside Hydrolase Family 3 protein Glycoside Hydrolase
G9N2U2 Laccase Other
G9MPP2 Alkaline ceramidase Other
G9MJC2 putative phosphoglycerate mutase family protein Other
G9N3S5 Peptidase aspartic proteolysis and peptidolysis
Los resultados anteriores nos dan una idea del amplio panel de
enzimas/proteínas que T. harzianum CEC- T24 secreta al medio de
cultivo, y que el grupo de las hidrolasas es el mayoritario, por ello,
además de la actividad quitinasa, se han medido también otras
actividades de interés industrial.
4.4 Producción de hidrolasas
Como ya se analizó anteriomente la producción de quitinasa entre FS

y FES, lo mismo ocurre para la producción de las otras enzimas, la
producción de estas otras enzimas también se ve influenciada por el tipo
de fermentación y el otro factor que es la aireación.
En la Tabla-R.13 se muestra los resultados de los análisis

enzimáticos ensayados con los diferentes medios de fermentación.
La propiedad hidrolítica de las quitinasas la convierte en una

alternativa atractiva como agente de control biológico seguro para el
medio ambiente. Existe una variedad de casos en los que se utilizan
organismos productores de quitinasa para inhibir el crecimiento de
fitopatógenos [Harman y col., 1993; Lorito y col., 1994].
Además, la capacidad de la quitinasa para hidrolizar la quitina la hace

muy útil para la producción de productos de valor agregado como
edulcorantes, factores de crecimiento, proteínas de una sola célula, etc.
[Cosio y col., 1982; Sakai y col., 1991].
P á g i n a | 174
Tabla R.13. Ensayo de actividades enzimáticas
QUITINASA CELULASA XILANASA PROTEASA
mg GlcNAc/mL UI/L mg Glucosa/mL UI/L mg Xilosa/mL UI/L muAbs UI/L
FS/HTCH+A 15 2260,30 3,24 149,88 5,78 7693,33 90,50 36,20
FS/HTCH-A 13,2 1989,06 2,7 124,90 5,60 7460,20 82,00 32,80
FES/HTCH+A 34,8 5243,89 14,22 657,79 11,03 14687,27 352,50 141,00
FES/HTCH-A 21 3164,41 8,04 371,91 8,23 10957,17 245,00 98,00

RESULTADOS Y RESULTADOS
Y DISCUSIONES
Figura R.18. Actividad quitinasa producida en el medio HTCH

utilizando FS y FES.
(P-valor, *= P<0,05,** = P<0,01 y *** = P<0,001).
Como se observa en la Figura-R.18 la producción de quitinasas es

mucho mayor en el medio HTCH+A utilizando la FES que en los otros
medios de fermentación como ya se ha mencionado anteriormente.
Como se puede observar la producción de celulasas (Figura-R.19)

FES/HTCH+A es mucho mayor (657,79 UI/L) que en los otros medios de
cultivo, el máximo de producción de esta enzima es al sexto dia de
fermentación, siendo estas enzimas de gran interés en la biorrefinería
para producir biocombustibles y productos con un alto valor agregado.
P á g i n a | 176
Figura R.19. Actividad celulasa producida en el medio HTCH utilizando

FS y FES.
(P-valor, *= P<0,05,** = P<0,01 y *** = P<0,001).
Las xilanasas catalizan la ruptura de los enlaces xilosídicos internos

de la molécula heteroxilana (xilano), un tipo de componente polisacárido
de la hemicelulosa, un componente importante de la biomasa de la
pared celular en los vegetales [Fang y col., 2012, Anthony y col.,
2003]. Las enzimas que degradan el heteroxylane son las endoxilanasas
(EC 3.2.1.8), que rompen el esqueleto del xilano en oligosacáridos
pequeños y las β-xilosidasas (EC 3.2.1.37), qe a su vez las degradan a
moléculas de xilosa [De Vries y Visser, 2001]. Las xilanasas se utilizan
principalmente en procesos de clarificación de vinos, zumos y pulpas, y
en procesos de biodegradación de papel [Krishna, 2005; Zhaoxin y
col., 2008]. La producción máxima obtenida de esta enzima es de
P á g i n a | 177
Y DISCUSIONES
14687,27 UI/L en el medio FES/HTCH+A (Ver Figura-R.20).
Figura R.20. Actividad xilanasa producida en el medio HTCH

(P-valor, *= P<0,05,** = P<0,01 y *** = P<0,001).
Las proteasas (EC 3.4.21-24 y 99) son enzimas hidrolíticas

industrialmente útiles que dividen los enlaces peptídicos entre residuos y
aminoácidos, es la enzima dominante en el mercado mundial,
especialmente en la industria de los detergentes. La acción de las
proteasas es fundamental durante el proceso de patogénesis de los
hongos entomopatógenos, ya que rompen los enlaces entre la quitina y
las proteínas, liberándola. Las proteasas son reprimidas por un sistema
de regulación por inducción-represión que ajusta la velocidad de
degradación de la cutícula de los insectos o en este caso la pared
P á g i n a | 178
celular de los hongos. Las quitinasas se expresan en sitios de

degradación proteolítica, por lo que la producción de quitinasas depende
de la accesibilidad del sustrato. La producción máxima obtenida de esta
enzima es de 141,00 UI/L en el medio FES/HTCH+A (Ver Figura-R.21).
Figura R.21. Actividad proteasa producida en el medio HTCH

