 Objetivo:

Aplicar los fundamentos teóricos de esta importante técnica de separación, purificación

e identificación y desarrollar en el laboratorio las técnicas cromatografías más
utilizadas.

 Fundamento:
La cromatografía se clasifica en cromatografía de adsorción y cromatografía de
partición de acuerdo al fenómeno involucrado en la separación.
Todos los métodos cromatográficos operan bajo el principio de que los componentes de unas mezclas se van a
distribuir desigualmente entre dos fases. La fase móvil es
generalmente un líquido o un gas que fluye continuamente sobre una fase estacionaria
que puede ser un líquido o un sólido. Los componentes individuales de la mezcla tienen
diferentes afinidades por la fase móvil y la fase estacionaria, de esta manera se
establece un equilibrio entre ambas fases y los constituyentes de dicha mezcla son
selectivamente separados temporalmente de la fase móvil, por la unión con la fase
estacionaria. Los métodos cromatográficos usados por los químicos modernos pueden ser clasificados por la
naturaleza de la fase móvil y la fase estacionaria, por ejemplo,
cromatografía en columna, cromatografía de gases (GC), cromatografía de líquidos de
alta resolución (HPLC) y cromatografía en capa fina (TLC) involucran una interacción
97 líquido-sólido o gas-sólido, (cromatografía de adsorción). La cromatografía de gas-líquido es un tipo de
cromatografía de gases que involucra una interacción entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria líquida
adsorbida sobre un sólido inerte
(cromatografía de partición). La cromatografía en papel pertenece también a este último tipo.

Términos empleados en cromatografía de adsorción

Soluto: La sustancia que se va a separar.

Adsorbente: La sustancia finamente dividida la cual constituye

la fase estacionaria en la cromatografía de
adsorción.

Origen o línea base: Punto en el cual la muestra es aplicada.

Desarrollo: El paso de un líquido a través del adsorbente para

efectuar la separación de la muestra.

Eluente: Es la fase móvil que efectúa la separación del

soluto, éste puede ser un líquido puro, una mezcla
de líquidos o un gas.

1
 Eluato: Es la mezcla de la fase móvil que efectuó la
separación junto con los solutos al final de la
cromatografía.

Revelado: Cuando los componentes de la muestra no son

coloreados (es decir, visibles a simple vista) el
cromatograma es visualizado por el empleo o
aplicación de luz ultravioleta o algún reactivo,
pueden ser vapores de yodo; a éstos se les
conoce como reveladores universales.

Rf o factor de retención: Es la relación de la distancia recorrida por el soluto

o componente (medida desde el punto de
aplicación hasta en el centro geométrico de la
mancha correspondiente) y la distancia recorrida
por el frente del eluente.

Existen una gran cantidad de adsorbentes disponibles comercialmente, ordenados en

forma decreciente de polaridad tenemos: alúmina (Al2O3), gel de sílice (ácido silícico
SiO2 xH2O), florisil (silicato de magnesio activado), celulosa, carbohidratos y algunos
otros de menor uso. En el laboratorio se utilizan por lo general, gel de sílice y alúmina,
ambos son sólidos polares.

El grado de actividad de los adsorbentes es disminuido por la presencia de pequeñas

cantidades de agua, por eso el porcentaje de humedad va a ser una de las variables
que se debe considerar al efectuar una cromatografía de adsorción. Otro factor a
considerar es el área específica, altas áreas específicas aseguran equilibrios rápidos y
buenas separaciones. Las áreas requeridas son del orden de cientos de metros
cuadrados por gramo.

2
En cromatografía en fase reversa el material de empaque para la fase estacionaria
consiste en perlas de vidrio recubiertas con una película de hidrocarburo no polar y
mezclas de agua y solventes orgánicos son empleados como fase móvil; bajo estas
condiciones las moléculas orgánicas no polares son fuertemente atraídas por la fase
estacionaria no polar y los solutos polares son más atraídos por la fase móvil. El orden
de elución es el reverso de la fase normal y muchas veces este método puede separar
mezclas que por fase normal no se logra.

