Tesis

ESCUELA INTERNACIONAL DE DOCTORADO
Programa de Doctorado de Ciencias de la Salud
Estudio descriptivo de la microbiota intestinal en

pacientes con infección por Clostridium difficile y en
individuos colonizados por Clostridium difficile.
Autor:
Pedro Sánchez Pellicer
Director:
Dr. D. Vicente Navarro López
Murcia, octubre de 2020

ESCUELA INTERNACIONAL DE DOCTORADO
Programa de Doctorado de Ciencias de la Salud
Estudio descriptivo de la microbiota intestinal en

pacientes con infección por Clostridium difficile y en
individuos colonizados por Clostridium difficile.
Autor:
Pedro Sánchez Pellicer
Director:
Dr. D. Vicente Navarro López
Murcia, octubre de 2020

AUTORIZACIÓN DEL DIRECTOR DE LA TESIS
PARA SU PRESENTACIÓN
El Dr. D. Vicente Navarro López como Director de la Tesis Doctoral
titulada “Estudio descriptivo de la microbiota intestinal en pacientes con
infección por Clostridium difficile y en individuos colonizados por
Clostridium difficile.” realizada por D. Pedro Sánchez Pellicer en el
Departamento de Ciencias de la Salud, autoriza su presentación a trámite
dado que reúne las condiciones necesarias para su defensa.
Lo que firmo, para dar cumplimiento a los Reales Decretos 99/2011,
1393/2007, 56/2005 y 778/98, en Murcia a 5 de octubre de 2020.

AGRADECIMIENTOS
A mi mujer Ruth y a mi hijo Ibai, las dos personas más importantes de mi

vida y que sin su amor y su apoyo esta tesis no hubiera sido posible. Amor
infinito a ambos.
A mis padres y hermano por haber confiado siempre en mí en cada paso

que he dado y por haberme proporcionado una educación de calidad.
Al Dr. Vicente Navarro, director de esta tesis y compañero de trabajo, por

su ayuda inestimable en todo el proceso de realización de esta tesis y por su
disponibilidad para cualquier cuestión.
A los amigos que se han interesado por este proyecto durante estos años o
bien a los que les he dado la matraca explicándoles temas sobre la microbiota
intestinal y Clostridium difficile. Vosotros sabéis quien sois. Os quiero socios.
A Simón y Rosana por su inestimable ayuda con el inglés. Muchas gracias.
A mis compañeros del laboratorio del Hospital Universitario del Vinalopó

por su ayuda inestimable en la realización de pruebas diagnósticas. Muchas
gracias.
A Oscar, mi confesor, que me hizo ser consciente de cuan tortuoso era el

camino, como lo habían afrontado otros y como debía afrontarlo yo.
“Si puedes emplear el inexorable minuto
recorriendo una distancia
que valga los sesenta segundos,
tuya es la Tierra
y todo lo que hay en ella,
y -lo que, es más-,
¡Serás un hombre! hijo mío.”
Fragmento del poema “Si” de Rudyard Kipling (1895).

RESUMEN
INTRODUCCIÓN.
Clostridium difficile es un bacilo Gram positivo, anaerobio estricto y

formador de esporas. Constituye la principal causa de diarrea nosocomial en
pacientes hospitalizados. Su patogenicidad se asocia al uso de antibióticos y a una
respuesta inmune disminuida, así como a la edad avanzada, hospitalización y
mayor severidad de la enfermedad de base. La clínica es debida a la producción
de las toxinas TcdA y TcdB de acción citotóxica. No obstante, la colonización
intestinal de C. difficile puede dar lugar a un abanico de situaciones como la
ausencia de síntomas (individuos colonizados) hasta diarrea grave o colitis
pseudomembranosa fulminante (individuos infectados).
La infección por C. difficile (CDI, Clostridium difficile infection) supone un

problema muy importante en cuanto a mortalidad, morbilidad y costes asociados
que supone. Además, el riesgo de recurrencia es muy elevado. Asimismo, se ha
evidenciado que la epidemiología de la CDI ha cambiado desde los inicios del
siglo XXI. Aparte de un aumento en la mortalidad y morbilidad que genera la
CDI, ha empezado a describirse la existencia de un gran número de casos
provenientes de la comunidad.
La disrupción de la microbiota intestinal endógena (disbacteriosis)

proporciona el ambiente ideal para que pueda producirse la infección, sin
embargo, una microbiota intestinal sana es capaz de prevenirla. A este fenómeno
se le denomina resistencia a la colonización. Un mecanismo corrompido de
resistencia a la colonización por C. difficile clave es el concerniente al metabolismo
de los ácidos biliares. Se ha comprobado que los ácidos biliares primarios
presentan una actividad germinante sobre las esporas de C. difficile, mientras que
los ácidos biliares secundarios presentan una actividad inhibitoria sobre la
germinación. La microbiota intestinal aporta los enzimas encargados de
transformar los ácidos biliares primarios en secundarios (principalmente BaiCD).
Los miembros de la microbiota intestinal que aporten estos enzimas producirían
un efecto inhibitorio sobre la germinación de C. difficile. Estos géneros se están
presentes en muy baja cantidad y su pérdida se asocia a CDI. Otras alteraciones
características de la microbiota intestinal de los pacientes con CDI son la
depleción de familias productoras de butirato como Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae y el incremento de patógenos oportunistas, principalmente del
phylum Firmicutes.
Por otra parte, la tasa de portadores o colonizados por C. difficile es

variable y dependiente de la edad. Es más elevada en aquellos sujetos con ciertas
situaciones concomitantes que favorezcan la colonización.
La comparación de la microbiota intestinal de sujetos infectados y

colonizados por C. difficile ha sido poco estudiado. Este enfoque podría aportar
información relevante sobre grupos susceptibles de desarrollo de CDI o de
protectores.
OBJETIVOS.
El objetivo del estudio es describir y comparar la microbiota intestinal de

15 pacientes con infección por C. difficile sintomática (Grupo CDI), 15 sujetos
colonizados por C. difficile (Grupo P) y 15 controles sanos (Grupo CTRL).
HIPÓTESIS.
La presencia de ciertos grupos minoritarios de bacterias clave podría

relacionarse con la inhibición de la transición desde un estado de colonización a
infección.
MATERIAL Y MÉTODOS.
Mediante secuenciación masiva del gen bacteriano ADNr 16S se realizaron

estudios de alfa y beta diversidad, mediante índices estadísticos basados en la
ecología bacteriana y mediante curvas de rarefacción y de composición mediante
el estudio de las abundancias relativas a nivel de phylum, familia y género. Se
valoraron las diferencias estadísticamente significativas entre los tres grupos
mediante el test no paramétrico de Wilcoxon. Asimismo, se realizaron estudios de
agrupamiento mediante análisis principal de componentes mediante un modelo
Unifrac.
RESULTADOS.
Se evidencia una pérdida de alfa diversidad y riqueza en los grupos CDI y

P con respecto al grupo CTRL, pero sin diferencias significativas entre los dos
primeros. El estudio de la beta diversidad mediante Análisis Principal de
Componentes Unifrac, mostró que la estructura de la microbiota intestinal de los
grupos CDI y C es diferente a la del grupo CTRL, pero con solapamiento en los
dos primeros grupos.
El estudio de la composición muestra que en los grupos CDI y P se

produce una fuerte disminución del phylum Firmicutes a expensas de las familias
Lachnospiraceae y Ruminococcaceae y una expansión de potenciales patógenos
oportunistas como el phylum Proteobacteria y las familias Enterococcaceae y
Streptococcaceae. Asimismo, hay una perdida de géneros con actividad BaiCD en
los pacientes infectados que se conservan en mayor medida en los individuos
colonizados, como Blautia, Eubacterium y Clostridium Scindens. También
observamos una ganancia de los géneros degradadores de mucina en el grupo
CDI y P, Ruminococcus torques Group y Ruminococcus gnavus Group y del patógeno
oportunista Veillonella que agravarían la disbacteriosis de los pacientes infectados
y colonizados por C. difficile. Curiosamente el género Clostridiodes que presenta
como única especie a C. difficile presenta similar abundancia relativa en infectados
y colonizados, permitiéndonos suponer que los factores relativas a la virulencia
causal también deben ser importantes. Dentro de la familia Erysipelatrichaceae se
expanden en los pacientes con CDI géneros de carácter proinflamatorio que se
observan en menor medida en los colonizados. El phylum Bacteroidetes sufre una
total reestructuración a nivel de familia y género tanto en pacientes infectados
como en individuos colonizados con respecto a los controles sanos. De manera
interesante el beneficioso género Bifidobacterium del phylum Actinobacteria se
pierde en los pacientes con CDI y se conserva en los individuos colonizados en
gran medida. También, el género Akkermansia, degradador de la mucina, se
incrementa en los infectados y disminuye en los colonizados, pudiendo suponer
una ventaja selectiva para una más eficaz colonización de y alcance de C. difficile
al epitelio intestinal.
CONCLUSIÓN.
Concluimos que los sujetos infectados y colonizados por C. difficile

presentan una microbiota intestinal con una diversidad, riqueza, estructura y
composición completamente diferente a la de los controles sanos. No obstante, la
microbiota intestinal de los sujetos infectados y colonizados por C. difficile
presenta grandes similitudes a nivel de diversidad, riqueza y estructura. Es en la
composición donde encontramos que los sujetos colonizados, en especial en
géneros minoritarios, presentan diferencias con respecto a los infectados. Este
hecho explica, al menos en parte, el estado de colonización asintomático por C.
difficile.
PALABRAS CLAVE: Clostridium difficile, colonización asintomática, infección por

Clostridium difficile, microbiota intestinal, ADNr 16S.
ABSTRACT.
INTRODUCTION.
Clostridium difficile is a Gram-positive bacillus, strict anaerobic and spore-

forming. It is the main cause of nosocomial diarrhea in hospitalized patients. Its
pathogenicity is associated with the use of antibiotics and a decreased immune
response, as well as with advanced age, hospitalization, and greater severity of
underlying disease. Clinic is due to production of the toxins TcdA and TcdB of
cytotoxic action. However, intestinal colonization of C. difficile can lead to a range
of situations such as absence of symptoms (colonized individuals) to severe
diarrhea or fulminating pseudomembranous colitis (infected individuals).
C. difficile infection (CDI) is a very important problem in terms of

mortality, morbidity, and associated costs. In addition, the risk of recurrence is
very high. It has also been shown that the epidemiology of the CDI has changed
since the beginning of the 21st century. Apart from an increase in mortality and
morbidity generated by the CDI, existence of many cases from the community has
begun to be described.
Disruption of the endogenous intestinal microbiota (dysbacteriosis)

provides the ideal environment for infection to occur, however, a healthy
intestinal microbiota can prevent it. This phenomenon is called resistance to
colonization. A corrupted mechanism of resistance to colonization by C. difficile
key is concern to the metabolism of bile acids. It has been shown that primary bile
acids have a germinating activity on spores of C. difficile, while secondary bile
acids have an inhibitory activity on germination. The intestinal microbiota
provides enzymes responsible for transforming primary bile acids into secondary
ones (mainly BaiCD). The members of the intestinal microbiota that contribute
these enzymes produce an inhibitory effect on the germination of C. difficile. These
genera are present in a very low quantity and their loss is associated with CDI.
Other characteristic alterations of the intestinal microbiota of patients with CDI
are a depletion of butyrate producing families such as Lachnospiraceae and
Ruminococcaceae and an increase of opportunistic pathogens, mainly from the
phylum Firmicutes.
On the other hand, the rate of carriers or colonized by C. difficile is variable
and dependent on age. It is higher in those subjects with certain concomitant
situations that favor colonization.
Comparison of intestinal microbiota of subjects infected and colonized by

C. difficile has been little studied. This approach could provide relevant
information on groups susceptible to the development of CDI or protectors.
OBJECTIVES.
The goal of the study is to describe and compare the intestinal microbiota
of 15 patients with symptomatic C. difficile infection (CDI Group), 15 subjects
colonized by C. difficile (P Group) and 15 healthy controls (CTRL Group).
HYPOTHESIS.
Presence of certain minor groups of key bacteria could be related to the

inhibition of the transition from a state of colonization to infection.
MATERIAL AND METHODS.
By means of high-throughput sequencing of 16S rDNA bacterial gene,

alpha and beta diversity studies were carried out, by means of statistical indices
based on bacterial ecology and by rarefaction curves, and composition by
studying relative abundances at the phylum, family, and genera levels. Statistically
significant differences between the three groups were assessed using the non-
parametric Wilcoxon test. Likewise, grouping studies were carried out through
principal component analysis using a Unifrac model.
RESULTS.
There is evidence of a loss of alpha diversity and richness in CDI and P

groups with respect to CTRL group, but without significant differences between
the first two. The study of beta diversity through Principal Components Analysis
Unifrac shows that the structure of the intestinal microbiota of CDI and P groups
is different from that of CTRL group, but with overlap in first two groups.
The study of composition shows that in CDI and P groups there is a strong
decrease in phylum Firmicutes at expense of Lachnospiraceae and
Ruminococcaceae families and an expansion of potential opportunistic pathogens
such as Proteobacteria phylum and the Enterococcaceae and Streptococcaceae
families. Likewise, there is a loss of genera with BaiCD activity in infected
patients that are conserved in colonized individuals, such as Blautia, Eubacterium
and Clostridium Scindens. We also observed a gain of mucin degrading generators
in CDI and P group, as Ruminococcus torques Group and Ruminococcus gnavus
Group, and the opportunistic pathogen Veillonella that would aggravate the
dysbacteriosis of patients infected and colonized by C. difficile. Curiously, genus
Clostridiodes, which presents C. difficile as the only species, has a similar relative
abundance in infected and colonized, allowing to assume that factors affected by
causal virulence must also be important. Within Erysipelatrichaceae family,
proinflammatory genera that are observed to a lesser extent in colonized expand
in patients with CDI. Phylum Bacteroidetes undergoes total restructuring at the
family and genera level in both infected patients and colonized individuals with
respect to healthy controls. Interestingly, beneficial genus Bifidobacterium of
phylum Actinobacteria is eradicated in patients with CDI and is largely conserved
in colonized individuals. Also, the genus Akkermansia, mucin degrader, increases
in infected and decreases in colonized, being able to provide a selective advantage
for a more effective colonization of C. difficile and for reach to intestinal
epithelium.
CONCLUSION.
We conclude that subjects infected and colonized by C. difficile have an

intestinal microbiota with a diversity, richness, structure, and composition
completely different from that of healthy controls. However, the intestinal
microbiota of subjects infected and colonized by C. difficile has great similarities in
terms of diversity, richness, and structure. It is in composition that we find that
colonized subjects, especially in minority genera, present differences with respect
to those infected. This fact explains, at least in part, the state of asymptomatic
colonization by C. difficile.
KEYWORDS: Clostridium difficile, asymptomatic colonization, Clostridium difficile
infection, intestinal microbiota, 16S rDNA.
ÍNDICE
Capítulo I: Introducción. Marco Teórico.

1.1 Estructura, Fisiología y Metabolismo de C. difficile.
1.1.1 Generalidades del Género Clostridium.
1.1.2 Estructura, Fisiología y Metabolismo de C. difficile.
1.2 Ciclo vital de C. difficile: Esporulación y Germinación.
1.2.1 Esporulación de C. difficile.
1.2.2 Estructura de la espora de C. difficile.
1.2.3 Formación de la espora de C. difficile.
1.2.4 Germinación de C. difficile.
1.2.4.1 Regulación de la germinación de las esporas de C. difficile.
1.2.4.2 Germinación de C. difficile y su relación con el metabolismo de los ácidos
biliares en el hospedador.
1.2.4.3 Impacto de los ácidos biliares secundarios provenientes de la microbiota
intestinal en la resistencia a la colonización de C. difficile.
1.3 Factores de Virulencia de C. difficile.
1.3.1 C. difficile, diversidad génica y virulencia.
1.3.2 Toxinas y Virulencia.
1.3.2.1 Estructura y mecanismo de acción de las toxinas TcdA y TcdB de C.
difficile.
1.3.2.2 Expresión y genética de las toxinas TcdA y TcdB de C. difficile.
1.3.2.3 Actividad y efectos celulares e inmunológicos de las toxinas TcdA y TcdB
de C. difficile.
1.3.2.4 Toxina binaria CDT de C. difficile.
1.3.3 Endosporas y virulencia.
1.3.4 Capas superficiales y proteínas de la pared celular y virulencia.
1.3.5 Fimbrias, pilis y virulencia.
1.3.6 Flagelos y virulencia.
1.3.7 Proteína fijadora de fibronectina y virulencia.
1.3.8 Proteínas de choque térmico y virulencia.
1.3.9 Cepas hipervirulentas de reciente aparición.
1.3.9.1 Factores que explican la hipervirulencia del ribotipo 027.
1.4 Diagnóstico de la infección por C. difficile.
1.4.1 Manifestaciones clínicas.
1.4.2 Diagnóstico microbiológico de la infección por C. difficile.
1.5 Respuesta Inmune durante la infección por C. difficile.
1.5.1 Respuesta inmune protectora y patogénica durante la infección de C.
difficile.
1.5.2 Papel de la microbiota en la respuesta inmune y su relación en la infección
de C. difficile.
1.6 Factores de riesgo para la infección por C. difficile.
1.6.1 Factores de riesgo para la infección de C. difficile durante la
hospitalización.
1.6.2 Factores de riesgo para la infección de C. difficile adquirida en la
comunidad.
1.7 Colonización por C. difficile.
1.7.1 Concepto de estado colonización por C. difficile.
1.7.2 Epidemiología de la colonización de C. difficile.
1.7.3 Implicación clínica de la colonización de C. difficile.
1.8 Tratamiento de la infección por C. difficile: Terapia antibiótica convencional
y nuevas terapias alternativas.
1.8.1 Tratamiento antibiótico convencional frente a la infección por C. difficile.
1.8.1.1 Tratamiento antibiótico convencional frente a la infección de C. difficile en
un episodio inicial.
un caso fulminante.
1.8.1.3 Tratamiento antibiótico convencional frente a la infección de C. difficile
recurrente.
1.8.1.4 Resistencias de C. difficile al tratamiento antibiótico.
1.8.2 Terapias alternativas para el tratamiento de la infección de C. difficile.
1.8.2.1 Trasplante de Microbiota Fecal.
1.8.2.2 Inmunoterapia.
1.8.2.3 Terapias complementaria y alternativas.
1.9 Epidemiología de la infección por C. difficile.
1.9.1 Definiciones.
1.9.2 Epidemiología de la infección de C. difficile.
1.9.3 Medidas preventivas para la infección y transmisión de C. difficile.
1.10 C. difficile y su relación con la microbiota intestinal.
1.10.1 La microbiota intestinal y su relación con el estado de salud.
1.10.2 Resistencia a la colonización por C. difficile.
1.10.3 Alteraciones de la microbiota Intestinal en pacientes con infección de C.
difficile.
1.10.4 Alteraciones de la microbiota intestinal en pacientes portadores
asintomáticos de C. difficile.
Capítulo II: Justificación del estudio y objetivos.
Capítulo III: Hipótesis.
Capítulo IV: Material y Métodos.

4.1 Diseño del estudio.
4.1.1 Criterios de inclusión y de exclusión.
4.1.2 Inclusión de los pacientes en el estudio.
4.1.3 Características de los grupos de estudio.
4.1.4 Recogida y Almacenamiento de las muestras de heces.
4.2 Pruebas de laboratorio para el diagnóstico de los pacientes con CDI e
identificación de los individuos colonizados por C. difficile.
4.2.1 Determinación de TcdA/TcdB y GDH en heces.
4.2.2 Determinación de los genes tcdb y TPI de C. difficile.
4.3 Determinación metataxonómica de la composición de la microbiota
intestinal.
4.3.1 Extracción del ADN.
4.3.2 Amplificación y secuenciación del ADN.
4.3.3 Análisis bioinformático de las secuencias de amplicones del gen bacteriano
ADNr 16S y asignación taxonómica.
4.4 Expresión de resultados.
4.4.1 Estructura de las comunidades microbianas.
4.4.2 Estudio de la diversidad y riqueza de la microbiota intestinal.
4.4.2.1 Índices para cuantificar la alfa diversidad y riqueza.
4.4.2.1.1 Índice de Shannon.
4.4.2.1.2 Índice de Simpson.
4.4.2.1.3 Estimador CHAO1.
4.4.2.1.4 Estimador ACE (Abundance-based Coverage Estimator).
4.4.2.2 Representación gráfica de los índices de alfa diversidad y riqueza y
estudio de diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.
4.4.2.3 Curvas de rarefacción.
4.4.2.4 Índices para cuantificar la beta diversidad.
4.4.2.4.1 Índice de similitud de Jaccard.
4.4.3 Análisis Principal de Componentes (PCoA, Principal Component Analysis).
4.4.4 Análisis UniFrac.
4.4.5 Estudio de la composición de la microbiota intestinal.
Capítulo V: Resultados.
5.1 Lecturas por muestra.
5.2 Estudio de la diversidad y riqueza de la microbiota intestinal de los grupos
de estudio.
5.2.1 Índices de alfa diversidad de Shannon y Simpson.
5.2.2 Estimadores de riqueza.
5.2.3 Curvas de rarefacción.
5.2.4 Índice de beta diversidad de Jaccard.
5.3 Análisis Principal de Componentes.
5.4 Análisis UniFrac.
5.4.1 UniFrac Weighted.
5.4.2 UniFrac Unweighted.
5.5 Análisis de la composición de la microbiota intestinal.
5.5.1 Diferencias a nivel de phylum.
5.5.1.1 Diferencias a nivel de phylum entre los grupos CDI y CTRL.
5.5.1.2 Diferencias a nivel de phylum entre los grupos P y CTRL.
5.5.1.3 Diferencias a nivel de phylum entre los grupos CDI y P.
5.5.2 Diferencias a nivel de familia.
5.5.2.1 Diferencias a nivel de familia entre los grupos CDI y CTRL.
5.5.2.2 Diferencias a nivel de familia entre los grupos P y CTRL.
5.5.2.3 Diferencias a nivel de familia entre los grupos P y CDI.
5.5.3 Diferencias a nivel de género.
5.5.3.1 Diferencias a nivel de género entre los grupos CDI y CTRL.
5.5.3.2 Diferencias a nivel de género entre los grupos P y CTRL.
5.5.3.3 Diferencias a nivel de género entre los grupos CDI y P.
Capítulo VI: Discusión.

6.1 Alfa diversidad y riqueza en los grupos CDI y P con respecto a los controles
sanos.
6.2 Estudio de la beta diversidad en los grupos CDI, P con respecto a los
controles sanos.
6.3 Diferencias en la composición mediante el estudio de las abundancias
relativas entre los grupos CDI, P y CTRL a diferentes rangos taxonómicos.
6.3.1 Diferencias de composición a nivel de phylum.
6.3.1.1 Diferencias de composición a nivel de phylum entre los grupos CDI y
CTRL.
6.3.1.2 Diferencias de composición a nivel de phylum entre los grupos P y CTRL y
entre los grupos CDI y P.
6.3.2 Diferencias de composición a nivel de familia y género pertenecientes al
phylum Firmicutes entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
6.3.2.1 Diferencias de composición en los géneros de las familias Lachnospiraceae
y Ruminococcaceae entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
6.3.2.2 Diferencias de composición en los géneros de la familia Veillonellaceae
entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
6.3.2.3 Diferencias de composición en los géneros de la familia
Acidaminococcaceae entre los grupos CDI y P con respecto al grupo
CTRL.
6.3.2.4 Diferencias de composición en los géneros de la familia Streptococcaceae
6.3.2.5 Diferencias de composición en los géneros de la familia Enterococcaceae
6.3.2.6 Diferencias de composición en los géneros de la familia Lactobacillaceae
Peptostreptococcaceae entre los grupos CDI y P con respecto al grupo
CTRL.
Erysipelatrichaceae entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
phylum Bacteroidetes entre los grupos CDI y P con respecto al grupo
CTRL.
6.3.3.1 Diferencias de composición en los géneros de la familia Bacteroidaceae
6.3.3.2 Diferencias de composición en los géneros de la familia Tannerellaceae
6.3.3.3 Diferencias de composición en los géneros de la familia Prevotellaceae
6.3.3.4 Diferencias de composición en los géneros de la familia Rikenellaceae
6.3.3.5 Diferencias de composición en los géneros de la familia Barnesiellaceae
6.3.3.6 Diferencias de composición en los géneros de la familia Marinifilaceae
phylum Proteobacteria entre los grupos CDI y P con respecto al grupo
CTRL.
6.3.4.1 Diferencias de composición en los géneros de la familia Enterobacteriaceae
6.3.4.2 Diferencias de composición en los géneros de la familia Burkholderiaceae
phylum Actinobacteria entre los grupos CDI y P con respecto al grupo
CTRL.
6.3.5.1 Diferencias de composición en los géneros de la Familia Bifidobacteriaceae
phylum Verrucomicrobia entre los grupos CDI y P con respecto al grupo
CTRL.
6.3.6.1 Diferencias de composición en los géneros de la familia Akkermansiaceae
6.4 Visión global de los resultados.
Capítulo VII: Líneas de futuro.
Capítulo VIII: Conclusiones.
Capítulo IX: Limitaciones del estudio.
Capítulo X: Bibliografía.
LISTADO DE FIGURAS
FIGURA 1: Esquema de la transmisión de la infección y ciclo vital de C. difficile.
FIGURA 2: Microfotografías de cortes finos de secciones de diversas cepas de

esporas de C. difficile.
FIGURA 3: Principales estadios morfogénicos de la esporulación.
FIGURA 4: Esquema del proceso de germinación de las esporas de C. difficile.
FIGURA 5: Dominios proteicos funcionales y estructurales de TcdA y TcdB.
FIGURA 6: Mecanismo de acción de las toxinas de C. difficile esquematizado.
FIGURA 7: Esquema de los diferentes toxinotipos y sus diferencias con respecto a

la cepa de referencia VPI 10463.
FIGURA 8: Correlación de los toxinotipos y ribotipos en cepas productoras de la

toxina binaria CDT.
FIGURA 9: Mecanismo de acción de la toxina binaria CDT de C. difficile.
FIGURA 10: Pseudomenbranas en endoscopia.
FIGURA 11: Colonias de C. difficile.
FIGURA 12: Tinción de Gram de C. difficile.
FIGURA 13: Algoritmo diagnóstico de la CDI en 2 pasos.
FIGURA 14: Algoritmo diagnóstico de la CDI en 3 pasos.
FIGURA 15: Algoritmo diagnóstico de la CDI multinivel.
FIGURA 16: Interacciones Hospedador-C. difficile que provocan las respuestas

inmunes innatas.
FIGURA 17: Esquema de la colonización por esporas de C. difficile y las diferentes

posibilidades de progresión.
FIGURA 18: Distribución de los ribotipos más frecuentes en Europa durante 2012-
2013.
FIGURA 19: Distribución geográfica de los ribotipos de C. difficile encontrados en
el estudio multicéntrico de Davies.
FIGURA 20: Esquema de la perdida de la resistencia a la colonización durante la

disbacteriosis y su susceptibilidad al desarrollo de CDI.
FIGURA 21: Funcionamiento de una Sonda Fluorescente en FluoroCycler.
FIGURA 22: Ejemplo de curva de melting con dos picos para tcdb y TPI.
FIGURA 23: Ejemplo de curva de melting con un pico para TPI.
FIGURA 24: Nomenclatura IUPAC del Forward primer y Reverse primer utilizados
en la secuenciación del gen ADNr 16S bacteriano.
FIGURA 25: Ejemplo de Biplot construido mediante PCoA de dos dimensiones

que permite visualizar 4 subgrupos.
FIGURA 26: Diagrama de cajas del índice de Simpson a nivel del rango
taxonómico de género de los 3 grupos de estudio.
FIGURA 27: Diagrama de cajas del índice de Shannon a nivel del rango
FIGURA 28: Diagrama de cajas del estimador CHAO1 a nivel del rango
FIGURA 29: Diagrama de cajas del estimador ACE a nivel del rango taxonómico
de género de los 3 grupos de estudio.
FIGURA 30: Curva de rarefacción a nivel de género del grupo de controles sanos.
FIGURA 31: Curva de rarefacción a nivel de género del grupo CDI.
FIGURA 32: Curva de rarefacción a nivel de género del grupo P.
FIGURA 33: Curva de rarefacción a nivel de género con todos los grupos de
estudio.
FIGURA 34: Diagrama de cajas del índice de beta diversidad de Jaccard nivel del
rango taxonómico de género de los 3 grupos de estudio.
FIGURA 35: PCoA a nivel de género.

FIGURA 36: Porcentaje de las varianzas explicadas con cada uno de los
componentes principales obtenidos.
FIGURA 37: Análisis UniFrac Weighted para los 3 grupos de estudio.
FIGURA 38: Análisis UniFrac Weighted para los grupos CDI y CTRL.
FIGURA 39: Análisis UniFrac Weighted para los grupos P y CTRL.
FIGURA 40: Análisis UniFrac Unweighted para los 3 grupos de estudio.
FIGURA 41: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de phylum en los

grupos CDI y CTRL.

grupos P y CTRL.

grupos P y CDI.
FIGURA 44: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de familia en los

grupos CDI y CTRL mayoritarias.
FIGURA 45: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de familia en los

grupos P y CTRL mayoritarias.
FIGURA 46: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de Familia en los

grupos P y CDI mayoritarias.
FIGURA 47: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de los géneros

mayoritarios en los grupos CDI y CTRL.
FIGURA 48: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de los géneros

mayoritarios en los grupos P y CTRL.
FIGURA 49: Diferencias más importantes en las abundancias relativas a nivel de

género en los grupos P, CTRL Y CDI.
FIGURA 50: PCoA basado en distancias UniFrac Unweighted de pacientes con CDI
(CDI), individuos colonizados asintomáticos (AS) y controles sanos (CT) en el
estudio de Zhang y col.
FIGURA 51: PCoA basado en distancias UniFrac Unweighted de pacientes con CDI
(Grupo R, triangulo), pacientes con CDI sometidos a FMT (Grupo RF, círculo) y
donantes sanos (Grupo D, cuadrado) en el estudio de Brown y col.
FIGURA 52: PCoA basado en distancias UniFrac Unweighted en pacientes con CDI
(Grupo CDI, círculo azul), con administración antibiótica previa sin clínica
(Grupo AB+, cuadrado verde) y sin administración antibiótica previa sin clínica
(Grupo AB-, triangulo rojo) en el estudio de Milani y col.
FIGURA 53: Diferencias en las abundancias relativas (%) de los phylum en los
grupos CDI, AS y CT en el estudio Zhang y col.
LISTADO DE TABLAS
TABLA 1: Características clínicas y demográficas de los grupos de estudio.
TABLA 2: Read Counts por muestra en el grupo de pacientes con CDI.
TABLA 3: Read Counts por muestra en el grupo de individuos colonizados por C.

difficile.
TABLA 4: Read Counts por muestra en el grupo de controles sanos.
TABLA 5: Comparación de los Índices de Shannon y Simpson en el rango

taxonómico de género.
TABLA 6: Comparación de los estimadores de riqueza CHAO1 y ACE en el rango

TABLA 7: Comparación del índice de beta diversidad de Jaccard en el rango

TABLA 8: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de phylum entre los
grupos CDI y CTRL.
TABLA 9: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de phylum entre los
grupos P y CTRL.
TABLA 10: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de phylum entre
los grupos P y CDI.
TABLA 11: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de familia entre
los grupos CDI y CTRL.
TABLA 12: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de Familia entre
los grupos P y CTRL.
TABLA 13: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de género entre
los grupos CDI y CTRL dentro del phylum Firmicutes.
los grupos CDI y CTRL dentro del phylum Bacteroidetes.
TABLA 15: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de Género entre
los grupos CDI y CTRL dentro del phylum Proteobacteria.
los grupos P y CTRL dentro del phylum Firmicutes.
los grupos P y CTRL dentro del phylum Bacteroidetes.
los grupos P y CTRL dentro del phylum Proteobacteria.
los grupos CDI y P dentro del phylum Firmicutes.
los grupos CDI y P dentro del phylum Bacteroidetes.
los grupos CDI y P dentro del phylum Proteobacteria.
TABLA 22: Propiedades metabólicas de Lactobacillus característicos de humanos.

LISTA DE ABREVIATURAS
ACE: Abundance-based Coverage.
ADN: Ácido Desoxirribonucleico.
ADP: Adenosina difosfato.
AGCC: Ácidos grasos de cadena corta.
ARN: Ácido Ribonucleico.
BaiCD: Bile Acid 7α Dehydroxylase.
BSH: Bile Salt Hydrolase.
CAZYmes: Carbohidrate Active Enzymes.
CCNN: Ensayo de Citotoxicidad.
CdeC: Cysteine rich exosporium protein.
CDC: Centers for Diseases Control.
CDI: Clostridium difficile infection.
CDI-IC: CDI de inicio en la comunidad.
CDI-ICIH: CDI de inicio en la comunidad asociada a ingreso hospitalario previo.
CDI-IH: CDI de inicio hospitalario.
CDT: Toxina Binaria Clostridium difficile.
cdtA: gen CDT.
cdtb: gen CDT.
CMBD: Conjunto mínimo básico de datos.
CoA: Coenzima A.
CROPS: Combined Repetitive Oligopeptides.
CSPG4: Condroitín sulfato proteoglicano 4.
CWP: Cell wall proteins.

CXCL1: Chemokine (C-X-C motif) ligand 1.
CXCL5: C-X-C motif Chemokine 5.
EAEC: Escherichia coli difusamente adherente.
EAEC: Escherichia coli Enteroagregativa.
ECDC: European Center Diseases Control.
EIEC: Escherichia coli Enteroinvasiva.
EMA: European Medecines Agency.
EPEC: Escherichia coli Enteropatógena.
EPINE: Estudios de prevalencia de las infecciones nosocomiales en España.
ETEC: Escherichia coli Enterotoxigénica.
FDA: US Food and Drug Administration.
FFA2: Free faty acid receptor 2.
FFA3: Free faty acid receptor 3.
FMT: Fecal Microbiota Transplantation.
GDH: Glutamato Deshidrogenasa.
HMW: High molecular weight.
IDSA: Infectous Diseases Society of America.
IgA: Inmunoglobulina A.
IL10: Interleucina 10.
IL-1β: Interleucina 1β.
IL-23: Interleucina 23.
ILCs: Células Linfoides Innatas.

INP6: Inositol hexafosfato.
LAB: Lactic Acid Bacteria.
LCT: Large Clostridial Toxins.
LMW: Low molecular weight.
LSR: Lypolysis-Stimulated Lipoprotein Receptor.
MACs: Microbiota Accesible Carbohydrates.
MAPK: Mitogen activated protein kinase.
MLST: Multilocus Sequence Typing.
NAATs: Nucleic Acids Amplification Tests.
NAD: Nicotinamida difosfato.
NF-κB: Nuclear Factor Kappa B.
OTU: Operational Taxonomic Unit.
PaLoc: Locus de Patogenicidad.
PBS: Phosphate-Buffered Saline.
PC: Principal Component.
PC1: Principal Component 1.
PC2: Principal Component 2.
PCOA: Principal Coordinates Analysis.
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa.
PRRs: Pattern Recognition Receptors.
PUL: Polysaccharide Utilization Loci.
ROS: Reactive Oxygen Species.
SHEA: Society for Healthcare Epidemiology of America.
SLPs: S-layer proteins.

STEC: Escherichia coli productora de toxina Shiga.
TC: Cultivo Toxigénico.
tcdA: gen TcdA.
TcdA: Toxina A Clostridium difficile.
tcdB: geb TcdB.
TcdB: Toxina B Clostridium difficile.
TLRs: Toll-Like Receptors.
TNFα: Factor de necrosis tumoral Alfa.
TNFβ: Factor de necrosis tumoral Beta.
TPI: Triose phosphate isomerase.
VIH: Virus de la inmunodeficiencia humana.
VRE: Vancomycin Resistant Enterococci.
VTEC: Escherichia coli Verocitotoxigénica.
Xfp: Fructosa 6 fosfato fosfocetolasa.

I-INTRODUCCIÓN.
MARCO TEÓRICO.
CAPITULO I – INTRODUCCIÓN. MARCO TEÓRICO________________________
CAPITULO I. INTRODUCCIÓN. MARCO TEÓRICO.
En este capítulo introductorio me propongo establecer un amplio marco

teórico, basado en una exhaustiva revisión bibliográfica actualizada. Puede que
resulte excesiva para el lector, pero considero que es imprescindible repasar
determinados aspectos para alcanzar otros, especialmente para comprender la
justificación de estudio.
En esta tesis el protagonista es Clostridium difficile. Conocer sus

características estructurales, morfológicas, metabólicas y su asignación
taxonómica es un buen punto de partida. A continuación, trataremos de
esclarecer su ciclo vital, factores de virulencia, diagnóstico de la infección que
produce en humanos, la respuesta inmune que se establece durante la infección
por parte del hospedador, factores de riesgo para la infección, la posibilidad de
colonización asintomática, los posibles tratamientos, tanto convencionales como
las nuevas terapias, la epidemiología de la infección y por ultimo, la relación de
este germen con la microbiota intestinal.
1.1 ESTRUCTURA, FISIOLOGÍA Y METABOLISMO DE C. DIFFICILE.
C. difficle pertenece al phylum Firmicutes, clase Clostridia, orden

Clostridiales, familia Clostridiaceae (Peptostreptococcaceae) y género Clostridium
(Peptoclostridium, Clostridioides).
1.1.1 Generalidades del Género Clostridium.
El género Clostridium fue propuesto por primera vez en 1880 por

Prazmowski con Clostridium butyricum como especie tipo. Englobaba a un amplio
abanico de bacilos Gram positivos, anaerobios y formadores de esporas. No fue
hasta el desarrollo de las técnicas filogenéticas moleculares como el estudio del
gen ARNr 16S que se puso de manifiesto la gran diversidad de este género y sus
interrelaciones con otros tipos de bacterias. En 1994 M. D. Collins propuso la
38
primera revisión de la clase Clostridia a partir de la secuenciación del ARNr 16S y
estableció una estructura jerárquica. El grupo designado originalmente como
cluster I englobaba a la especie tipo Clostridium butyricum y similares y
actualmente es conocido como el cluster Clostridium Sensu Stricto (Collins, 1994;
Lawson, 2015) tras las reorganizaciones y ramificaciones de especies que
actualmente están incluidas bien en otros nuevos géneros, o bien en otros clusters
dentro del género Clostridium. De las 238 especies que originalmente se
englobaron dentro del cluster Sensu Stricto, actualmente quedan menos de 80
(Lawson, 2015). Las modificaciones pueden consultarse en la Jean Euzéby´s List of
Prokaryotic Names with Standing Nomenclature (http://www.bacterio.cict.fr/) que
está actualizada de forma mensual al publicarse las reorganizaciones filogenéticas
en el International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.
Actualmente el género Clostridium está constituido por bacilos

normalmente Gram positivos. Pueden presentar o no movilidad, pero si son
móviles es debido a filamentos peritricos. La mayor parte de sus especies son
capaces de producir endosporas de forma oval o esférica. La pared celular
normalmente contiene ácido mesodiaminopimélico. El contenido de ADN G+C
oscila de entre 22 y 53 mol % (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
Metabólicamente presenta mucha heterogenicidad. Suelen ser bacterias

quimiorganótrofas, aunque algunas especies son quimiolitótrofas o
quimioautotrófas. Son capaces de producir distintos ácidos orgánicos y alcoholes
a partir de carbohidratos o péptidos. Pueden presentar de forma excluyente o
conjunta un metabolismo glucolítico o proteolítico. Metabolizan carbohidratos
(pero no polisacáridos), alcoholes, aminoácidos, purinas y pirimidinas, esteroides
u otros componentes orgánicos, por tanto, pueden ser capaces de realizar
fermentación acética, propiónica, butírica, de alcoholes, aminoácidos y de purinas
y pirimidinas, incluyendo otras menos comunes. Algunas especies son capaces de
fijar el nitrógeno atmosférico. No es un género sulfato reductor. La mayor parte
de las especies del cluster Sensu Stricto producen ácido butírico como producto
principal de fermentación (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
39
Normalmente son especies catalasa negativas, aunque en algunas cepas
pueden detectarse trazas. Muchas especies son anaerobias estrictas, aunque su
tolerancia al oxigeno es variable. Algunas especies pueden crecer, pero no
esporular en presencia de oxígeno atmosférico (Bergey´s Manual of Systematic
Bacteriology, 2012).
Para muchas especies el crecimiento es más rápido a pH 6.5-7.0 y a

temperatura entre 30 y 37ºC (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
Actualmente hay 168 especies diferentes validadas (Bergey´s Manual of Systematic
Debido a su gran diversidad metabólica y a que solo unas pocas especies

son patógenas debido a la producción de toxinas, muchas de estas especies han
tenido aplicaciones biotecnológicas como la producción de enzimas, compuestos
bioquímicos y biocombustibles.
1.1.2 Estructura, Fisiología y Metabolismo de C. difficile.
C. difficile fue identificado por primera vez por E. O´Toole en 1935. Se le

puso ese nombre por su particular dificultad en el aislamiento y posterior estudio.
M. D. Collins evidenció que, filogenéticamente era distinto a un cualquier
Clostridium del cluster I y fue ubicado en el cluster XI, junto a Peptostreptococcus
anaerobius, otra bacteria de poder patógeno (Collins, 1994). La segunda y última
edición del Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology ya considera a muchas
especies del cluster XI dentro de la nueva familia Peptotostreptococcaceae, C. difficile
entre ellas. Presenta similitudes en el ARNr 16S entre el 94.7 y 95.4% con
Eubacterium tenue, Clostridium irregulare, Clostridium sordellii, Clostridium ghonii,
Clostridium lituseburense, Clostridium mangenotii y Clostridium bifermentans. Se ha
propuesto que se le cambie el nombre a Clostridoides difficile, dentro de un nuevo
género Clostridiodes del cluster XI (Lawson, 2016). Para no que no haya confusión,
y puesto que el nombre de C. difficile está mucho más difundido, en el presente
estudio se le llamará por su nombre clásico.
40
C. difficile es una especie formada por bacilos Gram positivos, anaerobios
estrictos, de dimensiones 0.5-1.9 x 3.0-16.9 µm. Presenta movilidad en caldo de
cultivo debido a la presencia de filamentos peritricos. Algunas cepas producen
cadenas de 2 a 6 células unidas de extremo a extremo. Es productor de esporas
ovales subterminales, raramente terminales. La esporulación en muchas cepas se
produce en Agar Sangre Brucella tras dos días de incubación Esta puede
estimularse mediante enriquecimiento con 0.1% de taurocolato sódico. La pared
celular contiene ácido mesodiaminopimélico, como es característico en el género.
Las colonias en Agar Sangre son típicamente de 2-5 mm, circulares,
ocasionalmente rizoides, planas o ligeramente convexas, opacas, grisáceas o
blanquecinas y su superficie puede ser mate o brillante. Todas las cepas producen
una fluorescencia verde pálida evanescente bajo luz ultravioleta tras 48 horas de
incubación en Agar Sangre Brucella enriquecido con hemina y vitamina K. La
temperatura óptima de crecimiento está entre 30-37 ºC, aunque puede crecer entre
25-45ºC. Se requieren para el crecimiento los aminoácidos prolina, ácido aspártico,
serina, leucina, alanina, treonina, fenilalanina, metionina e isoleucina. El
contenido en ADN G+C (mol%) es 28% (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology,
2012).
En Agua de Peptona muestra turbidez y aparece un fino sedimento con su

crecimiento. Presenta un pH ácido de 5.5-5.7 tras 5 días de incubación. También
aparece gas, hidrogeno, amonio y en algunas cepas ácido sulfhídrico. Los
productos orgánicos que aparecen en el Agua de Peptona y que nos indica las
rutas metabólicas fermentativas para la obtención de energía, incluyen el ácido
acético, isobutírico, butírico, isovalérico (una de las pocas especies que lo
produce), isocapróico (una de las pocas especies que lo produce), fórmico y
láctico. El pirúvico es transformado en butirato y acetato. La treonina es
convertida en propionato. Por tanto, utiliza rutas glucolíticas y proteolíticas. El
ácido láctico no se utiliza como sustrato. Ácido fenilacético, fenilpropiónico,
hidroxifenilacético, ácidos indolacéticos derivados y p-cresol se producen en el
medio Triptona Soja Agar con fenilalanina, tirosina y triptófano. El ácido
isocapróico es generado desde la leucina, isovalerato desde leucina e isoleucina e
isobutirato desde la valina (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
41
En algunas cepas puede detectarse los enzimas hialuronidasa, glucuronidasa
extracelular, condroitín sulfatasa y colagenasa (Bergey´s Manual of Systematic
Las pruebas indol, lecitinasa, lipasa, almidón hidrolizado y de reducción

del nitrato son negativas. La hidrolisis de la esculina es positiva (Bergey´s Manual
of Systematic Bacteriology, 2012).
No es capaz de fermentar amigdalina, arabinosa, galactosa, glucógeno,

inositol, inulina, lactosa, maltosa, melibiosa, rafinosa, ramnosa, ribosa, almidón,
sacarosa. Por el contrario, la mayor parte de cepas es capaz de utilizar la fructosa
y el manitol y manosa. El uso de celobiosa, salicina, sorbitol, trealosa y xilosa es
pobre, solo produce débiles reacciones (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology,
2012).
C. difficile presenta una serie de reacciones importantes que le permiten su

supervivencia intestinal. El ácido p-hidroxifenilacético es transformado por la p-
hidroxifenilacético descarboxilasa en p-cresol, un compuesto de poder
bacteriostático que le proporciona una ventaja competitiva frente a otros
microorganismos de la microbiota intestinal. Es también capaz degradar la
etanolamina, constituyente de los fosfolípidos provenientes de la dieta del
hospedador, y utilizarla como fuente de carbono y nitrógeno (Bergey´s Manual of
Systematic Bacteriology, 2012).
1.2 CICLO VITAL DE C. DIFFICILE: ESPORULACIÓN Y GERMINACIÓN.
1.2.1 Esporulación de C. difficile.
C. difficile presenta la capacidad de formar esporas y del morfotipo de esta

espora latente, variable según la cepa, va a depender su patogenia, ya que su
forma vegetativa es de naturaleza anaeróbica y eso le imposibilita sobrevivir en
ambientes aeróbicos (Paredes-Sabja, 2014). Por tanto, para transmitir la infección,
es imprescindible la presencia de esporas capaces de tolerar el oxígeno (Deakin,
2012).
42
Durante el curso de la enfermedad se va a iniciar la secuencia de
esporulación que culmina en la generación de una espora latente, permitiendo a
C. difficile persistir en el hospedador y su diseminación al medio ambiente. Es por
ello la elevada tasa de recurrencias de la infección y la elevada transmisión en
ambientes hospitalarios. Las cepas incapaces de formar esporas no pueden
persistir en el intestino del hospedador y ser transmitidas horizontalmente
(Deakin, 2012). La desinfección ambiental del ámbito hospitalario va a resultar
clave para el control de la infección (Ali, 2011). Recientemente, se ha especulado
que la transmisión de las esporas podría ser también zoonótica, puesto que
numerosos estudios han mostrado que esporas provenientes de cepas toxigénicas
pueden encontrarse en animales domésticos (Rodríguéz, 2016)
Esquemáticamente y de manera resumida el ciclo infectante o de

colonización intestinal de C. difficile comienza con la ingestión de sus esporas,
resistentes al ambiente ácido gástrico y capaces de llegar al colon. Si se dan las
circunstancias adecuadas, como la presencia de sustancias germinantes y un
nicho ecológico adecuado (una disrupción de la microbiota intestinal), la espora
es capaz de transformarse en su forma vegetativa. Si la forma vegetativa prolifera
y se asienta, se produce una cantidad de toxinas específicas que son la principal
causa de la clínica, que abarca un espectro que puede ir desde una diarrea leve o
moderada hasta una colitis pseudomembranosa letal. Además, durante la
infección se inicia el proceso de esporulación en una subpoblación de la forma
vegetativa (Koenigsknecht, 2015), produciéndose una gran cantidad de esporas
que son emitidas al exterior a través de las heces (Barra-Carrasco, 2014).
En modelos murinos se ha observado qué tras la inoculación de esporas por

vía oral, las primeras formas vegetativas aparecían en el colon del ratón a las 6
horas, indicando que la germinación de las esporas ocurre antes de este tiempo. A
las 24 horas ya se detectaron por primera vez esporas en el colon (Koenigsknecht,
2015). Sabiendo que el proceso de la esporulación in vitro dura 9 horas, se dedujo
que la esporulación comenzaría a las 15 horas después de la infección (Pereira,
2013).
43
Es importante conocer los detalles de los procesos de esporulación,
germinación e interactuación con superficies celulares, para poder incidir a nivel
de la transmisión de la enfermedad, a nivel de la inhibición de la enfermedad. La
inhibición de la esporulación puede ser un mecanismo de acción para el
desarrollo de nuevas dianas terapéuticas, si bien el estudio de este proceso no se
conoce al detalle.
FIGURA 1: Esquema de la transmisión de la infección y ciclo vital de C. difficile. (Seekatz,

2014).
1.2.2 Estructura de la espora de C. difficile.
Las esporas de C. difficile, al igual que las de otros gérmenes productores,

son resistentes a muchos antibióticos, incluso metronidazol o vancomicina (Rineh,
2014) y al sistema inmune del hospedador, produciendo incluso un efecto
citotóxico en los macrófagos que las fagocitan (Paredes-Sabja, 2012a). Fuera del
organismo, son resistentes a la mayoría de los desinfectantes usados en el ámbito
44
hospitalario, tipo alcohol o compuestos de amonio cuaternarios (Ali, 2011). Por el
contrario, son sensibles al hipoclorito sódico.
La mitad de los pacientes que han padecido infección por C. difficile (CDI) y
han sido tratados y se han recuperado, aún emiten esporas hasta 4 semanas
después de la infección (Sunkesula, 2013).
Su estructura le concede una resistencia única. La parte central es el core,

donde está contenido el ADN de la espora, así como su ARN y la mayoría de sus
enzimas. Es el bajo contenido en agua lo que le confiere en parte su resistencia,
además de la presencia de ácido dipicolínico quelado con calcio y la protección de
su material genético mediante la saturación del ADN con proteínas α/β-SASP
(Setlow, 2007).
El core está rodeado por la membrana interna, que tiene un contenido

fosfolipídico similar al de su forma vegetativa pero una baja permeabilidad a las
moléculas pequeñas, incluyendo el agua (Cowan, 2004). Esto constituye otro
mecanismo de protección.
Rodeando a la membrana interna está la pared celular, que formará parte de

la estructura celular de la forma vegetativa naciente, y después de esta tenemos el
córtex, una gruesa capa de peptidoglicano con alguna modificación con respecto
al peptidoglicano clásico que se encuentra en la pared celular del resto de
bacterias. En este caso cada segundo residuo de ácido murámico ha sido
transformado en ácido murámico-δ-lactamo. Estos residuos durante el proceso de
germinación son reconocidos específicamente por enzimas líticos que hidrolizan
el córtex, pero no la pared celular (Paredes-Sabja, 2011).
El córtex está rodeado por una membrana externa, derivada de la célula

madre de la que proviene, que es clave en el proceso de formación de la espora,
pero que no le confiere resistencia. Después está la cubierta, de naturaleza
proteica, que le confiere protección frente agentes oxidantes y enzimas. Por
último, como capa más externa tenemos el exosporium, también de naturaleza
proteica.
45
FIGURA 2: Microfotografías de cortes finos de secciones de diversas cepas de esporas de

C. difficile. (Paredes-Sabja, 2014).
El exosporium tiene la capacidad de interactuar de forma muy eficaz con

receptores de las células intestinales epiteliales, pero su rol en la infección todavía
no está bien descrito (Paredes-Sabja, 2012b). Su morfología es dependiente del
tipo de cepa, pudiendo tener que ver en la virulencia de éstas (Paredes-Sabja,
2014). Se ha visto incluso que algunas cepas no poseen exosporium. Presenta unos
filamentos que tienen función de adherencia sobre la célula intestinal epitelial
(Paredes-Sabja, 2012b). También se sabe que es rico en la proteína CdeC (cysteine-
rich exosporium protein), con capacidad de unirse a anticuerpos, siendo esencial
para el correcto ensamblaje. Además, confiere a la espora resistencia al etanol, al
calor y la lisozima (Barra-Carrasco, 2013). Tiene la particularidad, a diferencia de
Bacillus subtilis, que está en contacto directo con la cubierta, es decir, no existe una
zona interespacial entre ellos.
1.2.3 Formación de la espora de C. difficile.
Los mecanismos moleculares que inician el proceso de esporulación no

están bien establecidos. El limitado conocimiento está basado en comparaciones
con otras bacterias formadoras de esporas como B. subtilis (Fimlaid, 2013). Aun
así, hay diferencias sustanciales con este paradigma. De hecho, solo el 25% de las
proteínas de la cubierta de la espora de C. difficile y B. subtilis son homólogas, lo
46
que dificulta realizar extrapolaciones (Henriques, 2007). Como en otros
Clostridium, el inicio de este proceso está regulado por varias histidina quinasas
(CD1352, CD1492, CD1579, CD1949 y CD2492), las cuales, a partir de ciertos
estímulos ambientales, presentan la capacidad de fosforilar el gen regulador
transcripcional Spo0A. Spo0A es el elemento regulador maestro que desencadena
los cambios morfogénicos precisos para que comience la esporulación. En
estudios in vivo se ha visto que las histidina quinasas a las 4 horas después de la
infección ya no están sobrexpresadas, permaneciendo constantes durante la
infección o bien estando solo sobrexpresadas durante las 4 primeras horas (Janoir,
2013). El mecanismo mediante el cual fosforilan a Spo0A es desconocido, a
diferencia de lo que ocurre en B. subtilis. La regulación del proceso de
esporulación es debida a una secuencia de reacciones de activación de los factores
sigma de la ARN polimerasa, específicos del proceso de esporulación: σF, σE, σG
y σK. Si bien estos factores también coinciden en B. subtilis y podría pensarse que
actúan de forma igual en C. difficile, hay diferencias notables en las funciones de
cada uno de ellos. Al contrario que en B. subtilis, σF es necesario para la activación
post traduccional de σK, σE es indispensable para la activación de σG, σG es
indispensable para la activación de σK y σK no sufre ninguna activación
proteolítica (Fimlaid, 2013). Además, la activación de los factores sigma durante la
fase de esporulación de C. difficile no está regida por las mismas señales
morfológicas que se observan en B. subtilis y tampoco siguen el mismo patrón
temporal (Fimlaid, 2013).
En B. subtilis la formación de las esporas comienza en la transición de la fase

de crecimiento exponencial a la fase estacionaria (estadio 0). En este punto la
expresión génica prima dar soporte a la esporulación más que al crecimiento
vegetativo. El estadio 0 se establece cuando se produce la activación post
traduccional del factor de transcripción Spo0A, el cual estimula la sobreexpresión
de genes relacionados con la esporulación y sirve como elemento regulador de la
esporulación. En C. difficile el proceso es el mismo, pero no así lo que lo inicia, ya
que, en este caso, como hemos visto, se debe a la fosforilación del Spo0A por
varias histidina quinasas y posiblemente por otros factores.
47
Como en la mayoría de las bacterias formadoras de esporas, el primer
evento morfológico es la formación y aparición de un septum polar, que da lugar
a un pequeña protoespora y a una célula madre todavía más grande. Después le
sigue el aprisionamiento de la protoespora por parte de la célula madre, que
también promueve la formación del córtex, cubierta y exosporium, hasta dar
lugar a la espora latente. Se sabe que el gen SpoIVA es esencial para conseguir la
localización de la cubierta rodeando la protoespora, siendo no necesario para la
formación del córtex, como en B. subtilis (Putnam, 2013).
FIGURA 3: Principales estadios morfogénicos de la esporulación. Abreviaciones: MC,

Célula Madre; FS, Protoespora. (Paredes-Sabja, 2014).
1.2.4 Germinación de C. difficile.
La germinación de las esporas de C. difficile fue evidenciada hace más de 30

años, cuando se demostró que el ácido biliar taurocólico era un potencial
germinante in vivo (Wilson, 1985). El siguiente hallazgo importante que se
evidenció hace 10 años fue que los ácidos biliares derivados del ácido cólico eran
activadores de la germinación cuando se combinaban con glicina u otros
aminoácidos cogerminantes, mientras que los derivados del ácido
quenodesoxicólico son inhibidores de forma competitiva de la germinación (Sorg,
2008). Esto se complementó con otro estudio del mismo autor en el que se
comprobó que el ácido taurocólico era el germinante derivado del ácido cólico
más potente y rápido, pero, sin embargo, la afinidad de la espora era mayor por el
ácido quenodesoxicólico (Sorg, 2010).
El estudio de la germinación de las esporas de C. difficile, su mecanismo de

activación, la cascada de reacciones que se producen y los factores que la afectan
es clave para estudiar su posible modulación e inhibición y para comprender el
48
efecto de la microbiota intestinal sobre ella. Además, como en la esporulación,
existe una variabilidad de activación de la germinación dependiente de la cepa.
1.2.4.1 Regulación de la germinación de las esporas de C. difficile.
La germinación de las esporas de C. difficile comienza cuando los

germinantes se unen a sus receptores específicos (Paredes-Sabja, 2014). Al igual
que con el estudio de la esporulación, el conocimiento del mecanismo de
germinación se ha obtenido por extrapolación con otras bacterias de genero
Bacillus y otros Clostridiales. Aun así, existen aspectos que todavía hoy se
desconocen y se siguen investigando. También, como en la esporulación, existen
diferencias en puntos críticos, lo que convierte su mecanismo de germinación en
único.
La unión de los germinantes a su receptor específico provoca una serie de

sucesos como la salida masiva del dipicolinato cálcico desde el core, la hidrólisis
del córtex y la hidratación del core (Paredes-Sabja, 2014).
La mayoría de las bacterias formadoras de esporas presentan receptores

sensibles a aminoácidos germinantes en la membrana interna como GerAA,
GerAB y GerAC. C. difficile carece de estos receptores (Paredes-Sabja, 2011). En
lugar de ello, utiliza una pseudoproteasa tipo subtilisina CspC, que es un receptor
no convencional sensible a ácidos biliares derivados del ácido cólico como el
ácido taurocólico (Francis, 2013), mediante un mecanismo en parte desconocido.
Así mismo, la glicina sirve como cogerminante, es decir, potencia la germinación
también mediante un mecanismo desconocido (Sorg, 2008).
Para proceder a realizar la proteólisis del córtex, C. difficile utiliza la

hidrolasa SleC (Buns, 2010), pero a diferencia de B. subtilis, que utiliza dos
hidrolasas redundantes, SleB y Cwij, ésta es activada mediante proteólisis previa
ya que se encuentra de forma inactiva como el zimógeno Pro-SleC en las esporas
maduras (Adams, 2013). En B. subtilus la activación de las hidrolasas del córtex
ocurre con la salida del dipicolinato cálcico desde el core, que se produce como
consecuencia de la unión del germinante a su receptor. El proceso de salida del
49
dipicolinato cálcico del core en las esporas de C. difficile ocurre de forma similar a
B. subtilis, con la unión de los germinantes a su receptor (Francis, 2009), pero
previamente debe activarse la hidrólisis del córtex (Wang, 2015). En dicho proceso
de salida del dipicolinato cálcico intervienen spoVAC, spoVAD, y spoVAE
(Donnelly, 2016). Sabiendo que en B. subtilus, SpoVAC tiene propiedades
mecanosensibles, se ha propuesto que la degradación previa del córtex podría
permitir la apertura de canales o poros, mediante la expansión de SpoVAC en
respuesta a la disminuida presión osmótica del exterior con respecto al core
(Francis, 2016). Este mecanismo implicaría que no intervienen otros factores.
Incluso si en el ambiente exterior donde la espora está germinando existiera una
osmolaridad mayor o igual que la del core podría verse afectada la salida de
dipicolinato cálcico, pero no la hidrólisis del córtex.
Como hemos visto, SleC experimenta proteólisis por unas proteasas de la

familia CsP, pero a diferencia de B. subtilis, en C. difficile, CspC y CspA son
pseudoproteasas, es decir su capacidad catalítica no es completa. Por otra parte,
CspB se fusiona a un dominio catalíticamente inactivo de CspA, aunque esta
fusión CspBA experimenta un procesado interdominio durante la formación de la
espora (Adams, 2013). No se conoce con exactitud el papel de CspA en la
germinación, pero recientemente se ha evidenciado que regula los niveles del
receptor germinante CspC en esporas maduras, y que la proteasa YabG libera a
CspB del domino CspA (Kevorkian, 2016). La actividad de la proteasa CspB está
controlada por la pseudoproteasa CspC (Francis, 2015). De forma general todas
estas proteasas juegan un papel clave en el proceso de germinación.
Recientemente se ha puesto de manifiesto el papel del calcio intestinal en el

mecanismo de germinación, que podría explicar que los pacientes con absorción
intestinal de calcio ineficiente, debido a déficit de vitamina D o al uso prolongado
de fármacos inhibidores de la bomba de protones, tengan mayor predisposición a
la enfermedad por C. difficile (Kochan, 2017). En un modelo murino se puso de
manifiesto que el calcio es capaz de activar CspB y este puede ser de origen
endógeno o exógeno. El calcio endógeno saliente desde el core en respuesta al
ácido taurocólico conjugado con la glicina puede servir como señal de
germinación al activar la hidrólisis del córtex, de manera que se ha propuesto que
50
in vivo, la germinación podría ocurrir debido al efecto sinérgico de la glicina, los
ácidos biliares y el calcio. El efecto de la glicina sería facilitar la salida del calcio
desde el core. De esta manera la germinación requiere calcio, que podría ser
proporcionado desde el exterior de la espora o bien desde el interior. Por tanto,
restringir el calcio libre intestinal podría ser una nueva diana terapéutica o
profiláctica, para tratar o prevenir la infección por C. difficile.
También se ha propuesto una ruta de germinación espontánea, pero en

recientes estudios se ha evidenciado que su frecuencia es muy variable, y se
desconoce los factores que la modulan (Kevorkian, 2017). La germinación
espontánea es un mecanismo común en las bacterias formadoras de esporas, pero
dada la especial naturaleza anaerobia estricta de C. difficile, es fácil pensar que sea
prácticamente inexistente, por cuestiones de optimización de la viabilidad.
51
FIGURA 4: Esquema del proceso de germinación de las esporas de C. difficile. (Kochan,

2017).
1.2.4.2 Germinación de C. difficile y su relación con el metabolismo de los ácidos

biliares en el hospedador.
Los ácidos biliares son los germinantes de las esporas de C. difficile y su

presencia en el tracto intestinal juega un papel clave en su colonización y
patogénesis. Los ácidos biliares derivan del colesterol y son sintetizados en el
hígado. Los ácidos biliares primarios son el ácido cólico y quenodesoxicólico, que
después son conjugados con taurina o glicina. Son secretados en el duodeno en
respuesta a la ingesta y la mayor parte (95%) son reabsorbidos en el íleo terminal
y devueltos al hígado mediante la circulación enterohepática. Los ácidos biliares
primarios que llegan al intestino grueso (5%), son biotransformados en ácidos
biliares secundarios mediante enzimas secretados por la microbiota intestinal de
forma específica, interviniendo dos tipos de reacciones, desconjugación y
52
deshidroxilación. Los ácidos biliares secundarios más abundantes son el ácido
desoxicólico, litocólico y ursodesoxicólico.
Las esporas de C. difficile requieren de forma específica ácidos biliares

primarios y aminoácidos como la glicina para la germinación. Los estudios (in
vitro e in vivo) muestran que la disminución de bacterias que tienen dotación
enzimática para obtener ácidos biliares secundarios genera una disminución de la
resistencia a la infección (Buffie, 2015). Además, los ácidos biliares secundarios
inhiben también el crecimiento y la actividad y cantidad de las toxinas causantes
de la clínica (Thanissery, 2017). Como en los procesos de germinación y
esporulación, el proceso inhibitorio es variable en función de la cepa.
En el intestino grueso los ácidos biliares secundarios inhibidores son

absorbidos a velocidades diez veces mayores que los ácidos biliares primarios
germinantes, dando lugar a una abundancia de germinantes en el entorno del
colon. En sujetos sanos con una microbiota intestinal normal, los ácidos biliares
primarios germinantes, son rápidamente desconjugados por ciertos grupos de
bacterias, reduciendo su abundancia relativa y la probabilidad de germinación de
las esporas de C. difficile (Sarker, 2012).
En estudios donde se observa la restauración de la microbiota intestinal en

pacientes con CDI antes y después a un trasplante fecal (FMT, Fecal Microbiota
Transplantation) se ha evidenciado que la composición y cantidad de ácidos
biliares son totalmente diferentes en ambas situaciones. La presencia de una carga
elevada de ácidos biliares primarios y conjugados en muestras “pre FMT” sugiere
su hidrolisis incompleta (Weingarden, 2014). El ácido taurocólico está muy
aumentado en muestras previas al FMT y el litocólico y otros ácidos biliares
secundarios muy disminuidos, y viceversa en muestras “post FMT”.
En modelos murinos, la administración de antibióticos y la posterior

colonización de C. difficile está asociado a alteraciones en el perfil normal de los
ácidos biliares intestinales, concretamente con una disminución de ácidos biliares
secundarios y un aumento de ácidos biliares primarios (Theriot, 2014).
53
1.2.4.3 Impacto de los ácidos biliares secundarios provenientes de la microbiota
intestinal en la resistencia a la colonización de C. difficile.
La microbiota intestinal aporta dos enzimas que transforman los ácidos

biliares primarios germinantes de C. difficile; BSH (Bile Salt Hydrolase) y BaiCD
(Bile-acid 7α-dehydroxylase). BSH hidroliza los ácidos biliares conjugados en ácidos
biliares libres. BaiCD es capaz de transformar los ácidos biliares primarios en
secundarios. Las bacterias cuyo genoma codifique estos enzimas producirían un
efecto inhibitorio sobre la germinación de las esporas de C. difficile. Perder estos
grupos supone una pérdida de resistencia a la colonización y germinación.
La desconjugación de los ácidos biliares primarios conjugados por BSH

secretada extracelularmente ocurre muy rápidamente. Estudios metagenómicos
han mostrado que los tres principales phylum que poseen BSH son Firmicutes
(30%), Bacteroidetes (14,4%) y Actinobacteria (8,9%) (Jones, 2008). Por tanto, está
ampliamente distribuida en muchos géneros como Clostridium, Bacteroides,
Lactobacillus, Bifidobacterium y Enterococcus.
Por el contrario, BaiCD se encuentra presente en escasos grupos de

bacterias que representan menos del 0,025% de la microbiota intestinal normal
(Winston, 2016), principalmente dentro del phylum Firmicutes en los géneros
Clostridium (Clostridium hiranonis, Clostridium hylemonae, Clostridium sordelli,
Clostridium absonum y Clostridium scindens) y Eubacterium (Buffie, 2015). La
reacción es más compleja que la de BSH, requiriendo múltiples pasos
intracelulares.
C. G. Buffie en 2015 encontró 11 grupos de bacterias que correlacionaron

con una resistencia a la infección, en un estudio donde se comparó la microbiota
intestinal de 12 portadores asintomáticos de C. difficile y 12 pacientes con CDI, en
pacientes hematológicos receptores de trasplante de médula ósea que recibieron
terapia antibiótica. Mediante un modelo matemático y mediante estudios
metabolómicos investigaron que mecanismo inhibitorio de infección subyace.
Los grupos encontrados constituyeron un 6% de la microbiota intestinal normal y
principalmente estuvieron comprendidos en el cluster Clostridium XIVa,
54
incluyendo C. scindens, donde se encontró la correlación más potente. C. scindens
sintetiza enzimas para la síntesis de ácidos biliares secundarios (BaiCD), muy
poco comunes en las bacterias intestinales. Los autores conclyueron que esta vía
metabólica tan rara era la que confiería está capacidad de resistencia a la infección
(Buffie, 2015). También aparecieron bacterias del género Blautia, Eubacterium o
Pseudoflavonifractor.
El género Bacteroides se ha puesto de manifiesto que también presenta una

correlación negativa con el desarrollo de CDI, en estudios donde se observa la
restauración de la microbiota intestinal en pacientes con CDI sometidos a FMT
(Shahinas, 2012). En estudios in vitro se ha puesto de manifiesto que Bacteroides
ovatus es capaz de inhibir el crecimiento de C. difficile al actuar sobre el
metabolismo de los ácidos biliares (Yoon, 2017). Bacteroides Ovatus no expresa
BaiCD pero si BSH que disminuye la reabsorción de los ácidos biliares
desconjugados en el intestino delgado, de manera que puede inhibir el
crecimiento de C. difficile y ejercer un efecto sinérgico en otras bacterias que
aporten actividad BaiCD.
La disbacteriosis que se genera de forma secundaria a un tratamiento

antibiótico, conduce a un descenso en el metabolismo de los ácidos biliares
germinantes en el intestino grueso y a una rápida absorción de los ácidos biliares
inhibidores, produciendose un desesquilibrio entre los procesos de inhibición y
germinación de las esporas de C. difficile, aparte de una perdida de resistencia a la
colonización mediante otros mecanismos, que serán desarrollados en otros
apartados. Por otra parte, se ha visto que extractos de intestino delgado de
ratones no tratados con antibióticos son capaces de inducir la germinación, pero,
ratones tratados con antibióticos generan una germinación de tres a diez veces
más potente. También se ha evidenciado que extractos de ciego de ratones
tratados con antibióticos generan una germinación treinta veces más potente
(Sorg, 2010). De forma global, todas estas observaciones indican que el
tratamiento antibiótico potencia la germinación de las esporas de C. difficile en el
intestino delgado con una reducción simultánea de los niveles de ácidos biliares
secundarios inhibitorios en el intestino grueso.
55
1.3 FACTORES DE VIRULENCIA DE C. DIFFICILE.
Debido a la la particular diversidade genética de C. difficile, los factores de

virulencia, es especial sus toxinas, son puntos básicos para compreender las
manifestaciones clínicas y la severidad de la la infección-
1.3.1 C. difficile, Diversidad Génica y Virulencia.
C. difficile es una especie que presenta una particular gran diversidad

genética, lo que hace que existan más de 600 ribotipos circulantes con
propiedades de virulencia de transmisibilidad y de especificidad de hospedador
diferentes. Un ribotipado eficiente va a resultar esencial para su análisis
epidemiológico y para asociar los diferentes subtipos sus características
singulares.
Actualmente, la técnica de ribotipado basada en los diferentes patrones de

bandas obtenidas al amplificar regiones intergénicas del ADNr 16S-23S de C.
diffiicle (Knetsch, 2013), es la más utilizada. No obstante, el Gold Standard para
estos estudios es el MLST (Multilocus Sequence Typing).
La primera descripción del genoma completo de C. difficile fue realizada en

2006 (Sebaihia, 2006). A continuación, mediante hibridación genómica comparada
combinada con microarrays se observaron las diversidades genéticas existentes en
las diferentes cepas en cuanto a especificidad de hospedador, origen filogenético
o virulencia (Stabler, 2006).
Utilizando todas estas técnicas de forma combinada se ha podido

comprobar que la evolución de C. difficile ha dado lugar a diferentes linajes
evolutivos. Actualmente, se definen 6 ramas filogenéticas designadas del 1 al 5 y
otra llamada C-1 (Janezic, 2015). 5 ramas (de la 1 a la 5) presentan cepas
toxigénicas y en 3 de ellas (1, 4 y 5) se combinan con cepas no toxigénicas. La
rama C-1 solo presenta cepas no toxigénicas.
56
Dichas ramas filogenéticas correlacionan exactamente con los diferentes
ribotipos existentes. La rama 1 es el grupo más heterogéneo. Pertenecen a esta
rama ribotipos como el 001, 012 y 014, siendo el 014 y el 001 el primero y segundo
más prevalentes en Europa y el 012 el octavo (Bauer, 2011). La rama 2 presenta al
ribotipo 027, un ribotipo hipervirulento de reciente aparición, que ha causado
diferentes brotes con gran severidad sobre todo en Estados Unidos, Canadá y
Reino Unido. Dentro de la rama 3 el ribotipo más prevalente es el 023, un ribotipo
que expresa la toxina binaria CDT y que es de los 15 ribotipos más prevalentes en
Europa (Bauer, 2011). La rama 4 también es conocida como rama A-B+ e incluye al
ribotipo 017, de los más predominantes en Asia y también presente en Europa
(Bauer, 2011). La rama 5 contiene al ribotipo 078 que desde hace pocos años se ha
demostrado que causa CDI en humanos cuando históricamente siempre se había
encontrado en animales. La rama C-1 solo contiene ribotipos no toxigénicos.
1.3.2 Toxinas y Virulencia.
1.3.2.1 Estructura y mecanismo de acción de las toxinas TcdA y TcdB de C.

difficile
La producción de las exotoxinas TcdA y TcdB son el mayor factor de

virulencia que presenta de C. diffile. TcdA y TcdB pertenecen a la familia de las
toxinas LCT (Large Clostridial Toxins), un grupo de proteínas homologas de alto
peso molecular que incluye las toxinas hemorrágicas de Clostridium sordellii (TcsL
y TcsH), la α toxina de Clostridium novyi (Tcnα) y la citotoxina de Clostridium
perfringens (TpeL). TcdA y TcdB tienen una similitud del 66% en cuanto a sus
aminoácidos, lo que sugiere que pueden provenir de una duplicación génica (Von
Eichel-Streiber, 1992). Comparten múltiples dominios conservados, incluyendo
un dominio catalítico glucosiltransferasa localizado en el extremo N-terminal, y
un dominio cisteína proteasa que es requerido para su autoprocesado y posterior
liberación del anterior dominio catalítico al citosol en las células infectadas.
Además, presenta un dominio hidrofóbico que actúa en la formación del poro y la
introducción posterior de las toxinas en la membrana endosomal previamente a
su salida al citosol. El extremo C-terminal consiste en una serie de repeticiones de
oligopéptidos (CROPS, Combined Repetitive Oligopeptides) que interactúan con
57
receptores no identificados de las células diana (Awat, 2014). Estos dominios se
encuadran en dos subunidades A y B. La subunidad A está constituida por el
dominio glicosiltransferasa N-terminal, mientras que la subunidad B por el
dominio CROPS, el dominio cisteína proteasa y el dominio hidrofóbico formador
de poros.
FIGURA 5: Dominios proteicos funcionales y estructurales de TcdA y TcdB.

(Chandrasekaran, 2017).
Los efectos de la intoxicación de las células diana con TcdA y TcdB ha sido
explicada mediante el modelo ABCD (A: Biological, B: Binding, C: Cutting, D:
Delivery). El primer paso es el reconocimiento y unión del extremo C-terminal a
las células diana. Esto se ha asociado a la intervención del dominio CROPS del
extremo C-terminal para TcdB, pero los receptores de las células intestinales no
han sido identificados para la toxina TcdA. Para TcdB recientemente se ha
identificado al CSPG4 (Condroitín Sulfato Proteglicano 4) (Yuan, 2015) y la
nectina 3 (LaFrance, 2015) como receptores, aunque este último se une a TcdB
mediante un dominio distinto al CROPS. La nectina 3 se expresa en la superficie
del epitelio del colon pero CSPG4 no. Por contra, está muy expresado en los
miofibroblastos subepiteliales. Durante la infección es probable que TcdB
interactúe con la nectina 3 para intoxicar el epitelio del colon y después, al
dañarse las uniones intercelulares, pueda tener acceso a CSPG4 de los
miofibroblastos subepiteliales intestinales más profundos.
El proceso de reconocimiento desencadena la endocitosis de las toxinas

mediante un mecanismo no establecido, clatrina y dinamina-dependiente, que
permite la internalización de las toxinas a endosomas de la célula diana. La
dinamina es una GTPasa que facilita la escisión y salida de las nuevas estructuras
endosómicas desde la membrana plasmática al citosol. No obstante, TcdB usa
preferentemente la ruta de la clatrina para internalizarse en forma de vesículas
58
(Chandrasekaran, 2017). Por tanto, a pesar de su homología, TcdB y TcdA usan
vías de internalización y reconocimiento presumiblemente diferentes. La
acidificación de los endosomas genera cambios conformacionales en las toxinas
conduciendo a la formación previa de una protrusión, que termina en la
formación de poros en la membrana del endosoma, debido a la exposición de
regiones hidrofóbicas.
Las toxinas liberadas al citosol, a través del poro formado, se unen al INP6
(inositol hexafosfato), el cual induce otro cambio conformacional en las toxinas en
el dominio cisteína proteasa que conduce a un autoprocesado catalítico en una
región situada entre este dominio y el glicosiltransferasa. Este paso produce que
se descubra la forma activa del dominio N-terminal glicotransferasa en el citosol
de la célula diana. Aunque TcdA y TcdB comparten el mismo mecanismo de
activación INP6-dependiente, la escisión no es equivalente entre ambas puesto
que TcdB resulta es más sensible que TcdA in vitro (Kreimeyer, 2011). Es
importante recalcar que la modulación de este autoprocesado puede afectar a la
virulencia de las toxinas en la célula diana. No obstante, en cepas mutantes con
autoprocesado deficientes, TcdA y TcdB aún pueden inhibir las GPTasas y causar
daños citopáticos, aunque con una cinética más lenta (Kreimeyer, 2011)
El domino glicosiltransferasa N-terminal supone forma activa de TcdA y

TcdB. Es capaz de inactiva a varias proteínas citosólicas GTPasas de la familia
Rho, entre ellas RhoA, B, C, G, Racl-3 y Cdc42, mediante un mecanismo de
transferencia covalente de un fragmento de glucosa. Esto genera una inactivación
de estas GTPasas, que afecta a varias rutas celulares de forma dramática, que
conlleva a la perdida de la integridad celular debido a la desregulación de la
polimerización de la actina, impidiendo que se formen los niveles adecuados de
actina F, lo que conlleva que la célula afectada presente un fenotipo característico
que precede a su apoptosis. La muerte celular del colonocito afecta a las uniones
intercelulares en el epitelio intestinal, generando un aumento de la permeabilidad
intestinal y una acumulación de fluido en la luz intestinal que se manifiesta en
forma de diarrea, principal signo de la CDI (Awad, 2014).
59
FIGURA 6: Mecanismo de acción de las toxinas de C. difficile esquematizado.

(Chandrasekaran, 2017).
1.3.2.2 Expresión y genética de las toxinas TcdA y TcdB de C. difficile.
Los genes tcdA y tcdB que codifican estas toxinas TcdA y TcdB se
encuentran en la región 19.6 KB del cromosoma bacteriano, llamado Locus de
Patogenicidad o PaLoc (Braun, 1996). En cepas no toxigénicas PaLoc es
reemplazado por una secuencia no codificante de entre 75 y 115 nucleótidos de
función desconocida (Braun, 1996). Se ha puesto en evidencia que PaLoc puede
ser transferido desde cepas toxigénicas a no toxigénicas mediante mecanismos de
transferencia horizontal de genes (Brouwer, 2013). PaLoc también codifica 3
proteínas accesorias cuya función es regular la producción de las toxinas o su
transporte extracelular:
 TcdR: Juega un papel clave en la expresión de los genes tcdA y tcdB y
otros genes PaLoc (Mani, 2001). Además, es capaz de autorregular
positivamente su propia expresión.
 TcdC: Es un factor anti-sigma que modula la expresión de tcdA y tcdB al
bloquear la asociación del TcdR y la ARN polimerasa (Carter, 2001). Por
tanto, regula negativamente la expresión de las toxinas.
60
 TcdE: Actúa a nivel del transporte de TcdA y TcdB desde la célula al
exterior. Muestra homología con el grupo de Bacteriophage Holin Proteins
que participa en la salida de fagos desde la bacteria que los contiene. TcdA
y TcdB no presentan señales de reconocimiento de secreción y no es
necesaria la lisis celular (Mukherjee,2002). Esto ha conducido a formular la
hipótesis de que existe una ruta de secreción de las toxinas no clásica en la
que participen las Holin Proteins.
La expresión de las toxinas se produce al entrar el microorganismo en la

fase estacionaria de crecimiento, supuestamente debida a la limitación de
nutrientes. La expresión génica está en equilibrio bidireccional siendo
influenciada por varios factores de tipo ambiental como son la temperatura (una
temperatura de 37ºC es estimuladora), concentraciones subinhibitorias de ciertos
antibióticos, ácidos grasos de cadena corta como el ácido butírico (activadores),
fuentes de carbono rápidamente metabolizables (la glucosa del microambiente
local inhibe la producción de toxinas), algunos aminoácidos (prolina y serina son
inhibidores mediante la vía de regulación transcripcional global CodY) y
finalmente, por último se ha visto que los factores que regulan la motilidad y la
esporulación también modulan la producción toxigénica (Apartado 1.2 “Ciclo vital
de C. difficile: Esportulación y Germinación”) . El butanol y la biotina son sustancias
inhibidoras (Chandrasekaran, 2017; Aktories, 2017).
Pueden darse cambios en la región codificante de las toxinas de PaLoc

como inserciones, deleciones y mutaciones puntuales que conforman una
heterogeneidad genética, dando lugar a una serie de diferentes toxinotipos. Esto
supone que haya cepas con diferente actividad y especificidad de sus toxinas con
respecto a la cepa de referencia VPI 10463 de C. difficile. Las deleciones en tcdA se
encuentran ampliamente en el dominio CROPS debido a recombinación entre
secuencias repetitivas, las cuales están muy conservadas en tcdA pero no así en
tcdB, donde predominan las mutaciones puntuales. Éstas normalmente ocurren
en regiones catalíticas y en el dominio CROPS. Las inserciones se suelen producir
en las regiones catalíticas de tcdA, y son debidas al elemento móvil ISTon el cual
es cortado por el ARNm y por tanto, no afecta a la actividad de TcdA (Rupnik,
2016).
61
Las cepas sin diferencias con respecto a la cepa de referencia VPI 10463 se
definen como del toxinotipo 0. Las que presentan diferencias en los genes tcdA y
tcdB se distribuyen en 34 toxinotipos restantes. Su estudio se realiza mediante
técnicas moleculares de fragmentos de restricción más posterior amplificación por
PCR. Se usan 3 fragmentos de restricción en ambos genes tcdA y tcdB: A1-A3 y
B1-B3. Se categorizan en toxinotipos mayores o menores con respecto a sus
diferencias con respecto al toxinotipo 0. Los toxinotipos menores tienen solo
cambios en una parte del gen, principalmente deleciones en la región A3 o bien
mutaciones puntuales en B1, como ocurre en el toxinotipo XII. Los toxinotipos
mayores tienen cambios en ambos genes y pueden estar en cualquiera de los
fragmentos de restricción.
62
FIGURA 7: Esquema de los diferentes toxinotipos y sus diferencias con respecto a la cepa
de referencia VPI 10463. (Rupnik, 2016).
La mayor parte de los toxinotipos producen ambas toxinas TcdA y TcdB.

