PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

HISTORIA:

Los medios de cultivo son preparaciones nutritivas especiales para la

recuperación, aislamiento y mantenimiento de microorganismos
bacterianos y fúngicos. Estos medios pueden ser sólidos, líquidos o
semisólidos.

Louis Pasteur fue el primero en demostrar que en un

caldo hecho con trozos de carne hervido servía para
que las bacterias se reprodujeran en gran cantidad,
hasta el punto de enturbiar el caldo. En este sentido, el
caldo de carne de Pasteur es considerado el primer
medio de cultivo líquido utilizado.

También Robert Koch hizo un aporte invaluable en el

mejoramiento de ciertas técnicas de laboratorio ya
que introdujo el concepto de medio de cultivo sólido

Al principio el usaba rodajas de patatas como medio

sólido, pero luego agregó gelatina a los caldos de
carne con mejores resultados. Sin embargo, había
momentos en que la gelatina se derretía y se
convertía en un cultivo líquido. Hoy se sabe que eso
ocurre porque algunas bacterias son capaces de
hidrolizar a la gelatina.

Fue entonces cuando a unos de sus colaboradores se le ocurrió la idea de

usar agar-agar, un compuesto que usaba su esposa para espesar sus
dulces. Este medio de cultivo rudimentario poco a poco ha ido
sofisticándose, hasta llegar a los medios de cultivo que hoy se conocen.
INTRODUCCIÓN:

Los medios de cultivo pueden adquirirse comercialmente listos para su uso

o se pueden preparar en el laboratorio a partir de material deshidratado el
cual contiene los componentes necesarios para elaborar cada uno de los
tipos de medios existentes. Para su elaboración hay que seguir las
instrucciones dadas por el fabricante, que se especifican en el prospecto
del envase. Normalmente consiste en disolver el medio deshidratado en
agua destilada, proceso que se conoce como reconstitución. La cantidad
de agua será la que indica el fabricante.
DESARROLLO:

1.Primeramente observaremos los medios de

cultivo deshidratados y veremos las
cantidades de preparación para cada uno
ya sea sólido o líquido. Debemos recordar
que los sólidos llevan el nombre de agar y los
medios líquidos llevan el nombre de caldos.

2. Como segundo paso pesaremos la

cantidad exacta del medio de cultivo según las
indicaciones de la etiqueta del frasco.

Para esto podríamos usar una balanza granataria o

una electrónica y cualquiera de estas debe estar
colocada en una superficie plana, rígida y
nivelada ya que esto nos ayudará a evitar errores
en la calibración y debemos asegurarnos que el
platillo de la balanza este limpio.

Antes de pesar nuestro medio de cultivo

deshidratado debemos de colocar en el
platillo ya sea papel aluminio o papel
toalla para evitar la contaminación de la
balanza.
Por ejemplo, si queremos preparar Agar MacConkey la casa comercial nos
indica que debemos preparar 50 gramos de medio deshidratado por cada
litro de agua destilada.

Pero en el caso que el profesional en laboratorio clínico no quiera preparar

esa cantidad de medio, se procede a hacer una regla de tres para
calcular la cantidad exacta de gramos que se debe agregar. Y esta
misma regla la podemos aplicar con diferentes medios de cultivo que
queramos preparar.
Ejemplo:

Debemos preparar 40 placas de Petri

con 20mL cada una
agar MacConkey
40 cajas de Petri X 20ml = 800ml

50g-------1000ml

X ---------800ml
X = 40g

3. Después de haber pesado nuestro medio deshidratado lo colocaremos

en un Erlenmeyer y agregaremos el agua destilada requerida, previamente
medida en una probeta.
4. Luego colocamos el agua destilada en el Erlenmeyer con el medio
deshidratado, mezclamos y colocamos una barrera de protección en la
boca matraz esta puede ser papel aluminio o añadir un tapón para evitar
la contaminación.