Cromatografía de capa fina

La cromatografía en capa fina, puede iniciarse preparando los platos o placas

cromatográficas, el adsorbente es usualmente alúmina o gel de sílice en suspensión
acuosa mezclada con una pequeña cantidad de aglutinante, suele emplearse almidón o
sulfato de calcio. Las placas son recubiertas con una delgada capa de 250 micras de
espesor, luego son secadas en una estufa a 110°C durante 1 hora, para eliminar el
agua presente, pues esta disminuye la actividad del adsorbente. Las placas pueden ser
de vidrio o de plástico duro. También se venden ya preparadas.
Para visualizar las bandas, si los compuestos son incoloros y presentan fluorescencia,
se emplea la lámpara de luz ultravioleta, cuando esto no funciona, se puede emplear
vapores de yodo (se introduce la cromatoplaca en un recipiente con cristales de yodo) o
bien se emplea un reactivo específico aplicado con un aspersor sobre la placa.

3
Cromatografía en columna

Esta técnica también es una forma de cromatografía de adsorción líquido-sólido y

constituye una poderosa herramienta en la síntesis orgánica, pues tanto en la industria
como en la investigación, frecuentemente es necesario separar los componentes de
una mezcla de reacción para ser usados posteriormente en otras rutas sintéticas. La
cromatografía en columna es idónea para este propósito. Cuando el propósito es
separar una mezcla se le conoce como técnica preparativa. Es importante mencionar que los principios teóricos
vistos para TLC se aplican de igual manera para cromatografía en columna. La selección del mejor eluente y
adsorbente se puede efectuar por medio de cromatografía en capa fina.

Los componentes de la mezcla son inicialmente adsorbidos por la fase estacionaria en

la parte superior de la columna, pero luego el eluente los mueve hacia abajo, a
diferentes velocidades, dependiendo de su afinidad por el material adsorbente. Un
componente débilmente adsorbido viajará más rápido que uno fuertemente unido a la
fase estacionaria. Cuando los componentes son coloreados, se observan diferentes bandas a medida que éstas se
separan por medio de efecto del eluente y los diferentes tiempos de retención de cada soluto. Cada fracción es
entonces separada en recipientes diferentes.

Proceso de empacado
Antes de iniciar el proceso de empacado se debe tener bien claro que la eficiencia de la
separación va a depender de lo bien que este proceso sea llevado a cabo, si llegan a
formarse fracturas en el adsorbente por causa de un empaque deficiente, es
conveniente volver a empezar. Existen dos formas de empacar una columna: el método en seco y el método en
húmedo; en el primero se va añadiendo el adsorbente seco sobre el eluente que se encuentra llenando la columna.
En el segundo se prepara una suspensión del
adsorbente en el eluente seleccionado y se añade a la columna que debe estar llena
sólo a la mitad de su capacidad. El método en húmedo se requiere cuando se usa como
adsorbente gel de sílice. La columna debe ser de vidrio con llave de teflón o bien provista de un pedazo de
manguera con una llave de Mohr para controlar la salida del solvente.