También en su mayoría son capaces de producir (al menos tienen los genes
funcionales) la toxina binaria CDT (será desarrollada en apartados posteriores de
este mismo epígrafe). Los toxinotipos menores no producen CDT. Siete
toxinotipos tienen fenotipo A-B+ y CDT puede ser positiva o negativa. Los
toxinotipos XIa al XId conforman el único grupo con parte del PaLoc presente
pero que no producen toxinas TcdA y TCdB, pero producen CDT, por tanto, su
fenotipo es A-B-CDT+. El fenotipo A+B- no se detecta con las técnicas descritas de
toxinotipado y no se engloba en ningún toxinotipo específico (Monot, 2015).
Los toxinotipos también pueden mostrar correlación con los diferentes

ribotipos, así que el ribotipado de las cepas puede sugerir la variante genética de
63
las toxinas. Algunos ribotipos con variantes genética de sus toxinas son el 017,
019, 023, 027, 033, 078, 126, 176 y 244 (Rupnik, 2008).
Los toxinotipos aislados en humanos más prevalentes son el III

(correlaciona con el ribotipo 027), IV (ribotipo 023), V (ribotipo 078/126) y VIII
(ribotipo 017). En un estudio europeo del año 2008 los toxinotipos y ribotipos más
frecuentes fueron 078/V, 027/III, 017/VIII, 126/V y 023/IV. Los genes para CDT se
detectaron en el 23% de las cepas (Bauer, 2011).
A diferencia de la mayoría de bacterias patógenas productoras de toxinas,

donde los genes que las codifican son muy estableces en cuanto a sus secuencias,
en C. difficile ocurre algo diferente. Ya hemos expuesto que se trata de una bacteria
con una gran diversidad genética. Por ello, existe una alta tasa de mutación en el
gen tcdB. Esto explicaría en parte la mayor aparición de cepas hipervirulentas. Es
posible que esta variación toxinotípica conduzca a una falta de protección
inmunitaria y que la población carezca de ella al exponerse a cepas con variantes
de toxinas. Esto también podría ser importante a la hora de producir vacunas y
anticuerpos como terapia alternativa a la convencional.
1.3.2.3 Actividad y efectos eelulares e inmunológicos de las toxinas TcdA y TcdB

de C. difficile.
TcdA y TcdB producen sus efectos tóxicos de forma sinérgica. TcdA altera
la integridad del epitelio intestinal y TcdB genera los efectos tóxicos propiamente
dichos. La importancia de la virulencia de TcdA ha sido cuestionado a raíz de
detectar toxinotipos A-B+ que producen un espectro similar a las producidos por
los toxinotipos A+B+. A destacar que las cepas A-B+ presentan una TcdB
modificada que presenta homología en cuanto al dominio enzimático y
especificidad de sustrato GPTasa con la toxina TcsL de Clostridium sordellii. Esto
hace que esta TcdB modificada, al igual que TcdA, pueda modificar las Ras
GTPasas, llevar a cabo la glicosilación que realiza la TcdA y, por tanto, realizar
sus funciones en este tipo de cepas. Por tanto, la toxina TcdB es capaz por si sola
de causar daños tóxicos (Chandrasekaran, 2017).
64
Los hallazgos clínicos básicos de la CDI, como la diarrea, enterocolitis y la
inflamación generada, se explican mediante los diferentes efectos que producen
las toxinas. Básicamente, inducen la muerte celular y alteran las uniones
intercelulares del epitelio colónico, causando un daño directo, y por otra parte
provocan una fuerte y exacerbada reacción inflamatoria intestinal. Todo esto lleva
a un aumento de la permeabilidad vascular y tisular y a la secreción de fluidos a
la luz intestinal. Además, la prolongación de este daño tisular y una exposición
continuada de la mucosa intestinal con el sistema inmune innato y mediadores
proinflamatorios contribuyen a la aparición de las pseudomembranas típicas
(Aktories, 2017)
Los efectos directos los diferenciamos en citotóxicos y citopáticos. El efecto

citopático se produce debido a la glicosilación de las GTPasas Rho. Esto produce
una pérdida de la funcionalidad del citoesqueleto afectando a las uniones
intercelulares, ya que las GTPasas son esenciales para el mantenimiento de la
estructura del epitelio celular. También se afecta la progresión del ciclo celular; las
toxinas TcdA y TcdB reducen la expresión de ciclina D1, la cual es necesaria para
progresar a la fase G1, provocándose una parada celular en G1-S. Por otra parte,
el efecto citotóxico se hace evidente a las 18-48 horas cuando se producen la
muerte celular mediante un mecanismo de apoptosis, caspasa-dependiente e
independiente (Chandrasekaran, 2017). También se han evidenciado efectos
citotóxicos que no se deben a la glicosilación de las GTPasas Rho: TcdB es capaz
de inducir una muerte celular bimodal dependiente de la concentración, ya que a
bajas concentraciones provoca la glicosilación de las GTPasas, pero a
concentraciones elevadas la muerte celular que produce no requiere de su
actividad glicosiltransferasa. Esto es debido a que TcdB induce la producción de
radicales libres (ROS, Reactive Oxygen Species) al actuar sobre la NADPH oxidasa
de los endosomas (Chumbler, 2016). El exceso de radicales libres genera daño del
ADN, peroxidación lipídica, disfunción mitocondrial y oxidación de proteínas
que producen la muerte celular. La capacidad única de TcdB y no de TcdA de
producir este daño más agresivo explica que las cepas salvajes A+B+ y la cepa A-
B+ causen más daño tisular que la A+B-.
65
Sumándose a los efectos directos anteriores descritos, TcdA y TcdB,
provocan la salida de multitud de mediadores inflamatorios desde las células
epiteliales, como interleucinas que promueven la quimiotaxis de los neutrófilos
hacia la mucosa colónica, como la interleucina 8 y la proteína 1 quimiotáctica de
monocitos (Bobo, 2013). Esto se produce mediante la activación en las células del
colon de las rutas NF-κB y MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase). La
infiltración de neutrófilos promueve la secreción de fluidos y potencia la
inflamación de la mucosa y el daño generado. Además, TcdA y TcdB debido al
daño tisular generado pueden acceder a la lámina propia y estimular
directamente a los macrófagos y las células dendríticas y potenciar la respuesta
inflamatoria, ya que estos producen más interleucinas inflamatorias como el TNF-
α, IL-6, IL-8, IL-1β, prostaglandina 2, leucotrieno B4, que producen un mayor
reclutamiento de neutrófilos en la mucosa colónica (Sun, 2009). Los mastocitos
intestinales y las neuronas también pueden verse afectadas. Los mastocitos se
activan por TcdA y TcdB y se degranulan emitiendo más mediadores
inflamatorios (Meyer, 2007). La activación de las células del sistema nervioso
intestinal provoca la secreción de sustancia P, un péptido con actividad
inflamatoria (Anton, 2004).
1.3.2.4 Toxina binaria CDT de C. difficile.
La tercera toxina de C difficile, la toxina binaria o CDT fue descubierta en

1987. Hace años era muy infrecuente en cepas productoras de CDI (menos del
10%), pero en los últimos 10 años su prevalencia se ha incrementado de forma
notoria (Rupnik, 2008). Esto es debido a que está frecuentemente asociada a las
llamadas cepas hipervirulentas de reciente aparición (ribotipo 027 y 078
principalmente), las cuales presentan mayor tasa de mortalidad y morbilidad
(Gerding, 2014). Estos ribotipos son capaces de producir CDT, junto a TcdA y
TcdB y el papel de la primera en la patogénesis de estas cepas permanece en
debate, puesto que además presentan otros factores de virulencia, como la
resistencia de alto nivel a los fluorquinolonas y la presencia de un codón de
parada en el gen tcdC, lo que produce una desregulación en la producción de
TcdA y TcdB (Rupnik, 2008). Por tanto, la severidad que producen puede ser
debida a un conjunto de causas. El estudio de las cepas hipervirulentas será
66
desarrollado en un apartado posterior más concisamente. Por otra parte, se ha
publicado que estos ribotipos no tienen siempre una correlación con la severidad
de la clínica, sobre todo en escenarios no epidémicos (Barbur, 2012).
CDT pertenece al grupo de las toxinas binarias, producidas por ciertas

especies de Clostridium y Bacillus, entre ellos Clostridium perfringens (Toxina Iota),
Clostridium spiriforme (Toxina CST), Clostridium botulinum (Toxina C2), Bacillus
cereus (Toxina VIP) y Bacillus anthracis. Son secretadas como 2 componentes
separados A y B. Se unen en la superficie de las células diana al interactuar
primero el componente B. Los dos componentes por separado CDTa y CDTb, no
son tóxicos de por sí y solo producen efectos en las células diana cuando se
combinan entre ellos (Chandrasekaran, 2017).
CDT está codificada por 2 genes; cdtA y cdtB, localizados en la región

cromosómica 6.2 kb (distinta a PaLoc), llamada Cdt locus o CdtLoc. Las cepas
CDT-no toxigénicas presentan una deleción de 2 kb en CdtLoc. CdtLoc presenta
un tercer gen, cdtR el cual es un gen regulador de la familiar LytTR. Este gen
regula positivamente la expresión de CDT, pero también las de TcdA y TcdB en
cepas del ribotipo 027 (Lyon, 2016). Los estímulos ambientales que regulan la
expresión de CDT no son del todo conocidos. Todas las cepas que contienen los
genes cdtA y cdtB de forma completa pertenecen, bien a alguna de las variantes
toxinotípicas (toxinotipos diferentes de 0), o bien a cepas no toxigénicas que no
presentan PaLoc (Gerding, 2014). La razón de esta correlación es desconocida,
quizás pueda deberse a que una gran proporción de cepas con el toxinotipo 0
contengan genes truncados de la toxina binaria.
No todos los toxinotipos de C. difficile, presentan genes de CDT, entre ellos

el toxinotipo VIII, muy ampliamente distribuido, pero sí que existe una asociación
con algunos ribotipos.
67
FIGURA 8: Correlación de los toxinotipos y ribotipos en cepas productoras de la toxina

binaria CDT. (Gerding, 2014).
Para iniciar su mecanismo de acción CDTb se acopla al receptor LSR

(Lipolysis-Stimulated Lipoprotein Receptor) que es un receptor de superficie presente
en muchos tejidos incluido el colon. CDTb induce el agrupamiento y la
acumulación del receptor. La acumulación del receptor unido al CDTb monómero
induce la polimerización de este. Después, le sigue la unión del componente
CDTa y la internalización del complejo al interior de la célula diana mediante
endosomas. La posterior acidificación de los endosomas es suficiente para
producir cambios conformacionales en el componente CDTb que le hace capaz de
insertarse en la membrana del endosoma y formar un canal transmembrana que
permite que el componente CDTa sea lanzado al citosol. CDTa es una ADP-
ribosiltransferasa la cual cataliza la transferencia de la ADP-ribosa desde el NAD
al residuo de arginina 177 de la Actina G monomérica (Gerding, 2014).
68
FIGURA 9: Mecanismo de acción de la toxina binaria CDT de C. difficile. (Chandrasekaran,

2017).
La intoxicación por CDT conduce a múltiples efectos celulares

patogénicos, incluidos la pérdida de la funcionalidad del citoesqueleto, la
formación de protrusiones celulares de microtúbulos, aumento de la adherencia
de patógenos y un aumento de la producción de interleucinas inflamatorias y una
supresión del sistema inmune innato. La ADP-ribosilación de la actina G hace que
esta sea incapaz de polimerizar y además promueve la despolimerización de la
actina F, dando lugar a su efecto citopático. La formación de protrusiones de
microtúbulos ocurre en microdominios ricos en esfingolípidos y colesterol y
también es debida a la ADP-ribosilación de la actina G. Estas protrusiones
generan como una especie de red que atrapa a los Clostridium, provocando un
aumento de la adherencia y potenciando la colonización. Con respecto a los
efectos inmunológicos, CDT actúa de forma sinérgica a TcdA y TcdB en cuanto a
la producción de interleucinas inflamatorias (Gerding, 2014).
69
Puesto que no existen métodos de detección de la toxina CDT en heces, el
verdadero impacto de la CDT en la mortalidad y morbilidad de la CDI está
probablemente infraestimado (Gerding, 2014).
1.3.3 Endosporas y virulencia.
Aunque desarrolladas en el apartado 1.2 “Ciclo vital de C. difficile:

Esporulación y Germinación”, hemos de decir que las esporas de C. difficile son
estructuras complejas, formados bajo el control de vías reguladoras
interrelacionadas. Su capacidad para resistir en ambientes hostiles durante largos
periodos de tiempo las convierte en un importante agente de transmisión en
humanos y animales y contribuye a su potencial virulencia.
Existe un debate sobre la asociación de ciertos ribotipos y la eficacia en

cuanto a la producción y germinación de las esporas. Algunos estudios han
evidenciado que algunas cepas, sobre todo las hipervirulentas como el ribotipo
027, forman esporas con mayor eficacia y perfección que las cepas clásicas, sin
embargo, otros estudios no han demostrado asociación (Burns, 2011a; Burns,
2011b)
El exosporium, la estructura más externa de la espora, se ha relacionado

con la eficacia en la germinación de la misma, ya que las esporas que poseen un
exosporium intacto germinan menos fácilmente que aquellas sin esta estructura
más externa (Escobar-Cortes, 2013).
Como hemos visto, el regulador maestro de la esporulación en C. difficile

es Spo0A. En estudios donde se han diseñado mutantes para Spo0A en la cepa
R20291 de C. difficile se ha visto que el fenotipo obtenido resulta no esporogénico.
El mutante era incapaz de producir la transmisión de organismo a organismo
(Deakin, 2012).
Las esporas son muy resistentes en el medio hospitalario, son capacesa de

unirse con mucha eficacia al acero inoxidable, muy usado en estos ámbitos, pero
70
no se ha observado una correlación fuerte entre diferentes ribotipos y la
capacidad de adherencia (Joshi, 2012).
Se ha evidenciado que la unión de las esporas a diferentes líneas celulares
es un proceso dependiente de la hidrofobicidad. Por ejemplo, las esporas del
ribotipo 002 (cepa DS1748) al ser más hidrofílicas se unen a las diferentes células
con menos eficacia, no obstante, otras variaciones en la composición de la espora
podrían contribuir a esta diferencia que se produce en este fenotipo (Joshi, 2012).
1.3.4 Capas superficiales y proteínas de la pared celular y virulencia.
La adherencia a las células del epitelio intestinal es un paso crucial para la

colonización y posterior establecimiento de la infección. Por ejemplo, las esporas
del ribotipo hipervilurento 027 se adhieren con mejor eficacia al epitelio intestinal
que las del ribotipo 002, sugiriendo que la adherencia puede ser un importante
factor de virulencia de C. difficile (Joshi, 2012).
Las capas superficiales celulares o S-layers son capas de naturaleza

proteica que se exponen en la superficie de muchas bacterias. Consisten en
monómeros idénticos de glicoproteínas. Presentan poder inmunogénico. Se ha
demostrado la presencia de SLPs (S-layer Proteins) en C. difficile, pero a diferencia
de otras bacterias, están constituidas por 2 subunidades proteicas: HMW (high
molecular weight) y LMW (low molecular weight), que derivan del precursor
polipeptídico SlpA por la acción de la proteasa Cwp84. HMW está muy
conservado pero LMW presenta cierta variabilidad genética, por tanto, existe una
potencial variabilidad entre las distintas cepas. HMW y LMW están unidas
mediante uniones no covalentes y se piensa que son importantes en la adherencia
a las células del hospedador (Awad, 2014).
Asimismo, estudios recientes han demostrado que las SLPs son

importantes en el reconocimiento inmune y en la respuesta inflamatoria. SLPs
aplicados sobre monocitos provocan la secreción de interleucinas inflamatorias
(Bianco, 2011).
71
SLPs es la familia mejor caracterizada de CWPs (Cell Wall Proteins). 12 de
los genes que codifican CWPs se agrupan en la región del locus slpA. Estudios
bioinformáticos han evidenciado la diversidad génica existente en 57 cepas
(Dingle, 2013). El resto de las 17 CWP locus están distribuidos por todo el genoma
de C. difficile. Estudios bioinformáticos en 40 cepas los clasifican en 2 grupos, uno
compuesto por 9 CWP locus que están conservados y un segundo grupo más
variable (Biazzo, 2013).
Con respecto a estas proteínas de la pared celular, la mejor caracterizada

es Cwp 84, una cisteína proteasa que participa en el remodelado de S-Layer y que
es capaz de degradar la matriz extracelular, por tanto, puede intervenir en los
procesos de diseminación durante la infección (Janoir, 2007). Otra proteína de la
pared celular que interviene en la adherencia celular es Cwp66, que fue detectada
mediante anticuerpos frente a las proteínas de superficie de bacterias sometidas a
choque térmico, sugiriendo que podría ser una proteína de choque térmico
asociada a la superficie celular (Waligora, 2001). Se ha propuesto que tenga
también propiedades de adherencia. CwpV también ha sido propuesto como
factor de virulencia al promover la agregación de la bacteria para facilitar la
formación de biofilms en el intestino del hospedador (Reynolds, 2011).
1.3.5 Fimbrias, pilis y virulencia.
Algunas cepas de C. difficile presentan fimbrias de ubicación polar.

Debido a que varios estudios han demostrado que cepas sin fimbrias causan CDI,
su presencia parece no ser importante en la patogénesis (Taha, 2007).
La mayor parte de las bacterias del orden Clostridiales codifican genes

pilus tipo IV. La cepa 630 de C. difficile presenta 9 genes de este tipo (Melville,
2013). Su poder patógeno tampoco es determinante.
1.3.6 Flagelos y virulencia.
Se conocen algunas cepas de C. difficile que presentan movilidad debido a

la presencia de flagelos. Las dos proteínas flagelares mejor caracterizadas son FliC
72
y FliD. El poder patógeno de los flagelos permanece en debate. Parece ser un
proceso cepa-dependiente. Así, en estudios epidemiológicos del ribotipo 027 se ha
comprobado que la presencia de flagelos es importante para su adherencia y
colonización del epitelio intestinal. No obstante, la ausencia de flagelos en cepas
no epidémicas, no reduce la adherencia intestinal (Baban, 2013). A destacar la
importancia de los flagelos en la formación y desarrollo de biofilms, un
mecanismo que presentan algunas bacterias para optimizar la colonización
cuando se ven expuestas a situaciones de stress ambiental (Ethapa, 2013).
1.3.7 Proteína fijadora de fibronectina y virulencia.
La fibronectina es una glicoproteína importante que interviene en la

adhesión de las bacterias patógenas a las células del hospedador. Forma parte de
la matriz extracelular y C. difficile es capaz de unirse a ella mediante la proteína
fijadora de fibronectina Fbp68. El gen que la codifica está bastante conservado. Su
papel en la patogenia de la CDI no está completamente explicado (Barketi-Klai,
2011). La metaloproteasa Zmp1 también es capaz de desestabilizar la fibronectina
y favorecer la propagación de C: difficile (Cafardi, 2013).
1.3.8 Proteínas de choque térmico y virulencia.
Se ha comprobado mediante estudios in vitro que el choque térmico

aumenta la adherencia de C. difficile a las células epiteliales. Este hecho ha dado
pie a que se sugiriera que algunas proteínas de choque térmico como GroEl
tengan importancia en la adherencia. Esta proteína solo se expresa y secreta al
espacio extracelular en condiciones de stress. Estudios en modelos murinos han
evidenciado que los anticuerpos anti-GroEl reducen la eficacia de la colonización
de C. difficile, reforzando el papel de GroEl en la adhesión (Pechine, 2013).
1.3.9 Cepas hipervirulentas de reciente aparición.
Durante la década de los 90, C. difficile fue una causa importante de diarrea
nosocomial, de difícil manejo, pero de mortalidad baja. A principios del siglo XXI
la situación cambió radicalmente ya que muchos estudios empezaron a alertar del
73
aumento de la mortalidad que producía esta infección y de la asociación de estos
casos más severos al ribotipo 027, una cepa anteriormente descrita como de escasa
patogenicidad (Pépin, 2004).
El primer caso documentado fue en Paris en 1985 (Popoff, 1988) y el
segundo en Minneapolis en 1988 (Razaq, 2007). Para observar el cambio, entre los
años 2003 y 2004 Canadá tuvo brotes en más de 30 hospitales. Quebec entre 2004
y 2007 tuvo más de 20000 casos de diarrea nosocomial con una notable severidad
(Labbe, 2008). Mediante estudios retrospectivos, se han obtenido datos similares
en Estados Unidos durante ese periodo. Entre 2003 y 2006 dos brotes de CDI en el
Stoke Mandeville Hospital de Inglaterra causaron 127 muertes. En 2007, el
ribotipo 027 hipervirulento fue identificado en 16 países europeos (Kuijper, 2008).
Aunque actualmente el ribotipo 027 aún persiste en Estados Unidos y Canadá hay
una bajada de su frecuencia de infección, sobre todo en Europa, aunque también
ya se han dado casos en otros continentes como Sudamérica y Australia.
En España, los estudios moleculares epidemiológicos de C: difficile son

escasos y es por lo cual la importancia del ribotipo 027 es casi desconocida. El
primer caso descrito y publicado fue en 2013 en el hospital Gregorio Marañón de
Madrid (Marín, 2014).
La caracterización del ribotipo 027 como hipervirulento no ha estado

exenta de controversia. Durante la primera década del siglo XXI, claramente se
convirtió en una cepa predominante en muchas áreas geográficas, como
demuestran varios estudios epidemiológicos como el realizado por la National
Ribotype-Based Surveillance Scheme de Inglaterra (Wilcox, 2012). Se demostró una
correlación entre frecuencia de CDI producida por el ribotipo 027 y el aumento de
la mortalidad. En años donde la frecuencia de la cepa había aumentado,
aumentaba la mortalidad y viceversa. Por ejemplo, entre 2007 y 2008 el 55% de los
casos de CDI fueron producidos por el ribotipo 027 y la mortalidad fue del 29%.
Entre 2009 y 2010 la frecuencia bajó a 21% y la mortalidad al 14%. Por tanto, se
evidenciaba la asociación con la mortalidad y severidad de la CDI y el cambio en
su epidemiología. Además, se observó que los enfermos presentaban mayor tasa
de recurrencia que con otras cepas (Marsh, 2012). Pero también surgieron estudios
donde, si bien se corroboraba que el ribotipo 027 se asociaba a las formas severas
74
de CDI, no es un predictor único de severidad. El recuento de leucocitos en
sangre total podría ser mejor indicador de severidad de la enfermedad que el
ribotipo (Walk, 2012). Por tanto, se cuestionaba la relevancia del ribotipo como
predictor de severidad (Sirard, 2011). Como punto intermedio, una idea bastante
aceptada hoy en día es que las ventajas que presenta el ribotipo 027, en cuanto a
sus factores de virulencia, junto con otras situaciones, le han permitido penetrar
en la población y reemplazar rápidamente otros ribotipos más frecuentes
anteriormente.
1.3.9.1 Factores que explican la hipervirulencia del ribotipo 027.
Las razones de la asignación del ribotipo 027 como hipervirulento

tampoco han sido fáciles de descifrar. Existen diferencias genómicas significativas
entre las cepas hipervirulentas y clásicas, pero discernir cuales de estas
diferencias son las que generan que haya cambios en la severidad de la
enfermedad que producen es difícil. Aun así, se han propuesto varias
explicaciones:
 Mayor producción de toxinas que las cepas clásicas (Warny, 2005): Debido
a la presencia de una mutación en el gen regulador tcdC del PaLoc, que es
un gen represor y el hecho de que este truncado, permitiría una
desregulación en la producción de toxinas y una mayor expresión. Pero
hay datos que ponen en duda que esta sea la causa del poder
hipervirulento del ribotipo 027 ya que algunas cepas también producen
cantidades anormalmente elevadas de toxinas y el gen tcdC está intacto
(Akerlund, 2008), y algunas otras cepas con el gen tcdC alterado no
producen grandes cantidades de toxinas (Murray, 2009).
 La toxina binaria CDT: Como se ha desarrollado en su apartado
correspondiente, CDT es un factor de virulencia con acciones citopáticas e
inflamatorias. En estudios en modelos murinos se ha observado que cepas
con CDT presentan mejor colonización y provocan mayor daño intestinal
(Schwan, 2009). El hecho de que en cepas no hipervirulentas también se
produzca CDT muestra que por sí sola no se demuestra la hipervirulencia
del ribotipo 027.
75
 Esporulación más eficiente que las cepas clásicas: Hay trabajos que
exponen que el ribotipo 027 es capaz de producir esporas de manera más
eficiente que las cepas clásicas (Merrigan, 2010) y viceversa (Burns, 2011a;
Burns, 2011b).
 Variaciones toxinotípicas: Existen variaciones genéticas en las cepas
clásicas e hipervirulentas (Lanis, 2010). No obstante, se ha puesto de
manifiesto que la TcdB del ribotipo 027 tiene mayor poder citotóxico que
las cepas clásicas (Stabler, 2009). Esta variante de TcdB es capaz de
traslocarse al citosol de las células infectadas más rápidamente y el
mecanismo de autoprocesado es más eficiente, ya que presenta una
estructura más favorable para ello.
A pesar de la evidencia contradictoria de si el ribotipo 027 produce formas

más severas de la enfermedad o no, está claro que ha emergido como una causa
común de CDI de entre cientos de cepas, por tanto, podría presentar ventajas
competitivas adaptativas que podrían explicar la sobrerrepresentación en los
mencionados brotes. Lo mismo ha ocurrido con el ribotipo 078, típicamente
encontrado anteriormente en animales, pero que ahora es de los más
predominantes en las CDI asociadas a la comunidad (Bauer, 2011). Como ocurre
con el ribotipo 027 también se asocia a mayor severidad (Goorhuis, 2008). La
evolución desde el año 2000 hacia cepas hipervirulentas parece que se ha
acelerado debido a la capacidad de C. difficile de alterar eficientemente sus
secuencias genómicas, adquirir genes nuevos o genes truncados mediante
recombinación genética.
1.4 DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR C. DIFFICILE.
Llegados a este punto vamos a desarrollar en que consiste el diagnóstico

de la CDI y cuales son sus manifestaciones clínicas. Asimismo, mostraremos el
amplio espectro clínico posible y las causas de ello.
La CDI se diagnostica por una serie de manifestaciones clínicas en

combinación con una serie pruebas de laboratorio o hallazgos histopatológicos o
radiológicos compatibles con la presencia de colitis pseudomembranosa
76
(McDonald 2018). La presencia de colitis pseudomembranosa evidenciada
mediante endoscopia, tras colectomía o en autopsia, es suficiente para el
diagnóstico, en ausencia de otra causa evidente.
A pesar de del aumento de la incidencia de la CDI, el interés por la

enfermedad y la aparición de cepas hipervirulentas, en muchos casos no se
diagnóstica de forma correcta o bien no se diagnóstica. En un estudio en España
se ha mostrado que 2 de cada 3 casos de CDI no se diagnostican, debido a la falta
de sospecha clínica, sobre todo en casos provenientes de la comunidad que no
presentan los factores de riesgo clásicos, y debido a un abordaje desde el
laboratorio inapropiado (Alcalá, 2012).
1.4.1 Manifestaciones clínicas.
De forma general la CDI puede cursar desde manifestaciones clínicas

leves, como una diarrea leve o moderada, hasta complicaciones más graves como
puede ser la colitis pseudomembranosa fulminante, megacolon tóxico e incluso
muerte (Crobach, 2016). El tipo de manifestaciones clínicas que va a producir la
infección va a depender del microorganismo y del estado del paciente. Del
microorganismo en cuanto a la virulencia de la cepa de C. difficile causal, y del
paciente, en cuanto a su estado inmune, comorbilidades asociadas y edad,
principalmente.
El pronostico de un paciente con CDI nos lo va a proporcionar el grado de

serveridad, que se clasifica en base a unos parámetros clínicos y de laboratorio. La
forma leve y/o moderada de la enfermedad se define como la presencia de diarrea
como único síntoma, con por lo menos 3 deposiciones o más en las últimas 24
horas (McDonald, 2018; Surawicz, 2013). En la forma severa aparece en el inicio o
durante el curso de la enfermedad hipoalbuminemia (menor a 3 g/dL) y
cualquiera de los siguientes signos: recuento de leucocitos totales en sangre
mayor a 15.000/µL y/o distensión abdominal sin otros criterios de la forma
complicada. En la forma complicada aparece al inicio o durante el curso de la
enfermedad cualquiera de los siguientes signos o síntomas: ingreso en la unidad
de cuidados intensivos, hipotensión con o sin administración requerida de
77
vasopresores, fiebre mayor o igual a 38.5ºC, distensión abdominal significativa,
signos de alteración en el íleo, alteración de la conciencia, recuento de leucocitos
totales en sangre mayor a 35.000/µL o menor a 2000/µL, concentraciones de
lactato en suero mayores a 2.2 mmol/L o cualquier tipo de signo de fallo orgánico.
Los signos de alteración en el íleo incluyen nauseas agudas, vómitos, cese súbito
de la diarrea (íleo paralítico) o evidencias radiológicas compatibles con tránsito
intestinal alterado (Surawicz, 2013).
Los hallazgos por endoscopia varían desde la presencia de eritrema a

colitis pseudomembranosa. La endoscopia por rutina no está recomendada en
pacientes con síntomas típicos con pruebas de laboratorio positivas. En la colitis
fulminante incluso hay un riesgo serio de perforación intestinal. No obstante,
puede ser útil cuando las pruebas de laboratorio son negativas y existe sospecha
clínica, cuando el diagnóstico de CDI debe ser imperativo debido a la situación
del paciente, y cuando no hay mejoría tras el tratamiento o bien en casos de
presentaciones atípicas (Postma, 2015).
FIGURA 10: Pseudomenbranas en endoscopia. (Jawa, 2012).
La recurrencia se produciría entre las 2-8 semanas siguientes al primer

tratamiento completo para erradicar la infección. Su riesgo oscila entre un 20%
tras la infección inicial a un 60% tras la primera recurrencia. Es más probable con
78
la edad avanzada, en formas graves iniciales, cuando existe un uso concomitante
de antibióticos (Alcalá-Hernández, 2016) y en presencia de múltiples cepas
infectantes de C. difficile (Seekatz, 2018).
Las manifestaciones extraintestinales de la infección por C. difficile son

muy poco comunes, produciéndose en menos del 1% de los casos. Principalmente
se dan en pacientes hospitalizados sometidos a cirugías gastrointestinales que
además, presentan factores de riesgo específicos para desarrollar CDI.
Normalmente se trata de afecciones en la región abdominopélvica debido a
perforaciones o infiltraciones. También se han descrito bacteriemias con
afectación de órganos a distancia (Mattila, 2013).
La artritis reactiva postcolitis por C. difficle también se ha documentado,

aunque escasamente se han publicado unos 50 casos. Se ha postulado que podría
deberse a un proceso autoinmune postinfeccioso (Legendre, 2016).
Añadir por último que en los últimos años se ha desarrollado y validado el

cuestionario CDI-DaySyms, con el fin de mejorar la evaluación diagnóstica de los
pacientes con CDI. Se trata de un cuestionario que evalúa los síntomas de la CDI
desde la perspectiva del paciente mediante una serie de ítems. Se diseñó en el año
2011, a partir de las recomendaciones de la US Food and Drug Administration
(FDA), que desarrollaron una guía para diseñar y promover esta clase de
cuestionarios (Kleinman, 2018).
1.4.2 Diagnóstico microbiológico de la infección por C. difficile.
Hemos de tener en cuenta que la interpretación de las pruebas de

laboratorio es complicada. La evidencia de C. difficile en heces no siempre supone
una infección, pues podríamos tener un sujeto colonizado pero no infectado,
puesto que existen individuos colonizados asintomáticos o en caso de presentar
diarrea la causa no sería C. difficile. Este punto será desarrollado en el apartado
específico de colonización por C. difficile. Es por lo cual que los datos y la sospecha
clínica es esencial para establecer un buen diagnóstico y una selección apropiada
de pacientes que a los cuales realizar las pruebas de laboratorio. Además, la
79
mayor parte de las diarreas asociadas al uso de antibióticos no se relacionan con
un patógeno en concreto y existen otras bacterias patógenas que pueden causar
diarrea posterior al uso de antibióticos, como Staphylococcus aureus, Clostridium
perfringens, Salmonella spp y Klebsiella oxytoca (Larcombe, 2016).
Existe una variedad de pruebas de laboratorio para la detección de la CDI.

Como pruebas de referencia, aunque no existe unanimidad al respecto, tenemos
el Cultivo Toxigénico (TC) y el Ensayo de Citotoxicidad (CCNA, Cell Cytotoxicity
Neutralization Assay,). Siempre ha existido controversia al respecto de cual de las
dos pruebas define mejor CDI. En un estudio multicéntrico del año 2013 se puso
de manifiesto que los casos con CCNA positivo (demostración de presencia de la
toxina libre) pero TC (demostración de la capacidad de producir toxina) negativo
correlacionan con la clínica, por tanto, toda muestra con CCNA positiva
representa un verdadero caso de CDI. No obstante, los casos con TC positivo pero
CCNA negativo resultarían difíciles de clasificar. Podría tratarse de pacientes
colonizados por cepas potencialmente productoras de toxina pero que no la están
generando, por tanto, no serían pacientes con CDI, y no deberían ser tratados. No
obstante, cabría la posibilidad de que la concentración de toxina libre fuera muy
baja y no fuera detectada por CCNA y sí la capacidad de producir esta toxina por
parte del TC, por tanto, con este punto de vista, sí que serían pacientes con CDI y
por tanto deberían tratarse (Planche, 2013).
El TC consiste en el cultivo anaeróbico de muestras de heces con la

posterior detección de las toxinas de C. difficile en los aislados del mismo.
Actualmente se usan medios selectivos con sangre que llevan lisozima o ácido
taurocólico para estimular la germinación. Se recomienda el pretratamiento de la
muestra mediante calor o alcohol para erradicar en la medida de lo posible la
microbiota intestinal contaminante del cultivo. Las colonias de C. difficile
presentan el típico aspecto verde-grisáceo con un olor característico a “cuadra de
caballo”, debido a la producción de p-cresol. También, se puede comprobar la
morfología de C. difficile mediante tinción de Gram de las colonias. Se trata de
bacilos Gram positivos con esporas en los extremos. Una vez obtenido el cultivo
puro del microrganismo se detecta la toxina mediante técnicas de biología
80
molecular, ensayo de citotoxicidad o bien mediante métodos rápidos como los
inmunocromatográficos (Alcalá-Hernández, 2016).
FIGURA 11: Colonias de C. difficile.
FIGURA 12: Tinción de Gram de C. difficile.
El CCNA detecta la toxina de C. difficile directamente en heces. En primer

lugar, se debe filtrar la muestra de heces y a continuación se aplica a una
monocapa de un cultivo celular que pueden ser fibroblastos, células Hep2, células
Vero, etc. A continuación, después de una incubación de 72 horas, se observa el
81
efecto citopático de la toxina en esta línea celular. Para eliminar efectos citopáticos
inespecíficos se añade antitoxina. Se trata de un método engorroso y carente de
estandarización pero se le considera uno de los Gold Standard al presentar una
especificidad cercana al 100% y una gran sensibilidad (McDonald, 2018).
Estas dos pruebas han sido reemplazadas en la práctica asistencial por

métodos de detección de la toxina directamente en heces o bien, por métodos
moleculares de amplificación de los genes que codifican las toxinas u otros genes
específicos de C. difficile.
La detección de la toxina libre en heces es una prueba rápida de

inmunoanálisis que usa anticuerpos monoclonales o policlonales y de la cual
existen múltiples ensayos comerciales. Se suelen usar técnicas cromatográficas o
de enzimoinmunoanálisis con lectura final mediante espectrofotometría. La
especificidad y sensibilidad de esta prueba es variable, en función del método
seleccionado, pero en los últimos años ha habido una mejora de sus
especificaciones analíticas (Crobach, 2016).
La detección de la Glutamato Deshidrogenasa (GDH) en heces es otra

prueba rápida, normalmente inmunocromatográfica, que detecta este enzima, que
se presenta en elevadas concentraciones en aislados de C. difficile. La GDH es
producida por cepas toxigénicas y no toxigénicas, por tanto, es una prueba de
elevada sensibilidad, pero poca especificidad, y que debe ser combinada con otras
(McDonald, 2018).
Otra prueba cada vez más instaurada en la práctica asistencial, debido a su

incorporación a algoritmos diagnósticos multinivel, es la amplificación mediante
PCR de los genes codificantes de las toxinas A y B (tcdA y tcdB) de C. difficile
(NAATs, Nucleic Acid Amplification Test). Son pruebas relativamente rápidas que
duran entre 45 y 180 minutos. También existen cada vez más métodos comerciales
bastante automatizados.
En un metanálisis realizado por la European Society of Clinical Microbiology

and Infectious Diseases en el año 2016 para confeccionar sus recomendaciones para
82
el diagnóstico de la infección por C. difficile, se comparó la sensibilidad y
especificidad de las pruebas rápidas de detección de toxinas y GDH en heces y de
NAATs, con las dos pruebas de referencia TC y CCNA (Crobach, 2016). Al
comparar con respecto a CCNA, la sensibilidad abarco desde 0.80 hasta 0.99 para
la GDH, de 0.44 hasta 0.99 para TcdA y TcdB, y de 0.83 a 1.00 para NAATs. La
especificidad varió entre 0.82 y 0.95 para la GDH, entre 0.87 y 1.00 para TcdA y
TcdB, y entre 0.87 y 0.98 para NAATs. Con respecto a TC, la sensibilidad abarcó
desde 0.83 hasta 1.00 para la GDH, de 0.29 hasta 0.86 para TcdA y TcdB, y de 0.77
a 1.00 para NAATs. La especificidad varió entre 0.88 y 1.00 para la GDH, entre
0.91 y 1.00 para las TcdA y TcdB, y entre 0.83 y 1.00 para NAATs. De este estudio
se dedujo que la detección de toxinas en heces es la prueba más específica,
mientras que la detección de GDH y el método NAATs son las más sensibles.
La Infectious Diseases Society of America y la Society for Healthcare

Epidemiology of America en sus recomendaciones establecen que es preferible
utilizar un algoritmo multinivel, utilizando la detección en heces de las toxinas
más la de GDH, sumándole o no a estas la NAATs, o bien utilizando NAATs más
la detección de toxina en heces, como mejor método diagnóstico de laboratorio
para detectar pacientes con elevado riesgo de padecer CDI clínicamente
significativa (McDonald, 2018). No recomienda realizar NAATs únicamente como
lo establece la guía clínica del American Journal of Gastroenterology (Surawicz, 2013)
en vez de algoritmos multinivel, ya que considera que tiene más eficacia
diagnóstica que la detección de la toxina junto con la detección de GDH en heces
como prueba inicial. La European Society of Clinical Microbiology and Infectious
Diseases también considera que no se debe usar un único método diagnóstico y
que se deben combinar en algoritmos diagnósticos multinivel (Crobach, 2016).
Algunos de los algoritmos diagnósticos propuestos, aprovechando las

mejores cualidades diagnósticas de los diferentes métodos, son los siguientes:
83
FIGURA 13: Algoritmo diagnóstico de la CDI en 2 pasos. (Alcalá-Hernández, 2016).
84
FIGURA 14: Algoritmo diagnóstico de la CDI en 3 pasos. (Alcalá-Hernández, 2016).
FIGURA 15: Algoritmo diagnóstico de la CDI multinivel. (Alcalá-Hernández, 2016).
85
En el algoritmo de dos pasos se comienza con la GDH que si es negativa
ya establecemos que no existe C. difficile toxigénico. Si es positiva utilizamos el
método NAAT que si es negativo también establecemos que no existe C. difficile
toxigénico, pero que si es positivo establecemos que existe C. difficile toxigénico.
Por tanto, está basado en la GDH y en NAAT.
El algoritmo de tres pasos también comienza con la GDH que si es

negativa también establecemos que no existe C. difficile toxigénico ya que es una
prueba muy sensible. Si es positiva realizamos la prueba rápida de detección de
toxinas en heces. Si es positiva establecemos que ya existe C. difficile toxigénico,
pero si es negativo realizamos NAAT. Si NAAT es negativo descartamos C.
difficile toxigénico pero si es positivo lo confirmamos. Por tanto, se considera
presencia de C. difficile toxigénico cuando se da GDH positivo y toxina positiva en
heces o cuando se da GDH positivo y NAATs positivo.
El algoritmo multinivel comienza con la detección simultánea de GDH y

toxinas en heces. Si ambas pruebas son positivas se establece que ya existe C.
difficile toxigénico, y si ambas son negativas se descarta. Cuando hay resultados
discrepantes se realizan ya técnicas moleculares NAATs, que si son positivas
confirman estos casos. De los casos discrepantes el de GDH positiva toxinas
negativas es mucho más común que el contrario. Del segundo (toxinas positivas,
GDH negativo) cabría esperar que NAAT fuera negativo y que la positividad de
las toxinas fuera un falso positivo.
En el trabajo multicéntrico de Planche del 2013 con 12420 muestras de

heces se validó que los algoritmos que usan NAATs y detección de toxinas en
heces, y los que usan GDH y la detección de toxinas son los mejores para el
diagnóstico microbiológico de la CDI (Planche, 2013).
Otro aspecto importante en el que coinciden las principales guías clínicas

de diagnóstico de CDI (European Society of Clinical Microbiology and Infectious
Diseases, Infectious Diseases Society of America, Society for Healthcare Epidemiology of
America y la guía del American Journal of Gastroenterology) es que no se debe repetir
una prueba positiva en heces para el control de la erradicación. En caso de querer
86
repetir una prueba negativa, al utilizar técnicas muy sensibles, se debe esperar al
menos una semana si todavía existe clínica compatible. Solo en casos de sospecha
de recurrencia a las semanas del episodio se deberísn repetir las pruebas
positivas.
Las principales guías también coinciden en que la población a la que se le

debe solicitar las pruebas de diagnóstico CDI, debe ser la de aquellos pacientes
que presentan 3 o más heces líquidas o semilíquidas (Escala 5-7 Bristol) en las
últimas 24 horas. Existen unos factores de riesgo que serán desarrollados en otros
apartados, como el uso de antibióticos, la estancia hospitalaria prolongada, edad
avanzada, presencia de comorbilidades, etc. Hay que tener en cuenta que se
deben descartar causas subyacentes como el uso de laxantes, quimioterapia,
enfermedad de Crohn, que podrían confundir, puesto que podríamos tener
concomitantemente una colonización de C. difficile y confundirla con una
infección por C. difficile responsable de la clínica. Se deben rechazar muestras de
heces sólidas y provenientes de pacientes que han tomado laxantes en las últimas
48 horas. No se deben solicitar a pacientes asintomáticos en ningún caso
(McDonald, 2018).
Las muestras de heces se deben conservar a 2-8ºC si no se van a procesar

en 24-72 horas y deben recogerse sin medio de transporte. El laboratorio debe
realizar estas pruebas al menos una vez al día, aunque es recomendable tenerla
como prueba urgente disponible 24 horas (Alcalá-Hernández, 2016).
La guía de Infectious Diseases Society of America, Society for Healthcare

Epidemiology of America es la única que incorpora consideraciones para pacientes
pediátricos. En neonatos debido a la alta tasa de colonización de C. difficile nunca
se deben realizar estas pruebas de diagnóstico microbiológico. En casos de niños
entre 1 y 2 años no debe realizarse de forma rutinaria el estudio. Solo en casos de
clínica compatible donde se han descartado otras causas de diarrea sería
procedente. En niños mayores de 2 años se recomienda realizar el diagnóstico
microbiológico en casos de diarrea prolongada y presencia de factores de riesgo
tales como la exposición a ambientes hospitalarios o el uso prologado de
antibióticos (McDonald, 2018).
87
1.5 RESPUESTA INMUNE DURANTE LA INFECCIÓN DE C. DIFFICILE.
Un aspecto clave es desglosary exponer la respuesta inmune global que se

establece entre C. difficile y el hospedador infectado. De esa manera, la respuesta
inmune global durante CDI no está completamente dilucidada puesto que existen
evidencias que demuestran tanto efectos protectores como efectos que finalmente
resultan patogénicos, como hemos visto en el apartado 1.3.2.3 “Actividad y efectos
eelulares e inmunológicos de las toxinas TcdA y TcdB de C. difficile”. Este efecto dual
de la respuesta inmune, junto con el mecanismo de resistencia a la colonización
de C. difficile que proporciona una microbiota normal, demuestra la importancia
de la relación entre las bacterias comensales intestinales y la respuesta
inflamatoria del hospedador durante la infección.
1.5.1 Respuesta inmune protectora y patogénica durante la infección de C.

difficile.
Se han realizado diversos estudios que demuestran que una respuesta

inflamatoria intacta es beneficiosa para combatir y resolver la infección de C.
difficile. Se ha visto en modelos animales que la ausencia de una respuesta inmune
completa es perjudicial para el hospedador. Se ha visto, por ejemplo, que ratones
infectados por C. difficile sin capacidad de movilizar sus neutrófilos en el intestino
presentaron mayor mortalidad que los controles (Hasegawa, 2011). Asimismo, la
leptina, una hormona asociada con la regulación de la respuesta inmune innata y
adaptativa, provocó el aumento de la erradicación de C. difficile, en modelos
murinos, y esto se correspondió con un aumento de mediadores inflamatorios
(Madan, 2014). También, las células linfoides innatas (ILCs) han sido identificadas
como células importantes en la resolución de la infección al producir IFNγ, una
interleucina proinflamatoria (Abt, 2015). Otra interleucina proinflamatoria, la IL-
22, ha sido asociada a mayor supervivencia a la CDI en ratones, ya que actuó
promoviendo la fagocitosis bacteriana dependiente de complemento (Hasegawa,
2014). Todos estos ejemplos mostrarían la importancia de una correcta respuesta
inmune para combatir la CDI.
88
Mientras que el reclutamiento de neutrófilos resulta clave para combatir la
CDI, también se ha evidenciado que estás células pueden exacerbar la severidad
de la enfermedad debido a efectos colaterales indeseables que ocasionan daños
tisulares y la formación de las pseudomembranas intestinales típicas. Ya hemos
visto que, junto a los efectos citopáticos y citotóxicos, TcdA y TcdB, provocan la
secreción de mediadores inflamatorios desde las células epiteliales como la
interleucina IL-8 y la proteína 1 quimiotáctica de monocitos, que promueven la
quimiotaxis de los neutrófilos hacia la mucosa colónica (Bobo, 2013). La
infiltración de neutrófilos promueve la secreción de fluidos y potencia la
inflamación de la mucosa y el daño generado. Además, TcdA y TcdB debido al
daño tisular generado pueden acceder a la lámina propia y estimular
directamente a los macrófagos y las células dendríticas y potenciar la respuesta
inflamatoria, ya que estos producen más interleucinas inflamatorias como el TNF-
α, IL-6, IL-8, IL-1β, prostaglandina 2, leucotrieno B4, que producen un mayor
reclutamiento de neutrófilos (Sun, 2009). Además, algunos estudios evidencian
que a través de efectos mediados por la IL-23, las toxinas TcdA y TcdB son
capaces de inclinar el balance inmune hacia una respuesta inflamatoria
exacerbada que conduce a una clínica severa (Cowardin, 2015). Otros estudios
muestran que la leucocitosis, como indicador de respuesta inflamatoria sistémica,
correlaciona con la severidad de la enfermedad y con un peor pronóstico en
pacientes hospitalizados con diarrea (Bulusu, 2000). A este respecto, se ha
asociado peor recuperación en pacientes hospitalizados con niveles elevados de
CXCL5 e IL-8, mediadores inflamatorios cuya función es reclutar neutrófilos en el
intestino. Además, en este estudio, la carga de C. difficile no se asoció con la peor
recuperación (El Feghaly, 2013). Asimismo, un polimorfismo en el gen que
codifica a la IL-8 que da lugar una sobrexpresión de esta se asoció a una elevada
tasa de recurrencia, apoyando la hipótesis que una inflamación
sobredimensionada es un mecanismo que provoca mayor severidad durante la
infección (Garey, 2010). Otras evidencias sobre la inducción de otros mediadores
inflamatorios que aumentan la severidad de la infección se encontraron en
estudios en modelos murinos que investigaron el papel de la IL-23, que también
tiene acción en el reclutamiento de neutrófilos intestinales (Buonomo, 2013). Un
esquema más amplio de las interacciones hospedador-patógeno que ocurren
durante la CDI puede observarse en la siguiente figura:
89
FIGURA 16: Interacciones Hospedador-C. difficile que provocan las respuestas inmunes
innatas. Los mecanismos de defensa están en rojo. La infiltración de neutrófilos puede
conducir a provocar daño tisular pero también a fagocitar C. difficile. SLPs (S-layer
proteins). CDT (Toxina binaria C. difficile). MAPK (Mitogen-activated protein kinase). TLR4
(Toll-like receptor 4). TLR5 (Toll-like receptor 5). Nod1 (Nucleotide-binding oligomerization
domain 1). (Sun, 2015).
Por tanto, viendo las evidencias a favor o en contra de uno de los dos
papeles de la respuesta inmune, protector o patógeno, durante la infección por C.
difficile, es probable que la respuesta inmune sea polifacética y pueda adoptar los
dos roles. La clave está en mantener un balance inflamatorio adecuado para
combatir la infección limitando los efectos colaterales como los daños tisulares. Lo
que resulta claro es que el grado de severidad de la clínica producida por la
infección de C. difficile gira entorno a la intensidad y el tipo de respuesta inmune
obtenida (Buonomo, 2016).
90
1.5.2 Papel de la microbiota en la respuesta inmune y su relación en la infección
de C. difficile.
La interrelación entre la microbiota y el epitelio intestinal juega un papel

importante en el modelaje de la respuesta inmune. Una prueba de ello es que los
ratones germ-free (ratones con tracto intestinal no colonizado por bacterias) tienen
poco desarrollada la respuesta inmune innata y adaptativa (Belkaid, 2014).
Las alteraciones en la composición de la microbiota pueden provocar

cambios en la reactividad de las células inmunes y esto puede contribuir en la
severidad de la infección de C. difficile. Por tanto, el enfoque es el contrario al del
apartado anterior donde se enumeraba como el sistema inmune puede influenciar
en la severidad de la CDI.
La influencia de la microbiota en el sistema inmune ocurre a través

moléculas señal de origen bacteriano que interactúan con células del intestino.
Algunas de éstas son la flagelina o las proteínas S-layer (proteínas de la superficie
celular bacteriana) que actúan sobre los PRRs (Pattern Recognition Receptors) de las
células inmunes y epiteliales. Estas señales son capaces de influir en el repertorio
de células inmunes presentes en la lámina propia y en su funcionalidad. Una clase
de PRRs son los TLRs (Toll-like Receptors) que reconocen específicamente señales
de C. difficile y contribuyen al inicio de la respuesta inmune del hospedador al
producir, por ejemplo, CXCL1, una interleucina responsable de la infiltración de
neutrófilos en la lámina propia del colon (Sansonetti, 2007). En este caso el TLR
implicado es el MyD88. Otros ejemplos son El TLR 4 que reconoce proteínas S-
layer y el TLR 5 que reconoce la flagelina (Sun, 2015).
Por tanto, una reducción de la diversidad de la microbiota intestinal puede

dar lugar a una respuesta inmune desequilibrada en el intestino que provoque un
aumento de la severidad de la CDI, puesto que estas señales microbianas pueden
influir e inducir a una población de linfocitos T reguladores en el colon (Lathrop,
2011). Esta regulación es a través de los ácidos grasos de cadena corta (AGCC),
productos provenientes de la fermentación bacteriana (principalmente) y de la
dieta, que genera una reducción de linfocitos T 17. Los linfocitos T 17 activados
91
estimulan la granulopiesis y el reclutamiento de neutrófilos en el lugar de
infección, por tanto, estos procesos se verían amortiguados (Arpaia, 2013). Por
ello, la composición y riqueza de la microbiota es clave para mantener un correcto
equilibrio entre la respuesta inmune proinflamatoria o reguladora, es decir, para
que no se produzca una disrupción entre la homeostasis entre los linfocitos T
reguladores y los linfocitos T 17.
Por otra parte, la microbiota intestinal también actúa a nivel de la capa

mucosa, al influir sobre la regulación de la expresión del gen muc2, uno de sus
componentes principales. La inducción de formación de capa mucosa reduciría la
inflamación al crear una barrera física entre la luz intestinal y el epitelio, y
provoca que las células dendríticas activen su capacidad reguladora de la
respuesta inmune (Shan, 2013).
El tratamiento antibiótico también produce un ambiente proinflamatorio

intestinal ya que aumenta la traslocación bacteriana. Esto provoca un aumento de
algunas interleucinas inflamatorias como el IFNγ o la IL-17 por los nódulos
mesentéricos linfoides (Knoop, 2015). Por tanto, el tratamiento antibiótico previo,
que es un hallazgo común en la CDI provoca, una disrupción de la microbiota
normal que permite la colonización de la bacteria, y por otra parte permite el
fenómeno de traslocación bacteriana con la consecuente inmune desequilibrada.
Asimismo, la microbiota intestinal también induce a las células

plasmáticas productoras de IgA, principal inmunoglobulina presente en las
mucosas, actuando a nivel de la barrera intestinal en su mantenimiento y
protección de microorganismos. Esto ha quedado evidenciado en los ratones germ
free que tienen niveles muy bajos de IgA (Macpherson, 2013). Además, existen
reducciones de las respuestas de las células plasmáticas, linfocitos B y
disminución de la IgA en pacientes con CDI y los niveles más bajos se dan en los
casos más severos (Johal, 2004). También, se ha visto que pacientes con
recurrencias de CDI comparados con aquellos que no recaen presentan
anticuerpos en suero frente a TcdA y TcdB muy bajos. Por tanto, la respuesta
inmune humoral es otro mecanismo por el cual la relación microbiota-sistema
inmune influye en la severidad de la CDI.
92
1.6 FACTORES DE RIESGO PARA LA INFECCIÓN DE CLOSTRIDIUM
DIFFICILE.
1.6.1 Factores de riesgo para la infección de C. difficile durante la

hospitalización.
Los principales factores de riesgo asociados a la CDI hospitalaria, son la

edad avanzada, que a su vez se asocia potencialmente a una mayor severidad de
la enfermedad de base y la presencia de mayores comorbilidades, y la duración
de la hospitalización (McDonald, 2006). El incremento diario en el riesgo de
padecer CDI durante una hospitalización ya nos sugiere que la misma
hospitalización es representativa de la duración y el grado de exposición a la
bacteria, probabilidad de exposición a antibióticos y severidad de la enfermedad
de base subyacente (Loo, 2011).
La exposición a antibióticos es el factor de riesgo modificable más

importante. Cualquier antibiótico se asocia con CDI, pero las cefalosporinas de
tercera y cuarta generación, carbapenems, fluorquinolonas y la clindamicina
presentan un elevado riesgo (Hensgens, 2012; Pépin, 2005; Johnson, 1999). La
exposición a estos antibióticos produce principalmente, aunque también por otros
mecanismos explicados en el apartado 1.5.2 “Papel de la microbiota en la respuesta
inmune y su relación en la infección de C. difficile”, una disrupción de la microbiota
intestinal normal, que hace que merme la resistencia a la colonización a C. difficile
ya que esta bacteria encuentra un nicho ecológico más apropiado para proliferar.
El riesgo relativo a la exposición a antibióticos y su asociación con la CDI depende
de la prevalencia local de los ribotipos circulantes y de si son particularmente
virulentos o bien resistentes al antibiótico administrado. La perturbación de la
microbiota en estos casos es de larga duración. El riesgo de CDI aparece al iniciar
el tratamiento y durante los 3 meses posteriores a la finalización de la terapia,
aunque el mayor riesgo dentro de este periodo (entre 7 y diez veces más) ocurre
durante el primer mes posterior a la administración antibiótica (Pépin, 2005). No
obstante, una sola dosis, por ejemplo, en una profilaxis antibiótica quirúrgica, ya
provoca que ese paciente tenga un mayor riesgo de una colonización o infección
de C. difficile. El número de antibióticos y los días de exposición también influyen
93
en el desarrollo de CDI. El uso de varios antibióticos provoca mayor riesgo y se
ha visto que la incidencia de la CDI aumenta con el número de antibióticos
prescritos (Thibault, 1991). Es por ello esto que en la guía de de práctica clínica
para la infección C. difficile en adultos y niños del año 2017 de la Infectious Diseases
Society of America (IDSA) y la Society for Healthcare Epidemiology of America (SHEA),
se hace referencia al uso de antibióticos para el control de la CDI y se recomienda
que se debe minimizar la frecuencia y la duración de la terapia de antibióticos de
alta riesgo y, en general, el número de antibióticos prescritos. También se
recomienda que exista una política bien establecida sobre el uso de antibióticos y
que la selección de éstos debería hacerse conforme a la epidemiología local y la
cepa predominante de C. difficile, y que debería plantearse restringir el uso de
fluorquinolonas, cefalosporinas y clindamicina, excepto en la profilaxis antibiótica
quirúrgica (McDonald, 2018). Por tanto, para un mayor control de la diseminación
de la infección o colonización de C. difficile es un proceso crítico evitar
tratamientos antibióticos innecesarios, minimizar su duración e implementar
políticas de uso.
La quimioterapia para el cáncer es otro factor de riesgo, ya que ciertos

antitumorales tienes en parte actividad antibiótica. También es debido a sus
efectos inmunosupresores que generan neutropenia (Morales Chamorro, 2005).
Otra causa de inmunosupresión a la que se asocia la CDI es el VIH. Estos
pacientes presentan mayor riesgo por la misma inmundeficiencia, pero también
por la posible exposición a antibióticos reiterada y a una exposición continuada a
ambientes hospitalarios (Sánchez, 2005). También el uso de corticoides supone un
factor de riesgo por la inmunosupresión. (Surawicz, 2013).
Otros factores de riesgo descritos hace algunos años son la cirugía

gastrointestinal y la manipulación del tracto gastrointestinal (Thibault, 1991). De
hecho, en la guía del American Collegue of Gastroenterology del año 2013 sobre
diagnóstico, prevención y tratamiento de la infección de C. difficile, se reconocen
ciertas situaciones comórbidas que generan un aumento en el riesgo de padecer
CDI como la ileostomía y colectomía. También hace especial mención a los
pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad hepática crónica,
receptores de trasplante de órganos, pacientes con hipogamaglobulinemia y
94
mujeres embarazadas y durante el periodo periparto (Surawicz, 2013). Con
respecto a los pacientes hospitalizados con enfermedad inflamatoria intestinal
esta guía recomienda el estudio microbiológico de la CDI cuando haya clínica
compatible. El diagnóstico en estos casos es difícil porque la clínica de un brote de
enfermedad inflamatoria intestinal y CDI es indistinguible. Además, los pacientes
con enfermedad inflamatoria intestinal tienen una mayor tasa de colonización de
C. difficile. Son especialmente propensos debido a la inflamación colónica
preexistente con colitis ulcerativa incluso y la terapia inmunosupresiva con
corticoides.
Con respecto a los medicamentos antiácidos o protectores de estómago,

como los inhibidores de la bomba de protones existe una controversia sobre si su
uso es o no un factor de riesgo. En las guías de práctica clínica para la infección C.
difficile en adultos y niños del año 2017 de la IDSAy SHEA, aparece como
recomendación que, si bien existe una asociación epidemiológica entre estos
medicamentos y la CDI y todo caso que exista de uso innecesario de inhibidores
de la bomba de protones debe ser discontinuado, no hay suficientes evidencias de
que cesar el tratamiento con estos fármacos supone una manera de prevenir la
CDI (McDonald, 2018).
1.6.2 Factores de riesgo para la infección de C. difficile adquirida en la

comunidad.
A principios del siglo XXI, junto con el cambio en la epidemiología de la

CDI debido a la aparición de ribotipos hipervirulentos y causantes de infecciones
de mayor severidad, hubo un aumento también de casos en la comunidad que se
mantiene hasta hoy (McDonald, 2018). Los factores de riesgo para estos casos no
están exactamente definidos. El programa de vigilancia de CDI del National Center
for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases del Centers for Disease Control and
Prevention durante los años 2009 a 2011, observó que el 82% de los casos
presentaron algún tipo de exposición a ambientes hospitalarios en las últimas 12
semanas, un 64% informó de administración de antibióticos en las últimas 12
semanas y 31% informó de uso de fármacos inhibidores de la bomba de protones
(Chitnis, 2013).
95
En pacientes ambulantes con enfermedad inflamatoria intestinal también

existe un riesgo aumentado de CDI. Las guías IDSA y SHEA del 2017
recomiendan que, en pacientes de este tipo que desarrollan diarrea, con un estado
quiescente de la enfermedad, o con la presencia de algún factor de riesgo clásico,
como una reciente hospitalización o el uso de antibióticos, se realice el diagnóstico
microbiológico CDI (McDonald, 2018).
Otros pacientes ambulantes con especial riesgo son los receptores de

trasplantes sólidos y de médula ósea (sobre todo durante el periodo
peritrasplante) y pacientes con enfermedad renal crónica y enfermedad renal
terminal.
1.7 COLONIZACIÓN POR C. DIFFICILE.
Un grupo importante en nuestro estudio van a ser los individuos

colonizados por C. difficile. En este apartado vamos a definir este estado de
colonización, repasar su epidemiología y, lo más importante, su implicación
clínica.
1.7.1 Concepto de estado de colonización por C. difficile.
La condición de colonización por C. difficile se produce cuando es

detectado en heces mediante las pruebas de laboratorio desarolladas en el
apartado 1.4.2 “Diagnóstico microbiológico de la infección por C. difficile”, en ausencia
de síntomas o signos de infección.
Aunque algún estudio ha mostrado que la detección de toxinas de C.

difficile en heces está asociada con una mayor severidad y sintomatología
(Planche, 2013), también se ha visto que la presencia de ellas por si mismas son
insuficientes para establecer el diagnóstico, ya que existen pacientes donde han
sido detectadas pero que no han presentado clínica (Kyne, 2000). Es por lo que la
CDI se diagnostica mediante una serie de manifestaciones clínicas en
combinación con pruebas de laboratorio o mediante hallazgos histopatológicos o
96
radiológicos compatibles con la colitis pseudomembranosa (McDonald 2018). Por
tanto, si bien en la bibliografía al respecto a lo largo de los años se han usado
diferentes denominaciones de portadores o colonizados asintomáticos de C.
difficile, es necesario definir el concepto correctamente y con mucha exactitud:
 Colonización asintomática o estado de portador asintomático: Es la ausencia
de diarrea (si está presente debe ser atribuible a otras causas diferentes a la
CDI) sin hallazgos histopatológicos o radiológicos compatibles con colitis
pseudomembranosa, pero con detección de C. difficile o de evidencia de la
presencia de sus toxinas en heces (Furuya-Kanamori, 2015).
La novedad de esta definición es que los síntomas pueden surgir a partir

de otras condiciones concomitantes. La diarrea afecta de forma habitual a
pacientes hospitalizados y la mayor parte de veces es atribuible a condiciones no
infecciosas, como puede ser efectos adversos de medicamentos o a otras
enfermedades como la enfermad inflamatoria intestinal, por ejemplo. La
proporción de casos de diarrea nosocomial atribuibles a C. difficile se sitúa sobre el
20% (Polage, 2012), aunque este dato va a variar en función de la epidemiología
local. Por tanto, la identificación de pacientes portadores asintomáticos puede ser
dificultosa, ya que muchas veces la causa de la diarrea no puede ser identificada y
surge la duda de si se trata de pacientes infectados o colonizados. Un ejemplo
claro de esto ocurre en pacientes hospitalizados con enfermedad inflamatoria
intestinal donde la propia enfermedad produce diarrea como síntoma principal y,
además, se trata de una población de pacientes con una alta tasa de portadores de
C. difficile. En estos casos siempre es muy importante valorar los factores de riesgo
existentes para desarrollar CDI.
1.7.2 Epidemiología de la colonización de C. difficile.
La tasa de colonización asintomática de C. difficile varía considerablemente

entre las diferentes poblaciones que se han estudiado. En niños menores de dos
años la tasa de portadores es muy elevada, sobre todo en neonatos hospitalizados
(McDonald, 2018), pudiéndo exceder del 40%. Aunque la tasa de colonización
disminuye desde el primer año de vida, es posible una detección intermitente a lo
largo de la infancia (Rousseau, 2012). Desde los 2-3 años la tasa de portadores ya
97
es similar a los adultos sanos (McDonald, 2018). Esto es debido a que a esta edad
la microbiota intestinal de los niños se asimila a la de los adultos y por tanto
comienzan los mecanismos de resistencia a la colonización de C. difficile. No
obstante, estudios recientes han demostrado que la tasa de colonización en niños
ya mayores de 2 años podría ser hasta del 30%. Estas variaciones epidemiológicas
deben considerarse en el contexto de las diferentes distribuciones de los ribotipos
en los diferentes países (Furuichi, 2014).
Debido a la elevada tasa de portadores, supone un reto definir cuando en

niños con diarrea se debe sospechar que la causa se debe a una infección por C.
difficile. De hecho, la guía clínica del 2017 de la IDSA y la SHEA no recomienda el
estudio microbiológico de C. difficile en niños menores de un año con diarrea. En
niños mayores de 2 años solo debe realizarse cuando exista una alta sospecha
debido a la presencia de factores de riesgo y/o enfermedades subyacentes que
supongan un riesgo, como la enfermedad inflamatoria intestinal o situaciones
inmunocomprometidas.
La relevancia clínica de la colonización de neonatos y niños pequeños es

baja debido a la baja tasa de enfermedad en esta población (Zilberberg, 2010). Esto
probablemente es debido a la ausencia o inmadurez de los receptores de las
toxinas TcdA y TcdB (Crobach, 2018). Aún así, van a formar un reservorio
potencial de transmisión a la población adulta. La fuente de colonización en los
niños es desconocida pero lo más probable es que sea ambiental y a través de
contacto persona-persona (Crobach, 2018).
En adultos sanos la tasa de colonizados por C. difficile puede variar entre el

4% y l5% (Crobach, 2018), aunque en ausencia de exposición a ámbitos
hospitalarios puede ser menor al 2% (McDonald, 2008).
Los estudios demuestran tasas de portadores de entre el 3% al 21% en los

pacientes hospitalizados. En un metanálisis del 2015 de 19 estudios realizados
entre 2005 y 2015 la tasa de portadores fue 8% (Zacharioudakis, 2015). Estos
pacientes van a suponer un reservorio de C. difficile considerable y una fuente
potencial de transmisión nosocomial (Riggs, 2007; Crobach, 2018). Por supuesto,
98
el tiempo de estancia hospitalaria va a estar relacionado con la colonización
debido a un mayor tiempo de exposición. No obstante, la potencial transmisión es
menor en portadores asintomáticos hospitalizados que en pacientes con
enfermedad activa (McFarland, 1989). Con respecto a los pacientes en cuidados
intensivos, un estudio reciente ha demostrado una baja tasa de colonización del
2% de cepas toxigénicas, con lo que desaconsejan las medidas para reducir la
presencia de C. difficile debido a la baja prevalencia, ya que resultarían poco coste-
efectivas (Zhang, 2016).
Existen otras poblaciones en las que encontramos tasas de portadores

elevadas. Una de ellas es la de ancianos en residencias de la tercera edad, donde
la tasa de portadores varía entre el 4% y el 51%. En instituciones donde ha habido
un brote previo de CDI la tasa de portadores es mayor (Crobach, 2018). Los
trabajadores de instituciones sanitarias también forman un potencial reservorio C.
difficile, con una tasa de portadores algo mayor a la de la población general,
debido al contacto continuado con las esporas. Los estudios realizados
demuestran mucha variabilidad en estos casos, pudiendo estar entre el 0% y el
12% (Furuya-Kanamori, 2015). Los pacientes con fibrosis quística tienen también
una elevada tasa de portadores, mayor incluso que los pacientes hospitalizados,
que varía entre el 8% y el 47% (Furuya-Kanamori, 2015). La causa por la cual estos
pacientes presentan una elevada colonización pero desarrollan poco la
enfermedad, es debida a la presencia de un transporte de electrolitos deficiente en
las células epiteliales que le concede cierta protección frente a las toxinas TcdA y
TcdB. Los pacientes en rehabilitación también presentan tasas de colonización
mayores de lo normal, debido a la estancia hospitalaria prolongada y repetida
(Furuya-Kanamori, 2015).
Un aspecto importante a la hora de valorar estas tasas de portadores

mayores en algunas poblaciones, es la duración del estado de colonización, es
decir, el tiempo durante el cual estos individuos permanecen asintomáticos desde
el contacto con las esporas de C. difficile hasta que desarrollan sintomatología, o
bien pasan a un estado de no colonización o erradicación. Para ello se requerirían
estudios longitudinales a gran escala, pero esto no ha sido posible y la
información al respecto es limitada. No obstante, se ha realizado alguna
99
aproximación mediante estudios observacionales de corto plazo (Samore, 1994).
Así, se estima que el tiempo que transcurre entra la ingesta de la espora y el
desarrollo de la CDI es de 1 a 2 semanas. Si esto no ocurre en este corto plazo de
tiempo no suele desarrollarse la clínica (Samore, 1994). A pesar de que los datos
son limitados, demuestran que la naturaleza del estado de portador suele ser
transitoria y sin sintomatología, siempre y cuando no haya una exposición
repetida a factores de riesgo determinantes de infección como la administración
de antibióticos. Bien es cierto que existe una marcada variabilidad en la duración
reportada por los diferentes estudios que seguramente tendrá relación con la
exposición repetida a las esporas de C. difficile o bien, con reservorios de la
bacteria, aspecto que no se ha investigado en los pocos trabajos sobre el tema.
Los factores de riesgo para una posible colonización, a diferencia de los

determinantes para el desarrollo de la enfermedad por infección de C. difficile, los
cuales son bien conocidos desde hace tiempo, han suscitado interés más bien de
forma reciente. Es importante distinguir entre los casos provenientes de la
comunidad y los provenientes de hospitalizaciones. Los estudios epidemiológicos
sobre colonización en la comunidad no son muy amplios. La transmisión
persona-persona es importante ya que se ha visto que pacientes colonizados en la
comunidad y sus familias o personas cercanas presentan los mismos ribotipos
(Kato, 2001).
Reconocer a los portadores sanos en el momento del ingreso hospitalario

resultaría importante porque conforman un reservorio y podrían diseminar las
esporas en este ámbito. Factores de riesgo bien conocidos de una posible
colonización en el momento del ingreso serían la hospitalización reciente, diálisis
crónica, terapia inmunosupresora, uso de inhibidores de la bomba de protones y
la presencia de anticuerpos frente a TcdB (Crobach, 2018). El principal riesgo de
todos es el contacto con ambientes hospitalarios previos y repetidos.
Los principales factores de riesgo para la colonización de C. difficile

durante la hospitalización son alguna hospitalización previa durante los doce
meses anteriores, el uso de inhibidores de la bomba de protones o
antihistamínicos anti H2, quimioterapia, corticoterapia, historia previa de CDI y
100
el uso de antibióticos (Loo, 2011M; Kong, 2015), aunque en otros estudios no se ha
encontrado asociación con antibioticoterapia o CDI previa (Zacharioudakis, 2015).
1.7.3 Implicación clínica de la colonización de C. difficile.
El aspecto más importante en el estudio de la colonización por C. difficile es

la implicación clínica que supone. Ya hemos visto que los portadores a nivel
epidemiológico suponen un reservorio potencial de infección que puede suponer
un riesgo para que otros pasen a estar colonizados o bien desarrollen la
enfermedad (Riggs, 2007). La otra clave resulta en saber si el hecho de estar
colonizado por C. difficile y ser definido como portador asintomático supone una
protección o bien es probable que se desarrolle progresión a CDI. La verdad es
que pocos estudios han sentados claras evidencias en el papel del estado de
portador asintomático en la progresión a CDI sintomática (Furuya-Kanamori,
2015). Lo que sí se ha confirmado es que las cepas toxigénicas son más
prevalentes en los portadores asintomáticos que las no toxigénicas (Furuya-
Kanamori, 2015).
Se ha demostrado que la colonización por C. difficile provoca una respuesta

inmune humoral que confiere cierta protección a la progresión hacia CDI en
ausencia de otros factores de riesgo. En un estudio prospectivo del New England
Journal of Medicine en el año 2000 las concentraciones de IgG frente a TcdA fueron
mayores en portadores asintomáticos en el momento de la colonización que
aquellos que desarrollaron diarrea (Kyne, 2000). El mismo autor en Lancet en el
2001 mostró que los pacientes de esta cohorte con un solo episodio de diarrea
tenían concentraciones más elevadas de IgM frente a TcdA y TcdB que aquellos
con CDI recurrente (Kyne, 2001). Además, la mayoría de los niños sanos y hasta
un 60% de los adultos presentan IgG e IgA frente a TcdA y TcdB detectables,
incluso si C. difficile no es detectado (Sánchez-Hurtado, 2008). Esto último
implicaría que durante la infancia se crean anticuerpos frente a C. difficile durante
la fase de colonización asintomática (Kelly, 2011). No obstante, un punto que
consideramos clave, como dijimos en el 1.3.2.2 “Expresión y genética de las toxinas
TcdA y TcdB de C. difficile”, es que, a diferencia de la mayoría de las bacterias
patógenas productoras de toxinas, donde los genes que las codifican están muy
101
conservados, en C. difficile no ocurre de esta manera. Existe una alta tasa de
mutación en el gen tcdB codificante de TcdB. Es posible que esta variación
toxinotípica conduzca a una falta de protección inmunitaria y que la población
carezca de ella al exponerse a cepas con variantes de toxinas. Este aspecto
resultaría importante a la hora de producir vacunas y anticuerpos como terapia
alternativa a la convencional.
No hay evidencia de que las cepas no toxigénicas sean capaces de producir

clínica. En el caso de estudios que han demostrado la presencia de cepas no
toxigénicas en pacientes con CDI, el cultivo de C. difficile mostró que realmente
había una mezcla de cepas toxigénicas y no toxigénicas, por lo cual no se asoció
su presencia al desarrollo de la CDI (Natarajan, 2013). Por tanto, los pacientes con
diarrea y con evidencia de presencia de cepas no toxigénicas de C. difficile deben
ser considerados portadores asintomáticos, a no ser que haya presencia de
hallazgos radiológicos o histopatológicos compatibles con colitis
pseudomembranosa. También, como en el caso de las cepas toxigénicas, la
colonización puede ser transitoria o permanente. Se ha sugerido que la
colonización por cepas no toxigénicas puede ofrecer protección contra la
infección, potenciando la resistencia a la colonización por cepas toxigénicas a
través de mecanismos competitivos de nutrientes o de accesibilidad a las células
epiteliales intestinales (Gerding, 2015).
La guía de práctica clínica para CDI de la IDSA y la SHEA no recomienda

realizar un screening activo para la búsqueda y detección de portadores
asintomáticos de C. difficile. Esto lo realiza en bases a que hay opciones limitadas
de tratamiento en estos casos, el tratamiento antibiótico en muchos casos no
erradica las esporas, los pacientes pueden volverse susceptibles a la progresión a
CDI y además la colonización puede ofrecer protección al desarrollo de CDI
(McDonald, 2018). Es más recomendable realizar una vigilancia en cuanto al
control de la infección en localizaciones de elevada tasa de portadores (Furuya-
Kanamori, 2015).
Como conclusión, hay que exponer que la colonización asintomática de C.

difficile permanece aún como un problema de salud complejo, con epidemiología
102
variable. Los portadores asintomáticos forman un potencial reservorio para la
transmisión horizontal a nivel hospitalario de cepas toxigénicas en mayor
medida. El impacto clínico de lo que supone ser portador asintomático y su
posible progresión al desarrollo de la enfermedad permanece todavía sin
resolución definitiva. Un metanálisis de 1998 (muy citado) basados en 4 estudios
previos a la época de los brotes de las cepas hipervirulentas, expuso que los
portadores asintomáticos tenían menor riesgo de desarrollar CDI (Shim, 1998). No
obstante, este metanálisis no analizó por separado la presencia de colonización
por cepas toxigénicas y no toxigénicas y su evolución. Esto es importante ya que
la colonización por cepas no toxigénicas llegaba a ser del 44%. Estudios
posteriores mejor diseñados en este aspecto, a pesar de otras limitaciones, sí que
han puesto de manifiesto que la colonización por cepas toxigénicas de C. difficile
en el inicio de la hospitalización supone un riesgo para el progreso a CDI durante
esa hospitalización (Crobach, 2018). Obviamente la colonización por cepas más
virulentas, en todos los aspectos posibles, tanto de toxicidad como de
colonización, va a aumentar la probabilidad de desarrollar CDI.
103
FIGURA 17: Esquema de la colonización por esporas de C. difficile y las diferentes

posibilidades de progresión. (Furuya-Kanamori, 2015).
1.8 TRATAMIENTO DE LA INFECCIÓN POR C. DIFFICILE: TERAPIA

ANTIBIÓTICA CONVENCIONAL Y NUEVAS TERAPIAS ALTERNATIVAS.
1.8.1 Tratamiento antibiótico convencional frente a la infección por C. difficile.
Cuando se ha establecido el diagnóstico de CDI, una práctica

recomendable es la supresión, en la medida de lo posible, de cualquier terapia
antibiótica que hubiera podido ser un factor de riesgo desencadenante. Si no se
suprime es posible que haya una respuesta clínica disminuida a la terapia,
además de un incremento de la probabilidad de recurrencias (Garey, 2008).
La terapia antibiótica debe ser iniciada empíricamente en dos situaciones;

si el diagnóstico microbiológico se va a demorar y existe una sospecha clínica
razonable, y si el paciente presenta una CDI fulminante (McDonald, 2018). En el
resto de situaciones convendría esperar a tener un diagnóstico completo para
104
establecer la terapia. De esta manera limitaremos la sobreutilización de
antibióticos y sus toxicidades y efectos adversos asociados, incluido la aparición
de bacterias multirresistentes.
Desde hace 30 años, el metronidazol y la vancomicina oral han sido los

tratamientos de elección para la CDI. Ensayos clínicos aleatorizados en los años 80
y 90 mostraron que no había diferencia en los resultados obtenidos con ambos
(Wenisch, 1996). No obstante, desde el año 2000 otros ensayos clínicos
aleatorizados con placebo sí que han evidenciado que la vancomicina oral
muestra mejores resultados que el metronidazol (Zar, 2007). Además, hace pocos
años, la agencia FDA americana aprobó la fidaxomicina como tratamiento para la
CDI. Dos ensayos clínicos aletorizados compararon la eficacia de la vancomicina
oral frente a la de la fidaxomicina mostrando la resolución de la diarrea
resultados similares, aunque la ausencia de diarrea a los 25 días fue mejor con la
fidaxomicina (Cornely, 2012).

un episodio inicial.
La guía clínica del 2017 de la IDSA y la SHEA realiza una serie de

recomendaciones al respecto del tratamiento antibiótico de elección con respecto a
un episodio inicial de CDI. La vancomicina o la fidaxomicina se recomienda por
encima del metronidazol. La dosis de la vancomicina oral es 125 mg/4 veces al día
y la de la fidaxomicina 200 mg/2 veces al día, durante 10 días en ambos casos. Si
hay problemas de abastecimiento de vancomicina o fidaxomicina, entonces se
recomienda metronidazol 500 mg/3 veces al día durante 10 días (McDonald,
2018). Hay que intentar evitar el uso prolongado del metronidazol debido a su
potencial neurotoxicidad irreversible. Es aceptable restringir el metronidazol solo
en casos de falta de disponibilidad de vancomicina o fidaxomicina o bien en
contraindicaciones a estos. Aunque los ensayos clínicos han demostrado que el
tratamiento de 10 días es suficiente en la mayoría de pacientes, en algunos casos
la respuesta tarda en alcanzarse, especialmente con el metronidazol. En estos
casos el tratamiento podría prolongarse hasta los 14 días (Wilcox, 1995).
105
Algunos estudios han intentado relacionar algunos parámetros con la
severidad de la CDI para valorar si el tratamiento está siendo eficaz. Se ha visto
que la fiebre superiror a 38.5ºC, un recuento total de leucocitos en sangre total
mayor a 15000/µL y una creatinina en suero mayor a 1.5 mg/dL correlaciona con
un fallo terapéutico y una mala evolución (Bauer, 2012). La guía de la IDSA y la
SHEA recomiendan el recuento total de leucocitos y la creatinina en suero como
factores que determinan la severidad de la CDI (McDonald, 2018), aunque esto no
es aplicable en caso de enfermedades concomitantes hematológicas malignas o de
insuficiencia renal.
Otros tratamientos antibióticos alternativos de probable eficacia, pero no

aprobados por la FDA son la nitazoxanida y el ácido fusídico. Tratamientos
ineficaces o de eficacia no demostrada, según la literatura, son la rifaximina,
tigeciclina y bacitracina (McDonald, 2018).

un caso fulminante.
La vancomicina oral a altas dosis ha sido el tratamiento histórico de

elección en casos de CDI fulminante. Si no hay presencia de íleo paralítico, la
vancomicina puede ser administrada por vía rectal en enemas. La dosis suele ser
500 mg/6 horas durante un mes o bien 500 mg en 100 mL de suero salino en
enema a los mismos tiempos. Se debe añadir metronidazol intravenoso 500 mg/8
horas (McDonald, 2018).
La intervención quirúrgica puede ser una opción en ciertos pacientes con

parámetros bioquímicos de severidad muy alterados, como un recuento total de
leucocitos mayor a 25000/µL y lactato en suero mayor a 4 mmol/L. La colectomía
subtotal es el procedimiento de elección en casos de megacolon tóxico,
perforación colónica y abdomen agudo o de pacientes con shock séptico asociado
a fallo multiorgánico (McDonald, 2018).
106
1.8.1.3 Tratamiento antibiótico convencional frente a la infección de C. difficile
recurrente.
Se espera aproximadamente que el 25% de los pacientes tratados para CDI

con vancomicina padezcan, al menos, una recurrencia (Cornely, 2012). La
recurrencia puede producirse por la misma o por distinta cepa de C. difficile,
aunque clínicamente ambas formas no pueden diferenciarse y serán manejadas de
igual forma. Las recurrencias se dan en menos casos si el episodio inicial es
tratado con fidaxomicina (Cornely, 2012).
El tratamiento de elección en la primera recurrencia es la vancomicina oral

mediante un régimen especial, es decir, 125 mg/12 horas una semana, 125 mg/24
horas una semana y 125 mg/48 horas durante 2-8 semanas. Lo que se busca es
eliminar las esporas y esperar que la microbiota intestinal se reestablezca. El
metronidazol no es opción en estos casos por sus peores resultados que la
vancomicina y su potencial efecto neurotóxico a largo plazo (McDonald, 2018). La
fidaxomicina a dosis normales sería otra opción que considerar.
Las segundas y siguientes recurrencias se deben tratar con vancomicina

oral a régimen especial que hemos visto en el apartado anterior. La experiencia
con fidaxomicina en estos casos es limitada (McDonald, 2018).
1.8.1.4 Resistencias de C. difficile al tratamiento antibiótico.
C. difficile es normalmente susceptible a los antibióticos de elección

vancomicina, metronidazol y fidaxomicina, pese a que la tasa de resistencias está
aumentando de forma global rápidamente. Estos tratamientos de elección aun son
notablemente activos y son los recomendados en las guías clínicas para la CDI,
pero sus resistencias comienzan a ser detectadas. También, se observan
resistencias variables a otros antibióticos que varían en función de la zona
geográfica (Banawas, 2018).
De forma general, se ha visto que las cepas epidémicas son más resistentes
que las no epidémicas. El ribotipo hipervirulento 027 presenta una resistencia a la
107
clindamicina del 50% y al moxifloxacino del 93% (Tickler, 2013), muy elevada esta
última debido a la presencia como factor de virulencia de mutaciones que le
conceden una resistencia de alto nivel a las fluorquinolonas (Mits, 2013). También
un 40% de estos ribotipos presentan una baja susceptibilidad a la vancomicina
(Tickler, 2013). De forma general las tasas de resistencia encontradas en el ribotipo
027 son mayores que las de ribotipos no 027.
En un trabajo epidemiológico realizado en hospitales de Barcelona en

2013, se pretendió estimar la incidencia de la CDI, ribotipos y toxinotipos en las
cepas aisladas, e identificar predictores de resultado desfavorable. Se observaron
unas resistencias del 74% a la clindamicina, del 49% a la eritromicina, del 42% al
moxifloxacino pero del 100% al ciprofloxacino, del 24% a la rifampicina y no hubo
resistencia a la vancomicina, metronidazol y tetraciclina (Rodríguez-Pardo, 2013).
Las resistencias al metronidazol son muy bajas, aunque algunos estudios

muestran tratamientos fallidos con este antibiótico (Debast, 2014). Los
mecanismos de susceptibilidad y resistencia al metronidazol para C. difficile y
otros anaerobios son desconocidos. Se ha especulado con que podría estar
reducida su entrada al interior de la bacteria (Banawas, 2018).
Se han reportado escasos casos de cepas de C. difficile resistentes a la

vancomicina (Banawas, 2018). Su mecanismo de acción es la inhibición de la
síntesis del peptidoglicano por la unión a la D-alanil-D-alanina al extremo
terminal del precursor del peptidoglicano. El mecanismo de resistencia de C.
difficile a este antibiótico es desconocido.
La fidaxomicina actúa a inhibiendo la ARN polimerasa durante la

transcripción bacteriana. Existen algunas cepas resistentes a este antibiótico,
aunque se considera de elección (Goldstein, 2011). El mecanismo de resistencia
sugerido se debería a mutaciones en la ARN polimerasa (Banawas, 2018).
Con respecto a la eritromicina y clindamicina, su mecanismo de acción es

a través de la inhibición de la síntesis proteica. Se unen a la subunidad 50s del
ribosoma de la bacteria e inhiben la extensión de la cadena peptídica. Ambos
presentan altas tasas de resistencia reportadas en varios países (Banawas, 2018).
108
La metilasa ribosomal codificada por el gen ermB puede modificar al ARNr 23S y
genera elevadas tasas de resistencia a estos antibióticos, aunque otro mecanismo
propuesto es el flujo activo al exterior de la bacteria.
La tetraciclina es un bacteriostático que se une específicamente al

segmento inicial del ARNr 30S, no permitiendo la unión del aminoacil-tARN al
ribosoma, por tanto, no permitiendo la formación de la cadena peptídica. La
resistencia es debida a un flujo activo de salida al exterior de la bacteria y también
la proteína Tetracycline Resistance. Esta proteína protege al ribosoma de la acción
de la tetraciclina. En China existe una tasa de resistencia del 62% a este antibiótico
(Huang, 2009).
Con respecto a la resistencia de las fluorquinolonas ya hemos visto su

importancia en la diseminación del ribotipo 027. Estos antibióticos actúan
inhibiendo la ADN girasa bacteriana, inhibiendo la síntesis o replicación del ADN
bacteriano. Los mecanismos de resistencia son mediante mutaciones en los genes
codificantes de las dianas (GyrA y/o GyrB), reduciendo su afinidad por los
antibióticos, y mediante un flujo activo al exterior de la célula o bien debido a una
permeabilidad reducida.
La resistencia a la rifampicina o miembros de su grupo como la rifamicina

o rifamixina es debida a mutaciones en la ARN polimerasa ADN dependiente que
la inhiben impidiendo la transcripción del ADN de C. difficile y otras bacterias
Gram positivas. En España encontramos una tasa de resistencia del 24%
(Rodríguez-Pardo, 2013).
1.8.2 Terapias alternativas para el tratamiento de la infección de C. difficile.
1.8.2.1 Trasplante de Microbiota Fecal.
El trasplante de microbiota fecal (FMT, Fecal Microbiota Transplantation) es

un método efectivo para la CDI recurrente (Brandt, 2012). Se recomienda por la
guía de la CDI de la IDSA y la SHEA del 2017 (McDonald, 2018), normalmente
después de la tercera recurrencia El objetivo es restaurar la composición normal
109
de la flora intestinal al transferir heces desde un donante sano. También se actúa
estimulando la respuesta inmune a la CDI en el receptor. Actualmente no está
aprobado como modalidad de tratamiento ni por la FDA ni por la EMA (European
Medecines Agency).
El primer FMT fue realizado en 1958 en 4 pacientes con colitis

pseudomembranosa y en todos los casos se resolvió la infección (Kelly, 2015). El
primer ensayo clínico aleatorizado que comparó resultados clínicos entre terapia
antibiótica y FMT se realizó en 2013 (van Nood, 2013). En pacientes con varías
recurrencias de CDI se observó un 81% de resolución de la diarrea en pacientes
tratados con FMT, y solo un 27% pacientes tratados con vancomicina. De hecho, el
estudio terminó prematuramente debido al beneficio que suponía ser tratado con
el FMT con respecto a la vancomicina.
No obstante, hay barreras prácticas para su mayor implantación (se

requiere un banco de donantes de heces y su preparación). Los efectos adversos
también deben ser considerados. La literatura nos dice que el FMT es seguro a
corto plazo, pero se han reportado casos de fiebre elevada o de colitis ulcerativa
(Roshan, 2018).
1.8.2.2 Inmunoterapia.
En 2017 la FDA y en 2018 la EMA aprobaron el primer anticuerpo

monoclonal para la prevención de CDI recurrente en pacientes mayores de 18
años, llamado bezlotuxumab (Zinplava®). Se trata de un anticuerpo con actividad
anti TcdB. Existe otro anticuerpo anti TcdA llamado actoxumab. En 2 ensayos
clínicos aleatorizados con 2655 pacientes con CDI que recibieron tratamiento
antibiótico se ha investigado la eficacia del bezlotuxumab, solo o combinado con
actoxumab en la tasa de recurrencias. La terapia con bezlotuxumab dio lugar a
una muy baja tasa de recurrencias (Wilcox, 2017). Debido a lo costoso del
tratamiento permanece en debate si esta terapia es coste-efectiva. Para la guía de
la CDI de la IDSA y la SHEA del 2017, todavía no hay suficiente evidencia para
recomendar este tratamiento en la práctica asistencial (McDonald, 2018).
110
1.8.2.3 Terapias complementaria y alternativas.
Debido a las crecientes tasas de fallos al tratamiento antibiótico

convencional se van proponiendo nuevas terapias alternativas. Los compuestos
bloqueadores de la toxina impiden que interactúen con el enterocito. Algunos de
ellos son adsorbentes como las resinas tipo colestiramina o colestipol, polímeros y
oligosacáridos. Los resultados obtenidos hasta la fecha no son satisfactorios
(Roshan, 2018).
Los bacteriófagos son virus aislados o integrados en el genoma bacteriano

que contienen elementos de control de lisogenia como represores, antirepresores e
integrasas. Se ha desarrollado un bacteriófago específico para la cepa NCTC 12712
de C. difficile que, en estudios in vitro ha demostrado un efecto reductor del
crecimiento y la producción de las toxinas, sin aparentemente afectar al resto de la
microbiota comensal intestinal (Meader,2010). Podría ser una terapia profiláctica
prometedora.
Los probiótios según la Organización Mundial de la Salud son

microorganismos vivos que, cuando son administrados en cantidades adecuadas,
confieren beneficios para la salud del hospedador. Una de sus propiedades es
quecal ser administrados vía oral mejoran la microbiota intestinal y la
reestablecen después de una disrupción secundaria a una administración de
antibióticos. También estimulan al sistema inmune del sujeto y la producción de
moléculas de poder antimicrobiano que degradan las toxinas o bloquean sus
sitios específicos de adherencia. Los probióticos más utilizados para tratar los
síntomas secundarios a la CDI son especies de Lactobacillus, Saccharomyces
Boulardii y Bifidobacterium spp. La guía clínica del American Journal of
Gastroenterology del 2013 es la única que expone que hay escasa evidencia para
recomendar el uso de probióticos como coadyuvantes al tratamiento antibiótico
para prevenir las recurrencias (Surawicz, 2013).
111
1.9 EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN DE C. DIFFICILE.
En este apartado mostraremos el problema de salud que supone

actualmente la CDI y el cambio en la epidemiología de dicha infección ocurrida
desde los inicios del siglo XXI, con mayor número de casos, mayor severidad y
mortalidad de los mismos, y con unos costes notables para el sistema de salud.
1.9.1 Definiciones.
La guía de práctica clínica del 2017 para CDI de la IDSA y la SHEA,

establece unas definiciones epidemiológicas con el fin de incrementar la
comparabilidad entre diferentes contextos clínicos. Se trata de definiciones de
caso, con el fin de establecer programas de vigilancia y estudios epidemiológicos
(McDonald, 2018):
 CDI de Inicio Hospitalario (CDI-IH): CDI que se produce a partir del
tercer día de ingreso.
 CDI de Inicio en la comunidad asociado a ingreso hospitalario previo
(CDI-ICIH): CDI antes de 28 días después de un alta hospitalaria.
 CDI de Inicio en la Comunidad (CDI-IC): Sin antecedentes de alta
hospitalaria en las últimas 12 semanas.
 CDI recurrente: Paciente hospitalizado qué tras finalizar el tratamiento,
comienza nuevamente con criterios de CDI entre 2 y 8 semanas después
del primer episodio.
 CDI caso nuevo: Es necesario una serie de manifestaciones clínicas en
combinación con pruebas de laboratorio (Ver apartado 1.4.2 “Diagnóstico
microbiológico de la infección por C. difficile”) o bien presencia
confirmada de hallazgos histopatológicos o radiológicos compatibles con
colitis pseudomembranosa.
En la guía clínica publicada en el American Journal of Gastroenterology en el

