CONTROL ANTIMICROBIANO EN LA PRODUCCIÓN DE ALCOHOL

CARBURANTE EN INCAUCA S.A.S

AUDITH YULIANA SALAZAR VEGA

PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

UNIVERSIDA DE PAMPLONA
 CONTROL ANTIMICROBIANO EN LA PRODUCCIÓN DE ALCOHOL

CARBURANTE EN INCAUCA S.A.S

AUDITH YULIANA SALAZAR VEGA

Trabajo de monografía presentado como requisito para optar por el título de

MICROBIOLOGO

Director: JOSÉ FELIX ORTIZ LEMUS

PhD

PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS

UNIVERSIDA DE PAMPLONA

2
 El presente trabajo lo dedico principalmente al creador de la vida, a mi Dios, quien en su

soberanía sabe muy bien los planes que tiene para mí, planes de bienestar y no de calamidad,

a fin de darme un futuro y una esperanza (Jeremías 29:11), él mi mayor inspiración,

permitiéndome alcanzar uno de mis sueños más anhelados.

A mis padres, por su entrega, amor y apoyo a lo largo de mi vida, quienes han sido

escalón fundamental para poder lograr este propósito, son los mejores padres.

3
 Agradecimientos

Agradezco primeramente a Dios por guiarme y darme la paciencia en cada etapa y paso de mi

vida, a mis amados padres Hosman Salazar y Judis Vega por brindarme su apoyo total para

poder culminar una de mis metas y forjarme a nunca rendirme, por siempre recordarme lo

perseverante que debo ser y siempre apoyarme en mis decisiones.

A mi tío Javier Vega, ingeniero en sistemas, por su apoyo tecnológico.

A mis hermanas Danna Salazar y Steffy Salazar por brindarme su amor y apoyo.

A mi director José Félix Ortiz Lemus por guiarme en este proceso, por su acogida y apoyo para

que este trabajo fuera posible.

A la Universidad de Pamplona, por los conocimientos adquiridos durante mi proceso de

aprendizaje.

4
 TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÒN ................................................................................................................... 9

2. OBJETIVOS .......................................................................................................................... 11

2.1 Objetivo general .................................................................................................................. 11

2.2 Objetivos Específicos .......................................................................................................... 11

3. JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................. 12

4. MARCO TEORICO .............................................................................................................. 14

4.1 Antecedentes ....................................................................................................................... 14

4.2 Bases teóricas y conceptuales ............................................................................................. 16

4.2.1 Miel de azúcar de caña ................................................................................................. 16

4.2.3 Fermentación alcohólica ............................................................................................... 16

4.2.2 Fuentes de contaminación presentes en fermentación .................................................. 19

4.2.4 Bacterias acido lácticas como contaminantes ............................................................... 19

4.2.5 Antibióticos .................................................................................................................. 21

5. METODOLOGIA EXPERIMENTAL .................................................................................. 23

5.1 Medición de ácido láctico ................................................................................................... 23

5.2 Recuento de levadura y viabilidad celular .......................................................................... 24

5.3 Determinación de contaminantes ........................................................................................ 25

5.4 Ensayo de antibióticos......................................................................................................... 26

5.4.1 Preparación de antibióticos ........................................................................................... 26

5.4.2 Preparación del inoculo y muestras. ............................................................................. 26

5.4.3 Medición del ácido láctico ............................................................................................ 27

5.4.4 Análisis de datos. .......................................................................................................... 27

6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ................................................................................ 28

7. RESULTADOS Y DISCUSION ........................................................................................... 29

5
 7.1 Medición de ácido láctico ................................................................................................... 29

7.2 Recuento de levadura y viabilidad celular .......................................................................... 30

7.3 Determinación de contaminantes ........................................................................................ 32

7. 4 Ensayo de antibióticos........................................................................................................ 36

8. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 41

9. RECOMENDACIONES O SUGERENCIAS ....................................................................... 42

10. GLOSARIO ....................................................................................................................... 43

11. REFERENCIAS ................................................................................................................. 44

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 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Perfil microbiano de una fermentación típica de destilería. ........................................ 17

Figura 2.Esquema proceso de fermentación de alcohol desarrollado en Incauca SAS. .............. 18
Figura 3. Evolución y crecimiento de la población de LAB durante la fermentación. ................ 20
Figura 4. Equipo Rqflex20. .......................................................................................................... 23
Figura 5.Producción de ácido láctico en fermentación tratada con antimicrobiano .................... 36
Figura 6. Antibióticos utilizados en los ensayos .......................................................................... 50
Figura 7.Preparación de los medios de cultivo. ........................................................................... 50
Figura 8. Equipo RQflex20 corriendo muestras diluidas antes preparadas. ................................ 51
Figura 9. Tiras reactivas luego de ser leídas en el equipo RQflex20. ......................................... 51

7
 LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Siembras de cada una de las muestras. ........................................................................... 25

Tabla 2. Concentraciones utilizadas por cada antibiótico. ............................................................ 27
Tabla 3. Cronograma de actividades realizadas semanalmente. ................................................... 28
Tabla 4. Datos de ácido láctico de los cinco fermentadores. ........................................................ 29
Tabla 5. Datos del conteo de levaduras. ....................................................................................... 31
Tabla 6. Resultados microbiológicos de contaminantes microbianos presentes en fermentadores y
aguas de proceso. .......................................................................................................................... 33
Tabla 7. Datos de análisis de varianza con α 0,05. ....................................................................... 39

8
 1. INTRODUCCIÒN

El alcohol carburante es utilizado como biocombustible, se considera necesario y benéfico

para el medio ambiente, pues mejora la combustión en los motores de explosión interna y

reduce las emisiones nocivas de gases contaminantes, ya que se produce a partir de biomasa

mediante tecnologías limpias. La principal materia prima para la producción de alcohol es la

caña de azúcar, ya sea en forma de jugo de caña o como melazas subproducto de la industria

azucarera. Para la producción de dicho alcohol se realiza un proceso de fermentación

convirtiendo los azúcares presentes en la materia prima, en etanol y gas carbónico, por medio

de la acción de levaduras; se desarrolla por medio de un proceso continuo de cinco reactores

que trabajan en serie, donde se llevan a cabo las reacciones químicas de transformación de

azúcar en etanol y gas carbónico(Incauca SAS, n.d.). La vía de obtención de alcohol a partir

de la biomasa continuará por mucho tiempo por ser en nuestro medio la alternativa más

viable, dada nuestra ubicación que permite aprovechar la energía solar durante todo el año.

Hasta el momento se ha considerado que la materia prima más apropiada para Colombia es la

caña de azúcar, ya que se dispone de una tecnología adecuada para obtener alcohol tanto para

licores como para uso industrial.

El proceso de producción de etanol es propenso a diferentes fuentes de contaminación,

comenzando con la materia prima empleada de la cual provienen diferentes bacterias, esta

debe mantenerse controlada. Las sustancias antimicrobianas como los antibióticos han sido

estudiados tras su descubrimiento a lo largo del tiempo por los infinitos usos que presentan,

por ende, han tenido una aceptación en las industrias de destilería, ya que se ha demostrado

que estas pueden controlar la contaminación por bacterias acido lácticas en el proceso

9
fermentativo en la producción de etanol, lo que conlleva a un mayor rendimiento y evita las

grandes pérdidas económicas que podría acarrear si se perjudica el proceso de fermentación.