(P-valor, *= P<0,05,** = P<0,01 y *** = P<0,001).
La producción de β-glucanasas, el otro grupo principal de enzimas

involucradas en la degradación de las paredes miceliales del patógeno,
también se induce en el medio de cultivo con HTCH como la principal
fuente de carbono [Bautista, 2015].
Como se observa en la Tabla R.13, se analizan diferentes enzimas en

cada medio de cultivo en el día 6 de fermentación, donde se puede
P á g i n a | 179
Y DISCUSIONES
observar que T. harzianum CEC-T24 excreta la mayor cantidad de

proteínas en el medio FES/HTCH+A, obteniendo 5243,89 UI /L de
quitinasa, 657,79 UI /L de celulasa, 14687,27 UI /L de Xilanasa y 141,00
UI /L de proteasa,
El interés biotecnológico de las enzimas líticas (quitinasas, β-

glucanasas y otras) se debe principalmente a sus aplicaciones
potenciales en la industria farmacéutica, alimentaria y agronómica, y
particularmente porque se pueden usar en el control biológico contra
hongos fitopatógenos o para mejorar la actividad insecticida en el
tratamiento de plagas. En consecuencia, la producción de estas enzimas
en grandes cantidades a bajos costos es muy deseable.
Por lo general, estas enzimas se producen en presencia de sustratos

específicos (quitina, glucanos, etc.) mediante mecanismos inductivos
específicos. Por lo tanto, los estudios principales sobre la secreción de
estas enzimas se han realizado utilizando micelio inactivado o paredes
celulares de diferentes patógenos, como Guignardia citricarpa, Pythium
sp., Sclerotium rolfsii o Rhizoctonia solani como sustratos específicos
(fuente de carbono principal).
Sin embargo, pocos estudios se han llevado a cabo utilizando

sustratos baratos y abundantes, como subproductos agroindustriales
ricos en quitina para mejorar la producción de estas enzimas líticas
(quitinasas y glucanasas, etc.).
P á g i n a | 180
4.5 Producción de quitinasas a escala semi-piloto.
La producción de quitinasas a escala semi-piloto se ha llevado a cabo

en un reactor tipo tubular rotatorio con aproximadamente 1 Kg de HTCH
adecuadamenta humedecida, sin formación de fase acuosa detectable,
con una humedad relativa del 99% - 100%, agitación suave de 60 rpm, y
aireación constante (3 L/min). Los resultados obtenidos se muestran en
la Tabla-R.14.
Tabla R.14. Producción y producción relativa de actividad quitinasa en

un reactor tubular rotatorio a escala semi-piloto.
UI/L día UI/L
1er ensayo 3.766,18 22.597,06
2º ensayo 4.468,71 26.812,27
3er ensayo 3.902,75 23.416,52
Valor medio 4.045,96±372,45 24.275,28±2234,97
Ensayo en mataz 8,73,98 5.243,88
Como puede observarse de estos resultados, la producción en el

reactor tipo tubular rotatorio incrementa la producción de actividad
quitinasa en un factor de 4,63. Esto puede explicarse por el mayor
control de parámetros como la humedad relativa, la agitación y sobre
todo la aireación, que en el caso del cultivo en el reactor tipo tubular
rotatorio son mucho más perfectos que en el cultivo en matraz con
aireación. Todo ello contribuye a un mejor desarrollo de T. harzianum
CEC-T24 en el medio de cultivo y por tanto de su producción.
P á g i n a | 181
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
5. CONCLUSIONES
 Se ha estudiado la producción de quitinasas por Bacillus licheniformis

ATCC 21415, Trichoderma atroviride CEC-T23 y Trichoderma
harzianum CEC-T24 crecidos en diferentes medios de cultivo
formulados con subproductos agroindustriales ricos en quitina
procedentes de hongos comestibles (Agaricus Bisporus) y crustáceos
(Procambarus clarkii) como fuente principal de carbono en un intento
de producir estas enzimas de una manera económicamente viable, y
darle un uso práctico a estos subproductos. Este trabajo es uno de
los primeros, que aborda de manera sistemática la utilización de los
subproductos ricos en quitina de la industria de los hongos y setas
comestibles para obtener productos de alto valor añadido, diferentes
de la quitina y el quitosano.
 Se ha preparado y caracterizado diferentes fuentes de fermentación a

partir de subproductos industriales (harina de tallos de champiñón,
HTCH, F-Q/G y harina de cangrejo, HC), para la producción de
quitinasas por fermentación, ensayando dos sistemas diferentes de
fermenacion: Fermentación Sumergida (FS) y Fermentación en
estado sólido (FES). T. harzianum CEC-T24 mostró la mayor
productividad de quitinasa en comparación con los otros
microrganismos ensayados, (873,98 UI L-1día-1) en el medio HTCH+A
en Fermentación en estado sólido. Los mejores resultados se
obtubieron en dicho medio, en el que se puede observar que en el
medio HTCH-A en FES produce 1,6 veces más cantidad de quitinasas
que en FS, y de igual manera el cultivo en el medio HTCH+A produce
P á g i n a | 185
CONCLUSIONES
2,3 veces más cantidad de quitinasas en FES que en FS.