4
 Proceso de elución
Para iniciar la cromatografía de la muestra, ésta se disuelve en una mínima cantidad de
solvente y se añade a la columna que previamente ha sido desalojada del eluente hasta
el nivel de la parte superior de la arena. Se deja adsorber la muestra y se lava con un
poco de eluente, después se llena la columna con más líquido.
La elución de la muestra puede ser simple o fraccionada (llamada también técnica de
gradiente). En la elución simple se usa un solo eluente durante toda la separación. Este
procedimiento funciona bien para la separación de mezclas de dos o tres componentes
con polaridades semejantes. La técnica de elución fraccionada es la más adecuada. En ésta se usa, una serie de
eluentes con incrementos en polaridad para llevar a cabo la elución de la mezcla en la columna. La elución se inicia
con un eluente no polar como hexano o éter de petróleo para separar la primera banda con los componentes menos
polares. Los componentes de mayor polaridad, quedan adsorbidos en la fase estacionaria y para moverlos se hace
un incremento gradual en la polaridad del eluente para que las bandas individuales se
separen y no coeluyan. Por ejemplo, si se parte de hexano, se va añadiendo 5 % de
cloroformo y 95 % de hexano, luego se incrementa el cloroformo a 10, 15, 20, 40, 80 %
disminuyendo el hexano. De esta manera las diferentes bandas migran, hasta
abandonar la columna. La elución se inicia con un eluente no polar como hexano o éter de petróleo para separar la
primera banda con los componentes menos polares. Los componentes de mayor polaridad, quedan adsorbidos en la
fase estacionaria y para moverlos se hace un incremento gradual en la polaridad del eluente para que las bandas
individuales se
separen y no coeluyan. Por ejemplo, si se parte de hexano, se va añadiendo 5 % de
cloroformo y 95 % de hexano, luego se incrementa el cloroformo a 10, 15, 20, 40, 80 %
disminuyendo el hexano. De esta manera las diferentes bandas migran, hasta
abandonar la columna.

 Toxicidad y propiedades físicas/químicas de cada compuesto químico (utilice el

siguiente formato para cada compuesto de acuerdo con la información que
encuentre) ejemplo

NOMBRE: CAS: 91-20-3

Naftaleno
Estado físico:
Liquido
CLAVE DESCRIPCIÓN
H228 sólidos inflamables
PELIGRO
H302 toxicidad aguda (oral)
H351 Carcinogenicidad
H400 peligroso para el medio ambiente acuático - peligro agudo
H410 peligroso para el medio ambiente acuático - peligro crónico
CLAVE DESCRIPCIÓN
ATENCIÓN

EQUIPO DE SEGURIDAD:
Protección respiratoria, Protección de los ojos, Protección de las manos, Protección del cuerpo,
PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS:
sólido (cristalinas)
5
Color blanco
Olor característico
Punto de fusión/punto de congelación 79 – 82 °C
Punto inicial de ebullición e intervalo de ebullición 218,1 °C
Densidad 1,069 g/cm³ a 24,7 °C

NOMBRE: Éter etílico CAS: 2679-89-2

Estado físico: liquido

CLAVE DESCRIPCIÓN
H224 Líquido y vapores extremadamente inflamables.
PELIGRO
H302 Nocivo en caso de ingestión.
H336 Puede provocar somnolencia o vértigo.
CLAVE DESCRIPCIÓN
P210 Mantener alejado del calor, de superficies calientes, de chispas, de llamas abiertas y de
ATENCIÓN cualquier otra fuente de ignición. No fumar.
P280 Llevar guantes/gafas de protección.

EQUIPO DE SEGURIDAD: • protección de las manos, protección de los ojos/la cara, protección respiratoria

PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS: Estado físico: líquido (fluido), Color: incoloro, Olor: levemente dulce,
Densidad: 0,78 g/cm³ a 20 °C

NOMBRE: Acetona CAS: 67-64-1

Estado físico: liquido

CLAVE DESCRIPCIÓN
H225 Líquido y vapores muy inflamables
PELIGRO
H319 Provoca irritación ocular grave
H336 Puede provocar somnolencia o vértigo
CLAVE DESCRIPCIÓN
P210 Mantener alejado de fuentes de calor, chispas, llama abierta o superficies
ATENCIÓN calientes. No fumar

EQUIPO DE SEGURIDAD: Protección de manos, protección de piel, protección de ojos y cara

PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS: Estado físico líquido

Color incoloro
Olor levemente dulce – afrutado
Punto de fusión/punto de congelación -94,8 °C (ECHA)
Punto de ebullición o punto inicial de ebullición e
intervalo de ebullición
56,05 °C (ECHA)