Este trabajo tiene como objetivo aplicar metodologías implementadas para llevar el control

de procesos fermentativos para la obtención de alcohol, analizando la viabilidad de la

levadura, cantidad de contaminantes presentes y la efectividad de la actividad antimicrobiana

de cuatro antibióticos (Monensina, Penicilina, Neomicina y Estreptomicina), para esto se

aplicó una metodología experimental donde se utilizó el equipo RQflex20 con tiras reactivas,

que mide la concentración de ácido láctico presente en la muestra, estudiando el

comportamiento de estas sustancias antimicrobianas tras su aplicación. Con ello se pudo

comparar cual tuvo mejor eficiencia y disminución de la contaminación presente en las

muestras, tomando en cuenta los antibióticos que podrían dar mejores rendimientos en el

proceso fermentativo, al final del estudio la monensina y penicilina mostraron óptimos

resultados en la disminución de carga contaminante presente en las muestras del fermento a

escala de laboratorio.

10
 2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general

➢ Analizar el efecto antimicrobiano de un grupo de antibióticos en el control de la

contaminación microbiana en el proceso fermentativo a partir de un estudio a nivel de

laboratorio.

2.2 Objetivos Específicos

➢ Determinar la concentración de ácido láctico en las muestras obtenidas a lo largo del

proceso fermentativo.

➢ Evaluar la viabilidad de las células de levadura durante las diferentes etapas de

fermentación.

➢ Determinar la concentración efectiva de los antibióticos como sustancias antimicrobianas

en el control de la contaminación en el proceso fermentativo del alcohol a escala de

laboratorio.

11
 3. JUSTIFICACIÓN

La fermentación es un proceso catabólico que no requiere de oxígeno, cuando se quiere obtener

metabolitos como el alcohol a partir de glucosa; este proceso se realiza bajo ciertas condiciones

controladas (pH, temperatura) en un sistema de fermentación continuo de cinco reactores

(fermentadores 1-5) que trabajan en serie, donde se llevan a cabo las reacciones químicas de

transformación de azúcar en etanol y gas carbónico, al fermentador 1 se le adiciona la miel, el

propagador de levadura, agua que ha pasado por esterilización U.V y nutrientes (ver. Figura2), el

uso de la levadura es de principal importancia por su potencial fermentativo, este es un

microorganismo unicelular que transforma azucares en alcohol, CO2 y energía, mediante una vía

glucolítica en un medio anaeróbico; sin embargo, este proceso no está exento de contaminantes

bacterianos provenientes de la materia prima (miel de caña) que ha sido adquirida, la cual puede

introducir microorganismos productores de ácido láctico, generando un tipo de antagonismo

causando el deterioro de la fermentación al generar transformaciones y posible inhibición de la

levadura; también se sabe que los elevados niveles de bacterias acido lácticas (BAL) reducen el

rendimiento de etanol, creando un descenso constante de las fuentes de carbono disponible, para

que la levadura realiza su actividad fermentativa y puede resultar en pérdidas de ingresos. El

ácido láctico es una sustancia fuertemente inhibitoria del proceso de consumo de glucosa en la

levadura, por lo tanto, afecta su reproducción y su desempeño en fermentación. Es por ello que el

uso de antibióticos como tratamiento para el control de contaminación es el más implementado

durante la etapa fermentativa.

El uso de un equipo Rqflex20, que tiene un sistema reflectoquant, permitirá llevar un control de

las bacterias acido lácticas presentes en la fermentación, mediante un análisis cuantitativo rápido

haciendo uso de tiras reactivas especiales que muestran resultados precisos, directamente en el

12
sitio. A pesar de las mejoras introducidas en los procesos de fermentación en los últimos años,

todavía no presentan un rendimiento satisfactorio con referencia al control de la contaminación.

Hoy en día, las características del procesamiento de la caña de azúcar en los molinos de

producción de alcohol dan lugar normalmente a la aparición de una microbiota bacteriana que

excede generalmente 104 células/ml en el mosto en fermentación (Arch Chemicals, Inc, 2015).

Además, el mismo mosto, que es un medio favorable para la proliferación bacteriana, tiene

variedades de bacterias contaminantes tales como Lactobacilli, su presencia tiende a provocar la

aglomeración de estos organismos en torno a las levaduras de fermentación, produciendo de este

modo la floculación y alterando la actividad productiva de las levaduras de fermentación. Es por

todo esto que el seguimiento que se realiza en el laboratorio de microbiología con este equipo

junto a otras metodologías es de suma importancia y necesario para la empresa para monitorear

los diferentes problemas que se presentan en la fermentación y buscar alternativas, que mitigue

la presencia de contaminantes productores de ácido láctico, evitando las posibles pérdidas que

este pueda generar.

13
 4. MARCO TEORICO

4.1 Antecedentes

La contaminación bacteriana que predomina durante la fermentación industrial de levaduras, son

las bacterias acido lácticas (BAL). Estas generan una disminución de la producción de etanol y

viabilidad celular de la levadura pues se crea una competencia por los factores de crecimiento en

el medio de fermentación, como azúcares y nutrientes disponibles, así mismo existe una

acumulación de subproductos como el ácido láctico y el ácido acético.

Uno de los sustratos que por su origen presenta problemas de contaminación por bacterias acido

lácticas son las melazas de caña, siendo considerado como el sustrato más utilizado a nivel

global para la producción de alcohol. El método principal por el cual los BAL inhiben la

producción de etanol por la levadura es mediante la producción de ácidos orgánicos como el

ácido láctico y, en menor grado, ácido acético. La producción de ácido láctico desvía el sustrato

fermentable de la producción de alcohol, ya que cada molécula de azúcar utilizada por BAL da

como resultado la pérdida de dos moléculas de etanol. El método secundario de inhibición es la

acumulación de ácido láctico y los efectos del pH bajo (<3,8) sobre la fisiología y el

metabolismo de la levadura, que se agrava aún más si hay ácido acético presente. (Seo et al.,

2020)

Las plantas a gran escala de producción de bioetanol suelen optar por el uso de agentes

antimicrobianos (antibióticos) para minimizar y/o prevenir la contaminación por bacterias acido

lácticas, pues este suele ser un método eficaz para destruir de manera selectiva los

contaminantes. Los antibióticos más comunes que se han empleado para el control de la

contaminación bacteriana son la penicilina, virginamicina, estreptomicina y tetraciclina. (Haris et

al., 2018)

14
En un estudio realizado por Day et al. Probaron la penicilina, la aureomicina, la cloromicetina, la

terramicina, la estreptomicina, la tirostricina, la bacitracina y la polimixina B

contra Lactobacillus sp. Y la flora bacteriana mixta obtenida de fermentaciones a escala

comercial. Observaron que todos los antibióticos administrados parecían inhibir los

contaminantes comúnmente asociados con la fermentación del alcohol de grano, pero variaban

en efectividad. Según la cantidad de antibiótico requerida, se encontró que la penicilina era la

más efectiva. Inhibió los contaminantes a una dosis más baja en comparación con otros

antibióticos. Al final de su estudio lograron concluir que la aureomicina, la bacitracina, la

cloromicetina y la terramicina tenían menos efectividad y la tirostricina y la estreptomicina eran

ineficaces, mientras que la polimixina B fue ineficaz a niveles de hasta 10 unidades / ml.

Para evaluar unos antibióticos y un antimicrobiano, en un trabajo realizado por Orozco et al.,

estudiaron el efecto de estos en el control de bacterias acido lácticas en tres ingenios productores

de alcohol en valle del cauca, Colombia; probaron los antibióticos virginamicina, estreptomicina,

penicilina, monensina, cocteles de los mismos y un antimicrobiano (lúpulo) en diferentes

concentraciones. Al concluir su estudio lograron exponer que la virginamicina en el ingenio A,

EPVM (coctel estreptomicina-penicilina-virginiamicina-monensina) en los ingenios B y C y el

antimicrobiano lúpulo en los tres ingenios fueron eficientes en el control de bacterias acido

lácticas.

