PRÁCTICA 6.

REACCIONES DE
DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA
Y ANTIBIOGRAMA
Estudiante: Rocio Canaza Mamani
Semestre II “A”
OBJETIVO
La clasificación de bacterias es esquematizada en un organizador visual correspondiente
a reacciones de diferenciación bioquímica y un antibiograma.
FUNDAMENTO
Una de las afecciones más frecuentes son las infecciones urinarias producidas
generalmente por bacterias Gram negativas, especialmente Escherichia coli, no obstante,
también hay bacterias Gram positivas que pueden estar involucradas, y siendo que todas
las especies de microorganismos tienen particularidades en cuanto a su metabolismo y su
sensibilidad a los antibióticos ha sido utilizada para clasificarlas en cepas sensibles o
resistentes, es que en la actualidad, a través de medios de cultivo y discos de antibióticos
es posible diferenciarlos.
MATERIALES
− Lámina portaobjetos
− Lámina cubreobjetos
− Mechero
− Asa Kohle
− Medios de cultivo de diferenciación bioquímica: TSI, LIA, CS, SIM
− Agar MH
− Discos de antibiotico
− Aceite de inmersión
− Microscopio óptico

PROCEDIMIENTO Urocultivo
Para el procesamiento se debe tener preparados los medios de cultivo como Agar Sangre
(AS), Agar Mc Conkey (AM) y Agar Manitol Salado (AMS) correspondiendo las
muestras de orina a 50 ml del chorro medio de orina, siendo de ahí sembradas con el asa
de siembra calibrada y esterilizada a la llama de un mechero, con la que se suministrará
0.001 ml de orina, mediante la técnica de dispersión – agotamiento (3 planos), en placas
de AS, AM y AMS, seguidamente se rotulará e incubará a 35-37 °C por 24 horas
(Sacsaquispe y Ventura, 2001).
De este modo, en AS, se valorará el crecimiento de bacterias Gram negativas y Gram
positivas, mientras que en AMS se aislará bacterias Gram positivas del género
Staphylococcus mediante el cambio de pigmentación, asimismo, para el reconocimiento
de especies Gram positivas se realizará las pruebas de catalasa, coagulasa y resistencia a
noboviocina, mientras, que para el aislamiento de bacterias Gram negativas se empleará
agar Mc Conkey; en caso haya crecimiento se cuantificará la cantidad de unidades
formadoras de colonias (UFC) siendo considerado ITU positivo una cantidad >100000
UFC (Sacsaquispe y Ventura, 2001).
Asimismo, para el reconocimiento bacteriano de bacterias Gram negativas se empleará
pruebas de diferenciación bioquímica que comprenderá los medios de cultivo Triple
Azúcar Hierro (TSI), Agar Lisina Hierro (LIA), Agar Citrato de Simmons (CS) y Medio
Motilidad Indol Sulfuro (SIM) para lo cual se inoculará una colonia sospechosa con el
asa recta por el centro hasta el fondo del tubo y se retirará por el mismo trazo, sembrando
en estría en la parte inclinada, inmediatamente después se incubará a 35-37°C por 18-24
h (Sacsaquispe y Ventura, 2001).
Interpretación
Para Gram positivos
− Staphylococcus: S. aureus (catalasa +, coagulasa+), S. saprophyticus (resistente a
novobiocina)
− Streptococcus: catalasa – (S. pyogenes β hemólisis) −
Enterococcus: catalasa –.
Para Gram negativos
Enterobacteriaceae y Gram negativos
TSI: Discrimina el consumo de lactosa, glucosa y sacarosa con producción o no de gas y
la producción de ácido sulfhídrico. A/A=Reacción ácida (amarilla) en pico de flauta
(lactosa) y fondo del tubo (glucosa)
LIA: La lectura se realiza en la columna y en la superficie inclinada, asimismo se observa
la formación de ácido sulfhídrico el cual se evidencia por una coloración negra.
CS: Azul es positivo, y verde, negativo
SIM: Es positivo si los microorganismos migran de la línea de siembra y se difunden en
el medio provocando turbidez, también puede manifestarse semejando “vellosidades” a
lo largo del trazo de siembra. En caso sea negativo se observará un crecimiento bacteriano
acentuado siguiendo el trazo de siembra, y el medio circundante se mantiene claro.
Finalmente, todas estas reacciones bioquímicas serán contrastadas con la Tabla de
Reacciones Bioquímicas de la Familia Enterobacteriaceae y de otras bacterias Gram
negativas.
Antibiograma
Se utilizará los microorganismos aislados en los medios de cultivo de siembra primaria
(AS, AM o AMS) con más de 24 h de incubación, y se seleccionará una colonia aislada
de la placa de Petri a ser transferida a un frasco de suero fisiológico estéril previamente
estandarizado con el patrón de turbidez 0.5 McFarland. Luego, se sembrará en el agar
Müeller Hinton (MH), con un hisopo estéril embebido en la suspensión anterior rotándolo
en las paredes del tubo para eliminar el excedente (por encima del nivel del líquido), luego
se sembrará suavemente sobre la superficie del medio en 3 direcciones haciendo girar la
placa Petri lo que permitirá una distribución homogénea del inoculo.
De ahí, se procederá mediante la técnica de Kirby Bauer a la aplicación de los discos de
antibiótico que se colocarán sobre la superficie del agar MH, con la ayuda de unas pinzas,
haciendo ligera presión sobre el medio, el cual luego de colocado, se extenderá
inmediatamente al agar y para evitar la superposición de zonas de inhibición, no se
colocarán más de doce discos en la placa Petri (150 mm de diámetro interno).
Concerniente a los discos de antibiótico, para Gram negativos se emplearán amoxicilina,
amikacina, gentamicina, trimetoprim sulfametoxazol, nitrofurantoina, ciprofloxacino y
ceftriaxona y para Gram positivos discos de penicilina, oxacilina, gentamicina,
tetraciclina, cloranfenicol, nitrofurantoina y vancomicina según recomendaciones del
Manual Operativo Estandarizado de Microbiología.
Interpretación
El halo de susceptibilidad se determinará con un vernier o regla milimetrada, midiendo el
diámetro del halo de susceptibilidad antimicrobiano producido alrededor de cada disco de
antibiótico, cumpliendo con el Manual de Procedimientos para la Prueba de Sensibilidad
Antimicrobiana por el Método de Disco Difusión del INS (2002) y el Performance
Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing (CLSI, 2016), donde según el diámetro
de halo de inhibición obtenido (mm) se establecerá la respuesta sensible, intermedia o
resistente al antimicrobiano de cada agente etiológico.