NOMBRE: Hexano CAS: 110-54-3

6
 Estado físico: liquido

CLAVE DESCRIPCIÓN
H225 Líquido y vapores muy inflamables
H304 Puede ser mortal en caso de ingestión y penetración en las vías respiratorias
PELIGRO H336 Puede provocar somnolencia o vértigo
H315 Provoca irritación cutánea
H361f Se sospecha que perjudica a la fertilidad
H411 Tóxico para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos
CLAVE DESCRIPCIÓN
P202 No manipular la sustancia antes de haber leído y comprendido todas las
ATENCIÓN instrucciones de seguridad
P280 Llevar guantes/gafas de protección

EQUIPO DE SEGURIDAD: Protección respiratorio, protección de piel, protección de ojos y cara

PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS:

Estado físico líquido
Color incoloro
Olor como: - Gasolina
Punto de fusión/punto de congelación -95 °C a 1.013 hPa (ECHA)
Punto de ebullición o punto inicial de ebullición e
intervalo de ebullición
68 – 69 °C a 1.013 hPa

NOMBRE: Metanol CAS: 67-56-1

Estado físico: liquido

CLAVEDESCRIPCIÓN
PELIGRO H225 Líquido y vapores muy inflamables
H370 Provoca daños a los órganos
CLAVEDESCRIPCIÓN
P210 Mantener alejado de fuentes de calor, chispas, llama abierta o superficies
ATENCIÓN calientes. No fumar
P280 Llevar guantes/gafas de protección
P270 No comer, beber ni fumar durante su utilización
EQUIPO DE SEGURIDAD: Protección en la piel, en los ojos/cara y manos

PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS:

Estado físico líquido
Color incoloro
Olor como: - alcohol
Punto de fusión/punto de congelación -98 °C (ECHA)
Punto de ebullición o punto inicial de ebullición e
intervalo de ebullición
65 °C a 1.013 hPa (ECHA)

NOMBRE: Etanol CAS: 64-17-5

7
 Estado físico: liquido

CLAVE
DESCRIPCIÓN
PELIGRO H225
Líquido y vapores muy inflamables
H319
Provoca irritación ocular grave
CLAVE
DESCRIPCIÓN
P210
Mantener alejado de fuentes de calor, chispas, llama abierta o superficies
ATENCIÓN
calientes. No fumar
P233 Mantener el recipiente herméticamente cerrado
EQUIPO DE SEGURIDAD: Protección en la piel, en los ojos/cara y manos

PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS:

Estado físico líquido
Color incoloro
Olor como: - alcohol
Punto de fusión/punto de congelación -114 °C
Punto de ebullición o punto inicial de ebullición e
intervalo de ebullición
78 °C a 1.013 hPa

 Metodología (diagrama de flujo)

 Observaciones (basado en los puntos importantes que se mencionaron en la sesión,

complementar con sus propias opiniones, puede incluir dibujos o fotografías de ser
necesario)

 Residuos (incluir el residuo que se genera y el Contenedor en el que se dispone)

Residuo generado Contendedor Cantidad aproximada

Acetona C 15 ml
Metanol C 5 ml
Hexano C 20 ml
Hexano:Acetato C 25 ml

Discusión:

Conclusión:
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Para definir el concepto de cromatografía se define un método de separación entre 2 fases. Cuando una
muestra se introduce en la fase móvil, las sustancias que la componen interactúan de manera diferente con
la fase estacionaria, lo que resulta en velocidades de migración distintas. Como consecuencia, los
componentes de la mezcla se separan a medida que avanzan a través del sistema cromatográfico. Este
proceso proporciona una representación visual de los distintos componentes de la muestra, lo que facilita
su identificación y cuantificación. La cromatografía se utiliza en una variedad de campos, como la química
analítica, la bioquímica y la investigación farmacéutica, y juega un papel crucial en la purificación y el
análisis de compuestos. Es una herramienta versátil y poderosa que permite desentrañar la complejidad de
las mezclas y facilita la investigación en diversas disciplinas científicas.