Bayrock et al., 2003, realizó un estudio para la disminución de la contaminación microbiana

donde aplicaron penicilina G en dos tipos de régimen de adición, continua y de manera pulsada

en fermentación continua, para verificar si existía alguna diferencia en control de la carga

bacteriana al final del proceso, al final del estudio concluyeron que las levaduras viables

aumentaron en las dos metodologías utilizadas y que no existían diferencias al momento de la

15
recuperación del alcohol, por lo tanto el antibiótico realizo su efecto en ambas condiciones como

se esperaba, lo que demostró su efectividad.

4.2 Bases teóricas y conceptuales

4.2.1 Miel de azúcar de caña

La miel de caña es un subproducto de la producción de azúcar, es un líquido denso y viscoso de

coloración marrón oscuro, rico en azúcares y que contiene un pequeño porcentaje de agua. Tiene

diferentes nombres según la región, como miel agotada, miel pobre, miel final, miel residual o

simplemente melaza. Su densidad es de 1.4 a 1.5 g / ml y su productividad es de 40 kg / ton de

caña de azúcar. La producción de etanol es de 280 230 L / tonelada de melaza. Su composición

depende de la variedad, edad, estado de salud, maduración, sistema de siembra, fertilización y

tratamiento del cultivo de la caña de azúcar, así como de las condiciones climáticas, procesos de

fabricación de azúcar, si la caña de azúcar fue cosechada cruda o quemada, clima y condiciones

de almacenamiento, etc. (de Vasconcelos, 2015)

4.2.3 Fermentación alcohólica

La fermentación alcohólica es un proceso biotecnológico realizado por levaduras, algunos tipos

de bacterias o algunos otros microorganismos para convertir los azúcares en alcohol etílico y

dióxido de carbono. En este proceso de fermentación, la levadura se utiliza principalmente como

biocultivo y solución acuosa de azucares como monosacárido (materias primas) como medio de

cultivo para la producción. En el proceso de fermentación alcohólica, la levadura lleva a cabo el

proceso de fermentación aeróbica, pero también puede fermentar las materias primas en

condiciones anaeróbicas. En ausencia de oxígeno, la fermentación alcohólica se produce en el

citosol de la levadura. La fermentación alcohólica comienza con la descomposición de los

16
azúcares por las levaduras para formar moléculas de piruvato, lo que también se conoce como

glucólisis. La glucólisis de una molécula de glucosa produce dos moléculas de ácido pirúvico.

Las dos moléculas de ácido pirúvico se reducen a dos moléculas de etanol y CO2. (Malakar et al.,

2020)

Figura 1. Perfil microbiano de una fermentación típica de destilería. Fuente: (Russell & Stewart, 2021)

En la Figura 1 se detalla el comportamiento de un perfil microbiano comúnmente observado en

las fermentaciones donde el contaminante mayoritario (Bacterias acido lácticas), presentan una

población inicial baja (10³ – 10⁵ células / ml), que puede mantenerse bajo control mediante el

crecimiento prolongado de levaduras y la acumulación de etanol, hasta que llega un punto donde

la población de levaduras comienza a disminuir y cesa la producción de etanol. En este momento

se permite que la población de las BAL se desarrolle (Russell & Stewart, 2021).

Las principales materias primas que se utilizan en la destilería de Incauca SAS, son la miel B, la

meladura y el jugo clarificado, provenientes de la fábrica de azúcar. El proceso de fermentación

17
consiste en convertir los azúcares presentes en la materia prima que vienen de la fábrica, en

etanol y gas carbónico, por medio de la acción de levaduras. La fermentación se desarrolla por

medio de un proceso continuo de cinco reactores que trabajan en serie, donde se llevan a cabo las

reacciones químicas de transformación de azúcar en etanol y gas carbónico. Al salir del último

fermentador, se obtiene un producto conocido como mosto o vino fermentado que contiene una

concentración de 9% (v/v) de alcohol. Además, contiene agua, sólidos y levadura, que se

recupera en el tanque de sedimentación para ser usada nuevamente en el proceso. La levadura

recuperada, se envía al tanque de acidulación donde se hace un choque con ácido sulfúrico para

reducir la contaminación bacteriana presente y nuevamente se recircula a los fermentadores para

continuar con el proceso de producción. El mosto o vino fermentado se envía al proceso de

destilación para continuar la separación del etanol producido(Incauca SAS, n.d.).

Figura 2.Esquema proceso de fermentación de alcohol desarrollado en Incauca SAS. Fuente: autor

18
4.2.2 Fuentes de contaminación presentes en fermentación

Las fuentes de contaminación se clasifican como directas o indirectas. Las fuentes directas

potenciales pueden originarse a partir de materia prima añadida al fermentador y pueden incluir

maíz pretratado, miel de caña, inóculos, enzimas, licor de maceración de maíz y aerosoles, lo que

permite la proliferación según la duración de la fermentación. Las posibles fuentes indirectas de

contaminación son las líneas de transferencia sucias o el agua utilizada para los sellos de la

bomba y el agitador. Todos los recipientes y líneas de transferencia generalmente se esterilizan

con vapor antes de su uso, sin embargo, la esterilización puede ser inadecuada. Debido a que la

fermentación es un proceso anaeróbico, la mayoría de los contaminantes bacterianos son

bacterias anaeróbicas o anaeróbicas facultativas. Estas bacterias tienen el potencial de sobrevivir

en niveles de pH mucho más bajos (pH <5.0) que la mayoría de las otras bacterias, crecer bien en

condiciones de fermentación y competir con la levadura por azúcares fermentables y otros

nutrientes necesarios, lo que resulta en reducciones en el rendimiento de etanol. (Muthaiyan et

al., 2011). Otro contaminante presente son las levaduras silvestres, distintas de S. cerevisiae, que

no se agregan intencionalmente en el fermentador, también pueden causar problemas para el

proceso de fermentación.

4.2.4 Bacterias acido lácticas como contaminantes

Las BAL se clasifican según los productos de su metabolismo de carbohidratos. Dentro de BAL

homofermentadores obligados, se incluye Lactococcus, Pediococcus, Streptococcus y algunas

especies de Lactobacillus, utilizan la glucólisis para producir ácido láctico como único producto

final. BAL heterofermentadores obligados, como Leuconostoc y algunas especies de

Lactobacillus, metabolizan los carbohidratos utilizando la vía 6 fosfogluconato / fosfocetolasa

(6-PG / PK), produciendo ácido láctico, dióxido de carbono y etanol o ácido acético dependiendo

19
del contenido de oxígeno del mosto. También existen los heterofermentadores facultativos,

compuestos principalmente de varias especies de Lactobacillus, pueden utilizar tanto la

glucólisis como la vía 6-PG / PK dependiendo de las condiciones ambientales. Como los LAB

compiten con la levadura por los carbohidratos durante las fermentaciones, la concentración y,

en menor medida, el tipo de BAL presente durante la fermentación son importantes.