Figura 1. Bacterias aisladas de infecciones de tracto urinario coloreadas mediante Tinción

de Gram
Interprete las siguientes reacciones de diferenciación bioquímica y antibiograma
para Gram negativos
 REACCIÓN DE DIFERENCIACIÓN
BIOQUÍMICA

INTERPRETACION DE UN ANTIGRAMA
Revisión especializada
En el artículo Urinary Tract Infection and Microbiome que esta ubicado en el enlace
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10252372/#:~:text=Urinary%20Microb
iome%20and%20UTIs,pyrosequencing%20from%20midstream%20urine%20samples
. encontrar las respuestas a los siguientes enunciados

Resultados

1. ¿Qué función tiene el sexo en los microbiomas urinarios?

El sexo es un factor importante que puede contribuir a las diferencias en los microbiomas
individuales iniciales. En comparación con las mujeres, solo unos pocos estudios han
evaluado los microbiomas del tracto urinario masculino y la mayoría se realizaron en el
entorno clínico de infecciones de transmisión sexual (ITS) Nelson y cols. utilizaron
secuenciación de ARNr 16s en la primera orina de hombres que visitaban una clínica de
ITS sin síntomas de uretritis. Lactobacillus , Corynebacteria y Streptococcus se
encontraban entre los géneros detectados con mayor frecuencia. El análisis de
agrupamiento mostró que las ITS estaban asociadas con organismos que generalmente no
están relacionados con el tracto urinario masculino, como Sneathia , Gemella y
Prevotella. También compararon microbiomas en muestras de orina y uretra de 32
hombres. Se descubrió que eran casi idénticos independientemente de la inflamación o la
infección. Para los pacientes sin ITS
,Lactobacillus , Sneathia y Veillonella fueron los más abundantes, mientras que para los
pacientes con ITS , Neisseria , Streptococcus y Corynebacterium fueron los más comunes
. Un estudio posterior realizado por Nelson evaluó muestras de orina y del surco coronal
en adolescentes varones asintomáticos con diversos estados de circuncisión e
antecedentes sexuales.
 2. ¿Cuáles son las implicaciones del microbioma del tracto urinario en las ITU?