Cuestionario:

1.- Dé la definición de cromatografía. Clasificación de la cromatografía. R=

La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes que se han de separar se
distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria, F.E.) mientras que la otra
(fase móvil, F.M.) se mueve en una dirección definida.

1.1 Cromatografía plana

Se realiza sobre papel u otro material sólido. Suele llamarse “en capa fina” o “en capa delgada” porque la
fase estacionaria recubre un soporte plano y rígido.

1.2 Cromatografía en columna

F.M. líquida, F.E. sólida: columnas de varios mm de diámetro y varios cm de longitud. F.M. gas, F.E. sólida:
columnas de unos 5 mm de diámetro y 1-20 m de longitud. F.M. gas, F.E. líquida: columnas “capilares”, con
menor diámetro y 30-100 m (incluso más) de longitud.
9
2.1 Cromatografía de gases

Con fase móvil gaseosa.

 Cromatografía gas-líquido
 Cromatografía gas-sólido

2.2 Cromatografía líquida

Con fase móvil líquida.

 Cromatografía líquido-líquido
 Cromatografía líquido-sólido

3.1 Cromatografía de adsorción

(atención: es adsorción, no absorción)

Diferente afinidad de adsorción de los componentes de la muestra sobre la superficie de un sólido activo.
La adsorción es la capacidad de las superficies para fijar moléculas. La F.E. es siempre sólida. Ejemplos:
alúmina, gel de sílice, carbón activo, fosfato cálcico, hidroxiapatito...

10
3.2 Cromatografía de reparto

Diferente solubilidad de los componentes de la muestra en la fase estacionaria (caso de la cromatografía

de gases), o diferentes solubilidades de los componentes en las fases móvil y estacionaria (caso de la
cromatografía líquida). Ejemplos: en cromatografía plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la
celulosa (papel) o al soporte sólido que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de
diatomeas, gel de sílice, celulosa en polvo...

3.3 Cromatografía de intercambio iónico

Diferente afinidad de los componentes de la muestra para el intercambio de iones. ¿Qué significa
intercambio de iones? La F.E. posee carga eléctrica y por ello interacciona con los componentes de la
muestra que tienen carga opuesta.

 Intercambio aniónico: F.E. con carga positiva, une aniones, bien los del disolvente (F.M.) o bien los
de la muestra (de ahí la palabra intercambio).
 Intercambio catiónico: F.E. con carga negativa, une cationes, bien los del disolvente (F.M.) o bien
los de la muestra.

Ejemplos de grupos funcionales intercambiadores (unidos covalentemente a la F.E. sólida):

3.4 Cromatografía de exclusión

También se llama de exclusión molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamaño, forma o carga
entre las moléculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo más habitual es aprovechar las
diferencias de forma y tamaño. En este caso, se la llama también cromatografía de exclusión por tamaño,
de filtración en gel, de permeación en gel o de tamiz molecular. Las moléculas más pequeñas pueden
penetrar en los poros de las partículas que forman el gel (fase estacionaria, relleno de la columna), por lo
que tienen mayor recorrido y se retarda su avance por la columna. Las moléculas de tamaño superior al de
los poros sólo circulan por el exterior de las partículas (se dice que son excluidas), por lo que avanzan más
rápido y eluyen antes.

3.5 Cromatografía de afinidad

Variedad particular de cromatografía en la que la separación se basa en la especificidad biológica singular

de interacción entre un componente de la muestra y otra molécula unida a la F.E.; los ejemplos más
comunes son las interacciones enzima-sustrato, antígeno-anticuerpo y ligando-receptor. F.E.: un soporte
inerte (microesferas de vidrio o plástico, gel de agarosa, ...) al que se une covalentemente el ligando de
afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de una enzima, anticuerpo, antígeno,

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hapteno, sustancia transportada, hormona, oligosacáridos, lectinas (proteínas con afinidad por
oligosacáridos) ... Pueden verse dos animaciones (A y B) de una cromatografía de afinidad.