2013 para el diagnóstico, tratamiento y prevención de la CDI del American College
of Gastroenterology, se definen las diferentes formas de CDI en cuanto a severidad,
que tomaremos como referencia. De esta manera, la forma leve y/o moderada se
define como diarrea como único síntoma, con por lo menos 3 deposiciones o más
112
en las últimas 24 horas. En la forma severa aparece en el inicio o durante el curso
de la enfermedad, hipoalbuminemia (menor a 3 g/dL) y cualquiera de los
siguientes signos: recuento total de leucocitos en sangre mayores a 15000/µL y/o
distensión abdominal sin otros criterios de la forma complicada. En la forma
complicada aparece al inicio o durante el curso de la enfermedad cualquiera de
los siguientes signos o síntomas: hipotensión con o sin administración requerida
de vasopresores, fiebre mayor o igual a 38.5ºC, distensión abdominal significativa,
signos de alteraciones en el íleo, alteración de la conciencia, recuento total de
leucocitos en sangre mayor a 35000/µL o menor a 2000/µL, concentraciones de
lactato en suero mayores a 2.2 mmol/L o cualquier signo de fallo orgánico. Como
signos de alteración del íleo tendríamos nauseas agudas, vómitos, cese súbito de
la diarrea (íleo paralítico) o evidencias radiológicas compatibles con tránsito
intestinal alterado (Surawicz, 2013).
1.9.2 Epidemiología de la infección de C. difficile.
Como veremos más adelante en los estudios más importantes en

diferentes países o regiones, la evidencia nos dice que la epidemiología de la CDI
ha cambiado en los últimos años. Durante mucho tiempo se ha creído que la CDI
ocurría únicamente en el ámbito hospitalario, pero la incidencia de casos
provenientes de la comunidad ha venido aumentando progresivamente en los
últimos años. Es destacable la dificultad para estimar la incidencia de la CDI-IC.
Los problemas se localizan en seleccionar los casos, ya que en muchos no se tiene
una sospecha clínica. Esto podría infraestimar su verdadera incidencia (Asensio,
2012).
El cambio de la epidemiología de la CDI comenzó en Estados Unidos a

raiz de la aparición del ribotipo hipervirulento 027 a inicios del siglo XXI, que
supuso multitud de brotes dispersos en diferentes hospitales (Loo, 2005). A groso
modo podemos decir que las hospitalizaciones por CDI en adultos se duplicaron
desde el 2000 al 2010 (Healthcare Cost and Utilization Project. HCUP Projections:
Clostridium difficile infection 2011 to 2012. Report # 2012-01). En 2009 el CDC
(Centers for Disease Control and Prevention) comenzó con un programa de vigilancia
de la CDI para valorar la dimensión de este problema en Estados Unidos. El
113
objetivo era estimar incidencia, recurrencia y mortalidad. El estudio más potente
y reciente se publicó en 2015 en el New England Journal of Medecine con estos datos
del CDC del año 2011 (Lessa, 2015). La incidencia para la CDI-IC estuvo
comprendida entre 30 y 120 casos por 100000 habitantes, y entre 50 y 160 casos
por 100000 habitantes para la CDI-IH. La tasa media fue 48 casos/100000
habitantes en CDI-IC y 93 casos/100000 habitantes en CDI-IH. Del total de casos
un 66% fueron CDI-IH y un 34% CDI-IC. La incidencia estimada resultó
ligeramente superior en mujeres que en hombres y considerablemente superior en
mayores de 65 años. Las recurrencias se estimaron en 13.5% en CDI-IC y en 20.9%
en CDI-IH y la mortalidad a los 30 días fue de 1.3% en CDI-IC y de 9.3% en CDI-
IH. Los principales ribotipos identificados fueron el 027, 020 y 106. El ribotipo 027
fue aislado más frecuentemente en el ámbito hospitalario y casi todos los casos
fueron positivos para CDT. Las conclusiones de este estudio son que la CDI causó
durante el 2011 en Estados Unidos 453000 infecciones y 29000 muertes,
aproximadamente. Aunque no son comparables los estudios debido a diferentes
definiciones de CDI o diferentes métodos diagnósticos utilizados, estas
estimaciones son bastante mayores que las de años anteriores que van desde
240000 a 330000 infecciones (Lessa, 2015). Este estudio confirmó la evidencia
creciente de que la CDI no estaba solo restringida al ámbito hospitalario.
También, confirmó que la incidencia ha ido aumentando progresivamente en los
últimos años y resultó ser una excelente fotografía de la problemática actual de
esta infección.
En Europa el primer estudio que se realizó para obtener datos de la

incidencia de la CDI fue en 2002. Se trataba de una encuesta a 212 hospitales
realizada por el Grupo Europeo para el estudio de Clostridium difficile (Barbut, 2003).
Se evidenció una incidencia media de 2.45 (0.13-7.10) casos por 10000 días-
paciente. Durante los años siguientes se produjo el primer gran brote del ribotipo
hipervirulento 027 en Reino Unido (Smith, 2005) que después se trasladó a otros
países, hasta que en 2008 fue detectado en hasta 16 países (Freeman, 2010). En
2008 el ECDC (European Center Disease Control) realizó una encuesta en 106
laboratorios de 34 países europeos con el fin de estimar incidencia de la CDI-IC,
CDI-IH, ribotipos, factores de riesgo y desenlace (Bauer, 2011). La incidencia
medía había aumentado hasta 5.50 (0.00-36.3) casos por 10000 días-paciente. Los
114
ribotipos más frecuentes fueron el 014/20 (15%), 001(10%), 078(8%) y 027(5%)
hasta un total de 64 diferentes. Como en el estudio americano de Lessa en 2015, la
CDI se produjo principalmente en personas mayores con comorbilidades
asociadas y un uso previo de antibióticos. Se hizo un seguimiento posterior
durante 3 meses de estos pacientes pacientes (se consiguieron datos del 96% de
los pacientes, 491/509) y el 22% de los pacientes fallecieron (101/455). Se estimó
que en el 2% de los casos la CDI fue causa primaria de la muerte y en el 7% causa
contributiva de la muerta.
El último gran estudio europeo y el más amplio, se realizó durante los

años 2012 y 2013. Se trató de un estudio multicéntrico en 482 hospitales de 20
países incluido España (Davies, 2016). La incidencia media fue 7.0 (0.7-28.7) casos
por 10000 días-paciente. Se encontraron 125 ribotipos diferentes en 19 países. El
ribotipo 027 fue el más prevalente (19%), después el 001/072 (11%) y 014/020
(10%). De forma notable el ribotipo 078, que era el tercero más frecuente en el
estudio del 2008 (Bauer, 2011) ahora apenas conformó el 3%, ocupando el 7º lugar.
115
FIGURA 18: Distribución de los ribotipos más frecuentes en Europa durante 2012-2013.
(Davies, 2016).
116
La distribución geográfica de los ribotipos encontrados en Europa puede
observarse en la siguiente figura:
FIGURA 19: Distribución geográfica de los ribotipos de C. difficile encontrados en el

estudio multicéntrico de Davies. Número de aislados: 1996. El número dentro del círculo
representa el total de aislados localizados en el país. (Davies, 2016).
Los hallazgos de este amplio estudio muestran que, al igual que en

Estados Unidos, la epidemiología de la CDI ha venido cambiando. Se está
produciendo un incremento de le infección, un cambio en la diversidad de los
ribotipos mayoritarios y un mayor número de ribotipos diferentes identificados.
De forma notable, el ribotipo hipervirulento 027 pasa del 5% al 19% desde el 2008
(Bauer, 2011) al 2013 (Davies, 2016), siendo el más frecuente. Además, en países
donde este ribotipo 027 era mayoritario, se observó una disminución de la
117
diversidad, concluyendo que este ribotipo, a partir de una propagación regional,
principalmente desde Reino Unido, se ha extendido prácticamente a toda Europa.
Con respecto a España hemos de decir que no ha existido un sistema de

vigilancia para la CDI, de manera que las estimaciones epidemiológicas se han
realizado a través de varios estudios para valorar la problemática de la CDI. Para
el periodo 1997-2005, un estudio basado en el CMBD (Conjunto mínimo básico de
datos), con las limitaciones que conlleva debido a una posible infraestimación,
observó una incidencia promedio de 41.2 casos por 100000 altas con una
tendencia al alza (Soler, 2008). En el 2008 se publicó un trabajo del grupo EPINE
español (Estudio de prevalencia de las infecciones nosocomiales en los hospitales
españoles) en 249 hospitales, para valorar la presencia de CDI entre los años 1999-
2007. Se observó un aumento desde 39 a 122 casos cada 100000 pacientes
hospitalizados con un incremento anual del 9% (Asensio, 2008). En otro estudio
multicéntrico del año 2007 en 103 hospitales se estimó una incidencia 171 casos
por 100000 ingresos y 13.4 casos por 100000 habitantes (Alcalá, 2011). Además, se
evidenció que la estrategia diagnóstica de la CDI se basaba en la mayor parte de
hospitales en la detección de la toxina en heces por enzimoinmuensayo
únicamente, por tanto, se podrían estar infradiagnosticando muchos casos de
CDI.
El resto de los datos del impacto actual de la CDI en España los obtenemos
de estudios en hospitales concretos. Por ejemplo, en un estudio descriptivo
realizado en el hospital de Salamanca entre 2005 y 2014 se observó una
prevalencia media global en esos años de 6.8 casos cada 100000 habitantes y año,
con incremento progresivo de la prevalencia de la CDI, llegando a 27 casos cada
100000 habitantes y año en 2014 (Cores-Calvo, 2016). Se observó una mayor
detección de casos a partir del 2011 cuando se instauró, junto a la detección de
toxinas en heces, la detección de GDH y el cultivo toxigénico. El 86.4% de los
casos fueron CDI-IH.
En España apenas hemos tenido casos documentados de la presencia del

ribotipo hipervirulento 027. Es por lo cual que el incremento de la CDI no se ha
achacado a la irrupción de este ribotipo. Según el estudio EPINE del 2008
118
(Asensio, 2008) el incremento es debido al uso de antibióticos, al envejecimiento
de la población y al aumento de las comorbilidades de los pacientes
hospitalizados. Como mencionamos en el apartado 1.3.9 “Cepas hipervirulentas de
reciente aparición”, en España los estudios moleculares epidemiológicos de C.
difficile son escasos y es por ello por lo que la importancia del ribotipo 027 es
desconocida. El primer caso descrito y publicado fue en 2013 en el hospital
Gregorio Marañón de Madrid (Marín, 2014). En este mismo hospital a los pocos
meses hubo un brote del ribotipo 027 (el único hasta la fecha en España) que
causó 141 casos de CDI, de manera que se hizo un estudio prospectivo (Bouza,
2017) y se encontró una notable asociación en pacientes con cirrosis hepática,
hallazgo ya descrito recientemente (Trifan, 2015).
Con respecto a la caracterización de la CDI-IC su incidencia es bastante

desconocida. En el estudio basado en CMBD (Soler, 2008) representaron el 26%
del total casos nuevos y en el estudio EPINE el 36% (Asencio, 2008).
Por tanto, la frecuencia de la CDI en España no está correctamente

definida. Existen varios estudios que difíciles de extrapolar y varios estudios en
hospitales concretos, ya que usan indicadores a veces no comparables. No
obstante, según el EUCLID Study (Davies, 2016) nuestra incidencia de CDI es
similar a la de países cercanos y va aumentando progresivamente, aunque
realmente desconocemos si ribotipo 027 no se ha extendido, por las razones antes
mencionadas. En este estudio no se reportó su presencia en España.
Es de recalcar que ha sido en España donde se ha hecho el primer y casi

único gran estudio, en 118 hospitales, que intentó evaluar el posible
infradiagnóstico de la CDI, debido a unas estrategias diagnósticas no apropiadas
y a la falta de sospecha clínica (Alcalá, 2012). Los resultados fueron que 2 de cada
3 casos no habrían sido diagnosticados por los laboratorios participantes. las
causas se atribuyeron principalmente a la falta pruebas diagnósticas sensibles
(19%) y la falta de sospecha clínica (48%) que fue mayor en los casos provenientes
de la comunidad y en menores de 65 años. Este estudio nos da una fotografía
clara de que en nuestro país existe un infradiagnóstico y que se deben poner al
día los laboratorios para ofrecer estrategias diagnósticas que optimicen la
119
sensibilidad y la especificidad, así como que los médicos entiendan la
epidemiología actual de la CDI para que no se dejen de diagnosticar casos por
falta de sospecha clínica. Todo esto ahonda en la falta de conocimiento sobre la
situación de la CDI en España.
Con respecto a la Comunidad Valenciana, a principios de 2017 el Servicio

de Vigilancia y Control Epidemiológico de la Conselleria de Sanitat i Salud Pública,
elaboró un protocolo para la vigilancia de la CDI. De esta manera, se enviarán los
resultados de forma periódico al Centro Nacional de Epidemiología, con lo que a
partir de ahora se tendrán datos más exactos. En el último informe de Incidencias
de microorganismos de especial vigilancia elaborado por la Red MIVA de la
Conselleria de Sanitat i Salud Pública, la tasa de incidencias para la CDI en el 2015
fue de 11.07 casos por 100000 habitantes, aunque en mayores de 60 años se elevó a
32.06 casos por 100000 habitantes, siendo ligeramente superior en mujeres que en
hombres.
Por otra parte, para valorar los efectos adversos de la CDI o la morbilidad,
podemos utilizar la tasa de colectomías, las recurrencias y las readmisiones
hospitalarias. De esta manera, la tasa de colectomías resulta un indicador muy
objetivo de la severidad. En Estados Unidos, durante los años previos al siglo XXI,
la tasa de colectomías reportada en algunos estudios oscilaba entre 0.5-1.3%. Esta
tasa después aumentó dramáticamente con la aparición de los brotes del ribotipo
027 a principios del siglo XXI hasta el 6.2% (Kwon, 2015). No obstante, la tasa de
colectomías no se ha mantenido persistentemente elevada, solo suele aumentar en
épocas de brotes hipervirulentos y no con los casos aislados.
Las recurrencias son otra fuente de morbilidad para los pacientes con CDI.
El riesgo de recurrencia tras un episodio inicial es del 10-30%, después de una
primera recurrencia es del 40% para ser de más del 50% en episodios posteriores
(Kwon, 2015). Estos pacientes tienen mayor probabilidad de sufrir reingresos
hospitalarios, obviamente.
De forma concomitante a la morbilidad, la mortalidad relacionada con la

CDI también ha ido aumentando. En los años previos al siglo XXI la tasa de
120
mortalidad era relativamente baja (<2%). Después aumentó durante los brotes del
siglo XXI hasta el 6.9-16.7%, pero ha permanecido más elevada en los casos
esporádicos, a diferencia de la morbilidad (Kwon, 2015).
Con respecto a los costes económicos que acarrea la CDI hay que decir que
tiene un profundo impacto en los sistemas de salud. Es difícil establecer el coste
adicional que supone una CDI en un paciente hospitalizado, puesto que estos
pacientes presentan más morbilidades y enfermedades de base que aquellos que
no han presentado CDI. Es por ello por lo que algunos estudios en Estados
Unidos han estimado los costes adicionales entre 3500 y 33000 dólares (Kwon,
2015). En Europa se ha realizado también algún estudio al respecto. En Alemania
se ha estimado que los costes asociados podrían estar entre 10000 y 71000 euros
(Wiegand, 2012). En España un estudio del 2012 ha estimado que la CDI para el
sistema nacional de salud podría suponer un coste de 33 millones de € anuales. El
95% del gasto se achacaría a la prolongación de la estancia hospitalaria. Una
infección inicial costaría 3900€, la primera recurrencia 4900€ y la segunda
recurrencia 6000€ (Asensio, 2013).
1.9.3 Medidas preventivas para la infección y transmisión de C. difficile.
Las siguientes recomendaciones son las establecidas por la Clinical Practice

Guidelines for Clostridium difficile Infection in Adults and Children: 2017 Update by the
Infectious Diseases Society of America and Society for Healthcare Epidemiology of
America (McDonald, 2018).
Los pacientes con CDI deben ser aislados en habitaciones individuales con
baños individuales para no permitir la transmisión a otros pacientes. Si no fuera
posible, se debe hacer un aislamiento en cohortes. Si existe una alta sospecha
clínica de CDI, pero los resultados de las pruebas de laboratorio se van a demorar
más de un día, es preferible el aislamiento de todas formas. El trabajador sanitario
y los acompañantes del paciente que entren a esta habitación aislada deberán
llevar siempre bata y guantes. El aislamiento debe continuar hasta 48 horas
resuelta la diarrea, aunque se puede prolongar hasta el alta si las tasas de CDI son
elevadas en el hospital. La habitación debe ser descontaminada con esporicidas al
121
alta, como hipoclorito sódico y glutaraldehído, aunque si existe una alta tasa de
CDI en el hospital debe ser realizada diariamente. Se debe asegurar la correcta
desinfección mediante controles ambientales.
De forma rutinaria después de entrar en contacto con un paciente debe

haber un cambio de guantes y previamente un lavado de manos con agua y jabón
o con solución hidroalcohólica, aunque es preferible el agua y jabón al ser más
efectivos eliminando las esporas. De todas formas, es muy difícil eliminar las
esporas de forma completa ya que son muy resistentes a los desinfectantes. Se
debe incentivar el lavado de manos constante por parte del paciente.
Con respecto a la política antibiótica, ya que hemos visto que los

antibióticos es uno de los factores de riesgo más importantes para la CDI, se debe
minimizar la frecuencia y duración de los antibióticos de riesgo, con el fin de
reducir el riesgo de CDI. Además, estos deben ser seleccionados en función de la
epidemiología local de los ribotipos circulantes. Debe considerarse la restricción
de fluorquinolonas, clindamicina y cefalosporinas. Asimismo, hay datos
insuficientes para recomendar la administración de probióticos como medida de
prevención primaria para el desarrollo de CDI.
1.10 C. DIFFICILE Y SU RELACIÓN CON LA MICROBIOTA INTESTINAL.
Este último apartado del marco teórico se acerca mucho a la naturaleza del
tema que vamos a plantear. Discerniremos los mecanismos de resistencia a la
colonización de patógenos intestinales como C. difficile que ejerce en condiciones
normales la microbiota intestinal. Asimismo, describiremos la disbacteriosis que
producen los antibióticos y la disbacteriosis que se observa en los pacientes con
CDI. Por último, repasaremos los escasos estudios que han descrito la microbiota
intestinal en individuos colonizados por C. difficile.
1.10.1 La Microbiota Intestinal y su relación con el estado de salud.
El término microbiota realmente hace referencia al conjunto de

microorganismos, ya sean bacterias, virus, hongos o parásitos que residen en
122
nuestro organismo, aunque al referirnos a ella en este estudio trataremos solo de
bacterias. Es posible encontrar estos microorganismos en muchas localizaciones
del organismo, y cada uno de estos ecosistemas presenta unas particularidades
adaptadas el nicho ecológico específico. El ecosistema más numeroso y complejo
es el del aparato digestivo. En el ciego es donde se encuentra la mayor densidad
de microorganismos.
La microbiota intestinal está formada por 10¹⁴ bacterias. Existen entre 500
y 1000 especies. Los principales phylum son Firmicutes (aproximadamente 60%) y
Bacteroidetes (25%). En menor proporción se encontrarían Proteobacteria,
Verrucomicrobia, Fusobacteria, Cianobacteria, Actinobacteria y Spirochaetes
(Alarcón Cavero, 2016).
La microbiota intestinal ofrece múltiples beneficios al organismo

hospedador, como el fortalecimiento de la integridad intestinal y el modelado del
epitelio intestinal, la protección frente a bacterias patógenas, la regulación del
sistema inmune, la digestión de alimentos y la síntesis de vitamina K y vitaminas
del grupo B. Establecemos con ella una relación mutualista, nos aportan
necesidades esenciales para el funcionamiento del cuerpo humano (Thursby,
2017).
Con las nuevas técnicas de secuenciación masiva centradas en el estudio

del gen ADNr 16S bacteriano podemos estudiar todas las bacterias presentes, a
nivel de género o especie, en una muestra de heces que sea representativa de la
microbiota intestinal. Esto ha permitido caracterizar la microbiota intestinal en
enfermedades extraintestinales e intestinales y se ha visto que la disrupción de la
microbiota, llamada disbacteriosis, está asociada a enfermedades como la
obesidad o al síndrome metabólico (Cani, 2016; Musso, 2010).
La composición de la microbiota intestinal puede variar en función de la

dieta, genética e interacción con el medio ambiente. Una característica de la
microbiota intestinal es que no es tan diversa como la de otras localizaciones y
que presenta un alto grado de redundancia funcional, es decir, aunque exista una
variabilidad intraindividual, debido a la redundancia funcional el perfil
123
metabólico sería similar. No obstante, aunque es difícil describir una microbiota
normal, se considera más saludable cuando más diversa y equilibrada sea
(Thursby, 2017)
Existe bastante consenso en que el inicio de la conformación de la

microbiota intestinal comienza justo después del nacimiento, aunque algún autor
ha apuntado que comienza durante la vida intraútero, basándose en que se ha
evidenciado la presencia de microbiota en la placenta y meconio (Prince, 2015). En
la época neonatal la microbiota es variable en función de si el parto es vaginal o
bien es mediante cesárea (Cabrera-Rubio, 2012). Si el parto ha sido vaginal la
microbiota presenta una gran cantidad de Lactobacillus durante unos pocos días,
reflejo de la alta abundancia vaginal. Si ha sido por cesárea, existe una
disminución de Bacteroides debido a un retraso en su colonización, pero hay una
elevada colonización por anaerobios tipo Clostridium. La microbiota intestinal es
más parecida a la de la madre si el parto ha sido por vía vaginal. Durante los
primeros meses de vida la microbiota intestinal está constituida por dos phylum
principalmente, Actinobacteria y Proteobacteria. A partir de aquí la microbiota va
madurando y diversificando durante el primer año de vida hasta dar lugar a una
microbiota todavía diferente a la del adulto, con una variabilidad intraindividual
muy grande. A los 2-3 años la microbiota del niño es la misma que la que
encontramos en el adulto. A partir de aquí permanece estable, aunque puede
sufrir caóticos cambios debido a la administración de antibióticos, de situaciones
patológicas o de cambios drásticos en la dieta. Sobre la edad de 65 años la
microbiota intestinal sufre cambios con un aumento de Bacteroidetes (Thursby,
2017). De forma global en la edad avanzada existe una reducción en la producción
bacteriana de AGCC y una mayor actividad proteolítica. Debido a la función
antinflamatoria e inmunomoduladora de los AGCC es fácil deducir que estos
procesos de cambios en la microbiota intestinal promueven la aparición de
procesos inflamatorios secundarios a la edad avanzada (Corrêa-Oliveira, 2016).
La composición de la microbiota intestinal está influenciada por el

hospedador y por la presión selectiva ambiental. El tracto gastrointestinal se
protege de lesiones y mantiene la homeostasis, limitando la exposición de la
microbiota intestinal al sistema inmune, mediante la formación de una barrera
124
intestinal multifactorial y dinámica. Esta barrera incluye componentes físicos
como la capa epitelial y mucosa, bioquímicos (enzimas y antimicrobianos
peptídicos) e inmunológicos (IgA y las células inmunes asociadas al epitelio
intestinal) (Thursby, 2017).
En el intestino la energía se extrae solo de unas pocas formas, como la

fermentación y sulfato-reducción de carbohidratos de la dieta o del hospedador,
por tanto, las bacterias que pueden sobrevivir están limitadas en este aspecto.
Asimismo, así se explica también los efectos que la dieta es capaz de producir en
la microbiota intestinal (Donaldson, 2015). La capa mucosa también es una fuente
de carbohidratos para la microbiota intestinal, ya que tiene grandes cantidades de
mucina, un gel altamente glicosilado. La capa mucosa, además, es esencial para la
interacción entre la microbiota y las células del sistema inmune. Una disminución
de los MACs de la dieta provocaría un consumo elevado de la mucina de la capa
mucosa y un adelgazamiento de ésta y un mayor acceso de las bacterias al epitelio
intestinal provocando fenómenos inflamatorios (Earle, 2015). La capacidad de las
bacterias intestinales para utilizar los azucares de la dieta o de la mucina es
determinada por las hidrolasas específicas presentes su genoma. Algunas de estas
hidrolasas degradan un amplio rango de polisacáridos mientras que otras son
específicas en degradar un grupo concreto (Tailford, 2015). Además, la
diversificación bacteriana puede ocurrir mediante mutaciones o transferencia
lateral de genes y esto produciría variaciones en el nicho ecológico. Otro concepto
clave para entender la microbiota intestinal es la cooperación metabólica
existente, es decir, los productos de fermentación de algunos grupos son sustratos
de otros. Por ejemplo, el ácido láctico, succínico y el 1,2 propanodiol son sustrato
de las bacterias productoras de butirato y propionato (Thursby, 2017).
Los AGCC predominantes en el tracto intestinal son el ácido propiónico,

butírico y acético. Están en proporción 1:1:3 (Musso, 2010). Son rápidamente
absorbidos por el epitelio intestinal y aquí intervienen en procesos celulares como
la expresión génica, quimiotaxis, diferenciación, proliferación y apoptosis celular
(Corrêa-Oliveira, 2016). El ácido acético es producido por la mayoría de las
bacterias anaerobias, mientras que el ácido propiónico y butírico es producido por
grupos exclusivos de bacterias con rutas metabólicas específicas. El ácido butírico
125
proviene de los carbohidratos por la vía glucolítica y acetil-coA, principalmente
de bacterias del phylum Firmicutes. El ácido propiónico proviene de las rutas del
ácido succínico y el propanodiol, y es producido por el phylum Bacteroidetes
principalmente. El ácido butírico tiene actividad antiinflamatoria y anticancerosa
(Morrison, 2016), además es una fuente de energía particularmente importante
para los colonocitos. Asimismo, el ácido butírico atenúa la traslocación bacteriana
y potencia la barrera intestinal al actuar sobre las uniones intercelulares y la capa
mucina (Morrison, 2016). Los AGCC también tienen una actividad reguladora del
sistema inmune y la respuesta inflamatoria y pueden influir en la producción de
citocinas (Morrison, 2016). Otros metabolitos, aparte de los AGCC, también
podrían tener impacto en el mantenimiento de la barrera intestinal, proliferación
del epitelio y sistema inmune (Nagai, 2016).
La microbiota intestinal también es importante en el desarrollo del sistema

inmune general y de la mucosa intestinal. Este proceso se realiza a través de la vía
de los PRRs en las células epiteliales, como los receptores Toll-like, que reconocen
señales moleculares producidas por las bacterias. Estas señales pueden
amortiguar ciertos procesos inflamatorios intestinales, discriminar entre bacterias
patógenas y beneficiosas o aumentar el número de las células inmunes o los PRRs
(Thursby, 2017).
La presencia física de la microbiota intestinal influye en la colonización de

bacterias patógenas al competir por las fuentes nutricionales y el nicho ecológico
y al producir antimicrobianos e IgA secretora. Debido a esto la administración de
antibióticos tiene un profundo impacto en la microbiota intestinal, al erradicar
ciertos grupos de bacterias. Este hecho permite la colonización de otras bacterias
que pueden ser patógenas.
Por tanto, la microbiota intestinal se ve influenciada por varios factores

que pueden alterarla, dando lugar a una disrupción de ésta que podría tener
consecuencias puesto que participa en varias funciones fisiológicas importantes.
126
1.10.2 Resistencia a la colonización por C. difficile.
El concepto de resistencia a la colonización intestinal de bacterias

patógenas fue propuesto incluso antes de que la infección por C. difficile se
asociase a colitis pseudomembranosa previa administración de antibióticos. No
obstante, el interés por saber los mecanismos mediante los cuales la microbiota
intestinal de un hospedador es capaz de prevenir estas colonizaciones es bastante
reciente.
Trabajos en modelos animales y humanos han demostrado que los

antibióticos tienen efectos profundos y duraderos en la estructura de la
microbiota intestinal (Antonopoulos, 2016). No solo afecta al tamaño total
(riqueza) de la microbiota intestinal sino también a la composición (diversidad),
alterando el equilibrio existente entre grupos específicos de bacterias (Reeves,
2011). Ambas situaciones disminuyen la resistencia a la colonización por C.
difficile. Los estudios en humanos han corroborado que los antibióticos alteran la
estructura, diversidad y riqueza de la microbiota intestinal (Peterfreund, 2012).
Asimismo, la disminución de diversidad no es recuperable en pacientes con CDI
recurrente, mientras que en pacientes con CDI recuperados que no recurren o en
pacientes sin CDI, la diversidad es normal (Chang, 2008).
C. difficile necesita ambientes específicos para su colonización y expansión

y esto ocurre mediante mecanismos complementarios. El metabolismo de C.
difficile en el contexto de la microbiota intestinal que ha colonizado está
íntegramente relacionado con su patogénesis. El desarrollo de la CDI involucra a
dos mecanismos muy importantes y claves como son el metabolismo de los ácidos
biliares y la competición con otras bacterias por los nutrientes, aunque existen
otros mecanismos mediante los cuales microbiota intestinal del hospedador se
resiste a ser colonizada por esta bacteria patógena (Britton, 2012). Estos
mecanismos menos importantes, pero a tener cuenta, son la producción de
antibacterianos peptídicos que se vería disminuida con la pérdida de riqueza de
la microbiota intestinal, y la comunicación entre el sistema inmune y la microbiota
que podría incrementar la susceptibilidad a la CDI después de la exposición
antibiótica al estar suprimido el sistema inmune innato (Hryckowian, 2017).
127
La germinación de C. difficile está estimulada o inhibida por una compleja
mezcla de ácidos biliares. Como vimos en el apartado 1.2.4.2 “Germinación de C.
difficile y su relación con el metabolismo de los ácidos biliares en el hospedador”, los
ácidos biliares son los germinantes esenciales de las esporas de C. difficile y su
presencia en el tracto intestinal juega un papel clave en su colonización y
patogénesis. Los ácidos biliares primarios son el ácido cólico y quenodesoxicólico,
que después son conjugados con los aminoácidos taurina o glicina. Son secretados
en el duodeno en respuesta a la ingesta y la mayor parte (95%) son reabsorbidos
en el íleo terminal y devueltos al hígado mediante la circulación enterohepática.
Los ácidos biliares primarios que llegan al intestino grueso (5%) son
biotransformados en ácidos biliares secundarios mediante enzimas secretados por
bacterias de la microbiota intestinal de forma específica, interviniendo dos tipos
de reacciones, desconjugación y deshidroxilación. Los ácidos biliares secundarios
más abundantes son el ácido desoxicólico, litocólico y ursodesoxicólico. Las
esporas de C. difficile requieren de forma específica ácidos biliares primarios y
aminoácidos como la glicina para la germinación. Los diversos estudios in vitro e
in vivo muestran que la depleción de bacterias que tienen dotación enzimática
para obtener ácidos biliares secundarios generaría una disminución de la
resistencia a la colonización (Buffie, 2015). Además, los ácidos biliares secundarios
inhiben también el crecimiento de C. difficile y la actividad y cantidad de las
toxinas causantes de la clínica (Thanissery, 2017). En el intestino grueso los ácidos
biliares secundarios, inhibidores de la germinación, son absorbidos a velocidades
diez veces mayores que los ácidos biliares primarios germinantes, dando lugar a
una abundancia de germinantes en el entorno colónico. En sujetos sanos con una
microbiota intestinal rica y diversa, los ácidos biliares primarios germinantes, son
rápidamente desconjugados por ciertos grupos de bacterias, reduciendo su
abundancia relativa y la probabilidad de germinación de las esporas de C. difficile
(Sarker, 2012).
Asimismo, como avanzamos en el apartado 1.2.4.3 “Impacto de los ácidos

biliares secundarios provenientes de la microbiota intestinal en la resistencia a la
colonización de C. difficile”, la microbiota intestinal aporta los enzimas BSH y
BaiCD que transforman los ácidos biliares primarios germinantes de C. difficile.
BSH hidroliza los ácidos biliares conjugados en ácidos biliares libres. BaiCD es
128
capaz de transformar los ácidos biliares primarios en secundarios. Las bacterias
cuyo genoma codifique estos enzimas producirían un efecto inhibitorio sobre la
germinación de las esporas de C. difficile. La desconjugación de los ácidos biliares
primarios conjugados por BSH secretada extracelularmente ocurre muy
rápidamente. Estudios metagenómicos han mostrado que los tres principales
phylum que poseen BSH son Firmicutes (30%), Bacteroidetes (14,4%) y
Actinobacteria (8,9%) (Jones, 2008). Por tanto, está ampliamente distribuida en
muchos géneros como Clostridium, Bacteroides, Lactobacillus y Bifidobacterium. Por
el contrario, BaiCD se encuentra presente en muy pocos grupos de bacterias, que
representan menos del 0,025% de la microbiota intestinal normal (Winston, 2016),
principalmente dentro del phylum Firmicutes en los géneros Clostridium, Blautia y
Eubacterium (Buffie, 2015). A este respecto, Buffie y col. en 2015, encontraron 11
grupos de bacterias que correlacionaron con una resistencia a la infección, en un
estudio donde se comparó la microbiota intestinal de 12 individuos portadores
asintomáticos de C. difficile y 12 pacientes con CDI. Mediante un modelo
matemático y estudios metabolómicos investigaron que mecanismo inhibitorio de
la infección subyacía detrás. Los grupos encontrados constituyeron un 6% de la
microbiota normal y principalmente estuvieron comprendidos en el cluster
Clostridium XIVa, incluyendo Clostridium scindens, donde se halló la correlación
más potente. C. scindens es un productor de BaiCD. Se formuló la hipótesis de si
esta vía metabólica tan rara es la que conferiría está capacidad de resistencia a la
infección (Buffie, 2015).
El género Bacteroides se ha puesto de manifiesto que también presenta una

correlación negativa con la CDI en estudios donde se observa la restauración de la
microbiota intestinal posterior a un FMT (Shahinas, 2012). A este respecto, en
estudios in vitro se ha evidenciado que Bacteroides ovatus es capaz de inhibir el
crecimiento de C. difficile al actuar sobre el metabolismo de los ácidos biliares
(Yoon, 2017). B. ovatus no expresa BaiCD, pero si BSH que disminuye la
reabsorción ácidos biliares desconjugados en el intestino delgado, de manera que
puede inhibir la germinación de C. difficile y ejercer un efecto sinérgico en
bacterias que aporten actividad BaiCD.
129
Por tanto, la disrupción de la microbiota intestinal secundaria a un
tratamiento antibiótico conduciría en el intestino grueso, a un descenso en el
metabolismo de ácidos biliares germinantes y a una rápida absorción de los
ácidos biliares inhibidores, produciendo un desequilibrio entre los procesos de
inhibición y germinación de las esporas de C. difficile.
Llegados a este punto es importante recalcar que el concepto de resistencia

la colonización es algo confuso, pues en los apartados anteriores hemos visto el
efecto que tiene la modulación del metabolismo de los ácidos biliares, debido a
una disrupción de la microbiota intestinal posterior al tratamiento antibiótico, en
la germinación de las esporas de C. difficile. Por tanto, el concepto de resistencia la
colonización por C. difficile engloba también al de resistencia a la germinación y en
definitiva al de resistencia a la infección.
Por otra parte, la microbiota intestinal también impide la colonización de

C. difficile mediante mecanismos competitivos de las fuentes de energía. La
pérdida de la resistencia a la colonización al administrar antibióticos provoca una
pérdida de diversidad que disminuye la competición por los nutrientes, y deja vía
libre para nichos ecológicos antes inaccesibles. Además, la lisis celular que se
produce libera fuentes de energía de carbono que las bacterias residuales y los
nuevos colonizadores pueden consumir. Por norma general, si dos bacterias
compiten por un nutriente limitado, la que presente un mecanismo más eficiente
desplazará a la otra de ese nicho. Se han realizado relativamente pocos estudios
sobre las vías metabólicas y la utilización de los nutrientes por parte de C. difficile,
pero se ha visto que puede crecer in vitro en presencia de azucares simples y
complejos, aminoácidos y péptidos (Britton, 2014). En un modelo murino se ha
visto que es capaz de usar como fuente de energía los ácidos siálicos en el
intestino del hospedador y proliferar (Ng, 2013). Los ácidos siálicos de la capa
mucosa se liberan y son consumidos en menor medida tras una disbacteriosis.
Esto permitiría la expansión de C. difficile (Hryckowian, 2017). C. difficile también
toma ventaja al usar el ácido succínico, un producto de fermentación aumentado
después de la disrupción de la microbiota tras administración antibiótica
(Ferreyra, 2014).
130
La reducción de los AGCC observada en la disbacteriosis se ha asociado
también a la perdida de resistencia a la colonización, ya que se ha visto que
inhiben el crecimiento de C. difficile in vitro. El otro posible mecanismo es que al
incrementarse el pH luminal al disminuir los AGCC se genera un ambiente
favorable para el crecimiento de C. difficile y Enterobacteriacea. Además, por los
efectos antinflamatorios del ácido butírico, con reducción de la permeabilidad,
aumento de la producción de mucina, aumento de la síntesis de péptidos
antimicrobianos etc, la caída de los grupos butirogénicos como las familias
Lachnospiracea y Rumminococcaceae, provoca un mayor riesgo de CDI (Ross,
2016).
Para apoyar la idea del desplazamiento del nicho ecológico mediante

mecanismos competitivos, la colonización en ratones con cepas no toxigénicas de
C. difficile previamente a la colonización con cepas toxigénicas, previene
completamente la aparición de colitis. Esto es debido a que la cepa no toxigénica
ocupa el nicho que la cepa toxigénica ocuparía y, por tanto, esta última es incapaz
de colonizar (Sambol, 2002).
La capacidad del FMT de curar la CDI recurrente con un éxito de casi el

100% apoya la idea que restaurar la diversidad de la microbiota es un proceso
clave, y que varios grupos de bacterias estarían implicados en prevenir o tratar la
CDI (Britton, 2014). Al comprobar la restauración de la microbiota intestinal en
pacientes con CDI previa y posteriormente a un FMT, se ha evidenciado que la
composición y cantidad de los ácidos biliares son totalmente diferentes en ambas
situaciones. La presencia de una carga elevada de ácidos biliares primarios y
conjugados en muestras “pre FMT” sugiere su hidrolisis incompleta
(Weingarden, 2014). El ácido taurocólico está muy aumentado en muestras
previas y el litocólico y otros ácidos biliares secundarios muy disminuidos, y
viceversa, en muestras “post FMT”. También la reposición de la producción de
antimicrobianos “post FMT”, como la turicina o la nisina, tiene una potencial
contribución en el éxito de la FMT (Baktash, 2018).
La dieta también jugaría su papel en la resistencia a la colonización. Se ha

visto que el zinc de la dieta juega su papel en la severidad y susceptibilidad de la
131
CDI (Zackular, 2016), ya que altera la microbiota intestinal y disminuye la
resistencia a la colonización. También se ha visto que la dieta baja en proteínas
supone protección en el desarrollo de CDI en ratones (Moore, 2015).
FIGURA 20: Esquema de la perdida de la resistencia a la colonización durante la

disbacteriosis y su susceptibilidad al desarrollo de CDI. (Ross, 2016).
132
1.10.3 Alteraciones de la microbiota Intestinal en pacientes con infección de C.
difficile.
Como hemos visto la microbiota intestinal mediante los mecanismos de

resistencia a la colonización puede ser una de las claves de la prevención de la
CDI. La disrupción de la microbiota intestinal predispone a la colonización por C.
difficile o a CDI. Descubrir cuál es el patrón de disrupción de la microbiota
intestinal en ambos casos nos permitiría entender los mecanismos subyacentes,
encontrar especies o grupos protectores o predisponentes y poder diseñar nuevas
terapias moduladoras de la microbiota con bacterias probióticas más enfocadas y
precisas. Debido a la gran variabilidad de composición de la microbiota intestinal
que encontramos en controles sanos, la mejor forma de caracterizar estos procesos
sería mediante un estudio prospectivo, anterior y posterior a una colonización o
CDI. Este abordaje es costoso y se prolongaría mucho tiempo en la práctica, de ahí
que se planteen alternativas como comparar diferentes cohortes de pacientes con
CDI, pacientes colonizados por C. difficile, pacientes con diarrea nosocomial sin
CDI y pacientes sin diarrea o controles sanos. Todos estos estudios suelen ser con
un número de muestras bastante reducido, siendo la interpretación de resultados
bastante compleja. Aun así, se han visto claras diferencias en la composición de la
microbiota intestinal entre algunos de estos grupos de pacientes.
En uno de los pocos estudios prospectivos realizados al respecto con

pacientes hospitalizados, se analizó la microbiota intestinal de 4 pacientes
portadores asintomáticos de C. difficile y 4 pacientes con CDI a lo lardo de su
ingreso. Se observó la dinámica de cambio de ciertos grupos de bacterias
potencialmente protectores. Interesantemente, días antes de que la colonización
fuera detectada en los portadores se observó una abundancia relativa elevada de
Clostridium cluster XI Incertae Sedis, otros Clostridium y Eubacterium, con respecto a
los pacientes con CDI. Se trata de uno de los trabajos que mejor sustentan la
hipótesis de que algunos grupos de bacterias inhibirían la transición del estado de
colonización a infección (Vincent, 2016).
Lee y col. en 2017, diseñaron también un estudio prospectivo de

caracterización de microbiota intestinal en pacientes hematológicos receptores de
133
trasplante de médula ósea, ya que la CDI es una frecuente causa de diarrea en
estos pacientes, puesto que reciben profilaxis antibiótica después del trasplante.
Se había visto que estos pacientes tienen altas de colonización de C. difficile. El
objetivo del estudio fue identificar bacterias protectoras a desarrollar CDI. De 234
trasplantados, 53 padecieron CDI. Se identificaron 3 grupos de bacterias
protectoras: el phylum Bacteroidetes, la familia Lachnospiraceae (Clostridium
cluster XIVa) y la familia Ruminococcaceae (Clostridium cluster IV). La pérdida de
diversidad no sería un factor predictivo de desarrollo inexcusable de CDI, ya que
se requeriría alguna alteración específica más (Lee, 2017).
Asimismo, se ha observado que la disbacteriosis es muy profunda en

pacientes con CDI recurrente. Weingarden y col. en 2014 estudiaron la microbiota
intestinal de 12 pacientes de forma anterior y posterior ser tratado con FMT, y en
los 2 donantes de heces que se requirieron para realizarlo. La diversidad fue
significativamente más elevada en las muestras “post FMT” que en las muestras
“pre FMT”. Esto fue debido a los cambios en abundancia relativa de los phylum
Bacteroidetes, Firmicutes y Proteobacteria. Las muestras de los donantes,
representativas de una microbiota sana, estaba compuesta por Bacteroidetes y
Firmicutes (80 –90% de las OTUs de cada muestra), con muy poca abundancia de
Proteobacteria (2% o menos de las OTUs de cada muestra). Por el contrario, las
muestras “pre FMT” tendían a ser dominadas por Proteobacteria, comprendiendo
sobre un 30-50% de las OTUs de cada muestra. Después del FMT, la microbiota
de los pacientes fue muy parecida a la de los donantes, con un aumento de
Firmicutes y Bacteroidetes, y disminución de Proteobacteria. De forma notable, se
observaron también grandes alteraciones a nivel de familia. Lachnospiraceae,
Bacteroidaceae y Ruminococcaceae comprendieron el 50% de las OTUs de cada
muestra de donante. Por el contrario, estas familias se encontraron en mucha
menor abundancia relativa en las muestras “pre FMT”, con Lachnospiraceae en
menos del 2%, Bacteroidaceae al 1% y Ruminococcaceae al 1%. Por el contrario,
aparecieron Enterobacteriaceae, Veillonellaceae y Verrucomicrobiaceae,
componentes menores en los donantes sanos, pero que representaron alrededor
del 50% de las OTUs en las muestras “pre FMT”. Después del FMT el patrón de la
microbiota a nivel de familia revirtió (Weingarden, 2014).
134
Antharam y col. en 2013 compararon la microbiota intestinal en 39
pacientes con CDI, 36 pacientes con diarrea nosocomial no debida a C. difficile
(CDN, Clostridium Difficile-negative nosocomial diarrhoea) y 40 controles sanos.
Tanto los pacientes con CDI como los que tenían CDN presentaron una
microbiota con menor diversidad, sobre todo a expensas del phylum Firmicutes
(De 75% en controles sanos pasó a 40% en ambos grupos). La mayor parte de los
Firmicutes correspondieron a la clase Clostridia. El cluster Clostridium XIVa (con el
género Eubacterium) y en menor medida el IV estuvieron significativamente
disminuidos en ambos grupos CDI y CDN con respecto a los controles sanos
(XIVa: 5.5% y 6.6% frente 18.4%; IV: 0.47% y 0.40% frente 2.95%). Estos grupos
incluyen una gran cantidad de bacterias beneficiosas productoras de butirato. A
nivel de familia, hubo una disminución en la abundancia de familias de bacterias
productoras de butirato, como Lachnospiraceae y Ruminococcaceae en ambos
grupos CDI y CDN. Sin embargo y de forma notable, no hubo diferencias
significativas en cuanto a la composición de ambos grupos. Algunos géneros
estuvieron más abundantes en los pacientes CDI con respecto a los controles
sanos, por ejemplo, Veillonella (4.5% frente 0.6%), Enterococcus (7.1% frente 0.05%)
y Lactobacillus (3.7% frente. 0.4%). Enterococcus y Lactobacillus son bacterias
productoras de ácido láctico del orden Lactobacillales. La familia
Desulfovibrionaceae de la clase Proteobacteria, que incluye un número
importante de bacterias Gram negativas reductoras de sulfato estuvo disminuido
en los pacientes con CDI. Los géneros Blautia, Pseudobutyrivibrio, Roseburia,
Faecalibacterium, Anaerostipes, Subdoligranulum, Ruminococcus, Streptococcus, Dorea
y Coprococcus fueron los principales géneros disminuidos en los grupos CDI y
CDN que permite diferenciarlo del grupo de controles sanos. En líneas generales,
los autores concluyeron que la disbacteriosis no específica entre los grupos CDI y
CDN pudo deberse a la alta frecuencia de exposición antibiótica previa (CDI:
87.2%, CDN: 58.3% frente a 22.5% controles), sugiriendo que el grupo CDN
podría ser susceptible al desarrollo de CDI (Antharam, 2013).
Skraban y col. en 2013 comparando pacientes con CDI y controles sanos

identificaron que la especie Bifidobacterium longum era la más importante especie
asociada a las muestras de los controles sanos. Además, este trabajo observó
cómo, aunque la presencia de ciertas combinaciones de especies se asoció a la
135
colonización por C. difficile o a CDI, la presencia de algunos ribotipos (como el
027) se asociaría a una disbacteriosis más profunda (Skraban, 2013).
Milani y col. en 2016 mediante la combinación de estudios moleculares

metagenómicos y metabolómicos en 25 pacientes con CDI, en 29 pacientes con
exposición a antibióticos pero sin CDI (AB+) y en 30 pacientes sin exposición
antibiótica ni CDI (AB-), intentaron caracterizar la microbiota intestinal de los
pacientes con CDI para dilucidar los mecanismos que subyacen en este proceso.
Los pacientes AB+ tuvieron una diversidad de microbiota similar a la de los AB-,
pero los pacientes CDI presentaron una diversidad menor a ambos grupos. Al
comparar el grupo AB- con el grupo CDI se encontraron varios grupos de
bacterias disminuidos en los pacientes CDI, como Faecalibacterium, Bifidobacterium,
Akkermansia, Bacteroides, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae y Alistipes, todas
bacterias con funciones beneficiosas. Asimismo, aparte de la familia
Peptostreptococcaceae que incluye a C. difficile, se encontraron varios grupos de
bacterias patógenas o patógenas oportunistas aumentadas en el grupo CDI con
respeto al grupo AB-, como Klebsiella, Escherichia/Shigella, Sutterella, Enterococcus,
Citrobacter, Veilonella, Proteus, Helicobacter, Morganella, Hafnia, Corynebacterium y
Staphylococcus. Con el fin de identificar grupos de bacterias que permitieran
caracterizar el riesgo de desarrollar CDI, se comparó el grupo AB+ y CDI frente al
AB- y se encontró que la disminución de Alistipes y el aumento de Enterococcus era
la alteración de la microbiota intestinal que mejor discriminaba el riesgo a
desarrollar CDI. Por otra parte, la caracterización metabolómica de los pacientes
con CDI permitió identificar un incremento de las glicosil hidrolasas y otros genes
relacionados con la producción de butirato, y un descenso de los genes
responsables de la degradación de los ácidos biliares primarios (Milani, 2016).
Gu y col. en 2016 investigaron las diferencias en la microbiota intestinal en

15 pacientes con CDI, 18 con diarrea nosocomial no de debida a C. difficile (CDN)
y 25 controles sanos. Con respecto a las diferencias entre CDI y controles, en
Firmicutes, hubo una reducción en CDI con respecto a controles, sobre todo
debido a la reducción del orden Clostridiales. En CDI se observa una dramática
bajada de Lachnospiraceae y Ruminococcaceae, productoras de butirato en
muchos géneros. En esta última familia, sobre todo fue debido a géneros como
136
Faecalibacterium, Clostrodium IV, Oscillospira y Ruminococcus. Por el contrario, hay
aumento en la familia Clostridiaceae_1, donde hay géneros de Clostridium
patógenos. Además, bacterias productoras de ácido láctico, como
Enterococcaceae, Streptococcaceae y Lactobacillaceae aumentaron en CDI. Como
era de esperar la familia Peptostreptococcaceae, donde se incluye C. difficile, era
más abundante en el grupo CDI. El phylum Bacteroidetes fue el dominante en
controles sanos, pero estuvo en menor abundancia en CDI, con reducciones en los
géneros Bacteroides y Alistipes. En el phylum Actinobacteria hubo similitud en
porcentaje total, pero diferencias a nivel de algunos géneros, por ejemplo,
incrementos de los órdenes Actinomicetales y Corinebacteriales, y a nivel de
género incrementos de Actinomyces y Rothiabacterium mientras que Colinisella
(genero productor de AGCC) estuvo reducida. A nivel Proteobacteria, la
abundancia fue mucho mayor en CDI, debido sobre todo a
gammaproteobacterias, que a su vez fue debido a aumenos en la familia
Enterobacteriacea, considerada patógena oportunista, especialmente
Escherichia/Shigella, Kleibsiella, Proteus y Providencia. Con respecto a la comparación
del grupo CDI con respecto al grupo CDN, no hubo diferencias en cuanto riqueza
y diversidad, pero si diferencias, por ejemplo, dentro del phylum Fusobacteria,
representado por el género Fusobacterium que presentó incrementos solo en el
grupo CDN, pero no en el grupo CDI ni en el de controles sanos. Gemminger,
Paraprevotella, Faecalobacterium, Fusobacterium y Collinsela estuvieron disminuidos
en los pacientes con CDI, pero Providencia y Proteus fueron más abundantes en el
grupo CDI que en el CDN. Por tanto, la microbiota intestinal de los pacientes
CDN podría ser susceptible a desarrollar CDI, ya que en la mayoría de los casos
ha habido exposición previa a antibióticos, y es muy parecida a la de CDI, pero
con la diferencia de que no ha habido exposición a esporas de C. difficile. La
reducción de Faecalibaterium en CDI que no se observó en CDN y controles es
importante. Faecalibacterium Prausnitzii es un gran productor de butirato y su
reducción es compatible con la inflamación existente en la CDI. En conclusión, se
objetivó una disminución de bacterias productoras de butirato en los grupos CDI
y CDN, y un aumento de patógenos oportunistas productores de endotoxinas y
grupos de bacterias productores de lactato en el grupo CDI al comparar con los
controles sanos (Gu, 2016).
137
1.10.4 Alteraciones de la microbiota intestinal en pacientes portadores
asintomáticos de C. difficile.
La inclusión de individuos colonizados de C. difficile en los estudios de

comparación de microbiota intestinal de cohortes frente a pacientes con CDI, es
probable que aporte información sobre la susceptibilidad o protección frente a la
CDI. Se han realizado varios trabajos al respecto, diferentes todos de ellos, y de
los cuales podemos extraer ciertas hipótesis de interés. Ya en 2004 Ozaki y col.
establecieron la relación entre la colonización de C. difficile y la abundancia en
heces de Enterococcus (Ozaki, 2004). Rea y col. en 2012, estudiaron la tasa de
colonización de C. difficile en ancianos, ya que se sabe que en ancianos es elevada
debido a varias causas como un estado inmune reducido, aumento de la
probabilidad de uso de antibióticos y a su más frecuente hospitalización. De 323
pacientes ancianos estudiados se detectaron 22 pacientes con estudio de C. difficile
en heces positivo y de estos 22, solo 2 casos fueron diagnosticados de CDI con
clínica, por tanto, el resto de casos positivos podemos estipular que se trataban de
portadores asintomáticos. A nivel phylum la única diferencia significativa fue la
reducción en Spirochaetes en portadores, el resto era similar salvo Proteobacteria,
que estuvo a 2,3% en controles y 4,3% en portadores. Hubo mucha variabilidad
entre las muestras en ambos grupos. Por ejemplo, Bacteroidetes estuvo entre el
4% y el 92% en los controles. A nivel familia, Erysipelotrichaceae, Aerococaccae y
Flavobacteriaceae estuvieron más elevadas en portadores y Enterococcaceae,
Spirochaetaceae, Prevotellaceae, estuvieron disminuidas. A nivel de género, solo
se vieron diferencias en aquellos grupos minoritarios que estuvieron en muy baja
proporción. Las diferencias más obvias se vieron en los 2 pacientes con CDI. En
estos pacientes el género dominante fue Parabacteroides, comparado con controles
y el resto de los portadores. Interesantemente. Bifidobacteria spp no fue detectada
en pacientes con CDI, pero si en el resto portadores y en los controles. Por otra
parte, solo en tres pacientes se detectó el ribotipo 027, en un portador y en los dos
casos de CDI. Además, hubo una tendencia en los CDI de tener poco
Faecalibacterium spp con respecto al grupo de portadores asintomáticos. Esta es
una bacteria de reconocido efecto antinflamatorio. Por tanto, aunque no hubo
unas alteraciones dramáticas en ambos grupos a nivel de phylum, existió una gran
variabilidad individual en la microbiota de estos pacientes ancianos (Rea, 2012).
138
Zhang y col. en 2015 consideraron que la colonización asintomática de C.
difficile estaba asociada a cambios en la microbiota intestinal, pero la transición a
un estado de CDI podría deberse a la influencia de otros grupos de bacterias y
también a otros factores como el estado inmune del paciente. Presentaron un
estudio con 3 grupos: 8 pacientes con CDI, 8 portadores asintomáticos de C.
difficile y 9 controles sanos. La hipótesis fue que la microbiota intestinal podría
contribuir a la patogénesis de CDI y el estado de la enfermedad. La microbiota de
infectados y colonizados tuvo menor diversidad que la de los controles sanos,
pero no difirieron en diversidad de manera estadísticamente significativa los dos
primeros grupos. Asimismo, la microbiota de los 3 grupos fue diferentes a nivel
estructural. A nivel phylum se observó que en controles sanos predominaba
Bacteroidetes (48,2%) y Firmicutes (41,5%) mientras que en los pacientes con CDI
había más abundancia relativa de Proteobacteria (33,6%) y menor de
Bacteroidetes (23,8%) y Firmicutes (23,8%). La microbiota de los cololizados fue
más parecida a la de los controles sanos que a la de los pacientes con CDI, pero
también hubo aumento de Proteobacteria y reducción de Firmicutes y
Bacteroidetes, aunque no tan pronunciada. Destacó el alto porcentaje de
Fusobacteria en individuos portadores y pacientes con CDI. A nivel de género, la
cantidad de Clostridium XI (donde se incluye C. difficile) fue de 6,5%, 1,6% y 0,0%
en los grupos de pacientes con CDI, portadores y controles sanos
respectivamente. En Bacteroidetes hubo disminución de Alistipes, Bacteroides y
Prevotella, y aumento de Parabacteroides en pacientes con CDI y portadores con
respecto a controles sanos. En Proteobacteria hubo aumento de
Escherichia/Shigella, Kleibsiella, Haemophilus, Pseudomonas y Biophila en pacientes
con CDI y portadores, pero disminución de Parasutterella y Gemminger en ambos
grupos. Dentro de Firmicutes, Clostridium XIVa, Clostridium Sensu Strict,
Enterococcus, Veillonella y Lactobacillus estuvieron aumentados en pacientes con
CDI y portadores y Phascolarctobacterium, Roseburia, Megamonas, Ruminococcus,
Faecalobacterium y Coprococcus estuvieron disminuidos en ambos. A destacar que
Bacteroides aumentó de 10,8%, 24% y 31% desde los pacientes con CDI, portadores
y controles sanos, mientras que en Escherichia/Shigella fue disminuyendo de 23,9%,
8,7% y 3,6%. Destacó también la escasez de Bifidobacterium en pacientes con CDI
con respecto a portadores y controles sanos. Se objetivó una escasez de bacterias
productoras de butirato como Coprococcus y Roseburia (Lachnospiraceae) y
139
Faecalibacterium y Ruminococcus (Ruminococcaceae) en CDI y portadores. Los
autores concluyeron que en los colonizados por C. difficile la microbiota podría ser
susceptible a desarrollar CDI, pero esto también dependería del estado inmune
del hospedador. El estudio confirmó que, si bien hay perdida de resistencia a la
colonización en portadores, debe existir algo más que dé lugar al estado de
enfermedad en estos pacientes, puesto que se objetiva una reducción de bacterias
productoras de butirato y una disbacteriosis con pérdida de riqueza, además de
una microbiota alterada con respecto a los controles sanos. Asimismo, también la
no transición a CDI desde el estado de portador asintomático podría deberse a
cepas poco virulentas (Zhang, 2015).
Daquigan y col. en 2017, mediante un método de secuenciación más

sensible para caracterizar la microbiota intestinal, reexaminaron muestras de
otros trabajos, corroborándose la correlación negativa con Clostridium scindens e
identificando nuevas correlaciones negativas con otras especies de Blautia (Blautia
faecis, Blautia luti, Blautia schinkii y Blautia wexlerae). Este grupo de bacterias
interviene en el metabolismo de los ácidos biliares ya que tiene actividad BaiCD y
transforma los ácidos biliares primarios en secundarios También, otros
Clostridiales como Clostridium paraputrificum y Clostridium neonatale y Veillonella
mostraron correlación positiva. Además, los datos sustentaron que la abundancia
relativa de C. difficile es menor en controles que en pacientes con CDI (Daquigan,
2017).
140
II-JUSTIFICACIÓN DEL
ESTUDIO Y
OBJETIVOS.
CAPITULO II – JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y OBJETIVOS________________
CAPITULO II. JUSTIFICACIÓN DEL ESTUDIO Y OBJETIVOS.
En este capítulo justificaremos el estudio diseñado en base a la

importancia del tema. A continuación, expondremos trabajos relevantes acerca de
la microbiota intestinal y la relación estrecha que se establece con respecto a la
patogénesis de la CDI. Asimismo, también expondremos los principales trabajos
pioneros que han aportado luz acerca de los mecanismos subyacentes al estado de
colonización asintomática por C. difficile. En el último párrafo desarrollaremos los
objetivos del presente estudio en base a lo expuesto anteriormente.
C. difficile produce una infección que causa desde manifestaciones clínicas

leves, como una diarrea leve o moderada, hasta complicaciones más graves como
la colitis pseudomembranosa fulminante y el megacolon tóxico que son mortales
en un gran número de casos (Crobach, 2016). El tipo de manifestaciones clínicas
que va a producir dependerá del microorganismo y del estado del paciente. Del
microorganismo en cuanto a la virulencia de este, por tanto, del tipo de cepa de C.
difficile causante de la infección, y del paciente, en cuanto a su estado inmune,
comorbilidades asociadas y edad, principalmente. Es destacable que existe una
elevada probabilidad de que se produzcan recurrencias a las 2-8 semanas una vez
resuelto el primer episodio. El riesgo de recurrencia tras un episodio inicial es del
10-30%, después de una primera recurrencia es del 40% para ser de más del 50%
en episodios posteriores (Kwon, 2015).
Los principales factores de riesgo asociados a la CDI hospitalaria son la

edad avanzada, que a su vez se asocia potencialmente a una mayor severidad de
la enfermedad de base y mayores comorbilidades, y la duración de la
hospitalización (McDonald, 2006). El incremento diario en el riesgo de padecer
CDI durante una hospitalización ya nos sugiere que la misma hospitalización es
representativa de la duración y el grado de exposición a la bacteria, probabilidad
de exposición a antibióticos y severidad de la enfermedad de base subyacente
(Loo, 2011). La exposición a antibióticos es el factor de riesgo modificable más
importante. Cualquier antibiótico se asocia con CDI, pero las cefalosporinas de
144
tercera y cuarta generación, carbapenems, fluorquinolonas y la clindamicina
presentan elevado riesgo (Hensgens, 2012; Pépin, 2005; Johnson, 1999). Este riesgo
y su asociación con la CDI dependen de la prevalencia local de los ribotipos
circulantes y de si son particularmente virulentos o bien resistentes al antibiótico
administrado. El riesgo de CDI aparece al iniciar el tratamiento y durante los 3
meses posteriores a la finalización de la terapia, aunque el mayor riesgo dentro de
este periodo (7 a 10 veces) ocurre durante el primer mes post administración
antibiótica (Pépin, 2005). Por otra parte, los factores de riesgo para los casos de
CDI provenientes de la comunidad no están exactamente definidos, aunque
podrían asociarse al uso de antibióticos o a la edad avanzada.
La CDI supone un problema muy importante en cuanto a mortalidad,

morbilidad y costes asociados que supone. Se ha evidenciado que la
epidemiología de la CDI ha cambiado en los últimos años. Durante mucho tiempo
se ha creído que la CDI ocurría únicamente en el ámbito hospitalario, pero la
incidencia de casos provenientes de la comunidad parece que ha venido
aumentado progresivamente, aunque es difícil estimar su incidencia. Durante la
década de los 90, C. difficile fue una causa importante de diarrea nosocomial, de
difícil manejo, pero de mortalidad baja. A principios del siglo XXI la situación
cambió radicalmente ya que muchos estudios empezaron a alertar del aumento
de la mortalidad que producía esta infección y de la asociación de estos casos más
severos a una cepa anteriormente descrita como de escasa patogenicidad; el
ribotipo 027 (Pépin, 2004).
C. difficile es una especie que presenta una gran diversidad genética, lo que
hace que existan múltiples cepas circulantes. Por tanto, tenemos diferentes
ribotipos circulantes y algunos de ellos se asocian a una mayor virulencia, debido
a una variabilidad genética en cuanto a los factores de virulencia posibles. La
producción de las exotoxinas TcdA y TcdB son el mayor factor de virulencia de C.
difficile y su producción es la causa de la sintomatología de la CDI. La expresión
de las toxinas se produce al entrar el microorganismo en la fase estacionaria de
crecimiento y está en equilibrio bidireccional e influenciado por varios factores de
tipo ambiental. Pueden producirse cambios en la región codificante de las toxinas
que conforman una heterogeneidad genética, dando lugar a una serie de
145
diferentes toxinotipos. Esto supone que haya cepas con diferente actividad y
especificidad de sus toxinas con respecto a la cepa de referencia de C. difficile
(Rupnik, 2016). A diferencia de la mayoría de las bacterias patógenas productoras
de toxinas, donde los genes que las codifican son muy estableces en cuanto a sus
secuencias, con C. difficile no ocurre esto. Existe una alta tasa de mutación en tcdB.
Es posible que esta variación toxinotípica conduzca a una falta de protección
inmunitaria y que la población carezca de ella al exponerse a cepas con variantes
de toxinas. La tercera toxina de C. difficile, la toxina binaria o CDT hace unos años
era muy infrecuente en cepas productoras de CDI (menos del 10%), pero en los
últimos 10 años su prevalencia se ha incrementado de forma notoria (Rupnik,
2008). Esto es debido a que está frecuentemente asociada a las llamadas cepas
hipervirulentas de reciente aparición (ribotipo 027 y 078 principalmente), las
cuales presentan mayor tasa de mortalidad y morbilidad (Gerding, 2014).
Las toxinas desencadenan una respuesta inmune exacerbada que puede

resultar patogénica, aunque de forma global, la respuesta inmune frente a C.
difficile no está completamente dilucida ya que también presenta efectos
protectores. Este mecanismo dual demuestra la importancia de la relación entre
las bacterias comensales intestinales y la respuesta inflamatoria del hospedador
durante la infección. Es probable que la respuesta inmune sea polifacética y
pueda adoptar los dos roles. La clave está en mantener un balance inflamatorio
adecuado para combatir la infección limitando los efectos colaterales como los
daños tisulares. El grado de severidad de la clínica producida por la CDI gira
entorno a la intensidad y el tipo de respuesta inmune obtenida (Buonomo, 2016).
La interrelación entre la microbiota y el epitelio intestinal juega un papel

importante en el modelaje de la respuesta inmune. Las alteraciones en la
composición de la microbiota pueden provocar cambios en la reactividad de las
células inmunes y esto puede contribuir en la severidad de la infección de C.
difficile. Además, la microbiota intestinal induce de formación de capa mucosa y
esto reduciría la inflamación al crear una barrera física entre la luz intestinal y el
epitelio, y provocaría que las células dendríticas activen su capacidad reguladora
de la respuesta inmune (Shan, 2013). El tratamiento antibiótico también produce
un ambiente proinflamatorio intestinal ya que aumenta la traslocación bacteriana
146
desde el intestino al exterior, con la consecuente activación de una respuesta
inmune desequilibrada.
El otro factor de virulencia más importante de C. difficile es su capacidad

de formar esporas. Del morfotipo de esta espora latente, variable según la cepa,
va a depender su patogenia y su transmisibilidad, ya que su forma vegetativa es
de naturaleza anaeróbica estricta y es incapaz de sobrevivir en ambientes
aeróbicos (Deakin, 2012). También, la germinación de las esporas, su mecanismo
de activación, la cascada de reacciones que se producen y los factores que la
afectan es clave para estudiar su posible modulación e inhibición y para
comprender el efecto de la microbiota intestinal sobre ella. Además, también
existe una variabilidad de activación de la germinación dependiente de la cepa.
La germinación de las esporas de C. difficile comienza cuando los germinantes
ácidos biliares y cogerminantes aminoácidos se unen a sus receptores específicos
(Paredes-Sabja, 2014). Por tanto, los ácidos biliares intestinales juegan un papel
clave en la colonización y patogénesis de C. difficile. Básicamente son derivados
del colesterol sintetizados en el hígado, secretados en el duodeno, reabsorbidos en
su mayor parte mediante circulación enterohepática y devueltos al hígado. Los
ácidos biliares primarios que llegan al intestino grueso son biotransformados en
ácidos biliares secundarios mediante enzimas secretados por la microbiota
intestinal de forma específica. Esto es lo más importante ya que la depleción de
bacterias que tienen dotación enzimática para obtener ácidos biliares secundarios
generan una disminución de la resistencia a la infección (Buffie, 2015). Además,
los ácidos biliares secundarios inhiben también el crecimiento y la actividad y
cantidad de la toxina causante de la clínica (Thanissery, 2017). En estudios donde
se observa la restauración de la microbiota intestinal en pacientes con CDI antes y
después al FMT se ha evidenciado que la composición y cantidad de ácidos
biliares son totalmente diferentes en ambas situaciones. La presencia de una carga
elevada de ácidos biliares primarios y conjugados en muestras pre FMT sugiere
su hidrolisis y transformación en ácidos biliares secundarios incompleta
(Weingarden, 2014). La microbiota intestinal aporta dos enzimas que transforman
los ácidos biliares primarios germinantes de C. difficile; BSH y BaiCD. BSH
hidroliza los ácidos biliares conjugados en ácidos biliares libres. BaiCD es capaz
de transformar los ácidos biliares primarios en secundarios. Las bacterias cuyo
147
genoma codifique estos enzimas producirían un efecto inhibitorio sobre la
germinación de las esporas de C. difficile. BaiCD se encuentra presente en muy
pocos grupos de bacterias, que representan menos del 0,025% de la microbiota
intestinal normal (Winston, 2016), principalmente dentro del phylum Firmicutes
en los géneros Clostridium, Eubacterium y Blautia (Buffie, 2015). Por tanto, la
disbacteriosis intestinal secundaria a un tratamiento antibiótico conducirá en el
intestino grueso a un descenso en el metabolismo de los ácidos biliares
germinantes y a una rápida absorción de los ácidos biliares inhibidores,
produciendo un desbalance entre los procesos de inhibición y germinación de las
esporas de C. difficile, estableciéndose un nicho ecológico muy favorable para su
proliferación.
Llegados a este punto hemos establecido la importancia actual de la CDI

por diferentes motivos: el fuerte impacto sanitario que supone, el cambio en su
epidemiología global con la aparición de cepas hipervirulentas, la variabilidad
genética particularmente elevada de C. difficile que le confiere unas propiedades
variables en cuanto a virulencia debido a la multitud de ribotipos circulantes, y la
estrecha relación con la microbiota intestinal. Pero no hemos tratado de una
situación como es el estado de colonización asintomática de C. difficile. En este
grupo de individuos colonizados centraremos parte del estudio para intentar
esclarecer que aspecto diferencial presentan en su microbiota intestinal que hace
que no desarrollen CDI, es decir, que no se establezca la clínica. La tasa de
portadores asintomáticos es muy variable y depende de la edad, siendo bastante
elevada en niños, mientras que en adultos va a depender de las características de
la población que estudiemos. De forma general, esta incidencia es más elevada en
caso de contacto con ámbitos hospitalarios y en ciertas situaciones concomitantes
que favorecen la colonización como ocurre en los pacientes con fibrosis quística y
enfermedad inflamatoria intestinal (McDonald, 2018). La naturaleza del estado de
colonización suele ser transitoria y sin sintomatología, siempre y cuando no haya
una exposición repetida a factores de riesgo. Los pacientes con diarrea y con
evidencia de presencia de cepas no toxigénicas de C. difficile siempre deben ser
considerados portadores asintomáticos, ya que no hay evidencia de que las cepas
no toxigénicas sean capaces de producir clínica.
148
El interés por saber los mecanismos mediante los cuales la microbiota
intestinal de un paciente sano es capaz de prevenir la colonización de C. difficile y
la CDI es bastante reciente. Se ha visto que los antibióticos tienen efectos
profundos y duraderos en la estructura de la microbiota intestinal, afectando
tanto a su riqueza como a su diversidad (Antonopoulos, 2016). Ambas situaciones
disminuyen la resistencia a la colonización por C. difficile. Asimismo, la
diversidad disminuida no es recuperable en pacientes con CDI recurrente,
mientras que en pacientes con CDI recuperada vuelve a valores normales (Chang,
2008).
Un aspecto esencial es que el metabolismo de C. difficile en el contexto de

la microbiota intestinal que ha colonizado está íntegramente relacionado con su
patogénesis. El desarrollo de la CDI involucra a dos mecanismos claves como son
el metabolismo de los ácidos biliares y la competición con otras bacterias por los
nutrientes (Britton, 2012). Otros mecanismos también importantes serían la
síntesis de antibacterianos peptídicos que estaría disminuida cuando la
microbiota pierde riqueza, y la existencia de una comunicación entre el sistema
inmune y la microbiota intestinal que también se vería alterada en una
disbacteriosis (Hryckowian, 2017). Con respecto al metabolismo de los ácidos
biliares y su influencia en la patogénesis de la CDI, Buffie y col. en 2015,
encontraron que la inhibición de la germinación de las esporas de C. difficile es
uno de los mecanismos inhibitorios del desarrollo de infección principales que
ocurren en los individuos colonizados que no desarrollan clínica. Asimismo, esto
sería posible gracias a escasos grupos de bacterias que actuarían favoreciendo la
síntesis de ácidos biliares secundarios (con acción inhibitoria de la germinación),
debido a la síntesis del enzima BaiCD. Estas bacterias pertenecerían a diferentes
especies del género Clostridium, sobre todo del cluster Clostridium XIVa y otros
géneros como Blautia y Eubacterium (Buffie, 2015). Por otra parte, la capacidad del
FMT de curar la CDI recurrente con un éxito de casi el 100% apoya la idea de que
la restauraciónde la microbiota intestinal es un proceso clave. Asimismo, este
hecho implica que varios grupos de bacterias estarían implicados en prevenir o
tratar la CDI (Britton, 2014). Al estudiar la restauración de la microbiota intestinal
en pacientes con CDI sometidos a FMT, se ha evidenciado que la composición y
cantidad de los ácidos biliares son totalmente diferentes en ambas situaciones
149
(Weingarden, 2014), evidenciándose un predominio superior de ácidos biliares
primarios germinantes en los pacientes con CDI no tratada con respecto a la
tratada y curada.
La pérdida de la resistencia a la colonización por patógenos intestinales

como C. difficile al administrar antibióticos, provoca una pérdida de diversidad y
riqueza que disminuye la competición por los nutrientes y deja vía libre para
nichos ecológicos antes inaccesibles. Para apoyar la idea del desplazamiento del
nicho ecológico mediante mecanismos competitivos, la colonización en ratones
con cepas no toxigénicas de C. difficile previamente a la colonización con cepas
toxigénicas, previene completamente la aparición de colitis. Esto es debido a que
la cepa no toxigénica ocupa el nicho que la cepa toxigénica ocuparía y, por tanto,
es incapaz de colonizar (Sambol, 2002).
Asimismo, la reducción de los AGCC que se suele observar en una

disbacteriosis se ha asociado también a perdida de resistencia a la colonización, ya
que se ha visto que inhiben la expansión de C. difficile por diferentes mecanismos.
Entre ellos estarían la disminución del pH luminal y los efectos antinflamatorios
del ácido butírico, con reducción de la permeabilidad, aumento de la producción
de mucina y aumento de la síntesis de péptidos antimicrobianos. La caída de los
grupos butirogénico, presentes sobre todo enlas familias Lachnospiracea y
Rumminococcaceae, provocaría un mayor riesgo o susceptibilidad de desarrollo
de CDI (Ross, 2016).
Por consiguiente, la microbiota intestinal de un individuo sano, mediante

los mecanismos de resistencia a la colonización puede ser una de las claves de la
prevención de la CDI. Descubrir cuál es el patrón de disrupción de la microbiota
intestinal en casos de colonización asintomática por C. difficile o CDI, nos
permitiría entender los mecanismos subyacentes, encontrar especies o grupos
protectores o predisponentes y poder diseñar en un futuro nuevas terapias
moduladoras con bacterias probióticas más enfocadas y precisas. Debido a la gran
variabilidad en la composición de la microbiota intestinal que encontramos en
controles sanos, la mejor forma de caracterizar estos procesos sería mediante
estudios prospectivos, antes y después de una colonización por C. difficile o una
150
CDI. Este abordaje es costoso y se prolongaría mucho en el tiempo en la práctica.
Debido a esto la alternativa que planteamos es la comparación de tres cohortes de
individuos: pacientes con CDI, pacientes colonizados por Clostridium Difficile y
controles sanos. Hasta la fecha, los estudios que han incorporado una cohorte de
individuos colonizados son bastante escasos y con pequeño tamaño muestral,
quizás por la dificultad de incorporar sujetos a este grupo. Esto ha hecho que la
interpretación de los resultados sea bastante compleja. No obstante, la
composición de la microbiota intestinal en los pacientes con CDI ha sido mostrada
y caracterizada en varios trabajos, evidenciando unas diferencias en cuanto a
composición y estructura totalmente diferentes a la de los controles sanos. Lee y
col. en 2017, estudiando la microbiota intestinal de 53 pacientes con CDI,
identificaron 3 grupos de bacterias identificadas como protectoras de forma
significativa de CDI: el phylum Bacteroidetes y las familias Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae. Además, concluyeron que la pérdida de diversidad no era un
factor predictivo de desarrollo inexcusable hacia CDI, afirmando que se requieren
otros factores que intervengan en este fenómeno (Lee, 2017). Otro hecho
importante es que la disbacteriosis es más profunda en pacientes con CDI
recurrente. Weingarden y col. en 2014 estudiaron la resutauración de la
microbiota intestinal en pacientes con CDI sometidos a FMT. La diversidad fue
significativamente más elevada en las muestras “post FMT” que en las muestras
“pre FMT”, debido a los cambios la composición en los phylum Bacteroidetes,
Firmicutes y Proteobacteria. Las muestras de los donantes, representativas de una
microbiota sana estaba compuesta por Bacteroidetes-Firmicutes principalmente,
con muy poca abundancia de Proteobacteria. Por el contrario, las muestras “pre
FMT” tendían a ser dominadas por Proteobacteria. De forma notable, se
observaron también dramáticas alteraciones a nivel de familia. Lachnospiraceae,
Bacteroidaceae y Ruminococcaceae comprendieron el 50% de las OTUs de cada
muestra de donante. Por el contrario, estas familias se encontraron en mucha
menor abundancia en las muestras ”pre FMT”. Por el contrario, aparecieron
Enterobacteriaceae, Veillonellaceae y Verrucomicrobiaceae, componentes
menores de la microbiota intestinal de los donantes de heces, pero que
representaron alrededor del 50% de las OTUs en las muestras “pre FMT”.
Después del FMT el patrón de la microbiota a nivel de familia revirtió
(Weingarden, 2014). Este estudio nos indicaría que la disbacteriosis existente en la
151
CDI se basa en la perdida de Firmicutes y Bacteroidetes y la ganancia de
enterobacterias, grupo de bacterias potencialmente patógenas u oportunistas,
además de una perdida fehaciente de bacterias productoras de butirato. Este
puede que sea el hallazgo más evidente que encontramos en estos pacientes. Estos
resultados se han sustentando en otros trabajos (Antharam, 2013). Milani y col. en
2016 mediante la combinación de estudios moleculares metagenómicos y
metabolómicos en 25 pacientes con CDI, en 29 pacientes con exposición a
antibióticos, pero sin CDI y en 30 pacientes sin exposición antibiótica ni CDI
también intentó caracterizar la microbiota intestinal de los pacientes con CDI para
dilucidar los mecanismos que subyacen en este proceso. Se encontraron varios
géneros disminuidos en los pacientes CDI como Faecalibacterium, Bifidobacterium,
Akkermansia, Bacteroides, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae y Alistipes, todas
bacterias con funciones beneficiosas. Asimismo, aparte de la familia
Peptostreptococcaceae que incluye actualmente a Clostridium Difficile, se
encontraron varios grupos de bacterias patógenas o patógenas oportunistas
aumentadas en el grupo CDI, como Klebsiella, Escherichia/Shigella, Sutterella,
Enterococcus, Citrobacter, Veilonella, Proteus, Helicobacter, Morganella, Hafnia,
Corynebacterium y Staphylococcus (Milani, 2016). Gu y col. en 2016, en un estudio
similar, observaron además que bacterias productoras de ácido láctico, como las
familias Enterococcaceae, Streptococcaceae y Lactobacillaceae aumentan
dramáticamente en CDI.
El objetivo principal de este estudio es la comparación de la microbiota

intestinal entre un grupo de pacientes con CDI y un grupo de individuos
colonizados por C. difficile con respecto a un grupo de controles sanos. Como
hemos visto, los estudios sobre la microbiota intestinal en determinadas
situaciones patológicas son bastante recientes, debido a la instauración de los
métodos moleculares basados en la secuenciación de ADNr 16S bacteriano. Más
concretamente los estudios sobre microbiota intestinal en pacientes con CDI ha
ayudado hasta la fecha a descubrir algunos de los mecanismos de resistencia la
colonización, germinación y expansión de C. difficile. Caracterizar el patrón de la
disbacteriosis que se produce nos permitiría entender los mecanismos que
subyacen, encontrar grupos de bacterias protectores o predisponentes a CDI y con
esto poder diseñar nuevos probióticos con acción preventiva o terapéutica. Es un
152
hecho que la interpretación de los datos obtenidos es compleja y que la
variabilidad intraindividual de la microbiota es considerable. Debido a lo costoso
de los estudios prospectivos, en los que se necesita un periodo de tiempo de
seguimiento con análisis repetidos en los pacientes para evaluar la evolución
temporal de las mismo y su relación con determinada intervención, se suele optar
por comparar los resultados de dos cohortes con características diferentes
evaluando la relación entre esas diferencias y los patrones de la microbiota
intestinal en ambas. En este sentido, comparar la microbiota intestinal en
pacientes con CDI con respecto a individuos colonizados por C. difficile que no
presentan clínica (o si la presentan se puede demostrar que es debido a otras
causas) ha sido poco estudiado. Este enfoque puede aportar información
relevante sobre la susceptibilidad o protección frente al desarrollo de CDI desde
la fase de portador (colonización). Es interesante saber porque muchos pacientes
que están colonizados de forma transitoria permanecen en ese estado un tiempo
prolongado sin desarrollar clínica. De los pocos trabajos al respecto, se obtienen
similitudes y diferencias entre estos dos grupos estudiados (Rea, 2012; Zhang,
2015; Han, 2019). Además, estos estudios son diferentes en algunos aspectos. Por
consiguiente, consideramos muy interesante nuestro abordaje en base a todo lo
expuesto anteriormente.
153
III-HIPÓTESIS.
CAPÍTULO III - HIPÓTESIS_______________________________________________
CAPÍTULO III: HIPÓTESIS.
La hipótesis de trabajo que manejamos es que la microbiota intestinal de

los pacientes con CDI y de los individuos colonizados por C. difficile es muy
diferente en cuanto a diversidad, riqueza, estructura y composición con respecto a
los controles sanos, pero no obstante es bastante similar entre si. Las diferencias
existentes en los individuos colonizados e infectados por C. difficile al respecto de
la microbiota intestinal se situarían en un conjunto de disimilitudes en la
composición, que explicarían, al menos en parte, la no evolución desde un estado
de colonización, que se observa en algunos casos, a un estado de infección con
desarrollo de clínica y sintomatología.
156
IV-MATERIAL Y
MÉTODOS.
CAPÍTULO IV - MATERIAL Y MÉTODOS__________________________________
CAPITULO IV. MATERIAL Y MÉTODOS.
4.1 DISEÑO DEL ESTUDIO.
Este trabajo de tesis doctotal es el resultado de un un estudio descriptivo

observacional transversal, donde comparamos la microbiota intestinal de 15
pacientes con CDI, 15 individuos colonizados por C. difficile y 15 controles sanos.
Los sujetos de estudio fueron incluidos desde el Hospital Universitario del
Vinalopó (Elche). El estudio fue aprobado por la Comisión de Investigación del
Hospital Universitario del Vinalopó el día 9 de noviembre de 2017.
Se definió como un caso de CDI aquel que presentaba diarrea (3

deposiciones o más catalogadas a partir del tipo 5 en la escala Bristol en las
últimas 24 horas), colitis pseudomembranosa o megacolon tóxico (McDonald,
2018; Surawicz, 2013) y donde se evidencia la presencia de C. difficile toxigénico
mediante las siguientes pruebas de laboratorio:
 Detección de las toxinas TcdA y/o TcdB y/o de la GDH de C. difficile en heces
mediante inmunocromatografía.
 Detección del gen tcdB de la toxina TcdB de C. difficile en heces mediante PCR.
 Detección del gen TPI (triose phosphate isomerase) de C. difficile en heces
mediante PCR.
Por otra parte, en la definición de caso colonizado por C. difficile el individuo
debía presentar ausencia de síntomas digestivos o en caso de tener diarrea tuvo
que ser atribuible a otras causas, junto con las pruebas de laboratorio
mencionadas para los casos de CDI para evidenciar la presencia de C. difficile en
heces, teniendo en cuenta que las cepas no toxigénicas (No detección del gen tcdB
de la toxina TcdB de C. difficile en heces mediante PCR y detección del gen TPI de
C. difficile en heces mediante PCR) siempre fueron incluídas en individuos
colonizados únicamente (Gerding, 2015)
160
4.1.1 Criterios de inclusión y de exclusión.
Los criterios de inclusión para el grupo de los pacientes con CDI (a partir
de ahora lo llamaremos grupo CDI) fueron los siguientes:
 Paciente mayor de 15 años.
 Presencia de diagnóstico clínico y microbiológico de CDI.
 Firma de consentimiento informado.
Por otra parte, los criterios de inclusión para el grupo de individuos

colonizados por C. difficile (a partir de ahora lo llamaremos grupo P) fueron los
siguientes:
 Individuo mayor de 15 años
 Ausencia de manifestaciones clínicas compatibles con CDI. En caso de
presentar diarrea ha de poder ser atribuida a otras causas diferentes.
 Evidencia de la presencia de C. difficile en heces mediante diagnóstico
microbiológico.
Con el fin de que ambos grupos fueran homogéneos y disminuir la

variabilidad de la microbiota relacionada con la edad, en este estudio no se
incluyeron pacientes pediátricos, ya que estos presentan una elevada tasa de
colonización de C. difficile “fisiológica”
Con respecto a los controles sanos (a partir de ahora lo llamaremos grupo

CTRL), los criterios de inclusión fueron los siguientes:
 Voluntarios sin síntomas digestivos.
 Pruebas negativas para la detección de C. difficile en heces.
 No administración antibiótica en los últimos tres meses.
161
4.1.2 Inclusión de los pacientes en el estudio.
En la siguiente figura describiremos el algoritmo multinivel para el

diagnóstico de CDI que se aplica en el Hospital Universitario del Vinalopó
(Alcalá-Hernández, 2016):
FIGURA 15: Algoritmo diagnóstico de la CDI multinivel. (Alcalá-Hernández, 2016).
La inclusión de los sujetos de los grupos CDI y P estuvo basada en la

forma convencional de diagnóstico de la CDI del Hospital Universitario del
Vinalopó. El hecho de pertenecer a un grupo u otro fue determinada por las
manifestaciones clínicas que presentaban los sujetos, como hemos visto en los
criterios de inclusión, que quedó evidenciada mediante revisión de las historias
clínicas.
Puesto que la identificación de individuos colonizados por C. difficile no

estaba implementada en la práctica asistencial y resulta dificultoso que los
médicos soliciten la determinación de toxinas y GDH de C. difficile sin sospecha
clínica de CDI, se realizaron varias estrategias para aumentar su captación.
Alguna de ellas fue consensuar un screening general con los facultativos
162
responsables de alguna localización teórica de elevada tasa de portadores
asintomáticos como la unidad de hemodiálisis, cuidados intensivos, residencias
de la 3º edad, etc.
4.1.3 Características de los grupos de estudio.
Las características clínicas y demográficas de los grupos de estudio

quedan descritas en la siguiente tabla:
TABLA 1: Carácterísticas clínicas y demográficas de los grupos de estudio.
163
4.1.4 Recogida y Almacenamiento de las muestras de heces.
Una vez identificados los sujetos de estudio mediante la revisión de la

base de datos con los casos con diagnóstico microbiológico en el periodo de enero
a diciembre de 2018, se contactó con los pacientes y se le proporcionó una hoja
informativa donde se explicaba brevemente el estudio. También se les entregó el
consentimiento informado que firmaron todos aquellos que consintieron
participar en el estudio y cumplían todos los criterios de inclusión.
, haciéndoles hincapié en la importancia de que una vez obtenida la muestra de
heces, debía llegar lo más pronto posible al laboratorio del Hospital Universitario
del Vinalopó. En caso de ser recogida el día anterior, era imprescindible su
refrigeración y almacenamiento en nevera.
Para la recogida de la muestra de heces se hizo hincapié en la importancia

de que una vez obtenida, debía llegar lo más pronto posible al laboratorio del
Hospital Universitario del Vinalopó de Elche. En caso de ser recogida el día
anterior, era imprescindible su refrigeración y almacenamiento en nevera. Una
vez la muestra de heces llegó al laboratorio, se procedió a congelarla a -80ºC hasta
su procesamiento para el análisis de la microbiota intestinal.
4.2 PRUEBAS DE LABORATORIO PARA EL DIÁGNOSTICO DE LOS

