CROMATOGRAFIA Los compuestos que se encuentran disueltos en la fase

mvil, poco a poco saldrn de la columna

Mtodo en el que los componentes a separar se cromatogrfica, y se recogen en fracciones.
distribuyen entre dos fases, una de las cuales
constituyen un lecho estacionario de amplio desarrollo Las fracciones menos polares, que son por lo general las
superficial y la otra es un fluido que pasa a travs o a lo que se retienen poco o nada en el absorbente, sern las
largo del estacionario. primeras en salir de la columna. En Cambio, las
sustancias ms polares, quedan retenidas por ms
La cromatografa consiste en una serie de mtodos que tiempo en el absorbente, y a menudo es necesario el uso
sirven para la separacin de una mezcla de solutos. Se de diferentes disolventes con la finalidad de
basa en la diferente velocidad con que se mueve cada incrementar su polaridad para que sean arrastradas por
uno de los solutos a travs de un medio poroso, estos.
arrastrando un disolvente en movimiento.
El tiempo que se necesita para hacer fluir un compuesto
por la columna, se conoce con el nombre de tiempo de
Fundamentos: retencin. Este tiempo vara, siendo caracterstico de
cada compuesto en condiciones cromatogrficas
El fundamento de la cromatografa consiste en el determinadas, que varan segn el absorbente usado, el
reparto o distribucin diferencial entre dos o ms disolvente, la presin, el dimetro que tenga la columna
compuestos (llamados solutos) entre dos fases, una de utilizada, etc.
las cuales permaneces fija, por lo que se le denomina
fase fija o estacionaria y otra que fluye a travs de ella, El absorbente mayormente utilizado para las
por lo que se denomina fase mvil o eluyente. Como la cromatografas en columna, es el gel de slice. A veces,
fase estacionara debe permanecer fija, su estado fsico en sustitucin del gel de slice, cuando ste es
se limita a slidos y lquidos, en tanto que la fase mvil incompatible con la mezcla a cromatografiar, se utilizan
requiere ser un lquido o un gas para poder fluir. la almina o el florisil (silicato magnsico). La
Tomando en consideracin el estado fsico de las fases. cromatografa en columna puede realizarse por
gravedad o a media presin. Cuando se realiza a media
Es esta prctica utilizaremos el mtodo de presin, se conecta la cabeza de la columna a un
cromatografa en columna y el de placa fina. compresor o a una lnea de aire comprimido.

CROMATOGRAFA POR COLUMNA La medida de las partculas de gel de slice para realizar
las cromatografas a media presin debe ser ms
La cromatografa en columna es quizs el mtodo ms pequeas que en el caso de la cromatografa por
general, utilizado para la separacin, a la vez que para la gravedad. Si en la cromatografa por gravedad
purificacin, de diferentes compuestos orgnicos que se utilizsemos un gel de slice con un tamao de partculas
encuentren en estado slido o lquido. En este tipo de ms pequeas, no se producira elucin, pues se
cromatografa, la fase estacionaria utilizada, es decir, impedira el flujo del disolvente. Pero en cambio, si
el absorbente, se coloca en el interior de una columna aplicamos presin, entonces debido a la fuerza si se
de vidrio, la cual finaliza con una llave (bureta) para producira la elucin por el disolvente.
controlar el paso de sustancias al exterior de la columna.
La fase estacionaria se impregna con el eluyente o fase A causa de la disminucin del tamao de las partculas
mvil. Seguidamente la mezcla orgnica que nos del absorbente, se produce una separacin ms eficaz.
interesa separar la depositamos por la parte superior de Generalmente la cromatografa a media presin,
la fase estacionaria, y as la fase mvil podr ir produce mejores resultados que la cromatografa por
atravesando el sistema. gravedad, y adems, al ser ms rpida, es la ms
utilizada.
 CROMATOGRAFA DE PLACA FINA
Cuando vamos a realizar una cromatografa en columna,
En la cromatografa en capa fina, la fase estacionaria o
lo primero que debemos hacer es elegir un disolvente tambin llamada, absorbente, se encuentra colocada
adaptado para nuestro caso, para as optimizar la uniformemente, formando una finsima capa de un
separacin de los componentes de la mezcla. Dicha espesor en torno a 0.1 mm, sobre un soporte o placa
operacin se produce a travs de cromatografa de vidrio o metal (incluso papel, que es la que
analtica en capa fina. La variante ms influyente en la utilizamos en esta practica). La mezcla que deseamos
analizar se colocar a una corta distancia del borde
eficacia de la separacin de la cromatografa a media
inferior de la mencionada placa(5 mm), la cual
presin usando gel de slice es dimetro de la introduciremos en una cubeta o recipiente que
columna, as como la cantidad de gel utilizado. contendr la fase mvil, o tambin llamado, eluyente.