Figura 3. Evolución y crecimiento de la población de LAB durante la fermentación. Fuente: (Russell & Stewart,
2021)

Durante la etapa inicial de fermentación (0 a 30 a 40 h), el crecimiento bacteriano es inhibido por

el rápido crecimiento de la levadura y la acumulación de etanol. Cuando entra a la segunda fase

de fermentación (30-40 a 70 h), la población de levaduras entra en una fase estacionaria,

comenzado a declinar su crecimiento, momento en el que la producción de etanol se completa

entre el 80 y el 90%. A medida que muere la población de levaduras, proliferan lactobacilos, lo

que provoca la acumulación de ácido láctico y acético, acelerando el declive de la levadura y, en

última instancia, permite el dominio de los lactobacilos. Durante la etapa final (70 h en adelante),

20
las poblaciones bacterianas, compuestas principalmente de homofermentadores como L.

acidophilus, L. delbrueckii y L. paracasei, alcanzan su punto máximo y luego declinan. Debido a

la falta de azúcares fermentables en esta etapa, se cree que estas bacterias sobreviven con los

nutrientes liberados por las células de levadura que mueren y los oligosacáridos

residuales.(Russell & Stewart, 2021)

4.2.5 Antibióticos

Además de los factores ya conocidos para el control como la calidad de las materias primas,

higiene en la manipulación, pasterización del mosto, sanitización y buen mantenimiento, los

antibióticos se utilizan como medida complementaria durante la fermentación de etanol. El

término “antibiótico” fue acuñado por Selman Waksman en 1942 para describir cualquier

sustancia producida por un microorganismo que es antagónico al crecimiento de otros

microorganismos en alta dilución. En la industria productora de etanol combustible, el control de

la contaminación bacteriana se ha logrado mediante el uso de antibióticos como la penicilina G,

la estreptomicina, la tetraciclina, la virginiamicina, la monensina o composiciones de estos

antibióticos. (Muthaiyan et al., 2011)

4.2.5.1 Penicilina

Dentro de los antibióticos más utilizados en destilerías para controlar contaminación por BAL, se

encuentra la penicilina, metabolito producido por algunas bacterias Penicillium, especies como

P. notatumm y P. crysogenum, es de tipo de Beta-lactámico, su espectro de acción es contra las

bacterias gran positivas y su mecanismo consiste en la inhibición de la síntesis de la pared

celular, evitando la generación de nuevas células. (K.A. Jacques, 2003) La influencia favorable

21
de la penicilina como agente de control de la contaminación en las fermentaciones alcohólicas de

melaza y caña de azúcar se ha reportado desde la década de 1950.

4.2.5.2 Estreptomicina

Este antibiótico es de tipo aminoglucósido producido por especies de Streptomyces¸ su

mecanismo de acción consiste en la apertura de poros en la pared celular de bacterias Gram

negativas, así mismo en la inhibición de la síntesis de proteínas de las mismas(K.A. Jacques,

2003) causando muerte celular en un periodo corto. Debido a su bajo espectro, en destilerías

suelen utilizarlo en conjunto con otro antibiótico para generar un efecto sinérgico, siempre que

los valores de pH del medio sean inferiores a 7.0 (Daniel Amsterdam, 2014)

4.2.5.3 Monensina

La monensina fue el primer ionóforo poli éter carboxílico, introducido en los Estados Unidos

para el control de la coccidiosis en 1971. La monensina pertenece a la familia química del ácido

poliéter monocarboxílico y se produce por fermentación de una cepa de Streptomyces

cinnamonensis. La monensina se usa en la prevención de la coccidiosis en aves de corral. La

monensina sódica es activa principalmente contra bacterias Gram positivas.(Anadón & Martínez-

Larrañaga, 2014)

22
 5. METODOLOGIA EXPERIMENTAL

5.1 Medición de ácido láctico

Para el análisis de ácido láctico, se utilizó un equipo de cuantificación reflectometría de

detección rápida Rqflex20, al cual se realizó su respectiva calibración y recalibración, utilizando

tiras de ensayo Reflectoquant Test Ácido Láctico MERCK (ver anexos), sumergiéndolas durante

dos segundos, en una solución de cada muestra de los 5 fermentadores diluida 1/100, seguido se

retiró el exceso de líquido y se insertó en el reflectómetro Reflectoquant Rqflex plus20 MERK,

registrando el valor obtenido en mg/l.

La preparación de la dilución para la miel B se realizó pesando 10g en un beaker, se diluyo, se

pasó a un balón de 100ml y se aforó, se agito para mezclar bien para tomar a partir de esta

dilución 10ml con probeta, se aforó nuevamente en un balón de 100ml y a partir de esta se

realizó la medición.

Figura 4. Equipo Rqflex20. Fuente: Avantor 2021

La prueba de ácido láctico mide la suma de ácido D- y L-láctico en bebidas, por ejemplo, vino,

cerveza y jugo de frutas después de la dilución. El ácido láctico es oxidado por el dinucleótido de
23
nicotinamida y adenina (NAD) bajo el efecto catalítico del lactato deshidrogenasa a un piruvato.

En presencia de diaforasa, el NADH formado en el proceso reduce una sal de tetrazolio a un

formazán azul que se determina por reflectometría en el equipo RQflex20 donde el rango de

medición es de 3.0 mg/l – 60.0mg/l (Merck, 2020).

5.2 Recuento de levadura y viabilidad celular

Para el recuento de levadura se preparó las muestras realizando una agitación a los frascos, a

partir de estos se tomó 1ml y se adiciono a un balón aforado de 100 ml, se aforo con agua de

proceso (agua que ha sido tratada en la empresa), se le adiciono azul de metileno para teñir la

levadura muerta y papaína para separar la levadura. Esto se realizó con cada uno de los

fermentadores y el propagador. El procedimiento para las cremas de levadura, se realizó pesando

10g de muestra en un Beaker de 100ml, se le adiciono 90ml de agua de proceso, se mezcló bien

y se tomó 1ml de la muestra para adicionar al balón y se aforo con agua de proceso a 100 ml y se

adiciono los reactivos descritos anteriormente.

A partir de las muestras aforadas se realizó agitación, se tomó una muestra con pipeta Pasteur y

adiciono a la cámara de Neubauer, la idea es de dejar que el líquido se introduzca entre la cámara

y el cubre objetos por capilaridad. El líquido debe penetrar de manera uniforme en la

hemicámara y sin desbordar. Se realizo conteo de levaduras vivas, gemantes, muertas, elongada

vivas, elongadas muertas, salvajes vivas y salvajes muertas (las levaduras elongadas son

consideradas células que han pasado por un estrés durante el proceso de fermentación). La

cámara de recuento, Neubauer, es un dispositivo de precisión hecho de vidrio óptico especial

dividido en dos secciones, la sección para contar las células es la cuadricula central, que contiene

25 cuadros limitados por una triple línea, esto se observa al microscopio con un aumento de 40x;

24
se cuentan todas las células que están dentro de cada cuadrado y aquellas que están tocando los

lados superior y derecho de dicho cuadrado(Cervecero Itinerante, 2019). Los datos obtenidos se

reportan en la base de datos empleada por la empresa.

5.3 Determinación de contaminantes

Para la determinación de contaminantes se realizó de acuerdo a lo descrito en la tabla 1 para las

muestras, con cada dilución, medio, método e incubación correspondientes a cada contaminante;

sin embargo, para los lodos se realizó un procedimiento diferente el cual se centrifuga a 3500rpm

por 10 minutos en tubos Falcon de 50ml, el sobrenadante se descarta, se adiciona 9ml de agua

peptona estéril y se homogeniza por agitación en vórtex, para diluir el pellet; a partir de esta

dilución se realiza lo especificado en la tabla 1. Las siembras se incubaron en su respectiva

temperatura por 48 horas. Después del tiempo de incubación se realizó conteo de las colonias

típicas en cada medio, se registró como unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/ml),

multiplicando por su respectiva dilución dependiendo de la muestra; los datos fueron ingresados

a la base de datos de la empresa.

Tabla 1. Siembras de cada una de las muestras.