PACIENTES CON CDI E IDENTIFICACIÓN DE LOS INDIVIDUOS
COLONIZADOS POR C. DIFFICILE.
4.2.1 Determinación de TcdA/TcdB y GDH en heces
La determinación en heces de TcdA/TcdB y GDH se realizó en el

laboratorio del Hospital Universitario del Vinalopó. Se utilizó el kit C. difficile
GDH-toxins A-B MonlabTests (Código MO-804022) de la casa comercial Monlab
(Barcelona, España), siguiendo las indicaciones del fabricante.
La prueba C. difficile GDH-toxins A-B MonlabTests es un test rápido que

permite la detección cualitativa simultáneamente de TcdA, TcdB y GHD. Se trata
de un método inmunocromatográfico, en donde en la fase estacionaria que
164
consiste en una membrana, se adsorben anticuerpos específicos frente a TcdA,
TcdB y GDH. Si se diera presencia de alguna de ellas en la muestra de heces,
previamente diluida, se produciría una reacción específica al añadir un
anticuerpo conjugado que se manifestará mediante una banda de color.
4.2.2 Determinación de los genes tcdb y TPI de C. difficile.
A las muestras a las que se les detectó TcdA/TcdB y/o GDH en heces se les
determinó la presencia de los genes tcdb y TPI, específicos de C. difficile. Se utilizó
el kit FluoroType CDiff, específico para el instrumento FluoroCycler de la casa
comercial Hain Lifescience (Nehren, Alemania). La presencia en heces del gen
tcdb pondría de manifiesto que existe una cepa toxigénica de C. difficile, mientras
que la presencia del gen TPI solo pondría de manifiesto la presencia de C. difficile
(gen constitutivo de cepa toxigénica o no toxigénica. Ambos resultados deben
valorarse en conjunto. Los dos resultados positivos posibles serían:
 tcdB+/tpi+: Presencia de C. dfficile Toxigénico.
 tcdB-/tpi+: Presencia de C. difficile No Toxigénico.
El procedimiento de la prueba constó de dos fases principales. El primer
paso fue la extracción del ADN de las muestras de heces y se utilizó para ello el
kit GXT Stool Extraction, adaptado específicamente para el instrumento GenoXtract
de la casa comercial Hain Lifescience (Nehren, Alemania). Al ADN extraído se le
adicionaron 2 mezclas de amplificación y detección. La primera llevaba los
nucleótidos, el buffer y la Taq polimerasa. El segundo llevaba las sondas de ADN
de detección marcadas con fluorescencia, el buffer y los primers. El fundamento es
que la sonda si no se une a su cadena complementaria de ADN no emite
fluorescencia, puesto que es amortiguada (fenomeno de Quenching) por las bases
contiguas. En caso de unirse a su cadena ADN complementaria, el fluoróforo se
libera porque la base contigua no ejerce este efecto sobre él.
FIGURA 21: Funcionamiento de una Sonda Fluorescente en FluoroCycler.
165
Una vez realizada la mezcla con los reactivos específicos se introdujo en el
instrumento FluoroCycler para su amplificación mediante PCR e hibridación.
Después de esto, los fluoróforos de las sondas específicas para los genes de C.
difficile estudiados fueron excitados mediante luz en el FluoroCycler, emitiéndose
una fluorescencia que fue medida, mientras se fue elevando la temperatura
gradualmente. Si los genes tcdb y/o TPI estaban presentes en la muestra de ADN,
aparecerían dos picos durante la construcción de la curva de melting.
FIGURA 22: Ejemplo de curva de melting con dos picos para tcdb y tpi. IC: Control
Interno.
FIGURA 23: Ejemplo de curva de melting con un pico para TPI. IC: Control Interno.
166
4.3 DETERMINACIÓN METATAXONÓMICA DE LA COMPOSICIÓN DE LA
MICROBIOTA INTESTINAL.
En este apartado se describirá la metodología que se siguió para

determinar la composición de la microbiota intestinal mediante la amplificación
del gen que codifica la subunidad 16S del ribosoma bacteriano, su secuenciación
masiva y como se realizó la asignación taxonómica de las secuencias obtenidas.
El gen bacteriano ADNr 16S, con un tamaño aproximado de 1500 pb,

presenta estructura muy conservada. Se utiliza de forma universal en la
identificación taxonómica puesto que presenta regiones variables que han
acumulado cambios genéticos que nos permite diferenciar bacterias
filogenéticamente próximas.
En el presente estudio, realizamos la determinación metataxonómica de la

composición de la microbiota intestinal de los grupos de pacientes con CDI y de
individuos colonizados por C. difficile, así como de los controles sanos, en el
Servicio de Secuenciación de la Fundación para el Fomento de la Investigación
Sanitaria y Biomédica de la Comunitat Valenciana (Fisabio).
4.3.1 Extracción del ADN.
Para la extracción del ADN se utilizó el robot MagNA Pure 2.0 LC (Código
0519768600) y el kit MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit - Large Volume
(Código 03264793001), ambos de la casa comercial ROCHE (Mannheim,
Alemania). A las muestras de heces se le añadieron tampón PBS 1.5 veces en
volumen y se vortearon hasta conseguir una solución homogénea. A
continuación, se centrifugaron a 2000 rpm 5 minutos y se recogió el sobrenadante.
500 µl de este sobrenadante fue sometido a la extracción automática del ADN
siguiendo las instrucciones del fabricante de acuerdo al protocol total NA external
lysis.
Para valorar una correcta extracción, la cuantificación del ADN obtenido

de cada muestra se realizó mediante el lector Qubit Fluorometric Quantitation
167
(Código Q33226) de la casa comercial ThermoFisher Scientific (Waltham,
Massachusetts, Estados Unidos) mediante el kit Qubit 1x dsDNA HS Assay
(Código Q33231). La medición de la concentración mediante este lector está
basada en emisión de fluorescencia a diferencia de la lectura de la absorbancia
ultravioleta que se ha venido utilizando en los últimos tiempos. Con esto se
consigue una mayor especificidad de lectura de ADN sobre el ARN. La
concentración mínima aceptable fue de 5 ng/dL.
4.3.2 Amplificación y secuenciación del ADN.
Los amplicones del gen ADNr 16S bacteriano fueron obtenidos siguiendo
el protocolo 16S rDNA gene Metagenomic Sequencing Library Preparation Illumina
protocol (Código 15044223 Revisión A), de la casa comercial Illumina (San Diego,
California, Estados Unidos). Las secuencias específicas amplificadas están en la
región V3 y V4 (459 bp) del gen ADNr 16S. Los primers específicos fueron
seleccionados a partir de bibliografía vigente al respecto (Klindworth, 2013):
FIGURA 24: Nomenclatura IUPAC del Forward primer y Reverse primer utilizados en la
secuenciación del gen ADNr 16S bacteriano.
En cada pocillo (hay 96 pocillos por plato) de reacción de PCR se puso el

ADN extraído de las heces a concentración de 5 ng/dL, los reverse y forward
primers y la ADN polimerasa del kit KAPA HiFi HotStart ReadyMixPCR (Código
168
KK2602) de la casa comercial Kapa Biosystems (Wilmington, Massachusetts,
Estados Unidos), siguiendo el protocolo mencionado. A continuación, se
introdujo el plato de muestras en el termociclador y se procedió a realizar el
siguiente ciclo de temperaturas:
 Desnaturalización inicial: 3 minutos a 95ºC.
 25 ciclos: 30 segundos a 95ºC + 30 segundos a 55ºC + 30 segundos a
72ºC.
 5 minutos a 72ºC.
 Fin de la reacción mediante enfriamiento a 4ºC
Previamente a la secuenciación se tuvieron que preparar, adaptar,

purificar y normalizar los amplicones al modelo de secuenciación Illumina
mediante fragmentación enzimática. Se utilizó el Nextera XT index kit v2 (Código
FC-131-2001). Para asegurar la normalización de tamaño se procesó 1µL del
producto de la PCR en un 2100 Bioanalyzer instrument usando un Bioanalyzer DNA
1000 chip de la casa comercial Aguilent (Santa Clara, Estados Unidos). El tamaño
esperado debe ser sobre 550 bp.
Las librerías de amplicones fueron secuenciadas en un MiSeq Sequencer de

la casa comercial Illumina (San Diego, California, Estados Unidos) siguiendo las
especificaciones del fabricante, utilizando el MiSeq Reagen kit v3 (Código MS-
10223001). El Sistema Illumina aplica un método de secuenciación basado en la
polimerización del ADN, donde la incorporación de un nucleótido marcado con
fluorescencia y protegido en la cadena naciente impide que siga creciendo.
Después de detectar la señal fluorescente se elimina el grupo protector
pudiéndose incorporar otro nucleótido marcado e iniciar un nuevo ciclo. Para
ello, básicamente consiste en un cartucho de un solo uso que contiene reservorios
con sello metálico prerrellenos con los reactivos de secuenciación y clustering,
junto con una flow cell que consiste en una placa con carriles hechos de vídreo
donde las reacciones de secuenciación se producen. La secuenciación se realizó
usando un ciclo 2x300pb paired-end, como recomienda el fabricante. El mix de
amplicones fue reforzado con PhiX control (Código FC-110-3001), con el fin de
mejorar la incorporación de bases durante la secuenciación como recomienda el
fabricante Illumina.
169
4.3.3 Análisis bioinformático de las secuencias de amplicones del gen
bacteriano ADNr 16S y asignación taxonómica.
El análisis bioinformático constó de varias etapas. En primer lugar, se

realizó un control de calidad de las secuencias obtenidos y una eliminación de las
secuencias quiméricas, entre otros procesos de filtrado. Después ya se pudó
proceder a la asignación taxonómica.
El formato de los archivos de las secuencias obtenidas en bruto fue

FASTQ, que suele ser el estándar actual y es el que proporciona el sistema de
secuenciación Illumina.
En la fase de control de calidad el objetivo es el filtrado y recorte

(trimming) de las secuencias con el fin de eliminar aquellas cortas o de baja
calidad. Con esto nos aseguramos una buena asignación taxonómica (Schmieder,
2011). Este proceso fue realizado mediante el programa prinseq-lite (http:
prinseq.sourceforge.net). Se aplicó una longitud mínima de secuencia de 50
nucleótidos (min_length: 50). Además, se aplicó un recorte de base por base desde
la derecha, midiéndose que la calidad no bajara del umbral de 30 en una ventana
de 20 nucleótidos usando la media (trim_qual_right: 30, trim_qual_type: mean,
trim_qual_window: 20).
Se debe tener en cuenta que los sistemas Illumina proporcionan las

secuencias desaparejadas R1 y R2 (forward/reverse), y estas deben ser aparejadas
para para obtener el amplicón completo.
A continuación, mediante el pipeline DADA2

(https://benjjneb.github.io/dada2/index.html), se procedió a realizar otro control
de calidad y para la corrección de errores que supuestamente produce Illumina
durante la amplificación se realizó un trimming a 280 y 210 bp en R1 y R2, se
unieron y se buscó las secuencias quiméricas para eliminarlas. Las secuencias
quiméricas son productos erróneos de la amplificación, pero son detectables
puesto que los extremos difieren mucho en cuanto a su asignación taxonómica. El
pipeline DADA2 introduce un método novedoso de corrección de errores, ya que
170
es capaz de discriminar con mejor exactitud errores de amplificación de
secuencias biológicas variantes (Callahan, 2016)
Para el análisis metataxonómico de las secuencias se utilizó el programa

QIIME 2 (http: quiime.org), el cual permite mediante plugins de acceso libre
realizar la amplia mayoría de los análisis necesarios para el estudio de la
microbiota, obtención de gráficas y estadísticas. Mediante un pipeline diseñado
especificamente a tal efecto, escrito en entorno RStatistics (https://cran.r-
project.org/index.html) se concatenan todos los pasos y se genera el flujo de
trabajo desde que obtenemos las secuencias hasta el informe final.
La asignación taxonómica fue realizada utilizando la base de datos

SILVA_release_132 (https://www.arb-silva.de) (Quast, 2013). Para las afiliaciones
taxonómicas se usó un clasificador bayesiano naive (https://github.com/qiime2/q2-
feature-classifier) integrado en QIIME 2. Cada OTU correlacionó por definición en
un 97% con la secuencia que se precie de la base de datos.
Los estudios ecológicos de diversidad y riqueza fueron realizados

mediante el plugin Community Ecology Package (https://cran.r-
project.org/web/packages/vegan/index.html).
4.4 EXPRESIÓN DE RESULTADOS.
Los resultados que obtenemos se expresan en su forma original como

abundancia relativa en porcentajes de los diferentes phylum, clase, orden, familia
y género. Para comparar la estructura de la microbiota intestinal de los grupos de
estudios utilizamos conceptos provenientes de la ecología microbiana como la
diversidad y la riqueza.
4.4.1 Estructura de las comunidades microbianas.
Los ecosistemas microbianos suelen tener pocas especies con muchos

individuos y muchas especies con pocos individuos. Las especies menos
abundantes determinan la diversidad específica del nivel trófico y en general de
171
todo el nicho ecológico. La diversidad disminuye cuando alguna población
alcanza una elevada densidad, puesto que significa que ha superado la
competencia y domina el ecosistema. Los nichos ecológicos complejos, con
riqueza de especies, es decir un número elevado de especies diferentes, requieren
una energía menor para mantenerse.
La diversidad de especies permite una gran variedad de respuestas ante

cambios dinámicos en el ecosistema. En comunidades microbianas dominadas
por factores biológicos, como la microbiota intestinal, la estabilidad se asocia a
una elevada diversidad, aunque no es posible definir una causa-efecto
establecida.
No existe una población única esencial en una microbiota intestinal, o en

general, en un ecosistema microbiano, con una elevada diversidad. Si se elimina
una sola población la estructura no se altera, pero se desconoce que diversidad es
la requerida para mantener la estabilidad de un nicho ecológico.
El hecho que los ecosistemas diversos pueden aguantar fluctuaciones y

agresiones de su entorno no significa que puedan superar todas ellas cuando son
continuadas (Atlas, 2002).
4.4.2 Estudio de la diversidad y riqueza de la microbiota intestinal.
La forma más simple de expresar la riqueza de una comunidad

microbioana o de una microbiota es el de número de OTUs diferentes, sin tener
en cuenta la abundancia de estas. Podemos recurrir a ciertos índices estadísticos,
que serán desarrollados más adelante, para evitar inexactitudes debido al
muestro, así como a la obtención de curvas de rarefacción.
Whittaker introdujo el concepto de diversidad y la dividió en varios

componentes para un mayor estudio. Los componentes mejor caracterizados son
la diversidad alfa y beta (Whittaker, 1972).
172
En el presente estudio, la alfa diversidad hace referencia al número de
OTUs diferentes en un grupo de pacientes, pero aunando dos variables: la riqueza
de OTUs y la abundancia relativa de ellas. También recurrimos a ciertos índices
estadísticos para evaluarla. Se trata de un concepto clave puesto que diversas
enfermedades se han correlacionado con disminuciones en la diversidad de la
microbiota intestinal, presumiblemente porque se produce un sobrecrecimiento
bacteriano de ciertos grupos, dando lugar a una disbacteriosis (Morgan, 2012a)
Para entender los resultados de los índices de alfa diversidad hay que
partir de dos premisas: A igualdad de OTUs, la alfa diversidad es máxima cuando
todas las OTUs están en igual proporción, y a igualdad de uniformidad, la alfa
diversidad es mayor cuando mayor sea el número de OTUs diferentes (Atlas,
2002).
4.4.2.1 Índices para cuantificar la alfa diversidad y riqueza.
4.4.2.1.1 Índice de Shannon.
El índice de Shannon es una herramienta muy utilizada para cuantificar la

alfa diversidad de una comunidad ecológica (microbiana), o en nuestro caso
microbiota intestinal (Hill, 1973). Pertenece al grupo de los índices estadísticos
basados en la estructura de las comunidades, es decir, en relación con la
abundancia relativa de sus respectivas OTUs. Dentro de estos, se trata de un
índice de equidad, ya que tiene en cuenta la abundancia de cada OTU y cuanto de
uniformemente se encuentran distribuidas. Asume, por definición, que todas las
OTUS posibles están representadas en las muestras. Por consiguiente, mide el
grado promedio de incertidumbre en predecir a que OTU pertenecería un
individuo seleccionado al azar de la muestra.
173
La fórmula matemática es la siguiente (Oksanen, 2017):
Pi es la abundancia relativa.
Toma valores entre 0, cuando solo hay una OTU y ln S, siendo S el total de
OTUs posible, cuando todas las OTUS están representadas por el mismo número
de individuos. En la práctica suele adoptar en comunidades biológicas un valor
máximo de 5.
Es importante recalcar que el índice de Shannon puede aumentar cuando

existe un aumento en la riqueza o bien, cuando se produce un aumento en la
equitatividad de la representación en la abundancia relativa de cada OTU.
De una forma pragmática se considera que una microbiota tiene una baja
diversidad cuando está por debajo de 1.5, siendo consideradas microbiotas
diversas las que tienen valores por encima de 3. Entre 1.5 y 3 se situarían las
microbiotas de diversidad media.
4.4.2.1.2 Índice de Simpson.
El índice de Simpson es otro índice estadístico para evaluar la alfa

diversidad basado en la estructura de las comunidades, pero de forma contraria al
índice de Shannon, es un índice de dominancia (Hill, 1973). Tiene más en cuenta
las OTUs predominantes y menos las minoritarias. Expresa la probabilidad de
que dos individuos seleccionados al azar de una población de N individuos
provengan de la misma OTU.
174
Donde Pi es la abundancia relativa de cada OTU.
También se puede expresar como índice de Simpson invertido (Oksanen,

2017):
Si el valor del índice de Simpson se acerca a 1 existirá una mayor

diversidad alfa, y si el valor se acerca a 0, habría una mayor dominancia por parte
de una OTU y una menor heterogeneidad de OTUs. De forma pragmática
podríamos considerar a una microbiota como poco diversa en base a este índice si
su valor está por debajo de 0.35.
4.4.2.1.3 Estimador CHAO1.
Se trata de un estimador de riqueza mediante un modelo no paramétrico,

basado en el número de OTUs raras (Chao, 1987). Estima el número de OTUs
esperadas considerando la relación entre el número de OTUs representadas por
un individuo (singlentons) y el número de OTUs representadas por 2 individuos
(doubletons). Mediante este estimador podremos deducir si el muestreo ha sido
adecuado, puesto que si el valor CHAO1 es mayor al total de observaciones, el
muestreo habrá sido insuficiente.
175
S es el número total de OTUs, F1 los singlentons y F2 los doubletons.
4.4.2.1.4 Estimador ACE (Abundance-based Coverage Estimator).
Es un estimador no paramétrico, al igual que CHAO1, pero estima la

riqueza en base a OTUs abundantes y raras, tomando un valor umbral para
separar ambos grupos (Chiu, 2014).
La fórmula es la siguiente (Oksanen, 2017):
En la anterior ecuación ai es el número de OTUs con abundancia i, y Srare es

el número de OTUs raras. Sabund es el número de OTUs abundantes y Nrare es el
número de individuos que hay con OTUs raras.
La interpretación es la misma que con el estimador CHAO1 y se acompaña

de un error estándar.
4.4.2.2 Representación gráfica de los índices de alfa diversidad y estudio de

diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.
La representación gráfica fue realizada mediante un diagrama de cajas

(boxplot). Para valorar si existían diferencias estadísticamente significativas a nivel
176
de cualquier rango taxonómico de los índices estadísticos medios de alfa
diversidad de los grupos de estudio, se utilizó el test no paramétrico de Wilcoxon
(Hollander, 2013). Se estimó como nivel de diferencia estadísticamente
significativa un valor de P<0.05. Estas pruebas estadísticas son las empleadas
comúnmente en la comparación de índices de alfa diversidad entre grupos en
estudios de microbiota intestinal (Xia, 2017).
4.4.2.3 Curvas de rarefacción.
Las curvas de rarefacción permiten realizar comparaciones de riqueza de

OTUs entre muestras al suponer que el tamaño de estas no es igual. Básicamente
calcula el número esperado de OTUs si todas las muestras fueran reducidas a un
tamaño estándar, puesto que se sabe que la riqueza va a aumentar con el tamaño
muestral y debemos descartar que las diferencias de riqueza obtenidas no se
deban a ello. Se muestra el número de OTUs estadísticamente esperado según se
incrementa el esfuerzo de muestreo (Gotelli, 2011).
El método de rarefacción estima el número medio de OTUs a través de

submuestras repetidas al azar de n individuos a partir de la muestra original más
grande. Permite construir una curva entera en la cual el número de individuos
submuestreados al azar se encuentran en un rango que va de 1 a N. Esta curva se
pretende llegue a ser asintótica para asegurar que se realizó un buen muestreo (en
nuestro caso se alcanzó una profundidad de secuenciación apropiada) de acuerdo
con el número de OTUs identificadas (Gotelli, 2011).
177
La fórmula matemática para calcular el número de OTUs esperada en una
microbiota rarificada desde N a n (N<n) individuos sería la siguiente (Oksanen,
2017):
Donde
En dicha fórmula xi es el total de OTUs i. El parámetro qi nos proporciona

la probabilidad de que la OTU i no aparezca en una muestra de tamaño n. Solo
será de valor positivo si N- xi ≥ n.
4.4.2.4 Índices para cuantificar la beta diversidad.
La diversidad beta se mide como la tasa de reemplazo de especies entre

hábitats. Aplicado al estudio de la microbiota puede definirse como las
diferencias existentes en cuanto a composición de dos muestras diferentes. Estas
diferencias en cuanto a diferencias en las proporciones de composición pueden
medirse de diferentes formas. Por un lado, tenemos los índices de beta diversidad
clásicos, y por otro lado tenemos los métodos basados en distancias entre las
diferentes muestras a partir de datos cualitativos o cuantitativos.
4.4.2.4.1 Índice de Similitud de Jaccard
Este índice expresa el grado en que dos muestras son semejantes por la
composición de sus OTUs de forma cualitativa.
La fórmula matemática es la siguiente: IJ = c/(a + b + c), donde a es el

número de OTUs de la muestra A, b es el número de OTUs de la muestra B y c es
el número de OTUs compartidas entre ambas muestras. Los valores van desde 0
cuando no hay ninguna OTU compartida hasta 1 cuando todas las OTUs están
por igual en ambas muestras.
178
Para cada uno de los grupos de estudio, se calculó el índice de Jaccard de
cada muestra con respecto al resto. Los datos obtenidos fueron representados
mediante un diagrama de cajas. A continuación, para observar si había
diferencias estadísticamente significativas a nivel de cualquier rango taxonómico
de los grupos de estudio se utilizó el tests no paramétrico de Wilcoxon
(Hollander, 2013). Se estimó como nivel de diferencia estadísticamente
significativa un valor de P<0.05.
4.4.3 Análisis Principal de Componentes (PCoA, Principal Component

Analysis).
El análisis principal de componentes (PCoA) es una técnica estadística

multivariante de reducción de dimensiones (número de variables). Pretende
sintetizar en un espacio de 2 dimensiones, cuya representación gráfica es el biplot,
la varianza en una nube de puntos multivariada, que serían las diferentes
muestras. Proporciona una visión general de la relación linear entre nuestras
muestras y las variables, en este caso abundancias relativas, en los diferentes
rangos taxonómicos. Por tanto, transforma un conjunto amplio de variables
correlacionadas en un conjunto reducido de nuevas variables, que explican mejor
la mayor parte de la variación existente en los datos. Por consiguiente, es una
buena herramienta para comenzar un análisis multivariante permitiéndonos
observar líneas de tendencias, variables clave y potenciales outliers (Buttigieg,
2014).
Usamos combinaciones lineales de las variables originales para construir y

obtener los PCs (Principal Component). Partiendo de la matriz (n x p) siendo n el
número de muestras y p el número de variables, rotamos el espacio teórico p-
dimesional para obtener una representación bidimensional que sacará a la luz la
mayor variabilidad posible. El primer PC es el eje que pasa por el centroide de la
nube de puntos y minimiza la distancia de cada punto a ese mismo eje, por tanto,
ese eje maximiza la variabilidad de la nube de puntos. El segundo PC se
construye de igual forma, pero ha de ser independiente al primer eje, por tanto,
ha de ser ortogonal y también pasar por el centroide. Con el segundo PC se
explica la mayor variabilidad no explicada por el primer PC. Si representamos la
179
ubicación de los objetos en un biplot con nuestros PC como ejes podemos deducir
si hay grupos de estudio similares o diferentes.
En el biplot, las muestras agrupadas estarán correlacionados, si están en

zonas opuestas tendrán correlación negativa y en ángulo recto no existiría
correlación.
También se proporciona la gráfica de autovalores (eigenvalues) ordenados

de mayor a menor. Esta gráfica nos permite saber el porcentaje de varianza
explicada por cada PC.
FIGURA 25: Ejemplo de biplot construido mediante PCoA de dos dimensiones que
permite visualizar 4 subgrupos.
Los gráficos se construyeron mediante el plugin para Qiime2 qiime2-qiime-

díversity-core-metrics-phylogenetic.
4.4.5 Análisis UniFrac.
El método UniFrac nos proporciona otro tipo de análisis de comparación

de comunidades microbianas o, como en el en el presente estudio, de la
microbiota intestinal de tres grupos de estudio. A diferencia del PCoA (basado en
la distancia euclídea), está basado en las diferencias filogenéticas de las muestras.
180
Por tanto, explora el grado de divergencia entre las diferentes secuencias que
hemos obtenido, al poder observar la distancia métrica entre muestras. Asimismo,
podemos comparar muchas muestras simultáneamente utilizando un análisis de
coordenadas principales, al igual que con el análisis PCoA, puesto que podemos
obtener una matriz de distancias. Se le considera una herramienta de mucha
potencia en estudios como el presente, al tener en cuenta precisamente las
diversidades filogenéticas (Lozupone, 2005). Puede usarse para agrupar muestras
usando herramientas estadísticas multivariantes.
Básicamente, el concepto UniFrac se refiere al porcentaje de longitud de

las ramas filogenéticas únicas para cada muestra. Cuando las comunidades sean
idénticas será de valor cero y cuando estén totalmente no relacionadas será de 1.
El método UniFrac balanceado o weighted, además tiene en cuenta las
abundancias relativas existentes en los rangos taxonómicos, por tanto, enfatiza los
grupos dominantes. Por otra parte, el método UniFrac desbalanceado o
unweighted, solo tiene en cuenta presencia o ausencia, enfatizando más en los
grupos menos comunes, de forma general.
Por tanto, mide la disimilitud entre dos colecciones de secuencias como la

cantidad de “carga genética” que es única para alguna de ellas, la cual es medida
como la fracción del brazo en el arbol filogenético que conduce a brazos
descendentes de una de las dos muestras, pero nunca de las dos.
Las distancias UniFrac fueron calculadas mediante el plugin para Qiime2

qiime2-qiime- diversity -tare-metrics-phylogenetic. Se utilizó el visualizador Emperor
(http://emperor.microbio.me) para obtener los gráficos en 2 dimensiones del
análisis principal de componentes, correspondiendo a cada eje la varianza
asignada (Vázquez-Baeza, 2013).
4.4.5 Estudio de la composición de la microbiota intestinal.
Para valorar las diferencias en la composición de la microbiota intestinal

de los 3 grupos de estudio analizaremos la media de las abundacias relativas a
181
nivel de phylum, familia y género y aplicaremos el test de Wilcoxon para valorar
diferencias estadísticamente significativas.
182
V-RESULTADOS
CAPÍTULO V – RESULTADOS___________________________________________
CAPITULO V. RESULTADOS.
5.1 LECTURAS POR MUESTRA.
Como hemos visto en el apartado 4.3.3 “Análisis bioinformático de las

secuencias de amplicones del gen bacteriano ADNr 16S y asignación taxonómica”, el
filtrado de las secuencias obtenidas en bruto supone un paso importante, a fin de
obtener una correcta y exacta asignación taxonómica y unas exactas abundancias
relativas de las respectivas OTUs. A modo ilustrativo vamos a exponer las
lecturas por muestra o read counts de cada grupo del estudio.
TABLA: READ COUNTS POR MUESTRA. GRUPO CDI

MUESTRA INPUT FILTERED DENOISED MERGED NON-CHIMERIC
CDI01 41945 36695 36695 35503 33176
CDI02 25438 23381 23381 22929 20484
CDI03 125778 113985 113985 113554 110768
CDI04 19329 17748 17748 17411 16455
CDI05 25524 23576 23576 23324 22325
CDI06 22997 20911 20911 19962 19389
CDI08 31245 28858 28858 28534 27039
CDI09 30847 27949 27949 27418 25916
CDI10 45737 41755 41755 41468 40667
CDI11 49742 43515 43515 42895 41964
CDI12 46573 42291 42291 41255 37228
CDI13 142762 87356 87356 86195 74624
CDI14 113644 70466 70466 69151 65435
CDI15 117108 57851 57851 57476 47417
CDI16 104209 60547 60547 59636 55760
TABLA 2: Read Counts por muestra en el grupo de pacientes con CDI.
186
TABLA: READ COUNTS POR MUESTRA: GRUPO INDIVIDUOS

COLONIZADOS POR C. DIFFICILE
P01 37029 34135 34135 33865 32505
P02 83178 76182 76182 75557 52891
P03 43708 40511 40511 40098 37099
P04 88391 81344 81344 81055 80275
P05 34518 31954 31954 31786 29948
P06 44967 40240 40240 39829 36491
P07 88428 80022 80022 79348 74514
P08 64642 59449 59449 59208 57569
P09 46761 43051 43051 42314 41507
P10 50298 45453 45453 45082 39292
P11 27666 24808 24808 24493 24084
P12 141922 88489 88489 86499 79519
P13 127951 76475 76475 75348 62604
P14 166561 102394 102394 100075 92046
P15 97571 60294 60294 60075 57803
TABLA 3: Read Counts por muestra en el grupo de individuos colonizados por C. difficile.
187
TABLA: READ COUNTS POR MUESTRA: GRUPO CONTROLES SANOS

S01777 165583 117324 117324 114878 107965
S02777 168588 120979 120979 117722 110972
S03777 189816 129385 129385 127325 120804
S04777 211680 149787 149787 145850 139792
S05777 199256 132380 132380 130059 124964
S07777 201086 135097 135097 132791 124018
S08777 193914 129333 129333 127138 121191
S09777 208095 145726 145726 141979 136395
S10777 194064 138041 138041 136063 129130
S12777 242950 171691 171691 170226 166563
S13777 191001 130625 130625 128179 120761
S14777 221951 158758 158758 156406 152208
S15777 199387 126888 126888 123269 118903
S16777 169512 115969 115969 114322 110944
TABLA 4: Read Counts por muestra en el grupo de controles sanos.
En las anteriores tablas se representa como en cada proceso de filtrado de

las secuencias obtenidas se va depurando el número de secuencias totales por
cada muestra:
 Input: Es el total de lecturas obtenidas durante la secuenciación.
 Filtered, Denoised: Son procesos de eliminación de secuencias cortas
o de mala calidad.
 Merged: Son las lecturas obtenidas tras la fusión de R1 y R2.
 Non-Chimeric: Son las lecturas obtenidas finalmente tras eliminar
las secuencias quiméricas.
188
5.2 ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD Y RIQUEZA DE LA MICROBIOTA
INTESTINAL DE LOS GRUPOS DE ESTUDIO.
5.2.1 Índices de alfa diversidad de Shannon y Simpson.
Los índices medios de Shannon y Simpson en el rango taxonómico de

género para cada grupo de estudio, y la comparación entre ellos para ver si
existen diferencias estadísticamente significativas, quedan recogidas en la
siguiente tabla:
GRUPO GRUPO ÍNDICE DE MEDIA MEDIA TEST DE

DE DE ALFA GRUPO GRUPO WILCOXON
ESTUDIO ESTUDIO DIVERSIDAD DE DE (P-VALUES)
1 2 ESTUDIO ESTUDIO
1 2
CDI CTRL Shannon 2.0 2.8 0.0002
CDI CTRL Simpson 0.7 0.9 0.0006
CDI P Shannon 2.0 1.9 0.3724
CDI P Simpson 0.7 0.7 0.3091
CTRL P Shannon 2.8 1.9 0.0003
CTRL P Simpson 0,9 0.7 0.0003
TABLA 5: Comparación de los Índices de Shannon y Simpson en el rango taxonómico de
género.
En negrita aparecen los valores de P<0.05 al aplicar el test de Wilcoxon.

Entre los grupos CDI y P no existen diferencias estadísticamente significativas en
los índices de Shannon y Simpson. Estos adoptan unos valores que nos indica una
diversidad que podríamos calificar de media-baja.
Al comparar los grupos CDI y P frente al de CTRL observamos diferencias

estadísticamente significativas en ambos índices, con valores mayores para el
grupo de controles sanos. Pragmáticamente podemos considerar que el grupo
CTRL presenta unos índices de Shannon y Simpson que nos indica una alfa
diversidad normal, y los grupos CDI y P presentan una disminución de la alfa
189
diversidad, pero sin diferencias estadísticamente significativas entre estos dos
últimos grupos.
En los siguientes diagramas de cajas se representan las diferencias en los

índices de Shannon y Simpson, calculados para el rango taxonómico de género,
entre los grupos CDI, P y CTRL.
FIGURA 26: Diagrama de cajas del índice de Simpson a nivel del rango taxonómico de
género de los 3 grupos de estudio.
190
FIGURA 27: Diagrama de cajas del índice de Shannon a nivel del rango taxonómico de
5.2.2 Estimadores de riqueza.
Las medias de los estimadores de riqueza CHAO1 y ACE en el rango

taxonómico de género para cada grupo de estudio, y la comparación entre ellos,
quedan recogidas en la siguiente tabla:
191
MEDIA MEDIA
GRUPO GRUPO
GRUPO GRUPO TEST DE
DE DE ESTIMADOR
DE DE WILCOXON
ESTUDIO ESTUDIO DE RIQUEZA
ESTUDIO ESTUDIO (P-VALUES)
1 2
1 2
CDI CTRL CHAO1 47.2 113.1 <0.0001

CDI CTRL ACE 47.2 113.1 <0.0001
CDI P CHAO1 47.2 51.6 0.9339
CDI P ACE 47.2 51.6 0.9339
CTRL P CHAO1 113.1 51.6 0.0004
CTRL P ACE 113.1 51.6 0.0004
TABLA 6: Comparación de los estimadores de riqueza CHAO1 y ACE en el rango

ambos estimadores de riqueza.
Al comparar los grupos CDI y P frente al grupo CTRL observamos

diferencias estadísticamente significativas puesto que el grupo de controles sanos
presenta valores mayores. Por tanto, podemos estimar que la riqueza de los
grupos CDI y P está muy disminuida con respecto al grupo de controles sanos.
En los siguientes diagramas de cajas se representan los datos de la tabla 6.
192
FIGURA 28: Diagrama de cajas del estimador CHAO1 a nivel del rango taxonómico de
193
FIGURA 29: Diagrama de cajas del estimador ACE a nivel del rango taxonómico de
Por tanto, en base a los índices de alfa diversidad estudiados y a los

estimadores de riqueza podemos establecer que existe una perdida de diversidad
y riqueza en los grupos CDI y P con respecto al de CTRL, pero no encontramos
diferencias estadísticamente significativas entre los grupos CDI y P.
5.2.3 Curvas de rarefacción.
A continuación, se muestran las curvas de rarefacción de los grupos de

estudio por separado y por último se muestra otra donde están los 3 grupos
194
juntos. Todas las curvas de rarefacción son a nivel de rango taxonómico de
género.
FIGURA 30: Curva de rarefacción a nivel de género del grupo de controles sanos.
195
FIGURA 31: Curva de rarefacción a nivel de género del grupo CDI.
196
FIGURA 32: Curva de rarefacción a nivel de género del grupo P.
197
FIGURA 33: Curva de rarefacción a nivel de género con todos los grupos de estudio.
De las curvas de rarefacción podemos confirmar que el grupo de controles

sanos presenta una riqueza superior a los grupos CDI y P, puesto que presentan
sus muestras un mayor número de géneros cuando se alcanza la fase asintótica.
Además, podemos concluir que el muestreo ha sido adecuado, es decir, la
secuenciación tiene suficiente profundidad puesto que hemos obtenido un
número de OTUs representativo del rango taxonómico género, al haber alcanzado
todas las curvas de rarefacción la fase asintótica.
198
5.2.4 Índice de beta diversidad de Jaccard.
La media del índice de beta diversidad de Jaccard para el rango

taxonómico de género para cada grupo de estudio, y la comparación entre ellos
para ver si existen diferencias estadísticamente significativas, quedan recogidas
en la siguiente tabla:
MEDIA MEDIA TEST DE WILCOXON

GRUPO 1 GRUPO 2
GRUPO 1 GRUPO 2 (P-VALUES)
CDI CTRL 0,17 0,31 <0,0001
CDI P 0,17 0,18 0,1205
CTRL P 0,31 0,18 <0,0001
TABLA 7: Comparación del índice de beta diversidad de Jaccard en el rango taxonómico
de género.

cuanto a su valor medio del índice de Jaccard.
Al comparar los grupos CDI y P frente al de CTRL observamos diferencias

estadísticamente significativas puesto que el grupo de controles sanos presenta
valores mayores. Por tanto, podemos estimar que la beta diversidad de los grupos
CDI y P está disminuida con respecto al grupo de controles sanos. No obstante,
podemos considerar todos los valores como bajos, por tanto, la variabilidad
intraindividual es bastante elevada, sobre todo en los grupos CDI y P.
En el siguiente diagrama de cajas se observan las diferencias en cuanto al

valor medio del índice de Jaccard, calculados para el taxa Género, entre los grupos
CDI y P, frente al CTRL.
199
FIGURA 34: Diagrama de cajas del índice de beta diversidad de Jaccard nivel del rango
Es destacable que la mediana del índice de Jaccard para el grupo control es

mayor que su media (entorno a 0.45 a diferencia de la media 0.31), aspecto que no
ocurre con respecto a los grupos CDI y P.
5.3 ANÁLISIS PRINCIPAL DE COMPONENTES.
El PCoA fue obtenido de acuerdo con lo expuesto en el apartado 4.4.4

“Análisis Principal de Componentes (PCoA, Principal Coordinate Analysis)” del
capítulo de Material y Métodos.
200
El biplot obtenido para el rango taxonómico de género fue el siguiente:
FIGURA 35: PCoA a nivel de género.
A continuación, exponemos la figura con todos los porcentajes de las

varianzas explicadas por todos los componentes principales, aunque solo usamos
los de mayor porcentaje que son el componente 1 y después el 2.
201
FIGURA 36: Porcentaje de las varianzas explicadas con cada uno de los componentes
principales obtenidos.
Por consiguiente, partimos de un PCoA con 2 componentes principales

que nos van a explicar una escasa variabilidad del 8.6% y 5.6%. Debido a esta
razón este modelo no sería exitoso. No obstante, sabiendo esto podemos observar
que las muestras del grupo CTRL quedan alejadas de las muestras de los grupos
P y CDI. Muchas muestras de los grupos P y CDI quedan solapadas en una
202
misma región, por tanto, presentan similitudes. Las muestras del grupo CTRL
quedaron más dispersas, incluso muestras como la S09777 y S05777 quedaron
alejadas de la región donde se agrupan. Las muestras del grupo CDI han sido las
que más agrupadas se observan, solapándose como hemos dicho con muchas del
grupo P.
5.4 ANÁLISIS UNIFRAC.
El análisis UniFrac fue realizado de acuerdo con lo expuesto en el

apartado 4.4.5 “Análisis UniFrac” del capítulo de Material y Métodos.
5.4.1 UniFrac Weig hted.
El análisis Unifrac Weighted de todos los grupos de estudio queda reflejado

en la siguiente figura:
203
FIGURA 37: Análisis UniFrac Weighted para los 3 grupos de estudio. Esferas CDI, Cono
CTRL y Cilindro P.
La variabilidad explicada en el eje 1 es del 42.6% y del eje 2 del 14.95%. Se

puede observar que las muestras de los controles sanos quedan en una región
diferente a las del resto que quedan algo dispersas pero agrupadas.
Aparte de una muestra outlayer del grupo CDI (muestra CDI15), podemos
observar dos agrupaciones con muestras de los grupos CDI y P agrupadas.
En las siguientes figuras observamos las diferencias entre los grupos CDI y
P con respecto al grupo CTRL:
204
FIGURA 38: Análisis UniFrac Weighted para los grupos CDI y CTRL. Esferas CDI y Cono
CTRL.
FIGURA 39: Análisis UniFrac Weighted para los grupos P y CTRL. Cilindro CDI y Cono
CTRL.
Este modelo es bastante exitoso puesto que explica una variabilidad
notable en sus componentes principales del 42.60% y 14.95%.
205
5.5.1 UniFrac Unweighted.
El análisis Unifrac Unweighted de todos los grupos de estudio queda

reflejado en la siguiente figura:
FIGURA 40: Análisis UniFrac Unweighted para los 3 grupos de estudio. Esferas CDI, Cono
CTRL y Cilindro P.
La variabilidad explicada en el eje 1 es del 17.25% y del eje 2 del 9.245%,

menor que la obtenida mediante el análisis Unifrac Weighted. También se puede
observar que las muestras del grupo control quedan en una región diferente a las
de los grupos CDI y P que quedan algo dispersas pero agrupadas.
5.5 ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN DE LA MICROBIOTA INTESTINAL.
206
5.5.1 Diferencias a nivel de phylum.
5.5.1.1 Diferencias a nivel de phylum entre los grupos CDI y CTRL.
En la siguiente figura se observan las diferencias de composición en

cuanto a abundancias relativas entre los grupos CDI y CTRL. Los grupos
minoritarios han quedado excluidos debido a que apenas son visualizables en la
figura.
FIGURA 41: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de phylum en los grupos CDI
y CTRL. Grupo CDI en azul y Grupo CTRL en amarillo.
La siguiente tabla recoge todas abundancias relativas de los phylum

existentes en los grupos CDI y CTRL y las diferencias estadísticamente
significativas mediante la aplicación del test de Wilcoxon:
207
MEDIA MEDIA TEST DE

PHYLUM GRUPO CTRL GRUPO CDI WILCOXON (P-
(%) (%) VALUES)
Firmicutes 66,8691 38,5533 0,0006
Bacteroidetes 19,5638 39,3656 0,0275
Verrucomicrobia 4,7534 5,9703 0,1605
Actinobacteria 4,6633 1,1694 0,0032
Proteobacteria 3,8165 14,3918 0,0154
Euryarchaeota 0,1141 0,0550 0,0260
Tenericutes 0,0680 0 0,0010
Patescibacteria 0,0618 0,0140 0,0002
Cyanobacteria 0,0533 0,0011 0,0252
Synergistetes 0,0271 0,2063 0,8314
Fusobacteria 0,0019 0,2291 0,4403
Epsilonbacteraeota 0,0000 0,0042 0,0906
TABLA 8: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de phylum entre los grupos
CDI y CTRL. En negrita se destacan las diferencias estadísticamente significativas
(P<0.05).
Por tanto, encontramos que de forma estadísticamente significativa existe

una reducción en los pacientes con CDI con respecto a controles sanos en los
phylum Firmicutes y Actinobacteria, y por otro lado, se produjo un aumento
estadísticamente significativo en los phylum Bacteroidetes y Proteobacteria.
Asimismo, es destacable el incremento no estadísticamente significativo de
Verrucomicrobia en los pacientes con CDI con respecto a los controles sanos.
5.5.1.2. Diferencias a nivel de phylum entre los grupos P y CTRL.

cuanto a abundancias relativas entre los grupos P y CTRL. Los grupos
minoritarios han quedado excluidos debido a que apenas son visualizables en la
figura.
208
FIGURA 42: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de phylum en los grupos P y
CTRL. Grupo P en rojo y Grupo CTRL en amarillo.

existentes en los grupos P y CTRL y las diferencias estadísticamente significativas
mediante la aplicación del test de Wilcoxon:
209
MEDIA MEDIA
TEST DE WILCOXON
PHYLUM GRUPO CTRL GRUPO P
(P-VALUES)
(%) (%)
Firmicutes 66,8691 39,1305 0,0016
Bacteroidetes 19,5638 36,0149 0,0521
Proteobacteria 3,8165 20,5514 0,0636
Euryarchaeota 0,1141 0,0369 0,0335
Tenericutes 0,0680 0,0038 0,0044
Cyanobacteria 0,0533 0,0011 0,1293
Synergistetes 0,0271 0 0,0142
Fusobacteria 0,0019 0,0430 0,8388
Epsilonbacteraeota 0 0,0019 0,3697
Lentisphaerae 0 0,0016 0,3697
P y CTRL. En negrita se destacan las diferencias estadísticamente significativas (P<0.05)
Por tanto, encontramos que de forma estadísticamente significativa

también observamos una reducción en los individuos colonizados por C. difficile
con respecto a controles sanos en el phylum Firmicutes e incrementos en
Bacteroidetes. También se observa un incremento en Proteobacteria no
significativo, aunque la P es 0.0636. Asimismo, es destacable la reducción no
estadísticamente significativa en los phylum Actinobacteria y Verrocomicrobia.
El patrón de las alteraciones encontradas a nivel de composición de

phylum en los grupos P y CDI con respecto a los controles es sano es bastante
similar. Las diferencias más notables que encontramos las podemos resumir en
los siguientes puntos:
 Disminución estadísticamente significativa de Verrucomicrobia en el
grupo P (1.2% frente a 4.7%) que no encontramos en el grupo CDI
(5.9% frente a 4.7%).
210
 Disminución estadísticamente significativa de Actinobacteria en el
grupo CDI (1.1% frente a 4.6%) que no encontramos en en el grupo P
(2.7% frente a 4.6%), aunque en P también existe una reducción en el
phylum Actinobacteria aunque menos acentuada.
 El aumento en Proteobacteria es mayor en el grupo P (20.5% frente a
3.8%) que en el grupo CDI (14.3% frente a 3.8%) con respecto a
controles sanos, si bien el aumento no es estadísticamente significativo
en el primer grupo con respecto a los controles sanos (P=0.0636).
5.5.1.3. Diferencias a nivel de phylum entre los grupos P y CDI.

cuanto a abundancias relativas entre los grupos CDI y P. Los grupos minoritarios
han quedado excluidos debido a que apenas son visualizables en la figura.
211
FIGURA 43: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de phylum en los grupos P y
CDI. Grupo P en rojo y Grupo CDI en azul.

existentes en los grupos CDI y P y las diferencias estadísticamente significativas
mediante la aplicación del test de Wilcoxon:
212
MEDIA MEDIA TEST DE

PHYLUM GRUPO CDI GRUPO P WILCOXON
(%) (%) (P-VALUES)
Bacteroidetes 39,3656 36,0149 0,6783
Firmicutes 38,5533 39,1305 1
Proteobacteria 14,3918 20,5514 0,8357
Fusobacteria 0,2291 0,0430 0,3114
Synergistetes 0,2063 0 0,0384
Acetothermia 0,0652 0 0,3506
Euryarchaeota 0,0255 0,0369 1
Epsilonbacteraeota 0,0042 0,0019 0,3258
Cyanobacteria 0,0011 0,0011 0,3616
Lentisphaerae 0 0,0016 0,3506
Tenericutes 0 0,0038 0,3506
P y CDI. En negrita se destacan las diferencias estadísticamente significativas (P<0.05).
Al comparar las abundancias relativas de los phylum de los grupos CDI y

P corroboramos lo encontrado en los puntos 5.5.1.1 y 5.5.1.2 A nivel de phylum la
microbiota intestinal de ambos grupos es muy similar, destacando principalmente
como diferencias la reducción de Verrucomicrobia en en el grupo P con respecto
al grupo CDI, aunque de forma no estadísticamente significativa y la
conservación en el grupo P de una mayor cantidad de Actinobacteria con respecto
a la pérdida que se observa en el grupo CDI con respecto a los controles sanos.
213
5.5.2. Diferencias a nivel de familia.
5.5.2.1. Diferencias a nivel de familia entre los grupos CDI y CTRL.

cuanto a abundancias relativas a nivel de familia entre los grupos CDI y CTRL.
Hemos eliminado de la figura los grupos minoritarios. Las familias mayoritarias
suman en total entorno al 93% y 97% de las OTUS en los grupos CDI y CTRL
respectivamente.
FIGURA 44: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de familia en los grupos CDI
y CTRL mayoritarias. Grupo CDI en azul y Grupo CTRL en amarillo.
214
La siguiente tabla recoge todas las diferencias en cuanto a estas
abundancias relativas a nivel de familia entre los grupos CDI y CTRL y sus
diferencias estadísticamente significativas aplicando el test de Wilcoxon:
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
PHYLUM FAMILIA WILCOXON
CDI CTRL
(P-VALUES)
(%) (%)
Firmicutes Ruminococcaceae 9,3575 31,4165 0
Firmicutes Lachnospiraceae 11,7971 18,7516 0,0771
Bacteroidetes Bacteroidaceae 26,847 11,0028 0,0307
Firmicutes Veillonellaceae 3,4787 10,2983 0,2216
Verrucomicrobia Akkermansiaceae 5,9703 4,7534 0,1605
Actinobacteria Bifidobacteriaceae 0,6280 3,7001 0,0076
Proteobacteria Enterobacteriaceae 10,6111 3,0008 0,0521
Bacteroidetes Rikenellaceae 2,9586 2,6011 0,1396
Bacteroidetes Prevotellaceae 1,9641 2,5391 0,2280
Firmicutes Acidaminococcaceae 3,4776 2,2511 0,9463
Firmicutes Erysipelotrichaceae 4,3136 1,7810 0,3710
Bacteroidetes Muribaculaceae 0,8198 1,5379 0,5039
Bacteroidetes Tannerellaceae 4,7580 1,1344 0,4982
Firmicutes Christensenellaceae 0,5444 1,0361 0,0076
Firmicutes Streptococcaceae 2,3442 0,7527 0,0701
Actinobacteria Coriobacteriaceae 0,2973 0,7479 0,0067
Bacteroidetes Barnesiellaceae 0,7821 0,3979 0,0992
Firmicutes Clostridiales Family XIII 0,6161 0,3389 0,0171
Proteobacteria Desulfovibrionaceae 0,2491 0,3337 0,1184
Proteobacteria Burkholderiaceae 3,1479 0,2873 0,6777
Bacteroidetes Marinifilaceae 1,0632 0,2665 0,4355
Actinobacteria Eggerthellaceae 0,1893 0,0848 0,3017
Firmicutes Peptostreptococcaceae 0,5298 0,0600 0,0134
Patescibacteria Saccharimonadaceae 0,0090 0,0554 0,0001
Proteobacteria Pasteurellaceae 0,1624 0,0512 0,8731
Firmicutes Peptococcaceae 0 0,0427 0,0010
Actinobacteria Actinomycetaceae 0,0286 0,0396 0,0298
Actinobacteria Atopobiaceae 0,0185 0,0372 0,0295
Actinobacteria Coriobacteriales Incertae Sedis 0,0030 0,0355 0,0167
Synergistetes Synergistaceae 0,2063 0,0271 0,8314
215
Firmicutes Bacillales Family XI 0,0034 0,0188 0,0006
Firmicutes Clostridiaceae 1 0,2619 0,0152 0,9438
Firmicutes Defluviitaleaceae 0,0012 0,0137 0,0044
Firmicutes Carnobacteriaceae 0,0269 0,0116 0,6495
Firmicutes Lactobacillaceae 1,0287 0,0111 0,3307
Tenericutes Firmicutes bacterium CAG:822 0 0,0110 0,3340
Bacteroidetes Flavobacteriaceae 0,0360 0,0107 0,1747
Firmicutes Leuconostocaceae 0,0005 0,0105 0,0186
Firmicutes Clostridiales vadinBB60 Group 0,0278 0,0104 0,9152
Firmicutes Eubacteriaceae 0,0031 0,0056 0,3905
Bacteroidetes Porphyromonadaceae 0,0478 0,0028 0,1742
Firmicutes Fusobacteriaceae 0,2291 0,0017 0,2800
Firmicutes Aerococcaceae 0,0064 0,0011 0,9710
Firmicutes Clostridiales Family XI 0,0447 0,0010 0,5987
Proteobacteria Neisseriaceae 0,0003 0,0009 0,5359
Cyanobacteria Family Clostridium sp. CAG:306 0 0,0006 0,3340
Firmicutes Staphylococcaceae 0,0020 0,0005 1
Proteobacteria Cardiobacteriaceae 0 0,0005 0,3340
Tenericutes Anaeroplasmataceae 0 0,0005 0,3340
Actinobacteria Corynebacteriaceae 0 0,0004 0,3340
Actinobacteria Micrococcaceae 0,0046 0,0004 0,5634
Tenericutes Mycoplasmataceae 0 0,0003 0,1498
Firmicutes Leptotrichiaceae 0 0,0002 0,3340
Acetothermia uncultured bacterium 'KTK 32' 0,0454 0 0,3697
Epsilonbacteriota Campylobacteraceae 0,0042 0 0,0906
Firmicutes Enterococcaceae 0,6853 0 0,0009
Proteobacteria Rhizobiaceae 0,0006 0 0,3697
Proteobacteria Xanthobacteraceae 0,0012 0 0,3697
Proteobacteria Desulfohalobiaceae 0,2192 0 0,3697
TABLA 11: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de familia entre los grupos
CDI y CTRL. En negrita se destacan las diferencias estadísticamente significativas
(P<0.05).
Observamos que de forma estadísticamente significativa existe una

reducción en los pacientes con CDI con respecto a controles sanos de las familias
Ruminococcaceae, Christensenellaceae y Bifidobacteriaceae. De forma no
estadísticamente significativa destacan las reducciones en ciertas familias como
Lachnospiraceae, Veillonellaceae, Prevotellaceae y ya como familia muy
216
minoritaria Eubacteriaceae. Por el contrario, de forma estadísticamente
significativa encontramos incrementos en los pacientes con CDI con respecto a los
controles sanos en las familias Bacteroidaceae, Peptostreptococcaceae (la familia a
la cual pertenece C. difficile) y Enterococcaceae. De forma no estadísticamente
significativa destacan los aumentos en ciertas familias como Enterobacteriaceae
(P=0.0521), Akkermansiaceae, Streptococcaceae y Burkholderiaceae y de familias
minoritarias como Lactobacillaceae.
5.5.2.2. Diferencias a nivel de familia entre los grupos P y CTRL.
En las siguientes figuras se observan las diferencias de composición en

cuanto a abundancias relativas de los grupos P y CTRL. No se incluye en la figura
los grupos muy minoritarios e irrelevantes. Las familias mayoritarias suman en
total en torno al 95% y 90% de las OTUS en los grupos P y CTRL respectivamente.
217
FIGURA 45: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de familia en los grupos P y
CTRL mayoritarias. Grupo P en rojo y Grupo CTRL en amarillo.

abundancias relativas a nivel de familia entre los grupos P y CTRL:
MEDIA MEDIA TEST DE

PHYLUM FAMILIA GRUPO GRUPO WILCOXON
CTRL P (P-VALUES)
218
(%) (%)
Firmicutes Ruminococcaceae 31,4165 6,3853 0

Bacteroidetes Muribaculaceae 1,5379 0 0,0318
Firmicutes Peptococcaceae 0,0427 0,0046 0,0167
Synergistetes Synergistaceae 0,0271 0 0,0142
Actinobacteria Coriobacteriales Incertae Sedis 0.0355 0.0062 0.0220
219
Bacteroidetes Flavobacteriaceae 0,0107 0 0,0061
Bacteroidetes Porphyromonadaceae 0,0028 0,0114 0,1742
Fusobacteria Fusobacteriaceae 0,0017 0,0430 0,9263
Proteobacteria Neisseriaceae 0,0009 0 0,1498
Firmicutes Staphylococcaceae 0,0005 0,0278 0,3258
Proteobacteria Cardiobacteriaceae 0,0005 0 0,3340
Tenericutes Anaeroplasmataceae 0,0005 0 0,3340
Actinobacteria Corynebacteriaceae 0,0004 0,0003 0,9604
Tenericutes Mycoplasmataceae 0,0003 0 0,1498
Fusobacteria Leptotrichiaceae 0,0002 0 0,3340
Firmicutes Enterococcaceae 0 0,4993 0,0021
Actinobacteria Propionibacteriaceae 0 0,0037 0,3697
Bacteroidetes Dysgonomonadaceae 0 0,0005 0,3697
Epsilonbacteraeota Campylobacteraceae 0 0,0019 0,3697
Firmicutes Bacillales Family XII 0 0,0002 0,3697
Firmicutes Syntrophomonadaceae 0 0,0002 0,3697
Lentisphaerae Victivallaceae 0 0,0016 0,3697
Proteobacteria Holosporaceae 0 0,0002 0,3697
Proteobacteria Paracaedibacteraceae 0 0,0002 0,3697
Proteobacteria Xanthobacteraceae 0 0,0002 0,3697
Proteobacteria Pseudomonadaceae 0 0,0015 0,3697
Verrucomicrobia Puniceicoccaceae 0 0,0008 0,3697
P y CTRL. En negrita se destacan las diferencias estadísticamente significativas (P<0.05).
Observamos que de forma estadísticamente significativa existe una

reducción en los individuos colonizados por C. difficile con respecto a los controles
sanos de las familias Rumminococcaceae, Akkermansiaceae, Prevotellaceae,
Acidominococcaceae, Erysipelotrichaceae, Muribaculaceae, Christensenellaceae, y
220
Barnesiellaceae. De forma no estadísticamente significativa destacan las
reducciones en ciertas familias como Lachnospiraceae y Bifidobacteriaceae. Por el
contrario, de forma estadísticamente significativa observamos aumentos en los
individuos colonizados por C. difficile con respecto a los controles sanos en las
familias Bacteroidaceae, Peptostreptococcaceae (la familia a la cual pertenece C.
difficile) y Enterococcaceae. De forma no estadísticamente significativa destacan
los incrementos en ciertas familias como Veillonellaceae, Enterobacteriaceae,
Rikenellaceae, Tannerellaceae y Streptococcaceae, y dentro de familias
minoritarias aparecen aumentos en familias como Burkholderiaceae,
Eubacteriaceae y Lactobacillaceae.
A nivel de familia podemos describir ciertas diferencias en cuanto a las

abundancias relativas de ciertos grupos de bacterias, que nos permitiría
caracterizar el patrón de disbacteriosis de ambos grupos con respecto a los
controles sanos. Entre las familias mayoritarias destacamos una serie de
diferencias entre los grupos P y CDI. Dentro de las familias del phylum Firmicutes
observamos:
 Si bien en ambos grupos se producen reducciones en las familias
Ruminococcaceae y Lachnospiraceae, en Ruminococcaceae es
ligeramente más pronunciada en el grupo P.
 Se produce una disminución de la familia Acidominococcaceae en el
grupo P y un aumento en el grupo CDI.
 Se produce un aumento de la familia Erysipelotrichaceae en el grupo
CDI mientras que en el grupo P la abundancia relativa es similar a la
de los controles sanos.
 En la familia Christensenellaceae se produce un descenso en ambos
grupos, pero es más pronunciado en el grupo P.
 En la familia Streptococcaceae se produce un aumento en ambos
 Se produce un aumento de la familia Veillonellaceae en el grupo P y
una disminución en el grupo CDI.
 Por ultimo, destacar que la familia Enterococcaceae no aparece en los
controles sanos, no obstante, en el grupo CDI y P sus abundancias
relativas son respectivamente 0.6% y 0.5%.
221
Con respecto a las familias del phylum Bacteroidetes destacamos:
 En la familia Prevotellaceae se produce un descenso en ambos grupos,
pero es más pronunciado en el grupo P.
 Se produce una desaparición total de la familia Muribaculaceae en el
grupo P y una reducción en el grupo CDI con respecto a los controles
sanos.
 En la familia Tamerellaceae se produce un aumento en ambos grupos,
pero es más pronunciado en el grupo CDI.
En el phylum Proteobacteria destacamos:
 En la familia Enterobacteriaceae se produce un aumento en ambos
 En la familia Burkholderiaceae se produce un aumento en ambos
grupos, pero es más pronunciado en el grupo CDI.
Por último, dentro de los phylum Verrucomicrobia y Actinobacteria
respectivamente destacamos:
 Se produce una disminución de la familia Akkermansiaceae en el
grupo P y un aumento en el grupo CDI.
 En la familia Bifidobacteriaceae se produce un descenso en ambos
grupos, pero es más pronunciado en el grupo CDI.
Por otro lado, dentro de las familias minoritarias, las diferencias entre los
grupos P y CDI son sutiles en muchos casos, pero destacamos las siguientes en
con respecto a los controles sanos:
 La familia Peptostreptococcaceae, a la cual pertenece C. difficile, no
aparece en los controles sanos, no obstante, en el grupo CDI y P sus
abundancias relativas son respectivamente 0.5298% y 0.4781%.
 Se produce una disminución de la familia Barnesiellaceae y
Marinifilaceae, ambas del phylum Bacteroidetes, en el grupo P y un
aumento en el grupo CDI
 En la familia Lactobacillaceae (Firmicutes) se produce un aumento en
ambos grupos, pero es más pronunciado en el grupo CDI (1.0287% y
0.2269%).
222
 Se produce un aumento de la familia Eubacteriacea (Firmicutes) en el
grupo P y una disminución en el grupo CDI (0.0127% y 0.0031%) frente
a los controles sanos (0.0056%).
5.5.2.3. Diferencias a nivel de familia entre los grupos P y CDI.

cuanto a abundancias relativas de las familias mayoritarias de los grupos P y CDI.
Las familias mayoritarias suman en total entorno al 90% y 93% de las OTUS en los
grupos P y CDI respectivamente.
223
La ctoba ci l l a cea e
Ma ri ni fi l a cea e
Prevotel l a cea e
Streptococca cea e
Ri kenel l a cea e
Burkhol deri a cea e
Aci da mi nococca cea e

FAMILIA
Vei l l onel l a cea e
Erys i pel otri cha cea e
Ta nnerel l a cea e
Akkerma ns i a cea e
Rumi nococca cea e
Enteroba cteri a cea e
La chnos pi ra cea e
Ba cteroi da cea e
0 5 10 15 20 25 30
ABUNDANCIAS RELATIVAS (%)
FIGURA 46: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de familia en los grupos P y
CDI mayoritarias. Grupo P en rojo y Grupo CDI en azul.

abundancias relativas a nivel de familia entre los grupos P y CDI:
224
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
PHYLUM FAMILIA WILCOXON
CDI P
(P-VALUES)
(%) (%)
Firmicutes Ruminococcaceae 9,3575 6,3853 0,1150
Bacteroidetes Muribaculaceae 0,8198 0 0,0797
Firmicutes Enterococcaceae 0,6853 0,4993 1
Fusobacteria Fusobacteriaceae 0,2291 0,0430 0,3114
Proteobacteria Desulfohalobiaceae 0,2192 0 0,3506
Synergistetes Synergistaceae 0,2063 0 0,0384
Bacteroidetes Porphyromonadaceae 0,0478 0,0114 1
Bacteroidetes Flavobacteriaceae 0,0360 0 0,1644
225
Epsilonbacteraeota Campylobacteraceae 0,0042 0,0019 0,3258
Actinobacteria Coriobacteriales Incertae Sedis 0,0030 0,0062 0,9720
Firmicutes Staphylococcaceae 0,0020 0,0278 0,3258
Proteobacteria Xanthobacteraceae 0,0012 0,0002 1
Proteobacteria Rhizobiaceae 0,0006 0 0,3506
Proteobacteria Neisseriaceae 0,0003 0 0,3506
Firmicutes Peptococcaceae 0 0,0046 0,1644
Actinobacteria Corynebacteriaceae 0 0,0003 0,3506
Actinobacteria Propionibacteriaceae 0 0,0037 0,3506
Bacteroidetes Dysgonomonadaceae 0 0,0005 0,3506
Firmicutes Bacillales Family XII 0 0,0002 0,3506
Lentisphaerae Victivallaceae 0 0,0016 0,3506
Proteobacteria Holosporaceae 0 0,0002 0,3506
Proteobacteria Paracaedibacteraceae 0 0,0002 0,3506
Proteobacteria Pseudomonadaceae 0 0,0015 0,3506
P y CDI. En negrita se destacan las diferencias estadísticamente significativas (P<0.05).
Al comparar los grupos CDI y P, a pesar de las diferencias expuestas en el

apartado 5.5.2.2 “Diferencias a nivel de Familia entre los grupos P y CTRL” con
respecto a los controles sanos, encontramos pocas familias en las que se
produzcan diferencias estadísticamente significativas. Asimismo, destacamos que
de forma estadísticamente significativa observamos disminuciones en el grupo P
con respecto al CDI de las familias Erysipelotrichaceae y Prevotellaceae.
226
5.5.3. Diferencias a nivel de género.
5.5.3.1. Diferencias a nivel de género entre los grupos CDI y CTRL.
Vamos a ir analizando dentro de cada phylum las diferencias que

observamos en los géneros de las distintas familias. En primer lugar, vamos a
observar las diferencias en cuanto a la composición a nivel del género en los
grupos CDI y CTRL dentro del phylum Firmicutes. En la siguiente tabla se recogen
las abundancias relativas y sus diferencias aplicando el test de Wilcoxon:
PHYLUM FIRMICUTES
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
FAMILIA GÉNERO WILCOXON
CDI CTRL
(P-VALUES)
(%) (%)
Acidaminococcaceae Phascolarctobacterium 2,7366 2,1897 0,6639
Acidaminococcaceae Acidaminococcus 0,7410 0,0614 0,1742
Aerococcaceae Abiotrophia 0,0064 0,0011 0,9710
Carnobacteriaceae Granulicatella 0,0269 0,0116 0,6495
Christensenellaceae Christensenellaceae R-7 Group 0,5330 0,9856 0,0043
Christensenellaceae Catabacter 0 0,0171 0,0025
Clostridiaceae 1 Clostridium Sensu Stricto 1 0,2590 0,0152 0,9812
Clostridiaceae 1 Clostridium Sensu Stricto 13 0,0029 0 0,3697
Defluviitaleaceae Defluviitaleaceae UCG-011 0,0012 0,0137 0,0044
Enterococcaceae Enterococcus 0,6853 0 0,0009
Erysipelotrichaceae Erysipelotrichaceae UCG-003 0,0018 0,7502 0
Erysipelotrichaceae Catenibacterium 0 0,3247 0,0318
Erysipelotrichaceae Holdemanella 0,0149 0,2120 0,9604
Erysipelotrichaceae Faecalitalea 0,0014 0,1819 0,0013
Erysipelotrichaceae Erysipelatoclostridium 2,9142 0,1754 0,0595
Erysipelotrichaceae Solobacterium 0,0108 0,0392 0,0006
Erysipelotrichaceae Holdemania 0,0134 0,0357 0,0079
Erysipelotrichaceae Clostridium innocuum Group 0,9964 0,0115 0,0001
Erysipelotrichaceae Merdibacter 0,0505 0,0114 0,0938
Erysipelotrichaceae Faecalicoccus 0 0,0080 0,1498
Erysipelotrichaceae Erysipelotrichaceae UCG-006 0 0,0040 0,3340
227
Erysipelotrichaceae Coprobacillus 0,0452 0,0031 0,8388
Erysipelotrichaceae Dielma 0,0028 0,0028 0,0449
Erysipelotrichaceae Erysipelotrichaceae UCG-004 0 0,0023 0,0694
Erysipelotrichaceae Turicibacter 0,0106 0,0017 0,7403
Erysipelotrichaceae Catenisphaera 0 0,0012 0,3340
Eubacteriaceae Anaerofustis 0,0020 0,0053 0,0901
Eubacteriaceae Eubacterium 0,0011 0,0003 0,5634
Bacillales Family XI Gemella 0,0034 0,0188 0,0006
Bacillales Family XI Parvimonas 0,0002 0,0005 0,3258
Bacillales Family XI Anaerococcus 0,0433 0,0002 1
Bacillales Family XI Peptoniphilus 0,0012 0,0002 0,9710
Bacillales Family XI Ezakiella 0 0,0001 0,3340
Clostridiales Family XIII Family XIII AD3011 Group 0,5922 0,2136 0,0112
Clostridiales Family XIII Family XIII UCG-001 0 0,0575 0
Clostridiales Family XIII Eubacterium brachy Group 0 0,0334 0,0004
Clostridiales Family XIII Eubacterium nodatum Group 0,0239 0,0196 0,0261
Clostridiales Family XIII Mogibacterium 0 0,0013 0,1498
Lachnospiraceae Agathobacter 0,0374 6,2873 0
Lachnospiraceae Roseburia 0,1196 2,7259 0
Lachnospiraceae Lachnospiraceae NK4A136 Group 0,1112 1,4926 0,0001
Lachnospiraceae Ruminococcus torques Group 1,1256 0,9151 0,4958
Lachnospiraceae Coprococcus 3 0,0024 0,7409 0
Lachnospiraceae Ruminococcus gnavus Group 3,2177 0,7389 0,0954
Lachnospiraceae Dorea 0,0377 0,7318 0
Lachnospiraceae Eubacterium ventriosum Group 0 0,7224 0
Lachnospiraceae Blautia 0,5904 0,6994 0,1831
Lachnospiraceae Lachnoclostridium 3,2330 0,3400 0,0195
Lachnospiraceae Eubacterium eligens Group 0,0063 0,3189 0,0260
Lachnospiraceae Coprococcus 2 0 0,2555 0,0142
Lachnospiraceae Tyzzerella 3 0 0,2178 0,0142
Lachnospiraceae Anaerostipes 0,0109 0,1775 0,0093
Lachnospiraceae Eubacterium xylanophilum Group 0 0,1578 0,0001
Lachnospiraceae Fusicatenibacter 0 0,1452 0
Lachnospiraceae CAG-56 0 0,1232 0
Lachnospiraceae Tyzzerella 4 0,8277 0,0977 0,0746
Lachnospiraceae Lachnospiraceae UCG-010 0,0961 0,0932 0,0028
Lachnospiraceae Sellimonas 0,1300 0,0650 0,6169
228
Lachnospiraceae Lachnospira 0 0,0578 0,0025
Lachnospiraceae Howardella 0 0,0576 0,0142
Lachnospiraceae Eubacterium ruminantium Group 0 0,0420 0,1498
Lachnospiraceae Lachnospiraceae UCG-001 0 0,0408 0,0142
Lachnospiraceae Shuttleworthia 0,0033 0,0348 0,2542
Lachnospiraceae GCA-900066575 0 0,0298 0,0001
Lachnospiraceae Lachnospiraceae FCS020 Group 0,0062 0,0203 0,0043
Lachnospiraceae UC5-1-2E3 0 0,0179 0,0025
Lachnospiraceae Eisenbergiella 0,1793 0,0168 0,4838
Lachnospiraceae Ruminococcus gauvreauii Group 0,0324 0,0138 0,0043
Lachnospiraceae Coprococcus 1 0 0,0135 0,0025
Lachnospiraceae Moryella 0,0010 0,0131 0,0217
Lachnospiraceae Lachnospiraceae ND3007 Group 0 0,0095 0,0142
Lachnospiraceae Marvinbryantia 0 0,0083 0,0061
Lachnospiraceae Eubacterium fissicatena Group 0,0082 0,0053 0,5155
Lachnospiraceae Eubacterium hallii Group 0,0011 0,0040 0,0790
Lachnospiraceae Tyzzerella 0,0053 0,0035 0,8899
Lachnospiraceae Lachnospiraceae UCG-008 0 0,0034 0,0694
Lachnospiraceae GCA-900066755 0,0022 0,0031 0,0901
Lachnospiraceae Oribacterium 0,0005 0,0031 0,5359
Lachnospiraceae Hungatella 0,5656 0,0028 0,0126
Lachnospiraceae Lachnospiraceae NK4B4 Group 0 0,0023 0,3340
Lachnospiraceae Butyrivibrio 0,0217 0,0021 0,5916
Lachnospiraceae Acetitomaculum 0 0,0019 0,3340
Lachnospiraceae Lactonifactor 0,0024 0,0014 1
Lachnospiraceae Johnsonella 0,0012 0,0010 0,5916
Lachnospiraceae Lachnoanaerobaculum 0 0,0006 0,3340
Lachnospiraceae Eubacterium oxidoreducens Group 0 0,0001 0,3340
Lachnospiraceae Anaerosporobacter 0,0024 0 0,3697
Lachnospiraceae Cellulosilyticum 0,0044 0 0,3697
Lachnospiraceae Epulopiscium 0,5071 0 0,3697
Lachnospiraceae Lachnoclostridium 5 0,0447 0 0,3697
Lachnospiraceae Lachnospiraceae NC2004 Group 0,0007 0 0,3697
Lachnospiraceae Robinsoniella 0,0207 0 0,1800
Lactobacillaceae Lactobacillus 1,0017 0,0111 0,3307
Lactobacillaceae Pediococcus 0,0270 0 0,3697
229
Leptotrichiaceae Sneathia 0 0,0002 0,3340
Leuconostocaceae Leuconostoc 0,0005 0,0057 0,0522
Leuconostocaceae Weissella 0 0,0049 0,1498
Peptococcaceae Peptococcus 0 0,0093 0,0694
Peptostreptococcaceae Romboutsia 0,1560 0,0592 0,0298
Peptostreptococcaceae Intestinibacter 0 0,0004 0,3340
Peptostreptococcaceae Peptostreptococcus 0,0047 0,0003 0,2913
Peptostreptococcaceae Clostridioides 0,3668 0 0
Peptostreptococcaceae Paeniclostridium 0,0017 0 0,1800
Peptostreptococcaceae Terrisporobacter 0,0006 0 0,3697
Ruminococcaceae Faecalibacterium 3,2948 11,2857 0,0013
Ruminococcaceae Ruminococcus 2 0,1022 4,5458 0,0009
Ruminococcaceae Subdoligranulum 0,3407 4,0918 0,0001
Ruminococcaceae Ruminococcaceae UCG-002 1,1564 1,8603 0,0043
Ruminococcaceae Eubacterium coprostanoligenes Group 0,0939 1,3705 0,0001
Ruminococcaceae Ruminococcaceae UCG-013 0,0017 0,9993 0
Ruminococcaceae Butyricicoccus 0,4306 0,7215 0,0219
Ruminococcaceae Ruminococcaceae NK4A214 Group 0,0462 0,4698 0,0001
Ruminococcaceae Negativibacillus 0,0228 0,3450 0,0002
Ruminococcaceae Ruminiclostridium 5 0,4855 0,3234 0,7767
Ruminococcaceae Oscillibacter 0,0999 0,1614 0,2067
Ruminococcaceae Fournierella 0,0065 0,1326 0,0911
Ruminococcaceae Flavonifractor 0,4630 0,1061 0,9824
Ruminococcaceae CAG-352 0,0072 0,0804 0,2298
Ruminococcaceae UBA1819 0,8726 0,0769 0,3469
Ruminococcaceae GCA-900066225 0,0427 0,0352 0,0418
Ruminococcaceae Anaerotruncus 0,0501 0,0234 0,2318
Ruminococcaceae Oscillospira 0,0048 0,0195 0,2913
Ruminococcaceae Intestinimonas 0,0816 0,0174 0,9800
230
Ruminococcaceae DTU089 0,4988 0,0166 0,0193
Ruminococcaceae Ruminiclostridium 1 0 0,0077 0,0318
Ruminococcaceae Harryflintia 0,0122 0,0075 0,1742
Ruminococcaceae Caproiciproducens 0,0004 0,0074 0,0690
Ruminococcaceae Ruminococcaceae UCG-009 0 0,0069 0,0318
Ruminococcaceae Anaerofilum 0,0011 0,0066 0,0790
Ruminococcaceae Ruminiclostridium 0,0041 0,0046 0,3516
Ruminococcaceae Papillibacter 0,0010 0,0045 0,0186
Ruminococcaceae Phocea 0 0,0042 0,0142
Ruminococcaceae Hydrogenoanaerobacterium 0,0042 0,0025 0,9754
Ruminococcaceae Acetanaerobacterium 0,0028 0,0023 0,3258
Ruminococcaceae Angelakisella 0 0,0016 0,1498
Ruminococcaceae Pygmaiobacter 0,0070 0,0009 0,9710
Ruminococcaceae Ruminococcaceae V9D2013 Group 0 0,0007 0,3340
Ruminococcaceae Pseudoflavonifractor 0,0006 0 0,3697
Staphylococcaceae Staphylococcus 0,0020 0,0005 1
Streptococcaceae Streptococcus 2,3431 0,7448 0,0701
Streptococcaceae Lactococcus 0,0012 0,0079 0,3092
Veillonellaceae Megasphaera 0,0026 5,0857 0,2808
Veillonellaceae Dialister 0,0765 4,1317 0,0862
Veillonellaceae Megamonas 0 0,9779 0,1498
Veillonellaceae Veillonella 2,9121 0,0824 0,1075
Veillonellaceae Allisonella 0 0,0207 0,3340
Veillonellaceae Anaeroglobus 0,4780 0 0,1800
TABLA 14: Diferencias en las abundancias relativas (%) a nivel de género entre los grupos
CDI y CTRL dentro del phylum Firmicutes. En negrita se destacan las diferencias
estadísticamente significativas (P<0.05).
Destacamos que de forma estadísticamente significativa existe una

reducción en los pacientes con CDI con respecto a controles sanos de los
siguientes géneros dentro del phylum Firmicutes: Christensenellaceae R-7 Group,
Eubacterium brachy Group, Agathobacter, Roseburia, Lachnospiraceae NK4A136 Group,
Coprococcus 3, Eubacterium ventriosum Group, Eubacterium eligens Group,
Eubacterium xylanophilum Group, Faecalibacterium, Ruminococcus 2, Subdoligranulum
231
y Eubacterium coprostanoigenes Group. Por el contrario, de forma estadísticamente
significativa existe un aumento en los pacientes con CDI con respecto a controles
sanos de siguientes géneros dentro del phylum Firmicutes: Clostridium innicuum
Group, Eubacterium nodatum Group y Lachnoclostridum.
A nivel de familia encontramos como principal alteración cuantitativa en

los pacientes con CDI con respecto a controles sanos una depleción abundante de
Ruminococcaceae y Lachnospiraceae. Vamos a ver cuales son las alteraciones
principales de los géneros dentro de estas dos familias en los pacientes con CDI
con respecto a los controles sanos. Con respecto a Ruminoccccaceae destacamos:
 Disminuciónes muy acentuadas de Faecalobacterium (3.9% en CDI frente a
11.2% en CTRL), Ruminococcus 2 (0.1% en CDI frente a 4.5% en CTRL) y
Subdoligranulum (0.3% en CDI frente a 4.0% en CTRL).
 Disminucion más moderadas Eubacterium coprostanoligenes Group (0.0939%
en CDI frente a 1.3705% en CTRL).
En la familia Lachnospiraceae destacamos:
 Disminuciónes acentuadas de Agathobacter (0.0374% en CDI frente a
6.2873% en CTRL), Roseburia (0.1% en CDI frebte a 2.7% en CTRL) y
Lachnospiraceae NK4A136 Group (0.1% en CDI frente a 1.5% en CTRL).
 Disminuciones más moderadas de Eubacterium ventriosum Group (0% en
CDI frente a 0.7224% en CTRL), Eubacterium eligens Group (0.0063% en CDI
frente a 0.3189% en CTRL y Eubacterium xylanophilum Group (0% en CDI
frente a 0.1578% en CTRL).
 Aumentos de Ruminococcus gnavus Group (3.2% en CDI frente a 0.7% en
CTRL) y Lachnoclostridium (3.2% en CDI frente a 0.3% en CTRL).
Dentro de otras familias dentro del phylum Firmicutes destacan las siguientes
alteraciones en el grupo CDI con respecto a los controles sanos:
 Reducción acentuada de Megasphaera (0.0374% en CDI frente a 6.2873% en
CTRL) y Dialister (0.0765% en CDI frente a 4.1317% en CTRL) y Megamonas
(0% en CDI frente a 0.9779% en CTRL) y aumento significativo de
Veillonella (2.9121 en CDI % frente a 0.0824% en CTRL), dentro la familia
Veillonellaceae.
232
 Aumento significativo de Erysipelatoclostridium (2.9% en CDI frente a 0.1%
en CTRL) y más moderado de Clostridium innocuum Group (0.9964% en
CDI frente a 0.0115% en CTRL), dentro de la familia Erysipelotrichaceae.
 Aumento acentuado del género Streptococcus de la familia
Streptococcaceae (2.3% en CDI frente a 0.7% en CTRL).
 Aumento moderado del género Acidaminococcus de la familia
Acidaminococcaceae (0.7410% en CDI frente a 0.0614% en CTRL).
 Aumento moderado del género Lactobacillus de la familia Lactobacillaceae
(1.0017% en CDI frente a 0.0111% en CTRL).
 Aumento moderado del género Enterococcus de la familia Enterococcaceae
(0.6853% en CDI frente a 0% en CTRL).
Con respecto al phylum Bacteroidetes la siguiente tabla recoge las

diferencias en la composición a nivel de género en los grupos CDI y CTRL:
233
PHYLUM BACTEROIDETES
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
FAMILIA GENERO WILCOXON
CDI CTRL
(P-VALUES)
(%) (%)
Bacteroidaceae Bacteroides 26,847 11,0028 0,0307
Barnesiellaceae Barnesiella 0,7501 0,3836 0,1184
Barnesiellaceae Coprobacter 0,0310 0,0114 0,4838
Marinifilaceae Odoribacter 0,8563 0,1674 0,1371
Marinifilaceae Butyricimonas 0,2069 0,0941 0,7110
Marinifilaceae Sanguibacteroides 0 0,0049 0,1498
Muribaculaceae CAG-873 0,1587 0 0,3697
Porphyromonadaceae Porphyromonas 0,0478 0,0028 0,1742
Prevotellaceae Prevotella 9 0,0213 1,8201 0,1193
Prevotellaceae Prevotellaceae NK3B31 group 0,0131 0,4546 0,1358
Prevotellaceae Paraprevotella 0,4986 0,1805 0,5943
Prevotellaceae Prevotellaceae UCG-001 0 0,0690 0,0694
Prevotellaceae Alloprevotella 0 0,0026 0,1498
Prevotellaceae Prevotella 0,1934 0,0010 0,9710
Prevotellaceae Prevotellaceae UCG-003 0,0127 0 0,3697
Rikenellaceae Alistipes 2,8709 2,5705 0,1075
Rikenellaceae Rikenellaceae RC9 gut group 0,0877 0,0263 1
Rikenellaceae Rikenella 0 0,0043 0,0318
Tannerellaceae Parabacteroides 4,7580 1,1344 0,4982
CDI y CTRL dentro del phylum Bacteroidetes. En negrita se destacan las diferencias
Observamos que de forma estadísticamente significativa se produce un

aumento en el grupo CDI con respecto a controles sanos en el género Bacteroides
con un cambio en la abundancia relativa que pasa desde el 11.0% al 26.8%. El
aumento en el phylum Bacteroidetes y de la familia Bacteroidaceae en el grupo
CDI es a expensas únicamente del género Bacteroides. Otras alteraciones en el
234
grupo CDI de interés que encontramos en los géneros de este phylum son el
aumento de Prevotella 7 (1.2242% en CDI frente a 0.0003% en CTRL) y
Paraprevotella (0.5% en CDI frente a 0.2% en CTRL) y la disminución de Prevotella
9 (0.0213% en CDI frente a 1.8201% en CTRL) de la familia Prevotellaceae, y un
aumento del género Parabacteroides (4.7% en CDI frente a 1.1% en CTRL) de la
familia Tannerellaceae.
Siguiendo con el estudio de las diferencias de composición a nivel de

género de los grupos CDI y CTRL, la siguiente tabla recoge estos datos con
respecto al phylum Proteobacteria:
235
PHYLUM PROTEOBACTERIA
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
FAMILIA GENERO WILCOXON
CDI CTRL
(P-VALUES)
(%) (%)
Burkholderiaceae Parasutterella 3,0870 0,2155 0,2927
Burkholderiaceae Sutterella 0,0608 0,0571 0,9090
Burkholderiaceae Oxalobacter 0 0,0147 0,0025
Cardiobacteriaceae Cardiobacterium 0 0,0005 0,3340
Desulfohalobiaceae Desulfovermiculus 0,2192 0 0,3697
Desulfovibrionaceae Desulfovibrio 0,0999 0,2551 0,0327
Desulfovibrionaceae Bilophila 0,1454 0,0656 0,1050
Enterobacteriaceae Escherichia-Shigella 9,1685 2,5561 0,1620
Enterobacteriaceae Klebsiella 0,0179 0,309 0,1930
Enterobacteriaceae Enterobacter 0,0014 0,0157 0,9604
Enterobacteriaceae Kluyvera 0 0,0117 0,1498
Enterobacteriaceae Citrobacter 0,0101 0 0,3697
Enterobacteriaceae Morganella 0,0043 0 0,0906
Enterobacteriaceae Proteus 0,8832 0 0,3697
Neisseriaceae Neisseria 0 0,0009 0,1498
Neisseriaceae Eikenella 0,0003 0 0,3697
Pasteurellaceae Haemophilus 0,1624 0,0512 0,8731
Xanthobacteraceae Bradyrhizobium 0,0012 0 0,3697
CDI y CTRL dentro del phylum Proteobacteria. En negrita se destacan las diferencias
Las alteraciones más llamativas en las diferencias de composición de los

grupos CDI y CTRL son el aumento en el grupo CDI de los géneros de la familia
Enterobacteriacea como Escherichia-Shigella (9.1% en CDI frente 2.5% en CTRL) y
Proteus (0.8832% en CDI frente a 0% en CTRL) y el aumento del género
Parasutterella (3.0% en CDI frente a 0.2% en CTRL) de la familia Burkholderiaceae.
Con respecto al phylum Actinobacteria solo es destacable la disminución

estadísticamente significativa que se produce en el grupo CDI con respecto a los
236
controles sanos del género Bifidobacterium (0.6% en CDI frente a 3.7% en CTRL) de
la familia Bifidobacteriacea.
Del resto de phylum Cyanobacteria, Epsilonbacteraota, Patescibacteria,