A veces se utilizan mezclas de disolventes y se hace una La fase mvil ir ascendiendo poco a poco sobre la
elucin en gradiente. Para esto, la cromatografa se placa de la fase estacionaria a travs de capilaridad,
inicia con una mezcla de disolventes de polaridad desplazando a los diferentes componentes de la mezcla
adecuada para poder separar el componente que posea a analizar, a distintas velocidades, lo que provocar la
mayor Rf, y as, una vez recogido, se aumentar poco a separacin de la mezcla. Cuando el frente del
disolvente se site prximo a la parte superior de la
poco la polaridad para poder ir separando los
placa, sacaremos la placa de la cubeta con la finalidad
componentes ms polares. Si cuando se empieza la de dejarla secar para poder ver las manchas de los
cromatografa se usa un disolvente excesivamente diferentes componentes. La relacin de las distancias
polar, los componentes de la mezcla eluirn recorridas por el compuesto y por el disolvente, desde
conjuntamente, lo que llevara a que la separacin no el punto de origen del cromatograma, se conoce
tenga lugar. Una de las mezclas de disolventes ms como Rf (rate factor), el cual posee un valor constante
utilizadas es hexano/acetato de etilo. En nuestra para cada compuesto en condiciones determinadas.
Estas condiciones pueden ser el tipo de absorbente
practica solo utilizamos el mtodo por gravedad y
utilizado, el tamao de la cubeta, la temperatura, el
utilizamos la mezcla de disolventes de hexano/acetato disolvente, etc.
de etilo y acetato de etilo metanol para separar los Es poco factible reproducir exactamente las
carotenos y clorofilas de nuestro concentrado de condiciones experimentales, as que se suele comparar
espinacas, esto se lleva a cabo por la diferencia de una muestra con otra, eluyendo ambas dentro de la
polaridad entre los carotenos y las clorofilas (Las misma placa. As, para poder calcular el Rf, se sigue la
siguiente frmula:
Clorofilas ms polares: Clorofila b, las siguientes las
Rf = Distancia recorrida por el compuesto / Distancia
Clorofilas apolares: Clorofila a; y por ltimo los
recorrida por el disolvente
carotenoides ms apolarares: Carotenos, por eso el
cambio de mezcla de solventes para aumentar la La distancia que recorre el compuesto se suele medir
polaridad del eluyente y pudiese separar correctamente desde el centro de la mancha, por lo cual se suelen
nuestras fases). El gel de slice, se utiliza para separar hacer unas marcas en la placa, si dichas manchas son
sustancias ms polares. El proceso de adsorcin se debe extremadamente grandes, el valor del Rf ser errneo.
As realizamos unas marcas en la placa donde
a interacciones intermoleculares de tipo dipolodipolo o
depositaremos con ayuda de una pipeta un mnimo de
enlaces de hidrgeno entre el soluto y el adsorbente. El muestra.
adsorbente debe ser inerte con las sustancias a analizar Cuanto ms polar sea el compuesto, ms retenido
y no actuar como catalizador en reacciones de estar en el absorbente, y por tanto ir ms lento y el
descomposicin. El adsorbente interacciona con las Rf ser tambin menor. Por otra parte, los compuestos
sustancias mediante interaccin dipolodipolo o poco polares, se consiguen desplazar a ms distancia
mediante enlace de hidrgeno si lo presentan. desde el origen.
 Discusin
La polaridad del disolvente influye en el valor del Rf,
por lo que deberemos tenerlo en cuenta. As, para un Se obtuvieron 10 tubos de ensayo en los que se capt
mismo tipo de compuesto, un aumento de la polaridad
la fase mvil (eluyente) junto con los componentes de
del disolvente har aumentar su desplazamiento en la
placa y por lo tanto tambin aumentar su Rf. nuestra muestra de concentrado de espinaca
(Carotenos, clorofila A y B) se utiliz una cromatografa
Para elegir un eluyente, se recomienda elegir un de placa en una bureta donde se empac la columna
disolvente en el que los componentes que formen la con slice-gel a la cual se le adicion por la parte
mezcla presenten un Rf de entorno a un 0.3 un 0.5. superior en una suspensin de 4g. de slice-gel en una
mezcla con hexano-acetato de etilo (1:1) . El primer
Para encontrar el eluyente ideal, es necesario probar
eluyente utilizado fue hexano-acetato de etilo debido a
con diferentes disolventes con distintas polaridades o
con mezclas de varios de ellos. En estos casos, su baja polaridad, se mantuvo un goteo uniforme en la
debemos cambiar a disolventes ms o menos polares. llave de salida en el disolvente durante todo el