Muestras Medio Método Dilución T° Incubación

Propagador PC Profundidad 101 35°C
MRS
WL Superficie 100 30°C
Fermentadores PC Profundidad 101 35°C
MRS 101 y 102
WL Superficie 100 30°C
Vinaza entrando PC Profundidad 101 35°C
al fermentador MRS 101 y 102
WL Superficie 100 30°C
Lodos PC Profundidad 35°C
MRS
MacConkey 101

25
 YGC 30 °C
WL Superficie
Aguas antes y TTC Filtración por - 35°C
después de UV MRS membrana
MacConkey
WORT 30 °C
WL
Fuente: Autor.

5.4 Ensayo de antibióticos

A continuación, se especifica el procedimiento para en el ensayo de antibióticos que fue

ejecutado cuatro veces, por ende, en los resultados se verá reflejado cuatro datos control, por

tanto, se pueden observar diferencias entre ensayos.

5.4.1 Preparación de antibióticos

Se preparó cuatro soluciones de antibióticos (Monensina, Penicilina, Neomicina,

Estreptomicina). Estos fueron preparados como se expone a continuación con sus proporciones:

• Se tomó un gramo del antibiótico Monensina, posteriormente se agregó a un balón

aforado de 100 ml y se aforó con 100 ml de etanol.

• Para la preparación de Penicilina, Neomicina y Estreptomicina, se usó la proporción

50:50, para ello se tomó un gramo de cada antibiótico, y se aforó con una mezcla de 50

ml de agua destilada estéril y 50 ml de etanol.

5.4.2 Preparación del inoculo y muestras.

Para la preparación del inóculo de bacterias ácido lácticas provenientes de la materia prima y el

proceso hasta la entrada a los fermentadores, se tomó 100 ml de 5 fermentadores de la destilería,

que llevan varios días en fermentación, realizando una mezcla, esta se adiciono a 1800 ml de

26
caldo MRS (Man Rogosa Sharpe) para su crecimiento, llevándolo a incubación en agitación

constante en un Shaker durante 24 horas.

Posteriormente se preparó 13 frascos con 300 ml de caldo MRS, los cuales se le agrego 100 ml

del cultivo antes preparado, se ajustó el pH a 4,2, pues las bacterias lácticas crecen con medios

ligeramente ácidos y finalmente se adicionaron los antibióticos con tres concentraciones

diferentes como se indica en la tabla 1 (cálculos: ver anexos) los frascos se llevaron a incubación

en Shaker durante 18 horas.

Tabla 2. Concentraciones utilizadas por cada antibiótico.

Antibióticos Concentración (ppm)

Monensina 3, 6, 8
Penicilina 3, 6, 8
Neomicina 3, 6, 8
Estreptomicina 3, 6, 8
Fuente: Autor

5.4.3 Medición del ácido láctico

Para este análisis se realizó el procedimiento descrito en el apartado 5.1 para determinar la

concentración del ácido láctico presente en las 13 muestras tratadas con los antibióticos y

verificar si hubo disminución de este.

5.4.4 Análisis de datos.

Los datos fueron organizados en hojas de cálculos Microsoft Excel 2019, donde se hallaron las

medias a cada grupo, se realizó gráficos estadísticos para su respectivo análisis y se aplicó la

prueba de análisis de varianza a las medias para verificar si los datos eran estadísticamente

significativos o no, a un nivel de significancia α 0,05.

27
 6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

A continuación, se evidencia el cronograma representado en diagrama de Gantt para cada una de

las actividades realizadas semanalmente, así mismo una actividad extra de un ensayo de

antibióticos realizado durante 4 semanas.

Tabla 3. Cronograma de actividades realizadas semanalmente.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Actividad Lunes Martes Miércoles Jueves Viernes
Medición
ácido láctico
Conteo de
levaduras
Perfil de
contaminación
Siembras de
medios
Propagación
de cepa para
la
fermentación
Limpieza de
laboratorio
Ensayo de
antibióticos
Fuente: autor

28
 7. RESULTADOS Y DISCUSION

Los resultados presentados a continuación son datos hipotéticos, debido a que la empresa exige

confidencialidad en el trabajo realizado.

7.1 Medición de ácido láctico

En la tabla 4 se registraron los datos obtenidos de 5 fermentadores, donde los valores no

excedieron al valor control que ha sido establecido por la empresa, lo que indica que el proceso

se desarrolló con normalidad, con la miel B que es un sustrato con altas cantidades de glucosa y

muy susceptible a contaminación ocurrió lo mismo, dada por los equipos o la materia prima de

donde es extraída.

Tabla 4. Datos de ácido láctico de los cinco fermentadores.

F1 F5 F2 F3 F4 Miel B
Lunes 810 1840 2130 2650 2800 1950
Martes 1010 1900 2200 2800 3090 2100
Miércoles 1920 1960 2280 2880 3120 2090
Jueves 2230 2300 2300 2890 3150 2200
Viernes 2630 2800 2950 3100 3300 2470
Valor 300 ppm-4000 ppm 2000-3000 ppm
control
* F1, F2, F3, F4 y F5 son los fermentadores. Los valores control son establecidos
por la empresa. Fuente: autor.

Se observo un aumento de ácido láctico en cada fermentador en el trascurso de los días, este

aumento no fue significativo indicando que la fermentación se mantuvo dentro de los valores

normales de 300-4000 ppm, en caso contrario, fuera sido necesario aplicar medidas de ajuste que

implicarían la adición de antibióticos, limpieza y desinfección en el proceso de fermentación o

en última instancia, la suspensión de la fermentación y/o liquidación del fermentador, puesto que

en estos casos, se ha informado que concentraciones de ácido láctico entre el 1 y el 4% inhiben el

29
crecimiento de la levadura, afectando directamente la producción de alcohol, está acidez es

desarrollada por diferentes Bacterias Acido lácticas homofermentativas y heterofermentativas

(Hynes et al., 1997).

La muestra analizada de miel B no evidencio un aumento significativo y estuvo dentro del rango

establecido, pues este dato es de importancia, siendo un valor referencia, ya que esta miel será

introducida a la fermentación, con una previa dilución y un tratamiento con temperatura, para

disminuir la carga microbiológica y la concentración de azúcar reductor total. En caso de que las

muestras presenten un valor por encima del valor de referencia determinado en la empresa,

indicaría una posible contaminación por bacterias productoras de ácido láctico, que tienen la

capacidad de desarrollar una fermentación láctica a partir de la glucosa que se ingresa en la

fermentación alcohólica, lo cual, implicaría un descenso en la cantidad de etanol, en una

proporción de dos moléculas de etanol por cada molécula de ácido láctico producido, inhibiendo

el crecimiento de la levadura, disminuyendo la productividad y ocasionando pérdidas

económicas (Malakar et al., 2020).

7.2 Recuento de levadura y viabilidad celular

La evaluación de viabilidad se realizó bajo conteo directo en cámara de recuento de Neubauer

empleando azul de metileno que permite la tinción de las células de levaduras muertas,

diferenciándolas de las vivas. Una célula viva es capaz de metabolizar el azul de metileno,

volviéndolo incoloro(Cervecero Itinerante, 2019). En la tabla 5, se muestra el conteo de

levaduras obtenido en la cámara de Neubauer, a partir de las muestras de mosto, evidenciándose

la viabilidad de la levadura en la fermentación, de esta forma, en el propagador de levadura, se

observó una viabilidad de 97,6 % en un ciclo de 24 horas, estando entre los límites establecidos

30
por la empresa, lo cual demostró que existe un aumento proporcional al tiempo generacional de

la levadura, trayendo como resultado un buen arranque del propagador (tanque donde se propaga

la levadura que será ingresada a fermentación), lo que facilitó la propagación de la levadura, con

el fin de masificar el cultivo de tal forma que sirva como inóculo a la fermentación(Julia sierra et

al., n.d.).

Tabla 5. Datos del conteo de levaduras.