Synergistetes, Tenericutes y Verrucomicrobia, solo destaca el aumento en
Akkermansia en CDI con respecto a controles sanos (5.9% en CDI frente a 4.7% en
CTRL) de la familia Akkermansiaceae del phylum Verrucomicrobia.
237
Por último, la siguiente figura muestra las principales diferencias
cuantitativas en la composición a nivel de género (suman en torno al 65% de las
abundancias relativas de ambos grupos) entre los grupos CDI con respecto a
controles, para resumir la disbacteriosis encontrada en el grupo CDI:
FIGURA 47: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de los géneros mayoritarios
en los grupos CDI y CTRL. Grupo CDI en azul y Grupo CTRL en amarillo.
238
5.5.3.2. Diferencias a nivel de género entre los grupos P y CTRL.
Al igual que en el apartado anterior analizamos dentro de cada phylum las

diferencias en la composición a nivel de género que observamos. A continuación,
en primer lugar, vamos a observar las diferencias dentro de los géneros del
phylum Firmicutes. En la siguiente tabla se recogen las abundancias relativas de
los distintos géneros de los grupos P y CTRL:
PHYLUM FIRMICUTES
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
CTRL P
(P-VALUES)
(%) (%)
Acidaminococcaceae Acidaminococcus 0,0614 0 0,0318
Aerococcaceae Aerococcus 0 0,0007 0,3697
Bacillales Family XII Exiguobacterium 0 0,0002 0,3697
Christensenellaceae Christensenellaceae R-7 Group 0,9856 0,1902 0,0008
Christensenellaceae Catabacter 0,0171 0,0171 0,0885
Clostridiaceae 1 Clostridium Sensu Stricto 13 0 0,0016 0,3697
Clostridiaceae 1 Clostridium sensu Stricto 2 0 0,0043 0,3697
Clostridiales Family XI Parvimonas 0,0005 0 0,0694
Clostridiales Family XI Anaerococcus 0,0002 0 0,3340
Clostridiales Family XI Peptoniphilus 0,0002 0,0007 0,9710
Clostridiales Family XI Ezakiella 0,0001 0,0053 0,2913
Clostridiales Family XI Tepidimicrobium 0 0,0086 0,3697
Clostridiales Family XI Tissierella 0 0,0013 0,3697
Clostridiales Family XIII Family XIII UCG-001 0,0575 0,0005 0
Clostridiales Family XIII Eubacterium brachy Group 0,0334 0,0051 0,0036
Clostridiales Family XIII Mogibacterium 0,0013 0 0,1498
239
Clostridiales Family XIII S5-A14a 0 0,0008 0,3697
Enterococcaceae Enterococcus 0 0,4993 0,0021
Erysipelotrichaceae Erysipelotrichaceae UCG-003 0,7502 0,0431 0,0001
Erysipelotrichaceae Catenibacterium 0,3247 0 0,0318
Erysipelotrichaceae Holdemanella 0,2120 0 0,3340
Erysipelotrichaceae Merdibacter 0,0114 0 0,0001
Erysipelotrichaceae Faecalicoccus 0,0080 0 0,1498
Erysipelotrichaceae Erysipelotrichaceae UCG-006 0,0040 0 0,3340
Erysipelotrichaceae Erysipelotrichaceae UCG-004 0,0023 0 0,0694
Erysipelotrichaceae Catenisphaera 0,0012 0 0,3340
Lachnospiraceae Roseburia 2,7259 0,1674 0,0001
Lachnospiraceae Lachnospiraceae NK4A136 Group 1,4926 0,3200 0,0015
Lachnospiraceae Ruminococcus torques Group 0,9151 1,8731 1
Lachnospiraceae Coprococcus 3 0,7409 0 0
Lachnospiraceae Dorea 0,7318 0,2986 0,0014
Lachnospiraceae Eubacterium ventriosum Group 0,7224 0,0032 0,0001
Lachnospiraceae Lachnoclostridium 0,3400 0,7856 1
Lachnospiraceae Eubacterium eligens group 0,3189 0,1217 0,1126
Lachnospiraceae Coprococcus 2 0,2555 0 0,0142
Lachnospiraceae Tyzzerella 3 0,2178 0 0,0142
Lachnospiraceae Fusicatenibacter 0,1452 0,007 0,0003
Lachnospiraceae Eubacterium xylanophilum Group 0,1578 0,001 0,0003
Lachnospiraceae CAG-56 0,1232 0 0
240
Lachnospiraceae Lachnospiraceae UCG-010 0,0932 0 0
Lachnospiraceae Lachnospira 0,0578 0,0109 0,0186
Lachnospiraceae Howardella 0,0576 0 0,0142
Lachnospiraceae Eubacterium ruminantium Group 0,0420 0 0,1498
Lachnospiraceae Lachnospiraceae UCG-001 0,0408 0 0,0142
Lachnospiraceae Lachnospiraceae FCS020 Group 0,0203 0 0,0004
Lachnospiraceae UC5-1-2E3 0,0179 0,0059 0,0186
Lachnospiraceae Ruminococcus gauvreauii Group 0,0138 0,0089 0,0043
Lachnospiraceae Moryella 0,0131 0 0,0061
Lachnospiraceae Lachnospiraceae ND3007 Group 0,0095 0 0,0142
Lachnospiraceae Marvinbryantia 0,0083 0 0,0061
Lachnospiraceae Oribacterium 0,0031 0,0174 0,5916
Lachnospiraceae Lachnospiraceae NK4B4 group 0,0023 0 0,3340
Lachnospiraceae Butyrivibrio 0,0021 0 0,1498
Lachnospiraceae Acetitomaculum 0,0019 0 0,3340
Lachnospiraceae Lactonifactor 0,0014 0 0,3340
Lachnospiraceae Johnsonella 0,0010 0 0,1498
Lachnospiraceae Lachnoanaerobaculum 0,0006 0,0031 1
Lachnospiraceae Eubacterium oxidoreducens Group 0,0001 0 0,3340
Lachnospiraceae Stomatobaculum 0 0,0009 0,3697
Lactobacillaceae Lactobacillus 0,0111 0,2256 0,2624
Lactobacillaceae Pediococcus 0 0,0013 0,3697
Leuconostocaceae Weissella 0,0049 0 0,1498
Peptococcaceae Peptococcus 0,0093 0 0,0694
241
Peptostreptococcaceae Intestinibacter 0,0004 0,0035 1
Peptostreptococcaceae Clostridioides 0 0,3638 0,0001
Peptostreptococcaceae Terrisporobacter 0 0,0013 0,3697
Ruminococcaceae Faecalibacterium 11,2857 0,9126 0
Ruminococcaceae Subdoligranulum 4,0918 0,2808 0
Ruminococcaceae Fournierella 0,1326 0,0320 0,0810
Ruminococcaceae CAG-352 0,0804 0 0,0694
Ruminococcaceae UBA1819 0,0769 0,6436 1
Ruminococcaceae Oscillospira 0,0195 0 0,0694
Ruminococcaceae Harryflintia 0,0075 0,0014 0,1358
242
Ruminococcaceae Anaerofilum 0,0066 0,0002 0,0452
Ruminococcaceae Ruminococcaceae UCG-007 0,0061 0 0,0318
Ruminococcaceae Papillibacter 0,0045 0 0,0025
Ruminococcaceae Phocea 0,0042 0 0,0142
Ruminococcaceae Ruminococcaceae UCG-008 0,0027 0 0,1498
Ruminococcaceae Angelakisella 0,0016 0,0025 0,5916
Ruminococcaceae Ruminococcaceae V9D2013 Group 0,0007 0 0,3340
Staphylococcaceae Staphylococcus 0,0005 0,0278 0,3258
Syntrophomonadaceae Syntrophomonas 0 0,0002 0,3697
Veillonellaceae Megamonas 0,9779 0 0,1498
Veillonellaceae Allisonella 0,0207 0 0,3340
Veillonellaceae Anaeroglobus 0 0,9869 0,1800
Veillonellaceae Selenomonas 3 0 0,0003 0,3697
P y CTRL dentro del phylum Firmicutes. En negrita se destacan las diferencias
Observamos que de forma estadísticamente significativa se produce una

reducción en el grupo P con respecto a los controles sanos en géneros como
Faecalibacterium, Agathobacter, Subdoligranulum, Coprococcus 3, Roseburia,
Eubacterium coprostanoligenes Group, Eubacterium ventriosum Group, Ruminococcus 2,
Eubacterium xylanophilum Group, Christensenellaceae R-7 Group, Lachnospiraceae
NK4A136 Group, Eubacterium brachy Group, Acidaminococcus y
Phascolarctobacterium. Por el contrario, encontramos aumentos estadísticamente
significativos en los géneros Enterococcus, Clostridioides, Clostridium innocuum
Group y Ruminococcus gnavus Group.
243
Al igual que observamos en el grupo de pacientes con CDI, en los
individuos colonizados por C. difficile encontramos con respecto a controles sanos,
como alteración principal en la composición a nivel de familia, una acentuada
depleción de Ruminococcaceae y Lachnospiraceae. Dentro de las alteraciones
principales de los géneros dentro de la familia Ruminococcaceae destacamos:
 Depleciones muy acentuadas de los géneros Faecalibacterium (0.9% en P
frente a 11.2% en CTRL), Ruminococcus 2 (0.6% en P frente a 5.0% en
CTRL), Subdoligranulum (0.3% en P frente a 4.1% en CTRL),
Ruminococcaceae UGC-002 (0.5% en P frente a 2.2% en CTRL),
Ruminococcaceae UGC-004 (0.0100% en P frente a 1.6804% en CTRL) y
Eubacterium coprostalogenes Group (0.2% en P frente a 1.4% en CTRL),
Con respecto a la familia Lachnospiraceae destacan las siguientes alteraciones:
 Disminuciones muy acentuadas de los géneros Agathobacter (0.1%en P
frente a 6.3% en CTRL), Roseburia (0.1% en P frente a 2.7% en CTRL) y
Lachnospiraceae NK4A136 Group (0.3% en P frente a 1.5% en CTRL).
 Disminuciones moderadas de los géneros Eubacterium ventriosum Group
(0.0032% en P frente a 0.7224% en CTRL), Eubacterium eligens Group (0.1%
en P frente a 0.3% en CTRL) y Eubacterium xylanophilum Group (0.0010% en
P frente a 0.1578% en CTRL),
 Aumentos acentuados del género Ruminococcus gnavus Group (5.3% en P
frente a 0.7%en CTRL) y más moderados en Blautia (1.5% en P frente a
0.7% en CTRL) y Lachnoclostridium (0.8% en P frente a 0.3% en CTRL)
Dentro de otras familias dentro del phylum Firmicutes destacan las

siguientes alteraciones a nivel de género en el grupo de individuos colonizados
por C. difficile con respecto a los controles sanos:
 Depleción acentuada del género Megasphaera (0.6% en P frente a 5.0% en
CTRL), disminución moderada de Megamonas (0% en P frente a 0.9779%
en CTRL), aumento acentuado de Veillonella (4.5646% en P frente a 0.824%
en CTRL) dentro de la familia Veillonellaceae.
 Dismución acentuada del género Phascolarctobacterium (0.5% en P frente a
2.7% en CTRL) de la familia Acidaminococcaceae.
 Disminución moderada del género Christensenellaceae R-7 Group (0.1902%
en CDI frente a 0.9856% en CTRL) de la familia Christensenellaceae.
244
 Aumento acentuado del género Streptococcus (3.5% en P frente a 0.7% en
CTRL) dentro de la familia Streptococcaceae.
 Aumento moderado del género Erysipelatoclostridium (1.1%en P frente a
0.8% en CTRL) de la familia Erysipelotrichaceae.
 Aumento moderado del género Clostridoides (0.3638% en P frente a 0% en
CTRL) de la familia Peptostreptococcacea. A este género pertenece C.
difficile.
 Aumento moderado del género Enterococcus (0.4993% en P frente a 0% en
CTRL) de la familia Enterococcaceae.
Con respecto del phylum Bacteroidetes la siguiente tabla recoge las

diferencias en la composición a nivel de género en los grupos P y CTRL:
245
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
CTRL P
(P-VALUES)
(%) (%)
Dysgonomonadaceae Dysgonomonas 0 0,0005 0,3697
Marinifilaceae Sanguibacteroides 0,0049 0 0,1498
Porphyromonadaceae Porphyromonas 0,0028 0,0114 0,1742
Prevotellaceae Prevotellaceae NK3B31 Group 0,4546 0 0,0318
Prevotellaceae Alloprevotella 0,0026 0 0,1498
Prevotellaceae Prevotella 7 0,0003 0 0,3340
Prevotellaceae Prevotella 6 0,0002 0,0002 1
Prevotellaceae Prevotella 2 0 0,0444 0,3697
Rikenellaceae Rikenella 0,0043 0 0,0318
P y CTRL dentro del phylum Bacteroidetes. En negrita se destacan las diferencias
Observamos que de forma estadísticamente significativa se produce un

aumento en el grupo P con respecto a controles sanos en el género Bacteroidetes
con un cambio en la abundancia relativa que pasa desde el 11.0% al 29.1%, y unas
disminuciones moderadas en los géneros Rikenella (0% en P frente a 0.0043% en
CTRL), Paraprevotella (0.0473% en P frente a 0.1805% en CTRL) y Barnesiella (0.1%
246
en P frente a 0.4% en CTRL). Por consiguiente, al igual que pasa en el grupo de
pacientes con CDI, el aumento en el phylum Bacteroidetes es a expensas de los
géneros Bacteroides (principalmente) y Parabacteroides (también aumenta en el
grupo P hasta el 2.3% frente a 1.1% del grupo de los controles sanos) de las
familias Bacteroidaceae y Tannerellaceae, respectivamente.
Con respecto del phylum Proteobacteria la siguiente tabla recoge las

diferencias en la composición entre los grupos P y CTRL:
247
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
CTRL P
(P-VALUES)
(%) (%)
Burkholderiaceae Parasutterella 0,2155 1,1747 1
Burkholderiaceae Oxalobacter 0,0147 0,0014 0,0100
Burkholderiaceae Curvibacter 0 0,0007 0,3697
Enterobacteriaceae Escherichia-Shigella 2,5561 10,6014 0,2051
Enterobacteriaceae Enterobacter 0,0157 0,0011 0,9604
Enterobacteriaceae Kluyvera 0,0117 0 0,1498
Enterobacteriaceae Citrobacter 0 0,0095 0,1800
Enterobacteriaceae Morganella 0 0,0007 0,3697
Neisseriaceae Neisseria 0,0009 0 0,1498
Pseudomonadaceae Pseudomonas 0 0,0015 0,3697
Xanthobacteraceae Bradyrhizobium 0 0,0002 0,3697
P y CTRL dentro del phylum Proteobacteria. En negrita se destacan las diferencias
No existen diferencias estadísticamente significativas. No obstante, las

alteraciones más llamativas, aunque no significativas son los aumentos
acentuados en el grupo P de dos generos de la familia Enterobacteriacea como
Escherichia-Shigella (10.6% en P frente a 2.5% en CTRL) y Kleibsiella (3.5% en P
frente a 0.3% en CTRL). También destaca el incremento más moderado de
Parasutterella (1.2% en P frente a 0.2% en CTRL) de las famila Burkholderiaceae.
En el phylum Actinobacteria la principal diferencia en la composición de

los grupos P y CTRL a nivel de género es la perdida (no significativa) de
248
Bifidobacterium (2.0% en P frente a 3.6% en CTRL) en el grupo P con respecto a los
controles sanos.
Del resto de phylums Cyanobacteria, Epsilonbacteraota, Patescibacteria,

Synergistetes, Tenericutes y Verrucomicrobia, solo destaca la depleción de
Akkermansia en en el grupo P con respecto a controles sanos (1.3% en P frente a
4.7% en CTRL) de la familia Akkermansiaceae del phylum Verrucomicrobia.
En la siguiente figura se muestras las principales diferencias en las

abundancias relativas de los géneros de los grupos P y CTRL que nos permite un
visionado rápido de la diferente composición de la microbiota intestinal de estos
dos grupos:
249
FIGURA 48: Diferencias en las abundancias relativas a nivel de los géneros mayoritarios
en los grupos P y CTRL. Grupo P en rojo y Grupo CTRL en amarillo.
250
Por consiguiente, a nivel taxonómico de género podemos observar una
serie de diferencias en cuanto a la composición de los grupos CDI y P con
respecto a los controles sanos, que nos distinguiría al patrón de disbacteriosis de
ambos grupos. A continuación, se resumen las diferencias más importantes que se
encuentran en cada phylum:
 phylum Proteobacteria:
o Enterobacteriaceae:
 Aunque en ambos grupos el género Escherichia-Shigella está
muy aumentando con respecto a los controles sanos llama la
atención que en el grupo P sea ligeramente superior (10.6% en
P y 9.1% en CDI).
 Con respecto a otros miembros de la familia Enterobacteriaceae
existen diferencias en los géneros Kleibsiella y Proteus. En
Kleibsiella existe una ligera disminución en CDI y un aumento
acentuado en P (0.0179% en CDI y 3.5697% en P). En Proteus se
observa en CDI un aumento hasta el 0.8832%, mientras que en
P no aparece, al igual que en controles sanos (0%).
o Burkholderiacea: Se produce un aumento más pronunciado en el
grupo CDI que en el grupo P (3.0870% en CDI y 1.1747% en P) a
expensas principalmente en ambos casos de Parasutterella.
 phylum Bacteroidetes:
o Bacteroidaceae:
 El acentuado aumento del género Bacteroides ambos grupos con
respecto a los controles sanos es más acentuado en P que en
CDI (29.1 en P % y 26.8% en CDI).
o Prevotellaceae:
 La perdida de Prevotella 9 es más acentuada en el grupo CDI
que en P (0.0213% en CDI y 1.3429% en P).
 En el género Prevotella 7 se produce un moderado aumento en
CDI (1.2242%) mientras que en controles sanos y el grupo P no
se detecta.
 En el género Paraprevotella se produce un ligero aumento en
CDI mientras que en el grupo P se da una ligera disminución
251
con respecto a los controles sanos (0.4986% en CDI y 0.0470%
en P).
o Barnesiellaceae:
 En Barnesiella se produce un ligero aumento en el grupo CDI
mientras que en el grupo P se observa una ligera disminución
con respecto a los controles sanos (0.7501 en CDI % y 0.1443%
en P).
o Marinifilaceae:
 En Odoribacter se produce un ligero aumento en el grupo CDI
mientras que en el grupo P se da una ligera disminución con
respecto a los controles sanos (0.8563% en CDI y 0.0437% en P).
 phylum Actinobacteria:
o Bifidobacteriaceae:
 En Bifidobacterium se produce una pérdida que es acentuada en
CDI (0.0245%) mientras que en el grupo P es más moderada
(2.0626%) con respecto a los controles sanos.
 phylum Verucomicrobia:
o Akkermansiaceae:
 Mientras que en el grupo CDI se produce un moderado
aumento de Akkermansia respecto a los controles sanos, en el
grupo P se produce una acentuada bajada (5.9% en CDI frente
a 1.3% en P).
 phylum Firmicutes:
o Ruminococcaceae:
 En Faecalibacterium se produce una perdida más acentuada en
el grupo P que en CDI (0.9126% en P y 3.2948% en CDI).
o Lachnospiraceae:
 En Ruminococcus gnavus Group se produce un aumento más
pronunciado en el grupo P que en CDI (5.3744% en P y 3.2177%
en CDI).
 En Ruminococcus torques Group se produce un aumento
moderado en el grupo P siendo más leve en CDI (1.8731% en P
y 1.1256% en CDI).
252
 En Blautia se produce una ligera disminución en el grupo CDI
(0.5904%) y un moderado aumento en el grupo P (1.5385%).
 En Lachnoclostridium se produce un aumento acentuado en CDI
(3.2330%), siendo más ligero en P (0.7856%).
o Veillonellaceae:
 Se observa una pérdida de Megasphaera más leve en el grupo
CDI que en P (0.0026% en CDI y 0.6327% en P).
 En Dialister se produce una acentuada pérdida en el grupo CDI
mientras que en P hay un aumento moderado (0.0765% en CDI
y 5.9524% en P).
 En Veillonela se produce un aumento pronunciado en ambos
grupos, pero es mayor en el grupo P que en el grupo CDI
(4.5646% en P y 2.9121% en CDI).
o Acidominococcaceae:
 En Phascolarctobacterium se produce un ligero aumento en el
grupo CDI mientras que en P se produce una disminución
acentuada con respecto a los controles sano (2.7336% en CDI y
0.5025% en P).
 En Acidominococcus se produce un ligero aumento en el grupo
CDI (0.7410%) mientras que en el grupo P no hay cambio con
respecto a controles sanos (0.0614%).
o Christensenellaceae:
 En Christensenellaceae R-7 Group se produce una pérdida casi
total en el grupo P (0.1902%) mientras que en el grupo CDI es
más moderada (0.5333%).
o Streptococcaceae:
 En Streptococcus se produce un aumento que es más
pronunciado en el grupo P que en el grupo CDI (3.5834% y
2.3431%).
o Erysipelotrichaceae:
 En Erysipeloclostridium se produce un aumento más
pronunciado en el grupo CDI que en el grupo P (2.9142% en
CDI y 1.2124% en P).
253
 En Clostridium innocuum Group se produce un ligero aumento,
pero algo más pronunciado en el grupo CDI que en el grupo P
(0.9964% en CDI y 0.2158% en P).
o Lactobacillaceae:
 En Lactobacillus se produce un moderado aumento, algo más
pronunciado en el grupo CDI que en el grupo P (1.0017% en
CDI y 0.5182% en P).
o Eubacteriaceae:
 En Eubacterium las diferencias son sutiles. En el grupo P se
produce un muy ligero aumento (0.0118%) con respecto al
grupo CDI y de controles sanos (0.0011% en CDI y 0.0003% en
CTRL).
o Peptostreptococcaceae:
 El género Clostridioides al cual pertence C. difficile es
prácticamente igual en los grupos CDI y P con respecto al
grupo de controles sanos, observándose un aumento moderado
similar (0.3668% en CDI y 0.3638% en P).
o Enterococcaceae:
 En Enterococcus hay un ligero aumento al respecto de los
controles sanos en ambos grupos siendo ligeramente mayor en
el grupo CDI que en el grupo P (0.6853% en CDI y 0.4993% en
P).
254
5.5.3.3. Diferencias a nivel de género entre los grupos CDI y P.
Al igual que en los apartados anteriores analizamos dentro de cada phylum

las diferencias en la composición a nivel de género entre los grupos CDI y P.
Como esto se describe en el apartado anterior 5.5.3.2, cuando vimos las
diferencias de los grupos CDI y P con respecto a los controles sanos, únicamente
vamos a disponer de las tablas de todos los phylums y ver cuales son las
diferencias aplicando el test de Wilcoxon.
PHYLUM FIRMICUTES
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
CDI P
(P-VALUES)
(%) (%)
Acidaminococcaceae Acidaminococcus 0,7410 0 0,3506
Aerococcaceae Aerococcus 0 0,0007 0,3506
Bacillales Family XI Ezakiella 0 0,0053 0,0797
Bacillales Family XI Anaerococcus 0,0433 0 0,3506
Bacillales Family XI Parvimonas 0,0002 0 0,3506
Bacillales Family XI Tepidimicrobium 0 0,0086 0,3506
Bacillales Family XI Tissierella 0 0,0013 0,3506
Bacillales Family XI Peptoniphilus 0,0012 0,0007 1
Christensenellaceae Catabacter 0 0,0171 0,1644
Christensenellaceae Christensenellaceae R-7 group 0,5330 0,1902 0,8521
Clostridiaceae 1 Clostridium Sensu Stricto 2 0 0,0043 0,3506
Clostridiaceae 1 Clostridium Sensu Stricto 13 0,0029 0,0016 1
Clostridiales Family XII Exiguobacterium 0 0,0002 0,3506
Clostridiales Family XIII Eubacterium brachy Group 0 0,0051 0,3506
Clostridiales Family XIII Family XIII UCG-001 0 0,0005 0,3506
255
Clostridiales Family XIII S5-A14a 0 0,0008 0,3506
Enterococcaceae Enterococcus 0,6853 0,4993 1
Erysipelotrichaceae Merdibacter 0,0505 0 0,0797
Erysipelotrichaceae Holdemanella 0,0149 0 0,3506
Erysipelotrichaceae Erysipelotrichaceae UCG-003 0,0018 0,0431 0,5772
Lachnospiraceae Lachnoclostridium 3,2330 0,7856 0,1099
Lachnospiraceae Robinsoniella 0,0207 0 0,1644
Lachnospiraceae Fusicatenibacter 0 0,0070 0,1644
Lachnospiraceae GCA-900066575 0 0,0175 0,1644
Lachnospiraceae Epulopiscium 0,5071 0 0,3506
Lachnospiraceae Lachnoclostridium 5 0,0447 0 0,3506
Lachnospiraceae Butyrivibrio 0,0217 0 0,3506
Lachnospiraceae Lachnospiraceae FCS020 Group 0,0062 0 0,3506
Lachnospiraceae Cellulosilyticum 0,0044 0 0,3506
Lachnospiraceae Anaerosporobacter 0,0024 0 0,3506
Lachnospiraceae Lactonifactor 0,0024 0 0,3506
Lachnospiraceae Johnsonella 0,0012 0 0,3506
256
Lachnospiraceae Moryella 0,0010 0 0,3506
Lachnospiraceae Eubacterium ventriosum Group 0 0,0032 0,3506
Lachnospiraceae Lachnoanaerobaculum 0 0,0031 0,3506
Lachnospiraceae Lachnospira 0 0,0109 0,3506
Lachnospiraceae Stomatobaculum 0 0,0009 0,3506
Lachnospiraceae UC5-1-2E3 0 0,0059 0,3506
Lachnospiraceae Dorea 0,0377 0,2986 0,3939
Lachnospiraceae Eubacterium eligens Group 0,0063 0,1217 0,5383
Lachnospiraceae Lachnospiraceae NK4A136 group 0,1112 0,3200 0,6093
Lachnospiraceae Roseburia 0,1196 0,1674 0,6545
Lachnospiraceae Ruminococcus torques Group 1,1256 1,8731 0,6706
Lachnospiraceae Oribacterium 0,0005 0,0174 1
Lachnospiraceae Ruminococcus gauvreauii Group 0,0324 0,0089 1
Lactobacillaceae Lactobacillus 1,0017 0,2256 1
Lactobacillaceae Pediococcus 0,0270 0,0013 1
Peptostreptococcaceae Clostridioides 0,3668 0,3638 0,1568
Peptostreptococcaceae Paeniclostridium 0,0017 0 0,1644
Peptostreptococcaceae Intestinibacter 0 0,0035 0,3506
Peptostreptococcaceae Terrisporobacter 0,0006 0,0013 1
Ruminococcaceae Faecalibacterium 3,2948 0,9126 0,1299
257
Ruminococcaceae Ruminiclostridium 1 0 0,0005 0,1644
Ruminococcaceae CAG-352 0,0072 0 0,3506
Ruminococcaceae Oscillospira 0,0048 0 0,3506
Ruminococcaceae Papillibacter 0,0010 0 0,3506
Ruminococcaceae Pseudoflavonifractor 0,0006 0 0,3506
Ruminococcaceae Angelakisella 0 0,0025 0,3506
Ruminococcaceae Subdoligranulum 0,3407 0,2808 0,4092
Ruminococcaceae Candidatus Soleaferrea 0,0114 0,0184 0,4885
Ruminococcaceae UBA1819 0,8726 0,6436 0,6742
258
Ruminococcaceae Harryflintia 0,0122 0,0014 1
Ruminococcaceae Fournierella 0,0065 0,032 1
Ruminococcaceae Anaerofilum 0,0011 0,0002 1
Staphylococcaceae Staphylococcus 0,0020 0,0278 0,3258
Syntrophomonadaceae Syntrophomonas 0 0,0002 0,3506
Veillonellaceae Selenomonas 3 0 0,0003 0,3506
Veillonellaceae Anaeroglobus 0,4780 0,9869 0,9720
CDI y P dentro del phylum Firmicutes. En negrita se destacan las diferencias
259
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
CDI P
(P-VALUES)
(%) (%)
Dysgonomonadaceae Dysgonomonas 0 0,0005 0,3506
Muribaculaceae CAG-873 0,1587 0 0,3506
Porphyromonadaceae Porphyromonas 0,0478 0,0114 1
Prevotellaceae Prevotella 7 1,2242 0 0,0797
Prevotellaceae Prevotellaceae NK3B31 Group 0,0131 0 0,3506
Prevotellaceae Prevotella 2 0 0,0444 0,3506
Rikenellaceae Rikenellaceae RC9 gut Group 0,0877 0 0,3506
CDI y P dentro del phylum Bacteroidetes. En negrita se destacan las diferencias
260
MEDIA MEDIA
TEST DE
GRUPO GRUPO
CDI P
(P-VALUES)
(%) (%)
Burkholderiaceae Curvibacter 0 0,0007 0,3506
Burkholderiaceae Oxalobacter 0 0,0014 0,3506
Burkholderiaceae Parasutterella 3,0870 1,1747 0,5974
Desulfohalobiaceae Desulfovermiculus 0,2192 0 0,3506
Enterobacteriaceae Morganella 0,0043 0,0007 0,2615
Enterobacteriaceae Proteus 0,8832 0 0,3506
Enterobacteriaceae Citrobacter 0,0101 0,0095 0,6327
Enterobacteriaceae Escherichia-Shigella 9,1685 10,6014 1
Enterobacteriaceae Enterobacter 0,0014 0,0011 1
Neisseriaceae Eikenella 0,0003 0 0,3506
Pseudomonadaceae Pseudomonas 0 0,0015 0,3506
Xanthobacteraceae Bradyrhizobium 0,0012 0,0002 1
CDI y P dentro del phylum Proteobacteria. En negrita se destacan las diferencias
Con respecto al phylum Actinobacteria, ya vimos que en la familia

Bifidobacteriaceae el género Bifidobacterium presenta una pérdida acentuada en el
grupo CDI (0.6245%) mientras que en el grupo P es más moderada (2.0626%) con
respecto a los controles sanos. Por consiguiente, se conserva en gran medida en el
grupo de los individuos colonizados por C. difficile. Asimismo, con respecto al
phylum Verucomicrobia y su familia Akkermansiaceae se observa que mientras
que en el grupo CDI se produce un moderado aumento de Akkermansia respecto a
los controles sanos, en el grupo P se produce una acentuada bajada (5.9% en CDI
frente a 1.3% en P).
261
Por consiguiente, a pesar de las diferencias vistas en ambos grupos a nivel
de género al respecto de los controles sanos, las diferencias con significación
estadística son muy escasas. Destacamos únicamente las siguientes:
 En Eubacterium nodatum Group, Clostridium innocuum Group del phylum
Firmicutes.
 En Paraprevotella del phylum Bacteroidetes.
Por ultimo, añadimos una figura para valorar visualmente diferencias

importantes en la composición a nivel de género de los 3 grupos de
estudio:
262
FIGURA 49: Diferencias más importantes en las abundancias relativas a nivel de género
en los grupos P, CTRL Y CDI. Grupo P en rojo, Grupo CTRL en amarillo y Grupo CDI en
azul.
263
VI-DISCUSIÓN
CAPÍTULO VI – DISCUSIÓN______________________________________________
CAPITULO VI. DISCUSIÓN.
6.1 ALFA DIVERSIDAD Y RIQUEZA EN LOS GRUPOS CDI Y P CON

RESPECTO A LOS CONTROLES SANOS.
Se evidencia una pérdida de alfa diversidad y riqueza en los grupos de

pacientes infectados por C. difficile y en los individuos colonizados con respecto al
grupo de controles sanos, a tenor de los resultados de las medias de los índices de
alfa diversidad de Shannon y Simpson, de los estimadores de riqueza CHAO1 y
ACE, y de las curvas de rarefacción (Figuras 26 a 33; Tablas 5 y 6), calculados
todos ellos para el rango taxonómico de género. Este hecho queda muy bien
reflejado en los respectivos diagramas de cajas (Figuras 26 a 29) de cada índice y
estimador. No obstante, entre los grupos CDI y P no existen diferencias
estadísticamente significativas en cuanto a la riqueza y alfa diversidad de su
respectiva microbiota intestinal. Hemos de remarcar que, en la mayor parte de
trabajos anteriores similares, al respecto del mismo punto, se han utilizado los
mismos índices y herramientas estadísticas usadas en el presente estudio.
Además, resulta destacable que las medianas observables en los diagramas de
cajas de los índices y estimadores anteriormente mencionados no difieren de las
medias.
La pérdida de alfa diversidad es un hallazgo obtenido muy frecuente en

los pacientes con CDI y este hecho concuerda con nuestros resultados, aunque
existen matices que debemos comentar. Chang y col. observaron ya en 2008 que la
alfa diversidad era muy baja y con diferencias estadísticamente significativas en 3
pacientes con CDI recurrente, con respecto a pacientes con CDI resuelta y 3
controles sanos, donde era normal. No obstante, en 4 pacientes con CDI de inicio
y en los controles sanos no se observaron diferencias estadísticamente
significativas, aunque los valores de alfa diversidad del grupo con CDI inicial
eran más bajos (Chang, 2008).
266
Estudios sobre la restauración de la microbiota intestinal en pacientes con
CDI sometidos a FMT como tratamiento, han mostrado la recuperación de la alfa
diversidad de forma posterior a dicho tratamiento. Weingarden y col. presentaron
que la alfa diversidad se recuperaba tras el FMT y que resultaba comparable a la
de los donantes de heces (Weingarden, 2014). No obstante, en un reciente trabajo
de Brown y col. también con una cohorte de pacientes con CDI sometidos a FMT,
se vio que, a los 4 meses de forma posterior al trasplante, la alfa diversidad
aumentaba, aunque sin llegar a los valores encontrados en los donantes de heces
(Brown, 2018).
En los trabajos de Antharam, Gu y Schubert, planteados de forma similar,

se estudiaron cohortes de pacientes con CDI (grupo CDI), con diarrea nosocomial
no debida a C. difficile (grupo CDN) y controles sanos. Se observó que ambos
grupos CDI y CDN presentaron una pérdida de alfa diversidad y riqueza
estadísticamente significativa con respecto al grupo de controles sanos, pero sin
diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos (Antharam, 2013;
Gu, 2016; Schubert, 2014). Por tanto, en pacientes con diarrea nosocomial no
debida a C. difficile también se observó una pérdida de alfa diversidad y riqueza,
de forma similar que en los pacientes con CDI y en individuos colonizados por C.
difficile de nuestro estudio. En nuestro trabajo el grupo de individuos colonizados
fue captado principalmente de la comunidad (87%; 13 de 15 sujetos). Aunque el
47% de estos individuos (7 de 15) presentaron diarrea en el momento de la
inclusión en el estudio (adquirida en la comunidad), se incluyeron en el grupo P
en base a que la diarrea se pudo atribuir a otra causa o bien porque se determinó
que la cepa causal de C. difficile era no toxigénica, por tanto, no causante de la
clínica. Usamos una definición exacta del estado de colonización (Furuya-
Kanamori, 2015), hecho que resulta difícil discernir de los estudios comentados al
respecto en este apartado. Es por lo cual que consideramos la cohorte de
individuos colonizados por C. difficile de naturaleza distinta a estas cohortes de
pacientes CDN. Por consiguiente, la pérdida de alfa diversidad y riqueza no es un
hallazgo que caracterice únicamente a los sujetos infectados o colonizados por C.
difficile, sino que lo hallamos en otras distintas situaciones.
267
Milani y col. mediante un enfoque similar a los trabajos anteriores
comentados, estudió la microbiota intestinal de tres cohortes de 25 pacientes
hospitalizados con CDI (grupo CDI), 29 pacientes hospitalizados que recibieron
administración antibiótica reciente (grupo AB+) y 30 pacientes hospitalizados que
no habían recibido administración antibiótica reciente (grupo AB-). En estos dos
últimos grupos los sujetos no presentaron ni diarrea ni clínica compatible con
enfermedad gastrointestinal. De forma similar a otros trabajos, el grupo CDI
presentó una alfa diversidad estadísticamente significativa con respecto al grupo
AB-, pero de forma llamativa el grupo AB+ presentó una diversidad similar el
grupo AB-, es decir que los pacientes que recibieron tratamiento antibiótico
presentaron similar alfa diversidad que aquellos que no lo recibieron (Milani,
2016), siendo la administración antibiótica una de las principales causas
reconocidas de disrupción de la microbiota intestinal (Kriss, 2018; Khanna,
2016b). El hecho que los pacientes de los grupos AB+ y AB- no presentaran clínica
resultaría un dato importante y nos podría sugerir este comportamiento más
homogéneo en cuanto a la alfa diversidad, a pesar de la administración antibiótica
en el grupo AB+.
Skraban y col. fueron un paso más allá cuando en un trabajo con 66

pacientes con CDI, 137 pacientes a los que se les había determinado la presencia
de C. difficile, debido a sospecha clínica o bien debido a la presencia de factores de
riesgo, con resultado negativo (Grupo CDI-) y 37 controles sanos, determinaron el
ribotipo y lo valoraron junto a las diferencias en alfa diversidad de la microbiota
intestinal de estos grupos. En primer lugar, observaron que muchos pacientes del
grupo CDI- presentaban la alfa diversidad disminuida como los pacientes con
CDI, con respecto a los controles sanos. Esto lo achacaron a que se trataba de
pacientes hospitalizados, muchos con diarrea y administración antibiótica previa.
En segundo lugar, observaron que la alfa diversidad era menor, y por tanto la
disbacteriosis más profunda, en aquellos pacientes donde se evidenciaron la
presencia de ribotipos considerados hipervirulentos como el 027. El ribotipo de la
cepa causal de los sujetos infectados y colonizados por C. difficile en nuestro
estudio no ha sido valorado, por tanto, desconocemos el efecto que tiene en
nuestros resultados. Skraban y col. concluyeron que la perdida de alfa diversidad
era un hecho común en los grupos CDI y CDI-, ya sean las muestras de heces
268
formes o líquidas, y que no necesariamente conecta solo con CDI, por tanto,
puede ser atribuible a otras causas (Skraban, 2013). En la misma línea, Lee y col.
en un trabajo prospectivo con pacientes sometidos a trasplante de médula ósea
que desarrollaron CDI, concluyeron que la pérdida de alfa diversidad no es un
factor de desarrollo inexcusable de CDI (Lee, 2017).
Los trabajos que han incorporado una cohorte de individuos colonizados

por C. difficile, como en nuestro estudio (donde hay 15 sujetos, 7 de ellos con
diarrea) han sido muy escasos, y esto es una de las razones por las cuales lo
hemos llevado a cabo. Zhang y col. evidenciaron resultados similares a los
nuestros en 8 portadores asintomáticos y en 8 pacientes con CDI estaba
disminuida con respecto a los controles sanos, donde observaron una pérdida de
alfa diversidad y riqueza con respecto a los controles, pero sin diferencias
estadísticamente significativas entre ellos (Zhang, 2015). Dong y col.
determinaron la tasa de colonización asintomática de C. difficile en la población
china. De 1709 individuos estudiados solo se detectaron 12 sujetos portadores
asintomáticos. Se observaron unos índices de alfa diversidad y riqueza que
indicaron una menor diversidad y riqueza en estos pacientes con presencia de C.
difficile, pero sin diferencias estadísticamente significativas con el resto de los
individuos sin evidencia de C. difficile en heces. Interesantemente, 9 de los 12
pacientes portadores asintomáticos tenían más de 65 años (Dong, 2018), ya que se
ha considerado que con la edad aumenta la tasa de colonización (Furuya-
Kanamori, 2015). Estos dos trabajos, junto al nuestro, apuntan a que los sujetos
colonizados en muchos casos van a presentar una pérdida de alfa diversidad y
riqueza, que podría verse agravada con la edad, por la presencia de diarrea
atribuible a otra causa no C. difficile, por la presencia de un ribotipo hipervirulento
de la cepa colonizante, administración antibiótica previa, duración de la
hospitalización y la presencia de comorbilidades.
Por consiguiente, en el presente estudio la perdida de alfa diversidad y

riqueza se observa tanto en pacientes con CDI como en individuos colonizados
por C. difficile, de forma coincidente a algunos trabajos anteriores. Esto nos
indicaría, como concluyeron otros autores, que la perdida de diversidad y riqueza
269
no supone de forma irremediable el desarrollo de CDI, ya que también se objetiva
en individuos colonizados.
Se ha considerado la administración de antibióticos como uno de los

principales desencadenantes de una disbacterosis con pérdida de alfa diversidad,
la cual es un factor de riesgo esencial de desarrollo de CDI (Khanna, 2016b). En
nuestro grupo de pacientes con CDI el 93% (14 de 15) había recibido antibióticos
en los 3 meses previos, principalmente cefalosporinas, beta-lactámicos y
fluorquinolonas, que están considerados de riesgo elevado. En los individuos
colonizados por C. difficile la tasa de administración antibiótica previa fue del 53%
(8 de 15) aunque en el 27% restante este dato fue desconocido (4 de 15). Por tanto,
tenemos una causa que explica en gran medida la perdida de alfa diversidad en
ambos grupos. Este dato lo desconocemos en los trabajos de Dong y Zhang, y es
posible que la discrepancia existente con el trabajo de Dong, en el que no se
encuentra una pérdida de alfa diversidad estadísticamente significativa en 12
individuos colonizados, sea debida a que no hayan recibido administración
antibiótica reciente, ya que se trata de individuos no hospitalizados provenientes
de la comunidad. Los factores de riesgo para una posible colonización en la
comunidad, a diferencia de los determinantes para el desarrollo de CDI, son algo
desconocidos. Los estudios epidemiológicos sobre colonización en la comunidad
no son muy amplios. La transmisión persona-persona parece ser importante ya
que se ha visto que individuos colonizados en la comunidad y sus familias o
personas cercanas presentan los mismos ribotipos (Kato, 2001).
El impacto de los antibióticos en la microbiota intestinal en el contexto de

la CDI o colonización por C. difficile depende de varios factores como su
mecanismo de acción, espectro de actividad, dosis y número de dosis recibidas,
vía de administración, farmacocinética y prevalencia local de las resistencias de C.
difficile. En principio cualquier antibiótico puede causar una disbacteriosis de
larga duración, pero existen unos antibióticos más disruptivos que otros y que se
asocian a un mayor riesgo de desarrollo de CDI. Históricamente, la clindamicina
ha sido el antibiótico mejor conocido como factor predisponente de CDI. Desde el
inicio del siglo XXI, las fluorquinolonas fueron también consideradas un factor de
riesgo de mucho peso. Asimismo, el riesgo va a aumentar en este caso a mayor
270
duración del tratamiento. Las cefalosporinas, macrólidos y beta-lactámicos
también son considerados como un factor de riesgo alto o moderado (Khanna,
2016b). Sea como fuere, los antibióticos son capaces de producir cambios
profundos y duraderos en la microbiota intestinal que tienen como consecuencia
reducciones de alfa diversidad y de riqueza (Antonopoulos, 2009), aunque como
vimos en el trabajo de Milani esto no se vea traducido en algunos casos en una
reducción significativa de alfa diversidad (Milani, 2016).
Existen otros factores, diferentes a la administración de antibióticos, que

pueden dar lugar a una pérdida de alfa diversidad, como son la edad avanzada,
enfermedad hepática, enfermedad inflamatoria intestinal y las hemopatías
malignas (Kriss, 2018). La presencia de estas situaciones se produjo en el 47% (7
de 15) de los pacientes del grupo CDI, mientras que no se observó en ninguno de
los individuos colonizados.
Otro hecho que hemos de tener en cuenta a la hora de valorar nuestros

resultados es que la microbiota intestinal, en el contexto de infección o
colonización por C. difficile en un ámbito hospitalario, está sometida a una
dinámica de cambios, que se refleja, entre otros aspectos, en su alfa diversidad y
riqueza. Este dato se ha obtenido de los escasos trabajos prospectivos realizados
al respecto, es decir, tomando muestras de los mismos individuos hospitalizados
a lo largo de un periodo de estancia hospitalaria (Lee, 2017; Vincent, 2016). Este
factor no ha sido constatado como significativo en individuos colonizados
provenientes de la comunidad, como la mayoría de los sujetos incluidos en el
grupo P del presente estudio (87%; 13 de 15), por tanto, no sabemos si este factor
podría influir en este grupo. Nuestra cohorte de pacientes con CDI proviene del
ámbito hospitalario en un 47% frente al restante 53% que proviene de la
comunidad, por tanto, sí que podría influir de alguna manera. El hecho que la
perdida de alfa diversidad en nuestros grupos CDI y P sea estadísticamente
significativa apoya que nuestros resultados sean compatibles con la realidad, a
pesar de que todos estos factores se debieran tener en cuenta para la valoración de
los resultados. No obstante, debemos seguir profundizando, mediante más
herramientas estadísticas, con el objetivo de valorar si existen factores que
271
expliquen la naturaleza del estado de portador de C. difficile y que mecanismos
podrían impedir su evolución a CDI.
6.2 ESTUDIO DE LA BETA DIVERSIDAD EN LOS GRUPOS CDI, P Y

CONTROLES SANOS.
Para el estudio de la beta diversidad de la microbiota intestinal de los

grupos de estudio hemos utilizado dos herramientas estadísticas como son el
índice de Jaccard y el análisis de agrupamiento basado en el Análisis Principal de
Componentes o PCoA. El rango taxonómico donde valoramos la beta diversidad,
al igual que con la alfa diversidad, fue el de género. Con esta información
describimos disimilitudes en la estructura de la microbiota intestinal de los
grupos de una forma global.
Se evidencia que los grupos CDI y P presentan una variabilidad

interindividual estadísticamente significativa mayor, por tanto, un índice de
Jaccard menor, que el grupo CTRL, pero sin diferencias entre ellos, a tenor de los
resultados de las medias de cada grupo del índice de Jaccard (Tabla 7). Es
destacable que la mediana del índice de Jaccard para el grupo CTRL es mayor que
la media, como podemos comprobar en el diagrama de cajas (Figura 34), por
tanto, consideramos este valor como más significativo que la media (0.45 frente
0.31). De cualquier manera, consideramos la variabilidad interindividual del
grupo de controles sanos como referencia.
Ciertamente pocos estudios han utilizado el índice de Jaccard para valorar

la beta diversidad de la microbiota intestinal existente entre sus cohortes de
individuos. No obstante, es una herramienta estadística sencilla que nos indica
que las muestras de los grupos CDI y P presentan una elevada variabilidad
interindividual. Este hecho es en parte compatible con que la estructura de la
microbiota intestinal es cambiante y está sujeta a cierta dinámica en individuos
infectados y colonizados por C. difficile en entornos hospitalarios, como
apuntamos en el apartado anterior (Lee, 2017; Vincent, 2016).
272
La segunda herramienta que utilizamos para valorar la beta diversidad de
la microbiota intestinal de nuestros grupos de estudio, por consiguiente, para
valorar si existen diferencias en su estructura, es el PCoA. Como dijimos en el
apartado 4.4.4 Análisis Principal de Componentes (Principal Component Analysis,
PCoA), el objetivo es valorar si existe algún factor que explique la mayor parte de
la variabilidad de los datos, ya que en este caso podrían ser interpretados de
forma sencilla y visual sin perder información relevante. El modelo PCoA que
partió de una matriz de datos basado en las abundancias relativas a nivel de
género no fue exitoso, puesto que la variabilidad explicada fue muy limitada. El
PC1 explicó una pobre variabilidad del 8.6% y el PC2 del 5.6%, por ello,
desechamos este modelo.
Recordemos que el PCoA basado en la distancia UniFrac o Análisis

UniFrac a diferencia del anterior, se basa en diferencias filogenéticas. La distancia
UniFrac entre 2 comunidades es la fracción de rama del árbol filogenético que
pertenece a una o a otra, pero no a ambas, por tanto, que es única para cada
comunidad. Esto es debido a que, a mayor similitud de secuencias, mayor
similitud evolutiva. Comunidades o cohortes de individuos similares,
presentaran una pequeña distancia UniFrac, mientras que comunidades
diferentes presentaran una gran distancia UniFrac (Lozupone, 2005). Las
modalidades UniFrac Weighted o Unweighted hacen referencia a si tiene o no tiene
en cuenta el modelo las abundancias relativas. La mayor parte de los estudios con
los que vamos a comparar nuestros resultados van a utilizar este modelo de
agrupamiento para valorar diferencias estructurales en la microbiota intestinal de
diferentes cohortes.
En el presente estudio el modelo que mejor expresa la mayor variabilidad

es el UniFrac Weighted. Presenta dos Componentes Principales, PC1 y PC2, que
explican una variabilidad del 42.60% y 14.95%. En el biplot observamos que la
microbiota intestinal de los grupos de pacientes con CDI e individuos colonizados
por C. difficile frente a los controles sanos tienen probables estructuras diferentes
puesto que se ubican en regiones diferentes. Esto es debido a que presentarían
composiciones diferentes a nivel de algunos de sus géneros. La variabilidad
parece ser mayor en los grupos CDI y P que en el grupo CTRL. Este dato
273
concuerda con el obtenido mediante el índice Jaccard. Asimismo, las muestras de
los individuos de los grupos CDI y P se solapan en dos clusters, por tanto, no
podemos diferenciarlos entre si. El grupo CTRL también presenta 3 muestras que
se solapan con los dos clusters anteriores comentados (Figura 37).
Comenzado con la comparativa de nuestros resultados con los de otros

autores, Zhang y col. en su estudio con cohortes de pacientes con CDI, individuos
colonizados asintomáticos por C. difficile y controles sanos, evaluaron la beta
diversidad usando un modelo PCoA basado en distancias UniFrac Unweighted.
Encontraron que los 3 grupos formaban clusters probablemente diferentes.
Aunque el autor no lo nombra yo considero, observado su biplot, que también hay
cierto solapamiento entre sus muestras CDI y P, como ocurre en nuestro estudio
(Figura 50). Además, de forma similar a la nuestra, llegaron a la conclusión que la
variación interindividual es mayor en los grupos de pacientes con CDI e
individuos colonizados que en el grupo de controles sanos. Por tanto, aunque
estos dos grupos presentaron una microbiota intestinal con alfa diversidad
disminuida con respecto a los controles sanos, pero sin diferencias significativas
entre ellos, la estructura de su microbiota intestinal es diferente (Zhang, 2015). Los
individuos de ambos grupos CDI y colonizados fueron incluidos desde el ámbito
hospitalario, por tanto, existe una mayor probabilidad en los portadores de una
mayor edad, mayor probabilidad de presencia de comorbilidades que alteren de
por si la estructura de la microbiota intestinal y de mayor probabilidad de
administración antibiótica.
274
FIGURA 50: PCoA basado en distancias UniFrac Unweighted de pacientes con CDI (CDI), individuos
colonizados asintomáticos (AS) y controles sanos (CT) en el estudio de Zhang y col. (Zhang, 2015).
En el reciente trabajo de Dong y col. en 2018 para evaluar la tasa de

colonización asintomática de C. difficile en población china, donde solo se
encontraron 12 portadores de 1709 sujetos de estudio, se realizó un PCoA basado
en distancias UniFrac Unweighted. Se evidenció un alto grado de solapamiento
entre los individuos colonizados por C. difficile y los controles sanos. No se pudo
discriminar diferencias estructurales entre ambos grupos, a diferencia de nuestros
resultados (Dong, 2018). Pensamos que estas discrepancias con nuestros
resultados podrían ser debidas a que los sujetos fueron incluidos desde la
comunidad, donde es probable que la colonización se haya producido persona-
persona, en ausencia de factores de riesgo clásicos, aunque hay que recordar que
9 de 12 de estos individuos colonizados tenían más de 65 años. Los autores del
trabajo en cierto modo coinciden con esta apreciación. Achacan que sus pacientes
colonizados no presentaban una microbiota intestinal alterada, a tenor de los
estudios de alfa diversidad y estructura basada en PCoA, en base a factores
275
dependientes del hospedador, como un estado inmune íntegro y la no presencia
de comorbilidades que pudieran afectar la integridad de la microbiota intestinal.
Esto podría explicar potencialmente las diferencias encontradas entre estos
individuos colonizados provenientes de la comunidad, y otras cohortes de
individuos colonizados provenientes de hospital y/o de hospital y comunidad,
como los sujetos de nuestro trabajo y el de Zhang.
En los estudios donde se ha procurado comprobar la recuperación de la

integridad de la microbiota intestinal en pacientes con CDI sometidos a un FMT,
se ha visto mediante PCoA basado en distancias UniFrac Unweighted, que las
muestras “post FMT” presentaron una estructura más relacionada con la de los
donantes sanos que con las previas al FMT (Figura 51). Por tanto, el FMT
recuperó la estructura de la microbiota intestinal de los pacientes con CDI hacia la
de los donantes, que se supone que es una microbiota sana, diversa y con los
mecanismos de resistencia a la colonización intacta (Brown, 2018). Los trabajos de
Weingarden al respecto coinciden con el Brown y también han mostrado
mediante análisis PCoA basados en distancias UniFrac que las muestras “post
FMT” y de donantes, forman un cluster diferente al de las muestras previas al
FMT (Weingarden, 2014).
276
FIGURA 51: PCoA basado en distancias UniFrac Unweighted de pacientes con CDI (Grupo R,
triangulo), pacientes con CDI sometidos a FMT (Grupo RF, círculo) y donantes sanos (Grupo D,
cuadrado) en el estudio de Brown y col. (Brown, 2018).
En el estudio de Skraban y col. que, recordemos, estuvo formado por 3

cohortes de 66 pacientes con CDI, 137 pacientes con sospecha de CDI o presencia
de factores de riesgo para CDI pero con prueba negativa para la determinación de
C. difícille (Grupo CDI-) y 37 controles sanos, realizaron un PCoA basado en una
matriz de abundancias relativas de grupos de bacterias dominantes, pero
partiendo de 7 grupos en función del origen de la muestra (muestra de rutina/
control sano), apariencia de las muestras de heces (líquida/forme) y C. difficile
Estatus (Negativo/Positivo Ribotipo 027/ Positivo Ribotipo No 027). Todos los
subgrupos mostraron una gran dispersión, particularmente las muestras
rutinarias a las que se les había solicitado pruebas para determinar la presencia de
C. difficile (se supone que provendrían de pacientes con diarrea o con factores de
riesgo para el desarrollo de CDI), es decir, hubo solapamiento con los controles
sanos, aunque se advirtieron diferencias estadísticamente significativas en los
centros de gravedad de los diferentes clusters. Este hecho se reprodujo de forma
277
similar en los otros subgrupos (Apariencia y C. difficile Estatus), por tanto, se pudo
considerar que la división fue adecuada (Skraban, 2016). Este hecho, supone que
la estructura de la microbiota intestinal podría ser variable en función del ribotipo
de la cepa causal y ser un factor de variabilidad interindividual que debemos
tener en cuenta que podría explicar en parte ciertas diferencias encontradas, por
ejemplo, entre nuestros resultados y los de Dong.
Gu y col. en su trabajo con pacientes con CDI (grupo CDI), con diarrea
nosocomial no CDI (grupo CDN) y controles sanos observaron mediante análisis
PCoA que las muestras del grupo CDI se diferenciaban del grupo CDN, aunque
algunas muestras del primer grupo se solapaban con las del segundo. A pesar de
observarse una gran variabilidad interindividual, el grupo de los controles sanos
también pudo diferenciarse del grupo de pacientes con CDI (Gu, 2016). Estos
datos son interesantes porque nos indicarían que los pacientes con diarrea
nosocomial no debida a C. difficile podrían presentar una estructura diferente a la
de los pacientes con CDI, es decir, diferente alteración de la integridad de la
microbiota intestinal.
Milani y col. con 3 cohortes constituidas por pacientes con CDI, individuos
con administración antibiótica reciente (grupo AB+) e individuos sin
administración antibiótica reciente (grupo AB-), en ausencia de diarrea o
enfermedad gastrointestinal en estos dos últimos grupos, observaron mediante
PCoA en base a una matriz UniFrac Unweighted, que los grupos AB+ y AB-
formaban un cluster diferente al grupo CDI, a pesar de la elevada variabilidad
interindividual de estos dos grupos (Figura 52). Es destacable que el grupo CDI
presentó incluso mayor variabilidad interindividual que el cluster formado por
AB+ y AB- (Milani, 2016). En un trabajo similar Sangster y col. con dos grupos de
12 pacientes con CDI y 12 pacientes con diarrea nosocomial no CDI, ambos
hospitalizados, también encontró mediante análisis PCoA UniFrac Weighted
disimilitudes entre los grupos (Sangster, 2016). Todos estos datos indicarían que
la estructura de la microbiota intestinal de los individuos que hubieran recibido o
no administración antibiótica presentaría menos disimilitudes en ausencia de
diarrea u otros síntomas gastrointestinales.
278
FIGURA 52: PCoA basado en distancias UniFrac Unweighted en pacientes con CDI (Grupo CDI,
círculo azul), con administración antibiótica previa sin clínica (Grupo AB+, cuadrado verde) y sin
administración antibiótica previa sin clínica (Grupo AB-, triangulo rojo) en el estudio de Milani y
col. (Milani ,2016).
Por tanto, nuestros datos apuntan a que claramente la estructura de la

microbiota intestinal de los pacientes con CDI y de los individuos colonizados por
C. difficile es diferente a la de los controles sanos. Mediante herramientas
estadísticas de agrupamiento como el modelo PCoA basado en distancias
UniFrac, no podemos afirmar que la estructura de los grupos P y CDI sea
notablemente diferente, ya que muestras de ambos grupos se solapan. Al igual
que con el hallazgo de la pérdida de alfa diversidad en ambos grupos, donde no
hallamos diferencias estadísticamente significativas, tampoco podríamos usar la
beta diversidad como elemento diferenciador notorio del estado de colonización e
infección por C. difficile. La clave podría estar en combinaciones de géneros que
mediante interacciones metabólicas con C. difficile creen un ambiente intestinal
propicio para la inhibición de la germinación de las esporas, producción de
279
toxinas, etc de este germen en los individuos colonizados. Estas alteraciones en la
composición entre los grupos CDI y P podrían caracterizarse mediante el estudio
de la composición en abundancias relativas a diferentes rangos taxonómicos.
Estas posibles diferencias en la composición serán analizadas en el apartado
siguiente.
6.3 DIFERENCIAS EN LA COMPOSICIÓN MEDIANTE EL ESTUDIO DE LAS

ABUNDANCIAS RELATIVAS ENTRE LOS GRUPOS CDI, P Y CTRL A
DIFERENTES RANGOS TAXONÓMICOS.
6.3.1. Diferencias de composición a nivel de phylum.
6.3.1.1 Diferencias de composición a nivel de phylum entre los grupos CDI y

CTRL.
Si recapitulamos los resultados llegados a este punto del estudio tenemos

que los grupos de pacientes con CDI y los individuos colonizados por C. difficile,
presentan una microbiota intestinal con una alfa diversidad y riqueza reducida
con respecto al grupo de controles sanos. Asimismo, mediante el análisis de
agrupamiento, aplicando un modelo UniFrac, podemos distinguir que la
estructura de la microbiota intestinal de los grupos CDI y P es diferente a la del
grupo CTRL, produciéndose un cierto solapamiento entre las muestras de los
mismos grupos CDI y P. Además, mediante el índice de beta diversidad de
Jaccard observamos que los grupos CDI y P presentan una mayor variabilidad
interindividual que el grupo CTRL. En el presente apartado comenzamos a
valorar las diferencias en cuanto a la composición de los diferentes componentes
de la microbiota intestinal de los 3 grupos de estudio en el rango taxonómico de
phylum. La comparativa de los pacientes con CDI con respecto a los controles
sanos muestra diferencias notables entre ambos grupos.
Las alteraciones más destacables que encontramos en los pacientes con

CDI con respecto al grupo CTRL fueron las siguientes:
 Reducción estadísticamente significativa de Firmicutes (38.5% en CDI
280
 Aumento estadísticamente significativo de Bacteroidetes (39.7% en CDI
frente a 19.6% em CTRL).
 Aumento estadísticamente significativo de Proteobacteria (14.4% en CDI
Otras alteraciones de interés, pero no significativas y concernientes a

grupos minoritarios fueron las siguientes:
 Aumento de Verrucomicrobia (6.0% em CDI frente a 4.7% em CTRL).
 Disminución de Actinobacteria (1.2% en CDI frente a 4.6% en CTRL).
Las diferencias detectadas en el resto de phylum no las consideramos

debido a que presentaron abundancias relativas muy escasas (por debajo del 0.2%
en cualquier caso). En la comparativa no entraron las bacterias Archae
metanógenas y los hongos filamentosos que, si bien tienen su importancia en la
relación entre microbiota intestinal y salud, se escapan a la secuenciación del
ADNr 16S (Sangster, 2016).
En primer lugar, debemos explicar que tomamos como referencia la

microbiota intestinal del grupo de los controles sanos, ya que recogemos que se
trata de individuos sin factores presentes que disturben su microbiota intestinal.
En este grupo la microbiota intestinal está compuesta por 2 phylum principales
como son Firmicutes y Bacteroidetes, y por una serie de phylum minoritarios como
Verrucomicrobia, Fusobacteria, Actinobacteria y ocasionalmente Proteobacteria.
Estos datos concuerdan con lo esperado en función de la amplia bibliografía al
respecto de la composición a nivel de phylum de una microbiota intestinal intacta
(Mariat, 2009), a pesar de las variaciones individuales existentes en cuanto a la
composición de esta. Asumiendo la posibilidad de estas variaciones encontradas
en la población general, se ha visto que las interrelaciones metabólicas
permanecen estables, puesto que la microbiota intestinal es un ecosistema
dinámico que ejerce funciones metabólicas, fisiológicas, inmunológicas y de
protección frente a patógenos (Hollister, 2014). Por tanto, podemos hablar de la
existencia de un core funcional y concluimos que tomamos como nuestra
referencia la microbiota intestinal del grupo CTRL.
281
Comenzando con la comparativa de nuestros resultados con estudios
anteriores similares, observamos que en trabajos donde se comparó la microbiota
intestinal de pacientes con CDI, anterior y posteriormente a un FMT, se encontró
que los cambios en la alfa y beta diversidad después del FMT se relacionaron con
unos drásticos cambios en la composición a nivel de phylum, principalmente en
Firmicutes, Bacteriodetes y Proteobacteria (Weingarden, 2014; Shahinas, 2012).
Tanto en Bacteroidetes como en Firmicutes se observó una llamativa reducción en
su composición en los pacientes con CDI con respecto a los donantes de heces. La
pérdida de estos grupos se recuperó con el FMT, de forma que en los pacientes
“post FMT” sus abundancias relativas fueron similares a las de los donantes (80-
90% de las OTUs). Con respecto a Proteobacteria, se trató de un phylum
minoritario en los donantes (<2%), sin embargo, fue dominante en las muestras
“pre FMT”, para que después del FMT disminuyera drásticamente, pero sin llegar
a las abundancias relativas tan bajas encontradas en los donantes (Weingarden,
2014). De esta forma se comprueba que el FMT restaura casi de forma total la
microbiota intestinal de los pacientes con CDI que retorna a una composición
similar a la de los donantes, que en este caso son considerados como controles
sanos. Por tanto, podemos considerar que los datos que encontramos en estos
estudios fueron similares a los nuestros. En primer lugar, también podemos
concluir que las diferencias con respecto a alfa y beta diversidad y riqueza que
encontramos en los pacientes con CDI con respecto al grupo CTRL se deben a las
drásticas diferencias en la composición a nivel de phylum. Nuestros datos apuntan
a una drástica disminución de Firmicutes (38.5% en CDI frente a 66.9% en CTRL)
y a un aumento de Proteobacteria (14.4% en CDI frente a 3.8% en CTRL), como se
obtuvo en los estudios anteriores (Weingarden, 2014; Shahinas, 2012). Por el
contrario, se observa un aumento en Bacteroidetes (39.7% en CDI frente a 19.6%
en CTRL). Tanto en los trabajos de Weingarden y col. como en el de Shahinas y
col. las muestras “pre FMT” presentaron una disminución de Bacteriodetes con
respecto a los donantes, que después se recuperó con el FMT, por tanto, este dato
supone un hallazgo diferente al de nuestro estudio. Al respecto de este hecho, en
primer lugar, no hay que perder perspectiva de que estamos valorando las
diferencias en cuanto a composición mediante abundancias relativas, y esto
supone que haya unos sesgos que hemos de tener en cuenta, y que podría dar
lugar a la explicación del hecho de que en nuestro estudio se observe un aumento
282
de Bacteriodetes en los pacientes con CDI. Si supusiésemos que la perdida de
riqueza en este grupo fue debida principalmente a expensas del phylum
Firmicutes (debido a la administración antibiótica previa), el aumento de
Bacteroidetes podría ser un artefacto debido al uso de abundancias relativas y no
de abundancias absolutas puesto que no determinamos la carga total bacteriana
en heces. Otra explicación posible, ligada a la anterior, es que nuestra cohorte de
controles sanos presenta una abundancia relativa media de Bacteroidetes del
19.6%, “más reducida de lo habitual”, y de Firmicutes del 66.9%, “más abundante
de lo habitual”. Aunque ambos phylum sumen más del 80%, como suele ocurrir en
una microbiota intestinal sana, sí que parece que está algo desnivelada, aunque
esto no suponga que sea una microbiota disruptiva, ya que presenta elevada
riqueza y alfa diversidad. Como ya hemos visto existe una variabilidad
interindividual en cuanto a la composición, aunque se conserve el core funcional,
y bien podría ser este caso, aunque normalmente el phylum Bacteroidetes suele
abarcar la mitad o más de la microbiota intestinal total (Human Microbiome
Project Consortium, 2012). También hay que comentar que en los estudios “pre y
post FMT” anteriores los casos de CDI fueron recurrentes, y en nuestro estudio
solo dos casos de CDI fueron recurrencias. La CDI recurrente se ha asociado a un
grado más profundo de disbacteriosis (Chang, 2008), con una perdida de alfa
diversidad más pronunciada, por tanto, los pacientes de los estudios anteriores
podrían haber perdido cantidades de Bacteroidetes y Firmicutes de forma más
implícita. Con respecto al phylum Proteobacteria en nuestro estudio también se
observa un aumento en el grupo de pacientes con CDI con respecto al grupo de
controles sanos (14.4% en CDI frente a 3.8% en CTRL), mucho menor a la hallada
en el estudio de Weingarden y col. donde 13 de 14 muestras de pacientes con CDI
presentaron una abundancia relativa mayor al 90% (Weingarden, 2014). Este dato
también apunta, enlazando con lo explicado anteriormente, a que la explicación
del aumento de Bacteroidetes en el grupo CDI en nuestro estudio pudiera ser
debido a una drástica disminución de Firmicutes y a un aumento no tan
pronunciado de Proteobacteria. Siguiendo con otros phylum minoritarios, pero de
funciones importantes como son Actinobacteria y Verrucomicrobia, nuestros
datos concuerdan con los de este tipo de estudios. Aquí, la pérdida de
Actinobacteria en pacientes con CDI “pre FMT” se restauró y se igualó a la de los
donantes y el aumento de Verrucomicrobia previo al FMT no se observó de forma
283
posterior, al igual que no se observó en los donantes de heces. En nuestro estudio
se observa en los pacientes con CDI los mismos resultados que en las
anteriormente comentadas muestras “pre FMT” y la restauración hacia una
microbiota intestinal normal similar a la de los donantes de heces, nos indica su
importancia funcional. Es destacable que las diferencias de nuestras medias en el
grupo CDI con respecto al CTRL para estos 2 phylum no fueron estadísticamente
significativas. Aún así, podemos decir que apuntan a su importancia en la
patogénesis de la CDI y su relación con la microbiota intestinal.
En apartados posteriores entraremos en detalle en los mecanismos que

podrían subyacer bajo el FMT para que genere la curación de la CDI con esa
elevada tasa de éxito (Brandt, 2012). Estos mecanismos, aunque no son objeto del
presente estudio nos serán útiles para sentar las bases sobre la patogénesis de la
CDI y la inhibición de ciertos procesos que podrían explicar, al menos en parte, la
ausencia de clínica en sujetos colonizados por C. difficile.
Lee y col. estudiaron de forma prospectiva 234 casos de pacientes con

trasplante reciente de médula ósea que recibieron terapia antibiótica profiláctica y
de los cuales 53 desarrollaron CDI, e identificaron al comparar la microbiota
intestinal de estos con los que no desarrollaron CDI, al phylum Bacteroidetes y las
familias Lachnospiraceae y Ruminococcaceae del phylum Firmicutes, como
protectores al desarrollo de CDI de forma conjunta (Lee, 2017). Este dato apunta
hacia la importancia de forma general del phylum Bacteroidetes al respecto de que
es un grupo que impediría o favorecería el no desarrollo de CDI desde un estado
de elevado riesgo como inmunodeficiencia, comorbilidades asociadas presentes y
terapia antibiótica reciente. Por tanto, resultaría lógico extrapolar este dato al
respecto de la búsqueda de cambios en la microbiota intestinal de pacientes con
CDI e individuos colonizados que es objetivo principal del presente estudio. Pero,
nuestros resultados muestran que el grupo CDI presenta un aumento de
Bacteroidetes estadísticamente significativo con respecto al grupo CTRL, y
aunque anteriormente hemos mencionado posibles causas a este hallazgo resulta
difícil justificar o formular hipótesis de su relación con el desarrollo de CDI con
nuestros resultados. Además, aparte del trabajo de Lee y col existen variados
trabajos donde también se ha evidenciado que el phylum Bacteroidetes y la
284
reducción en su abundancia relativa se asocia a CDI (Zhang, 2015; Gu, 2015;
Manges, 2010). Aunque más adelante profundizaremos en las funciones e
interrelacionas metabólicas e inmunológicas de todos los phylum importantes y su
relación con los cambios observados en el presente estudio entre los grupos CDI y
CTRL, podemos adelantar que el phylum Bacteroidetes es un reconocido miembro
asociado con la salud y que contribuye, entre otras funciones al desarrollo del
sistema inmune de la mucosa intestinal (Lee, 2013).
El phylum Bacteroidetes es fenotípicamente muy diverso. Engloba a bacilos

o cocobacilos Gram negativos, no productores de esporas y mayoritariamente
anaerobios estrictos. Está constituido en 4 clases, siendo Bacteroidia la más
relevante respecto a la microbiota intestinal. Esta clase solo presenta el orden
Bacteriodales, siendo el género Bacteroides de la familia Bacteroidaceae el género
tipo. Particularmente el género Bacteroides engloba a bacilos Gram negativos de
extremos redondeados, anaerobios estrictos, principalmente sacarolíticos, aunque
muy débilmente proteolíticos, cuyos productos de fermentación principales son el
succinato y el acetato (Bergey´s Manual of Systematic Bactereology, 2012). Los
géneros predominantes de la microbiota intestinal humana del phylum
Bacteroidetes son Bacteroides, Prevotella y Porphyromonas, aunque Alistipes y
Parabacteroides también son importantes. Bacteroidetes presenta un genoma con
una gran capacidad de procesar polisacáridos puesto que, en comparación con
otros phylum, codifica a un gran número de CAZYmes (Carbohidrate-Active
Enzymes), como glicosil transferasas, glicósido hidrolasas y polisacárido liasas que
actúan a nivel del catabolismo de los carbohidratos provenientes de la dieta o de
los glicanos de la mucosa intestinal (El Kaoutari, 2013). Estos genes se localizan en
los llamados PULs (Polysaccharide Utilization Loci) del cromosoma bacteriano. Los
PULs codifican complejos protéicos situados en la membrana externa bacteriana
llamados “Starch Utilization Like Systems”, compuestos por diversas proteínas que
atrapan, degradan e importan una variedad de glicanos (Tuson, 2018). Los
miembros del phylum Bacteroidetes presentan una docena de PULs distintos que
les permite adaptarse de forma rápida a cambios en la disponibilidad de estos
nutrientes en el intestino. Además, pueden competir con otras bacterias por los
polisacáridos de la dieta. Al tratarse de un phylum vasto y adaptable a condiciones
ambientales, las abundancias que encontramos en diferentes poblaciones pueden
285
ser variables y esto ha impedido que se haya podido relacionar de forma clara con
ciertas situaciones patológicas (Johnson, 2017). Por tanto, Bacteroidetes y su
notoria presencia en la microbiota intestinal resultaria potencialmente beneficiosa
para la salud en este aspecto, debido a que aporta enzimas específicos de la
degradación de polisacáridos, y es capaz de completementar la dotación
enzimática de nuestras células eucariotas para la degradación de carbohidratos no
digeribles (fibra), también llamados MACs (Microbiota Accessible Carbohydrates). Es
recalcable que en ausencia de MACs los miembros de la microbiota intestinal
comienzan a aumentar el consumo del mucus intestinal.
Revisado el phylum Bacteroidetes hemos de añadir que uno de los

mecanismos de resistencia a la colonización esencial que se perdería en la CDI, es
la competencia por los nutrientes. Una microbiota intestinal sana, rica y diversa
provocaría que los patógenos oportunistas, como C. difficile, dispongan de
limitados nutrientes y la elevada densidad microbiota jugaría un papel protector
al ocupar nichos ecológicos. La disbacteriosis que genera la administración
antibiótica junto con otros factores de riesgo, altera las fuentes de nutrientes de
dos formas. Esto supone un cambio en la dinámica de la interacción microbiota-
patógeno. Al reducirse la diversidad disminuye la competición por los nutrientes
y permite que C. difficile se asiente en nichos ecológicos antes no permitidos.
Además, debido a la lisis celular bacteriana se liberan nutrientes que la microbiota
intestinal remanente puede consumir. La teórica pérdida de Bacteroidetes en los
pacientes con CDI encontrada en varios estudios, aunque no en el nuestro dónde
observamos un aumento, daría lugar a una perdida de mecanismos de resistencia
a la colonización relacionados con la competición de nutrientes debido a su
importante papel en la degradación de carbohidratos no digeribles. Realmente
hay pocos trabajos sobre el metabolismo de C. difficile y su obtención de energía a
partir de nutrientes, no obstante, se ha observado en un modelo murino que C.
difficile es capaz de degradar la mucina intestinal y utilizar los ácidos siálicos,
monosacáridos componente de esta, como fuente de energía (Ng, 2013). Esto le
permitiría expandirse en el intestino del hospedador y ocupar el nicho ecológico
que habría quedado vacante. La disponibilidad de los ácidos siálicos de la mucosa
intestinal que ocurre tras una disbacteriosis permitiría y sería un factor
importante en la expansión de C. difficile y debido a la gran actividad sobre los
286
carbohidratos, la pérdida del phylum Bacteroidetes resultaría clave. El incremento
transitorio postantibiótico de estos monosacáridos liberados desde la mucosa
intestinal proporciona una oportunidad de expansión para C. difficile.
Por otro lado, la teórica pérdida (pero recordemos, no observada en

nuestro estudio) de Bacteroidetes en los pacientes de CDI también afecta al
sistema inmune, puesto que miembros de este phylum tienen la capacidad de
activar las células dendríticas intestinales que inducen a las células plasmáticas de
la mucosa intestinal a secretar IgA, que es una vía de defensa innata frente a
patógenos oportunistas como C. difficile (He, 2007).
El phylum Firmicutes engloba a las bacterias mayormente Gram positivas,

ya que todos sus miembros presentan una pared celular amplia y rígida, aunque
existen familias Gram negativas como Veilloneaceae. Se compone de 26 familias y
223 géneros. Es un phylum fenotípicamente muy diverso. La morfología de sus
miembros puede ser esférica, filamentosa, bacilar de extremos romos. Puede
presentar o no flagelos y pueden presentar o no la capacidad de formar esporas.
Pueden ser gérmenes aerobios, anaerobios o facultativos y la mayoría son
quimiorganotrofos. Comprende a las clases Bacilli, Clostridia y Erysipelotricha,
siendo las dos primeras las más importantes como miembros de la microbiota
intestinal. La clase Bacilli engloba 2 órdenes, Bacillales y Lactobacillales. La clase
Clostridia engloba a los Clostridiales y otros órdenes de menor relevancia en
nuestro estudio. La clase Erysipelotricha solo engloba a la familia
Erysipelotrichaceae, de menor relevancia en la microbiota intestinal (Bergey´s
Manual of Systematic Bactereology, 2012). Firmicutes es junto a Bacteoridetes el
phylum más abundante en una microbiota intestinal sana y saludable. Nuestros
resultados nos muestran una dramática reducción en los pacientes con CDI con
respecto a los controles sanos. Este hallazgo ya había sido corroborado por otros
autores (Weingarden, 2014; Shahinas 2012; Zhang, 2015; Gu, 2015, Manges, 2010).
Es por lo cual que al phylum Firmicutes se le ha otorgado un papel preponderante
y clave en la patogénesis del desarrollo de la CDI, especialmente al orden
Clostridiales. Como hemos visto anteriormente el phylum Bacteroidetes juega un
papel principal en la digestión y metabolismo de componentes de la dieta
indigeribles como la fibra y otros polisacáridos, pero también Firmicutes, ya que
287
participa de forma preponderante en la fermentación anaerobia. La fermentación
colónica anaerobia es un proceso donde carbohidratos, proteínas, polifenoles y
residuos derivados del hospedador provenientes o de la mucosa intestinal son
metabolizados en una gran variedad de productos finales. Es una vía metabólica
que permite a la bacteria mantener sus funciones celulares y obtener energía. Los
productos obtenidos pueden ser AGCC, metabolitos proteicos (compuestos
fenólicos, compuestos nitrogenados, compuestos sulfurados) y gases, que pueden
interactuar con las células epiteliales e influir en sus funciones. Después de su
absorción pueden producir incluso efectos sistémicos. Los Clostridiales incluyen a
las principales familias productoras de AGCC. Su importante depleción en los
pacientes con CDI provocaría que se hayan corrompido ciertos mecanismos de
resistencia a la colonización. Dentro de los AGCC generados a partir de
monosacáridos tenemos al acetato, propionato y butirato. Hemos de recalcar que
su síntesis a nivel intestinal solo es producto de la fermentación anaeróbica
bacteriana. Los AGCC (principalmente el butirato) son la principal fuente de
energía de los colonocitos, ya que son absorbidos y oxidados. Esto provocaría de
forma directa una disminución de la carga osmótica en el colon debido a
carbohidratos no digeribles previniendo una diarrea osmótica. Por otra parte, los
AGCC son los principales aniones en el intestino grueso y son los responsables de
la caída del pH desde el íleo hasta el colon proximal. A partir del colon distal los
AGCC decaen y se incrementa el pH. Esto es importante ya que el pH ácido
impide la proliferación de patógenos oportunistas sensibles e inactiva ciertos
enzimas microbianos. El aspecto más importante es que los AGCC, en especial el
butirato, presentan efectos antiinflamatorios al regular la secreción de citocinas
proinflamatorias en diferentes células inmunes intestinales, siendo este
mecanismo dependiente del tipo de célula inmune en cuestión. Uno de los
mecanismos principales que son capaces de realizar el butirato y el propionato,
pero no el acetato, son las modificaciones epigenéticas, es decir la modulación de
la expresión génica, como son la acetilación de las histonas. La acetilación de los
residuos de lisina de las histonas facilita el acceso de los factores de transcripción
a la región promotora, lo que supone la activación del gen. Las histona-
diacetilasas eliminan estos grupos acetilo, permitiendo que las histonas sostengan
el ADN más firmemente. Los AGCC mencionados son inhibidores de las histonas
diacetilasas, lo que supone una hiperacetilación de las histonas que afecta a la
288
expresión de los genes. Dependiendo del tipo de célula, la inhibición de las
histonas diacetilasas provoca supresión de la proliferación celular, inducción de la
diferenciación celular y bloqueo del ciclo celular (Wu, 2012). Por otra parte, los
AGCC son considerados unas importantes señales químicas que genera la
microbiota intestinal capaces de interactuar con receptores de las células
epiteliales intestinales como el FFA2 y FFA3 (Free Faty Acid Receptor). El receptor
FFA2 está ampliamente distribuido en los diferentes tipos de células inmunes
intestinales y este dato ya nos indica el papel de los AGCC en la regulación de la
respuesta inmune. Su activación en este caso conduce a una rápida producción de
citocinas protectoras (Masui, 2013). Asimismo, el butirato disminuye la actividad
del factor de transcripción NF-κB (Nuclear Factor Kappa B) que participa en la
regulación de la expresión de los genes de algunas citocinas como el TNF-α,
mediante un mecanismo no dependiente de las histona-diacetilasas. También se
ha visto que en macrófagos estimulados con lipopolisacárido el butirato reduce
significativamente las concentraciones de las citocinas proinflamatorias TNF-α,
TNF-β, IL-1β y IL-6 (Segain, 2000). Otro estudio más reciente ha confirmado la
disminución de mediadores proinflamatorios como la IL-6, IL-12 y NO en
macrófagos intestinales de la lámina propia intestinal (Chang, 2014). Al respecto
de la inmunidad humoral, los Clostridiales promueven el desarrollo de las células
plasmáticas secretoras de IgA (Umesaki, 1999). Con respecto a la respuesta
inmune adaptativa, algunos estudios han evidenciado el papel importante de la
influencia de los AGCC en los linfocitos T reguladores. Para entender este dato
hay que explicar que los linfocitos T son activados por antígenos procesados
unidos a receptores del complejo mayor de histocompatibilidad de las células
presentadoras de antígenos. Los linfocitos T que se ubican en la lámina propia de
la mucosa intestinal puede presentar un efecto citotóxico (Linfocitos T CD8) o
bien secretar citocinas y actuar en el control de la respuesta inmune adaptativa
(Linfocitos CD4). La microbiota intestinal está constantemente produciendo
antígenos que podrían promover una fuerte respuesta inmune en los linfocitos T.
Por tanto, se requiere un control muy fino que debe determinar cuándo se debe
producir una fuerte respuesta para contrarrestar patógenos oportunistas, y
cuando esta se debe inhibir si el antígeno proviene de miembros de la microbiota
intestinal comensales o beneficiosos. Esto se consigue mediante la regulación de
las subpoblaciones de los linfocitos T. El mantenimiento de un equilibrio entre
289
linfocitos Th1, Th2 y Th17 es esencial y está controlado de forma estricta por la
subpoblación de linfocitos T reguladores mediante contacto directo, o bien
mediante la secreción de citocinas como el TGF-β, IL-10 y IL-35. Los AGCC
inducen la expansión y función a los linfocitos T reguladores (Smith, 2013). Todos
estos datos nos conducen a que la drástica perdida de Firmicutes en los pacientes
con CDI, provoca una depleción de las principales familias butirogénicas, que a
su vez conlleva una disbacteriosis disfuncional, un riesgo de infecciones
oportunistas, un aumento del stress oxidativo y la formación de un ambiente
proinflamatorio (Moreno-Indias, 2014). Todos estos aspectos son influyentes en la
patogénesis de la CDI.
Enlazando con el párrafo anterior, como ya introdujimos en el marco

teórico, la respuesta inmune que se produce durante la CDI puede adoptar un rol
protector, pero también un rol patógenico. El reclutamiento de neutrófilos es
esencial para combatir la infección, pero también puede exacerbar la severidad de
la enfermedad ya que puede conducir a un daño tisular y a la formación de colitis
pseudomembranosa. Algunas de las acciones que generan las toxinas de C.
difficile son la secreción de fluidos a la luz intestinal, la secreción de citocinas
proinflamatorias provenientes de diversas células inmunes intestinales y la
activación de la degranulación de mastocitos, generando una respuesta inmune
exacerbada. Es por lo que se considera que una respuesta inflamatoria intacta es
beneficiosa para combatir y resolver la infección sin generar clínica. En este
aspecto, como hemos visto, la depleción del phylum Firmicutes influencia la
respuesta de las células inmunes en el intestino y podría contribuir a la severidad
de la CDI. La influencia de los AGCC sobre los linfocitos T reguladores es el
mecanismo clave, ya que produce una disminución de linfocitos Th17, cuya
activación genera granulopoyesis y reclutamiento de los neutrófilos en el lugar de
la infección (Buonomo, 2016).
El phylum Protebacteria está compuesto por bacterias Gram negativas y se

constituye en 5 clases, siendo Gammaproteobacteria la más importante en
relación con la microbiota intestinal, ya que engloba, entre otros ordenes, el de los
Enterobacteriales. Dentro de este orden se engloba la familia Enterobacteriacea,
que es la principal familia de la microbiota intestinal que tiene relevancia en los
290
pacientes de los grupos CDI y P, como veremos en el apartado siguiente. Los
miembros de la familia Enterobacteriacea son bacilos o cocobacilos Gram
negativos, móviles o inmóviles y no formadores de esporas. Pueden crecer en
presencia y ausencia de oxígeno, por tanto, son aerobios-anaerobios facultativos
en su mayoría. Son quimiorganotrofos, pudiendo presentar capacidad metabólica
fermentativa o respiratoria. Durante la fermentación de la glucosa, otros
carbohidratos y polialcoholes, generan ácidos y gases. La mayoría tienen la
capacidad de reducir el nitrato en nitrito. La familia Enterobacteriacea engloba a
muchos géneros con heterogeneidad en cuanto a su genética y metabolismo, lo
que le concede heterogeneidad en su ecología y capacidad patógena en el ser
humano. Además, presenta una gran capacidad y frecuencia de intercambio
genético entre miembros del mismo género o similares, aspecto que le podría
suponer ventajas selectivas en ciertos casos (Bergey´s Manual of Systematic
Bactereology, 2012).
La expansión del phylum Proteobacteria es hallazgo común en los

pacientes con CDI. La ausencia o baja presencia en los controles sanos es también
un hallazgo común. Esto ha sido corroborado por múltiples trabajos anteriores
(Manges, 2010; Gu, 2015; Zhang, 2015; Weingarden, 2014; Shahinas, 2012).
Aunque bien es cierto que, en estos trabajos, las cifras de abundancia relativa del
phylum Proteobacteria son bastante mayores que a las obtenidas a partir de
nuestros resultados para el grupo CDI (14.4%). Por ejemplo, en el trabajo de
Weingarden y col. 13 de 14 muestras “pre FMT” presentaron una abundancia
relativa mayor al 90%, muy alejado de nuestras cifras.
La expansión del phylum Proteobacteria es el más robusto patrón ecológico

de disbacteriosis intestinal. De forma contraria, la ausencia de Proteobacteria
como componente de la microbiota intestinal sugiere una microbiota sana. Esta se
observa en pacientes con inflamación intestinal severa como la enfermedad
inflamatoria intestinal, cáncer colorrectal y enterocolitis necrotizante, y también
con inflamación intestinal leve como síndrome metabólico y síndrome de colon
irritable (Shin, 2015). En todos estos ejemplos, el aumento de Proteobacteria es
efecto y no causa de la disbacteriosis, como en el caso de la CDI (Litvak, 2017). A
continuación, explicaremos los mecanismos que explican esta afirmación.
291
La dominancia de anaerobios estrictos en el intestino grueso, debido a la
limitación de oxígeno en este ambiente, tiene importantes consecuencias en el
metabolismo y consumo de nutrientes por los componentes de la microbiota
intestinal. Por otra parte, el aumento de la disponibilidad de oxígeno en el
intestino grueso supone una disrupción de la anaerobiosis que permitiría una
ventaja selectiva para los anaerobios facultativos, como los componentes del
phylum Proteobacteria (Rivera-Chávez, 2016). Esto puede ocurrir por varias
causas. En primer lugar, hemos de exponer que los colonocitos son la principal
fuente de oxígeno en el intestino grueso, por tanto, en la superficie del colon se
emite una cantidad muy limitada. Esto supone que la escasa cantidad de
Proteobacteria que se encuentra en una microbiota intestinal sana crezca cerca de
la superficie epitelial. En los colonocitos la principal vía de obtención de energía
es la beta-oxidación del butirato aportado mediante procesos fermentativos por
los grupos productores de butirato, en especial pertenecientes al phylum
Firmicutes (Velazquez, 1997). En este proceso el butirato se transforma en dióxido
de carbono, mediante el consumo de oxígeno. Por tanto, la depleción de
Firmicutes y Bacteroidetes que se observa tras la administración antibiótica,
conlleva una reorientación metabólica en el colonocito hacia la glucolisis
anaerobia, lo que supone un menor consumo de oxígeno, un aumento de la
oxigenación en la superficie del colon, y se facilitaría la expansión del phylum
Proteobacteria (Donohoe, 2012). Asimismo, el ambiente proinflamatorio debido a
la disminución de butirato en el intestino grueso conlleva a una hiperplasia en las
criptas intestinales, y esto supone un reemplazo de colonocitos hipóxicos a
colonocitos indiferenciados normóxicos (López, 2016). Además, la inflamación
intestinal (también la provocada por las toxinas TcdA y TcdB) provoca un
aumento de las especies reactivas de oxigeno capaces de oxidar compuestos de
sulfuro endógenos a tetrationato, un compuesto que actúa como aceptor de
electrones y que permite la expansión de anaerobios facultativos como
Proteobacteria (Winter, 2013). Por tanto, mediante este doble mecanismo de
aumento de la disponibilidad de oxígeno y de compuestos aceptores de
electrones, secundario a una depleción de butirato o la existencia de un ambiente
proinflamatorio intestinal, se produce la expansión de Proteobacteria en los
pacientes con CDI. Como dijimos anteriormente, este hecho es “efecto” y no
“causa” de la disbacteriosis que se observa en estos pacientes (Litvak, 2017).
292
La expansión del phylum Proteobacteria tiene efectos inflamatorios, puesto
que sus miembros presentan como factor de virulencia la liberación de la
endotoxina, cuya actividad depende del lípido A del lipopolisacárido bacteriano.
La endotoxina se libera en durante la lisis celular y provocaría un aumento del
reclutamiento de los neutrófilos en el intestino grueso, colaborando en la
patogénesis de la CDI.
Entrando ya en los phylum minoritarios de la microbiota intestinal de los

pacientes con CDI del presente estudio, Actinobacteria engloba a bacterias Gram
positivas aerobias, aerobias o anaerobias facultativas y no formadoras de esporas.
La mayor parte son gérmenes quimiorganótrofos. Este phylum es fenotípicamente
muy diverso e incluye a cocos y bacilos. Incluye a las clases Acidimicrobiia,
Actinobacteria, Coriobacteriia, Rubrobacteria y Thermoleophilia. Dentro de la
clase Actinobacteria se encuentra el orden Bifidobacteriales que engloba a la
familia Bifidobacteriacea. La familia Bifidobacteriacea es la más importante y
representativa del phylum Actinobacteria a nivel de la microbiota intestinal, con
potenciales efectos beneficiosos para la salud (Bergey´s Manual of Systematic
Bactereology, 2012).
La familia Bifidobacteriacea incluye a géneros de bacterias Gram positivas,

en forma de bacilos simples o en agregados, sin cápsula, no formadoras de
esporas y sin movilidad. Son anaerobias, quimiorganótrofas, de metabolismo
fermentativo que genera ácidos, pero no gases, a partir de múltiples
carbohidratos (Bergey´s Manual of Systematic Bactereology, 2012).
En el presente estudio observamos una reducción en la abundancia