Observándose que este sistema de fermentación incrementa
significativamente la producción enzimática.
 Se determinó la producción de quitinasa mediante la medida de

actividad y de proteína y el perfil de enzimas/proteínas secretadas al
medio de cultivo, el análisis electroforético permitió la detección de 25
proteínas diferentes entre ellas cinco quitinasas con masas
moleculares 82, 65, 48, 31 y 25 kDa, respectivamente, que fueron
comprobadas mediante un zimograma.
 Se estudiaron las proteínas secretadas por T. harzianum CEC-T24

mediante técnicas proteómicas el número de enzimas/proteínas
detectadas es mucho mayor en HTCH (183 proteínas especificas de
T. harzianum CEC-T24), 161 proteínas especificas de T. harzianum
CEC-T24 en medios formulados con F-Q/G y 91 proteínas especificas
de T. harzianum CEC-T24 en medios formulados con HC.
 Además cuando se crece T. harzianum CEC-T24 en un reactor tipo

tambor rotatorio, a escala semi-piloto (1 Kg de medio de cultivo), bien
controlado, la productividad es 6,72 veces superior a la descrita para
medios aireados en matraces.
 Estas enzimas tienen aplicaciones potenciales en la industria

farmacéutica, alimentaria y agronómica donde podrían desempeñar
un importante papel en biocontrol y tratamiento de enfermedades de
P á g i n a | 186
CONCLUSIONES
las plantas, debido a que no son tóxicas, son biodegradables y

biocompatibles.
P á g i n a | 187
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P á g i n a | 210
BIBLIOGRAFÍA
P á g i n a | 211
ANEXOS
ANEXOS
ANEXOS
Anexo 1:
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PARA ELECTROFORESIS DE
PROTEINAS EN GELES DE ACRILAMIDA
EN TRIS-GLICINA
Soluciones stock
1. Tris-HCl 100 mM (pH 6,8):

Tris 1,211 g
H2O 80 mL
Ajustar el pH a 6,8
H2O csp 100 mL
2. SDS 10% (p/v):

SDS 10 g
H2O csp 100 mL
3. Azul de Bromofenol 0,5% (p/v):

Azul de Bromofenol 0,25 g
H2O 50 mL
Soluciones de trabajo
1. Acrilamida 30% (p/v):

Acrilamida 30 g
H2O 100 mL
2. Bis-acrilamida 1% (p/v):
Bis-acrilamida 0,5 g
H2O 50 mL
3. Running buffer 4X:

1,5M Tris-HCl (pH 8,8) 36 g
H2O 150 mL
Ajustar pH 8,8
0,4% SDS 8 mL de SDS al 10%
Revisar pH
H2O csp 200 mL
P á g i n a | 214
ANEXOS
4. Solución A (Solución stock de acrilamida, T= 30%, C= 2,7%)

Acrilamida 29,2 g
Bis-acrilamida 0,8 g
H2O csp 100 mL
Durante la preparación de esta solución trabajar siempre con guantes y

en campana. (Acrilamida es Neurotóxica)
5. Stacking buffer 4X (Solución C):

0,5M Tris-HCl (pH 6,8) 6,05 g
H2O 50 mL
Ajustar pH 6,8
0,4% SDS 4 mL de SDS al 10%
Revisar pH
H2O csp 100 mL
6. Tampón de electroforesis 1X:

Tris-HCl 25mM 3g
Glicina 190mM 14,258 g
SDS 0,1% 10 mL de SDS al 10%
H2O 900 mL
Ajustar pH a 8,4 con HCl gota a gota
H2O csp 100 mL
Estable a temperatura ambiente varias semanas. Preferible preparar
cada semana.
7. Tampón de muestra 4X (de carga, de disociación, Mixer):

0,02M Tris-HCl pH 6,8 2 mL de Tris-HCl 100mM
20% β-mercaptoetanol 2 mL
4,6% SDS 0,46 g
40% glicerol 4 mL de glicerol al 99%
0,01% azul de Bromofenol 0,3 mL de AdB al 0,5% (p/v)
H2O csp 10 mL
Hacer alícuotas y guardar a -20 ˚C
P á g i n a | 215
ANEXOS
Anexo 2:
XIII EUCHIS & VIII SIAQ
Production of chitinases by submerged fermentation in media

formulated with colloidal chitin of fungi.
Anabell Del Rocío Urbina Salazar, Alberto Renato Inca Torres, Pilar
Carbonero Aguilar, Gonzalo Falcón García and Juan D. Bautista.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de

Farmacia, Universidad de Sevilla. 41012-Sevilla, Spain.
ABSTRACT
Production of chitinases is essential for obtaining chitin-oligosaccharides
with potential use as elicitors in biocontrol (1). Chitinase production by
Bacillus licheniformis ATCC 21415 grown in different culture medium
formulated with powder chitin (pCH), colloidal chitin (cCH and fungal
chitin (fCH) as the main carbon source was studied. The growth of this
microorganism produced higher chitinase activity in a medium formulated
with fungal (Agaricus bisporus) chitin (fCH) than in the other culture
media (2). Bacillus licheniformis ATCC 21415 shows the highest
chitinase productivity after 8 days of growth with a productivity of 81.25
mU/L/day. Chitinase production, under these conditions, was studied by
electrophoretic methods, in which two bands with molecular mass
around 90 and 74 kDa are detected. These results show that the culture
of B. licheniformis ATCC 21415 in a medium formulated with fCH, a
cheap and abundant fermentation medium, could be a good procedure
for the regular production of glycosidases, particularly chitinases at
practical and/or industrial scale.
References
(1) N.N. Nawani, B.P. Kapadnis (2005) Optimization of chitinase production using statistics based
experimental designs Process Biochemistry, Volume 40, Issue 2, Pages 651-660.
(2) Shailesh R. Waghmare, Jai S. Ghosh. (2010) Chitobiose production by using a novel
thermostable chitinase from Bacillus licheniformis strain JS isolated from a mushroombed. Carbohydrate
Research Volume 345, Issue 18, Pages 2630-2635.
P á g i n a | 216
ANEXOS
Anexo 3:
IV Jornadas Doctorales de la Universidad de Murcia
Mushroom ergothioneine enriched aqueous extracts (M-ERG-EAE) suppress