2.- ¿Qué significa R.f. y para qué sirve conocerlo? R=

Rf es el factor de retardo o retraso, que mide la movilidad relativa de cada componente con respecto al
máximo posible, la distancia recorrida por el frente de fase móvil.

Componente 1: Rf = a / D

Componente 2: Rf = b / D

Componente 3: Rf = c / D

3.- La cromatografía en capa fina, sus características y aplicaciones. R=

En la cromatografía en capa fina (CCF) la fase estacionaria consiste en una capa delgada de un
adsorbente (como por ejemplo gel de sílice, alúmina o celulosa) depositada sobre un soporte plano como
una placa de vidrio, o una lámina de aluminio o de plástico. La CCF es una técnica analítica y tiene como
objetivo el análisis de una mezcla de componentes. El proceso es similar a la cromatografía de papel con la
ventaja de que se desarrolla más rápidamente, proporciona mejores separaciones y se puede elegir entre
diferentes adsorbentes. La CCF es una técnica estándar en el laboratorio de química orgánica. Debido a su
simplicidad y velocidad, la CCF se utiliza a menudo para monitorizar las reacciones químicas y también
para el análisis cualitativo de los productos de una reacción, puesto que permite conocer de manera rápida
y sencilla cuántos componentes hay en una mezcla.

Procedimiento

Una placa de CCF es una lámina de vidrio, metal o plástico recubierta con una capa delgada de un sólido
adsorbente (gel de sílice o alúmina). Se deposita una pequeña cantidad de la muestra problema en
disolución en un punto en la parte inferior de la placa. Entonces la placa se introduce en una cubeta
cromatográficas, de forma que sólo la parte inferior de la placa queda sumergida en el líquido. Este líquido
o eluyente es la fase móvil y asciende por la placa de CCF por capilaridad.

A medida que el eluyente pasa por el lugar donde está la mancha de la mezcla problema se establece un
equilibrio entre las moléculas de cada uno de los componentes en la mezcla que son adsorbidas y las que
se encuentran en disolución.

En principio, los componentes se diferenciarán en solubilidad y en la fuerza de su adsorción, de forma que

unos componentes se desplazarán más que otros. Cuando el eluyente llega a la parte superior de la placa,
esta se saca de la cubeta, se seca, y los componentes separados de la mezcla se visualizan.

Cuando son visibles, se puede determinar para cada una de las manchas el valor de Rf (factor de
retención), o la distancia que cada compuesto se desplaza en la placa. Cada compuesto tiene un Rf
característico que depende del disolvente empleado y del tipo de placa de CCF utilizada, pero es
independiente del recorrido del disolvente. De esta manera se puede ayudar a identificar un compuesto en
una mezcla al comparar su Rf con el de un compuesto conocido (preferiblemente cuando se hacen eluir en
la misma placa de CCF).

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4.- Eluentes, soportes y reveladores más comunes para cromatografía en capa fina. R=

5.- Factores que influyen en una separación por cromatografía en capa fina. R=

La temperatura, pureza de los disolventes, polaridad del eluyente, cantidad de la muestra y las condiciones
físicas en donde se lleva a cabo la cromatografía (si existen o no corrientes de aire), son unos de los
factores que influyen para obtener unos mejores resultados.

Bibliografía:

 Karenvanegas. (2013, 18 septiembre). Cromatografía en placa fina. quimicahidrocarburos.

https://quimicahidrocarburos.wordpress.com/2013/09/18/cromatografia-en-placa-fina/#:~:text=La
%20temperatura%2C%20pureza%20de%20los,para%20obtener%20unos%20mejores
%20resultados.
 Herr�ez, A. (s. f.). Cromatografía. https://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm#:~:text=Definici
%C3%B3n%3A,mueve%20en%20una%20direcci%C3%B3n%20definida.
 Operaciones B Sicas en el laboratorio de QU Mica. Cromatograf A. Cromatograf A en capa fina y en
columna. (s. f.). https://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html

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