a) Microbioma urinario e infecciones urinarias

Las infecciones urinarias pueden ocurrir cuando se altera el equilibrio entre el microbioma
del huésped y del tracto urinario . Wilner et al. perfilaron comunidades microbianas en 50
pacientes con infecciones urinarias agudas no complicadas utilizando secuenciación de
ARNr 16s y pirosecuenciación de amplicón fimH de muestras de orina a mitad de camino.
Las comunidades microbianas de ITU mostraron diferencias según la edad, con
individuos más jóvenes dominados por Escherichia coli ( E. coli ) y pacientes mayores
con altas abundancias de Pseudomonas . En mujeres con ITU, se observó una

proporción relativamente mayor de Enterobacteriaceae , mientras que en pacientes

masculinos con ITU no se detectaron Streptococcus , Lactobacillus y Staphylococcus .

b) Infecciones recurrentes del tracto urinario y efectos de los antibióticos en el

microbioma

Las ITU recurrentes plantean una carga significativa tanto en los aspectos personales
como sociales, desde la disminución de la calidad de vida (CV) hasta cuestiones
socioeconómicas . La patogénesis de las ITU recurrentes aún no se ha definido; sin
embargo, se han propuesto dos teorías principales y estudios de apoyo para ambos En
primer lugar, las infecciones repetidas a través de una ruta ascendente fecal-
perinealuretral están respaldadas por estudios que muestran similitudes entre los
microbiomas de la orina y el intestino y evidencia de un reservorio intestinal para la
recurrencia .
Magruder et al. utilizaron secuenciación de ARNr 16s y metagenómica en muestras
fecales y de orina de receptores de trasplantes de riñón y descubrieron que la abundancia
intestinal de Escherichia y Enterococcus eran factores de riesgo independientes de
bacteriuria. El análisis de cepas también mostró una estrecha alineación a nivel de cepas
en las muestras de intestino/orina . Forde et al. analizó la dinámica de una población de
E. coli ST131 durante más de 5 años en una mujer con ITU recurrentes desde 1970. Se
utilizó WGS para identificar un linaje clonal que vincula las ITU recurrentes y la flora
fecal, proporcionando evidencia de un reservorio intestinal . Una segunda teoría teoriza
que la supervivencia de las bacterias en la vejiga mediante comunidades bacterianas
intracelulares (IBC) progresa hacia reservorios intracelulares inactivos persistentes
(QIR). Mientras que estudios anteriores se centraron en recrear el ciclo IBC/QIR en
modelos murinos,estudios recientes proporcionan evidencia de bacterias que residen en
la pared de la vejiga de pacientes con ITU recurrente junto con alteraciones de la
arquitectura urotelial

c) Microbioma y tratamientos emergentes para las infecciones urinarias

recurrentes

La investigación sobre las infecciones urinarias recurrentes y la resistencia a los

antimicrobianos utilizando tecnología de punta ha proporcionado nuevos conocimientos
y una comprensión de cómo las comunidades microbianas interactúan y cambian los
estados patológicos. Este conocimiento puede traducirse en el desarrollo de la modulación
del microbioma del tracto urinario como un posible método para el tratamiento de las
infecciones urinarias.
Se ha evaluado ampliamente la eficacia de las bacterias protectoras, como los lactobacilos
, para mejorar los mecanismos defensivos del tracto urinario .Se cree que estos
probióticos, cuando se administran en cantidades suficientes, benefician al huésped a
través de componentes antimicrobianos como bacteriocinas, biosurfactantes y ácidos
lácticos .

3. ¿Cuál es la relación entre infecciones recurrentes del tracto urinario y efectos

de los antibióticos en el microbioma?

Las infecciones recurrentes del tracto urinario (ITU) pueden estar vinculadas a los efectos
de los antibióticos en el microbioma de varias maneras. Cuando se utilizan antibióticos
para tratar las ITU, estos medicamentos no solo eliminan la bacteria causante de la
infección, sino que también afectan a otras bacterias presentes en el tracto urinario,
incluyendo aquellas que son beneficiosas para mantener un equilibrio saludable. Este
desequilibrio en el microbioma puede tener consecuencias significativas. En primer lugar,
la eliminación de bacterias beneficiosas debilita las defensas naturales del organismo, lo
que puede hacer que el tracto urinario sea más susceptible a futuras infecciones. Además,
el uso repetido de antibióticos puede generar resistencia bacteriana, lo que significa que
las bacterias pueden volverse menos sensibles o resistentes a los efectos de los antibióticos
utilizados, haciendo que el tratamiento sea menos efectivo con el tiempo.
En resumen, la relación entre ITU recurrentes y los efectos de los antibióticos en el
microbioma es compleja y multifacética. La investigación continúa para comprender
mejor estas interacciones y desarrollar estrategias clínicas que minimicen los impactos
negativos de los antibióticos en el microbioma, ayudando así a prevenir la recurrencia de
las infecciones del tracto urinario.