TNF-α and MMP-1 expression in UV-irradiated human dermal fibroblasts.
Anabell del Rocío Urbina-Salazar1,2, Alberto Renato Inca-Torres1,2, Pilar Carbonero Aguilar1, Olga Cremades de
Molina1, Juan Bautista1.
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Sevilla, C/ Profesor 7 García González 2,
41012 - Sevilla, Spain, [email protected]; 2 Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, Facultad de Ciencias,
Panamericana Sur km 9 1 1/2, EC060155 - Riobamba, Ecuador, [email protected].
Ergothioneine (ERG), is a dietary antioxidant that scavenges hydrogen

peroxide (H2O2), superoxide anion (•O2−), singlet oxygen (1O2), hydroxyl radical
(•OH) and nitric oxide (NO) derivatives [1]. ERG exhibits potential applications as
a food additive and as an antioxidant for the treatment and/or prevention of
oxidative stress related diseases [2]. Natural ERG is preferred by consumers
rather than the synthetic.
In this work we study the nature of the antioxidant activity and investigate
the effect of M-ERG-EAE, a natural product enriched in natural ERG in the form of
extract, M-ERG-EAE, obtained from the edible mushroom (Agaricus bisporus) [3],
on UV-induced cellular response.
In cultured fibroblasts, M-ERG-EAE suppressed TNF-α upregulation by

UV-B radiation. In addition, in fibroblasts exposed to UV-A, M-ERG-EAE
suppressed the expression of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) protein by
nearly 50% and reduced MMP-1 mRNA expression.
From these results, we concluded that M-ERG-EAE, as pure ERG,

scavenges reactive oxygen species generated by both type-I and type-II
photosensitizacion and suppressed both TNF-α expression and MMP-1 at their
translational level. M-ERG-EAE may reduce skin antiaging effects after UV
irradiation by the scavenging of •O2- and 1O2, and reducing signals for protease
and inflammatory activity.
References:
(1) Servillo L., D’Onofrio N., Casale R., Cautela D., Giovane A., Castaldo D., Balestrieria M.L. (2017).
Ergothioneine products derived by superoxide oxidation in endothelial cells exposed to high-glucose. Free
Radical Biology and Medicine, 108:8–18.
(2) Halliwell B., Cheah I.K., Drum C.L. (2016). Ergothioneine, an adaptive antioxidant for the protection of injured
tissues? A hypothesis, Biochem. Biophys. Res. Commun. 470:245–250.
(3) Cremades O., Diaz-Herrero M.M., Carbonero-Aguilar P, Gutierrez-Gil J.F., Fontiveros E., Bautista J. (2015).
White button mushroom ergothioneine aqueous extracts obtained by the application of enzymes and membrane
technology. Food Bioscience, 10:42 – 47.
P á g i n a | 217
ANEXOS
Anexo 4:
III JORNADAS DOCTORALES DE FARMACIA
PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A PARTIR DE LOS

SUBPRODUCTOS DE LA INDUSTRIA AGROALIMENTARIA:
Aplicación a los Hongos comestibles y Crustáceos.
Anabell del Rocío Urbina-Salazar.

Introducción
La quitina, es un polímero lineal β-1,4 insoluble de N-acetil-D-
glucosamina (GlcNAc), es un importante componente estructural de la
mayoría de los crustáceos, insectos, algas y hongos. Las quitinasas son
enzimas que degradan la quitina a acetil glucosamina y son sintetizadas
principalmente por bacterias y hongos (1). Estas enzimas tienen
aplicaciones potenciales en la industria farmacéutica, alimentaria y
agronómica donde podrían desempeñar un importante papel en
Biocontrol y tratamiento de enfermedades de las plantas, debido a que
son no-tóxicas, biodegradables y biocompatibles (2). Este trabajo trata
sobre la producción de quitinasas por Bacillus licheniformis ATCC 21415
y Trichoderma harzianum CEC-T24 crecidos en diferentes medios de
cultivo formulados con sub-productos agroindustriales de hongos
comestibles (Agaricus Bisporus) y crustáceos (Procambarus clarkii)
como fuente principal de carbono.
Objetivos
 Preparación y caracterización de la fuentes de fermentación a partir de
subproductos agroindustriales (harina de tallos de champiñón, HTCH y
harina de cangrejo, CFM).
 Producción de quitinasas por fermentación en estado sólido (FES) y
fermentación sumergida (FS)
 Extracción, concentración/fraccionamiento y estabilización de enzimas
(quitinasas).
 Estudio de la secreción de proteínas (secretoma) de B. licheniformis
ATCC 21415 o T. harzianum CEC-T24 crecido en los diferentes medios
de cultivo, mediante técnicas electroforéticas y proteómica.
 Producción de quitinasas a escala semi-piloto. (Pendiente).
P á g i n a | 218
ANEXOS
 Estabilización y/o inmovilización de concentrado de quitinasas en forma