Células propagador F1 F5 F2 F3 F4 Crema 1 Crema 2

Vivas 210 195 186 175 168 157 580 1020
Gemantes 50 45 43 41 35 30 270 70
Muertas 5 130 144 150 120 150 1670 420
Elongada 0 3 1 2 0 0 0 0
Viva
Elongada 0 2 1 1 0 0 0 0
Muerta
Salvaje viva 0 0 0 0 0 0 0 0
Salvaje 0 0 0 0 0 0 0 0
muerta
Viabilidad 97,6 60 56,3 53,8 58,3 51 25 70,8
(%)
Valores 90-100 30-90 >9 > 50
limites
*Los valores limites son establecidos por la empresa. Fuente: autor.

El recuento de la levadura en las cremas de fermentación evidenció que en la crema 1 la cantidad

de células muertas es alta, al contrario de lo observado en la crema 2, esto se debe a qué en el

proceso final de la fermentación es sometido a un proceso de sedimentación y tratamiento con

ácido sulfúrico, acidificando el medio, lo que facilitó la eliminación de las bacterias

contaminantes, pero de igual forma indujo la muerte de la levadura sustrato (Iván Leal

Granadillo et al., 2014), observándose una viabilidad de aproximadamente el 25% y 70,8 % en

crema 1 y 2, respectivamente.

31
Este procedimiento nos ayuda a tener un estimado de la cantidad de levaduras disponibles

durante la fermentación, lo que nos permitió visualizar si hay una población baja, en tal caso se

requirió aumentar la propagación celular, aplicando acciones correctivas, e igualmente, demostró

como la viabilidad disminuye a lo largo del proceso continuo desde F1 a F4, esto se debe a que la

levadura va agotando su fuente de carbono, en el proceso de reducción que genera alcohol y CO2

(Malakar et al., 2020).

7.3 Determinación de contaminantes

La información presentada a continuación son el resultado de una toma de muestra, ya que no se

permitió la presentación de los resultados de toda la práctica, por motivo de confidencialidad

empresarial.

El recuento dado de los microorganismos contaminantes en la (tabla 6), se observan valores altos

en la microbiota mesofílica siendo estos >1600 UFC/ml, demostrándose su capacidad de

resistencia a los procesos de esterilización que se llevan a cabo en la empresa, entre estos: la

esterilización por U.V para el tratamiento del agua que entra a la fermentación, la esterilización

por temperatura y presión para las mezclas al momento de diluir la materia prima Miel B

proveniente de la caña de azúcar; este tipo de microorganismos consumen el azúcar utilizado por

la levadura en la fermentación ácido láctica, produciendo exopolisacaridos que permiten la

adherencia microbiana a los fermentadores, su presencia no es perjudicial a menos que promueva

el crecimiento(Serrano Galvis, 2006), estos microorganismos son indicadores de la calidad

sanitaria, que muestra las condiciones higiénicas de la materia prima, como también las aguas

que son utilizadas, por ello estas pruebas se realizan para identificar factores de riesgo y

restringir microbiota que puedan llegar a estropear la fermentación.

32
El recuento de mesófilos obtenido en el propagador dependió del tiempo de permanencia en el

fermentador, de esta forma, a mayor tiempo, mayor será el recuento de microorganismos, el

recuento de la Crema 1 siempre será <1 UFC/ml, ya que, al ser tratado con ácido sulfúrico,

eliminara las bacterias procedentes de los tanques de fermentaciones, lo que nos da una idea, que

la principal entrada de microorganismos mesófilos posiblemente provino de la materia prima, el

propagador y agua después de UV.

Tabla 6. Resultados microbiológicos de contaminantes microbianos presentes en fermentadores y aguas de proceso.

Muestra Mesófilos Bacterias Bacterias Termófilas Entero Mohos Levaduras

(UFC/ml) Ácido Acido (UFC/ml) Bacterias (UFC/ml) (UFC/ml)
lácticas acéticas (UFC/ml)
(UFC/ml) (UFC/ml)
Propagador 3000 4000 100 - - - -
Fermentador >1600 >1600 10 - - - -
1
Fermentador >1600 >1600 10 - - - -
5
Vinaza >1600 >1600 <1 - - - -
entrando
Crema 1 <1 <1 <1 - - - -
Lodos 1 3000 <10 <10 2000 <10 <10 <10
Lodos 2 300 <10 <10 1000 <10 <10 <10
Aguas Antes 1600 100 0 - 0 10 400
UV
Aguas 400 0 0 - 0 0 0
después UV
*Los datos aquí registrados, no tienen valores de referencia, porque no fueron suministrados por la
empresa. Fuente: Autor.

Se puede observar que los recuentos de las bacterias acido lácticas fueron altos en el propagador

y los fermentadores, lo que genera un problema a la empresa pues estas reducen la eficiencia del

proceso, porque tienen necesidades nutricionales parecidas a las de la levadura, produciendo una

competencia por el carbono disponible y factores de crecimiento, generando la floculación de la

levadura y disminuyendo el consumo de carbohidratos, lo cual puede reducir la productividad del

etanol entre el 2 al 7% v/ v (SOSSA, 2009). El recuento obtenido en lodos 1 no evidenció la

33
presencia de BAL, debido a que la mezcla de donde se extrajo la muestra de lodo es sometida a

un tratamiento de temperatura con vapor a 90°C; al igual en la muestra analizada a partir de

lodos 2 donde no se evidencio crecimiento de BAL, posiblemente al tratamiento de temperatura

de 121°C por 7 minutos a que es sometida, eliminando la contaminación presente; sin embargo,

la mezcla es una dilución de la materia prima, haciéndola más susceptible a la proliferación de

BAL debido a su bajo contenido en ATR (Azúcar Total Recuperable) (Rovira Carballido & A.

Rovira Viyella, n.d.). Las muestras analizadas de vinaza presentaron recuentos altos de BAL pues

esta se obtiene en el tanque final como residuo de la fermentación que posteriormente es tratada

con calor logrando una disminución en su concentración.

El recuento de las Bacterias Ácido Acéticas (BAA) evidenció altos valores en el propagador,

siendo significativo, ya que no debería existir crecimiento de estos contaminantes, puesto que

este tipo de bacterias, producen ácido acético a partir de la oxidación del etanol y afectan

notablemente las características organolépticas del etanol (Axelsson, 2004).

La presencia de bacterias termófilas en las muestras de lodos procedentes de mezclas

introducidas a los fermentadores, fue alto, a pesar que pasan por un proceso similar a la

esterilización, estos microorganismos puede llegar a generar problemas en la fermentación al

que hidrolizar la sacarosa, formando dextranos que aumentan la viscosidad y generando biofilms

que generan incrustaciones en los equipos y tuberías, ocasionando problemas de transferencia de

calor e incrementando los costos de operación por la limpieza; también hacen que los cristales de

azúcar se elonguen, aumentando los niveles de azucares reductores ocasionándole estrés a la

levadura por el aumento de solutos(Hugo Martín Rodríguez Magaña, 2018). Las Bacterias

termófilas pueden soportar las altas temperaturas poseen mecanismos que les permiten resistir

condiciones extremas de temperatura como las estructuras de protección muy resistentes a los

34
tratamientos térmicos del proceso, su membrana es rica en ácidos grasos saturados, que forman

entre si enlaces hidrófobos muy estables al calor (Claudia Suárez Núñez et al., 2004).