relativa de Actinobacteria en el grupo de los pacientes con CDI frente a los
controles sanos. Esta reducción es cuantitativamente poco importante (4.6% en
CTRL frente a 1.2% en CDI), pero puede tener consecuencias debido a los efectos
beneficiosos que producen los miembros de este phylum. Históricamente y debido
a que es un phylum minoritario, en muchos trabajos donde se ha querido dilucidar
los mecanismos patogénicos subyacentes a la CDI se ha obviado su papel. No
obstante, algunos trabajos anteriores si que destacan sus abundancias relativas
diferentes en los pacientes con CDI con respecto a grupos control. Milani y col. al
293
comparar una cohorte de pacientes con CDI frente a pacientes que no habían
recibido antibioticoterapia previa como grupo control, observaron que se
producía una reducción del género Bifidobacterium en el grupo CDI (Milani, 2016).
Estos resultados han sido corroborados en otros trabajos como el de Zhang y col.
(Zhang, 2015). También, Skraban y col. en un trabajo similar evidenciaron que
Bifidobacterium Longum era el mejor predictor de un estatus C. difficile negativo
(Skraban, 2013). Weingarden y col., estudiando la microbiota intestinal en la CDI
en pacientes sometidos a FMT con éxito, observaron que en las muestras “post
FMT” se producía un aumento en Actinobacteria, lo que supone que son parte
importante en la restauración de la microbiota intestinal de estos pacientes
(Weingarden, 2014). No obstante, otros pocos trabajos han encontrado que el
phylum Actinobacteria tuvo una abundancia relativa similar, o sin diferencias
estadísticamente significativas entre los pacientes con CDI y los controles sanos
(Manges, 2010; Gu, 2016). Un hecho importante a recalcar es que la abundancia
relativa de Bifidobacteriacea disminuye con la edad, permitiendo que la
microbiota intestinal sea más permisiva a infecciones oportunistas en la edad
avanzada (Claesson, 2012).
Los efectos beneficiosos que presentan la familia Bifidobacteriacea y la

relación de su depleción con la patogénesis de la CDI, serán discutidos en
apartados siguientes, cuando pasemos a valorar las diferencias en la composición
a nivel de familias y géneros.
El phylum Verrocomicrobia, también minoritario, engloba a la importante

y relevante familia Akkermansiaceae, que a su vez contiene al género
Akkermansia. Dicho género está constituido por bacterias Gram negativas, en
forma de cocobacilos aislados, en pareja y raramente en cadena. No presentan
movilidad y son anaeróbios estrictos. Son quimiorganótrofos y su metabolismo es
fermentativo obligado. Acetato, propionato y etanol son sus principales
productos provenientes de la fermentación (Bergey´s Manual of Systematic
Bactereology, 2012). La particular característica que presentan es que son capaces
de degradar la mucina de la capa mucosa. Esto le confiere unas propiedades
especiales que serán discutidas en apartados siguientes, cuando pasemos a
valorar las diferencias a nivel de familias y géneros.
294
En el presente estudio se produce un ligero aumento en la abundancia
relativa de Verrucomicrobia (más adelante veremos que se trata en su totalidad
del género Akkermansia) en el grupo de los pacientes con CDI, con respecto a los
controles sanos (6.0% en CDI frente a 4.7%), siendo la diferencia no
estadísticamente significativa (P=0.17). No obstante, pensamos que este dato es
importante dadas las peculiares propiedades de este género al respecto de la
degradación de la propia mucina de la capa mucosa intestinal del hospedador.
Estas propiedades y la relación en la patogénesis de la CDI serán discutidas en
apartados siguientes, cuando pasemos a valorar las diferencias en la composición
a nivel de familias y géneros.
En pocos trabajos se ha mencionado el phylum Verrucomicrobia en cuanto

a su relación con la patogénesis de la CDI y si se trata de un grupo protector o
predisponente a la misma. Weingarden y col. en un trabajo donde valora las
diferencias en la microbiota intestinal en pacientes que se van a someter a FMT y
tomando como controles sanos a los donantes de heces, destacó la disminución de
del phylum Verrocomicrobia en las muestras “post FMT”, situándolo como un
factor predisponente al desarrollo de CDI (Weingarden, 2014). La primera
observación de incrementos de Akkermansia muciniphila en una cohorte de
pacientes con CDI, la proporcionó Sangster y col. en 2016 (Sangster, 2016). La
explicación de este dato se basó en que Akkermansia muciniphila es una bacteria
con capacidad para degradar la mucina, componente de la capa mucosa, y este
hecho podría suponer una ventaja selectiva para C. difficile para su colonización y
expansión. Ya profundizaremos en este aspecto en los próximos apartados, como
dijimos anteriormente. Por otra parte, en el trabajo de Milani y col con 3 cohortes;
pacientes con CDI, pacientes sin CDI pero que habían recibido terapia antibiótica
(AB+) y pacientes sin CDI sin recibir administración antibiótica (AB-), observó al
comparar la composición de la microbiota intestinal en los grupos CDI y AB- que
se producía una disminución de Akkermansia en el grupo CDI, y que se trataba de
un grupo protector debido a potenciales efectos beneficiosos (Milani, 2016). Esta
dualidad de efectos será discutida próximamente. Asimismo, Milani y col.
destacan que en varías muestras de la cohorte de pacientes con CDI se observaron
incrementos de Akkermansia, achacándolo a un epifenómeno debido a
modificaciones del microambiente intestinal.
295
6.3.1.2 Diferencias de composición a nivel de phylum entre los grupos P y CTRL
y entre los grupos CDI y P.
En este apartado procedemos a analizar las diferencias en la composición a

nivel de phylum entre los grupos de individuos colonizados por C. difficile frente al
grupo de controles sanos, y también discutiremos al mismo tiempo las diferencias
entre los grupos de individuos colonizados y pacientes con CDI.
En líneas generales, las diferencias en la composición de la microbiota

intestinal a nivel de phylum en el grupo P con respecto al grupo CTRL son
similares a las encontradas en el grupo CDI, aunque con sendas diferencias
importantes en los grupos minoritarios y con ligeros matices en los grupos
mayoritarios. Estas diferencias en los grupos minoritarios ya aportan luz al
objetivo del presente estudio, el cual es discernir diferencias en la microbiota
intestinal entre los individuos colonizados e infectados por C. difícil,e que nos
permita explicar los mecanismos patogénicos de la CDI y los subyacentes al
estado de colonización.
En el grupo P con respecto a los controles sanos, se observa en los phylum

mayoritarios una fuerte depleción de Firmicutes (66.9% en CTRL frente a 39.1%
en P), un aumento en Bacteroidetes (19.6% en CTRL frente a 36.0% en P) y un
aumento en Proteobacteria (3.8% en CTRL frente a 20.5% en P). Las diferencias
con Firmicutes y Bacteroidetes son estadísticamente significativas (P<0.05) y con
Proteobacteria no lo es, aunque la P es de 0.0636 (a efectos prácticos podemos
considerar que lo es). El patrón de disbacteriosis que nos aporta el análisis de los
grupos mayoritarios en el grupo P es similar al encontrado en el grupo CDI, con
escasas variaciones. El aumento de Bacteroidetes es ligeramente inferior en P que
en CDI y la expansión de Proteobacteria es algo superior en P que en CDI (ambas
diferencias no son estadísticamente significativas). La depleción en Firmicutes es
similar en ambos grupos CDI y P. Estos resultados enlazan con los análisis de alfa
y beta diversidad. Ya observamos una perdida de riqueza y alfa diversidad en
ambos grupos CDI y P con respecto a los controles sanos, pero sin diferencias
estadísticamente significativas entre ambos. También, mediante el análisis de
agrupamiento UniFrac unweighted observamos que las muestras de los grupos
296
CDI y P presentaban disimilitudes con respecto al grupo CTRL al formar este un
cluster bien diferenciado, pero también que las muestras de los grupos CDI y P
presentaban cierto grado de solapamiento y no podían diferenciarse como clusters
diferentes. Por tanto, era de esperar que las diferencias entre ambos grupos con
respecto a los phylum mayoritarios fueran mínimas.
La importante depleción de Firmicutes en el grupo de individuos

colonizados conlleva a una perdida de mecanismos de resistencia a la
colonización, al igual que lo apuntado en el apartado anterior con respecto al
mismo hallazgo que encontramos en los pacientes con CDI. La expansión de
Protebacteria, curiosamente algo más pronunciado en el grupo P, también
implicaría, al igual que en el grupo CDI, la presencia de disbacteriosis, debido a
un aumento de la disponibilidad del oxígeno y de compuestos aceptores de
electrones, de forma secundaria a una depleción de butirato o la existencia de un
ambiente proinflamatorio intestinal, considerando este hecho como “efecto” y no
como “causa” (Litvak, 2017). El aumento de Bacteroidetes, aunque ligeramente
inferior en el grupo P respecto al grupo CDI, es difícil de explicar, al igual que en
el grupo CDI. Ya hemos visto que se trata de un phylum que cuenta con grupos
protectores de bacterias con importantes funciones en cuanto al metabolismo de
carbohidratos y en cuanto al modelaje de la respuesta inmune. Cuando
comparemos más adelante estos resultados con los escasos estudios realizados al
respecto, discutiremos este hallazgo.
Por tanto, por los resultados antes mencionados, los individuos

colonizados por C. difficile presentan un grado de disbacteriosis cercano al de los
pacientes con CDI, en base a las similitudes que encontramos al respecto de sus
phylum mayoritarios. No obstante, los antecedentes de esta cohorte de individuos
son diferentes a los del grupo CDI. La edad media es inferior (51±26 en el grupo P
frente a 69±19 en el grupo CDI), la tasa de administración antibiótica previa es
inferior (53% en el grupo P frente a 93% en el grupo CDI), la presencia de
comorbilidades es inferior (40% en el grupo P frente a 87% en el grupo CDI) y la
mayor parte de los casos provienen de la comunidad (87% a diferencia del 13% de
los pacientes con CDI, donde la mayor parte eran pacientes hospitalizados).
Además, el 47% de los individuos estuvieron colonizados por cepas no
297
toxigénicas de C. difficile, hecho que obviamente no ocurre en los pacientes con
CDI, puesto que la cepa en estos casos es siempre toxigénica.
Las diferencias más destacables, como hemos adelantado anteriormente,

se producen en los phylum minoritarios Actinobacteria y Verrucomicrobia. De
forma llamativa, el phylum Actinobacteria va descendiendo desde los grupos
CTRL (4.6%), P (2.8%) hasta CDI (1.7%). Aunque las diferencias no son
estadísticamente significativas, consideráramos que existe una tendencia, y que
en el grupo P existe una pérdida de Actinobacteria no tan pronunciada como en el
grupo CDI. Este hallazgo lo consideriríamos importante. El phylum Actinobacteria
engloba a la familia Bifidobacteriacea, de efectos beneficiosos comentados
brevemente en el apartado anterior y que serán más ampliamente desarrollados
cuando veamos las diferencias a nivel de familia y género. El hecho de mantener
una cantidad todavía adecuada de esta familia podría ser un dato importante a la
hora de clarificar la microbiota intestinal de los individuos colonizados por C.
difficile que permanecen en este estado sin desarrollar CDI. Asimismo, de forma
muy llamativa encontramos diferencias con respecto al phylum Verrucomicrobia.
Observamos una disminución en el grupo P con respecto a los controles sanos
(1.3% en P frente a 4.7% en CTRL), de forma a diferente al grupo CDI donde se
evidencia un aumento (6.0% en CDI frente a 4.7% en CTRL). Además, la
diferencia entre el grupo CDI y P (6.0% en CDI frente a 1.3% en P) es
estadísticamente significativa. Este hallazgo es novedoso. Si bien se había
publicado que el género Akkermansia de la familia Akkermansiaceae, principales
miembros de la microbiota intestinal del phylum Verrucomicrobia, podría tener un
papel predisponente en la CDI (Sangster, 2016; Weingarden, 2014) debido a una
serie de particularidades, nunca se había evidenciado que hubiera una
disminución en los individuos colonizados por C. difficile con respecto a los
controles sanos. Este hecho, que será discutido más profundamente cuando
veamos las diferencias en la composición a nivel de género y familia, realza el
papel de este grupo de bacterias minoritario, aunque importante, en la
patogénesis de la CDI (Hryckowian, 2017).
Llegados a este punto vamos a comparar nuestros resultados de las

diferencias de composición de la microbiota intestinal a nivel de phylum con la
298
cohorte de individuos colonizados con los escasos estudios al respecto realizados
hasta la fecha. La comunidad científica coincide en que hacen falta más datos
sobre la composición de la microbiota intestinal y su relación con la patogénesis
de la CDI, y en que la comparativa entre cohortes de pacientes con CDI en
individuos colonizados por C. difficile resulta una excelente aproximación para
arrojar luz a estos hechos.
Rea y col. en una cohorte de 22 individuos colonizados por C. difficile

provenientes de instituciones para la tercera edad, no encontraron diferencias en
la composición a nivel de phylum a excepción de un ligero aumento de
Proteobacteria (4.3% frente a en 2.3% en 252 controles sanos). Por tanto, sus
autores sugieren que la microbiota intestinal de estos individuos podría
prevenirles de la germinación, multiplicación y expansión, y toxicidad de C.
difficile. También se destacó una elevada variabilidad en la composición en estos
pacientes colonizados (Rea, 2011). Estos resultados son diferentes a los nuestros,
donde si que encontramos diferencias a nivel de phylum entre los individuos
colonizados con respecto a los controles, que nos permite afirmar que existe un
grado de disbacteriosis importante, pero que también debe existir algún factor
que inhiba la expansión y toxicidad de C. difficile en esta cohorte, coincidiendo con
los autores de este trabajo en este punto.
Zhang y col. en una aproximación similar a la nuestra, utilizaron 3

cohortes de 8 pacientes con CDI, 8 individuos portadores asintomáticos de C.
difficile y 9 controles sanos, todos ellos hospitalizados, donde el 100% de los
pacientes con CDI y el 75% de los portadores asintomáticos habían recibido
tratamiento antibiótico previo. Observaron que en el grupo de portadores
asintomáticos las diferencias en la composición a nivel de phylum eran fehacientes
con respecto al grupo de controles sanos. Para los 3 phylum mayoritarios el estado
de portador se colocaba como un estado intermedio entre el estado de enfermo y
el estado sano. Se produjo una depleción en Firmicutes y Bacteroidetes menos
pronunciada y un aumento de Proteobacteria también menos pronunciado que
los observados en los pacientes con CDI. Con respecto a Actinobacteria se observó
en portadores un aumento con respecto a los controles sanos pero una
erradicación absoluta en los pacientes con CDI (Figura 53). Los autores
299
concluyeron en base a las similitudes en la composición a nivel de phylum entre
los grupos de portadores asintomáticos y los pacientes con CDI, que en los
portadores asintomáticos de C. difficile se observa una disbacteriosis con depleción
de grupos butirogénicos, pero especularon que estos no desarrollan CDI debido a
factores dependientes del hospedador como el estado inmune. (Zhang, 2015).
Nuestros resultados en el grupo de individuos colonizados son similares a los
obtenidos por Zhang y col., evidenciándose una depleción en Firmicutes y una
expansión de Proteobacteria, aunque en nuestro estudio se observa un aumento
en Bacteroidetes a diferencia del anterior donde se observó una disminución. Los
resultados de nuestro estudio en cuanto al aumento en Bacteroidetes en los
individuos colonizados de C. difficile (al igual que en los pacientes con CDI)
podría tener varias explicaciones. Como hemos comentado anteriormente para
valorar diferencias en la composición utilizamos abundancias relativas y esto
podría estar sujeto a sesgos en la interpretación. Si asumiéramos que la
antibioticoterapia previa provocaría la intensa depleción de Firmicutes, el
aumento en Bacteroidetes podría ser un artefacto, como argumentamos en
relación con el grupo CDI. La diferencia con el grupo P es que en esta cohorte la
administración antibiótica previa solo se documentó en el 53% de los sujetos, a
diferencia del grupo CDI donde se documentó en el 93%. Asimismo, la mayor
parte de los sujetos provienen de la comunidad y la presencia de comorbilidades
es mucho menor que en el grupo CDI. Por tanto, consideramos que esta
explicación tiene menos peso para esta cohorte de individuos. Otro posible
argumento es que, a nuestra impresión, la cantidad de Bacteroidetes en los
controles sanos podría ser menor de lo esperada y la de Firmicutes mayor de lo
esperada, en base a la bibliografía (Human Microbiome Project Consortium,
2012), aunque esto no suponga la presencia de disbacteriosis en esta cohorte. Por
tanto, el aumento de Bacteroidetes en individuos colonizados supondría un
artefacto como en el caso anterior. La tercera explicación es asumir que el
aumento de Bacteroidetes en individuos colonizados conlleva un efecto protector
que actuaría impidiendo la transición desde un estado de colonización a infección
por C. difficile. Como hemos visto se trata de un phylum constituido por miembros
con potenciales efectos beneficiosos en cuanto a la digestión de carbohidratos,
desplazamiento de patógenos oportunistas por competencia por el nicho
ecológico y activación del sistema inmune (Johnson, 2016).
300
FIGURA 53: Diferencias en las abundancias relativas (%) de los phylum en los grupos CDI, AS y CT
en el estudio Zhang y col. CDI: C. difficile infection patients, AS: Asymptomatic C. difficile carriers, CT:
Healthy controls. (Zhang, 2015).
Dong y col. estudiaron la microbiota intestinal en 12 sujetos de

nacionalidad china provenientes de la comunidad al realizar un extenso cribado
poblacional de colonización de C. difficile. En estos 12 individuos colonizados,
entre las diferencias en la composición a nivel de phylum destacaron la
disminución en Bacteroidetes (22% en colonizados frente a 44% en controles), el
aumento en Proteobacteria (21% en colonizados frente a 12% en controles) y un
ligero aumento en Actinobacteria (resultados no aportados por el autor). Al
respecto del phylum Firmicutes no hubo diferencias. Los autores concluyeron que
la microbiota de los individuos colonizados era susceptible de desarrollar CDI
puesto que había evidencia de disbacteriosis (Dong, 2018). Es destacable el dato
de Actinobacteria y su importancia como grupo protector y su relación en la
susceptibilidad al desarrollo de CDI en individuos colonizados por C. difficile, en
concordancia con nuestros resultados.
En el último estudio realizado similar al nuestro se ha comparado la

microbiota intestinal de 21 sujetos colonizados por C. difficile y 58 pacientes con
301
CDI con la de una cohorte de controles sanos. Las diferencias en la composición
no fueron tan dramáticas como las que obtuvimos en nuestro estudio. Se
evidenció en el grupo de colonizados una ligera disminución en Firmicutes,
Bacteroidetes y Actinobacteria, y un aumento en Proteobacteria. En el grupo de
pacientes con CDI los resultados fueron similares (Han, 2019).
Para sintetizar los hallazgos encontrados en la microbiota intestinal a nivel

de phylum en los individuos colonizados por C. difficile, previamente habría que
exponer que la colonización puede explicarse por factores dependientes de la
virulencia de la cepa causal, o por el grado de compromiso de la microbiota
intestinal que es insuficiente para que se establezca una completa virulencia, es
decir, una completa germinación y toxicidad suficiente para que se establezca la
clínica. En nuestra cohorte de individuos colonizados por C. difficile las diferencias
en la composición de la microbiota intestinal con respecto a los controles sanos, es
bastante similar a la encontrada en nuestra cohorte de pacientes con CDI. Esto
ocurre en los tres phylum mayoritarios; Firmicutes, Bacteroidetes y Proteobacteria.
Es en los phylum minoritarios donde empezamos a encontrar diferencias que nos
permiten caracterizar el estado de colonización. El mantenimiento de la
abundancia relativa de Actinobacteria por encima de la del grupo de pacientes
con CDI es un hallazgo que permitiría explicar este hecho en parte. La
disminución de Verrucomicrobia con respecto a los controles, y el aumento que se
produce en el grupo CDI supone un hallazgo nuevo que pone en boga la
importancia de la familia Akkermansiaceae en la patogénesis de la CDI que
supone una ventaja selectiva para la expansión de C. difficile. Los pocos trabajos
realizados al respecto de forma similar arrojan datos variables, pero podemos
observar varias tendencias. Salvo en el trabajo de Rea y col. se suele evidenciar el
estado de colonización como también un estado disruptivo de la microbiota
intestinal en mayor o menor grado de forma similar a la disbacteriosis franca
observada en los pacientes con CDI, con disminuciones en Firmicutes,
Bacteroidetes y aumento en Proteobacteria, pero con Actinobacteria mayormente
conservado. En algunos de estos trabajos los autores concluyen que el estado de
portador implica una microbiota intestinal susceptible de infección. Pensamos
que esto en parte es cierto. En un sujeto colonizado se ha debido producir una
disbacteriosis previa en mayor o menor grado para que sea posible la
302
colonización de C. difficile, pero a su vez, en el contexto de esa disbacteriosis
deben existir grupos de bacterias que minimizan la replicación, germinación y
toxicidad necesarias para que se establezca la virulencia completa. El estudio de
las diferencias en la composición a nivel de phylum entre las cohortes de pacientes
con CDI, individuos colonizados y controles sanos ya empieza a arrojar luz. El
siguiente paso es discutir las diferencias en la composición a nivel de género y
familia, dentro de los mismos phylum comentados.

phylum Firmicutes entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
En este apartado y en los siguientes la forma de proceder va a ser discutir

las similitudes y diferencias en la composición de familias y géneros
pertenecientes al phylum Firmicutes, en este caso, entre los grupos CDI y P con
respecto a los controles sanos. Esto nos permitirá encontrar grupos de bacterias
que impidan que los individuos colonizados por C. difficile presenten clínica
asociada a la presencia de esta bacteria.
En el apartado “6.3.1. Diferencias de composición a nivel de phylum”

discutimos la depleción acentuada que se observa en el phylum Firmicutes en
ambas cohortes de pacientes con CDI e individuos colonizados por C. difficile con
respecto a los controles sanos. Ahora vamos a discutir a costa de que familias y
géneros es debida esta dramática disminución.
Las diferencias a nivel de familia que consideramos más significativas en

el grupo CDI con respecto a controles sanos son las siguientes:
 Disminuciones estadísticamente significativas en la familia
Ruminococcaceae (9.3% en CDI frente a 31.4% en CTRL).
 Disminuciones no estadísticamente significativas en las familias
Lachnospiraceae (11.8% en CDI frente a 18.7% en CTRL) y
Veillonelaceae (3.5% en CDI frente a 11.0% en CTRL), aunque al
respecto de Lachnospiraceae la p es 0.07.
 Aumentos no estadísticamente significativos en las familias
Acidaminococcaceae (3.5% en CDI frente a 2.2% en CTRL),
303
Erysipelotrichaceae (4.3% en CDI frente a 1.8% en CTRL),
Streptococcaceae (2.3% en CDI frente a 0.7% en CTRL),
Lactobacillaceae (3.5% en CDI frente a 11.0% en CTRL),
Enterococcaceae (0.6853% en CDI frente a 0% en CTRL) y
Peptostreptococcaceae (0.5298% en CDI frente a 0.0600% en CTRL).
Por otra parte, las diferencias a nivel de familia que consideramos más
significativas en el grupo P con respecto a los controles sanos son las siguientes:
 Disminuciones estadísticamente significativas en las familias
Ruminococcaceae (6.4% en P frente a 31.4% en CTRL) y
Acidaminococcaceae (0.5% en P frente a 2.2% en CTRL).
 Disminuciones no estadísticamente significativas en las familia
Lachnospiraceae (12.8% en P frente a 18.7% en CTRL).
 Aumentos estadísticamente significativos en las familias
Enterococcaceae (0.4993% en P frente a 0% en CTRL) y
Peptostreptococcaceae (0.4781% en P frente a 0.0600% en CTRL).
Veillonellaceae (12.1% en P frente a 10.3% en CTRL) y Streptococcaceae
En consecuencia, podemos considerar que las diferencias a nivel de familia

con respecto al grupo de controles sanos que encontramos de forma común en los
grupos CDI y P, son la reducción acentuada en Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae, y los ligeros aumentos en Enterococcaceae y
Peptostreptococcaceae.
Por el contrario, las diferencias más llamativas en el patrón de

disbacteriosis a nivel de familia, entre los grupos CDI y P con respecto a controles
sanos, son la disminución en Veillonellaceae en CDI y el aumento en P, la
disminución en Acidaminococcaceae en P y el aumento en CDI, el aumento más
pronunciado en Streptococcaceae en P que en CDI, el aumento en
Erysipelotrichaceae en CDI que no encontramos en P y el aumento en
Lactobacillaceae en CDI que no encontramos en P.
304
6.3.2.1 Diferencias de composición en los géneros de las familias Lachnospiraceae
y Ruminococcaceae entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
La acentuada reducción observada en la familia Ruminococcaceae en el

grupo de pacientes infectados por C. difficile es a expensas de los géneros
Faecalibacterium (3.9% en CDI frente a 11.2% en CTRL), Ruminococcus 2 (0.1% en
CDI frente a 4.5% en CTRL), Subdoligranulum (0.3% en CDI frente a 4.1% en
CTRL) y Eubacterium Coprostanoligenes Group (0.0939% en CDI frente a 1.3705% en
CTRL) y Ruminococcaceae UCG-014 (0.0794% en CDI frente a 1.7% en CTRL), que
supondrían más del 70% de la reducción que se observa en esta familia. Respecto
a la acentuada reducción en el grupo de sujetos colonizados por C. difficile resulta
a expensas de los géneros Faecalibacterium (0.9% en P frente a 11.2% en CTRL),
Ruminococcus 2 (0.6% en P frente a 4.5% en CTRL), Subdoligranulum (0.3% en P
frente a 4.1% en CTRL), Eubacterium Coprostanoligenes Group (0.2% en P frente a
1.4% en CTRL), Ruminococcaceae UCG-002 (0.5% en P frente a 1.9% en CTRL) y
Ruminococcaceae UCG-014 (0.0100% en P frente a 1.7% en CTRL), que supondrían
casi toda la reducción que se observa en esta familia. Por tanto, la diferencia más
llamativa que encontramos en ambos grupos CDI y P es la disminución más
pronunciada en P que en CDI en el género Faecalibacterium, mientras que en el
resto de los géneros consideramos similitudes.
Con respecto a la pronunciada reducción que se observa en la familia

Lachnospiraceae en el grupo CDI resulta a expensas de los géneros Agathobacter
(0.0374% en CDI frente a 6.3% en CTRL), Roseburia (0.1% en CDI frente a 2.7% en
CTRL) y Lachnospiraceae NK4A136 (0.1% en CDI frente a 1.5% en CTRL), que
supondrían la práctica totalidad de la reducción que se observa en esta familia.
No obstante, también se observan aumentos en los géneros Ruminococcus Gnavus
Group (3.2% en CDI frente a 0.7% en CTRL) y Lachnoclostridium (3.2% en CDI
frente a 0.3% en CTRL). En el grupo de individuos colonizados también se
observan disminuciones en los géneros Agathobacter (0.1% en P frente a 6.3% en
CTRL), Roseburia (0.1% en CDI frente a 2.7% en CTRL) y Lachnospiraceae NK4A136
(0.3% en CDI frente a 1.5% en CTRL), y los aumentos en Ruminococcus Gnavus
Group (5.3% en P frente a 0.7% en CTRL) y Lachnoclostridium (0.8% en P frente a
0.3% en CTRL) y a parte se observa un aumento en Blautia (1.5% en P frente a
305
0.7% en CTRL) que no se observa en CDI (0.5904% en CDI frente a 0.6994% en
CTRL). Por consiguiente, las diferencias más notables en el patrón de
disbacteriosis que encontramos entre los grupos CDI y P con respecto a los
controles sanos dentro de los géneros de la familia Lachnospiraceae resultarían el
aumento más pronunciado de Ruminococcus Gnavus Group en P que en CDI, el
aumento más pronunciado de Lachnoclostridium en CDI que en P y la ligera
dismunción de Blautia en CDI con respecto al moderado aumento en P. Además,
destacamos que el aumento observado en Ruminococcus Torques Group en ambos
grupos con respecto a CTRL es ligeramente más pronunciado en P (1.8731% y
1.1256% en P y CDI frente a 0.915% en CTRL).
La depleción de las familias Lachnospiraceae y Ruminococcaceae es un

hallazgo común en pacientes con CDI (Antharam, 2013; Milani, 2016; Gu, 2016).
En estudios de cohortes de comparación de la microbiota intestinal de pacientes
con CDI (Grupo CDI), pacientes con diarrea nosocomial no debida a C. diffile
(Grupo CDN) y controles sanos se ha observado la reducción en ambas familias
en los grupos CDN y CDI respecto a los controles sanos. Los géneros
característicos asociados a estas reducciones fueron Blautia, Roseburia,
Subdoligranulum, Ruminoccocus, Dorea y Coprococcus (Antharam, 2013). En el
trabajo de Milani y col. donde se compararon cohortes de pacientes con CDI, con
administración antibiótica previa sin CDI (Grupo AB+) y sin administración
antibiótica ni CDI (Grupo AB-), también se observó una franca reducción de la
familia Lachnospiraceae y el género Faecalibacterium en los pacientes con CDI con
respecto al grupo AB-. Al aplicar un módelo estadístico ajustado a sexo y edad, y
a variables clínicas, se sumaron como predictores de CDI la disminución de
Ruminococcaceae y Subdoligranulum (Milani, 2016). Lee y col. mediante un
estudio prospectivo en pacientes receptores de trasplante de médula ósea que
desarrollaron CDI encontraron que el phylum Bacteroidetes y las familias
Lachnospiraceae y Ruminococcaceae, de forma conjunta y no independiente,
estuvieron significativamente correlacionados con protección frente a CDI (Lee,
2017). Gu y col. en un trabajo similar al de Antharam en 2013 pero realizado en
población china, también observaron reducciones en Lachnospiraceae a expensas
de los géneros Blautia, Lachnospira incertae sedis, Roseburia y Dorea, y en
306
Ruminococcaceae a expensas de los géneros Faecalibacterium, Ruminococcus y
Oscillospira (Gu, 2016).
Los estudios donde se ha pretendido evaluar diferencias de composición

en la microbiota intestinal en pacientes con CDI sometidos a FMT, también nos
han aportado evidencias acerca de que la pérdida de géneros de las familias
Lachnospiraceae y Ruminococcaceae es un hallazgo que caracteriza a la
microbiota intestinal de estos individuos (Weingarden, 2014; Shahinas, 2012;
Brown, 2018). La expansión de estás familias que se ha evidenciado en las
muestras “post FMT” ha puesto de manifiesto su importancia en la elevada tasa
de éxito del FMT como terapia no convencional a la infección por C. difficile. En el
trabajo de Shahinas y col. se observó que de forma fehaciente se produce una
expansión posterior al FMT de géneros como Faecalibacterium y Roseburia
(Shahinas, 2012). Brown y col. hallaron que Faecalibacterium era un género que
significativamente estaba disminuido en los pacientes con CDI al comparar la
composición de la microbiota intestinal con la de los donantes de heces (Brown,
2018).
Aunque más adelante entraremos en detalle en la importancia del

metabolismo intestinal de los ácidos biliares y la producción de AGCC en la
patogénesis de la CDI, los mecanismos intrínsecos al éxito del FMT nos han
demostrado la importancia de la depleción de las familias Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae en los pacientes con CDI. Esto genera que los pacientes con CDI
tengan una composición intestinal alterada de los ácidos biliares. Esto se traduce
en un descenso en el metabolismo de los ácidos biliares primarios germinantes de
las esporas de C. difficile, y en una rápida absorción de los ácidos biliares
secundarios inhibidores, produciendo un desesquilibrio entre los procesos de
inhibición y germinación (Sorg, 2010). Las muestras “pre FMT” presentan niveles
más elevados de ácidos biliares primarios, mientras que las muestras “post FMT”
contienen predominantemente ácidos biliares secundarios, de forma similar a los
donantes, y esto se acompaña de la depleción de las familias Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae en el primer caso y su expansión y recuperación en el segundo.
(Weingarden, 2014). La microbiota intestinal aporta los enzimas BSH y BaiCD que
metabolizan los ácidos biliares primarios germinantes. BSH hidroliza los ácidos
307
biliares conjugados en ácidos biliares libres. BaiCD es capaz de transformar los
ácidos biliares primarios en secundarios. Las bacterias cuyo genoma codifique
estos enzimas producirían un efecto inhibitorio sobre la germinación de las
esporas de C. difficile. Perder estos grupos supone, por consiguiente, una pérdida
de la resistencia a la colonización y germinación. Buffie y col. en un estudio donde
compararon la microbiota intestinal de 12 individuos portadores asintomáticos y
12 pacientes con CDI, mediante posteriores análisis metabolómicos y aplicando
modelos matemáticos, hallaron 11 grupos de bacterias que correlacionaron
potentemente con una resistencia a la infección. Estos géneros y especies estaban
incluidos mayoritariamente en el cluster Clostridium XIVa, es decir en la familia
Ruminococcaceae, incluyendo Clostridium scidens, donde se encontró la
correlación más potente. Clostridium scidens sintetiza el enzima BaiCD, muy poco
común. Se formuló por primera vez la hipótesis por la cual esta vía metabólica tan
rara era la que confiería está capacidad de resistencia a la infección (Buffie, 2015).
Por consiguiente, la pérdida de estas familas supone una franca perdida de este
mecanismo clave de resistencia a la colonización, y es por lo que uno de los
mecanismos de éxito del FMT es la recuperación de estas perdidas, alcanzando
unos niveles similares a los de los donantes. No obstante, y como veremos más
adelante en detalle, los géneros que aportan el enzima BaiCD son muy escasos,
siendo este hecho un potencial marcador que nos distinga, al menos en parte, la
microbiota intestinal de los pacientes con infección por CDI y de los individuos
colonizados por C. difficile que no desarrollan clínica. Por otra parte, otro
mecanismo clave, relacionado con la depleción de las familias Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae en las muestras de pacientes con CDI, que se pone de manifesto
al producirse la recuperación de estas familias mediante FMT, es el de la síntesis
de AGCC a partir de carbohidratos no digeribles de la dieta principalmente.
Como ya hemos introducidos en el apartado “6.3.1.1. Diferencias a nivel de phylum
entre los grupos CDI y CTRL”, los clostridiales incluyen a las principales familias
productoras de AGCC, en especial de butirato. Estas familias son principalmente
Lachnospiraceae y Ruminococcaceae (Antharam, 2013). Como ya hemos dicho
son la principal fuente de energía de los colonocitos, provocando de forma directa
una disminución de la carga osmótica en la luz intestinal al reducir los
carbohidratos no digeribles. Al ser los principales aniones en el intestino grueso y
provocar la caída del pH desde el íleo hasta el colon proximal, actúan impidiendo
308
la proliferación de patógenos oportunistas e inactivando enzimas microbianos.
Sus consecuencias más importantes son las relativas a su capacidad de regular la
secreción de citocinas proinflamatorias en diferentes células inmunes intestinales
mediante diferentes mecanismos, generando efectos antiinflamatorios. Incluso
presentan influencia sobre los linfocitos T reguladores, que a su vez disminuyen
los linfocitos Th17, cuya activación estimula la granulopoyesis y el reclutamiento
de neutrófilos en el lugar de la infección (Buonomo, 2016). Por tanto, la depleción
de las familias Lachnospiraceae y Ruminococcaceae en las muestras “pre FMT”
con CDI tiene influencia sobre la reactividad de las células inmunes intestinales,
contribuyendo a la severidad de la CDI. Asimismo, la recuperación de estas
familias con el FMT pone en liza la importancia de este mecanismo patogénico en
la CDI.
Nuestros resultados al respecto de la disminución de las familias

Lachnospiraceae y Ruminococcaceae en los pacientes con CDI concuerdan con lo
hallado en los estudios anteriores mencionados. Al respecto de los géneros a
expensas de los cuales se produce las disminuciones de estas familias aparece
mayor vartiabilidad. Ya entraremos más en detalle en los géneros destacables,
pero esto puede ser debido a que la microbiota intestinal conforma un ecosistema
dinámico con funciones fisiológicas, metabólicas, inmunológicas y de protección
frente a patógenos, que es estable en base a que existe un grado de redundancia
funcional de sus miembros, es decir, hablamos de la existencia de un core
funcional. Por tanto, la disminución relativa en los géneros de estas familias
mayoritarias comparada con cohortes de indiviuos de referencia puede ser
variable, ya que unos cuantos géneros ejercerían las mismas funciones. No
obstante, en los estudios anteriores aparecen disminuciones en géneros que
aparecen en el nuestro como Faecalibacterium, Subdoligranulum, Roseburia y Blautia.
En los escasos estudios anteriores que han comparado la microbiota

intestinal en pacientes con CDI frente a portadores asintomáticos o individuos
colonizados por C. difficile nos encontramos que las depleciones en las familias
Lachnospiraceae y Ruminococcaceae se produce en ambos grupos de sujetos
(Zhang, 2015; Han, 2019). En el trabajo de Zhang y col. destacó la depleción de
géneros productores de butirato de ambas familias como Faecalibacterium y
309
Ruminococcus (Ruminococcaceae) y Roseburia y Coprococcus (Lachnospiraceae) en
los grupos de pacientes con CDI y portadores asintomáticos de origen
hospitalario, sin diferencias significativas entre ambos grupos (Zhang, 2015). Han
y col observaron que disminuciones en ambas familias Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae en pacientes con CDI y portadores asintomáticos, algo más
pronunciada en CDI, pero sin diferencias significativas entre ambos grupos. Esto
se traduce en disminuciones de géneros butirogénicos como Lachnospira,
Odirobacter, Coprococcus y Anaerostipes (Han, 2019). En el trabajo de Dong y col.
donde realizaron un cribado poblacional de colonización asintomática de C.
difficile en población china y encontraron 12 portadores asintomáticos, se observó
en este grupo una disminución estadísticamente significativa de los géneros
butirogénicos Roseburia y Faecalibacterium (Dong, 2018)
Nuestros resultados, al respecto de las familias Lachnospiraceae y

Ruminococcaceae, coinciden de forma general con todos estos estudios. Nuestros
resultados muestran que no hay diferencias estadísticamente significativas entre
los grupos CDI y P, tanto a nivel de las familias Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae como de los géneros que los componen, aunque se producen
variaciones no significativas que nos va a permitir describir una tendencia, que
suponemos con un mayor tamaño muestral se confirmaría. Encontramos
disminuciones en los géneros Faecalibacterium, Ruminococcus 2, Subdoligranulum,
Agathobacter, Roseburia en ambos grupos CDI y P. Todos estos géneros son
grandes productores de butirato. Las bacterias butirogénicas conforman un grupo
funcional y se agrupan principalmente, como dijimos, en la clase Clostridia del
phylum Firmicutes, clusters IV y XIVa, aunque realmente es una característica
ampliamente distribuida en las bacterias gram positivas anaerobias estrictas
componentes de la microbiota intestinal (Louis, 2009). La primera conclusión que
podemos extraer es que tanto en pacientes con CDI como en individuos
colonizados por C. difficile se ha establecido una microbiota intestinal con la
capacidad para sintetizar butirato muy disminuida. Las consecuencias debido a
esto es que también debe existir un ambiente intestinal proinflamatorio en los
individuos colonizados, aunque este hecho no debe ser suficiente por si solo para
distinguir infección y colonización. De hecho, los estudios al respecto de la
relación entre los AGCC y la patogénesis de la CDI arrojan resultados confusos,
310
aunque la depleción de los grupos butirogénicos componentes de la microbiota
intestinal ha sido confirmado por multiples estudios (Antharam, 2013), incluido el
nuestro. Asimismo, los AGCC parecen correlacionar con la resistencia a la
colonización frente a C. difficile en ciertos casos en modelos murinos (Theriot,
2014). No obstante, en el estudio de Reeves y col. se observó una recuperación
parcial de la resistencia a la colonización en ratones germ free colonizados con
Lachnospiraceae, pero no así con Escherichia coli, y no se encontró en el primer
caso asociación entre la producción de los AGCC y el nivel de colonización de C.
difficile (Reeves, 2012). Por tanto, la relación causal entre la patogénesis de la CDI
y la producción intestinal de AGCC no está esclarecida del todo, y nuestros
resultados apuntan a que este mecanismo por si solo no es esencial ni
discriminatorio de infección y colonización. De hecho, la depleción de las familias
Lachnospiraceae y Ruminococcaceae también se ha encontrado en cohortes de
pacientes con diarrea nosocomial no debida a C. difficile (Antharam, 2013;
Schubert, 2014).
Otro de los mecanismos de resistencia a la colonización que se ve

transgredido en la disbacteriosis que encontramos en los pacientes con CDI es el
relacionado con el metabolismo de los ácidos biliares. Los ácidos biliares
primarios son los compuestos que promueven la germinación de las esporas de C.
difficile y su transformación en la forma vegetativa que es capaz de producir las
toxinas TcdA y TcdB causantes de la clínica. Por consiguiente, su presencia en el
tracto intestinal juega un papel clave en su colonización y patogénesis de C.
difficile. Los ácidos biliares derivan del colesterol y son sintetizados en el hígado.
Los ácidos biliares primarios son el ácido cólico y quenodesoxicólico, que después
son conjugados con los aminoácidos taurina o glicina. Son secretados en el
duodeno en respuesta a la ingesta y la mayor parte (95%) son reabsorbidos en el
íleo terminal y devueltos al hígado mediante la circulación enterohepática. Los
ácidos biliares primarios que llegan al intestino grueso (5%), son
biotransformados en ácidos biliares secundarios mediante enzimas secretados por
la microbiota intestinal de forma específica, interviniendo dos tipos de reacciones,
desconjugación y deshidroxilación. Los ácidos biliares secundarios más
abundantes son el ácido desoxicólico, litocólico y ursodesoxicólico. En individuos
sanos con una microbiota intestinal rica y diversa, los ácidos biliares primarios
311
germinantes, son rápidamente desconjugados por ciertos grupos de bacterias,
reduciendo su abundancia relativa y la probabilidad de germinación de las
esporas de C. difficile (Sarker, 2012). Los ácidos biliares secundarios inhiben
también el crecimiento, actividad y cantidad de las toxinas causantes de la clínica
(Thanissery, 2017). Como en los procesos de germinación y esporulación, el
proceso inhibitorio es variable en función de la cepa causal.
En el trabajo de Weingarden y col. donde se estudió la restauración de la

microbiota intestinal en pacientes con CDI sometidos a FMT, se evidenció que la
composición y cantidad de ácidos biliares es totalmente diferente en ambas
situaciones. La presencia de una carga elevada de ácidos biliares primarios en
pacientes con CDI de forma prevía al FMT sugirió su hidrolisis incompleta
(Weingarden, 2014). Por otro lado, los ácidos biliares secundarios estuvieron muy
disminuidos de forma posterior al FMT, enlazando la recuperación de la
microbiota intestinal con el equilibrio del metabolismo de los ácidos biliares.
Asimismo, en modelos murinos la administración de antibióticos y la posterior
colonización de C. difficile ha estado asociado a alteraciones en el perfil normal de
los ácidos biliares intestinales, concretamente con una disminución de ácidos
biliares secundarios y un aumento de ácidos biliares primarios (Theriot, 2014).
La microbiota intestinal aporta el enzima BaiCD (Bile-acid 7α-dehydroxylase)

que transforma los ácidos biliares primarios en secundarios, no obstante, esta
capacidad esta limitada a un grupo muy reducido de bacterias. Las bacterias cuyo
genoma codifique estos enzimas producirían un efecto inhibitorio sobre la
germinación de las esporas de C. difficile. Perder estos grupos supondría una
pérdida de este mecanismo de resistencia a la colonización.
Buffie y col. en un trabajo donde pretendían diferenciar los miembros de la

microbiota intestinal más influyentes en la resistencia a la colonización,
encontraron varios grupos de bacterias que correlacionaron de forma negativa
con la CDI, tanto en un modelo animal como humano. Los grupos encontrados
constituyeron el 6% de la microbiota intestinal normal y principalmente
estuvieron comprendidos en el cluster Clostridium XIVa de los clostridiales, por
tanto, en la familia Lachnospiraceae, incluyendo C. Scindens, donde se encontró la
312
correlación negativa más potente. C. Scindens presenta una actividad BaiCD 10
veces más potente que otros clostridiales, de ahí su particular importancia. Se
formuló por primera vez la hipótesis de si esta vía metabólica tan rara era la que
confería está capacidad de resistencia a la infección o por lo menos de si su
importancia era preponderante (Buffie, 2015). También aparecieron bacterias del
género Blautia, Eubacterium o Pseudoflavonifractor, siendo relevantes a este
respecto. En otro trabajo reciente, Solbach y col. cuantificaron el BaiCD gen cluster,
como medida de los niveles de bacterias intestinales con actividad BaiCD y
encontraron una potente correlación negativa con la CDI (Solbach, 2018). Kang y
col. mediante un estudio in vitro, añadieron a este hecho que las bacterias con
actividad BaiCD, además son capaces de secretar antibióticos derivados del
triptófano con actividad frente a C. difficile, en respuesta a los ácidos biliares
secundarios (Kang, 2019). Daquigan y col reexaminaron secuencias del gen ADNr
16S mediante un método de alta resolución y corroboraron la importancia de C.
Scindens en la resistencia a la colonización de C. difficile y de muchos miembros
del género Blautia (Daquigan, 2017).
El género Clostridium es filogenéticamente muy complejo y continuamente

se van reasignando especies a géneros de nueva creación (Yutin, 2013). Muchas de
las especies con actividad BaiCD se incluyen en el cluster Clostridium XIVa, muy
relacionadas unas con otras (Ridlon, 2016) que comprende principalmente a la
familia Lachnospiraceae (Collins, 1994). C. Scindens se engloba dentro del género
Lachnoclostridium y aunque observamos un aumento en el grupo CDI con respecto
a los grupos P y CTRL (3.2% en CDI frente a 0.8% en P y 0.3% en CTRL),
mediante la secuenciación del gen ADNr 16S se logra diferenciar que C. Scindens
es ligeramente mayor en el grupo de individuos colonizados que en pacientes con
CDI (0.0204% en CDI frente a 0.0744% en P, p=0.3375), remarcando la importancia
de este minoritario grupo en la inhibición de un microambiente intestinal
propicio para la germinación de las esporas de C. difficile que se amortigua en los
individuos colonizados. Respecto al género Blautia, que también ha sido
destacado en trabajos anteriores como un grupo de bacterias con actividad BaiCD
(Buffie, 2015; Daquigan, 2017) se conserva de igual forma en el grupo P en mayor
abundancia que en el grupo CDI (1.5385% en P frente a 0.5904% en CDI), llegando
a la misma conclusión. El género Eubacterium se situa en en difentes familias, por
313
las razones antes esgrimidas sobre la continua reorganización de los clostridiales.
En la familia Lachnospiracea se han situado varios grupos como Eubacterium
ventriosum Group, Eubacterium eligens Group, Eubacterium xylanophilum Group,
Eubacterium ruminantium Group, Eubacterium fissicatena Group, Eubacterium hallii
Group y Eubacterium oxidoreducens Group. Todos estos grupos se encuentran en
muy escasa abundancia en el grupo de controles sanos y se observa una práctica
erradicación en los pacientes con CDI y una mínima conservación en los sujetos
colonizados. En Eubacterium coprostanoligenes Group de la familia Ruminococcacea
se observa la misma tendencia. Todos estos resultados nos confirman que la
relación entre el metabolismo de los ácidos biliares por parte miembros de la
microbiota intestinal y su relación con la patogénesis de la CDI es un mecanismo
esencial, y el abordaje del presente estudio mediante un grupo de pacientes con
CDI y un grupo de individuos colonizados de C. difficile así lo muestra. No
obstante, es sugerible que en un futuro recurramos a una combinación de
estudios metabolómicos, de genómica funcional y de metagenómica, junto al
estudio del gen ADNr 16S para consolidar esta evidencia, ya que este por si solo
es insuficiente. Es posible que desconozcamos el total de miembros de la
microbiota intestinal con actividad BaiCD, además ya hemos visto que existen
grupos con alta y con baja actividad BaiCD (Doerner, 1997).
El género Ruminococcus Gnavus Group está aumentado tanto en el grupo de

pacientes con CDI como en los individuos colonizados (3.2% en CDI y 5.3% en P
frente a 0.7% en CTRL). Con respecto al aumento observado en Ruminococcus
Torques Group en ambos grupos con respecto a CTRL, resulta ligeramente más
pronunciado en P (1.8731% y 1.1256% en CDI y P frente a 0.915% en CTRL).
Ambos géneros, a diferencia de otros miembros del cluster Clostridium XIVa no
son productores de butirato (Dethlefsen, 2006), y son considerados especialistas
degradadores de mucina (Sicard, 2017). La capa mucosa intestinal se compone
principalmente de esta mucina, la cual está compuesta por complejos
aglomerados de glicoproteínas con glicanos O-ligados y es producida por las
células intestinales (goblet cells). Además, se ha visto que Ruminococcus Gnavus
presenta in vitro actividad β-glucuronidasa, con lo que puede inducir la formación
de componentes tóxicos en el colon y causar o perpetuar la inflamación local
(Beaud, 2005). De hecho, se ha evidenciado incrementos de su abundancia en la
314
microbiota intestinal de pacientes con enfermedad de Crohn (Joossens, 2011) y
este hallazgo se ha asociado a los mecanismos mencionados y a las propiedades
descritas. Por consiguiente, estos géneros dotarían de una ventaja selectiva para la
colonización de patógenos oportunistas como C. difficile. En el presente estudio se
observa el aumento tanto en pacientes con CDI como en individuos colonizados
por C. difficile, aunque podemos decir la tendencia es mayor en los individuos
colonizados, aunque no de forma significativa. Por tanto, este mecanismo es
común a ambos grupos de estudio y no es discriminador de ninguno de ellos,
pero coadyuva a la disbacteriosis generada en ambas cohortes de sujetos. Este
hallazgo no ha sido documentado en la bibliografía revisada al respecto de la
disbacteriosis asociada a la presencia de C. difficile, pero si en otras situaciones
como la enfermedad de Crohn (Joossens, 2011).
6.3.2.2 Diferencias de composición en los géneros de la familia Veillonellaceae

En los pacientes con CDI se produce una disminución en la familia

Veillonellaceae que en el grupo de controles sanos se compone mayoritariamente
de los géneros Megasphera y Dialister y en menor medida de Megamonas. En el
grupo CDI se observa una práctica erradicación de estos géneros y una expansión
de Veillonella (2.9121% en CDI frente a 0.0824% en CTRL), que aparece de forma
muy minoritaria en el grupo CTRL. En los individuos colonizados por C. difficile
se produce un ligero aumento en esta familia con respecto a los controles. No
obstante, se observa una perdida de Megasphera muy pronunciada, aunque sin
llegar a la erradicación que observamos en el grupo CDI, y un aumento de
Veillonella ligeramente superior al producido en el grupo CDI (4.5646% en CDI
frente a 0.0824% en CTRL). Dialister se conserva en el grupo P, llegando incluso a
aumentar levemente respecto a CTRL (6.0% en P frente a 5.1% en CTRL).
Megamonas, al igual que en grupo CDI, padece una total erradicación en el grupo
P. Por consiguiente, la principal diferencia en ambos grupos CDI y P, es la
conservación del género Dialister y una mayor expansión de Veillonella en P
respecto a CDI. Ambas cohortes presentan en común la práctica erradicación de
Megasphera y Megamonas.
315
La familia Veillonellaceae se compone de bacterias Gram negativas,
anaerobias estrictas, no formadoras de esporas y de morfología diversa. El género
tipo de la familia es Veillonella. Veillonella cumple estas características. Muchas
cepas de este género no fermentan los carbohidratos y sus mayores productos
metabólicos son el acetato y el propionato, por tanto, no se trata de un grupo
butirogénico. Forman parte de la microbiota oral, genitourinaria, respiratoria e
intestinal y pueden producir infecciones severas como bacteriemia, meningitis,
osteomielitis y endocarditis. El principal factor de virulencia asociado a su
potencial patogenicidad es que su lipopolisacárido bacteriano es muy endotóxico.
Asimismo, se ha observado que también tiene capacidad para reducir la actividad
microbiana de los neutrófilos. Dialister es otro género no butirogénico. Es un
miembro importante de la microbiota oral puesto que ha sido identificado en
variadas infecciones orales. También ha sido identificado en hemocultivos y
abcesos. Megasphaera presenta como metabolitos finales acetato, propionato,
valerato y butirato. También, como los géneros anteriores, se ha aislado en
muestras clínicas (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
En el reciente trabajo de Han donde se estudió la microbiota intestinal de

58 pacientes con CDI, 21 portadores asintomáticos y 20 controles, se observó una
disminución de la familia Veillonellaceae en ambos grupos donde se detectó
presencia de C. difficile en heces, aunque sin diferencias significativas. Asimismo,
ambos grupos presentaron de forma significativa niveles más elevados de
Veillonella y más disminuidos de Dialister, con respecto a los controles sanos (Han,
2019). En el estudio de Weingarden, en pacientes con CDI sometidos con éxito a
FMT para su curación, se observó que Veillonellaceae presentó mayores niveles
en las muestras “pre FMT” para después disminuir en las “post FMT”, sugiriendo
este hallazgo que no se trata de una familia beneficiosa, o por lo menos sus
géneros mayoritarios (Weingarden, 2014). Antharam y col. observaron que en
cohortes de pacientes con CDI y en pacientes con diarrea nosocomial no debida a
C. difficile se producían aumentos del género Veillonella con respecto a los
controles sanos (Antharam, 2013). Milani y col. también observaron que en
cohortes de pacientes con CDI se producían aumentos de los niveles de Veillonella
con respecto a un grupo de individuos que no habían recibido administración
antibiótica previa. Los autores consideran a Veillonella como un patógeno
316
oportunista que se expande debido a la simplificación de la microbiota intestinal,
y la aparición de nuevos nichos ecológicos disponibles en pacientes con CDI. En
Megasphaera y Dialister no se observan diferencias en ambos grupos, siendo
prácticamente indetectables (Milani, 2016).
En nuestro estudio, la expansión de un género potencialmente patógeno

oportunista como Veillonella observada en ambos grupos CDI y P es un hallazgo
que explicamos de forma similar a la de Milani y col., entendiendo que se
produce debido a la perdida de mecanismo de competitividad de nutrientes y de
ocupación de nuevos nichos ecológicos. Además, sus potenciales efectos debido a
la presencia de un lipopolisacárido bacteriano muy tóxico, podría añadir
severidad a la clínica de la CDI. No obstante, el hecho que este hallazgo también
se produzca en el grupo de individuos colonizados, incluso a mayores niveles,
nos indica que no se trara de un grupo demasiado importante ni discriminatorio.
Por otra parte, la erradicación de Dialister en el grupo de pacientes con CDI y el
ligero aumento en los individuos colonizados, lo colocaría como potencial
biomarcador que intervendría en la no transición desde un estado de colonización
a un estado de infección. No obstante, este hallazgo no concuerda con trabajos
anteriores. Excepto en el trabajo de Han y col., donde se observa una disminución
de los niveles de Dialister en individuos portadores y enfermos, ningún trabajo
acerca de la microbiota intestinal y su relación con la patogénesis de la CDI
destaca su importancia, por consiguiente, resulta difícil establecer un mecanismo.
Se trata de un género no butirógenico y ha sido aislado en cultivos
microbiológicos patológicos, además no se le reconocen efectos beneficiosos.
Recientemente, en un estudio que ha tenido gran repercusión y de gran potencia
estadística, se ha relacionado su disminución, junto a Coprococcus, con la
depresión y la ansiedad, y ha sido propuesto como psicobiótico (Valles-Colomer,
2019). El mecanismo de este potencial efecto beneficioso en este trastorno es
desconocido.
317
Acidaminococcaceae entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
En el grupo de pacientes con CDI se observa un aumento de la familia

Acidaminococcaceae con respecto a los controles sanos (3.5% en CDI frente a 2.2%
en CTRL). Este incremento es debido al aumento en los géneros
Phascolarctobacterium (2.7% en CDI frente a 2.2% en CTRL) y Acidaminococcus
(0.7410% en CDI frente a 0.0614% en CTRL). Por otro lado, en el grupo de
individuos colonizados por C. difficile se observa una reducción de la familia
Acidaminococcaceae con respecto a los controles sanos (0.5% en P frente a 2.2% en
CTRL). La reducción es debida a la disminución del género Phascolarctobacterium
(0.5% en P frente a 2.2% en CTRL) y a la erradicación completa de Acidaminococcus
(0% en P frente a 0.0614% en CTRL).
Zhang y col. observaron tanto en 8 pacientes con CDI como en 8

portadores asintomáticos de C. difficile que el género Phascolarctobacterium estaba
reducido en ambos grupos con respecto a los controles sanos (Zhang, 2015).
Asimismo, Han y col. observaron el mismo hallazgo en 21 individuos colonizados
y 58 pacientes con CDI (Han, 2019).
El género Phascolarctobacterium de la familia Acidaminococcaceae está

compuesto por bacterias Gram negativas, anaerobias estrictas y no formadoras de
esporas. El propionato y el acetato son los principales metabolitos producidos
mediante la fermentación del succinato. Se ha visto que Phascolarctobacterium
incrementa su abundancia como miembro de la microbiota intestinal tras la
administración de berberina y metfotmina, fármacos para reducir los niveles de
glucosa en sangre. Esto retralimenta los efectos beneficiosos de estos fármacos
(Zhang X, 2015). Otros estudios también han propuesto al género
Phascolarctobacterium como un grupo beneficioso de mecanismo desconocido (Wu,
2017). Se ha evidenciado que puede ser un componente bastante usual de la
microbiota normal en edad adulta, produciéndose una erradicación o
disminución en niños menores de un año y en mayores de 60 años, que son los
periodos donde se produce la mayor tasa de enfermedad digestiva o metabólica y
estos sendos hallazgos han sido interconectados (Wu, 2017).
318
Por lo tanto, se considera al género Phascolarctobacterium como beneficioso
para la salud por mecanismos no esclarecidos. Su papel en la microbiota intestinal
en el contexto de una CDI, según los trabajos anteriores comentados (Han, 2019;
Zhang, 2015), también nos sugeriría que es un potencial grupo beneficioso cuyos
niveles suelen disminuir y este hecho facilitaría la infección por C. difficile. No
obstante, este hallazgo también se produce en los portadores asintomáticos de C.
difficile, por tanto, a priori, no parece ser un género que nos discrimine y
caracterize ambas cohortes. Nuestros datos muestran que el género
Phascolarctobacterium esta reducido en el grupo de individuos colonizados por C.
difficile con respecto a los controles sanos, pero aumentado en el grupo de
pacientes con CDI, no concordando del todo con los datos observados en otros
trabajos. Podemos suponer que no se trata de un género clave en la patogénesis
de la CDI, aunque presente efectos beneficiosos y que no permite discriminar la
microbiota de ambos grupos CDI y P. Simplemente podemos afirmar que la
perdida de este género agrava la disbacteriosis de los individuos colonizados por
C. difficile.
El género Acidaminococcus esta formado por cocos Gram negativos,

anaerobios estrictos y no formadores de esporas. Un aspecto importante es que
presenta lipopolisacárido bacteriano, por tanto, posee poder patógeno. Puede
utilizar el aminoácido glutamato como única fuente de energía, mediante una vía
metabólica minoritaria dentro de los clostridiales, la vía (R)-2-hidroxiglutarato en
la cual intervienen enzimas poco usuales como la 2-hidroxiglutarato
deshidrogenasa, glutaconato CoA-transferasa, 2-hidroxiglutaril CoA-deshidratasa
y glutaconil CoA- descarboxilasa. Todos estos enzimas son sintetizados por el
género Acidaminococcus. Gough y col. evidenciaron que la perdida de diversidad
junto a un aumento de los niveles de Acidaminococcus se relacionaba con un futuro
menor crecimiento en niños de bajos recursos. La explicación que los autores
dieron al respecto se relacionaba con el hecho por el cual el género
Acidaminococcus fermenta el aminoácido glutamato, ya que este dato provoca un
efecto deletéreo en el crecimiento de estos niños, debido a la importancia del
glutamato en el metabolismo de los aminoácidos, balance de nitrógeno y en
funciones de barrera intestinal. Este hallazgo podría reflejar el estado de
319
malnutrición de estos niños, puesto que su microbiota intestinal se focaliza en
utilizar como fuente de energía las proteinas (Gough, 2015).
6.3.2.4 Diferencias de composición en los géneros de la familia Streptococcaceae

En el grupo de pacientes con CDI se observa un aumento de la familia

Streptococcaceae con respecto a los controles sanos (2.3% en CDI frente a 0.7% en
CTRL). Este incremento es debido en exclusiva a expensas del género
Streptococcus. Por otro lado, en el grupo de individuos colonizados por C. difficile
se observa un aumento más pronunciado (3.5% en P frente a 0.7% en CTRL),
también a expensas de dicho género. La diferencia entre los grupos CDI y P no es
estadísticamente significativa.
Los trabajos de comparación de microbiota intestinal de pacientes con CDI

frente a controles sanos, frente a individuos colonizados por C. difficile o en
estudios donde se ha comparado esta en pacientes con CDI antes y después a un
FMT, han arrojado resultados discrepantes y apenas se han puesto en valor en la
discusión de estos. Gu y col. observaron en un grupo de pacientes con CDI con
respecto a controles sanos un aumento estadísticamente significativo de las
bacterias productoras de ácido láctico, a las cuales pertenece el género
Streptococcus (Gu, 2016). Estos autores consideran a este género como patógeno
oportunista común que se expande cuando la microbiota intestinal es alterada por
antibióticos. Además, considera que la disminución de grupos butirogénicos, el
aumento de grupos productores de ácido láctico y la expansión de patógenos
oportunistas constituye un patrón de disbacteriosis que podría incrementar la
susceptibilidad al desarrollo de CDI. Por otra parte, en el trabajo de Antharam y
col. se objetivó que el género Streptococcus estaba característica y
significativamente disminuido en grupos de pacientes con CDI y con diarrea
nosocomial no debida a C. difficile (Antharam, 2013). Schubert y col. encontraron
que en pacientes con diarrea nosocomial no debida a C. difficile había mayor
probabilidad de que el género Streptococcus presentara una mayor abundancia, no
así en pacientes con CDI (Schubert, 2014). En trabajos como los de Shahinas y col.
y Brown y col. donde se ha estudiado la microbiota intestinal en pacientes con
320
CDI antes y después de un FMT se evidenció que Streptococcus estaba presente en
las muestras “pre FMT”, por tanto, de pacientes con CDI franca, pero que caía
drásticamente en las muestras “post FMT” para aproximarse a los niveles que se
encuentran en los donantes de heces (Shahinas, 2012; Brown, 2018). En trabajos de
comparación de microbiota en pacientes con CDI y portadores asintomáticos de
C. difficile se ha encontrado que Streptococcus estuvo ligeramente en mayores
cantidades en los portadores asintomáticos que en el grupo de pacientes con CDI
y el de controles sanos (Zhang, 2015). También en el similar trabajo de Han y col.
se encontró que existían ligeras disminuciones en ambos grupos de infectados y
colonizados por C. difficile sin diferencias estadísticamente significativas. Por
consiguiente, la bibliografía al respecto de este género nos lanza resultados
dispares, sugiriendo este hecho que la importancia en cuanto a su relación con la
patogénesis de la CDI podría ser menor.
El género Streptococcus, junto a otros géneros como Lactobacillus o

Enterococcus, pertenece a las llamadas Lactic Acid Bacteria (LAB). Streptococcus está
compuesto por cocos Gram positivos, no formadores de esporas, anaerobios
facultativos, aunque algunas especies requieren CO2 para su crecimiento. No
poseen enzimas como la peroxidasa o catalasa, de manera que para tolerar el
oxígeno recurre a metales como el selenio, manganeso o zinc. Durante su
evolución natural este género no adquirió la capacidad de sintetizar el grupo
hemo que es un componente esencial de los citocromos respiratorios, por tanto,
solo puede realizar un metabolismo respiratorio mediante la suplementación
exógena de hemina que obtiene de la hemoglobina del hospedador por medio de
la hemolisina. Debido a esto, recurre a una fermentación homoláctica para
obtener energía, de manera que produce ácido láctico a través de la ruta
glucolítica anaeróbica de Embden-Mayeroff a partir de diferentes monosacáridos
hexosas. Por otra parte, los disacáridos son hidrolizados en monosacáridos en el
exterior celular o bien son internalizados e hidrolizados en el interior celular
(Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
Se ha evidenciado en estudios in vitro que el ácido láctico reduce los

niveles de las toxinas TcdA y TcdB de C. difficile de forma dosis dependiente y de
forma independiente a la carga bacteriana (Kolling, 2012). En el mismo estudio
321
también se objetivó que los niveles de lactato luminal presentaban una correlación
inversa con los niveles de C. difficile en un modelo murino (Kolling, 2012). Por
consiguiente, el género Streptococcus y el resto de LAB resultarían beneficiosos en
este aspecto. Este hecho iría en contra de los estudios de comparación de
microbiota en cohortes de pacientes con CDI y controles sanos, como el de Gu y
col, donde se considera que la disminución de grupos butirogénicos, el aumento
de grupos productores de ácido láctico y la expansión de patógenos oportunistas
constituye un patrón de disbacteriosis que podría incrementar la susceptibilidad
al desarrollo de CDI.
Al igual que ocurre con la expansión del phylum Protebacteria, pensamos

que la expansión que se produce en el género Streptococcus es debida a la perdida
en la riqueza de anaerobios estrictos que supone una ventaja selectiva para los
anaerobios facultativos (Rivera-Chávez, 2016), como es el caso. La depleción de
grupos butirogénicos que hemos observado tanto en pacientes con CDI como en
individuos colonizados por C. difficile tras la administración antibiótica
principalmente, conlleva una reorientación metabólica en el colonocito hacia la
glucolisis anaerobia desde la beta-oxidación del butirato, lo que supone un menor
consumo de oxígeno y un aumento de la oxigenación en la superficie del colon
(Donohoe, 2012).
En base a nuestros resultados pensamos que la aparición del género

Streptococcus surje como efecto y no como causa en la disbacteriosis presente en
pacientes con CDI e individuos colonizados por C. difficile. Asimismo, si bien es
un género con potencial poder patógeno, pensamos que en el contexto de la CDI
se trata de un grupo protector, debido principalmente a la producción metabólica
de ácido láctico. El hecho de que en nuestro estudio se situen sus niveles de forma
superior en individuos colonizados que en infectados por C. difficile lo situa como
posible candidato a factor protector de moderada importancia, que explicaría en
parte, la no transición de un estado de colonización sin clínica a un estado de
infección.
322
6.3.2.5 Diferencias de composición en los géneros de la familia Enterococcaceae
En el grupo de pacientes con CDI se observa un aumento estadísticamente

significativo de la familia Enterococcaceae con respecto a los controles sanos
(0.6853% en CDI frente a 0% en CTRL). Este incremento es debido en exclusiva a
expensas del género Enterococcus. Por otro lado, en el grupo de individuos
colonizados por C. difficile se observa un aumento estadísticamente significativo,
aunque menos pronunciado (0.4993% en P frente a 0% en CTRL), también a
expensas de dicho género. La diferencia entre los grupos CDI y P no es
estadísticamente significativa.
Varios y diversos trabajos han evidenciado que los pacientes con CDI
presentan incrementos del género Enterococcus como miembro de la microbiota
intestinal. Sangster y col. al poner de manifiesto que la familia
Peptostreptococcaceae, donde se incluye actualmente C. difficile, se relacionaba
significativamente con el género Enterococcus en pacientes con CDI, concluyeron
que el incremento en dicho género patógeno oportunista era característico de
estos pacientes (Sangster, 2012). Milani y col. observaron un aumento en la
abundancia relativa de Enterococcus desde el 0.27% en sujetos que no habían
recibido tratamiento antibiótico, hasta el 16.86% en pacientes con CDI. Además,
también se aumentó en pacientes sin CDI pero que recibieron tratamiento
antibiótico hasta el 1.95%. Es por ello que los autores concluyeron que
Enterococcus debe ser considerado como un marcador de riesgo de desarrollo a
CDI y, por tanto, un suceso temprano en la cascada fisiopatológica que concluye
con la colonización de C. difficile (Milani, 2016). Otros trabajos han recalcado la
importancia de que el género Enterococcus forma parte de las LAB. Gu y col.
encontraron niveles aumentados en pacientes con CDI respecto a los controles
sanos y, además, mediante metagenómica evidenciaron que la familia
Enterococcaceae aumentaba en pacientes con CDI y en pacientes con diarrea
nosocomial no debía a C. difficile. Por tanto, los resultados mediante secuenciación
del gen ADNr 16S y mediante estudios metagenómicos fueron concordantes y
concluyeron que Enterococcus es un patógeno oportunista que se convierte en
dominante cuando la microbiota intestinal equilibrada está alterada debido a los
323
antibióticos (Gu, 2015). Antharam y col. también situaron a Enterococcus en este
contexto y recalcaron la importancia de que se trate de un género productor de
ácido láctico. Encontraron que en los pacientes con CDI la abundancia relativa de
Enterococcus aumentó al 7.1% desde el 0.05% que presentaron los controles sanos.
Enterococcus fue detectable en el 85% de los pacientes con CDI y solo en el 22% de
los controles sanos. Además, Enterococcus también estuvo aumentado en pacientes
con diarrea nosocomial no debida a C. difficile (Antharam, 2013).
En trabajos donde se ha comparado la microbiota intestinal en pacientes

sometidos a un FMT también se ha evidenciado que Enterococcus está presente en
las muestras “pre FMT” para desaparecer en las “post FMT” (Shahinas, 2012).
Brown y col. combinaron los estudios de secuenciación del gen ADNr 16S con la
cuantificación de los ácidos biliares. Encontraron que el género Enterococcus
estaba positivamente relacionado con los ácidos biliares primarios germinantes, y
negativamente con los ácidos biliares secundarios inhibidores. Los autores
concluyeron que Enterococcus debía actuar favoreciendo la germinación de las
esporas de C. difficile, aunque por mecanismos no definidos al completo (Brown,
2018).
En individuos colonizados por C. difficile también se ha evidenciado la

presencia de Enterococcus. Ya en 2004 Ozaki y col. observaron en 7 individuos
portadores de C. difficile, utilizando técnicas de cultivo, que estaban densamente
colonizados por Enterococcus y, por tanto, concluyeron que este género podría
estar asociado a la colonización por C. difficile. Zhang y col. encontraron que las
abundancias relativas de Enterococcus eran mayores en pacientes con CDI e
individuos colonizados por C. difficile frente a controles sanos de forma
estadísticamente significativa. De forma llamativa, aunque no significativa, los
niveles eran mayores en los individuos colonizados (5%) que en los infectados
(3%). Los autores expusieron que se desconoce el efecto y el rol de Enterococcus al
respecto de la CDI, aunque suponen que existe relación en el estado de la
enfermedad (Zhang, 2015). Han y col. también evidenciaron que los niveles de
Enterococcus eran mayores en pacientes con CDI e indiviuos colonizados por C.
difficile que en controles sanos (8.65% y 8.86% respectivamente frente a 0.56%) de
forma estadísticamente significativa. De manera interesante, también mostraron
324
que los sujetos de ambos grupos con baja carga del gen tcdB presentaron
abundancias relativas de Enterococcus muy superiores, de forma significativa, a
los sujetos con alta carga del gen tcdB (12.8% frente a 0.89%). Por tanto, sería un
género influenciado por la cantidad de toxina producida de C. difficile (Han, 2019).
Asimismo, en el trabajo prospectivo de Vincent y col. con 4 pacientes con

CDI y 4 sujetos colonizados por C. difficile, donde analizaron la microbiota
intestinal en diferentes días, observaron que en un individuo se producían picos
del género Enterococcus, pudiendo llegar a un 98% de abundancia relativa. Estos
picos se producían al recibir administración intravenosa de vancomicina. Los
autores concluyeron que este hecho podría representar un sobrecimiento de
Vancomycin Resistant Enterococci (VRE) (Vicent, 2016). Fujitani y col. unos años
antes ya habían mostrado la relación entre los VRE y la CDI, encontrando un 50%
de colonización por VRE en individuos colonizados por C. difficile (Fujitani, 2011).
El género Enterococcus está compuesto por cocos Gram positivos

dispuestos en pareja o en cadena, no formadoras de esporas y anaerobias
facultativas. Ciertas especies requieren CO2 para su crecimiento. La actividad
hemolítica es variable entre las especies y dentro de la misma especie. Se trata de
un grupo catalasa negativo que no expresa de forma completa los citocromos, al
igual que ocurre con el resto de LAB, ya que no puede sintetizar el grupo hemo.
No obstante, puede tolerar cierta toxicidad del O2 y son consideradas bacterias
microaerófilas. Al igual que el género Streptococcus presenta una fermentación
homoláctica produciendo ácido láctico como producto final a partir de la glucosa,
sin generación de gas (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
Enterococcus es un género miembro usual, aunque como componente muy

minoritario, de la microbiota intestinal normal. Las dos especies más comunes
encontradas en heces son Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium. Ambas
especies también son responsables de producir ciertas infecciones oportunistas
como endocarditis, peritonitis, sepsis, infecciones del tracto gastrointestinal y
colitis, infecciones del tracto urinario asociadas o no a catéter, endolftalmitis,
abcesos, infecciones de herida quirúrgica e infección endodóncica (Goh, 2017). E.
faecalis es responsable del 80-90% de las infecciones enterocócicas nosocomiales y
325
E. faecium del 10-15%. La razón de ello puede ser que E. faecalis es 100 veces más
abundante en el tracto gastrointestinal que E. faecium. Las infecciones raramente
se producen en pacientes inmunocompetentes ya que son típicas de pacientes
inmunocomprometidos o con presencia de comorbilidades (Goh, 2017).
Característicamente, la infección por estos patógenos oportunistas se inicia

con un sobrecrecimiento intestinal, traslocación a través de la barrera intestinal y
salida al torrente sanguíneo, hasta afectar algún órgano en pacientes
inmunocomprometidos. Siguiendo con esto, Brandl y col. mostraron en modelos
murinos que la reducción de bacterias Gram negativas de la microbiota intestinal
debido a la administración antibótica producía una reducción de la lectina RegIII
por las Paneth Cells. Esto generaba un aumento de VRE puesto que RegIII es una
lectina que selectivamente inactiva bacterias Gram positiva incluyendo VRE
(Brandl, 2008).
La patogénesis de Enterococcus viene dada por la presencia de factores de

virulencia y su resistencia a antibióticos. Estos factores de virulencia están
involucrados en la adhesión celular o a las proteínas de la matriz extracelular y
también están relacionados con la evasión al sistema inmune del hospedador. La
ausencia de estos factores de virulencia limita en gran medida el poder patógeno,
por consiguiente, su presencia es dependiente de la cepa. Los factores de
virulencia de Enterococcus faecalis han sido descritos mientras que en el caso de
Enterococcus faecium no ha sido posible debido a la difícil manipulación de los
cultivos aislados.
La citolisina es el factor de virulencia más importante y es expresado por

muchas cepas de E. faecalis. Es activa frente a células eucariotas y frente a otras
bacterias. Dicha actividad citolítica podría darle acceso a nutrientes que no serían
accesibles para cepas no citolíticas. Además, al actuar sobre los hematíes pone a
su disposición la hemina, con lo que es capaz de obtener energía mediante
respiración aeróbica. Las proteasas como la gelatinasa están implicadas en el daño
tisular que se produce durante la infección ya que degradan el tejido conectivo.
Además, degradan componentes clave del sistema inmune del hospedador e
interfieren en las viás de señalización celular del mismo, con lo que se facilita su
326
propia supervivencia. Las adhesinas conceden a Enterococcus la capacidad de
producir biofilms y la adhesión a proteinas de la matriz extracelular, que son paso
muy importantes en la infección temprana (Garsin, 2014).
Algunas cepas de Enterococcus también son capaces de producir

bacteriocinas con propiedades antimicrobianas. Es por ello por lo que algunos
miembros de dicho género tienen utilidad como probióticos y en la industria
alimentaria. Sus características para ello son la tolerancia al ambiente ácido
gástrico y las sales biliares intestinales, la adherencia a superficiales epiteliales
intestinales, la persistencia en el tracto gastrointestinal, la modulación del sistema
inmune y su actividad bactericida frente a patógenos intestinales incluido C.
difficile. Las bacteriocinas de Enterococcus, también llamadas enterocinas,
presentan un amplio espectro de actuación, incluso algunas tienen actividad
frente a esporas y frente a bacterias productoras de esporas. Algunas cepas son
capaces de producir varias de estas bacteriocinas, lo que les supone una ventaja
selectiva frente a otras especies del tracto intestinal (Hanchi, 2018).
Más concretamente en el tema que nos concierne, Mansour y col. en un

estudio donde pretendieron aislar y caracterizar nuevos probióticos capaces de
inhibir in vivo e in vitro C. difficile como estrategía efectiva y segura para controlar
la CDI, encontraron que uno de ellos se trababa de una mezcla de dos cepas de E.
faecalis y otra cepa de E. faecium. Ninguna de estas tres cepas presentaba el gen
cylA que codifica la citolisina, que es el mayor factor de virulencia que presenta
este género. Esto se comprobó también mediante la nula actividad hemolítica en
agar sangre. Las tres cepas fueron consideradas seguras en base a estos datos y a
que presentaron susceptibilidad antibiótica. La inhibición constatada tanto in vitro
como in vivo, se atribuyó a sustancias bactericidas (Mansour, 2018).
En resumen, nuestros datos muestran que tanto en pacientes con CDI

como en los individuos colonizados por C. difficile se observa una ligera
expansión del género Enterococcus. Este ligero aumento es inferior, en líneas
generales, al que encontramos en muchos otros trabajos (Milani, 2016; Antharam,
2013; Zhang, 2015; Han, 2019) donde se alcanzan cifras superiores en cuanto a las
abundancias relativas de este género, tanto en pacientes con CDI como en
327
individuos colonizados por C. difficile. Incluso en el trabajo prospectivo de Vicent
y col. se han evidenciado picos de Enterococcus atribuidos a la presencia de VRE al
administrar vancomicina (Vincent, 2016). Enterococcus es un género anaerobio
facultativo que es capaz de adaptarse a la presencia de O2 en su nicho ecológico.
Como explicamos para el phylum Proteobacteria o el género Streptococcus, grupos
que también toleran O2 y pueden adaptarse a un metabolismo oxidativo en ciertas
situaciones, la disbacteriosis que presentan ambos grupos de pacientes CDI y P
con perdida en la riqueza de anaerobios estrictos, supone una ventaja selectiva
para los anaerobios facultativos (Rivera-Chávez, 2016). La depleción de grupos
butirogénicos que hemos observado tanto en pacientes con CDI como en
(Donohoe, 2012). Por tanto, la aparición de Enterococcus parece ser efecto y no
causa de la disrupción de la microbiota intestinal hallada en estos individuos.
Tampoco, nuestros resultados muestran que sea un hallazgo diferenciador de la
microbiota intestinal de los pacientes con infección y los sujetos con colonización
por C. difficile, así como que los escasos trabajos anteriores similares al nuestro
tampoco lo muestran (Zhang, 2015; Han, 2019). Lo que si que coinciden muchos
trabajos es que tratan a Enterococcus como un género patógeno oportunista y que,
por tanto, podría colaborar de alguna manera en la disbacteriosis encontrada en la
infección y colonización por C. difficile, incluso exarcebando los síntomas de la
CDI. No obstante, pensamos que el tema no es tan sencillo. Ya hemos discutido
con el género Streptococcus que el ácido láctico generado como producto de
fermentación final reduce los niveles de las toxinas TcdA y TcdB de C. difficile de
forma dosis dependiente y de forma independiente a la carga bacteriana (Kolling,
2012). Por consiguiente, el género Enterococcus, al presentar el mismo producto
principal de fermentación resultaría beneficioso en este aspecto. Por otra parte, se
ha evidenciado en cepas carentes de producción de citolisina, su principal factor
de virulencia, que es capaz de inhibir C. difficile, tanto en modelos in vivo como in
vitro (Mansour, 2018). Por tanto, Enterococcus presenta una dualidad de efectos
positivos o negativos en función de la cepa de E. faecalis o E. faecium que formen
parte de la microbiota intestinal de los pacientes con CDI o individuos
328
colonizados por C. difficile. Para concluir, estamos de acuerdo que se trata de un
género característico de ambos grupos CDI y P, pero que para poder sacar
conclusiones sobre el poder que ejerce en la patogenicidad de la CDI se debería
recurrir a estudios metagenómicos para conocer la especie y el grado de
virulencia de esta.
6.3.2.6 Diferencias de composición en los géneros de la familia Lactobacillaceae

En el grupo de pacientes con CDI se observa un aumento no

estadísticamente significativo de la familia Lactobacillaceae con respecto a los
controles sanos (1.0287% en CDI frente a 0.0111% en CTRL). Este incremento es
debido casi en exclusiva a expensas del género Lactobacillus. Por otro lado, en el
grupo de individuos colonizados por C. difficile se observa un aumento menor que
tampoco es estadísticamente significativo (0.2269% en P frente a 0.0111% en
CTRL), también a expensas prácticamente de dicho género. La diferencia entre los
grupos CDI y P no es estadísticamente significativa.
Los trabajos que han estudiado la composición de la microbiota intestinal

en los pacientes con CDI en diversas situaciones tales como para valorar su
restauración tras un FMT, o comparándola con la de diferentes cohortes de
pacientes (sujetos colonizados, pacientes con diarrea nosocomial no debida a C.
difficile), no suelen incidir en la importancia del género Lactobacillus en este
contexto. No obstante, algunos estudios recogen este hallazgo como significativo.
Gu y col. encontraron en pacientes con CDI con respecto a los controles sanos un
aumento estadísticiamente significativo de la familia Lactobacillaceae. Además,
mediante análisis metagenómico se comprobó que el género Lactobacillus tenía
incrementado sus niveles en pacientes con CDI y en pacientes con diarrea
nosocomial no debida a C. difficile con respecto a los controles sanos. Los autores
concluyeron que la reducción de bacterias productoras de ácido butírico y el
aumento de bacterias productoras de ácido láctico sugieren susceptibilidad al
desarrollo de CDI (Gu, 2016). Por otra parte, en estudios que han incorporado
cohortes de individuos colonizados por C. difficile también se hallado en estos
incrementos en la familia Lactobacillaceae y el género Lactobacillus. Zhang y col.
329
evidenciaron tanto en pacientes con CDI como en individuos colonizados un
incremento significativo de Lactobacillus con respecto a los controles sanos,
aunque no llegó a superar el 1% en ninguno de los dos casos (Zhang, 2015). Los
autores concluyeron que si bien podía tener alguna influencia sobre el estado de
la enfermedad (infección o colonización), su rol específico es desconocido. Han y
col. en un trabajo similar, pero de mayor tamaño muestral, encontraron que la
familia Lactobacillaceae presentó incrementos en pacientes con CDI e individuos
colonizados por C. difficile con respecto a controles sanos (3.31% y 4.35 frente a
1.07%). De manera interesante, también mostraron que los sujetos de ambos
grupos con baja carga de gen tcdB presentaron abundancias relativas de
Lactobacillus muy superiores de forma estadísticamente significativa a los sujetos
con alta carga de tcdB (6.50% frente a 0.09%). Por tanto, es un género influenciado
por la cantidad de toxina de C. difficile, pero que no diferencia entre infección y
colonización (Han, 2019). Por último, en estudios que han evaluado la microbiota
intestinal en pacientes con CDI sometidos a FMT se ha evidenciado que en
muestras “post FMT” hay un incremento de Lactobacillus (Shahinas, 2012), por lo
que pudiera parecer que interviene en la restauración de forma positiva. A este
respecto Brown y col. encontraron que Lactobacillus presentaba una correlación
positiva con los ácidos biliares primarios y correlación negativa con los ácidos
biliares secundarios y por consiguiente, se asoció a susceptibilidad a desarollar
CDI (Brown, 2018).
El género Lactobacillus está compuesto por bacilos Gram positivos,

anaerobios facultativos, microaerófilos y no formadores de esporas. Pertenece al
orden de los Lactobacillales como los géneros Streptococcus y Enterococcus. El ácido
láctico es su principal producto proveniente del metabolismo de los carbohidratos
(al menos el 50%), por consiguiente, pertenece al grupo LAB. De acuerdo con el
tipo de fermentación de los carbohidratos pueden subdividirse en
homofermentadores obligados, heterofermentadores facultativos y
heterofermentadores obligados. Los homofermentadores obligados pueden
convertir las hexosas en ácido láctico por la vía Embden-Meyerhof, pero no
pueden metabolizar las pentosas. Los heterofermentadores facultativos además
pueden convertir las pentosas en ácido láctico y ácido acético, y etanol. En los
heterofermentadores obligados las hexosas son transformadas en ácido láctico,
330
CO2, etanol y ácido fórmicom, y ácido succínico. Las pentosas son convertidas en
ácido láctico y ácido acético (Mikelsaar, 2016).
TABLA 22: Propiedades metabólicas de Lactobacillus característicos de humanos.

mayormente negativo, bmayormente positivo, cinducible por pentosa. (Mikelsaar, 2016).
a
El genero Lactobacillus se compone de más de 170 especies y varias

subespecies con una gran variabilidad fenotípica y genotípica que hace muy
complicado generalizar acerca de sus miembros. Son miembros minoritarios de la
microbiota intestinal. Algunos de ellos son Lactobacillus fermentum, Lactobacillus
plantarum, Lactobacillus casei y Lactobacillus rhamnosus. Aunque los consideramos
parte de la microbiota intestinal comensal, también pueden comportarse como
patógenos oportunistas. Se han asociado a bacteriemias, colecistitis, endocarditis,
empiema, meningitis, peritonitis, pielonefritis, infecciones de prótesis y abcesos
dentales (Goldstein, 2012), poniendo de manifiesto que tienen capacidad
infecciosa en ciertas situaciones, normalmente en casos de pacientes
331
inmunodeprimidos o con enfermedades concomitantes. Su poder patógeno puede
venir de la capacidad de algunas cepas para adherirse a la mucosa intestinal lo
cual podría tener relación con la traslocación a la sangre, su capacidad para
adherirse al colágeno de la matriz extracelular, su capacidad para agregar
plaquetas y la producción de algunos enzimas como glicosidasas y proteasas que
pueden actuar en la citólisis de tejidos afectados (Sherid, 2016). No obstante, son
casos esporádicos y por lo que se conoce y se ha estudiado tanto a este género es
por sus propiedades beneficiosas respecto a la microbiota intestinal. Basicamente,
sus tres funciones son mantener y promover la resistencia a la colonización de
patógenos oportunistas, mantener funciones metabólicas en el hospedador
debido a sus metabolitos y modular la respuesta inmune innata atenunado la
inflamación crónica de bajo grado (Mikelsaar, 2016). Se ha evidenciado que el
incremento de Lactobacillus en el intestino ha correlacionado con numerosos
efectos beneficiosos como la reducción del riesgo a desarrollar infecciones
intestinales, disbacteriosis, enfermedades metabólicas y enfermedades
autoinmunes (Floch, 2019).
Los efectos beneficiosos de Lactobacillus se han atribuido a la síntesis de

diferentes moléculas de interés. Lactobacillus sintetiza AGCC debido a su
metabolismo fermentativo, principalmente ácido láctico, acético y succínico. El
ácido acético puede contribuir a la acidificación del microambiente intestinal y
este hecho es importante puesto que, junto al resto de LAB, puede competir con
otras bacterias menos acidófilas, que son la mayoría de las bacterias patogénicas
(Pessione, 2012). El ácido láctico modula la respuesta inmune innata al actuar
sobre neutrófilos y células epiteliales (Blad, 2012). Por otra parte, Lactobacillus
puede sintetizar acidos linoleicos conjugados que presentan efectos beneficiosos
en el cáncer, inflamación, enfermedades metabólicas y enfermedades
cardiovasculares. Asimismo, Lactobacillus participa en la detoxificación de
componentes fenólicos derivados del metabolismo proteínico por la microbiota
intestinal. Dichos compuestos fenólicos se formarían a partir de la degradación
bacteriana de aminoácidos aromáticos (Mikelsaar, 2016).
Centrándonos en los posibles efectos beneficiosos del género Lactobacillus

en la CDI y su papel como probiótico, en primer lugar, hay que decir que no todas
332
las especies de Lactobacillus tienen propiedades probióticas ya que la eficacia de
una bacteria probiótica es cepa dependiente (Goldstein, 2017). Las actuales guías
clínicas de diagnóstico, tratamiento y prevención de C. difficile (European Society of
Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Infectious Diseases Society of America,
Society for Healthcare Epidemiology of America) no recomiendan la administración de
probióticos como medida para prevenir o tratar la CDI (McDonald, 2018; Debast,
2014). Esta recomendación se ha establecido en base a que existe una enorme
variedad de probióticos disponibles y los ensayos clínicos que se hacen al
respecto son normalmente de poca calidad, con tamaños muestrales pequeños,
incontrolados y frecuentemente financiados por la casa comercial del mismo
probiótico. Por tanto, es difícil sacar conclusiones de peso y confirmar las
hipótesis acerca de sus mecanismos de acción (McFarland, 2009). No obstante, se
incide en que su utlilidad podría situarse en mayor medida en la prevención
primaria donde la alteración de la microbiota intestinal no sería tan profunda que
en la prevención secundaria, donde ya observamos cambios profundos con
perdida de riqueza, diversidad y grupos de bacterias importantes. A esta
confusión al respecto del valor de Lactobacillus como probiótico en CDI hemos de
añadir que el proceso de manufacturado y control de calidad también influyen en
las propiedades del producto finalizado. Por otra parte, una revisión en Cochrane
del año 2017 de 31 ensayos clínicos con 8672 pacientes concluyó que existía una
evidencia moderada para afirmar que los probióticos eran seguros y eficaces para
prevenir la CDI, sobre todo en pacientes no inmunocomprometidos o no
severamente debilitados (Goldenberg, 2017).
Puesto que como hemos dicho que existe una enorme variación en cuanto
la eficacia de las especies de Lactobacillus como tratamiento de la CDI, incluso en
diferentes prepraciones de la misma especie (Grześkowiak, 2011), vamos a
centrarnos en una formulación que funciona para revisar los posibles mecanismos
de acción. El probiótico Bio-K+ es una fórmula de Lactobacillus acidophilus CL 1285,
Lactobacillus casei LBC80R y Lactobacillus rhamnosus CLR2. Es un ejemplo de
probiótico bien caracterizado y eficaz en la reducción de la CDI cuando se
administra en nivel hospitalario (McFarland, 2018). Los efectos potenciales que
puede presentar un probiótico en la CDI son la restauración de la microbiota
intestinal, inhibición directa del crecimiento de C. difficile, neutralización de las
333
toxinas y modulación de la respuesta inflamatoria. Se ha evidenciado que Bio-K+
es capaz de modificar temporalmente la microbiota intestinal, presenta una fuerta
capacidad para competir frente a patógenos oportunistas como C. difficile debido a
la producción de ácidos orgánicos como el ácido láctico y la síntesis de
bacteriocinas y presenta la capacidad de neutralizar las toxinas debido al ácido
láctico y en general al ambiente ácido generado por los ácidos orgánicos
generados (McFarland, 2018). Asimismo, las bacteriocinas producidas por
Lactobacillus y en general por todas las LAB han cobrado reciente importancia.
Son moléculas peptídicas que interfieren con el crecimiento de otras bacterias.
Esta acción bactericida es selectiva y su espectro de acción varía en función de la
especie productora. Un ejemplo de bacteriocinas son los lantibióticos que pueden
actuar formando poros en la membrana celular de las bacterias e interfiriendo en
la síntesis de la pared celular (Pessione, 2012). Como hemos dicho, no todas las
especies de Lactobacillus presentan estas propiedades e incluso dentro de las
mismas especies hay grandes variaciones dependientes de la cepa.
Por consiguiente, Lactobacillus es un género complejo de interpretar en el

contexto de la CDI. Pensamos que su expansión en los pacientes con CDI y en
individuos colonizados por C. difficile, corroborada en nuestro estudio y en otros
(Zhang, 2015; Han, 2019), es debido a la misma razón por la que se produce la
expansión del phylum Proteobacteria y la expansión de otras LAB como
Streptococcus y Enterococcus. Lactobacillus es un género anaerobio facultativo,
incluso microaerófilo, que es capaz de adaptarse a la presencia de O2 en su nicho
ecológico. La disbacteriosis que presentan ambos grupos de pacientes CDI y P con
perdida en la riqueza de anaerobios estrictos, supone una ventaja selectiva para
los anaerobios facultativos (Rivera-Chávez, 2016). La depleción de grupos
butirogénicos que hemos observado tanto en pacientes con CDI como en
(Donohoe, 2012). Por tanto, la expansión de Lactobacillus es “efecto” y no “causa”
de la disrupción de la microbiota intestinal hallada en estos individuos. Por otra
parte, no encontramos diferencias significativas entre las abundancias relativas de
334
Lactobacillus entre los grupos CDI y P, pero sí con respecto a los controles sanos.
Este hecho también se ha constado en la bibliografía revisada (Zhang, 2015; Han
2019). Lo que si diferencia nuestros resultados con los de estos otros trabajos es
que la expansión de Lactobacillus es menor en nuestro estudio. Esto puede ser
debido a que la susceptibilidad antibiótica es muy variable según la especie y el
efecto es difícil de prever (Goldstein, 2012). También es difícil de prever lo que
supone a la patogénesis de la CDI este género. Hemos visto que algunas especies
y cepas de estas especies, no todas, presentan efectos beneficiosos sobre la CDI.
No obstante, también se han documentado casos de infecciones por Lactobacillus,
por tanto, puede presentar poder patógeno y comportarse como un patógeno
oportunista. Se deberían recurrir a estudios metagenómicos para caracterizar las
especies de Lactobacillus a expensas de las que se produce su aumento en los
pacientes con CDI y en los individuos colonizados por C. difficile, e incluso el tipo
de cepa para poder sacar conclusiones acerca de si suponen protección o
susceptibilidad al desarrollo de la CDI. Lo que sí que concluímos es que tanto
Lactobacillus como el resto de LAB son marcadores de disbacteriosis en ambos
grupos de individuos.