de nano/micropartículas para su uso como plaguicida alternativo al uso
de productos químicos altamente tóxicos para el medio ambiente.
(Pendiente).
Material y Métodos
Los microorganismos se han mantenido en placas de PDA y se
cultivaron en FS y FES utilizando diferentes medios formulados con
HTCH, M-Ch/G-F y CFM y CF-ChF como principal fuente de carbono,
bajo control de pH, temperatura, O2-disuelto y agitación, utilizando polvo
de quitina (Chp) y quitina coloidal (CHc) como controles positivos (3).
La productividad y secreción de la enzima (quitinasa) se ha seguido
mediante el análisis de la actividad quitinasa (midiendo la cantidad de N-
AcGln liberada), la concentración de proteína (4) y de biomasa. La
evolución de las diferentes etapas se ha seguido mediante PAGE SDS
(5).
Resultados y Discusión
Todos los microorganismos produjeron una mayor actividad de quitinasa
en un medio formulado con M-Ch/G-F como fuente de carbono en
comparación con el medio formulado con Chp o CHc. T. harzianum
CEC-T24 mostró la mayor productividad de quitinasa (261.5 mU L -1/día).
La producción de quitinasa se controló mediante la medida de actividad
y proteína y PAGE-SDS. El análisis electroforético permitió la detección
de 28 proteínas diferentes -tres diferentes quitinasas con 82, 50 y 31
kDa-. Estos resultados apunta a que el cultivo de T. harzianum CEC-T24
en un medio de fermentación barato y abundante representa un buen
procedimiento para la producción a gran escala de quitinasas.
Bibliografía
1. Sahai A.S., Manocha M.S., (1993). Microbiol. 11:317-338.
2. Nawani N.N. and Kapadnis B.P., (2005). Process Biochemistry 40:651-660.
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5. Laemli U.K., (1970). Nature 227:680-685.
P á g i n a | 219
ANEXOS
Anexo 5:
Innovation in Pharmacy:
Advances and Perspectives.
1st Global Congress of Pharmacy Faculties. September 24-28th, Salamanca, Spain

2018
Preparation of Fungal-Nano chitin crystals: Aplication to Mushroom

(Agaricus bisporus) by-products.
Anabell del Rocío URBINA-SALAZARa,b*, Alberto Renato INCA-
TORRESa,b, and Juan BAUTISTAa.
a Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de

Sevilla, C/ Profesor García González nº2, 41012 Sevilla, Spain,
[email protected]
b Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, Facultad de Ciencias,
Panamericana Sur km 1 1/2, Riobamba, Ecuador,

[email protected]
Abstract:
Chitin is a crystalline polysaccharide of high molecular weight,

found in crustacean shells, insect cuticles and in yeast, green algae and
cell walls of fungi. It occurs as a highly-organized micro- and nano-fibril
structure [1]. Transformation of micro-fibrils in nano-crystals can be
achieved dissolving the amorphous regions followed by acidic breaking
[2,3]. Functionalized fungal-chitin nanocristals (FChNC) can be used in
the medical-pharmaceutical and food industry do to it antifungal activity
[4].
In this work we report on FChNC preparation using fungal chitin

(Agaricus bisporus) as raw material, obtained by a sequential process
based on the use of proteases, glucanases [5]. The concentration of raw
fungal chitin obtained by this process, determined as N-acetyl-
glucosamine, is 83 ±1.8%, being a chitin of good quality, similar to that
P á g i n a | 220
ANEXOS
commercially available for food and medical uses. Preparation of fungal

nano-chitin fibres (FNChF) was obtained disintegrating chitin aggregates
in a wet-type grinder, generating chitin gel-suspension. Disintegration
was achieved due to a high surface-to-volume ratio. Obtained uniform
chitin fibers with a width of approximately 10 nm which still maintained
their original chemical and crystalline structures [6]. These fibrils form
highly crystalline regions and disordered (amorphous) regions that can
be turned in nanocrystals via top-down methods such as acid hydrolyses
by dissolving the amorphous regions [2,3]. Functionalization of FNChC
allows it uses in different composites with medico-pharmaceutical and
food uses.
Graphical abstract
References
[1] Salaberria A.M., et al., (2015). Eur. Polym. J. 68:503–515.
[2] Salaberria A.M., et al., (2015). React. Funct. Polym. 89:31–39.
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[5] Cremades et al., (2012).
[6] Ifuku S., (2014). Molecules. 19:18367-18380
Financial support and/or acknowledgments

Spanish Ministry of Science and Innovation (project RTC-2015-4039-2), FEDER funds of the European
Union.
CITIUS, Universidad de Sevilla, Servicio de Biología, Invernadero y Servicio de Microanálisis.
P á g i n a | 221
ANEXOS
Anexo 6:
PREPARATION OF FUNGAL CHITIN FROM AGROINDUSTRIAL BY-

PRODUCTS: APLICATION TO EDIBLE MUSHROOMS (Agaricus
bisporus) BY-PRODUCTS.
Alberto Renato Inca Torres, Anabell Del Rocío Urbina Salazar, Gonzalo
Falcón García, Pilar Carbonero Aguilar, and Juan Bautista Palomas.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Farmacia,

Universidad de Sevilla. 41012-Sevilla, Spain.
The use of chitin-oligosaccharides for use as potential elicitors requires

abundant chitin rich materials, readily available and cheap (1). For this
purpose, the production of enriched chitin fractions from by-products of the
edible mushroom processing industry are of great interest if appropriated
procedures were developed (2).
Traditional methods for the commercial preparation of chitin involve

alternate hydrochloric acid and alkali treatment, followed by a bleaching
stage with chemical reagents to obtain a colorless product. These
processes are highly contaminant. Therefore, the developments of
environmental friendly processes are of high interest. In this work we report
on preliminary results obtained with an enzymatic procedure, environmental
friendly, based on the use on proteases and glucanases that lead to fungal
chitin fraction with a chitin concentration > 80±2%.
References
1. (1). Gianfranco Romanazzi, Simona Marianna Sanzani, Yang Bi, Shiping Tian, Porfirio Gutiérrez
Martínez, Noam Alkan, (2016). Induced resistance to control postharvest decay of fruit and vegetables.
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2. (2). K.S. Matsumoto, R.G. Guevara-González, I. Torres-Pacheco, (2006). Fungal chitinases. Advances in
Agricultural and Food Biotechnology, pp. 289–304
P á g i n a | 222
ANEXOS
Anexo 7:
IV Jornadas Doctorales de la Universidad de Murcia
“In vitro” study of mushroom ergothioneine enriched aqueous
extracts (M-ERG-EAE) against oxygen activated substances.
Alberto Renato Inca-Torres1,2, Anabell Del Rocío Urbina-Salazar1,2,