5. Procederemos a colocar el matraz en un agitador

magnético esto hará que se mezcle el medio de
manera automatizada evitando que el agar se pegue
en las paredes del matraz también estos equipos suelen
estar equipados con calefacción lo que permitirá
calentar el medio hasta llegar al punto de ebullición.

6. Mientras nuestro medio llegue al punto de ebullición podemos preparar

los materiales para colocarlos en la autoclave.

Las cajas de Petri que utilizaremos posteriormente las envolveremos en

papel estraza y le colocaremos cinta testigo, luego de que nuestro medio
llegue al punto de ebullición le colocaremos la cinta testigo.
La cinta testigo posee unas pequeñas líneas en diagonal de color
blanquecinas y si estas líneas pasan de este color al negro nos indicara si
nuestros materiales pasaron por un proceso correcto de esterilización
cuando los coloquemos en la autoclave.

7. Como siguiente paso colocaremos nuestra preparación en la autoclave

para garantizar que nuestro medio este totalmente esterilizado. Este tipo
de equipos emplean vapor de agua saturado, a una presión de 15 libras lo
que permite que la cámara alcance una temperatura de 121ºC y el
tiempo de esterilización para colocar nuestro medio será de 15 minutos.

Cuando se utiliza este método es

importante controlar en la autoclave la
relación entre la temperatura, la presión y
el tiempo de exposición, ya que éstos son
factores críticos en el proceso. Sólo
cuando el vapor se coloca bajo presión,
es cuando su temperatura aumenta por
encima de los 100ºC y esto permite
alcanzar las temperaturas de esterilización
(121ºC). Entre las ventajas de este método
de esterilización tenemos que no deja
residuos, las autoclaves modernas son
sencillos de manejar y es un método
rápido de esterilización.

Luego de sacar todos nuestros materiales de la

autoclave verificamos si la cinta testigo presenta las
líneas color negro y si es así podemos proceder con
el siguiente paso:
8. Crearemos un ambiente estéril con el
mechero de Bunsen trabajando con este
30 centímetro a la redonda, siempre
flameando la boca del matraz luego
vertemos el medio a las placas de Petri y
estas placas generalmente tienen la
capacidad de unos 25 ml cada una y
dejamos que con el tiempo se solidifiquen.

CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

Una vez que se ingresa un medio de cultivo al laboratorio se debe

identificar con una clave, registrar la fecha de recepción, la de apertura y
la de caducidad. El almacenamiento debe realizarse en las condiciones
especificadas por el fabricante. Los envases deben estar herméticamente
cerrados, especialmente cuando se trate de medio deshidratados. No es
recomendable utilizar medios deshidratados que presenten
apelmazamiento o un cambio de color.

Se debe verificar que los medios de cultivo y diluyentes preparados por el

laboratorio tengan las características adecuadas con respecto a:
 Esterilidad
 Propiedades físicas: pH, color

 Productividad o promoción de crecimiento: Recuperación o

supervivencia de los microorganismos de interés.
 Selectividad: Inhibición de los microorganismos no deseados.

 Porcentaje de recuperación bacteriana. Es el rendimiento o

recuperación de un microorganismo que se espera que se desarrolle en el
medio de cultivo.
Control de esterilidad de los medios de cultivo

Este procedimiento se lleva a cabo cada vez que se prepara un lote de

medio de cultivo o diluyente. Los medios de cultivo preparados se incuban
en estufa a 35 °C durante 24h. Esta prueba se realiza sobre el 5% del lote
preparado. El criterio de aceptación es que no debe haber crecimiento, sí
se presenta desarrollo se rechaza el lote.

Si hay crecimiento microbiano (imagen A), el medio de cultivo no ha sido

preparado en condiciones de esterilidad, si no se presentan colonias
(imagen B) se ha preparado adecuadamente.
Almacenamiento de los medios de cultivo

Se debe determinar y verificar el período de validez de los medios

preparados en las condiciones de conservación especificadas. Se debe
observar el cambio de color, la evaporación, la deshidratación, y si ocurre
crecimiento microbiano. En general los medios preparados se guardan a 4°
C, no más de tres meses