Peptostreptococcaceae entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
En el grupo de pacientes con CDI se observa un aumento estadísticamente

significativo de la familia Peptostreptococcaceae con respecto a los controles
sanos (0.5298% en CDI frente a 0.0600% en CTRL). Dentro de esta familia el
género más importante es Clostridioides que tiene como única especie a
Clostridioides difficile, que es el nombre propuesto recientemente en base a estudios
filogenéticos (Lawson, 2016). Para evitar la confusión y debido a la
convencionalidad del nombre clásico, nos seguiremos refiriendo a esta bacteria
como Clostridium difficile, aunque nos referiremos en este punto al género como
Clostridioides. Clostridioides está incrementado en el grupo CDI con respecto al de
los controles sanos de forma estadísticamente significativa (0.3668% en CDI frente
a 0% en CTRL). Por otro lado, en el grupo de individuos colonizados por C.
difficile también se observa un aumento estadísticamente significativo en la familia
Peptostreptococcacea (0.4781% en P frente a 0.0600% en CTRL) y un aumento del
335
género Clostridioides (0.3638% en P frente a 0% en CTRL). La diferencia entre los
grupos CDI y P no es estadísticamente significativa tanto para la familia
Peptostreptococcaceae como para el género Clostridioides. Por tanto, C. difficile
aparece en casi idéntica abundancia relativa tanto en los pacientes con CDI como
en los individuos colonizados, estando totalmente suprimido en los controles
sanos como era de esperar.
En nuestro estudio, la positividad del gen tcdB por PCR no distingue entre
colonización e infección, ya que en nuestra cohorte de individuos colonizados por
C. difficile el 53% presenta cepas toxigénicas. Esto está en línea con otros trabajos
al respecto (Planche, 2013). Asimismo, algunos estudios han sugerido que la carga
del gen de tcdB es un predictor de positividad de toxina libre (Kim, 2018), aunque
existen resultados contradictorios entre la carga del gen de tcdB y el desarrollo de
la infección (Davies, 2018). En el trabajo de Han y col., donde estudiaron la
microbiota intestinal de pacientes con CDI, individuos portadores asintomáticos
de C. difficile y controles sanos, subclasificaron los sujetos en base a la carga del
gen de tcdB, como sujetos high load tcdB y low high tcdB. La carga de toxina de tcdB
tampoco distinguió entre colonización e infección. Tampoco diferenció
diversidad, agrupamiento ni cambios importantes en géneros productores de
butirato beneficiosos (Han, 2019). Este hecho enlaza con nuestros resultados
donde la abundancia relativa de C. difficile es casi igual en ambos grupos,
sugiriendo que la mayor presencia de esta bacteria no distingue infección ni
colonización, asi como la mayor carga de gen de la toxina tampoco, es decir, la
mayor presencia de producción de toxina. En el trabajo de Zhang y col. se puso
hincapié en que el cluster Clostridium XI, donde se ubica C. difficile, disminuye su
abundancia relativa desde el grupo de pacientes con CDI, portadores
asintomáticos de C. difficile y controles sanos (6.5%, 1.6% y 0%), sugiriendo que la
infección implica mayor presencia de C. difficile (Zhang, 2015). Nosotros no
estamos de acuerdo con esta conclusión. Pensamos que nuestro estudio,
estimando la abundancia relativa del género Clostridioides mediante secuenciación
del gen ADNr 16S, aporta resultados más fiables y concluímos de forma diferente.
Como ya hemos comentado en apartados introductorios, las toxinas TcdA

y TcdB, sobre todo esta última, son las responsables de la clínica producida por C.
336
difficile. La expresión de las toxinas se produce al entrar el microorganismo en la
fase estacionaria de crecimiento, supuestamente debido a la limitación de
nutrientes. Los genes tcdA y tcdB se localizan en PaLoc o locus de patogenicidad.
De manera interesante, pueden producirse cambios en la región codificante de las
toxinas de PaLoc como inserciones, deleciones y mutaciones puntuales que
conforman una heterogeneidad genética, dando lugar a una serie de diferentes
toxinotipos. Esto supone que podrían existir cepas con diferente actividad y
especificidad de sus toxinas con respecto a la cepa de referencia de C. difficile VPI
10463 (Rupnik, 2016). Las cepas sin diferencias con respecto a la cepa de
referencia VPI 10463 pertenecerían al toxinotipo 0. Las que presentan diferencias
en los genes tcdA y tcdB se distribuyen en 34 toxinotipos restantes. Se categorizan
en toxinotipos mayores o menores con respecto a sus diferencias con respecto al
toxinotipo 0. La mayor parte de los toxinotipos producen ambas toxinas TcdA y
TcdB. También en su mayoría son capaces de producir la toxina CDT. Los
toxinotipos menores no producen CDT. Siete toxinotipos tienen fenotipo A-B+ y
CDT puede ser positiva o negativa. Los toxinotipos XIa al XId conforman el único
grupo con parte del PaLoc presente pero que no producen toxinas TcdA y TCdB,
pero producen CDT, por tanto, su fenotipo es A-B-CDT+. El fenotipo A+B- no se
detecta con las técnicas descritas de toxinotipado y no se engloba en ningún
toxinotipo específico (Monot, 2015). Los toxinotipos también pueden mostrar
correlación con los diferentes ribotipos, así que el ribotipado de las cepas puede
sugerir la variante génica de las toxinas (Rupnik, 2008). Por consiguiente, los
toxinotipos son importantes porque muestran propiedades funcionales de las
variantes de las toxinas de C. difficile, es decir mayor o menor actividad y mayor o
menor producción. Pero, la correlación entre los diferentes toxinotipos que nos
permita discriminar infección de colonización, así como severidad de la CDI, no
se ha clarificado. No obstante, una pista de que esto puede ser así nos la da el
ribotipo hipervirulento 027. En este ribotipo se produce una variación en el gen
tcdB (Lanis, 2010). La TcdB del ribotipo 027 tiene más poder citotóxico que las
cepas clásicas (Stabler, 2009). Esta variante de TcdB es capaz de traslocarse al
citosol de las células infectadas más rápidamente y el mecanismo de
autoprocesado es más eficiente, ya que presenta una estructura más favorable
para ello.
337
En uno de los pocos trabajos que han combinado el estudio de la
microbiota intestinal mediante secuenciación del gen ADNr 16S y el ribotipado de
las cepas toxigénicas causales en 105 pacientes con CDI, 66 pacientes con diarrea
nosocomial no debida a C. difficile y 37 controles sanos, los autores concluyeron
que existía una asociación entre el ribotipo 027 y su mayor capacidad de
colonización y la presencia de mayor cambio en la estructura de la microbiota
intestinal (Skraban, 2013
Las manifestaciones clínicas que produce la CDI abarcan desde

manifestaciones clínicas leves hasta complicaciones muy graves como colitis
pseudomembranosa, megacolon tóxico, íleo paralítico e incluso la muerte. Incluso
se puede producir una colonización asintomática de C. difficile. Este espectro de
situaciones es debido a que depende de factores que competen al individuo, como
el estado inmune, la presencia de comorbilidades, la edad y el grado de
compromiso de la microbiota intestinal, y también a C. difficile en cuanto a la
virulencia de la cepa causal. Nuestros resultados muestran que la abundancia
relativa de C. difficile es similar en individuos con infección y colonización. Es por
lo cual que factores concernientes a C. difficile deberían ser tenidos en cuenta en la
diferenciación entre la infección y la colonización. Pensamos que las variantes
toxinotípicas son un ejemplo al respecto. No olvidemos que los individuos
colonizados de nuestra cohorte, presentan un grado de compromiso de la
microbiota intestinal importante con escasas diferencias con los pacientes con CDI
de momento, aún algunos colonizados por cepas no toxigénicas. Por tanto,
nuestros datos apuntan a la importancia de evaluar factores de virulencia de C.
difficile en un futuro, junto a estudios de secuenciación masiva del gen ADNr 16S
y estudios metagenómicos.
6.3.2.8 Diferencias de composición en los géneros de la familia Erysipelatrichaceae


estadísticamente significativo de la familia Erysipelatrichaceae con respecto a los
controles sanos (4.3% en CDI frente a 1.8% en CTRL). Este incremento es debido
casi en exclusiva a expensas de los géneros Erysipeloclostridium (2.9% en CDI
338
frente a 0.2% en CTRL) y de Clostridium innocuum Group (1.0% en CDI frente a
0.0115% en CTRL), produciéndose en el segundo género una diferencia
estadísticamente significativa. Por otro lado, en el grupo de individuos
colonizados por C. difficile se observa una ligera disminución de
Erysipelatrichaceae no estadísticiamente significativa (p=0.0521) (1.6% en P frente
a 1.8% en CTRL). No obstante, también se produce una expansión, aunque menos
pronunciada de Erysipeloclostridium (1.2% en P frente a 0.2% en CTRL) y de C.
innocuum Group (0.2% en P frente a 0.0115% en CTRL), produciéndose únicamente
en el segundo género una diferencia estadísticamente significativa. Además, se
producen perdidas en el grupo P de géneros minoritarios como Catenibacterium,
Holdmanella, Faecalitalea y Erisipelotrichaceae UCG-003, no tan pronunciado en el
grupo CDI. La diferencia a nivel de la familia Erypelatrichaceae entre los grupos
CDI y P es estadíscamente significativa (4.3% en CDI frente a 1.6% en CTRL). Los
géneros Erysipeloclostridium (2.9% en CDI frente a 1.2% en P) y C. innocuum Group
(1.0% en CDI frente a 0.2% en P) presentan mayores abundancias relativas en el
grupo de pacientes infectados que en el los sujetos colonizados, produciéndose
únicamente en el segundo género una diferencia estadísticamente significativa.
En pocos trabajos se ha puesto en valor la importancia de la familia

Erysipelatrichacea en el contexto de la CDI. Han y col. observaron un ligero
aumento en el grupo de pacientes con CDI (1.25%) y una disminución en el grupo
de individuos colonizados (0.67%) con respecto a los controles sanos (1.13%).
Ninguna diferencia fue estadísticamente significativa. Asimismo, se produce una
total erradicación del género Catenibacterium en los grupos de infectados y
colonizados con respecto a los controles sanos (0.53%). Estos resulados estarían en
la misma línea de los nuestros. Los autores consideran que la erradicación de
Catenibacterium en ambos grupos de infectados y colonizados por C. difficile
podría ser un marcador específico de disbacteriosis (Han, 2019). En el trabajo de
Rea y col. donde estudiaron la microbiota intestinal en individuos de elevada
edad portadores de C. difficile, también se observó una reducción de
Erysipelatrichaceae estadísticamente significativa (Rea, 2012).
La familia Erysipelatrichaceae pertenece a la tercera clase Erysipelatrichia

del phylum Firmicutes. Está comprendida por bacilos Gram positivos, inmóviles,
339
no formadores de esporas, aeróbicos o anaeróbicos facultativos,
quimiorganótrofos y de metabolismo respiratorio y débilmente fermentativo
(Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
Está familia es un miembro constituyente muy minoritario de la

microbiota intestinal y se ha considerado que tiene efectos fisiológicos y
patológicos (Kaakoush, 2015). No obstante, en los trabajos donde se ha
mencionado no se le ha dado demasiada importancia. Los miembros de esta
familia presentan dos características importantes. Por un lado, parecen ser
altamente inmunogénicos y por otro se expanden, en mayor o menor medida,
después de administración antibiótica. La abundancia relativa de
Erysipelatrichaceae se ha correlacionado con los niveles de TNFα en pacientes con
infección crónica de VIH respecto a controles sanos (Dinh, 2015). Igualmente, el
hecho de que su abundancia relativa esté incrementada en el cáncer colorrectal
pone de manifiesto su potencial importancia en procesos inflamatorios
intestinales (Chen, 2012). Además, en un modelo murino se ha evidenciado que
Erysipelatrichaceae se expandió tras la administración de gentamicina (Zhao,
2013). No obstante, los trabajos al respecto de la relación entre la familia
Erysipelatrichaceae y la enfermedad inflamatoria intestinal han arrojado
evidencia inconsistente (Kaakoush, 2015).
Erysipelatoclostridium es un género de nueva creación comprendido por

bacilos Gram positivos, inmóviles, anaerobios obligados, no formadores de
esporas y de matebolismo fermentativo (Yutin, 2013). La especie tipo es
Erysipelatoclostridium ramosum aunque comprende también a Erysipelatoclostridium
cocleatum, Erysipelatoclostridium saccharogumia y Erysipelatoclostridium spiriforme.
Este nuevo género se situa en el cluster Clostridium XVIII y recientemente ha sido
confirmado como un grupo de bacterias monofilogenético (Parks, 2018).
Erysipelatoclostridium es un género potencialmente patógeno escasamente
prevalente que suele afectar a pacientes inmunocomprometidos, menores de 5
años y ancianos. No obstante, debido a su dificultad de cultivo es posible su
infradiagnóstico. Se han documentado casos de gangrena gaseosa, otitis media,
anemia hemolítica no autoinmune, pielonefritis, osteomielitis, artritis,
bacteriemia, etc (Zakham, 2019). De forma interesante, también se ha asociado a
340
casos de peritonitis, abceso intestinal y colitis pseudomembranosa (Alcalde-
Vargas, 2012), aunque es un grupo muy minoritario de la microbiota intestinal.
Los hallazgos de nuestro estudio al respecto de este género nos indican una
mayor expansión en los pacientes con CDI (2.9%) que en individuos colonizados
por C. difficile (1.2%) con respecto a los controles sanos (0.2%). Esta expansión es
presumiblemente debida a la aparición de nuevos nichos ecológicos debido a la
perdida de diversidad y riqueza en ambos grupos CDI y P. Debido al carácter
patógeno de este género y al efecto proinflamatorio intestinal de la familia
Erysipelatrichaceae (Dinh, 2015), consideramos un hallazgo relevante este hecho y
que podría tener repercusión en la transición del estado colonización sin clínica a
un estado de infección. Este hecho no ha sido valorado en ningún trabajo acerca
de la patogénesis de la CDI.
Clostridium innocuum es un microorganismo ubicado en el cluster

Clostridium XVIa aunque actualmente pertence a la familia Erysipelatrichaceae. Es
una especie de bacilos Gram positivos, inmóviles, anaerobios estrictos,
formadores de esporas y de metabolismo fermentativo complejo (Bergey´s
Manual of Systematic Bacteriology, 2012). Pertenece junto a Erysipelatoclostridium
ramosum y a Clostridium clostridioforme al grupo RIC. Se trata de un miembro
minoritario de la microbiota intestinal con poder patógeno capaz de producir
infecciones extraintestinales infrecuentes (aunque es posible que exista un
infradiagnóstico debido a la complejidad de identificación) pero muy graves
(Chia, 2017), sobre todo en pacientes ancianos con enfermedades de base.
Asimismo, también es un agente causal de infecciones gastrointestinales
secundarias al consumo de antibióticos como diarrea, colitis severa y colitis
pseudomembranosa (Chia, 2018). Una particularidad de esta especie es que es
resistente a la vancomicina, ya que presenta una alanina-D-alanina
carboxipeptidasa que elimina el residuo terminal D-alanil-D-alanina de alta
afinidad para la vancomicina que impediría la síntesis del precursor de la pared
celular bacteriana (Chia, 2017). Es posible que su único mecanismo de virulencia
sea la existencia de estructuras similares al lipolisacárido bacteriano (Chia, 2017).
Por tanto, la expansión de esta especie, debido a la aparición de nuevos nichos
ecológicos de forma secundaria a la administración de antibióticos, en pacientes
con CDI que no observamos en individuos colonizados por C. difficile es un
341
hallazgo que se debe tener en cuenta. Debido a su poder patógeno intestinal
(Chia, 2017) y extraintestinal (Chia, 2018), capacidad inflamatoria (Dinh, 2015),
podría tener repercusión en la transición del estado colonización sin clínica a un
estado de infección. Este hecho no ha sido valorado en ningún trabajo acerca de la
patogénesis de la CDI. Por consiguiente, los miembros patógenos de la familia
Erysipelatrichaceae que hemos observado, se expanden en los pacientes con CDI,
pero en mucho menor medida en los individuos colonizados por C. difficile y
debido a ello podrían ser predisponentes al desarrollo de CDI. Solo en otros
estudios prospectivos, donde se evalue la microbiota de una cohorte en situación
basal y luego se observe los que evolucionen a CDI o no, se podría saber si este
hallazgo es causa o consecuencia de la CDI.

phylum Bacteroidetes entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
En el apartado 6.3.1 “Diferencias de composición a nivel de phylum”

discutimos el incremento en las abundancias relativas que se observa en el phylum
Bacteroidetes en ambas cohortes de pacientes con CDI e individuos colonizados
con C. difficile con respecto a los controles sanos. Ahora vamos a discutir a costa
de que familias y géneros son debidos estos aumentos.

 Aumento estadísticamente significativo en la familia Bacteroidaceae
Tannerellaceae (4.7% en CDI frente a 1.1% en CTRL), Marinifilaceae
(1.0% en CDI frente a 0.2% en CTRL), Barnesiellaceae (0.8% en CDI
frente a 0.4% en CTRL) y Rikenellaceae (2.9% en CDI frente a 2.6% en
CTRL).
 Disminuciones no estadísticamente significativas en las familias
Muribaculaceae (0.8% en CDI frente a 1.5% en CTRL) y Prevotellaceae
342
significativas en el grupo P con respecto a controles sanos son las siguientes:
 Aumento estadísticamente significativo en la familia Bacteroidaceae
(29.1% en P frente a 11.0% en CTRL).
 Aumento no estadísticamente significativo en la familia Tannerellaceae
(2.3% en CDI frente a 1.1% en CTRL) y Rikenellaceae (2.7% en P frente
a 2.6 en CTRL)
 Disminuciones estadísticamente significativas en las familias
Muribaculaceae (0.0% en P frente a 1.5% en CTRL) y Prevotellaceae
(1.4% en P frente a 2.5% en CTRL) y Barnesiellaceae (0.2% en P frente a
0.4% en CTRL).
 La familia Marinifilaceae presenta igualdad de abundancias relativas
en los grupos Py CTRL (0.2% en P frente a 0.2% en CTRL).
En consecuencia, podemos considerar que las diferencias a nivel de familia

con respecto al grupo de controles sanos que encontramos de forma común en los
grupos CDI y P, son el aumento acentuado en Bacteroidaceae y el ligero aumento
en Rikenellaceae.
Por el contrario, las diferencias más llamativas en el patrón de

disbacteriosis a nivel de familias del phylum Bacteroidetes, con respecto a
controles sanos de los grupos CDI y P, son la disminución en Prevotellaceae más
pronunciada en P que en CDI, la disminucíon en Muribaculaceae más
pronunciada en P (erradicación total) que en CDI, el aumento en Tannerellaceae
más pronunciado en CDI que en P, el aumento de Marinifilaceae en CDI que no
se observa en P y el aumento en Barnesiellaceae en CDI mientras que en P se
observa una disminución.
Por tanto, si bien las familias mayoritarias se comportan de forma similar

en ambas cohortes de pacientes infectados y colonizados por C. difficile, en las
familias minoritarias encontramos diferencias que discutiremos a continuación.
343
6.3.3.1 Diferencias de composición en los géneros de la familia Bacteroidaceae
En el grupo de pacientes con CDI se observa un llamativo aumento

estadísticamente significativo de la familia Bacteroidaceae con respecto a los
en exclusiva al género Bacteroides. Por otro lado, en el grupo de individuos
colonizados por C. difficile se observa otro llamativo aumento aún mayor que el
encontrado en el grupo CDI y que es estadísticamente significativo (29.1% en P
frente a 11.0% en CTRL), también a expensas totalmente de dicho género. La
diferencia entre los grupos CDI y P no es estadísticamente significativa.
Bacteroides es un género que la mayor parte de la comunidad científica ha

asociado su depleción a CDI y la perdida de resistencia a la colonización. No
obstante, en algunos trabajos evidenciamos resultados similares a los nuestros,
donde hemos encontrado un aumento en su abundancia relativa. En estudios
donde han comparado la microbiota intestinal de pacientes con CDI y portadores
asintomáticos de C. difficile se han visto resultados discordantes. Zhang y col.
observaron en 8 pacientes con CDI, 8 portadores asintomáticos (ambos grupos de
individuos hospitalizados) y 8 controles sanos que el género Bacteroides estaba
muy disminudo en infectados (11%), mientras que se conservaba en mayor grado
en colonizados (24%) frente a los controles sanos (31%). Los autores exponen que
dicho género se ha visto muy afectado por la administración antibiótica (Zhang,
2015). Por otra parte, Han y col. en un trabajo con mayor tamaño muestral, con 58
pacientes con CDI y 21 individuos colonizados por C. difficile, encontraron que la
familia Bacteroidaceae estaba ligeramente aumentada en los pacientes infectados
(23.5%) frente a los controles sanos (20%), y los individuos colonizados
presentaron una ligera disminución (18.6%) (Han, 2019). En el estudio de Dong y
col. donde encontraron 12 portadores asintomáticos de C. difficile al realizar un
screnning en población china, observaron que la microbiota intestinal de estos
pacientes presentaba un descenso significativo de Bacteroides (Dong, 2018). Rea y
col. en una cohorte de ancianos en instituciones de la tercera edad observaron que
su microbiota intestinal presentaba descensos en la familia Bacteirodeceae (56%)
344
con respecto a los controles sanos (63%) (Rea, 2012). Por tanto, ciertamente hay
disparidad de resultados.
Los estudios que han analizado la restauración de la microbiota intestinal

en pacientes con CDI sometidos a FMT han mostrado que la expansión de
Bacteroides es un hallazgo común. Weingarden y col. observaron que en las
muestras “pre FMT” la familia Bacteroidaceae representaba menos del 1%
mientras que en las muestras “post FMT” su abundancia relativa se acercaba a la
de los donantes de heces (Weingarden, 2014). Las cifras tan extremas en las
muestras “pre FMT” de los pacientes con CDI podrían deberse a que se trataba de
pacientes sometidos a varios ciclos de antibióticos con varios fracasos
terapeúticos. Shahinas y col. observaron un gran incremento de Bacteroides tras el
FMT, que se acompañó de un descenso de Escherichia/Shigella (Shahinas, 2012).
Brown y col. en un trabajo similar donde además determinarón los niveles de
diferentes ácidos biliares primarios y secundarios, concluyeron que la depleción
de Bacteroides que estuvo asociada de forma estadísticamente negativa a los ácidos
biliares primarios, significaba una perdida de resistencia a la colonización
(Brown, 2018).
Los estudios donde que han comparado la microbiota intestinal de

pacientes con CDI con diferentes cohortes muestran resultados discrepantes con
respecto al género Bacteroides, aunque la tendencia es que en estos pacientes con
CDI está disminuido. Milani y col. observaron una disminución de Bacteroides en
pacientes con CDI (11%) con respecto a una cohorte de individuos sanos que no
habían recibido tratamiento antibiótico (30%). No obstante, en sujetos que sí
habían recibido tratamiento antibiótico pero que no presentaban CDI, Bacteroides
no disminuía (31%) (Milani, 2016). En otros trabajos también se ha evidenciado la
perdida de Bacteroides en pacientes con CDI (Sangster, 2016; Vicent, 2013; Skraban,
2016). Schubert y col. mediante un modelo estadístico donde combinaron factores
clínicos y datos de la microbiota intestinal de pacientes con CDI, concluyeron que
la depleción de Bacteroides era indicativo de una mayor probabilidad de CDI
(Schubert, 2014). Gu y col. confirmaron la disminución de Bacteroides en pacientes
con CDI y con diarrea nosocomial no debida a C. difficile evidenciada mediante
secuenciación masiva del gen ADNr 16S y mediante estudios metagenómicos
345
(Gu, 2016). No obstante, y de forma llamativa, Antharam y col. observaron un
aumento de Bacteroides en pacientes con CDI (29.5%) y con diarrea nosocomial
no debida a C. difficile (45.7%) con respecto a controles sanos (16.1%) (Antharam,
2013).
El género Bacteorides esta compuesto por bacilos de extremos redondeados

Gram negativos, inmóviles, anaerobios estrictos, quimiorganótrofos, sacarolíticos
aunque débilmente proteolíticos, de metabolismo fermentativo donde los
mayores productos de fermentación son el succinato y el acetato. Comprende más
de 60 especies, siendo Bacteroides fragilis la especie tipo. Las especies de este
género conforman un grupo heterogéneo bioquímica y fisiológicamente (Bergey´s
Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
Bacteroides presenta la particularidad de presentar múltiples mecanismos

bioquímicos para adaptarse al medio que le rodea. Algunas especies codifican
una citocromo oxidasa que provocaría la reducción de los niveles de oxigeno
intracelular y por extensión de los niveles de oxigeno en el intestino. Esto
permitiría la supervivencia de bacterias anaerobias estrictas que se beneficiarían
de esta propiedad de Bacteroides, para las cuales el O2 es letal (Baughn, 2004).
Posiblemente está sea una de las causas de su amplia propagación en el intestino
de múltiples mamíferos y ser uno de los géneros componentes mayoritarios de la
microbiota intestinal humana. Por otra parte, Bacteroides presenta una inusual
capacidad de reconocer y metabolizar una gran cantidad de polisacáridos
provenientes de la dieta y del mismo hospedador. Como ya avanzamos en el
apartado “6.3.1.1. Diferencias a nivel de phylum entre los grupos CDI y CTRL”,
Bacteroides codifica un gran número de CAZYmes (Carbohidrate-Active Enzymes),
que metabolizan estos polisacáridos (El Kaoutari, 2013). Estos genes se localizan
en los llamados PULs (Polysaccharide Utilization Loci) de su cromosoma bacteriano.
Bacteroides presenta múltiples PULs que les permiten adaptarse de forma rápida a
cambios en la disponibilidad de estos nutrientes en el intestino (Tuson, 2018). Este
hecho es importante, puesto que en el colon los carbohidratos accesibles para las
bacterias en su mayoría han sido absorbidos o consumidos, y el remanente lo
componen polisacáridos no digeribles que muchas bacterias no pueden
metabolizar. Bacteroides sí es capaz de degradar estos polisacáridos, adaptarse a
346
ellos y generar carbohidratos más simples que sí pueden asimilar otras muchas
bacterias. Dicho todo esto, otro aspecto destacable es que la competición por los
nutrientes entre miembros de la microbiota intestinal es mayor cuando los grupos
de bacterias están mas relacionados filogenéticamente, puesto que de esta manera
comparten genes y capacidades funcionales (Wexler, 2017). Este hecho implicaría
que la depleción del género Bacteroides evidenciada en los pacientes con CDI e
individuos colonizados por C. difficile por muchos autores (Sangster, 2016; Vicent,
2013; Skraban, 2016), aunque no observada en nuestro estudio, podría tener
menos influencia a priori en la perdida de la resistencia a la colonización por
mecanismos de competición de nutrientes, ya que está sería más acusada con la
pérdida de miembros del phylum Firmicutes, en especial de la clase Clostridia,
más cercanos filogenéticamente a C. difficile. Por consiguiente, el género
Bacteroides podría ser más insustancial en este aspecto, aunque esté considerado
un género beneficioso. Se ha observado en un modelo murino que C. difficile es
capaz de degradar la mucina intestinal y metabolizar los ácidos siálicos que la
componen (Ng, 2013). Esto le permitiría expandirse en el intestino y ocupar un
nicho ecológico. Además, la disponibilidad de los ácidos siálicos de la mucosa
intestinal existente tras una disbacteriosis post antibiótica permitiría y sería un
factor importante en la expansión de C. difficile y debido a la gran actividad sobre
los carbohidratos del género Bacteroides, el incremento transitorio post antibiótico
de estos monosacáridos liberados desde la mucosa intestinal proporcionaría una
oportunidad de expansión para C. difficile.
Por otra parte, Bacteroides es considerado beneficioso al respecto de su

capacidad inmunomoduladora puesto que presentan la capacidad de activar las
células dendríticas intestinales que inducen a las células plasmáticas de la mucosa
intestinal a secretar IgA, que es una vía de defensa innata frente a patógenos
oportunistas como C. difficile (He, 2007). Asimismo, algunas cepas de Bacteroides
secretan bacteriocinas como la BSAP-1 (Bacteroidales Secreted Antimicrobial protein
1) (Wexler, 2017).
Con respecto a los estudios que han evaluado directamente la influencia

de Bacteroides en la CDI, Yoon y col. demostraron que Bacteroides ovatus era capaz
de inhibir in vitro el crecimiento de C. difficile y que este efecto estuvo mediado
347
por los ácidos biliares y por enzimas que secreta el género Bacteroides como la
BSH que inhibien la germinación de C. difficile. La BSH actúa disminuyendo la
reabsorción ácidos biliares desconjugados en el intestino, por tanto, los miembros
que producen este enzima inhiben la proliferación de C. difficile mediante su
efecto sinérgico con BaiCD (Yoon, 2017). Deng y col. observaron que mediante un
tratamiento profiláctico bacterioterápico con Bacteroides fragils se disminuia la
mortalidad y morbilidad en ratones con CDI. Este hallazgo fue atribuido a la
inhibición de la proliferación de C. difficile, modulación de la microbiota intestinal
e inhibición de la destrucción de la barrera intestinal, mitigando el estres epitelial
y la colitis (Deng, 2018).
Bacteroides también es considerado un patógeno oportunista, ya que es

agente etiológico de multitud de infecciones, principalmente intraabdominales.
La adquisición de factores de virulencia es lo que provoca que un género
comensal, miembro importante de la microbiota intestinal pueda ser en un
momento dado un patógeno oportunista. El principal factor de virulencia es la
presencia de polisacáridos capsulares (Coyne, 2001).
Por lo tanto, el género Bacteroides presenta una dualidad comensal y

patógeno oportunista. Mediante estudios in vitro y en modelos murinos se ha
evidenciado en algunas especies una capacidad para mitigar la CDI (Deng, 2018;
Yoon, 2017). Presenta una actividad inmunomoduladora en procesos
inflamatorios intestinales que podría limitar la respuesta inmune exacerbada que
se observa en los pacientes con CDI (Hee, 2007). Por otra parte, Bacteroides
presenta una inusual capacidad de reconocer y metabolizar una gran cantidad de
polisacáridos provenientes de la dieta y del mismo hospedador. Es capaz de
degradar estos polisacáridos, adaptarse a ellos y generar carbohidratos más
simples que sí pueden asimilar otras muchas bacterias. Pero como la competición
por los nutrientes entre miembros de la microbiota intestinal es mayor cuando los
grupos de bacterias están mas relacionados filogenéticamente (Wexler, 2017)
implicaría que la depleción del género Bacteroides evidenciada en los pacientes
con CDI e individuos colonizados por C. difficile por muchos autores (Sangster,
2016; Vicent, 2013; Skraban, 2016), aunque no observada en nuestro estudio,
podría tener menos influencia a priori en la perdida de la resistencia a la
348
colonización por mecanismos de competición de nutrientes, ya que está sería más
acusada con la pérdida de miembros del phylum Firmicutes, en especial de la clase
Clostridia, más cercanos filogenéticamente a C. difficile. Dicho todo esto, y puesto
que Bacteroides es un género muy adaptable a diferentes condiciones ambientes,
las abundancias relativas que encontramos en diferentes poblaciones son
variables y eso ha dificultado encontrar asociación con ciertas situaciones
patológicas (Johnson, 2017). Los trabajos que han estudiado la microbiota
intestinal de la CDI, en distintas situaciones, podrían establecer que podría
tratarse de un género protector, ya que la principal tendencia es la disminución de
sus abundancias relativas en los pacientes con CDI. No obstante, en algunos
trabajos como el Antharam y col. se observó un aumento de los niveles de
Bacteroides en pacientes con CDI y con diarrea nosocomial no debida a C. difficile
con respecto a los controles sanos (Antharam, 2013). En el trabajo de Han se
encontraron niveles de Bacteroides muy parecidos entre pacientes con CDI,
individuos colonizados por C. difficile y controles sanos (Han, 2019). Nuestros
resultados van en la línea de estos hallazgos, con un aumento similar de
Bacteroides en los pacientes con CDI y en los individuos colonizados con respecto
a los controles sanos. Es llamativa la abundancia relativa tan baja de Bacteroides en
el grupo de los controles sanos, así como también muy baja en el grupo de
controles sanos de Antharam y col. Es posible la que perdida de diversidad y
riqueza observado en los grupos CDI y P haya afectado en mayor medida al
phylum Firmicutes con respecto a Bacteroidetes, y que debido a la baja abundancia
relativa de Bacteroides en los controles sanos, pareciera que aumenta en los
pacientes infectados y colonizados por C. difficile. Al encontrar este hallazgo en
ambos grupos CDI y P, no se trata de un género que explique en parte la no
transición desde un estado de colonización a infección, que se observa en los
individuos colonizados de C. difficile.
6.3.3.2 Diferencias de composición en los géneros de la familia Tannerellaceae


estadísticamente significativo de la familia Tannerellaceae con respecto a los
349
en exclusiva al género Parabacteroides. Por otro lado, en el grupo de individuos
colonizados por C. difficile se observa otro aumento de menor medida que el
encontrado en el grupo CDI, estadísticamente significativo (2.3% en P frente a
1.1% en CTRL), también a expensas totalmente de dicho género. La diferencia
entre los grupos CDI y P no es estadísticamente significativa. Dentro de la
abundancia relativa del género Parabacteroides en el grupo CDI, un 2.7%
comprende a la especie Parabacteroides merdae y el 2.0% es Parabacteroides spp. Con
respecto al grupo de los individuos colonizados, un 1.0% pertenece a la especie P.
merdae y el 1.3% es Parabacteroides spp.
Pocos trabajos han destacado la importancia del género Parabacteroides con

respecto a su papel en la patogénesis de la CDI. Rea y col. mostraron que
Parabacteroides era el género dominante en 2 pacientes ancianos con CDI (97.4%
y 61.5% frente al 15.0% en el grupo control y 8.5% en 20 portadores asintomáticos
de C. difficile) (Rea, 2001). Zhang y col. encontraron que Parabacteroides presentaba
un aumento estadísticamente significativo en pacientes con CDI (10%) y
portadores asintomáticos de C. difficile (15%) (Zhang, 2015). Han y col. obtuvieron
que Parabacteroides presentó un incremento estadísticamente significativo en
pacientes con CDI (3.8%) y en individuos colonizados (5.0%) con respecto a los
controles sanos (1.3%) (Han, 2019). Lo único que se ha aportado en la discusión de
estos trabajos es que posiblemente este incremento sea debido a un fenómeno de
expansión debido a una perdida de mecanismos de resistencia a la colonización
por competición de los nutrientes, es decir, por la aparición de nuevos nichos
ecológicos. En el trabajo de Shahinas y col, se observó que Parabacteroides
aumentaba de forma significativa de forma posterior a un FMT en 6 pacientes con
CDI (Shahinas, 2012). Por lo tanto, estamos ante un género que suele presentar
abundancias relativas incrementadas tanto en pacientes con CDI y en individuos
colonizados por C. difficile, en mayor o menor medida. Esto estaría en la misma
línea que nuestros resultados. Además, el incremento suele ser mayor en los
colonizados que en los infectados, aunque en nuestro estudio ocurre lo contrario.
Parabacteroides es un género de nueva creación compuesto por bacilos

Gram negativos, anaerobios estrictos, no formadores de esporas, inmóviles,
350
sacarolíticos, cuyos mayores metabolitos producidos son el ácido acético y el
ácido succínico (Sakamoto, 2006).
En el trabajo de Khanna y col. donde compararon la microbiota intestinal

de pacientes con CDI con y sin recurrencia posterior, evidenciaron que el género
Parabacteroides era un predictor muy potente de recurrencia (Khanna, 2016a). Por
otra parte, Parabacteroides diastonis es una especie productora de succinato como
principal metabolito. En un modelo murino se observó que el succinato está
presente en muy baja concentración en el intestino y que se elevaba de forma
transitoria después de administración antibiótica o después de un tratamiento
que alterara el transito intestinal. C. difficile era capaz de expandirse utilizando
como fuente de energía este succinato más accesible. Con este trabajo se intentó
identificar el mecanismo subyacente por el cual P. diastonis es predictor de
recurrencia (Ferreyra, 2014). Por otra parte, P. diastonis es capaz de potenciar la
colitis en ratones con disbacteriosis y con la microbiota intestinal intacta, por lo
tanto, este trabajo evidencia su poder patógeno por si mismo (Dziarski, 2016). En
otro trabajo donde se estudió la microbiota intestinal en ratones infectados con C.
difficile ribotipo 027, que desarrollaron una infección crónica más contagiosa
durante un mayor periodo de tiempo, se observó que P. diastonis era una especie
patógena oportunista importante. Los autores también observaron que el perfil de
los AGCC estaba alterado con una disminución de butirato y acetato y un
incremento del succinato, que correlacionó con la presencia de P. diastonis
(Lawley, 2012). Por último, P. diastonis ha sido recientemente evidenciada como la
especie más representada en una cohorte de pacientes con enfermedad de Crohn
(Lopetuso, 2017).
Como conclusión, tenemos muchas evidencias de que Parabacteroides es un

género patógeno oportunista que se expande cuando se genera una disbacteriosis
intestinal y que colabora en la clínica observada en varios trastornos intestinales.
Hemos dicho que P. diastonis es capaz de potenciar la colitis en ratones con
disbacteriosis y con la microbiota intestinal intacta (Dziarski, 2016). Con respecto
a la CDI hemos visto que el succinato, principal metabolito de P. diastonis, permite
la expansión de C. difficile, ya que es utilizado por este como fuente de energía
(Ferreyra, 2014). La bibliografía revisada nos ha mostrado que Parabacteroides
351
presenta elevadas abundancias relativas tanto en pacientes con CDI como en
individuos colonizados por C. difficile, aunque la tendencia es que el aumento es
mayor en los colonizados (Zhang, 2015; Han, 2019). No obstante, nuestros
resultados indican un aumento en ambos grupos de pacientes, aunque es mayor
en los pacientes con CDI. Concluímos que es un género característico de la CDI y
marcador de la disbacteriosis presente tanto en individuos colonizados como
infectados. Es difícil apresurarse a decir que es un género que diferencia el estado
de los infectados y de los colonizados, ya que a raíz de sus mecanismos
subyacentes en la patogénesis de la CDI y de la bibliografía al respecto, harían
falta estudios metagenómicos para concretar que especies están en juego.
6.3.3.3 Diferencias de composición en los géneros de la familia Prevotellaceae

En el grupo de pacientes con CDI se observa un descenso estadísticamente

significativo de la familia Prevotellaceae con respecto a los controles sanos (2.0%
en CDI frente a 2.5% en CTRL). Por otro lado, en el grupo de individuos
colonizados por C. difficile se observa otro descenso estadísticamente significativo
(1.4% en P frente a 2.5% en CTRL), aunque mas pronunciado que el encontrado
en el grupo CDI. La diferencia entre los grupos CDI y P no es estadísticamente
significativa. A nivel de género de esta familia destacan la práctica erradicación
de Prevotella 9 en los pacientes con CDI con respecto a controles sanos que no se
observa en los colonizados (0.0213% en CDI frente a 1.8% en CTRL y 1.3% en P),
la expansión de Prevotella 7 en el grupo CDI que no se observa en los controles
sanos ni en el grupo P (1.2% en CDI frente a 0.0003% en CTRL y 0.0% en P), el
aumento de Paraprevotella en los pacientes con CDI y el descenso en los
individuos colonizados con respecto a los controles sanos (0.4986% en CDI y
0.0473% en P frente a 0.1805% en CTRL).
La pérdida del género Prevotella y de otros miembros de la familia

Prevotellaceae en los pacientes con CDI es un hallazgo evidenciado en muchos
trabajos (Vincent, 2013; Skraban, 2013; Rea, 2012). No obstante, en trabajos donde
se ha comparado la microbiota intestinal de pacientes con CDI e individuos
colonizados por C. difficile también se ha evidenciado esta pérdida en los
352
colonizados. Zhang y col. encontraron una perdida más pronunciada en Prevotella
en los portadores asintomáticos, rozando la erradicación, que en los pacientes con
CDI, cuando se compararon los datos de ambos grupos con respecto a los
controles sanos donde su abundancia relativa fue entorno al 5% (Zhang, 2015). En
el trabajo de Han y col. con 58 pacientes con CDI, 21 individuos colonizados y 20
controles sanos, también se evidenció una pérdida de Prevotella en infectados
(1.4%) y colonizados (0.6%) con respecto a los controles sanos (8.2%), aunque de
nuevo más profunda en colonizados (Han, 2019). En el grupo de 12 portadores
asintomáticos del estudio de Dong y col. también observaron una práctica
erradicación de Prevotella en estos con respecto a los controles sanos (0.03% frente
a 5.53%). Los autores expusieron la hipótesis de que Prevotella es un género que
protegería al hospedador frente a la colitis inflamatoria producida por patógenos
debido a su papel en la digestión de carbohidratos complejos y a la producción de
sustratos esenciales para el colonocito (Dong, 2018). Discutiremos esto más
adelante porque existe una dualidad de efectos beneficiosos y efectos
proinflamatorios.
El género Prevotella está comprendido por bacterias Gram negativas,

anaerobias, no formadoras de esporas, inmóviles, moderadamente sacarolíticas
cuyos principales metabolitos glucolíticos son el acetato y el succinato, aunque
generan bajos niveles de otros AGCC. Prevotella copri es la principal especie
componente de la microbiota intestinal (Bergey´s Manual of Systematic
Bacteriology, 2012). Los géneros que manejamos en nuestro estudio, Prevotella 7 y
Prevotella 9, provienen de la base de datos que utilizamos para asignar las
secuencias SILVA con el fin de incrementar la resolución de la familia
Prevotellaceae (Henderson, 2019). Este género presenta más de 40 especies, casi
todas ellas se ubican en la cavidad oral y algunas forman parte de la microbiota
intestinal.
La abundancia relativa de Prevotella como componente de la microbiota

intestinal parace estar influenciada por la dieta. Es más común en dietas ricas en
vegetales y se correlacionado con el vegetarianismo (Wu, 2011). Aunque otro
trabajo ha evidenciado que el efecto de simples ingredientes de la dieta sobre
Prevotella no es fácilmente predecible (Singh, 2017). Otro hecho importante es que
353
Bacteroides y Prevotella son antagónicos, es decir, o predomina uno o predomina
otro, debido a fenómenos de competición por los nutrientes (Kovatcheva-
Datchary, 2015). Asimismo, los miembros del género Prevotella se adaptan a los
cambios ambientales y nutricionales de la microbiota intestinal modulando la
expresión génica y adquiriendo y perdiendo genes (Gupta, 2015). Esto supone
que sea un género con una gran diversidad génica y que exista una gran
variabilidad en las cepas, lo que es probable que explique la diferente respuesta
de Prevotella a la dieta o a diversas condiciones. Estos datos podrían sugerir que se
trata de un grupo beneficioso, pero también se ha asociado a procesos
inflamatorios. Algunos estudios han demostrado que en los pacientes infectados
con VIH existe una disbacteriosis intestinal caracterizada por un incremento de
Prevotella y un descenso de Bacteroidetes (Luzupone, 2013). Incluso se ha sugerido
que Prevotella sea la causa principal de la inflamación intestinal persistente
observada en estos pacientes y que esto conduzca a una alteración funcional de la
mucosa intestinal e inflamación sistémica crónica (Dillon, 2014). Por lo tanto,
algunas cepas de Prevotella se comportan como patobiontes proinflamatorios y se
expanden en un ambiente inflamatorio, exhibiendo una capacidad intrínsica
superior de estimular los linfocitos Th17, comparada con otros miembros
comensales de la microbiota intestinal (Larsen, 2017). Por otra parte, se ha
evidenciado en ratones tratados con antibióticos que la adición de P. copri
incrementa la susceptibilidad a la colitis inducidad por dextrato sulfato sódico. La
hipotésis de los autores del estudio fue similar a las del trabajo de Dillon y col., es
decir, P. copri podría haberse expandido en un ambiente proinflamatorio y
exacerbar la misma inflamación (Scher, 2013). No obstante, se requieren más
estudios en humanos para caracterizar el rol de Prevotella en las distintas
patologías donde se ha visto que se incrementan sus abundancias relativas. Pero
Prevotella no solo exhibe siempre propiedades proinflamatorias, debemos hablar
solo de especies y cepas específicas de este género con esta capacidad de
patobionte.
Por otra parte, como ya comentamos cuando discutíamos el papel de

Parabacteroides en la CDI, en un modelo murino se observó que el succinato está
presente en muy baja concentración en el intestino y que se elevaba de forma
transitoria después de administración antibiótica o después de un tratamiento
354
que alterara el transito intestinal. C. difficile era capaz de expandirse utilizando
como fuente de energía este succinato más accesible (Ng, 2013). Prevotella, al igual
que Parabacteroides es un género cuyo principal metabolito generado es el
succinato. Podría permitir o ayudar en la expansión de C. difficile mediante el
mismo mecanismo. Por otra parte, P. copri es capaz de potenciar la colitis en
ratones tanto con disbacteriosis como con la microbiota intestinal intacta, por lo
tanto, se evidencia su poder patógeno por si mismo (Dziarski, 2016).
Por consiguiente, en nuestro estudio observamos una disminución de la

famila Prevotellacea en los grupos CDI y P, aunque más pronunciado en P. En el
género Prevotella 9 en los pacientes con CDI se produce una prática erradicación
con respecto a controles sanos que no se observa en los colonizados que
conservan una gran parte. Con respecto a Prevotella 7 en el grupo CDI se observa
una expansión que no se observa en los controles sanos ni en el grupo P. Como
hemos explicado anteriormente, Prevotella es un género con una gran diversidad
genética y con mucha variabilidad funcional en sus especies y cepas. Algunas de
estas tienen un efecto beneficioso ya que participan en la digestión de
carbohidratos complejos, pero otras se comportan como patobiontes
proinflamatorios. Además, el hecho que el género Prevotella sea productor de
succinato podría favorecer la expansión intestinal de C. difficile (Ng, 2013). El
hecho que Prevotella y Prevotellaceae esté disminuido en pacientes con CDI es un
hallazgo evidenciado en varios trabajos y no se suelen encontrar resultados
contradictorios, por lo cual es un marcador de disbacteriosis en estos pacientes
(Vincent, 2013; Skraban, 2013; Rea, 2012). En individuos colonizados por C. difficile
se han encontrado abundancias relativas de Prevotella aun más bajas que las que
presentan los pacientes con CDI (Zhang, 2015; Han, 2019). En nuestro estudio
ocurre lo mismo, la depleción es mayor en colonizados. Esto podría tener una
explicación. El género Prevotella 9 que está erradicada en el grupo CDI, aunque sin
embargo se conserva en los colonizados y en los controles sanos, podría
comprender a grupos beneficiosos, de los que se verían privados los pacientes con
CDI y no los controles sanos ni los colonizados. Por otra parte, el género Prevotella
7 que se expande en los pacientes con CDI y se mantiene erradicado en los
controles sanos y en los colonizados, podría comprender a esas especies
patobiontes proinflamatorias. Debido a la pérdida de miembros del phylum
355
Firmicutes y de grupos productores de butirato se produciría un ambiente
intestinal proinflamatorio, que permitiría la expansión de especies comprendidas
en el género Prevotella 7 en los pacientes con CDI. Esto por alguna razón no
dilucidada no ocurriría en los individuos colonizados por C. difficile. Por tanto, si
mediante estudios metagenómicos se identifican especies y cepas beneficiosas y
proinflamatorias podríamos encontrar un biomarcador que explique en parte la
diferencia entre el estado de colonización e infección. No obstante, los niveles de
Prevotella 7 y Prevotella 9 nos parece un buen punto de partid para ello.
Con respecto al género Paraprevotella ya hemos visto que es un grupo

minoritario de la microbiota intestinal de los controles sanos (0.1805%).
Asimismo, se produce una disminución en los individuos colonizados por C.
difficile (0.0473%) y un aumento en los pacientes con CDI (0.4986%). En ambos
casos se trata de diferencias estadísticamente significativas. El aumento de este
género en pacientes con CDI ha sido documentado por Milani y col. (0.24% en
CDI con respecto a 0.1% en una cohorte de individuos que no han recibido
administración antibiótica) (Milani, 2016). No obstante, Han y col. observaron una
erradicación de Paraprevotella en pacientes con CDI y en individuos colonizados
con respecto a los controles sanos (0.10% en CDI y 0.04% en P frente a 0.48% en
controles sanos) (Han, 2019)
El género Paraprevotella comprende dos especies, Paraprevotella clara y

Paraprevotella xylaniphila. Se trata de bacterias Gram negativas, no formadoras de
esporas, inmóviles, anaerobios estrictos, con el succinato y el acetato como
principales productos de fermentación (Moritoni, 2009). El hecho de que sea un
género productor de succinato podría permitir la expansión de C. difficile (Ng,
2013), como explicamos con el género Prevotella. Se ha evidenciado en algunas
enfermedades como la enfermedad de Behcet o la cirrosis biliar primaria, una
expansión de Paraprevotella en la microbiota intestinal de estos pacientes (Ye, 2018;
Lv, 2016). Los autores de estos estudios han postulado que este género podría
provocar una respuesta inmune exacerbada y provocar un daño tisular en la
barrera intestinal epitelial.
356
Por consiguiente, aunque Paraprevotella es un género poco estudiado y
mencionado en su relación con la patogénesis de la CDI, en base a nuestros
resultados y su asociación con otras enfermedades, postulamos que podría
tratarse de un género que favorecería la creación de un ambiente inflamatorio que
ayudaría a desencadenar una respuesta inmune exacerbada en los pacientes con
CDI y a aumentar el daño tisular. Asimismo, la no expansión de este género en
los individuos colonizados por C. difficile resultaría beneficioso para evitar el
desarrollo de clínica.
6.3.3.4 Diferencias de composición en los géneros de la familia Rikenellaceae entre

los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
En el grupo de pacientes con CDI y en el grupo de sujetos colonizados por

C. difficile no se observan diferencias estadísticamente significativas en las
abundancias relativas de la familia Rikenellaceae con respecto a los controles
sanos (2.9% en CDI y 2.8% en P frente a 2.6% en CTRL). Asimismo, tampoco hay
diferencias significativas entre los grupos CDI y P. El género más representativo
de esta familia en los tres grupos de estudio es Alistipes. Por consiguiente,
podemos considerar que la abundancia relativa de Alistipes en los 3 grupos de
estudio es similar y presenta una abundancia relativa cercana al 3%.
Alistipes es un género que diversos autores han puesto en valor en cuanto

a que se trata de un grupo protector de la CDI. Milani y col. destacaron que la
pérdida de Alistipes, junto con la expansión de Enterococcus, conforman un suceso
previo que conllevaría a la cascada de eventos que provoca la pérdida de
resistencia a la colonización que se observa en los pacientes con CDI (Milani,
2016). Este descenso de la abundancia relativa de Alistipes observada en el trabajo
de Milani desde el 11% de los controles sanos hasta el 1.25% en los pacientes con
CDI, ha sido corroborada por otros trabajos (Gu, 2016). Shahinas y col. también
observaron que la abundancia relativa de Alistipes se restauraba en los pacientes
sometidos a FMT con éxito (Shahinas, 2012). Por otra parte, Zhang y col.
evidenciaron una pérdida de Alistipes tanto en pacientes infectados como en
individuos colonizados por C. difficile, con respecto a los controles sanos (Zhang,
2015). No obstante, Han y col. observaron abundancias relativas similares de
357
Alistipes en pacientes con CDI y en controles sanos, mientras que se observó un
leve aumento en los individuos colonizados (Han, 2019). El trabajo de Han y col.
pondría en valor la hipótesis de Milani al respecto de que Alistipes es un grupo
que confiere protección frente a la CDI, puesto que presenta un aumento en los
individuos colonizados por C. difficile. Nuestros resultados son discrepantes a este
respecto, puesto que no encontramos diferencias significativas entre los pacientes
infectados, individuos colonizados y los controles sanos. Por tanto, no podríamos
concluir con nuestros resultados que es un grupo protector, sino más bien
intrascendente.
La familia Rikenellaceae es fenotípicamente diversa y engloba a dos

géneros que son Alistipes y Rikenella. Alistipes es componente de la microbiota
intestinal en humano mientras que Rikenella es más frecuente en animales.
Alistipes es un género compuesto por bacterias Gram negativas, anaerobias
estrictas, no formadoras de esporas e inmóviles, cuyo principal producto de
fermentación es el ácido succínico y en menor medida el ácido acético. Su poder
patógeno es controvertido, se ha aislado en algunos cultivos de infecciones
polimicrobionas junto a otros gérmenes anaerobios, pero no hay consenso acerca
de su potencial patogenicidad (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology,
2012).
Como hemos expuesto anteriormente, Alistipes y su perdida en los

pacientes con CDI es un hallazgo que muchos autores han remarcado. A partir de
aquí se ha supuesto que se trata de un grupo protector. Otros estudios han
evaluado este poder protector. Schubert y col. en un estudio con ratones y
aplicando un modelo estadístico random forest, identificaron una serie de grupos
de bacterias que restauraron la resistencia a la colonización que se perdería con la
administración antibiótica, y entre estos se encontraba el género Alistipes
(Schubert, 2014). También se ha evidenciado mediante otro estudio que Alistipes
finegoldii atenuó la colitis inducida por dextrano sulfato sódico en ratones
(Dziarski, 2016). Asimismo, en un reciente metanálisis que tuvo por objetivo
identificar biomarcadores de la microbiota intestinal en distintas patologías
intestinales incluida la CDI, se ha correlacionado a Alistipes con un estado de
salud (Mancabelli, 2017). Por otra parte, como ya comentamos con otros géneros
358
productores de succinato, en estudios con ratones se ha observado que el
succinato está presente en muy baja concentración en el intestino y que se elevaba
de forma transitoria después de administración antibiótica y C. difficile era capaz
de expandirse utilizando como fuente de energía este succinato más accesible en
esta nueva situación (Ng, 2013). Alistipes, de forma similar a Prevotella y
Parabacteroides, podría permitir o ayudar en la expansión de C. difficile mediante el
mismo mecanismo.
Por consiguiente, los trabajos realizados al respecto del estudio de la

microbiota intestinal en la CDI y también, los trabajos experimentales con
modelos murinos nos sugieren que el género Alistipes se asocia con un estado de
salud y que resultaría protector de la CDI. No obstante, nuestros resultados
mostrarían que Alistipes es un género irrelevante, puesto que no observamos
diferencias significativas ni fehacientes entre los grupos de infectados y
colonizados por C. difficile y los controles sanos. Lo lógico hubiese sido evidenciar
una pérdida de Alistipes en los pacientes con CDI y una conservación en el grupo
P con respecto a los controles sanos. Es difícil dar una explicación a este hecho.
Sabiendo que existe una variabilidad interindividual en la microbiota intestinal
de la población sana mientras que las interrelaciones metabólicas permanecen
estables, la microbiota intestinal funcionaría como un ecosistema dinámico que
ejerce funciones metabólicas, fisiológicas, inmunológicas y de protección frente a
patógenos (Hollister, 2014). Por lo tanto, podemos formular la hipótesis por la
cual la cual Alistipes podría presentar en nuestra cohorte de controles sanos unos
niveles reducidos de partida puesto que otros grupos de bacterias ejercerían sus
funciones protectoras, y por ello no observaríamos un descenso en su abundancia
relativa en los pacientes con CDI.
6.3.3.5 Diferencias de composición en los géneros de la familia Barnesiellaceae


estadísticamente significativo de la familia Barnesiellaceae con respecto a los
al género Barnesiella. Por otro lado, en el grupo de individuos colonizados por C.
359
difficile se observa una reducción estadísticamente significativa (0.2% en P frente a
0.4% en CTRL), también a expensas totalmente de dicho género. La diferencia
entre los grupos CDI y P no es estadísticamente significativa.
El género Barnesiella comprende a dos especies, Barnesiella viscericola y

Barnesiella intestinihominis. Se trata de bacilos Gram negativos, no formadores de
esporas, inmóviles, anaerobios estrictos, de metabolismo fermentativo
estrictamente sacarolítico cuyos principales metabolitos son el ácido succínico y
acético (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012). Se trata de un género
minoritario en la microbiota intestinal humana, normalmente por debajo del 1%.
Pocos estudios han intentado evidenciar el rol de Barnesiella como

componente de la microbiota intestinal. Con respecto a la patogénesis de la CDI
apenas hay dos trabajos que destacaron su importancia. Milani y col. observaron
una reducción de Barnesiella desde el 1.27% en sujetos que no recibieron
administración antibiótica como controles sanos frente al 0.11% en pacientes con
CDI (Milani, 2016). Estos autores no destacaron su rol como posible grupo
protector. Schubert y col. en un modelo murino observaron una expansión de
Barnesiella tras la restauración de la microbiota intestinal al administrar
metronidazol a ratones, a los que previamente se les había administrado 7
antibióticos diferentes y posteriormente esporas de C. difficile (Schubert, 2015). De
estos dos estudios deduciríamos que Barnesiella colabora en la eliminación de C.
difficile, pero se requerirían más evidencias. Por otra parte, al ser Barnesiella un
género productor de succinato, y al haberse evidenciado que C. difficile puede ser
capaz de expandirse utilizando como fuente de energía este succinato más
accesible en esta nueva situación (Ng, 2013), Barnesiella, de forma similar a
Prevotella, Parabacteroides y Alistipes, podría permitir o ayudar en la expansión de
C. difficile mediante el mismo mecanismo.
Hemos dicho anteriormente que pocos estudios han intentado evidenciar

el rol de Barnesiella como componente de la microbiota intestinal. Vamos a
exponer algunos para intentar intuir su rol. En un metanálisis que tuvo por
objetivo identificar biomarcadores de la microbiota intestinal en distintas
patologías intestinales incluida la CDI, se ha correlacionado a Barnesiella con un
360
estado de salud (Mancabelli, 2017). Otros estudios, tanto en humanos como en
ratones, han demostrado que una microbiota intestinal rica en Barnesiella inhibe la
proliferación o la colonización de VRE (Ubeda, 2013). Asimismo, se ha descrito
papel inmunodulador anticanceroso de B. intestinihominis ya que actuaría
modulando la respuesta inmune en este proceso (Daillère, 2016). No obstante, se
ha evidenciado que Barnesiella estaba anormalmente elevada en infectados por
VIH con respecto a controles sanos no infectados (Dinh, 2015).
Nuestros resultados no concuerdan con los de Milani y col. (Milani, 2016),

pero podemos afirmar que nuestro estudio es el primer trabajo que expone las
abundancias relativas de Barnesiella en individuos infectados y colonizados por C.
difficile. Si bien no existen diferencias significativas entre ambos grupos, nuestros
resultados muestran una reducción de Barnesiella en grupo P y un aumento en el
grupo CDI. A pesar de que la escasa bibliografía al respecto del rol de Barnesiella
como miembro minoritario de la microbiota intestinal, se podría aventurar que es
un género con propiedades beneficiosas para la salud, aunque por mecanismos
aún desconocidos. Por tanto, no podemos sacar conclusiones fehacientes de
nuestros resultados y concluímos que Barnesiella tiene un papel irrelevante en la
patogénesis de la CDI y que se requieren más estudios a este respecto.
6.3.3.6 Diferencias de composición en los géneros de la familia Marinifilaceae


estadísticamente significativo de la familia Marinifililaceae con respecto a los
en la práctica al género Odoribacter. Por otro lado, en el grupo de individuos
colonizados por C. difficile se observa una reducción no estadísticamente
significativa (0.2% en P frente a 0.3% en CTRL). La diferencia entre los grupos
CDI y P no es estadísticamente significativa (1.0% en CDI frente a 0.2% en P). Por
lo tanto, se observa un incremento moderado en la abundancia relativa de
Odoribacter no estadísticamente significativa con respecto a los individuos
colonizados por C. difficile y los controles sanos.
361
El género Odoribacter está compuesto por bacilos Gram negativos,
anaerobios estrictos, inmóviles, no formadores de esporas, cuyos mayores
productos de fermentación son el ácido acético, succínico y propiónico (Hardham,
2008). Consta de 3 especies, Odoribacter denticanis, Odoribacter laneus y Odoribacter
splanchnicus, que son frecuentemente componentes minoritarios de la microbiota
intestinal. Podríamos considerarlo un patógeno oportunista, aunque solo ha sido
aislado en abcesos abdominales secundarios a intervenciones quirúrgicas en
humanos (Göker, 2011).
En el contexto de la CDI pocos trabajos han puesto en valor la presencia o

ausencia de Odoribacter. Milani y col. evidenciaron una reducción en la
abundancia relativa de Odoribacter, practicamente una erradicación, en pacientes
con CDI (0.03%) con respecto a sujetos que no recibieron administración
antibiótica previa como controles sanos (1.27%) (Milani, 2016). Han y col. también
observaron en 58 pacientes con CDI (0.05%) una erradicación de Odoribacter con
respecto a los controles sanos (0.46%). Por otra parte, en 21 sujetos colonizados
por C. difficile (0.53%) no se evidenció apenas diferencia con respecto a los
controles sanos, por tanto, se conservaba en los colonizados y se perdía en los
infectados. Además, los autores destacaron que Odoribacter no es detectable en
muchas de las muestras de los pacientes con CDI, cosa que no ocurre en los
controles sanos (Han, 2019). Por otra parte, Brown y col. estudiando la
restauración de la microbiota intestinal y las modificaciones de los ácidos biliares
en heces en 10 pacientes con CDI sometidos a FMT, observaron que Odoribacter
estuvo correlacionado negativamente de forma significativa con los ácidos biliares
primarios, y de forma positiva con los ácidos biliares secundarios, de forma que
provacaría la inhibición de la germinación de las esporas de C. difficile (Brown,
2018). Por lo tanto, aunque pocos son los trabajos al respecto de la patogénesis de
la CDI que citan a Odoribacter parecería que van en la linea de que se trate un
grupo protector.
Asimismo, en estudios sobre la microbiota intestinal en la enfermedad de

Crohn se ha visto que Odoribacter presenta bajas abundancias relativas sobre todo
en casos graves de colitis ulcerativa (Morgan, 2012b). En otro ensayo clínico
aleatorizado con un probiótico en pacientes con síndrome de colon irritable, se
362
evidenció que pacientes con mejoría en los marcadores inflamatorios presentaron
una mayor abundancia relativa de Odoribacter que los no respondedores (Hod,
2018).
En consecuencia, los pocos trabajos al respecto nos indicarían que el

género Odoribacter conferiría protección frente a la CDI al intervenir en los
mecanismos de resistencia a la colonización (Brown, 2018). Asimismo, mediante
mecanismos desconocidos parece tener efectos antinflamatorios (Hod, 2018). No
obstante, nuestros resultados nos muestran un ligero aumento de la abundancia
relativa de Odoribacter en los pacientes con CDI con respecto a los controles sanos
y los individuos colonizados por C. difficile. Por tanto, en base a esto no podemos
extraer dichas conclusiones y lo consideramos un género a seguir investigando.
Además, al ser Odoribacter un género productor de succinato, y al haber evidencia
que C. difficile puede ser capaz de expandirse utilizando como fuente de energía el
succinato (Ng, 2013), Odoribacter, de forma similar a Prevotella, Parabacteroides,
Alistipes y Barnesiella, podría permitir o ayudar en la expansión de C. difficile
mediante el mismo mecanismo. También hemos de tener en cuenta la variabilidad
interindividual en la microbiota intestinal de la población sana, donde se ha visto
que las interrelaciones metabólicas permanecen estables, puesto que la microbiota
intestinal es un ecosistema dinámico que ejerce funciones metabólicas,
fisiológicas, inmunológicas y de protección frente a patógenos (Hollister, 2014).
Por lo tanto, podemos formular la hipótesis mediante la cual Odoribacter podría
presentar en nuestra cohorte de controles sanos unos niveles reducidos, puesto
que otros grupos de bacterias ejercerían sus funciones protectoras, y por ello no
observaríamos un descenso en su abundancia relativa en los pacientes con CDI,
tal como explicamos para el género Alistipes.

phylum Proteobacteria entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
En el apartado 6.3.1 “Diferencias de composición a nivel de phylum”

discutimos el incremento en las abundancias relativas que se observa en el phylum
Proteobacteria en ambas cohortes de pacientes con CDI e individuos colonizados
363
por C. difficile con respecto a los controles sanos. Ahora vamos a discutir a costa
de que familias y géneros es debida estos aumentos.

 Aumento no estadísticamente significativo en la familia
Enterobacterioceae (10.6% en CDI frente a 3.0% en CTRL), aunque la p
es 0.0521 y de la familia Burkholderiaceae (3.1% en CDI frente a 0.3%
en CTRL).
significativas en el grupo P con respecto a controles sanos son las siguientes:
 Aumento no estadísticamente significativo en la familia
Enterobacterioceae (14.7% en P frente a 3.0% en CTRL), aunque la p es
0.0770, y de la familia Burkholderiaceae (1.2% en P frente a 0.3% en
CTRL).
Por consiguiente, en ambos grupos observamos un incremento en la

abundancia relativa de las familias Enterobacteriaceae y Burkholderiaceae, si bien
es algo más pronunciado en el grupo de los individuos colonizados por C. difficile.
6.3.4.1 Diferencias de composición en los géneros de la familia Enterobacteriaceae

El aumento en la abundancia relativa de la familia Enterobacteriaceae en el

grupo de pacientes con CDI es debido a los incrementos no estadísticimamente
significativos de los géneros Escherichia/Shigella (9.2% en CDI frente a 2.5% en
CTRL) y Proteus (0.8% en CDI frente a 0.0% en CTRL), con respecto a los controles
sanos. Por otra parte, en el grupo de los individuos colonizados por C. difficile
observamos un incremento ligeramente superior de Escherichia/Shigella (10.6% en
P frente a 2.5% en CTRL) y de Klebsiella (3.6% en P frente a 0.3% en CTRL), con
respecto a los controles sanos. Este incremento de Klebsiella en el grupo P no se
observa en el grupo CDI y el de Proteus del grupo CDI tampoco se observa en P.
364
El incremento de la familia Enterobacteriaceae a expensas del género
Escherichia/Shigella es un hallazgo frecuente en los pacientes con CDI. Milani y col.
observaron un aumento hasta el 10.7% en pacientes con CDI con respecto a un
grupo de individuos que no habían recibido administración antibiótica como
controles sanos (Milani, 2016), que presentaron una abundancia relativa del 0.9%,
de forma similar a nuestros resultados. Además, en este trabajo se observó un
llamativo incremento de Klebsiella al 14.3% en el grupo de los pacientes con CDI
desde el 0.12% de los controles sanos (Milani, 2016). Gu y col. corroboraron el
aumento en la familia Enterobacteriaceae y del género Escherichia/Shigella
obtenido mediante secuenciación masiva del ADNr 16S, mediante estudios
metagenómicos para la detección de la especie Escherichia coli, que estaba muy
incrementada con respecto a los controles sanos (Gu, 2016). De esta forma se
evidenció que la principal especie responsable del incremento del género
Escherichia/Shigella (géneros indiferenciables mediante secuenciación masiva del
ADNr 16S) en los pacientes con CDI es mayoritariamente E. coli. Por otra parte, en
trabajos donde se ha estudiado la microbiota intestinal en pacientes con CDI antes
y después de un FMT, se ha observado que el éxito del FMT conlleva una
erradicación o dramática disminución de la familia Enterobacteriaceae y de
géneros como Escherichia/Shigella, Proteus y Klebsiella (Weingarden, 2014; Shahinas,
2012; Brown, 2018).
Nuestros resultados muestran un incremento, además de en los pacientes

con CDI, en los individuos colonizados por C. difficile. Este hecho también ha sido
observado en algunos de los pocos trabajos que han incluido una cohorte de
sujetos colonizados. Han y col. evidenciaron un incremento de la familia
Enterobacteriaceae en pacientes infectados (28.1%) y en individuos colonizados
(27.8%) con respecto a los controles sanos (13.7%) (Han, 2019). Zhang y col.
observaron un incremento menor de Escherichia/Shigella en un grupo de indiviuos
colonizados por C. difficile (8.7%) con respecto a los pacientes con CDI (23.9%),
aunque superior de forma significativa que los controles sanos (3.6%) (Zhang,
2015). Además, observaron un incremento de Klebsiella en ambos grupos de
pacientes, aunque fue ligeramente mayor en los pacientes con CDI, pero sin
alcanzar el 5% (Zhang, 2015). Rea y col. solo observaron el incremento de
Enterobacteriaceae en 2 pacientes con CDI ribotipo 027 y no en 22 individuos
365
colonizados (Rea, 2012). Por otra parte, Dong y col. en 12 pacientes colonizados
por C. difficile obtenidos de la comunidad al realizar un screening poblacional no
evidenciaron incrementos significativos de Escherichia/Shigella (Dong, 2018).
La familia Enterobacteriaceae es un grupo heterogéneo de bacilos Gram

negativos, aeróbicos o anaeróbios facultativos, no formadores de esporas, móviles
o inmóviles, quimiorganótrofos de metabolismo fermentativo o respiratorio. El
género Escherichia/Shigella coincide con estas características y presenta 5 especies;
E. coli, E. hermannii, E. fergusonii, E. vulneris y E. blattae (Bergey´s Manual of
Systematic Bacteriology, 2012). Vamos a asumir que el incremento de
Escherichia/Shigella ocurre a expensas de la especie E. Coli de forma mayoritaria,
puesto que ya se ha evidenciado este hecho mediante estudios metagenómicos
(Gu, 2016).
E. coli es miembro de la microbiota intestinal de cualquier mamífero y por

supuesto del ser humano. Es una de las primeras especies que coloniza a los niños
y es un colonizador duradero en los adultos (Palmer, 2007). E. coli es eliminado
por las heces del hospedador y persiste en el medio ambiente, donde no prolifera.
La colonización se produce por la ingesta de bacterias viables en aguas o
alimentos contaminados. E. coli alcanza el tracto intestinal debido a su tolerancia
extrema a la pH ácido del estómago (Lin, 1996). El éxito de la colonización
intestinal va a depender de la competición por los nutrientes con el resto de
miembros de la microbiota intestinal, la penetración en la capa mucosa ya que es
su hábitat natural, la capacidad de evitar las defensas del hospedador y la
capacidad de crecimiento rápido superior a la tasa de recambio de la capa mucosa
(Conway, 2015). A pesar de la resistencia la colonización que ejerce una
microbiota intestinal rica y diversa, los humanos estamos colonizados por una
media de 5 cepas diferentes de E. coli, produciendose además una continua
sucesión de cepas diferentes (Apperloo-Renkema, 1990). Esto significa que cepas
diferentes pueden colonizar y crecer a pesar de haber otras antes. De hecho, es
mas difícil la colonización posterior de una misma cepa de E. coli que si es
diferente (Leatham, 2009).
366
La competición por los nutrientes de E. coli en el intestino se produce de
varias maneras. En primer lugar E. coli podría utilizar nutrientes que no
consumen otros miembros de la microbiota intestinal. En segundo lugar, una cepa
de E. coli podría consumir más rápido y crecer más rápido que el resto de cepas
de E. coli. En tercer lugar, E. coli podría establecer una relación simbiótica con
otros géneros, como por ejemplo Bacteroides, que es capaz de degradar
polisacáridos complejos puesto que E. coli solo consume monosacáridos y
disacáridos (Conway, 2015). Por consiguiente, la pérdida de diversidad y de
riqueza, principalmente debido a la dramática depleción de miembros del phylum
Firmicutes, que observamos en los pacientes con CDI y en los individuos
colonizados por C. difficile, supone una mayor facilidad de colonización de nuevas
cepas de E. coli. Este hecho explicaría en parte los incrementos observados en el
género Escherichia/Shigella en los grupos CDI y P con respecto a los controles
sanos.
Además de una mayor probabilidad de colonización de nuevas cepas de E.

coli tanto en infectados como en colonizados por C. difficile debido a la disrupción
de la microbiota intestinal que presentan, en estos pacientes se produce una
expansión de miembros de la familia Enterobacteriaceae debido a dos
características. En primer lugar, pueden adoptar un metabolismo respiratorio y
fermentativo. En segundo lugar, son aerobios y anaerobios facultativos. Como
dijimos en el apartado “6.3.1.1. Diferencias de composición a nivel de phylum entre los
grupos CDI y CTRL”, existe una dominancia de anaerobios estrictos en el intestino
grueso debido a la limitación de oxígeno en este ambiente. Este hecho tiene
importantes consecuencias en el metabolismo y consumo de nutrientes por los
componentes de la microbiota intestinal. En consecuencia, el aumento de la
disponibilidad de oxígeno en el intestino grueso supone una disrupción de la
anaerobiosis que permitiría una ventaja selectiva para los aerobios y anaerobios
facultativos, como los miembros de la familia Enterobacteriaceae (Rivera-Chávez,
2016). Esta mayor disponibilidad del oxigeno puede ocurrir por varias causas. En
primer lugar, hemos de decir que los colonocitos son la principal fuente de
oxígeno en el intestino grueso, por tanto, en la superficie del colon se emite una
cantidad muy limitada. Esto es la causa por la cual E. coli y otros miembros de la
familia Enterobacteriaceae solo prolifere en la superficie epitelial y en la capa
367
mucosa. Asimismo, en los colonocitos la principal vía de obtención de energía es
la beta-oxidación del butirato aportado mediante procesos fermentativos por los
grupos productores de butirato, en especial pertenecientes al phylum Firmicutes
(Velazquez, 1997). En este proceso el butirato se transforma en dióxido de
carbono, mediante el consumo de oxígeno. Por tanto, la depleción del phylum
Firmicutes observada en nuestro trabajo, tanto en los pacientes con CDI como en
los individuos colonizados por C. difficile, conlleva una reorientación metabólica
en el colonocito hacia la glucolisis anaerobia, lo que supone un menor consumo
de oxígeno y un aumento de la oxigenación en la superficie del colon, que se
traduce en una expansión de la familia Enterobacteriaceae, principalmente del
género Escherichia/Shigella (Donohoe, 2012). Asimismo, el ambiente
proinflamatorio debido a la disminución de butirato en el intestino grueso
conlleva una hiperplasia en las criptas, y esto supone un reemplazo de los
colonocitos hipóxicos a colonocitos indiferenciados normóxicos (López, 2016). Por
otra parte, la inflamación intestinal (también las toxinas TcdA y TcdB) provoca un
aumento de las especies reactivas de oxigeno capaces de oxidar compuestos de
sulfuro endógenos a tetrationato, un compuesto que actúa como aceptor de
electrones y que también favorece la expansión de anaerobios facultativos
(Winter, 2013). Por consiguiente, mediante estos mecanismos se genera la
expansión de la familia Enterobacteriaceae en los pacientes con CDI y en los
individuos colonizados por C. difficile. De esta forma, se complementa el aumento
de Escherichia/Shigella mediante colonizaciones de cepas nuevas, explicado en el
párrafo anterior.
E. coli es una bacteria que presenta una gran diversidad genética. Esto es
debido a que presenta un genoma flexible que contiene entre 4.5 y 5.5 Mbp de
ADN en función de las cepas (Bergthorsson, 1998). Además, menos de la mitad de
sus genes están conservados en todos los miembros de las diferentes cepas. Estos
datos suponen que hagamos una clasificación basada en criterios genéticos y
clínicos. Diferenciamos entre las cepas de E. coli comensales y sin factores de
virulencia que son miembros de la microbiota intestinal, cepas patógenas
intestinales productoras de diarrea y cepas productoras de infecciones
extraintestinales.
368
Centrándonos en las cepas de E. coli productoras de diarrea se han
considerado las siguientes:
 E. coli enteropatogénica (EPEC).
 E. coli enterotoxigénica (ETEC).
 E. coli enteroinvasiva (EIEC)
 E. coli enteroagregativa (EAEC).
 E. coli productora de toxina Shiga (STEC) y E. coli Verocitotoxigénica
(VTEC).
 E. coli difusamente adherente (EAEC).
Estas cepas de E. coli producen enfermedades intestinales que cursan

desde diarrea autolimitada hasta colitis hemorrágicas. Vamos a desarrollar con
algo más de detalle las características de cada una de estas cepas.
E. coli enteropatogénica fue la primera cepa patológica identificada de E.

coli. Se adhiere a las células epiteliales intestinales y provoca la despolimerización
de la actina de las microvellosidades, que a su vez conlleva un incremento de la
permeabilidad del epitelio intestinal, y una perdida de la fijación de las uniones
intercelulares. También provocaría una migración de leucocitos
polimorfonucleares a la luz y el epitelio intestinal. La diarrea sobreviene por el
incremento de la secreción de iones, incremento de la permeabilidad intestinal,
inflamación intestinal y pérdida de potencial superficie de absorción debido a la
reducción de las microvellosidades (Kaper, 2014).
E. coli enterotoxigénica se asocia a una elevada mortalidad en niños

menores de 2 años. También es una frecuente causa de diarrea en los turistas de
viaje a países subdesarrolados, debida a la ingesta de agua y comida
contaminadas por aguas residuales. ETEC produce una enterotoxina termoestable
y una enterotoxina termolábil cholera toxin-like. Ambas toxinas estimulan el
receptor guanilato ciclasa del epitelio intestinal que conlleva un incremento del
GMP cíclico. Esto genera una disminución de la reabsorción de sodio y cloruro y
un incremento de la secreción de bicarbonato, lo que genera una diarrea acuosa
(Kaper, 2004).
369
E. coli enteroinvasiva está muy cercana filogenéticamente a Shigella,
compartiendo muchas de sus propiedades incluido los mecanismos de virulencia.
Ambas bacterias contienen sistemas para invadir células eucariotas y evadir el
sistema inmune del hospedador. La patogénesis de EIEC conlleva la penetración
en la célula epiteliar intestinal, lisis de su vacuola endocítica, replicación
intracelular e invasión de celulares epiteliares adyacentes y finalmente inducción
de la apoptosis en macrófagos infectados y liberación de IL-1β. EIEC podría
producir desde diarrea acuosa hasta colitis inflamatoria y disentería (Kaper,
2004).
E. coli enteroagregativa se ha asociado a diarrea crónica en países

desarollados y en pacientes inmunocomprometidos. Los mecanismos patogénicos
de EAEC incluyen su adherencia a la capa mucosa mediante fimbrias. Esto
provoca inflamación ya que induce la liberación de IL-8 que provocaría la
migración de los neutrófilos al epitelio intestinal generándose daño tisular (Kaper,
2004).
E. coli productora de toxina Shiga y E. coli Verocitotoxigénica causan colitis

hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico. La infección suele producirse
mediante la ingesta de alimentos contaminados. Producen una toxina similar a la
toxina Shiga producida por Shigella dysenteriae. A veces se manifiesta como
diarrea hemorrágica y fallo renal agudo. El mecanismo patogénico comienza
cuando STEC o VTEC se ingiere y se adhiere a células epiteliares de tracto
gastrointestinal. La toxina es transportada al riñon por via sanguínea o por
migración de los neutrófilos (Kaper, 2004).
Por consiguiente, puesto que en los pacientes con CDI y los individuos
colonizados por C. difficile de nuestro estudio se encuentran incrementos similares
pronunciados de Escherichia/Shigella donde probablemente E. coli será el
componente mayoritario de este cluster, y conociendo que existen varias cepas de
E. coli enteropatógenas, sería interesante conocer la presencia de estas cepas en
ambos grupos de estudio. Es por lo cual que formulamos la hipótesis que en el
grupo CDI hay una colonización de cepas patogénicas que podrían potenciar los
efectos de las toxinas de C. difficile. Esta colonización es más susceptible en estos
370
pacientes debido a la perdida de diversidad y riqueza de la microbiota intestinal
que presentan. Por otra parte, esta colonización no se produciría en los
individuos colonizados por C. difficile. Este hecho podría explicar en parte la
diferente expresión clínica en la infección con respecto a la colonización de C.
difficile.
Con respecto al género Klebsiella que está incrementado en los individuos

colonizados por C. difficile, pocos trabajos han evidenciado este hecho. En trabajos
donde se ha estudiado la microbiota intestinal en pacientes con CDI antes y
después de un FMT, se ha observado que el éxito del FMT conlleva una
erradicación o dramática disminución de la familia Enterobacteriaceae y de
géneros como Klebsiella (Weingarden, 2014; Shahinas, 2012; Brown, 2018). Zhang y
col. observaron un incremento de Klebsiella en ambos grupos de pacientes
infectados y colonizados por C. difficile, aunque fue ligeramente mayor en los
pacientes con CDI, pero sin llegar al 5% (Zhang, 2015). Milani y col. observaron
un llamativo incremento de Klebsiella al 14.3% en el grupo de los pacientes con
CDI desde el 0.12% de los controles sanos (Milani, 2016). Por tanto, solo el trabajo
de Milani y col. muestra una expansión amplia de este género, mientras que el
resto de los trabajos informan de incrementos leves como en nuestro estudio, pero
tanto en pacientes infectados como en individuos colonizados por C. difficile. Es
por lo cual que le damos una menor importancia a la influencia de Klebsiella en la
patogénesis de la CDI, debido seguramente a una menor capacidad de
colonización y de expansión, por la mayor eficacia en este sentido de E. coli.
Klebsiella es un frecuente patógeno humano, sobre todo de infecciones

respiratorias, urinarias y de tejidos blandos. Comprende a varias especies, pero
las más frecuentes son Klebsiella pneumoniae y Klebsiella oxytoca, siendo la primera
más virulenta, ya que la segunda suele asociarse solo a infecciones urinarias y a
infecciones polimicrobianas, no produciendo bacteriemias (Bergey´s Manual of
Systematic Bacteriology, 2012). K. pneumoniae puede localizarse en el intestino y
formar parte como miembro minoritario de la microbiota intestinal que se suele
situar en la capa mucosa intestinal como E. coli. No obstante, la colonización
prolongada de cepas virulentas de K. pneumoniae puede conducir al desarrollo de
enfermedades intestinales inflamatorias como la enfermedad de Crohn o colitis
371
ulcerosa (Kaur, 2018). Los serotipos K1 y K2 son considerados los más virulentos
debido a la presencia de una cápsula de polisacárido que le permite eludir la
fagocitosis por los macrófagos. Por consiguiente, por todo lo explicado respecto a
este género en este párrafo y en el anterior, consideramos que el incremento de
Klebsiella que observamos en los individuos colonizados por C. difficile con
respecto a los controles sanos y a los pacientes con CDI, debería complementarse
mediante estudios metagenómicos para conocer las especies colonizantes y en
caso de ser K. pneumoniae, su serotipo. Aún así, lo consideramos un género de
poca influencia.
Por ultimo, destacamos un ligero incremento del género Proteus en los

pacientes con CDI que no se observa ni en controles sanos ni en individuos
colonizados por C. difficile, donde su abundancia relativa es 0%. Proteus es un
patógeno oportunista con las características clásicas de la familia
Enterobacteriaceae a las que suma una gran movilidad debido a la presencia de
un gran número de flagelos peritricos. Comprende 4 especies identificadas (más 3
genomoespecies sin identificar) siendo Proteus vulgaris y Proteus mirabilis (sobre
todo P. mirabilis) componentes minoritarios ocasionales de la microbiota intestinal
(Drzewiecka, 2016). Ambas especies generalmente producen infecciones
urinarias. En un estudio en España con controles sanos se evidenció que solo el
4% estaban colonizados por especies del género Proteus, sugiriendo la baja tasa de
colonización (Porres-Osante, 2015). Además, se le ha identificado como un
potencial agente causal de diarrea, aunque sugiriendo que adopta un rol
oportunista cuando la diarrea la produce otro agente causal y no Proteus
primariamente (Müller, 1986). No obstante, en condiciones normales debe ser
considerado como un colonizador (Drzewiecka, 2016).
Pocos trabajos han relacionado la presencia de Proteus con la patogénesis

de la CDI. Brown y col. observaron que con el FMT se erradicaba la presencia de
este género que se observaba en los pacientes con CDI recurrente (Brown, 2018).
Nuestros resultados muestran una colonización de Proteus en los pacientes con
CDI que no se observa en los controles sanos ni en los individuos colonizados por
C. difficile. Esto es presumiblemente debido a que la microbiota intestinal de estos
pacientes lo permite y no así la de los otros dos grupos. La presencia de Proteus
372
agrava la disbacteriosis de esos pacientes y potencia la presencia de clínica, ya
que hemos visto que adopta un rol oportunista en coinfecciones con otros
patógenos intestinales (Müller, 1986). Este hecho no se produciría en los indiviuos
colonizados y explicaría en parte junto a otras alteraciones y diferencias que C.
difficile no sea causante de clínica en estos individuos.
6.3.4.2 Diferencias de composición en los géneros de la familia Burkholderiaceae