En el caso de compuestos poco polares, los cuales se procedimiento. No se dej bajar el nivel del disolvente,
desplazan del origen con bastante facilidad, se utiliza mas all del adsorbente para evitar agrietamientos y
un disolvente apolar, generalmente el hexano. Cuando as obtener un fraccionamiento uniforme. Se realiza un
se trata de compuestos con una polaridad media, es
goteo de del extracto de espinaca con una pipeta
aconsejable usar mezclas de hexano/ acetato de etilo
en diferentes proporciones segn la polaridad. Los pasteur evitando que este escucrra las paredes para
productos ms polares de todos, los cuales quedan obtener un mejor resultado al verter el eluyente y
muy retenidos en el absorbente, necesitan un continuamos realizandolo hasta que los pigmentos
disolvente ms polar como pueden ser el metanol o penetren en la silica gel una vez que esto suceda se
distintas mezclas de cloruro de metileno/metanol en vierte la mezcla de hexano-acetato de etilo el cul
diferentes proporciones. debido a su baja polaridad comienza a realizar la
Una vez realizada la cromatografa, pasamos a su
separacin de los carotenos (color amarillo) as como
visualizacin. La gran parte de las placas
cromatogrficas contienen un producto indicador de clorofila A (verde claro) que son los componentes
fluorescente que permite la visualizacin de los apolares y debido a su baja polaridad el hexano-
compuestos que son activos a la luz ultravioleta, acetato de etilo separa de la fase fija, se grega despus
concretamente a 254 nm. El indicador absorbe la luz una mezcla de acetato etilo-metanol (mayo polaridad
UV, y emite luz visible, por lo general de color verde. La que hexano-acetato de etilo) que separ la clorofila B
presencia de un compuesto activo que se encuentra en
(verde fuerte) y carotenoides sobrantes (amarillo)
el UV evita que dicho indicador absorba luz en la parte
siendo estos compuestos de carcter polar, durante el
en la cual hemos colocado el producto, lo cual se
traduce en ver una mancha en la placa lo que nos proceso se recuperan las muestras de la fase movil en
indica la presencia de un determinado compuesto. los tubos de ensayo sin detener el flujo de la misma,
Cuando se trata de compuestos que no consiguen distribuyendo en partes iguales en los tubos el
absorber la luz UV, la visualizacin del cromatograma resultado del eluyente con los componentes de la
necesita usar un agente revelador. Dicho revelador muestra.
debe reaccionar con los productos que son absorbidos
dando compuestos de colores. Por lo cual, el revelador
a usar depende del tipo de compuesto que queramos
visualizar.
(Bureta con empaque de silica-gel con mezcla de
hexano-acetato de etilo)
(Bureta en rpoceso de separacin de fases con la
muestra de extracto de espinaca)
Finalmente en una cromatoplaca (cromatografa de satisfactorio de nuestros componentes del extracto de
placa fina) , se traz dos lineas a 0.5 cm en la parte acuerdo al eluyente utilizado (poco polar).
posterior, y sobre la lnea inferior se colocan tres
muestras equidistantes de las muestras obtenidas de
carotenos y clorofila recolectados de la fase movil de la
cromagografa de columna, as como una de la muestra
original de extracto de espinaca, Se coloc en una
cmara cromatogrfica con hexano-AcOEt (7:3) como
BIBLIOGRAFA:
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fase mvil y se sac con pinzas para dejarse secar. Una
enfoque en ciencias de la vida
vez seco, se calcul el Rf. Anderson Guarnizo Franco, Pedro Nel
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Compuestos separados a partir del extracto de
Armenia, Quindio, Colombia, 2009
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Acetato n)
/cromatografia-en-papel/
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1 9.7: 03 Amarill Caroten 0.88 cromatografia/capa-fina
6. http://quimica.laguia2000.com/general/cro
o os
matografia-en-capa-fina
7 6:4 Verde Clorofila 0.61 7.
claro b

3 5:5 Verde Clorofila 0.5

oscuro a

CONCLUSIONES
Los resultados fueron lo esperados debido al correcto
uso de eluyentes en cada momento de cada
cromatografa, se utiliz un eluyente muy poco polar
para la separacin de carotenos (apolares) y de clorofila
A (apolar) pero se utiliz un eluyente ms polar para
extraer la clorofila B (polar) as como los carotenoides
sobrantes (polares) en cromatografa de columna y en
cromatografa se debe tener cuidado de no juntar las
muestras mucho y dejarlas secar el momento de
ponerlas sobre la placa ya que se pueden juntar, sin
embargo obtuvimos un desplazamiento