Practica de Biologia Practica 12023

PRÁCTICA DE BIOLOGÍA MOLECULAR 2023B
Equipo________________
LEE DETENIDAMENTE Y CONTESTA CORRECTAMENTE.
 Explica por qué los ácidos nucleicos se precipitan en presencia de alcohol y sales?
 Describa la metodología por medio de un esquema como se realiza la extracción de ADN.
 Que función tiene la Proteinasa K en la extracción de ácidos nucleícos.
 Explica tres técnicas que forman parte del diagnóstico molecular.

 Qué es el espectrofotómetro y qué función tiene en la cuantificaciín de los ácidos nucleícos
 Porque es importante conocer la cantidad y calidad del ADN
Introducción
El ácido desoxirribonucleico (ADN) es el material genético que da a los seres vivos sus características
genotípicas y fenotípicas. La estructura básica del ADN es idéntica en todos los organismos y está
compuesta por dos cadenas de nucleótidos unidas por la complementariedad de las bases a través de
puentes de hidrogeno entre A y T o C y G en forma de doble hélice. Cada nucleótido consiste de una
molécula de azúcar (desoxiribosa), un grupo fosfato y una de las cuatro bases nitrogenadas: adenina,
citosina, guanina o timina. El ADN está localizado dentro del núcleo de las células eucariotas, rodeado
de proteínas llamadas histonas y está organizado en cromosomas. El aislamiento y purificación de
ADN, es el primer paso en cualquier análisis genético. La selección del método de extracción está
determinada por la estructura celular de cada organismo y la aplicación que se requiere. En general
dada su complejidad macromolecular, los ácidos nucleicos son difíciles de separar de los
componentes de membrana (lípido, proteína, carbohidratos) y de otras moléculas solubles
(polisacáridos). Existen métodos que alteran la estructura y característica del ADN, de ahí que se
elaboren métodos capaces de eliminar impurezas de las preparaciones basándose en las propiedades
físico-químicas del ácido nucleícos. La mayoría se caracterizan por el empleo de detergentes y
solventes orgánicos que rompen los núcleos de las células y remueven las proteínas adheridas al ADN,
seguidos por la precipitación de éste con sales y alcoholes. El método para la extracción de ADN por
precipitación con sales (Método de Miller) consiste en la obtención de leucocitos a partir de sangre
periférica y se basa en la precipitación de proteínas celulares, con una solución saturada de cloruro
de sodio. Para estimar la cantidad de ADN genómico y verificar su pureza se determina la densidad
óptica a 260 nm y 280 nm por medio de un espectrofotómetro. Una relación de densidad óptica
260/280 nm entre 1.8 y 2.0 indica que el ADN tiene una pureza adecuada; mientras que, si es menor,
se debe considerar contaminación de la muestra, principalmente por sales o proteínas. Durante los
80” s, Kary Mullis desarrolló una metodología capaz de generar millones de copias de una secuencia
de ADN especifico. Esta técnica conocida como Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polimerase
chain reaction: PCR) es un proceso bioquímico in vitro mediante el cual las cadenas individuales de
ADN blanco son duplicadas por la enzima ADN polimerasa a partir de las moléculas de ADN de
cadena sencilla denominados primers o indicadores, los cuales se utilizan en cada uno de los ciclos
(generalmente entre 20-30) que integran la reacción. Al final de ciclo las cadenas nuevas vuelven a
ser duplicadas por las mismas enzimas, lográndose una producción exponencial de millones de copias
del gen o segmento de ADN específico sometido al proceso.
A. PROCEDIMIENTO
Pasos para la extracción de ADN

1. Colocar 10µl de proteinasa K.
2. Colocar 100µl de la muestra.
3. Colocar 100µl de buffer AL y mezclar en el vortex 15 segundos.
4. Incubar a 56º por 10 minutos.
5.Centrifugar en microcentrífuga.
6. Colocar 100µl de Etanol al 96% y mezclar en vortex 15 segundos.
7. Centrifugar en microcentrífuga.
8. Colocar la mezcla en la columna del kit y centrifugar a 8000 rpm por 1
minuto.
9. Retirar del filtrado el desecho y colocar la solución de lavado AW1 (250µl)
y centrifugar a 8000 rpm por 1 minuto (Fase de lavado).
10. Retirar el desecho y colocar AW2 (250µl) y centrifugar a 10000 rpm por
3 minutos.
11. Centrifugar 1 minuto para eliminar residuos en la microcentrífuga.
12. Colocar 100µl de AE, colocamos un nuevo tubo de 1.5µl y esperar 10
minutos y centrifugar a 8000 rpm.
Dejar reposar a -8ºC 1 hora.
Almacenar por una semana a -20ºC.
Protocolo 2:
Extracción de ADN genómico.

 El botón de leucocitos extraído en la práctica anterior se descongela a temperatura de 37 grados
centígrados para posteriormente resuspenderlo en 3 ml de buffer de lisis de núcleos llamada solución
B (Tris HCl 10mM, NaCl 400 mM, EDTA Na2 2mM, pH 8.2).
 El lisado de leucocitos se deja en digestión toda la noche a 37C con 0.2 ml de SDS al 10%, 0.5 ml
de solución de proteinasa K (1 mg de proteinasa K en SDS al 10% y EDTA Na2 2mM pH 8.2).
 Al siguiente día adicionar 1 ml de solución saturada de NaCl 6M
 Agitar vigorosamente por 15 seg.
 Centrifugar a 5,000 rpm durante 15 min.
 Recuperar el sobrenadante (que contiene el ADN) y transferirlo a otro tubo.
 Adicionar dos volúmenes de etanol absoluto frío y mezclar por inversión varias veces hasta que
forme un precipitado (el ADN “limpio” flota en la superficie).
 Transferir el ADN precipitado a un microtubo de 1.5 ml con una punta estéril y lavarlo con etanol
frío al 70% 2 veces.
 Se deja evaporar el etanol del ADN limpio.
 Disolver el ADN en 400 µl de buffer TE (Tris HCl 10 mM, EDTA 0.2 mM, pH 7.5) por 2 h a 37C.
Se almacena a – 20ºC hasta su empleo
A. PROCEDIMIENTO
Colocar __ l de la muestra de ADN en una celda de cuarzo conteniendo 1 ml de agua destilada,
mezclar suavemente y leer a 260 y 280 nm, en el espectrofotómetro.
Mediante la aplicación de la siguiente fórmula se determina la concentración del ADN:
ADN ng/ml = D.O. 260 nm x dilución (1005/5 l) X 50 (factor constante)*
*50 es el coeficiente de extinción molar de 50 ng/ml de ADN que

tienen la máxima absorbancia de 1.0 unidad de densidad óptica (D.O.)
a 260 nm.

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LEE DETENIDAMENTE Y CONTESTA CORRECTAMENTE.

 Describa la metodología por medio de un esquema como se realiza la extracción de ADN.

 Que función tiene la Proteinasa K en la extracción de ácidos nucleícos.

 Explica tres técnicas que forman parte del diagnóstico molecular.

Pasos para la extracción de ADN

Extracción de ADN genómico.

ADN ng/ml = D.O. 260 nm x dilución (1005/5 l) X 50 (factor constante)*

*50 es el coeficiente de extinción molar de 50 ng/ml de ADN que

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