El recuento de mohos y levaduras en agua antes de UV no fue significativo, ya que en la muestra

de agua después del tratamiento de UV no evidencio crecimiento, indicando que proceso de

esterilización se está llevando con normalidad. La muestra de lodos procedentes de las mezclas

no presentó crecimiento, estos resultados son positivos ya que su presencia puede influir en las

características finales del alcohol, algunas especies de hongos, pueden metabolizar los azúcares y

ácidos orgánicos, resultando subproductos como el ácido acético, acetato de etilo y acetaldehído

que a elevadas concentraciones causan efectos en las características del alcohol. Algunas

especies al realizar su metabolismo hacen que disminuya el nitrógeno asimilable, vitaminas y

otros micronutrientes esenciales para la levadura al producir alcohol(Franco et al., 2019).

Por último, no hubo presencia de bacterias entéricas en el agua antes y después de ser sometida

al tratamiento con UV, lo que indicó que el agua utilizada para la fermentación estaba libre de

estos contaminantes y no generaran problemas en el producto final, su presencia podría radicar

en serios problemas relacionados con la capacidad de fermentar la glucosa por vía glucolítica

generando ácidos como producto final (María C. Apella & Paula Z. Araujo, n.d.), disminuyendo el

pH de la fermentación, causando que la levadura no realice correctamente su metabolismo para

la producción de alcohol; algunas especies pueden llegar a colonizar superficies de tuberías de

agua formando biopelículas que les permiten sobrevivir por tiempos prolongados generando

problemas en el proceso(Ríos-Tobón et al., 2017). La muestra analizada de lodos no evidenció

presencia de estos microorganismos, ya que al ser sometida a un tratamiento con temperatura

(Figura 2), elimina la posibilidad de supervivencia (Horacio A. Lopardo et al., n.d.).

35
7. 4 Ensayo de antibióticos

Los resultados de la efectividad antimicrobiana de los antibióticos ensayados partieron de

determinar el porcentaje de acidez medido como ácido láctico, puesto que este es el producto de

la actividad del principal grupo contaminante en el proceso de fermentación de etanol para parte

de la levadura, proceso que se realizó a través de la técnica rápida Rqflex20. Se analizaron en el

laboratorio 13 muestras dosificadas con antibióticos bajo las concentraciones 3, 6 y 8 ppm. Para

la determinación se empleó el sustrato industrial de fermentación al cual se le añadió el

antibiótico y se realizó análisis de la concentración de ácido láctico presente luego de 18 horas de

incubación en agitación constante, esto permitió comparar y evidenciar que antibiótico resulta

efectivo siendo contrastado con el dato de la muestra control.

Figura 5. Concentración de ácido láctico en fermentación tratada con sustancias antimicrobianas -E1 (Replica 1),
E2 (Replica 2), E3 (Replica 3), E4 (Replica 4). Fuente: autor.

En la figura 5, E1, E2, E3 y E4, se evidencia como disminuye la concentración de ácido láctico a

medida que se aumenta la concentración del antibiótico, en el caso de la monensina (E1) una

36
concentración de 3 ppm mostró 3190 mg/l y para 8 ppm 1430 mg/l de ácido láctico en

comparación con los 6000 mg/l de ácido láctico de la muestra control, observándose una

diferencia de 4570 mg/l, lo mismo se observa para E2, E3 y E4, donde se aprecia la disminución

de ácido láctico, lo cual es correspondiente con estudios relacionados donde se evidenció que

muestras tratadas con monensina a partir de una concentración de 3 ppm, pueden lograr la

obtención de menores niveles de concentración de Ácido láctico (Orozco et al., 2018). Es

importante aclarar que el antibiótico monensina es un tipo de ionóforo que obstruyen el

transporte de cationes en la membrana de las bacterias gram-positivas, interfiriendo en la

absorción de nutrientes para la célula y promoviendo un mayor gasto energético para el

mantenimiento del balance osmótico. Para el caso de las bacterias gram-negativas sufren un

aumento en la demanda de energía para el mantenimiento, pero ellas pueden adaptarse

(continuando creciendo y/o sobreviviendo) debido a la capacidad de transporte de electrones

acoplada a la expulsión de protones y/o síntesis de ATP (Fuentes Alarcón, 2006).

En el tratamiento con penicilina se observa que el mayor efecto se encuentra en la concentración

8 ppm seguido de la 6 y 3 ppm respectivamente, para cada una de las réplicas (E1, E2, E3.E4),

esto demuestra lo explicado en otros estudios donde su acción contra bacterias gram positivas y

su mecanismo impide la producción de nuevas células, por lo tanto, ha sido altamente

implementado en destilerías(K.A. Jacques, 2003). Ya que la penicilina contiene un anillo

lactamico β para su actividad biológica, estas al unirse a los receptores, la síntesis de

peptidoglucano se inhibe debido al bloqueo de la transpeptidación. La acción bactericida final es

la eliminación de un inhibidor de las enzimas autolíticas de la pared celular que activa las

enzimas y acaba en la lisis celular (B. Joseph Guglielmo, 2017).

37
Para el caso de estreptomicina se evidencio que en E1, E2, E3 y E4, los datos de ácido láctico se

salieron del valor de la muestra control, siendo estos más altos, como se observa en el E3, en una

concentración de 3 ppm dio 1630 mg/l, siendo el dato control de 1450 mg/l, así mismo para las

otras concentraciones 6 y 8 ppm, que en vez de disminuir la carga del contaminante, se mostró

un aumento de este, por tanto, se infiere que su efectividad fue casi nula en la muestra con el

fermento, por tanto, no sería de utilidad su aplicación. En estudios anteriores se ha demostrado

la efectividad de la estreptomicina en el control de la contaminación en destilerías, sin embargo,

estos resultados nos muestran que su actividad fue baja, esto se debe a que su espectro es bajo

frente a bacterias Gram positivas y su actividad bactericida es dependiente de la concentración

suministrada (Agroquimicos de mexico, n.d.). Es por ello que, debido a su corto espectro, ha sido

utilizado en destilerías en conjunto con otro antibiótico para generar un efecto sinérgico, siempre

y cuando el pH del medio se mantenga a inferiores de 7.0, la combinación más utilizada ha sido

la de penicilina/estreptomicina (Daniel Amsterdam, 2014). Para el caso de neomicina, esta

sustancia es bactericida, actúa contra la gran mayoría de bacterias gram negativas y no tiene

actividad contra anaerobios(Eliana Sáenz Anduaga, 2005), esto puede ser una complicación al

momento de ser utilizada en fermentación pues no arrojaría buenos resultados en la disminución

de bacterias acido lácticas y en este ensayo se observa que los resultados fueron incongruentes,

pues al igual que estreptomicina, su actividad fue casi nula y no disminuyo la concentración del

ácido láctico generado por bacterias acido lácticas consideradas una microbiota contaminante en

fermentación y obtención de etanol. Es de resaltar el uso de la neomicina y estreptomicina, que

son aminoglucósidos, de tipo bactericida. Estos agentes inhiben la síntesis de proteínas en las

bacterias al impedir la función de la subunidad 30S del ribosoma bacteriano. Las bacterias

anaerobias son resistentes a los aminoglucósidos porque el transporte a través de la membrana

38
celular es un proceso que requiere energía dependiente de oxigeno. Su principal utilidad actual

consiste en emplearlos para tratar microorganismos gramnegativos resistentes sólo sensibles a

los aminoglucósidos, o en dosis bajas en combinación con fármacos lactámicos β (B. Joseph

Guglielmo, 2017).

Las diferencias de la concentración de ácido láctico en los resultados obtenidos entre ensayos

realizados pueden deberse a la cantidad de bacterias productoras de ácido láctico presentes

durante la etapa fermentativa al momento de realizar cada montaje.

Tabla 7. Datos de análisis de varianza con α 0,05.