Gonzalo Falcón-García1, Olga Cremades de Molina1, and Juan Bautista1.
1
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Sevilla, C/
Profesor 7 García González 2, 41012 - Sevilla, Spain, [email protected]; 2 Escuela
Superior Politécnica de Chimborazo, Facultad de Ciencias, Panamericana Sur
km 9 1 1/2, EC060155 - Riobamba, Ecuador, [email protected].
Ergothioneine (ERG), 2-mercapto-L-histidine betaine, is a dietary

component acting as antioxidant and cytoprotectant. ERG scavenges
hydrogen peroxide (H2O2), superoxide anion (•O2−), singlet oxygen (1O2),
lipid peroxides, hydroxyl radical (•OH) and nitric oxide (NO) derivatives (1).
ERG exhibits potential applications as a food additive and as an antioxidant
for the treatment and/or prevention of oxidative stress related diseases (2).
Commercial ERG are mainly synthetic, however natural ERG is preferred by

consumers. In this work we present a natural product enriched in natural ERG in
the form of extract, M-ERG-EAE, obtained from the edible mushroom (Agaricus
bisporus) using enzymes and membrane technology (MAE) (3). This product can
be incorporated in solid or liquid foods or used as a component of cosmetic
creams such as sunscreen creams.
“In vitro” studies show that M-ERG-EAE, as pure ERG, scavenged

the superoxide anion radical (•O2-) and singlet oxygen (1O2), preventing the
formation of the high dangerous radical •OH and preventing the damage in
biomolecules, mainly proteins, nucleic acids and lipids.
From these results, we concluded that M-ERG-EAE, as pure ERG,

scavenged •O2- and 1O2, reducing the formation of the high dangerous
radical •OH mainly in presence of transition metals such as Fe2+ and Cu+.
References:
1. Servillo L., D’Onofrio N., Casale R., Cautela D., Giovane A., Castaldo D., Balestrieria M.L. (2017). Ergothioneine products derived by
superoxide oxidation in endothelial cells exposed to high-glucose. Free Radical Biology and Medicine, 108:8–18.
2. Halliwell B., Cheah I.K., Drum C.L. (2016). Ergothioneine, an adaptive antioxidant for the protection of injured tissues? A hypothesis,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 470:245–250.
3. Cremades O., Diaz-Herrero M.M., Carbonero-Aguilar P, Gutierrez-Gil J.F., Fontiveros E., Bautista J. (2015). White button mushroom
ergothioneine aqueous extracts obtained by the application of enzymes and membrane technology. Food Bioscience, 10:42 – 47.
P á g i n a | 223
ANEXOS
Anexo 8:
Innovation in Pharmacy:
Advances and Perspectives.
1st Global Congress of Pharmacy Faculties. September 24-28th, Salamanca, Spain

2018
Preparation of Nanochitin from Crawfish (Procambarus clarkii) by-

products.
Alberto Renato INCA-TORRESa,b*, Anabell del Rocío URBINA-

SALAZARa,b, and Juan BAUTISTAa.
a Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de
Sevilla, C/ Profesor García González nº2, 41012 Sevilla, Spain,

[email protected]
b Escuela Superior Politécnica de Chimborazo, Facultad de Ciencias,
Panamericana Sur km 1 1/2, Riobamba, Ecuador,

[email protected]
Abstract:
Nanochitin fibers (NChC) were prepared from crawfish chitin
(Procambarus clakii) by-products. Raw chitin has been obtained by two
different processes: Process A consists of a first deproteinization with a
protease treatments, followed by a demineralization in situ by lactic acid
fermentation (1) and a second deproteinization by alkaline treatment;
Process B consists of acid demineralization step, followed by an
enzymatic treatment with proteases and a final alkaline treatment. The
concentration of raw crab chitin obtained from Process-A and -B
determined as N-acetyl-glucosamine is 85 ± 1.8% and 83 ± 2.3%, being
a chitin of good quality, similar to that commercially available for food
and medical uses. Subsequently, the preparation of chitin nanofibers
were carried out disintegrating the chitin aggregates by a milling process.
After a treatment cycle with a wet-type grinder, the chitin suspension
P á g i n a | 224
ANEXOS
formed a gel; disintegration was achieved due to a high surface-to-

volume ratio. Obtaining highly uniform chitin fibers with a width of
approximately 10 nm which still maintained their original chemical and
crystalline structures (2,3). The obtained product can be used for
industrial applications in pharmacy, cosmetic, agriculture and wastewater
treatments.
Graphical abstract
REFERENCES
1. Bautista et al., (2001). Process Biochemistry, 37: 229-234.
2. Abe K.., et al., (2007). Biomacromolecules. 8: 3276–3278.
3. Ifuku S., (2014). Molecules, 19: 18367-18380.
Financial support and/or acknowledgments