El incremento de la abundancia relativa de la familia Burkholderiaceae en

el grupo de pacientes con CDI es debido prácticamente en su totalidad al
aumento no estadísticimamente significativos del género Parasutterella (3.1% en
CDI frente a 0.2% en CTRL) con respecto a los controles sanos. Por otra parte, en
el grupo de los individuos colonizados por C. difficile también se observa un
incremento, aunque más moderado y tampoco estadísticamente significativo
(1.2% en P frente a 0.2% en CTRL) con respecto a los controles sanos. No se
observan diferencias estadísticamente significativas entre los grupos CDI y P.
La familia Burkholderiaceae pertenece a la clase Betaproteobacteria, a

diferencia de Enterobacteriaceae que se engloba dentro de la clase
Gammaproteobacteria, dentro del phylum Proteobacteria. Es una familia muy
diversa, tanto fenotípicamente, metabólica y ecológicamente. Incluye a bacterias
aerobias y anaerobias, y quimiorganótrofas y quimiolitótrofas ((Bergey´s Manual
of Systematic Bacteriology, 2012). El género Parasutterella es relativamente de
reciente identificación (Nagai, 2009). Está conformado por cocobacilos Gram
negativos, anaerobios estrictos, inmóviles, no formadores de esporas y
asacarolíticos. Comprende a dos especies, Parasutterella excrementihominis y
Parasutterella secunda, siendo ambos componentes minoritarios de la microbiota
intestinal, aunque principalmente P. excrementihominis (Ju, 2019). El conocimiento
de las características fisiológicas y metabólicas de Parasutterella es muy limitado.
En un trabajo muy reciente, se ha conseguido aislar Parasutterella en ratones y se
han estudiado algunas de sus características. Además, esta cepa ha sido inoculada
en ratones para observar el rol que adopta como miembro de su microbiota
intestinal. Se observó que Parasutterella presenta como principal producto final de
373
fermentación el ácido succínico, y que, aunque es definido como anaerobio
estricto es capaz de tolerar ciertas concentraciones de oxígeno, mediante
mecanismos desconocidos. También se evidenció que las concentraciones
intestinales en los ratones colonizados por Parasutterella de ácidos biliares
primarios como el ácido cólico y taurocólico, y algunos secundarios como el ácido
taurodesoxicólico, estaban disminuidos. Aunque los autores no pueden concluir
si este cambio en el metabolismo de los ácidos biliares fue debido a la
introducción de Parasutterella o de cambios que produjese Parasutterella en la
actividad de otras bacterias (Ju, 2019). Esta relación con el metabolismo de los
ácidos biliares fue conjeturada previamente por Staley y col. en un trabajo donde
estudiaron la restauración de la microbiota intestinal en pacientes con CDI
sometidos a FMT (Staley, 2016). Observaron que el género Parasutterella, junto con
otros, se incrementaba en los pacientes curados “post FMT” y formularon la
hipótesis de que los miembros de estos géneros tuvieran influencias sobre el
metabolismo de los ácidos biliares, mecanismo esencial ya que tiene gran
influencia sobre las esporas de C. difficile. Aunque los autores recomendaron
tomar esta hipótesis con cautela, gracias al trabajo de Ju y col. sabemos que sí
tiene influencia sobre el metabolismo intestinal de los ácidos biliares. No obstante,
no podemos aseverar si Parasutterella es un grupo protector de CDI a este
respecto, si no se evidencia que presenta actividad BaiCD. Por otra parte, otro
trabajo ha puesto de manifiesto que el género Parasutterella era más abundante en
heces en pacientes con síndrome inflamatorio intestinal que en controles sanos y
que podría estar relacionado con el desarrollo del síndrome de colon irritable.
Asimismo, los mismos autores observaron que este incremento en la abundancia
relativa de Parasutterella se relacionaba con un aumento del cociente entre células
inflamatorias y células epiteliares en el téjido intestinal, lo cual sugería que podría
estar asociado con la inflamación crónica intestinal en pacientes con enfermedad
inflamatorio intestinal (Chen, 2018).
Por consiguiente, nuestros resultados muestran un incremento de

Parasutterella en pacientes con CDI y en menor médida en individuos colonizados
por C. difficile, con respecto a los controles sanos, donde es un género muy escaso.
En contra de lo mencionado en el trabajo de Staley y col. (Staley, 2016) donde
parece que Parasutterella es un género protector, nuestros resultados apuntan a lo
374
contrario, ya que se observa en indivuos infectados y colonizados por C. difficile.
Debido a la reciente identificación y más reciente caracterización metabólica
(Nagai, 2009; Ju, 2019) no se ha establecido la relación entre CDI y Parasutterella,
salvo Staley y col. que conjeturaron su actividad sobre el metabolismo de los
ácidos biliares (Staley, 2009). De hecho, casi ningún trabajo resalta la abundancia
relativa de Parasutterella en estos trabajos. Por ejemplo, Zhang y col. observaron
una reducción de Parasutterella tanto en sujetos infectados como colonizados por
C. difficile con respecto al 3% observado en los controles sanos (Zhang, 2015),
apuntando a que su pérdida disminuye la resistencia a la colonización de
patógenos intestinales. Pero, por otra parte, ya hemos visto que es un género
relacionado con la inflamación intestinal (Chen, 2019) y, además, al ser un género
productor de ácido succínico podría permitir la expansión de C. difficile, puesto
que lo utiliza como fuente de energía (Ng, 2013). Por lo tanto, es un género del
cual se conoce poco y del cual tenemos pruebas a favor y en contra de si se trata
de un género protector o predisponente de CDI. Se deberían establecer estudios
metagenómicos y funcionales en modelos murinos, en relación con la CDI, para
hipotetizar su función en la patogénesis de la CDI.

phylum Actinobacteria entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
6.3.5.1 Diferencias de composición en los géneros de la Familia Bifidobacteriaceae

Dentro del phylum Actinobacteria, únicamente destacamos las diferencias

en las abundancias relativas de la familia Bifidobacteriaceae. En el grupo de
pacientes con CDI se observa una reducción estadísticamente significativa de la
familia Bifidobacteriacea con respecto a los controles sanos, a expensas del género
Bifidobacterium (0.6% en CDI frente a 3.7% en CTRL). Por otra parte, en el grupo
de los individuos colonizados por C. difficile también se observa está disminución
no estadísticamente significativa con respecto a los controles sanos (2.1% en CDI
frente a 3.7 en CTRL), aunque la familia Bifidobacteriacea y el género
Bifibobacterium se conserva más que en los pacientes con CDI. No se observan
diferencias estadísticamente significativas entre los grupos CDI y P. Las especies
375
de Bifidobacterium implicadas son Bifidobacterium longum subsp longum y
Bifidobacterium breve, principalmente.
Históricamente, en muchos trabajos donde se ha estudiado la microbiota

intestinal de pacientes con CDI en diferentes modalidades, se ha obviado el papel
de Bifidobacterium. Por tanto, son relativamente pocos los estudios que han puesto
en valor su posible presencia o ausencia y su rol en la patogénesis de la CDI. En el
trabajo de Zhang y col., aunque los autores no lo nombran ni en los resultados ni
en la discusión, observamos en una figura que Bifidobacterium está erradicado en
los pacientes con CDI con respecto a los controles sanos donde se abundancia
relativa es del 1%. En individuos colonziados por C. difficile Bifidobacterium está
ligeramente incrementado al 2% (Zhang, 2015). En el trabajo de Han y col.
tampoco los autores nombran a Bifidobacterium en todo el artículo, no obstante, en
una tabla podemos observar que Bifidobacterium está disminuido tanto en
pacientes infectados (0.59%) como colonizados (0.37%), con respecto a los
controles sanos (2.1%) (Han, 2019). Rea y col. evidenciaron que Bifidobacterium no
se detectó en pacientes con CDI, mientras que sí era detectado en sujetos
colonizados (1.6%) y en controles sanos (2.8%) (Rea, 2011). Esta disminución de
Bifidobacterium se ha observado en otros pocos trabajos. Milani y col. observaron
una disminución en pacientes con CDI (0.32%) con respecto a individuos que
habían recibido administración antibiótica como controles sanos (0.65%) (Milani,
2016). Asimismo, Skraban y col. observaron que Bifidobacterium longum estaba
muy disminuido en pacientes con CDI, pero su elevada abundancia relativa era el
mejor predictor de no infección o colonización por C. difficile (Skraban, 2013).
También, Rousseau y col. pusieron de manifiesto que B. longum se asociaba a la
microbiota intestinal de niños no colonizados por C. difficile, a diferencia de los
niños colonizados la cual se asociaba a Klebsiella pneumoniae y Ruminococcus
gnavus (Rousseau, 2011). Todos estos limitados trabajos nos indican que en
pacientes con CDI sí que se produce una disminución de Bifidobacterium. No
obstante, en individuos colonizados por C. difficile, la bibliografía al respecto
aporta resultados dispares. Nuestros resultados van más en la línea de los
trabajos de Zhang y Rea (Zhang, 2015; Rea, 2011), donde se conserva el género
Bifidobacterium en los sujetos colonizados y se erradica en la CDI.
376
El género Bifidobacterium está compuesto bacilos Gram positivos de
diferente morfología, no formadores de esporas, inmóviles, anaerobios estrictos,
aunque algunas especies son capaces de tolerar O2 siempre en presencia de CO2.
Presenta actividad sacaroclástica y su metabolismo es fermentativo, donde el
ácido acético y el ácido láctico son los principales productos finales, a relación
molar 3:2. Tambíen se genera en mucha menor medida ácido succínico, ácido
fórmico y etanol (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, 2012).
El género Bifidobacterium comprende a 70 especies y otras 10 subespecies

(http://www.bacterio.net/bifidobacterium.html). Se trata de un género de efectos
beneficiosos importantes, cuya abundancia relativa como componente de la
microbiota intestinal se situa entre el 1-4%. Bifidobacterium catenulam,
Bifidobacterium pseudocatelanulam, Bifidobacterium adolescentes, Bifidobacterium
longum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis y
Bifidobacterium dentium son especies componente comunes de la microbiota
intestinal humana (Hidalgo-Cantabrana, 2017). Asimismo, existe una variabilidad
interindividual en cuanto a las bifibobacterias presentes (Delgado, 2006).
La particularidad metabólica que presenta Bifidobacterium es el catabolismo

de los monosacáridos mediante la ruta fructosa 6 fosfato. En esta vía la fructosa-6-
fosfato fosfocetolasa es el principal enzima (Xfp). Xfp tiene afinidad por la
glucosas-6-fosfato o xilulosa-5-fosfato. Los principales productos finales, como
hemos mencionado antes, son el ácido acético y el ácido láctico (González-
Rodríguez, 2013). Por otra parte, Bifidobacterium tiene la capacidad de degradar
polisacáridos complejos en fuentes de energía accesibles. Por ejemplo, durante la
época neonatal y primera niñez Bifidobacterium es capaz de degradar
oligosacáridos provenientes de la leche humana (Duranti, 2015). Conforme llega
la edad adulta la población de Bifidobacterium varía hacía unas especies que
presenten la capacidad de degradar polisacáridos no digeribles provenientes de
las plantas (Duranti, 2014). Este hecho, permite que Bifidobacterium tenga
influencia sobre otros miembros de la microbiota intestinal, puesto que degrada
polisacáridos complejos en azúcares más simples, asimilables por estos otros (De
Vuyst, 2011). Por otra parte, Bifidobacterium también es capaz de metabolizar
polifenoles. Los polifenoles son compuestos naturales encontrados en los
377
vegetales, de diversa estructura química pero siempre con residuos hidroxifenilo.
La mayor parte de los polifenoles de la dieta alcanzan el intestino grueso donde
son fermentados por miembros de la microbiota intestinal, en especial por
bacterias del género Bifidobacterium (Cardona, 2013). Bifidobacterium degrada el
nucleo polifenólico en ácidos carboxílicos aromáticos más simples, que son
considerados responsables de sus propiedades beneficiosas (Pasinetti, 2018).
Entre estas propiedades están las antimicrobianas y las antinflamatorias (Boto-
Ordóñez, 2014), las cuales podrían ser beneficiosas en el contexto de la CDI.
Bifidobacterium presenta propiedades beneficiosas como resultado de la

compleja interrelación con otros miembros de la microbiota intestinal y con el
hospedador. Esta correlación no está completamente dilucida a nivel molecular.
Una de estas propiedades beneficiosas para la salud del hospedador es que son
importantes en la erradicación de patógenos intestinales. De forma contraria,
niveles dismunidos de Bifidobacterium se han correlacionado con el
sobrecrecimiento de patógenos intestinales (Hidalgo-Cantabrana, 2017). El hecho
por el cual en la edad anciana disminuye la abundancia relativa de Bifidobacterium
como miembro de la microbiota intestinal (Arboleya, 2016), podría estar
relacionado con la mayor incidencia de CDI en estos pacientes y con que la edad
sea un factor de riesgo importante para el desarrollo de esta infección.
Especies del género Bifidobacterium han sido incluidas históricamente en

compuestos probióticos debido a las propiedades beneficiosas antes mencionadas.
Entre las indicaciones de estos probióticos está la diarrea asociada al
sobrecremiento de patógenos intestinales, incluido C. difficile. Es en los trabajos
que han evaluado la eficacia y los mecanismos de acción de estos probióticos,
donde se ha evidenciado su actividad en la inhibición de la patogénesis de la CDI,
y nos servirán para establecer las bases del significado de nuestros resultados al
respecto de este género. Como dijimos en el apartado “6.3.2.6. Diferencias de
composición en los Géneros de la Familia Lactobacillaceae entre los grupos CDI y P con
respecto al grupo CTRL”, la eficacia de una bacteria probiótica es cepa y especie
dependiente (Goldstein, 2017), por tanto, no todas las especies de Bifidobacterium
van a resultar útiles en la erradicación de C. difficile. Las actuales guías clínicas de
diagnóstico, tratamiento y prevención de C. difficile (European Society of Clinical
378
Microbiology and Infectious Diseases, Infectious Diseases Society of America, Society for
Healthcare Epidemiology of America) no recomiendan la administración de
probióticos como medida para prevenir o tratar la CDI (McDonald, 2018; Debast,
2014), y esto es debido a que existe una enorme variedad de probióticos
disponibles y los ensayos clínicos que se hacen al respecto son normalmente de
poca calidad, con tamaños muestrales pequeños, incontrolados y frecuentemente
financiados por la casa comercial del mismo probiótico (McFarland, 2009). Una
reciente revisión en Cochrane de 31 ensayos clínicos concluyó que existía una
evidencia moderada para afirmar que los probióticos eran seguros y eficaces para
prevenir la CDI, sobre todo en pacientes no inmunocomprometidos o no
severamente debilitados (Goldenberg, 2017). No obstante, pocos trabajos han
evaluado la inhibición de C. difficile por cepas del Bifidobacerium tanto in vivo como
in vitro. Yun y col. investigaron el efecto de la cepa ATCC 15707 de B. longum
sobre la mortalidad y el daño intestinal en ratones infectados por C. difficile,
observando un efecto beneficioso en estas dos variables (Yun, 2017). Valdés-
Valera y col. observaron que las cepas B. animalis subsp. lactis Bb12, B. longum
IPLA20022, B. bifidum IPLA20015 y B. breve IPLA20006, eran capaces de inhibir el
crecimiento y disminuir la producción de TcdA y TcdB in vitro mediante cocultivo
con C. difficile, aunque este efecto fue variable en base al prebiótico añadido
(Valdés-Varela, 2016). El trabajo más completo hasta la fecha que contiene
estudios in vitro e in vivo con ratones, es el realizado por Wei y col., donde
evaluaron la capacidad neutralizante a las toxinas de C. difficile así como la
prevención del desarrollo de CDI en ratones, de la cepa B. longum JMD301.
Observaron in vitro mediante cocultivo con C. difficile que B. longum JMD301
inhibió su crecimiento y promovió la degradación de TcdA y TcdB. Esto fue
confirmado in vivo al determinar la cantidad de toxinas y la abundancia de C.
difficile en el intestino de los ratones infectados por C. difficile a los que se le
suministró este probiótico. Además, evidenciaron una reducción de interleucinas
proinflamatorias como la IL-6 y el TNFα, un aumento de la interleucina
inmunosupresora IL-10 y un menor daño tisular intestinal. Posteriormente,
ampliaron el experimento in vitro con otras 40 cepas probióticas de Bifidobacterium
y Lactobacillus y observaron que el efecto producido por 8 cepas de B. longum
sobre C. difficile era similar al obtenido por la cepa JMD301 y era dosis
dependiente (Wei, 2018). En este trabajo también se pone de manifiesto que el pH
379
ácido generado por Bifidobacterium es una variable importante en la neutralización
de las toxinas, además de en la inhibición del crecimiento y por consiguiente en la
producción de toxinas por C. difficile. Aquí entra la importancia de los ácidos
orgánicos generados por Bifidobacterium que es uno de los mecanismos mediante
los cuales logra inhibir el sobrecrecimiento y toxicidad de C. difficile. Como ya
dijimos para las bacterias LAB, el ácido acético y láctico, principales productos de
la fermentación de Bifidobacterium, contribuyen a la acidificación de del
microambiente intestinal y esto les permite competir con otras bacterias menos
acidófilas como C. difficile (Pessione, 2012). Además, aunque Bifidobacterium no
genere ácido butírico, un potente, antiinflamatorio, lo hace de forma indirecta
puesto que géneros como Agathobacter utilizan como sustrato el acetato para
producirlo (Rivière, 2015). Asimismo, el ácido láctico es capaz de modular la
respuesta inmune innata al actuar sobre los neutrófilos y las células epiteliales
intestinales (Blad, 2012), enlazando con otro mecanismo que hace que
Bifidobacterium tenga efectos beneficiosos sobre la CDI, como es la
inmunomodulación. Los otros mecanismos de acción anti C. difficile son la síntesis
de moléculas antibacterianas y los mecanismos competitivos. Estudios in vitro e in
vivo han evidenciado que la capacidad adherente a la capa mucosa y las células
epiteliares intestinales de Bifidobacterium interfiere con los patógenos intestinales
(Servin, 2004). Otro aspecto importante de Bifidobacterium presente en algunas
especias y cepas es la presencia de capa polisacarídica extracelular. Se le atribuyen
funciones de inmunomodulación y de modulación de la microbiota intestinal,
puesto que puede actuar como reservorio de nutrientes (Bottacini, 2017).
Por consiguiente, nuestros resultados muestran una profunda depleción

de Bifidobacterium en los pacientes con CDI con respecto a los controles sanos. Por
otra parte, en los individuos colonizados por C. difficile se conserva en gran parte
la presencia de Bifidobacterium. Este hallazgo lo consideramos muy importante.
Pocos trabajos acerca de la microbiota intestinal en pacientes con CDI mediante
secuenciación masiva del ADNr 16S han puesto en valor este hecho. Para
nosotros es muy destacable que se conserve Bifidobacterium en los individuos
colonizados, ya que debido a las propiedades beneficiosas y diferentes
mecanismos de acción antes revisados sobre la inhibición en patógenos
intestinales, particularmente de C. difficile, explicaría, al menos en parte, que estos
380
individuos no expresen la clínica asociada a la CDI. Hasta nuestro conocimiento,
es la primera vez que se llega a estas conclusiones con respecto a la colonización
por C. difficile. Asimismo, debido a que la eficacia de Bifidobacterium como bacteria
con propiedades probióticas es dependiente de la especie y la cepa, mediante
estudios metagenómicos se podría complementar el estudio y evidenciar las cepas
concretas que se conservan en los individuos colonizados por C. difficile.

phylum Verrucomicrobia entre los grupos CDI y P con respecto al grupo CTRL.
6.3.6.1 Diferencias de composición en los géneros de la familia Akkermansiaceae

Dentro del phylum Verrucomicrobia, únicamente destacamos las

diferencias en las abundancias relativas de la familia Akkermansiaceae. En el
grupo de pacientes con CDI se observa un incremento no estadísticamente
significativo de la familia Akkermansiaceae con respecto a los controles sanos, a
expensas del género Akkermansia (6.0% en CDI frente a 4.7% en CTRL). Por otra
parte, en el grupo de los individuos colonizados por C. difficile se observa una
disminución estadísticamente significativa con respecto a los controles sanos
(1.3% en CDI frente a 4.7% en CTRL). No se observan diferencias estadísticamente
significativas entre los grupos CDI y P.
La familia Akkermansiaceae solo consta del género Akkermansia.

Akkermansia muciniphila es la única especie aislada en humanos (Derrien, 2004).
Akkermansia está constituido por bacterias de morfología oval, Gram negativas,
inmóviles, no formadoras de esporas, anaerobias estrictas, quimioorganótrofas,
de metabolismo fermentativo obligado. Su característica más destacable es la
capacidad para fermentar la mucina de la capa mucosa intestinal. El ácido acético
y propiónico y el etanol son los principales productos finales de la fermentación
de la mucina.
Al respecto de la CDI, solo recientemente se ha incidido en la importancia

que podría presentar en su patogénesis. Sangster y col. observaron un incremento
381
de A. muciniphila en 12 pacientes con CDI con respecto a 12 controles sanos. Los
autores destacaron que debido a la capacidad de A. muciniphila de degradar la
mucina, y puesto que C. difficile por si mismo también es capaz de degradar la
mucina, le proporcionaría una ventaja selectiva de expandirse, ya que es capaz
adherirse a una capa mucosa alterada con mejor eficacia que otros miembros de la
microbiota intestinal (Sangster, 2016). Por tanto, según los autores, la mayor
presencia de A. muciniphila podría facilitar la transición desde un estado de
colonización a un estado de infección. De manera interesante, los autores también
reflexionan sobre la dificultad de curación completa y los fracasos terapéuticos de
la CDI, puesto que otras bacterias coexistentes a C. difficile dificultan reestablecer
la microbiota normal, por diferentes mecanismos, y uno de ellos podría ser la
degradación de la mucina de la capa mucosa que realiza A. muciniphila. Otro
trabajo que fue publicado en la misma fecha que el de Sangster y col. también
evidenció un incremento de A. muciniphila del 3.6% en pacientes con CDI, con
respecto al 0.6% que se observo en individuos que no habían recibido tratamiento
antibiótico como controles sanos (Milani, 2016). Estos autores señalaron que,
aunque A. muciniphila presenta propiedades beneficiosas, su expansión en los
pacientes con CDI podría estar relacionada con la modificación del
microambiente intestinal, y podría reflejar la inflamación de la capa mucosa.
Recientemente, Han y col. han mostrado unos resultados menos espectaculares,
con una abundancia relativa media A. muciniphila del 0.14% en individuos con
presencia de tcdB frente al 0.01% de los controles sanos (Han, 2019). Nuestros
resultados muestran por primera vez un incremento de A. muciniphila en los
pacientes con CDI y una dismunición en los individuos colonizados por C.
difficile.
Para entender la naturaleza de nuestros resultados al respecto de A.

muciniphila resulta interesante revisar la composición, estructura y rol de la capa
mucosa. La mucosa intestinal está compuesta principalmente por mucina, que
resulta en aglomerados complejos de glicoproteínas con O-glicanos específicos,
producidss por las células epiteliales intestinales secretoras específicas. Puede ser
secretada en forma de gel o formando parte del glicocálix de éstas células. Su
estructura peptídica consiste en repeticiones de los aminoácidos prolina, treonina
y serina que conforman los sitios de unión covalente para los polisacáridos
382
altamente O-glicosilados. La estructura básica de polisacárido es una combinación
de galactosa, N-acetilgalactosamina y N-acetilglicosamina, con diferentes glicanos
unidos a este nucleo cuyo monosacárido terminal suele ser fucosa o ácido siálico.
La mucina MUC2 es la más abundante en el colon (Sicard, 2017). La capa mucosa
del colon es la mas gruesa de todo del intestino, debido a que alberga a un gran
número de bacterias. Se divide en una capa interna densa, firmemente ligada al
epitelio intestinal, poco permisiva a la penetración de bacterias, y una capa
externa expuesta a la actividad proteolítica y sacarolítica de las bacterias de la
microbiota intestinal, que además les proporciona sitios de adhesión (Sicard,
2017). La competición por este nicho ecológico es importante a la hora de
conformar la estructura de la microbiota intestinal.
Una de las funciones de la capa mucosa intestinal descrita en el párrafo

anterior es la protección frente a patógenos intestinales. Una alteración en la
integridad de la capa mucosa supone que sea más permeable y se permita un
mayor acceso al epitelio y este hecho podría generar inflamación (Antoni, 2014).
Por otra parte, la capa mucosa también es una potencial fuente de nutrientes para
los patógenos intestinales. Este hecho se pone de manifiesto en el tratamiento
antibiótico, ya que perturba la microbiota intestinal y la disponibilidad de la
fucosa y los ácidos siálicos de la mucina, lo cual facilita la expansión de C. difficile
(Ng, 2013). Además, la toxina TcdA de C. difficile es capaz por si misma de
disminuir la exocitosis de mucina por las células intestinales productoras (Branka,
1997). Por consiguiente, el incremento de A. muciniphila en los pacientes con CDI
reflejaría una mayor degradación de la capa mucosa intestinal, lo cual es un
proceso importante para el desarrollo de dicha infección. En los individuos
colonizados por C. difficile, de forma interesante, evidenciamos una disminución
de A. muciniphila que reflejaría una mayor integridad de la mucosa intestinal. Este
hecho, descrito en el presente estudio por primera vez, pensamos que es
importante y que diferencia el estado de colonización y de infección de C. difficile,
junto a otras disimilitudes discutidas.
383
6.4 VISIÓN GLOBAL DE LOS RESULTADOS.
La microbiota intestinal de los individuos infectados y colonizados por C.

difficile es a grandes rasgos similar. No obstante, es muy diferente a la de los
controles sanos en estructura y composición. Con respecto a la estructura, la
disbacteriosis que presentan los primeros se manifiesta en una pérdida de alfa
diversidad y riqueza. Por consiguiente, ambos grupos de individuos presentan
una microbiota intestinal con un número relativamente bajo de OTUs y en franca
desproporción, comparada con la de un grupo control en el cual hemos
descartado situaciones patológicas que provoquen una disrupción de su
microbiota intestinal. Sin embargo, no hemos encontrado diferencias
estadísticamente significativas en la alfa diversidad y riqueza de la microbiota
intestinal de los individuos infectados y colonizados por C. difficile. Este hecho ya
había sido manifestado en otros trabajos (Chang, 2008). También se ha observado
que la pérdida de alfa diversidad y riqueza de los pacientes con CDI se restauraba
mediante el FMT y que esto suponía la curación (Weingarden, 2014),
demostrando que es un hallazgo característico de las disbacteriosis de estos
pacientes y su importancia en la patogénesis de la CDI. No obstante, la pérdida de
alfa diversidad y riqueza aparece en otras situaciones. Algunos autores han
evidenciado este hallazgo en pacientes con diarrea nosocomial no debida a C.
difficile (Antharam, 2013; Gu, 2016; Schubert, 2014) y en pacientes hospitalizados
que han recibido administración antibiótica pero que no presentaron clínica
(Milani, 2016). Por ende, no es una característica única de la microbiota intestinal
de los pacientes infectados y colonizados por C. difficile, sino que es compartida
con otros casos y situaciones clínicas. Asimismo, la virulencia de la cepa
infectante o colonizante también podría generar un mayor grado de disbacteriosis
traducido en una pérdida de alfa diversidad y riqueza más profunda. De hecho,
se ha observado que la presencia en pacientes con CDI del ribotipo 027,
considerado hipervirulento, provoca este resultado (Skraban, 2013). Otras
condiciones que podrían suponer la pérdida de alfa diversidad y riqueza, aparte
de la administración antibiótica, presencia de diarrea y virulencia de la cepa
colonizante o infectante de C. difficile, son la hospitalización y la presencia de
comorbilidades. En el presente trabajo todas estas condiciones son más
representativas en los pacientes con CDI que en los individuos colonizados por C.
384
difficile. Consideramos importante destacar que el grupo de individuos
colonizados por C. difficile del presente estudio fue captado principalmente desde
la comunidad (87%). Aunque el 47% de estos individuos presentaron diarrea en el
momento de la inclusión en el estudio (adquirida en la comunidad), se incluyeron
en el grupo P en base a que la diarrea se pudo atribuir a otra causa o bien porque
se determinó que la cepa causal de C. difficile era no toxigénica, por tanto, no
atribuible a la causa de la clínica. Para ello tuvimos en cuenta la definición exacta
del estado de colonización de C. difficile (Furuya-Kanamori, 2015) puesto que en
muchos trabajos hay cierta confusión en este aspecto. No obstante, nuestros
resultados muestran que la pérdida de alfa diversidad y riqueza de la microbiota
intestinal de los pacientes infectados por C. difficile no se diferencia de la de los
colonizados, a pesar de ser las condiciones de los primeros más propicias a una
disbacteriosis que la de los segundos. Hay muy pocos trabajos que incorporen
una cohorte de individuos colonizados por C. difficile (y esto es una de las razones
de ser del presente estudio) para el estudio de la patogénesis de la CDI, pero en
estos la colonización por C. difficile en muchas ocasiones también implicaría
pérdida de alfa diversidad y de riqueza de su microbiota intestinal. Por tanto,
concluimos que la pérdida de alfa diversidad y de riqueza de la microbiota
intestinal en individuos colonizados por C. difficile no es un factor de desarrollo
irremediable hacia la CDI y que, por tanto, debe haber otras diferencias que
expliquen por qué esto no sucede.
Por otra parte, la pérdida de riqueza se debe traducir en una perdida de

resistencia a la colonización de patógenos oportunistas intestinales, debido a
mecanismos de competición de nutrientes. Aparecerían nichos ecológicos
vacantes que la anterior densidad microbiana no permitiá. La competición por los
nutrientes entre miembros de la microbiota intestinal es mayor cuando los grupos
de bacterias están mas relacionados filogenéticamente, puesto que de esta manera
comparten genes y capacidades funcionales (Wexler, 2017).
El estudio de la beta diversidad de la microbiota intestinal basado en el

índice de Jaccard de los individuos infectados y colonizados por C. difficile nos
muestra una mayor variabilidad interindividual en estos grupos con respecto a
los controles sanos, pero sin encontrar diferencias estadísticamente significativas
385
entre los dos primeros grupos. Este hecho enlazaría con la dinámica de cambios
de la microbiota intestinal en los pacientes ingresados con CDI que se ha
observado en los pocos estudios prospectivos al respecto (Lee, 2017; Vicente,
2016). Este dato explicaría la elevada variabilidad interindividual observada en
nuestro grupo de pacientes con CDI, no obstante, el grupo de individuos
colonizados por C. difficile proviene principalmente de la comunidad. Por otra
parte, el estudio de agrupamiento basado en PCoA utilizando la distancia
UniFrac muestra como la microbiota intestinal de los grupos de pacientes con CDI
e individuos colonizados por C. difficile frente a los controles sanos tienen
probables estructuras diferentes puesto que se ubican en regiones diferentes,
debido a grandes diferencias en su composición. No obstante, los individuos de
los grupos CDI y P se solapan en dos clusters, por tanto, no podemos
diferenciarlos entre si. Además, es observable que presentan una mayor
variabilidad interindividual que el cluster de los controles sanos. Por consiguiente,
al igual que el estudio de alfa diversidad, la beta diversidad de los individuos
colonizados por C. difficile tampoco muestra diferencias significativas con la de los
pacientes infectados por C. difficile, por lo que su composición debe ser similar y
las diferencias las deberemos encontrar a nivel de escasos géneros. Por otra parte,
este hallazgo que nos indica una diferente estructura de la microbiota intestinal
en el estado de infección y colonización por C. difficile con respecto a los controles
sanos, tampoco es únicamente característico de estas situaciones, ya que se ha
observado que pacientes con diarrea nosocomial no debida a C. difficile (Gu, 2016)
y pacientes hospitalizados a los que se la administrado terapia antibiótica (Milani,
2016) también conforman clusters diferentes a los controles sanos mediante PCoA.
Por consiguiente, tampoco es un elemento diferenciador único del estado de
colonización e infección por C. difficile.
Los resultados de alfa y beta diversidad y riqueza se traducen en drásticas

alteraciones en la composición a nivel de phylum en los individuos infectados y
colonizados por C. difficile con respecto a los controles sanos. En los phylum
mayoritarios encontramos en ambo grupos CDI y P una muy fuerte depleción de
Firmicutes, un aumento en Bacteroidetes y una expansión de Proteobacteria. Este
hecho sería responsable que en los análisis de agrupamiento conformen dos
386
clusters separados de los controles sanos, aunque con cierto grado de
solapamiento entre ellos.
La reducción de Firmicutes en infectados y colonizados por C. difficile

conllevaría a la pérdida de varios mecanismos de la resistencia a la colonización
de patógenos intestinales ejerce una microbiota intestinal sana, rica y diversa. Este
hallazgo, corrobarado por varios autores (Weingarden, 2014; Shahinas, 2012; Gu,
2016; Zhang, 2015; Manges, 2010) implica una disminución en AGCC a nivel
intestinal. Los clostridiales son los principales productores de AGCC, en especial
de butirato que es producto de la fermentación anaerobia, que presentan varias
funciones que inhibien la proliferación de patógenos intestinales. En primer lugar,
el butirato provoca un pH ácido en el intestino grueso que inactiva enzimas
microbianos y ciertos patógenos. En segundo lugar, es la fuente de energía
principal de los colonocitos lo que conlleva a una reducción de la carga osmótica.
En tercer lugar y más importante desde el punto de vista de la patogénesis de
CDI, es que presenta un potente efecto antinflamatorio. Entre otras acciones, el
butirato induce la expansión y función de los linfocitos T reguladores (Buonomo,
2016), que contribuye a que se produzca un control fino de la respuesta inmune.
Debido a que las toxinas TcdA y TcdB provocan la secreción de citocinas
proinflamatorias por parte de las células inmunes epiteliales y la degranulación
de mastocitos, que se traduce en una respuesta inmune exacerbada frente a C.
difficile que conlleva la presencia de clínica, una respuesta inflamatoria intacta
combatiría la infección sin generar efectos adversos. La depleción de miembros
butirogénicos de Firmicutes se traduciría en un aumento del stress oxidativo, del
riesgo de infecciones oportunistas intestinales, y la creación de un ambiente
proinflamatorio.
La expansión del phylum Proteobacteria en pacientes con CDI e individuos

colonizados por C. difficile es consecuencia de la depleción de bacterias
butirogénicas anteriormente comentadas. Este hecho conlleva una mayor
disponibilidad de oxígeno y a una ventaja selectiva de los anaerobios facultaticos
como Proteobacteria en detrimento de los anaerobios estrictos (Rivera-Chávez,
2016). Es un hallazgo común en los pacientes infectados (Weingarden, 2014;
Shahinas, 2012; Gu, 2016; Manges, 2010) y colonizados (Zhang, 2015; Dong, 2018;
387
Han, 2019) por C. difficile y posiblemente el más robusto marcador de
disbacteriosis en términos generales (Shin, 2015). Su presencia provoca efectos
adversos puesto que son patógenos oportunistas reconocidos.
Bacteroidetes es otro phylum mayortario de la microbiota intestinal que

encontramos elevado en los pacientes con CDI y en los individuos colonizados
por C. difficile. No obstante, este hallazgo es contradictorio puesto que es un
phylum de potenciales efectos beneficiosos a nivel de catabolismo de
polisacáridos complejos y del modelaje de la respuesta inmune (He, 2007).
Asimismo, varios autores han evidenciado que sus cantidades se ven reducidas
en la CDI (Weingarden, 2014) y el estado de colonización por C. difficile (Zhang,
2015). Una explicación posible pudiera ser que nuestra cohorte de controles sanos
presenta una abundancia relativa media de Bacteroidetes “más reducida de lo
habitual” y de Firmicutes “más abundante de lo habitual”. Aunque ambos phylum
sumen más del 80%, como suele ocurrir en una microbiota intestinal sana, sí que
parece que está algo desnivelada, aunque esto no suponga que sea una microbiota
disruptiva, ya que presenta elevada riqueza y alfa diversidad (Human
Microbiome Project Consortium, 2012).
Por consiguiente, con respecto a los tres phylum mayoritarios, en nuestra

cohorte de individuos colonizados por C. difficile las diferencias en la composición
de la microbiota intestinal con respecto a los controles sanos son bastante
similares a las halladas en nuestra cohorte de pacientes con CDI. A este respecto
recordemos que la colonización puede explicarse por factores dependientes de la
virulencia de la cepa causal de C. difficile, o por el grado de compromiso de la
microbiota intestinal que es insuficiente para que se establezca una completa
virulencia, es decir, una completa germinación y toxicidad suficiente para que se
establezca la clínica. Nuestros resultados muestran también que el estado de
colonización es un estado disruptivo de la microbiota intestinal en mayor o menor
grado de forma similar a la disbacteriosis franca observada en los pacientes con
CDI. En un sujeto colonizado se ha debido producir una disbacteriosis previa en
mayor o menor grado para que sea posible la colonización de C. difficile, pero a su
vez, en el contexto de esa disbacteriosis deben existir grupos de bacterias que
minimicen la replicación, germinación y toxicidad necesarias para que se
388
establezca la virulencia completa. Los resultados hallados al respecto de la alfa y
beta diversidad, riqueza y abundancias relativas de los phylum mayoritarios
Firmicutes, Bacteroidetes y Proteobacteria todavía no evidenciaron tales
diferencias entre individuos infectados y colonizados por C. difficile.
Volviendo al phylum Firmicutes, el grueso de la drástica depleción, tanto

en pacientes infectados como en individuos colonizados por C. difficile, es debido
a elevadas disminuciones en la abundancia relativa de las familias
Lachnospiraceae y Ruminococcacea y a sus géneros como Faecalibacterium,
Subdoligranulum, Ruminococcus 2, Agathobacter y Roseburia. Nuestros resultados al
respecto concuerdan con lo hallado en estudios anteriores, tanto en infectados
(Antharam, 2013; Weingarden, 2014) como en colonizados por C. difficile (Zhang,
2015). Al respecto de los géneros a expensas de los cuales se produce las
disminuciones de estas familias aparece una mayor variabilidad. Esto puede ser
debido a que la microbiota intestinal conforma un ecosistema dinámico con
funciones fisiológicas, metabólicas, inmunológicas y de protección frente a
patógenos, que es estable en base a que existe un grado de redundancia funcional
de sus miembros, es decir, de un core funcional. Por tanto, la disminución relativa
en los géneros de estas familias mayoritarias comparada con cohortes de
individuos de referencia puede ser variable, ya que unos cuantos géneros
ejercerían las mismas funciones. No obstante, en los estudios anteriores aparecen
disminuciones en géneros que aparecen en el nuestro como Faecalibacterium,
Subdoligranulum y Roseburia. La conclusión que podemos extraer es que tanto en
pacientes con CDI como en individuos colonizados por C. difficile se establece una
microbiota intestinal con la capacidad para sintetizar butirato muy disminuida.
Las consecuencias debido a esto es que también debe existir un ambiente
intestinal proinflamatorio en los individuos colonizados, aunque este hecho no
debe ser suficiente por si solo para distinguir infección y colonización por C.
difficile. De hecho, la depleción de las familias Lachnospiraceae y
Ruminococcaceae también se ha encontrado en cohortes de pacientes con diarrea
nosocomial no debida a C. difficile (Antharam, 2013; Schubert, 2016).
Por otra parte, el metabolismo de los ácidos biliares a nivel intestinal es de

gran importancia en la patogénesis de la CDI, puesto que los ácidos biliares
389
primarios presentan una actividad germinante de las esporas de C. difficile
mientras que los secundarios presentan actividad inhibitoria. Los ácidos biliares
primarios que llegan al intestino grueso en muy baja cantidad porque la mayor
parte son reaobsorvidos, son biotransformados en ácidos biliares secundarios
mediante enzimas secretados por la microbiota intestinal de forma específica. En
individuos sanos con una microbiota intestinal rica y diversa, los ácidos biliares
primarios germinantes, son rápidamente desconjugados y transformados en
ácidos biliares secundarios por ciertos grupos de bacterias, reduciendo su
concentración y la probabilidad de germinación de las esporas de C. difficile
(Sarker, 2012). El enzima clave es BaiCD, no obstante, esta capacidad esta limitada
a un grupo muy reducido de bacterias. Las bacterias cuyo genoma codifique estos
enzimas producirían un efecto inhibitorio sobre la germinación de las esporas de
C. difficile. Perder estos grupos supondría una pérdida de este mecanismo de
resistencia a la colonización. Muchas de las especies con actividad BaiCD se
incluyen en el cluster Clostridium XIVa, muy relacionadas filogenéticamente unas
con otras (Ridlon, 2016) que comprende principalmente a la familia
Lachnospiraceae (Collins, 1994). Clostridium Scindens presenta una actividad
BaiCD muy elevada y aunque se engloba dentro del género Lachnoclostridium, que
está aumentado en los pacientes con CDI con respecto a los controles sanos e
individuos colonizados por C. difficile, mediante la secuenciación del gen ADNr
16S logramos suficiente profundidad para diferenciar que C. Scindens es
ligeramente mayor en el grupo de individuos colonizados que en pacientes con
CDI, aunque de forma no significativa, pero remarcando la importancia de este
minoritario grupo en la inhibición de un microambiente intestinal propicio para la
germinación de las esporas de C. difficile que se amortiguaría en los individuos
colonizados. Respecto al género Blautia, que también como grupo de bacterias
con actividad BaiCD (Buffie, 2015; Daquigan, 2017) se conserva de igual forma en
el grupo P en mayor abundancia que en el grupo CDI, llegando a la misma
conclusión. El último género que destacamos con actividad BaiCD es Eubacterium
(Buffie, 2015; Daquigan, 2017). El género Eubacterium se situa en en diferentes
familias, por las razones antes esgrimidas sobre la continua reorganización de los
clostridiales. En la familia Lachnospiracea se han situado varios grupos como
Eubacterium ventriosum Group, Eubacterium eligens Group, Eubacterium xylanophilum
Group, Eubacterium ruminantium Group, Eubacterium fissicatena Group, Eubacterium
390
hallii Group y Eubacterium oxidoreducens Group. Todos estos grupos se encuentran
en muy escasa abundancia relativa en el grupo de controles sanos y se observa
una práctica erradicación en los pacientes con CDI y una mínima conservación en
los sujetos colonizados. En Eubacterium coprostanoligenes Group de la familia
Ruminococcacea se observa la misma tendencia. Todos estos resultados nos
confirman que la relación entre el metabolismo de los ácidos biliares por parte de
miembros de la microbiota intestinal y su relación con la patogénesis de la CDI es
un mecanismo esencial, y el abordaje del presente estudio mediante un grupo de
pacientes con CDI y un grupo de individuos colonizados de C. difficile así lo
muestra.
Como contrapunto a la fuerte disminución de la familia Lachnospiraceae,

encontramos una expansión de interés en dos de sus géneros. Los géneros
Ruminococcus Gnavus Group y Ruminococcus Torques Group presentan incrementos
de sus abundancias relativas, en los pacientes con CDI y en los individuos
colonizados por C. difficile con una mayor tendencia en los colonizados aunque
sin diferencias significativas. Ambos géneros, a diferencia de otros miembros del
cluster Clostridium XIVa no son productores de butirato (Dethlefsen, 2006), y son
considerados especialistas degradadores de mucina (Sicard, 2017). Por
consiguiente, estos géneros dotarían de una ventaja selectiva para la colonización
y/o infección a patógenos oportunistas como C. difficile. Su presencia no sería
discriminadora de ninguno de los dos estados, pero coadyuvaría a la
disbacteriosis generada en ambas cohortes de sujetos. Este hallazgo no ha sido
documentada en ningún al respecto de la disbacteriosis establecida y asociada a la
presencia de C. difficile, pero si en otras situaciones como la enfermedad de Crohn
(Joossens, 2011).
Siguiendo con otras familias minoritarias dentro del phylum Firmicutes,

Veillonellaceae sufre una reconstrucción, tanto en individuos infectados como
colonizados por C. difficile, donde desaparecen géneros que podríamos considerar
“intrascendentes” para nuestro interés, como Megasphera y Megamonas, mientras
que Veillonella se expande. Veillonella es considerado como un patógeno
oportunista (causante de infecciones extraintestinales oportunistas) que se
expande debido a la simplificación de la microbiota intestinal, y a la aparición de
391
nuevos nichos ecológicos disponibles en pacientes con CDI (Antharam, 2013;
Weingarden, 2014) y en individuos colonizados por C. difficile (Han, 2019). El
hecho que este hallazgo también se produzca en el grupo de individuos
colonizados por C. difficile nos indica que no se trataría de un grupo demasiado
importante ni discriminatorio de ambos estados. No obstante, es un indicador de
disbacteriosis franca en ambos estados.
Dentro de las familias productoras de ácido láctico del phylum Firmicutes

encontramos diferencias en la composición interesantes en los géneros
Streptococcus, Enterococcus y Lactobacillus. Con respecto a Streptococcus se observa
incrementos en ambos grupos CDI y P con respecto a los controles sanos, mayor
en el caso de los individuos colonizados por C. difficile, aunque la diferencia no es
significativa. Los trabajos de comparación de microbiota intestinal de pacientes
con CDI frente a controles sanos, frente a individuos colonizados por C. difficile o
en estudios donde se ha comparado esta en pacientes con CDI antes y después a
un FMT, han arrojado resultados discrepantes y apenas se han puesto en valor al
género Streptococcus en la discusión de estos. Algunos autores han considerado
este género como patógeno oportunista común que se expande cuando la
microbiota intestinal es corrompida por antibióticos (Gu, 2016). Por el contrario,
otros no lo encontraron como miembro característico de la microbiota intestinal
en pacientes con CDI (Schubert, 2014; Antharam, 2013). En estudios donde se ha
observado la variación de la microbiota intestinal en pacientes con CDI tras un
FMT se evidenció que Streptococcus estaba presente en las muestras “pre FMT”,
pero que caía drásticamente en las muestras “post FMT” (Weingarden, 2014;
Brown, 2018). En trabajos de comparación de la microbiota intestinal en pacientes
con CDI y portadores asintomáticos de C. difficile se ha encontrado Streptococcus
resulta ligeramente superior en los portadores asintomáticos que en el grupo de
pacientes con CDI y en controles sanos (Zhang, 2015). La bibliografía al respecto
de este género nos lanza resultados dispares, sugiriendo este hecho que la
importancia en cuanto a su relación con la patogénesis de la CDI podría ser
menor o poco influyente. No obstante, se ha evidenciado en estudios in vitro que
el ácido láctico reduce los niveles de las toxinas TcdA y TcdB de C. difficile de
forma dosis dependiente y de forma independiente a la carga bacteriana (Kolling,
2012). Por consiguiente, el género Streptococcus y el resto de LAB resultarían
392
beneficiosos en este aspecto. Al igual que ocurre con la expansión del phylum
Protebacteria, pensamos que la expansión que se produce en el género
Streptococcus es debida a la perdida en la riqueza de anaerobios estrictos que
supone una ventaja selectiva para los anaerobios facultativos (Rivera-Chávez,
2016; Donohoe, 2012). Por tanto, en base a nuestros resultados pensamos que la
aparición del género Streptococcus surje como “efecto” y no como “causa” en la
disbacteriosis presente en pacientes con CDI e individuos colonizados por C.
difficile. Asimismo, si bien es un género con potencial poder patógeno, pensamos
que en el contexto de la CDI se trata de un grupo protector, debido
principalmente a la producción metabólica de ácido láctico. El hecho que en
nuestro estudio se situen sus niveles de forma superior en individuos colonizados
que en infectados por C. difficile nos lo situa como posible candidato a factor
protector de moderada importancia, que explique en parte, la no transición de un
estado de colonización sin clínica a un estado de infección. Con respecto al género
Enterococcus nuestros resultados muestran otro incremento, aunque muy leve, en
pacientes con CDI y en individuos colonizados por C. difficile con respecto a los
controles sanos y sin diferencias significativas. Varios y diversos trabajos han
evidenciado que los pacientes con CDI presentan incrementos del género
Enterococcus como miembro de la microbiota intestinal (Sangster, 2012; Milani,
2016; Antharam, 2013; Gu, 2016) aunque también se ha evidenciado en pacientes
con diarrea nosocomial no debida a C. difficile (Antharam, 2013; Gu, 2016). En
individuos colonizados por C. difficile también se ha evidenciado la presencia de
Enterococcus (Ozaki, 20014; Zhang, 2015). A pesar de estos hallazgos y los nuestros
se desconoce el efecto y el rol de Enterococcus en la patogénesis de la infección y/o
colonización por C. difficile. Enterococcus es un género anaerobio facultativo que es
capaz de adaptarse a la presencia de O2 en su nicho ecológico y adaptarse a un
metabolismo oxidativo en ciertas situaciones. También la perdida de anaerobios
estrictos en los grupos CDI y P le supone una ventaja selectiva (Rivera-Chávez,
2016) por el mismo mecanismo que al género Streptococcus. Por consiguiente, la
aparición de Enterococcus es “efecto” y no “causa” de la disrupción de la
microbiota intestinal de estos individuos. Tampoco, nuestros resultados muestran
que sea un hallazgo diferenciador de la microbiota intestinal de los pacientes con
infección y colonización por C. difficile. Algunos de los autores mencionados,
debido a que Enterococcus presenta factores de virulencia y poder patógeno,
393
comportándose como un patógeno oportunista en ciertas situaciones, piensan que
podría colaborar en la patogénesis de la CDI. Para nosotros Enterococcus presenta
una dualidad de efectos positivos (debido a la actividad frente a C. difficile del
ácido láctico) o negativos (debido a la citolisina y demás factor de virulencia) en
función de la cepa de E. faecalis o E. faecium que formen parte de la microbiota
intestinal de los pacientes con CDI o individuos colonizados por C. difficile. Por
consiguiente, estamos de acuerdo que se trata de un género característico de de la
colonización y/o infección por C. difficile, pero que para poder sacar conclusiones
sobre el poder que ejerce en la patogenicidad de la CDI se debería recurrir a
estudios metagenómicos para conocer la especie y el grado de virulencia de esta.
Por último, Lactobacillus muestra otro incremento, aunque muy leve, en pacientes
con CDI y en individuos colonizados por C. difficile con respecto a los controles
sanos, sin diferencias significativas aunque superior en el grupo CDI. Se trata de
un género poco relacionado con la patogénesis con la CDI al respecto de la
microbiota intestinal, y se ha incidido más bien poco en su importancia al
respecto, aunque algún autor ha destacado unos resultados similares a los
nuestros (Gu, 2016), incluso en los individuos colonizados por C. difficile (Zhang,
2015). Los pocos estudios muestran resultados dispares sobre si se trata de un
género protector (Shahinas, 2012) o susceptible (Brown, 2018) al desarrollo de
CDI. Además, Lactobacillus se compone de más de 170 especies y varias
subespecies con una gran variabilidad fenotípica y genotípica que hace muy
complicado generalizar acerca del género. Aunque se ha asociado a ciertas
infecciones, lo cierto es que Lactobacillus presenta potenciales efectos beneficiosos
debido a la producción de AGCC, en especial el ácido láctico, con los efectos antes
mencionados sobre C. difficile y sus toxinas, y otras sustancias de interés como los
ácidos linoleicos de acción antinflamatoria, los compuestos fenólicos (Mikelsaar,
2016) y ciertas bacteriocinas (Pessione, 2012). Pero hay que remarcar que no todas
las especies de Lactobacillus tienen propiedades probióticas inhibiendo el
sobrecrecimiento de patógenos intestinales como C. difficile, ya que la eficacia de
una bacteria probiótica es cepa dependiente (Goldstein, 2017). Por consiguiente,
Lactobacillus es un género complejo de interpretar en el contexto de la CDI. Su
expansión en los pacientes con CDI y en individuos colonizados por C. difficile, es
debido a la misma razón por la que se produce la expansión de otras LAB como
Streptococcus y Enterococcus. Es difícil de prever lo que supone a la patogénesis de
394
la CDI este género, puesto que algunas especies y cepas de estas especies, no
todas, presentan efectos beneficiosos sobre la CDI y que, por otra parte, se han
documentado casos de infecciones por Lactobacillus, pudiéndose comportar como
un patógeno oportunista. Lo cierto es que se deberían recurrir a estudios
metagenómicos para caracterizar las especies de Lactobacillus a expensas de las
que se produce su aumento en los pacientes con CDI y en los individuos
colonizados por C. difficile, e incluso el tipo de cepa, para poder sacar conclusiones
acerca de si suponen protección o susceptibilidad al desarrollo de la CDI. Lo que
si que concluímos es que tanto Lactobacillus como el resto de LAB son marcadores
de disbacteriosis en ambos grupos de individuos.
Dentro de la familia Peptostreptococcaceae del phylum Firmicutes se situa

el género Clostridiodes que tiene como única especie a C. difficile. Clostridioides está
incrementado, en los grupos CDI y P con respecto al de los controles sanos
(donde no hay presencia de C. difficile) de forma significativa, aunque con una
abundancia relativa casi idéntica muy escasa. La positividad del gen tcdB por
PCR no distingue entre colonización e infección, ya que en nuestra cohorte de
individuos colonizados por C. difficile el 53% presenta cepas toxigénicas
(obviamente el 100% de las cepas de C. difficile en el grupo de pacientes con CDI
son toxigénicas). Nuestros resultados sugieren que sugiriendo que la mayor
presencia de C. difficile no distingue infección ni colonización. Algún autor ha
evidenciado que la carga del gen tcdB, relacionado con la mayor presencia de
toxina TcdB libre, tampoco correlaciona con un estado de colonización o
infección, diversidad, estructura de la microbiota intestinal o cambios importantes
en géneros productores de butirato beneficiosos (Han, 2019), enlazando con
nuestros resultados. Las toxinas TcdA y TcdB son las responsables de la clínica
producida por C. difficile. Los genes codificantes tcdA y tcdB se localizan en su
locus de patogenicidad y pueden producirse cambios inserciones, deleciones y
mutaciones puntuales que conforman una heterogeneidad genética, dando lugar
a una serie de diferentes toxinotipos. Esto supone que podrían existir cepas con
diferente actividad y especificidad de sus toxinas con respecto a la cepa de
referencia de C. difficile VPI 10463 (Rupnik, 2016), por consiguiente, son
importantes porque muestran propiedades funcionales de las variantes de las
toxinas con variabilidad en su actividad y producción. No obstante, la correlación
395
entre los diferentes toxinotipos que nos permita discriminar estados de infección
y colonización no se ha clarificado. Una pista podría la variente del tcdB del
ribotipo 027 que codifica una toxina de mayor poder citotóxico que las cepas
clásicas (Stabler, 2009). Por otra parte, la variabilidad del espectro clínico que
presenta la CDI, incluso pudiendo establacerse un estado de colonización
asintomática, es debido a condiciones del individuo (como el grado de
compromiso de la microbiota intestinal) y a la virulencia de la cepa causal de C.
difficile. Por consiguiente, nuestros resultados apuntan a que la abundancia
relativa de C. difficile no es un elemento diferenciador del estado de colonización e
infección y que habría que buscar factores de virulencia como el toxinotipado en
futuros estudios como tal.
En último lugar al respecto del phylum Firmicutes, la famila

Erysipelatrichaceae es la última donde observamos diferencias en la composición
de sus géneros de los individuos colonizados e infectados por C. difficile con
respecto a los controles sanos. En el género Erysipeloclostridium se observa una
expansión en pacientes con CDI y en individuos colonizados por C. difficile,
aunque de forma no significativa, con mayor abundancia relativa en los
infectados. Erysipelatoclostridium es un género potencialmente patógeno,
escasamente prevalente que suele afectar a pacientes inmunocomprometidos,
menores de 5 años y ancianos (Zakham, 2019). También se ha asociado a casos de
peritonitis, abceso intestinal y colitis pseudomembranosa (Alcalde-Vargas, 2012),
aunque es un grupo muy minoritario de la microbiota intestinal. La expansión
observada en ambos grupos CDI y P es presumiblemente debida a la aparición de
nuevos nichos ecológicos debido a la perdida de diversidad y riqueza. Debido al
carácter patógeno de este género y al efecto proinflamatorio intestinal de la
familia Erysipelatrichaceae (Dinh, 2015), consideramos este hallazgo como
relevante y que podría tener repercusión en la transición del estado colonización
asintomático hacia un estado de infección, ya que la expansión es más abundante
en los pacientes con CDI. Este dato no ha sido valorado en ningún estudio acerca
de la patogénesis de la CDI y su relación con la microbiota intestinal, y
consideramos que debiera seguir siendo investigado. Con respecto al género
Clostridium innocuum Group, el comportamiento es similiar, observándose
incrementos en ambos grupos CDI y P con respecto a los controles sanos (donde
396
la abundancia relativa es prácticamente del 0%), siendo significativas las
diferencias entre los infectados y los colonizados por C. difficile y los infectados
frente a los controles sanos. Se trata de un miembro minoritario de la microbiota
intestinal con poder patógeno capaz de producir infecciones extraintestinales pero
muy graves (Chia, 2017), sobre todo en pacientes ancianos con enfermedades de
base e infecciones gastrointestinales secundarias al consumo de antibióticos como
diarrea, colitis severa y colitis pseudomembranosa (Chia, 2018). Asimismo, es un
género resistente a la vancomicina de forma constitutiva, debido a
particularidades en la composición del peptidoglicano de su pared celular. Por
tanto, de igual forma que con Erysipelatoclostridium, la expansión de Clostridium
innocuum Group es debida a la aparición de nuevos nichos ecológicos. El hecho
que el incremento sea significativamente superior en pacientes con CDI con
respecto a los individuos colonizados por C. difficile pensamos que es importante
y se debe tener en cuenta en la patogénesis de la CDI. Debido a su poder como
patógeno intestinal (Chia, 2017) y capacidad inflamatoria (Dinh, 2015) podría
tener repercusión como grupo predisponente a desarrollar CDI. Este hecho no ha
sido valorado en ningún estudio acerca de la patogénesis de la CDI. Por
consiguiente, los miembros patógenos de la familia Erysipelatrichaceae que
hemos mencionado se expanden en los pacientes con CDI, pero en mucho menor
medida en los individuos colonizados por C. difficile y debido a ello son
predisponentes al desarrollo de CDI.
El phylum Bacteroidetes sufre una total reestructuración de su composición

a nivel de familias y géneros tanto en pacientes con CDI como en individuos
colonizados por C. difficile. Si bien las familias mayoritarias se comportan de
forma similar en ambas cohortes de pacientes infectados y colonizados por C.
difficile, en las familias minoritarias sí encontramos diferencias. De la siguiente
manera, se observa un llamativo incremento significativo del género Bacteroides en
ambos grupos CDI y P, con respecto a los controles sanos. Bacteroides es un género
en el cual hay un general consenso sobre la asociación de su depleción con la CDI
y la perdida de resistencia a la colonización (Zhang, 2015; Dong, 2018; Rea, 2012;
Weingarden, 2014; Brown, 2018; Shahinas, 2012). No obstante, en algunos trabajos
encontramos resultados similares a los nuestros, donde hemos encontrado un
aumento en su abundancia relativa tanto en pacientes infectados (Antharam,
397
2013) como en colonizados por C. difficile (Han, 2019). Bacteroides conforma un
género heterogéneo bioquímica y fisiológicamente. Presenta una capacidad muy
adaptable al medio y una gran capacidad de metabolización de polisacáridos
provenientes de la dieta y del mismo hospedador. Es por ello su amplia
distribución como miembro mayoritario de la microbiota intestinal.
Consideramos insustancial una teórica perdida de Bacteroides, mostrada por
muchos autores, al respecto de la patogénesis de la CDI, debido a que la
competición por los nutrientes suele ser mayor entre bacterias cercanas
filogenéticamente, por tanto, sería más probable la expansión de C. difficile con la
depleción del phylum Firmicutes. De hecho, se ha observado que C. difficile es
capaz de degradar la mucina de la capa mucosa y de metabolizar los ácidos
siálicos que la componen (Ng, 2013), permitiéndole su expansión. Por tanto, la
mayor disponibilidad de los ácidos siálicos de la mucosa intestinal que se genera
tras una disbacteriosis post antibiótica sería un factor importante en la expansión
de C. difficile y debido a la gran actividad sobre los carbohidratos del género
Bacteroides, el incremento transitorio post antibiótico de estos monosacáridos
liberados desde la mucosa intestinal proporcionaría una oportunidad de
expansión para C. difficile. Asimismo, Bacteroides también es considerado un
patógeno oportunista, ya que es agente etiológico de multitud de infecciones,
principalmente intraabdominales. Por otra parte, mediante estudios in vitro y
modelos murinos se ha evidenciado en algunas especies una capacidad para
mitigar la CDI (Deng, 2018; Yoon, 2017) y presenta una actividad
inmunomoduladora en procesos inflamatorios intestinales que podría limitar la
respuesta inmune exacerbada que se observa en los pacientes con CDI (Hee,
2007). Por consiguiente, pensamos que es difícil establecer si se trata de un género
que indique protección o susceptibilidad a desarollar CDI. Al producirse el
incremento de Bacteroides en ambos grupos CDI y P, no se trata de un género que
explique en parte la no transición desde un estado de colonización a infección, ya
que se observa igual de aumentado en los individuos colonizados de C. difficile.
Por último, es llamativa la abundancia relativa tan baja de Bacteroides en el grupo
de los controles sanos. Pensamos que la perdida de diversidad y riqueza
observado en los grupos CDI y P haya afectado en mayor medida al phylum
Firmicutes con respecto a Bacteroidetes, y que debido a la baja abundancia
398
relativa de Bacteroides en los controles sanos, pudiera parecer que aumenta en los
pacientes infectados y colonizados por C. difficile.
Siguiendo con la familia Tannerellaceae del phylum Bacteroidetes

observamos incrementos significativos del género Parabacteroides en los
individuos colonizados e infectados por C. difficile, en mayor medida en los
pacientes con CDI, aunque sin diferencias significativas entre los grupos CDI y P.
Pocos estudios han destacado la importancia del género Parabacteroides con
respecto a su papel en la patogénesis de la CDI. Parabacteroides suele presentar
abundancias relativas incrementadas tanto en pacientes con CDI y en individuos
colonizados por C. difficile, en mayor o menor medida, en línea con nuestros
resultados (Rea, 2012; Zhang, 2015; Han, 2019). Algún autor, incluso, ha
manisfestado que se trata de un género marcadador de recurrencia (Khanna,
2016a). Ciertamente, existen muchas evidencias de que Parabacteroides es un
género patógeno oportunista que se expande cuando se genera una disbacteriosis
intestinal y que colabora en la clínica observada en varios trastornos intestinales
(Lopetuso, 2017; Dziarski, 2016). Asimismo, Parabacteroides es productor de
succinato y se ha visto que el succinato está presente en muy baja concentración
en el intestino y que se eleva de forma transitoria después de administración
antibiótica o después de un tratamiento que alterara el transito intestinal. C.
difficile es capaz de expandirse utilizando como fuente de energía este succinato
más accesible (Ferreyra, 2014). Concluímos que es un género característico de la
CDI y marcador de la disbacteriosis presente tanto en individuos colonizados
como infectados. Es difícil apresurarse a decir que es un género que diferencia el
estado de los infectados y de los colonizados, ya que a raíz de sus mecanismos
subyacentes en la patogénesis de la CDI y de la bibliografía al respecto, harían
falta estudios metagenómicos para concretar que especies están en juego.
Por último, al respecto de la familia Prevotellaceae, aunque bien es cierto

que disminuye de forma significativa en pacientes con CDI e individuos
colonizados por C. difficile con respecto a los controles sanos, a nivel de los
géneros que la componen sufre una total reconstrucción. Asimismo, destacan la
práctica erradicación del género Prevotella 9 en los pacientes con CDI con respecto
a controles sanos que no se observa en el grupo P y la expansión de Prevotella 7 en
399
el grupo CDI que no se observa en los controles sanos ni en el grupo P. La
pérdida del género Prevotella y de otros miembros de la familia Prevotellaceae en
los pacientes con CDI (Vincent, 2013; Skraban, 2013; Rea, 2012) e individuos
colonizados por C. difficile (Zhang, 2015; Han, 2019; Dong, 2018) es un hallazgo
evidenciado en muchos estudios. Se suele concluir que Prevotella es un género
protector debido a su papel en la digestión de carbohidratos complejos y a la
producción de sustratos esenciales para el colonocito. No obstante, se ha sugerido
que Prevotella es la causa principal de la inflamación intestinal persistente en
pacientes VIH generando a una alteración funcional de la mucosa intestinal e
inflamación sistémica crónica (Dillon, 2014), se ha visto que en ratones tratados
con antibióticos la adición de Prevotella copri incrementa la susceptibilidad a la
colitis inducidad por dextrato sulfato sódico (Scher, 2013) y también que, P. copri
es capaz de potenciar la colitis en ratones tanto con disbacteriosis como con la
microbiota intestinal intacta (Dziarski, 2016). Además, Prevotella, al igual que
Parabacteroides es un género cuyo principal metabolito generado es el succinato y
podría permitir o ayudar en la expansión de C. difficile mediante el mismo
mecanismo. Por tanto, se trata de un género con una gran diversidad génica,
existiendo una gran variabilidad en las cepas y tenemos una dualidad de efectos
patobiontes y beneficiosos. Nuestros resultados muestran que Prevotella 9 está
erradicada en el grupo CDI, aunque sin embargo se conserva en los individuos
colonizados por C. difficile y en los controles sanos, con lo que podríamos concluir
que este género comprendería a grupos beneficiosos, los cuales se verían privados
los pacientes con CDI y no los controles sanos ni los colonizados. Por otra parte, el
género Prevotella 7 se expande en los pacientes con CDI y se mantiene erradicado
en los controles sanos y en los colonizados, pudiendo comprender a especies
patobiontes proinflamatorias. Debido a la perdida de miembros del phylum
Firmicutes y de grupos productores de butirato se produciría un ambiente
intestinal proinflamatorio, que permitiría la expansión de especies comprendidas
en el género Prevotella 7 en los pacientes con CDI. Esto por alguna razón no
dilucidada no ocurriría en los individuos colonizados por C. difficile. Por tanto, si
mediante estudios metagenómicos se identifican especies beneficiosas y
proinflamatorias podríamos encontrar un biomarcador que explique en parte la
diferencia entre el estado de colonización e infección por C difficile. Para ello, los
niveles de Prevotella 7 y Prevotella 9 nos parece un buen punto de partida. Con
400
respecto al género Paraprevotella es un grupo minoritario de la microbiota
intestinal de los controles sanos y se observa una escasa disminución significativa
en los individuos colonizados por C. difficile y un escaso aumento significativo en
los pacientes con CDI. El comportamiento de este género en individuos
colonizados e infectados ha mostrado resultados dispares (Milani, 2016; Han
2019). El hecho de que sea un género productor de succinato podría permitir la
expansión de C. difficile (Ng, 2013), como explicamos con el género Prevotella. Por
consiguiente, aunque Paraprevotella es un género poco estudiado en su relación
con la patogénesis de la CDI, en base a nuestros resultados y su asociación con
otras enfermedades (Ye, 2018; Lv, 2016), postulamos que podría tratarse de un
género que favorecería la creación de un ambiente inflamatorio que ayudaría a
desencadenar una respuesta inmune exacerbada en los pacientes con CDI y a
aumentar el daño tisular. Asimismo, la no expansión de este género en los
individuos colonizados por C. difficile resultaría beneficioso para evitar el
desarrollo de clínica.
Con respecto a la expansión del phylum Proteobacteria la observamos tanto

en los pacientes con CDI como en los individuos colonizados por C. difficile. Dicho
incremento es a expensas del género Escherichia/Shigella. El incremento de la
familia Enterobacteriaceae a expensas del género Escherichia/Shigella es un
hallazgo frecuente en los pacientes con CDI (Milani, 2016; Gu, 2016; Weingarden,
2014; Shahinas, 2012; Brown, 2018). Asimismo, se ha puesto de manifiesto que la
principal especie que se incrementa en este género es Escherichia coli. Por
consiguiente, vamos a asumir que E. coli es la especie predominante en nuestros
resultados al respecto. Nuestros resultados, además, muestran un incremento,
además de en los pacientes con CDI, en los individuos colonizados por C. difficile.
Este hecho también ha sido observado en algunos de los pocos trabajos que han
incluido una cohorte de sujetos colonizados (Han, 2019; Zhang, 2015). Por
consiguiente, puesto que en los pacientes con CDI y los individuos colonizados
por C. difficile de nuestro estudio se encuentran incrementos similares
pronunciados de Escherichia/Shigella donde probablemente E. coli será el
componente mayoritario de este cluster, y conociendo que existen varias cepas de
E. coli enteropatógenas, sería interesante conocer la presencia de estas cepas en
ambos grupos de estudio. Es por lo cual que formulamos la hipótesis que en el
401
grupo CDI hay una colonización de cepas patogénicas que podrían potenciar los
efectos de las toxinas de C. difficile. Esta colonización es más susceptible en estos
pacientes debido a la perdida de diversidad y riqueza de la microbiota intestinal
que presentan. Por otra parte, esta colonización no se produciría en los
individuos colonizados por C. difficile. Este hecho podría explicar en parte la
difficile. Asimismo, nuestros resultados también muestran una presencia de
Proteus en los pacientes con CDI, que no se observa en los controles sanos ni en
los individuos colonizados por C. difficile. Esto es presumiblemente debido a que
la microbiota intestinal de estos pacientes lo permite y no así la de los otros dos
grupos. La presencia de Proteus agrava la disbacteriosis de esos pacientes y
potencia la presencia de clínica, ya que hemos visto que adopta un rol oportunista
en coinfecciones con otros patógenos intestinales (Müller, 1986). Este hecho no se
produciría en los indiviuos colonizados y explicaría en parte junto a otras
alteraciones y diferencias que C. difficile no sea causante de clínica en estos
individuos.
En la composición de la microbiota intestinal de individuos infectados y

colonizados por C. difficile, a nivel de los phylum minoritarios Actinobacteria y
Verrucomicrobia sí que encontramos diferencias importantes. Con respecto a
Actinobacteria es destacable la práctica erradicación estadísticamente significativa
del género Bifidobacterium en los pacientes con CDI con respecto a los controles
sanos, y la parcial conservación en los individuos colonizados. Llama la atención
los escasos estudios que han puesto en valor la posible presencia o ausencia de
Bifidobacterium y su rol en la patogénesis de la CDI. Todos estos limitados trabajos
nos indican que en pacientes con CDI se observaría una disminución de
Bifidobacterium (Zhang, 2015; Milani, 2016; Skraban, 2013) aunque, no obstante, en
individuos colonizados por C. difficile, la bibliografía al respecto aporta resultados
dispares (Zhang, 2015; Rea, 2011; Han, 2019). Consideramos a Bifidobacterium un
género beneficioso, de propiedades antimicrobianas y antinflamatorias (Boto-
Ordóñez, 2014), las cuales podrían ser favorables en el control de C. difficile. De
forma contraria, niveles disminuidos de Bifidobacterium se han correlacionado con
el sobrecrecimiento de patógenos intestinales (Hidalgo-Cantabrana, 2017).
Estudios in vivo e in vitro han demostrado que algunas especies de Bifidobacterium
402
son capaces de inhibir el crecimiento de C. difficile y disminuir la producción de
TcdA y TcdB (Valdés-Varela, 2016), neutralizar TcdA y TcdB (Wei, 2018) y
disminuir el daño tisular y la mortalidad en ratones infectados (Yun, 2017). Estas
acciones serían debidas a la capacidad de Bifidobacterium de modular la respuesta
inmune, la síntesis de ácidos orgánicos y la acidificación del microambiente
intestinal (Pessione, 2012).Por consiguiente, consideramos muy destacable que se
conserve Bifidobacterium en los individuos colonizados por C. difficile, ya que
debido a las propiedades beneficiosas y diferentes mecanismos de acción en la
inhibición en patógenos intestinales como C. difficile, se explicaría, al menos en
parte, que estos individuos no expresen la clínica asociada a la CDI ya que
comportan un mejor control del patógeno. Hasta nuestro conocimiento, es la
primera vez que se llega a estas conclusiones con respecto a la colonización por C.
difficile y el papel de Bifidobacterium.
Con respecto al otro phylum minoritario Verrucomicrobia, también hemos

encontrado diferencias destacables en su composición y abundancia relativa entre
los pacientes con CDI y los individuos colonizados por C. difficile. Hemos
observado que estas diferencias observadas son a expensas del género
Akkermansia, que solo comprende en humanos a la especie Akkermansia
muciniphila. En el grupo de pacientes con CDI se observa un incremento no
estadísticamente significativo mientras que en el grupo de los individuos
colonizados por C. difficile se observa una disminución estadísticamente
significativa, con respecto a los controles sanos. A. muciniphila presenta como
característica más destacable es la capacidad para fermentar la mucina de la capa
mucosa intestinal. Al respecto de la CDI, solo recientemente se ha incidido en la
importancia que podría presentar en su patogénesis. Si dos estudios evidenciaron
que en pacientes con CDI se observa una expansión de A. muciniphila (Sangster,
2016; Milani, 2016), nuestros resultados muestran por primera vez un incremento
de A. muciniphila en los pacientes con CDI y una dismunición en los individuos
colonizados por C. difficile. Por consiguiente, el incremento de A. muciniphila en
los pacientes con CDI reflejaría una mayor degradación de la capa mucosa
intestinal, lo cual es proceso importante para el desarrollo de dicha infección. En
los individuos colonizados por C. difficile, de forma interesante, evidenciamos una
disminución de A. muciniphila que reflejaría una mayor integridad de la mucosa
403
intestinal. Este hecho, descrito en el presente estudio por primera vez, pensamos
que es importante y que diferencia el estado de colonización y de infección de C.
difficile, junto con el conjunto de diferencias encontradas.
404
VII - LÍNEAS DE
FUTURO.
CAPÍTULO VII–LÍNEAS DE FUTURO______________________________________
CAPÍTULO VII. LÍNEAS DE FUTURO
A lo largo de la discusión hemos planteado diversos estudios

metagenómicos futuros que vamos a recopilar en este capítulo.
De forma global es sugerible que en un futuro recurramos a una

combinación de estudios metabolómicos, de genómica funcional y de
metagenómica, junto al estudio del gen ADNr 16S para consolidar la evidencia
sobre el estado de colonización asintomática por C. difficile.
Hemos visto que las manifestaciones clínicas que produce la CDI son muy
variables desde leves a muy graves o fulminantes. Incluso se puede producir una
colonización asintomática de C. difficile. Este espectro de situaciones es debido a
que depende de factores que competen al individuo, como el estado inmune, la
presencia de comorbilidades, la edad y el grado de compromiso de la microbiota
intestinal, y también a C. difficile en cuanto a la virulencia de la cepa causal.
Nuestros resultados muestran que la abundancia relativa de C. difficile es similar
en individuos con infección y colonización. Es por lo cual que factores
concernientes a C. difficile deberían ser tenidos en cuenta en la diferenciación entre
la infección y la colonización. Pensamos que las variantes toxinotípicas son un
ejemplo al respecto. Por tanto, valoramos la importancia de evaluar factores de
virulencia de C. difficile en un futuro, junto a estudios de secuenciación masiva del
gen ADNr 16S y estudios metagenómicos.
El género Enterococcus presenta una dualidad de efectos positivos o

negativos en función de la cepa de E. faecalis o E. faecium que formen parte de la
microbiota intestinal de los pacientes con CDI o individuos colonizados por C.
difficile. Nuestros resultados muestran que se trata de un género característico de
ambos grupos CDI y P, pero que para poder sacar conclusiones sobre el poder
que ejerce en la patogenicidad de la CDI se debería recurrir a estudios
metagenómicos para conocer la especie y el grado de virulencia de esta.
408
Con respecto a Lactobacillus se deberían recurrir a estudios metagenómicos
para caracterizar las especies a expensas de las cuales se produce su aumento en
los pacientes con CDI y en los individuos colonizados por C. difficile que
observamos en nuestro estudio, e incluso el tipo de cepa, para poder sacar
conclusiones acerca de si suponen protección o susceptibilidad al desarrollo de la
CDI.
El género Erysipelatoclostridium presenta un carácter patógeno, así como la

familia Erysipelatrichaceae un efecto proinflamatorio intestinal (Dinh, 2015).
Nuestros resultados muestran que podría tener repercusión en la transición desde
un estado colonización asintomático hacia un estado de infección, ya que su
expansión es más abundante en los pacientes con CDI. Este dato no ha sido
valorado en ningún estudio acerca de la patogénesis de la CDI y su relación con la
microbiota intestinal, y consideramos que debiera seguir siendo investigado. De
igual forma que con Erysipelatoclostridium, la expansión de Clostridium innocuum
Group es debida a la aparición de nuevos nichos ecológicos. El hecho que el
incremento sea significativamente superior en pacientes con CDI con respecto a
los individuos colonizados por C. difficile pensamos que es importante y se debe
tener en cuenta en la patogénesis de la CDI. Debido a su poder como patógeno
intestinal (Chia, 2017) y capacidad inflamatoria (Dinh, 2015) podría tener
repercusión como grupo predisponente a desarrollar CDI. Este hecho no ha sido
valorado en ningún estudio acerca de la patogénesis de la CDI. Por consiguiente,
los miembros patógenos de la familia Erysipelatrichaceae que hemos mencionado
se expanden en los pacientes con CDI, pero en mucho menor medida en los
individuos colonizados por C. difficile y debido a ello son predisponentes al
desarrollo de CDI.
Nuestros resultados muestran que Prevotella 9 está erradicada en el grupo

CDI, aunque sin embargo se conserva en los individuos colonizados por C. difficile
y en los controles sanos, con lo que podríamos concluir que este género
comprendería a grupos beneficiosos, de los cuales se verían privados los
pacientes con CDI y no los controles sanos ni los sujetos colonizados. Por otra
parte, el género Prevotella 7 se expande en los pacientes con CDI y se mantiene
erradicado en los controles sanos y en los sujetos colonizados, pudiendo
409
comprender a especies patobiontes proinflamatorias. Debido a la perdida de
miembros del phylum Firmicutes y de grupos productores de butirato se
produciría un ambiente intestinal proinflamatorio, que permitiría la expansión de
especies comprendidas en el género Prevotella 7 en los pacientes con CDI. Esto por
alguna razón no dilucidada no ocurriría en los individuos colonizados por C.
difficile. Por tanto, si mediante estudios metagenómicos se identifican especies
beneficiosas y proinflamatorias podríamos encontrar un biomarcador que
explique en parte la diferencia entre el estado de colonización e infección por C
difficile. Para ello, los niveles de Prevotella 7 y Prevotella 9 nos parece un buen
punto de partida.
Puesto que en los pacientes con CDI y en los individuos colonizados por
C. difficile de nuestro estudio se encuentran incrementos pronunciados similares
de Escherichia/Shigella donde probablemente E. coli será el componente
mayoritario de este cluster, y conociendo que existen varias cepas de E. coli
enteropatógenas, sería interesante conocer la presencia de estas cepas en ambos
grupos de estudio. Es por lo cual que formulamos la hipótesis que en el grupo
CDI hay una colonización de cepas patogénicas que podrían potenciar los efectos
de las toxinas de C. difficile. Por otra parte, esta colonización no se produciría en
los individuos colonizados por C. difficile. Este hecho podría explicar en parte la
difficile.
Consideramos que el incremento de Klebsiella que observamos en los

individuos colonizados por C. difficile con respecto a los controles sanos y a los
pacientes con CDI, debería complementarse mediante estudios metagenómicos
para conocer las especies colonizantes y en caso de ser K. pneumoniae, su serotipo.
La colonización prolongada de cepas virulentas de K. pneumoniae puede conducir
al desarrollo de enfermedades intestinales inflamatorias como la enfermedad de
Crohn o colitis ulcerosa (Kaur, 2018). Los serotipos K1 y K2 son considerados los
más virulentos debido a la presencia de una cápsula de polisacárido que le
permite eludir la fagocitosis por los macrófagos.
410
Por último, nuestros resultados muestran un incremento de Parasutterella
en pacientes con CDI y en menor médida en individuos colonizados por C.
difficile, con respecto a los controles sanos donde se trata un género muy escaso.
En contra de lo mencionado otros estudios donde parece que Parasutterella es un
género protector (Staley, 2016), nuestros resultados apuntan a lo contrario, ya que
se observa en indivuos infectados y colonizados por C. difficile. Por lo tanto, es un
género del cual se conoce poco y del cual tenemos pruebas a favor y en contra de
si se trata de un género protector o predisponente (Chen, 2019) de CDI. Se
deberían establecer estudios metagenómicos y funcionales en modelos murinos,
en relación con la CDI, para hipotetizar su función en la patogénesis de la CDI.
411
VIII - CONCLUSIONES.
CAPÍTULO VIII – CONCLUSIONES________________________________________
CAPITULO VIII. CONCLUSIONES.
En base a nuestro objetivo principal de la tesis que era la comparación de

la microbiota intestinal de pacientes con CDI e individuos colonizados por C.
difficile con respecto a un grupo de controles sanos, podemos concluir que los
sujetos infectados y colonizados por C. difficile presentan una microbiota intestinal
con una diversidad, riqueza, estructura y composición completamente diferente a
la de los controles sanos. No obstante, la microbiota intestinal de los sujetos
infectados y colonizados por C. difficile presenta grandes similitudes a nivel de
diversidad, riqueza y estructura. Es en la composición donde encontramos que los
sujetos colonizados, en especial en géneros minoritarios, presentan diferencias
con respecto a los infectados. Este hecho explica, al menos en parte, el estado de
colonización asintomático por C. difficile.
414
IX - LIMITACIONES.
CAPÍTULO IX – LIMITACIONES______________________________________
CAPÍTULO IX. LIMITACIONES.
Consideramos que la presente tesis presenta dos limitaciones principales.

La primara limitación es el tamaño muestral. Cada cohorte de pacientes con CDI,
de individuos colonizados por C. difficile y de controles sanos está compuesta por
15 sujetos. Este tamaño muestral nos ha permitido encontrar diferencias
estadísticamente significativas en cuanto a diversida, riqueza y composición en
los grupos de sujetos infectados y colonizados por C. difficile con respecto a los
controles sanos. No obstante, las diferencias en cuanto a composición de los
sujetos colonizados con respecto a los infectados son mayormente no
significativas. Pensamos que con un mayor tamaño muestral las diferencias
discutidas serían significativas. Asimismo, esta tesis consiste en un estudio
descriptivo. El principal escollo para aumentar el tamaño muestral ha sido la
inclusión de individuos colonizados por C. difficile.
La segunda limitación que consideramos a tener en cuenta para la

interpretación de los resultados es la dieta. La dieta es un factor a tener en cuenta
en la composición de la microbiota intestinal y en el presente estudio no se han
recogido variables al respecto. Asimismo, pensamos que esto podría tener mayor
influencia en la microbiota intestinal de los controles sanos.
418
X - BIBLIOGRAFÍA.
CAPÍTULO X – BIBLIOGRAFÍA____________________________________________
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ESCUELA INTERNACIONAL DE DOCTORADO

Programa de Doctorado de Ciencias de la Salud

Estudio descriptivo de la microbiota intestinal en

Murcia, octubre de 2020

Estudio descriptivo de la microbiota intestinal en

Murcia, octubre de 2020

El Dr. D. Vicente Navarro López como Director de la Tesis Doctoral

titulada “Estudio descriptivo de la microbiota intestinal en pacientes con

infección por Clostridium difficile y en individuos colonizados por

Clostridium difficile.” realizada por D. Pedro Sánchez Pellicer en el

Departamento de Ciencias de la Salud, autoriza su presentación a trámite

dado que reúne las condiciones necesarias para su defensa.

Lo que firmo, para dar cumplimiento a los Reales Decretos 99/2011,

1393/2007, 56/2005 y 778/98, en Murcia a 5 de octubre de 2020.

A mi mujer Ruth y a mi hijo Ibai, las dos personas más importantes de mi

A mis padres y hermano por haber confiado siempre en mí en cada paso

Al Dr. Vicente Navarro, director de esta tesis y compañero de trabajo, por

A Simón y Rosana por su inestimable ayuda con el inglés. Muchas gracias.

A mis compañeros del laboratorio del Hospital Universitario del Vinalopó

A Oscar, mi confesor, que me hizo ser consciente de cuan tortuoso era el

recorriendo una distancia

que valga los sesenta segundos,

y todo lo que hay en ella,

y -lo que, es más-,

¡Serás un hombre! hijo mío.”

Fragmento del poema “Si” de Rudyard Kipling (1895).

Clostridium difficile es un bacilo Gram positivo, anaerobio estricto y

La infección por C. difficile (CDI, Clostridium difficile infection) supone un

La disrupción de la microbiota intestinal endógena (disbacteriosis)

Por otra parte, la tasa de portadores o colonizados por C. difficile es

La comparación de la microbiota intestinal de sujetos infectados y

El objetivo del estudio es describir y comparar la microbiota intestinal de

La presencia de ciertos grupos minoritarios de bacterias clave podría

Mediante secuenciación masiva del gen bacteriano ADNr 16S se realizaron

Se evidencia una pérdida de alfa diversidad y riqueza en los grupos CDI y

El estudio de la composición muestra que en los grupos CDI y P se

Concluimos que los sujetos infectados y colonizados por C. difficile

PALABRAS CLAVE: Clostridium difficile, colonización asintomática, infección por

Clostridium difficile is a Gram-positive bacillus, strict anaerobic and spore-

C. difficile infection (CDI) is a very important problem in terms of

Disruption of the endogenous intestinal microbiota (dysbacteriosis)

Comparison of intestinal microbiota of subjects infected and colonized by

Presence of certain minor groups of key bacteria could be related to the

MATERIAL AND METHODS.

By means of high-throughput sequencing of 16S rDNA bacterial gene,

There is evidence of a loss of alpha diversity and richness in CDI and P

We conclude that subjects infected and colonized by C. difficile have an

Capítulo I: Introducción. Marco Teórico.

Capítulo II: Justificación del estudio y objetivos.

Capítulo III: Hipótesis.

Capítulo IV: Material y Métodos.

Capítulo VI: Discusión.

Capítulo VIII: Conclusiones.

Capítulo IX: Limitaciones del estudio.

FIGURA 1: Esquema de la transmisión de la infección y ciclo vital de C. difficile.

FIGURA 2: Microfotografías de cortes finos de secciones de diversas cepas de

FIGURA 3: Principales estadios morfogénicos de la esporulación.

FIGURA 4: Esquema del proceso de germinación de las esporas de C. difficile.

FIGURA 5: Dominios proteicos funcionales y estructurales de TcdA y TcdB.

FIGURA 6: Mecanismo de acción de las toxinas de C. difficile esquematizado.