ANÁLISIS DE VARIANZA
Valor
Origen de las Suma de Grados de Promedio de los crítico
variaciones cuadrados libertad cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 31604063,19 3 10534687,73 5,30 0,015 3,49
Dentro de los
grupos 23873425 12 1989452,083
Total 55477488,19 15
*F: calculado, Valor critico F: Teórico. Fuente: autor.

Ho: Todas las medias de los grupos son iguales.

Ha: Por lo menos dos medias no son iguales.
Nivel de significancia: α 0.05

En la tabla 7 observamos los resultados del análisis de varianza realizado a las medias obtenidas

en los cuatro ensayos para cada antibiótico. La teoría nos indica que Fc>Ft rechazamos la

hipótesis nula (Ho), por tanto, aceptamos la alternativa (Ha), Atendiendo a esto, se observa que

el valor F calculado es de 5,30, siendo mayor que el dato teórico de 3,49, evidenciando que

existen diferencias entre las medias de los cuatro antibióticos analizados, lo que nos confirma los

resultados arrojados del ácido láctico, que indican que estos no guardan un comportamiento

similar entre ellos. Otra manera de determinar si las medias de los datos son iguales o no, es

39
mirando si la probabilidad es menor a α 0,05 rechazando la hipótesis nula (Ho), siendo el valor P

de 0,015, mucho menor al nivel de significancia (0,05), entonces se rechaza la hipótesis de que

todas las medias son iguales. (Padilla, n.d.).

40
 8. CONCLUSIONES

La medición de ácido láctico como medida control en la fermentación que permite identificar la

existencia de microorganismos contaminantes asociados al proceso, principalmente bacterias

acido lácticas, que compiten por la fuente de carbono y a su vez inhiben la actividad de la

levadura, generando perdidas en la producción de etanol.

La viabilidad celular establecida bajo recuento directo al microscopio permitió determinar la

actividad fermentativa de la levadura, evaluando su capacidad de propagación en sustrato

azucarado, de tal forma que la misma es inversamente proporcional a la concentración del ácido

láctico, afectándose el rendimiento de la levadura en la producción de etanol.

Dentro del estudio de la actividad antimicrobiana, la monensina y la penicilina muestran los

mejores resultados en la reducción de la concentración del ácido láctico a partir de

fermentaciones realizadas en laboratorio, lo cual permite inferir que podrían ser usados

individual o colectivamente en el control de la microbiota contaminante, principalmente

bacterias ácido lácticas, lo que permite generar un efecto positivo en el rendimiento fermentativo

de la levadura.

41
 9. RECOMENDACIONES O SUGERENCIAS

El uso de antibióticos ha sido altamente cuestionado, ya que su uso excesivo ha generado

bacterias multirresistentes, un estudio realizado por Murphree et al., 2014 reportaron

resistencia en 32 aislados de bacterias acido lácticas a los antibióticos, de ocho instalaciones

de bioetanol en los estados unidos, por ello se busca la implementación de métodos

alternativos de control de la contaminación. El ácido de lúpulo puede ser utilizado como

antibacteriano, al ser de origen natural los contaminantes no desarrollan resistencia y puede

llegar a sustituir los antibióticos comerciales. Según el artículo publicado en la revista

Ethanol Producer Magazine, el lúpulo contiene ácidos orgánicos naturales débiles, al

momento dosificarlo en el propagador, las bacterias absorben el extracto de lúpulo a través

de la pared celular y, al ser un ácido orgánico débil, reduce el pH dentro de la célula

bacteriana, por tanto, previene que las bacterias absorban glucosa, evitando la competencia

con las levaduras. El uso de esta sustancia genera un impacto positivo en la fermentación, por

tanto, observaron aumento en el conteo de levadura, aumentando el rendimiento en la

producción de alcohol.(Matt Thompson, 2020).

Antes de recurrir al uso de los antibióticos, se debería revisar su composición química,

debido a que estos pueden dejar trazas en el alcohol producido y causar efectos ambientales

tras la reacción de combustión. También es necesario realizar identificaciones de los

microorganismos que se encuentran presentes en los fermentadores, puesto que la eficacia de

los antibióticos se limita normalmente a un cierto grupo de bacterias, lo que podría conllevar

a la resistencia de otras. Ya que posiblemente estos son los que están generando

problemáticas durante la fermentación. Por último, sería necesario implementar la

identificación de ácido acético en las muestras a la par que se determina el ácido láctico.

42
 10. GLOSARIO

• Alcohol carburante: es un Compuesto inflamable que no tiene color y tiene olor

característico de los alcoholes. Se puede producir a partir de maíz, papa, remolacha, yuca,

sorgo o de la caña de azúcar, todos ellos tienen la propiedad de contener carbohidratos que

al fermentarse se transforman en alcohol.

• Anaeróbico: es un proceso que se desarrolla sin oxígeno. Condición que presentan algunos

microorganismos para su crecimiento. Las bacterias anaerobias son microorganismos que

son capaces de sobrevivir y multiplicarse en ambientes que no tienen oxígeno.

• Bioetanol: Es un combustible biodegradable que se puede utilizar mezclado con El diésel

petrolero o puro, descubierto por el profesor Expedito Parente de la Universidad Federal de

Ceará, Brasil, en 1977, resultante de la reacción de un Ácido graso vegetal o animal, con un

alcohol –etanol o metanol– en presencia De un catalizador, generalmente, hidróxido de

potasio o de sodio.

• Fermentación: La fermentación alcohólica es un complejo proceso biológico originado por

la actividad de algunos microorganismos que procesan los hidratos de carbono como fuente

de energía, por ejemplo, la glucosa.

• Melaza: La melaza de caña es el líquido residual que queda tras la cristalización del azúcar

de caña. Tiene una textura espesa y viscosa, y su color puede ir desde una tonalidad ámbar

hasta marrón muy oscuro, prácticamente negro.

43
 11. REFERENCIAS

Agroquimicos de mexico. (n.d.). Estreptomicina. Terralia Informacion Agricola. Retrieved

December 3, 2021, from

https://www.terralia.com/agroquimicos_de_mexico/view_composition?composition_id=12910

Anadón, A., & Martínez-Larrañaga, M. (2014). Veterinary Drugs Residues: Coccidiostats. In

Encyclopedia of Food Safety. Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-378612-8.00246-8

ARCH CHEMICALS, INC (2015). Control de la contaminación microbiana en procesos de

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12.

48
 12. ANEXOS

1. cálculos preparaciones

Antibióticos

1 gramo 1 gramo
𝑀𝑜𝑛𝑒𝑛𝑠𝑖𝑛𝑎 = 𝑁𝑒𝑜𝑚𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎 =
100 ml etanol 50 ml ADE + 50 ml etanol

1 gramo 1 gramo
𝑃𝑒𝑛𝑖𝑐𝑖𝑙𝑖𝑛𝑎 = 𝐸𝑠𝑡𝑟𝑒𝑝𝑡𝑜𝑚𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎 =
50 ml ADE + 50 ml etanol 50 ml ADE + 50 ml etanol

*ADE: agua destilada estéril.

Cálculos para hallar la cantidad de antibiótico a utilizar.

V2 × C2
𝑉1 =
C1

400 ml × 3 ppm
𝑉1 = = 0.12 𝑚𝑙
10000 ppm

400 ml × 6 ppm
𝑉1 = = 0.24 𝑚𝑙
10000 ppm

400 ml × 8 ppm
𝑉1 = = 0.32 𝑚𝑙
10000 ppm

2. Imágenes tomadas durante el proceso.

49
Figura 6. Antibióticos utilizados en los ensayos.

Figura 7.Preparación de los medios de cultivo.

50
Figura 8. Equipo RQflex20 corriendo muestras diluidas antes preparadas.

Figura 9. Tiras reactivas luego de ser leídas en el equipo RQflex20.

51