 Spanish Ministry of Science and Innovation (project RTC-2015-4039-2), FEDER funds of the European Union.
 CITIUS, Universidad de Sevilla, Servicio de Biología, Invernadero y Servicio de Microanálisis.
P á g i n a | 225
ANEXOS
Anexo 9:
USE OF CRAYFISH (Procambarus clarkii) CHITIN AS CARBON

SOURCE FOR THE PRODUCTION OF CHITINASES BY
SUBMERGED FERMENTATION
Pilar Carbonero Aguilar, Gonzalo Falcón García, Anabell Urbina

Salazar, Alberto Inca Torres and Juan Bautista.
There is an increasing interest in chitinases for it uses in biocontrol

and control of plagues, so as for the production of chitino-
oligosaccharides (elicitors) (1). But an effective practical uses required a
viable production of this enzymes. For that purpose it is necessary to
have an abundant, easily acquired, seasonally independent and cheap
fermentation media, obtained by environmentally friendly processes.
Such a fermentation media can be obtained from crayfish (Procambarus
clarkii) sub-products by treatment with enzymatic and chemical
procedures which originate chitin enriched fraction. These chitin enriched
fraction can be used as carbon sources and as an inductor for chitinases
production by fermentation procedures, using defined media culture
(Mesia-I, -II, -III and –IV) inoculated with a genetically modified Bacillus
licheniformis ATCC 21415 (2).
Production of chitinase was studied in the theses medias: Media-I:

Coloidal Chitin (positive control); Media-II: P. clarkii-Chitin (65.3±2,7 %);
Media-III: P. clarkii-Chitin (78±3,2 %) and Media-IV: P. clarkii-Chitin
(23.1±1.03. %). Our results show that the production of chitinase activity
is higher than that observed with colloidal chitin (prepared from
commercial chitin, and used as positive control). Chitinase productivity
after 7 days of growth was of 73.25 mU/L/day. Secretion of chitinase to
culture medium was studied by electrophoretic methods, and two bands
with molecular mass around 91 and 75 kDa were detected. These results
show that the growth of B. licheniformis ATCC 21415 in a medium
formulated with P. clarrkii-Chitin, could be a good procedure for the
regular production of chitinases.
References
1. S. Das, D. Roy, R. Sen., (2016). Utilization of Chitinaceous Wastes for the Production of Chitinase.
Advances in Food and Nutrition Research. Volume 78, pp. 27–46
2. Saima, M. Kuddus, Roohi, I.Z. Ahmad, (2013). Isolation of novel chitinolytic bacteria and production
optimization of extracellular chitinase. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 11, 39–46
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ANEXOS
Anexo 10:
Production of Crawfish (Procambarus clarkii) enriched fractions by

enzymatic procedures for fermentation uses and chitin-
oligosaccharides.
Falcón-García G., Carbonero-Aguilar P., Inca-Torres A.R., Urbina-

Salazar A.R., and Bautista J.
Currently, chitin, chitosan, and their derivatives are widely used in

chemistry, medicine, pharmacy, cosmetics, food technology, water
treatment, etc. [1,2].
A prerequisite to increase the use of chitin is the development of

environmental friendly manufacturing processes, or the development of
profitable processes to recover chitin and other products such as
proteins, protein-hydrolyzates and pigments, if crustacean-processing
waste products are used as starting material [3]. Traditional methods for
the commercial preparation of chitin from crustacean shell (exoskeleton)
involve alternate hydrochloric acid and alkali treatment stages to remove
calcium carbonate and proteins, respectively, followed by a bleaching
stage with chemical reagents to obtain a colourless product. These
processes are highly contaminant [2].
Therefore, the development of environmental friendly processes is

of high interest.
The in-situ production of lactic acid at low cost from agroindustrial
by-products, and protease treatment could contribute to the development
of this type of processes for the recovery of chitin.
In this work, we report on the in-situ production of lactic acid using

crayfish meal supplemented with brewer’s grains soluble as fermentation
media, for the demineralization of crayfish exoskeleton followed by
protease treatment as deproteinization step.
References
1. Fatma Gassara, Candice Antzak, Chandran Matheyambath Ajila, Saurabh Jyoti Sarma, Satinder Kaur Brar, M. Verma. Chitin and chitosan
as natural flocculants for beer clarification Journal of Food Engineering 166 (2015), 80–85
2. Imen Hamed , Fatih Ozogul, Joe M. Regenstein. Industrial applications of crustacean by-products (chitin, chitosan, and
chitooligosaccharides): A review. Trends in Food Science & Technology 48, (2016), 40–50
J. Bautista*, M. Jover, J.F. Gutierrez, R. Corpas, O. Cremades, E. Fontiveros , F. Iglesias, J. Vega.Preparation of crayfish chitin by in situ lactic
acid production, Process Biochemistry 37 (2001) 229–234
P á g i n a | 227
ANEXOS
Anexo 10:
5th International Conference Enzymes in the Environment. Ecology,
Activity and Application. Bangor, Gales, Reino Unido. 2016
OBTAINING A SOIL BIOSTIMULANT FROM SEWAGE SLUDGE:

EFFECT ON SOIL BIOCHEMISTRY
Bruno RODRIGUEZ-MORGADO* ([email protected]); Pablo CABALLERO JIMENEZ; Alberto

Renato INCA TORRES; Anabell URBINA SALAZAR; Juan PARRADO RUBIO*, Dept.
Biochemistry and Molecular Biology, University of Seville, Spain; Manuel TEJADA MORAL, Dept.
Crystallography, Mineralogy and Agricultural Chemistry, University of Seville, Spain
Sewage sludge is a byproduct of wastewater treatment plants. These

sludges present a serious problem because current management
consists mainly in composting, a process that requires large amounts of
space and time, resulting in a final product with low added-value. In order
to promote a more dynamic use of sewage sludge while increasing their
added-value, we implemented a fermentative technology using Bacillus
licheniformis ATCC 21415, a microorganism widely used in industry, that
excreted different hydrolytic enzymes, which together with the Bacillus
itself have a great potential in soil applications. We studied both the
production of various enzymes associated with geochemical cycles, such
as proteases, cellulases, lipases, etc., and the total production of
extracellular proteins by proteomic analysis thereof. Finally, we have
applied these fermented products as edafic biostimulants, evaluating its
effect on the biochemical properties of soil, mainly in enzymatic activities
related to microbiota, such as dehydrogenase, phosphatase and
glucosidase.
References
1. Parrado, J., Rodriguez-Morgado, B., Tejada, M., Hernandez, T., & Garcia, C. (2014). Proteomic analysis of enzyme production by Bacillus
licheniformis using different feather wastes as the sole fermentation media. Enzyme and microbial technology, 57, 1-7.
2. Tejada, M., García-Martínez, A. M., Rodríguez-Morgado, B., Carballo, M., García-Antras, D., Aragón, C., & Parrado, J. (2013). Obtaining
biostimulant products for land application from the sewage sludge of small populations. Ecological engineering, 50, 31-36.
P á g i n a | 228
ANEXOS
Anexo 11: Artículo 1
P á g i n a | 229
ANEXOS
P á g i n a | 230
ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
P á g i n a | 237
ANEXOS
Anexo 12: Artículo 2
P á g i n a | 238
ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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ANEXOS
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DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA

“PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A PARTIR DE

Memoria presentada para optar al grado de Doctor en

ANABELL DEL ROCÍO URBINA SALAZAR

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Prof. Dr. José Luis Venero Recio

José Luis Venero Recio, Catedrático de Universidad de Bioquímica y

Que la tesis doctoral titulada “PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A

Fdo: José Luis Venero Recio

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Juan Dionisio Bautista Palomas, Catedrático de Universidad de

Que la Tesis Doctoral titulada “PRODUCCIÓN DE QUITINASAS A

Parte de los resultados presentados en esta Tesis doctoral, han sido

Urbina-Salazar A.R., Inca-Torres A.R., Falcón-García G., Carbonero-

Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., Falcón-García G., Carbonero-

Parte de los resultados presentados en esta tesis doctoral han sido

Urbina-Salazar A.R., Inca-Torres A.R., Carbonero-Aguilar P., Falcón-

Urbina-Salazar A.R, Inca-Torres A.R., Carbonero-Aguilar P., Cremades

Urbina-Salazar A.R., Inca-Torres A.R., and Bautista J., (2018).

Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., Falcón-García G., Carbonero-

Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., Falcón-García G., Cremades O.

Inca-Torres A.R., Urbina-Salazar A.R., and Bautista J., (2018).

Carbonero-Aguilar P., Falcón-García G., Urbina-Salazar A.R., Inca-

Falcón-García G., Carbonero-Aguilar P., Inca-Torres A.R., Urbina-

Rodríguez-Morgado B., Caballero Jiménez P., Inca-Torres A.R., Urbina-

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular

Esta Tesis se ha realizado gracias a la financiación de los siguientes

Proyecto: Aumento del contenido de vitamina D en champiñón

Proyecto: Valorización de fibras celulósicas y de quitina obtenidas

La gratitud es la clave que convierte los problemas en bendición y lo inesperado en regalos.

Primeramente agradezco al Profesor Juan D. Bautista Palomas por confiar en mí y abrirme

A Dn Walter, Myriam y Vale por estar siempre pendientes de nosotros.

RESUMEN ............................................................................................. iii

1.1.1 Generalidades .............................................................................. 3

1.1.2 Clasificación de las quitinasas .................................................... 6

- Clasificación según la Comisión de Enzimas de la IUPAC.......... 7

- Clasificación basada en la secuencia aminoacídica y

- Clasificación basada en el mecanismo ........................................ 10

1.1.3 Importancia y Aplicaciones de las Quitinasas .......................... 12

1.3.1.1 Quitinasas y Agronomía ........................................................ 15

1.1.3.2 Quitinasas en la Industria Alimentaria ................................... 19

1.1.3.3 Otras Aplicaciones de Quitinasas .......................................... 20

1.1.4 Producción de Quitinasas por Fermentación ............................ 20

b) Fermentación en Estado líquido o Sumergida ............................ 23

c) Fermentación Discontinua .......................................................... 24

d) Fermentación Continua ............................................................... 24

1.1.4.1 Microorganismos ................................................................... 25

1.1.4.2 Factores extrínsecos de Cultivo ............................................. 27

1.4.3 Medios de cultivo (Sustratos) ................................................... 28

1.2.1 Subproductos de la Industria de Hongos y Setas Comestibles . 32

1.2.2 Subproductos de la Industria de Crustáceos ............................. 40

3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................ 53

3.1.1 Reactivos ................................................................................... 53

3.1.2. Materiales ................................................................................. 57

3.1.3 Equipos ..................................................................................... 59

3.4.1 Secado y molienda .................................................................... 64

3.4.2 Preparación de la Fracción enriquecida de Quitina/Glucano

3.5.1 Humedad ................................................................................... 69

3.5.2 Cenizas .............................................................................. 70

3.5.3 Grasas ................................................................................ 70