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Marca de la cruz
LA REVISTA DE QUÍMICA BIOLÓGICA VOL. 290, núm. 40, pp. 24294 –24307, 2 de octubre de 2015
© 2015 por The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. Publicado en los EE. UU.
Subunidad del complejo del microprocesador Síndrome de DiGeorge Región

crítica Gen 8 (Dgcr8) es necesario para la mielinización de las células de
S
Schwann y el mantenimiento de la mielina*□
Recibido para publicación, 6 de enero de 2015, y en forma revisada, 11 de agosto de 2015 Publicado, JBC Papers in Press, 13 de agosto de 2015, DOI 10.1074/jbc.M115.636407
Hsin-Pin Lin‡, Idil Oksuz‡, Edward Hurley§, Lawrence Wrabetz§y Rajeshwar Awatramani‡1
Desde el‡Departamento de Neurología y Centro de Medicina Genética, Facultad de Medicina Feinberg de la Universidad Northwestern, Chicago, Illinois
60611 y§Instituto de Investigación Hunter James Kelly, Universidad de Buffalo, Universidad Estatal de Nueva York, Buffalo, Nueva York 14203
Fondo:Dgcr8regula el procesamiento primario de miARN en el núcleo.

Resultados:Ablación condicionalDgcr8en las células de Schwann durante el desarrollo o en la edad adulta provoca defectos en la formación de mielina y la
expresión génica característicos de las células de Schwann inmaduras y desnervadas (lesionadas).
Conclusión:Dgcr8es necesaria para la formación y el mantenimiento de la mielina.
Significado:Los miARN sincronizan la traducción de genes esenciales para la formación de mielina.
Investigamos el papel de un componente clave del complejo de y se activan nuevos programas de expresión génica específicos de células. Es
microprocesadores, DGCR8, en la regulación de la formación y el fundamental dilucidar los mecanismos que sustentan la ejecución precisa de
mantenimiento de la mielina. Encontramos que la ablación condicionalDgcr8 las transiciones del desarrollo para comprender los trastornos del desarrollo,
en las células de Schwann (SC) durante el desarrollo da como resultado una así como la plasticidad de los tipos de células.
detención de la diferenciación SC.Dgcr8Los SC de knock-out condicional (cKO) Células de Schwann (CS)2son un buen modelo para estudiar la
no logran formar relaciones 1: 1 con los axones o, una vez logrado esto, no diferenciación celular porque los estados de diferenciación SC pueden
logran formar vainas de mielina. La expresión de genes que normalmente se identificarse fácilmente mediante marcadores morfológicos y moleculares (1,
encuentran en SC inmaduras, como la región determinante del sexo Y-box 2 ( 2). Durante el desarrollo, las SC pasan por múltiples etapas de diferenciación
medias2), se incrementa enDgcr8cKO SC, mientras que la expresión de genes para mielinizar axones del sistema nervioso periférico. El desarrollo de SC
relacionados con la mielina, incluida la respuesta de crecimiento temprano comienza con la transición de la migración de células de la cresta neural a
del factor de transcripción regulador maestro 2 (Egr2), se reduce. Además, la precursores de SC, que luego generan SC inmaduras comprometidas. Las SC
expresión de un nuevo programa de expresión génica que involucra a sonic inmaduras comprometidas envuelven axones de diámetro grande o
hedgehog (Shh), activadode novoen los nervios lesionados, se eleva enDgcr8 pequeño y se diferencian en SC mielinizantes o no mielinizantes,
cKO pero no enEgr2ratones nulos, un modelo de arresto de diferenciación SC, respectivamente. Las SC no mielinizantes se envuelven alrededor de
lo que sugiere que el programa de expresión génica relacionado con lesiones múltiples axones de pequeño diámetro para formar colectivamente haces de
enDgcr8Los cKO no pueden atribuirse al arresto por diferenciación. Ablación Remak. Las SC mielinizantes pasan por un proceso denominado clasificación
inducible deDgcr8 en SC adultos da como resultado cambios en la expresión radial para establecer relaciones 1:1 con axones únicos, característicos de la
génica similares a los encontrados en cKO, incluido un aumento en la etapa de promielinización, antes de producir vainas de mielina
expresión demedias2 yShh. Los análisis de estos nervios revelan multilamelares (1). Cada una de estas etapas de diferenciación SC se
principalmente un espesor de mielina y una distribución del tamaño de los caracteriza por una morfología distintiva. La mielinización adecuada y el
axones normales, pero algunos SC desdiferenciados y una mayor infiltración mantenimiento de la mielina son esenciales para la conducción saltatoria de
de macrófagos. Juntos, nuestros datos sugieren queDgcr8es responsable de la los impulsos nerviosos, así como para el soporte trófico de los axones (3).
modulación de los programas de expresión génica que subyacen a la Pacientes con neuropatías desmielinizantes, en
formación y el mantenimiento de la mielina, así como de la supresión de un
programa de expresión génica relacionado con lesiones.
2Las abreviaturas utilizadas son: SC, célula de Schwann; miARN, microARN; cKO, con-
knock-out adicional; TAM, tamoxifeno; SN, nervio ciático; EdU, 5-etinil-2--desoxiuridina;
qRT, tiempo real cuantitativo; Egr, respuesta de crecimiento temprano; Tcf, factor de
transcripción; Pmp, proteína de mielina periférica; Ngfr, receptor del factor de
crecimiento nervioso; Gdnf, factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales;
Durante el desarrollo de un organismo multicelular, las células se
mbp, proteína básica de mielina; Mpz, proteína de mielina cero; Dhh, erizo del
diferencian para adquirir funciones especializadas. Durante el proceso desierto; Smo, homólogo suavizado; Gja, proteína de unión gap,-1; Dll1, tipo delta 1;
de diferenciación, los programas de genes precedentes se apagan, Pax3, caja emparejada 3; Ccnd1, ciclina D1; Erbb2, homólogo 2 del oncogén viral de la
leucemia eritroblástica v-erb-b2; Jag1, dentado 1; Nras, oncogén ras de
neuroblastoma; Nfkb1, potenciador del gen del factor nuclear del polipéptido ligero
*Este trabajo fue apoyado, en su totalidad o en parte, por los Institutos Nacionales de kappa en células B 1; Hes1, peludo y potenciador de split 1; Id2, inhibidor de la unión
Salud Grant 1R01NS071081-01 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y al ADN 2; Cnp, 2-,3-nucleótido cíclico 3-fosfodiesterasa; Pou3f1, dominio POU, clase 3,
Accidentes Cerebrovasculares (para RA). Los autores declaran no tener conflictos de factor de transcripción 1; Plp, proteína proteolipídica; Rara, receptor de ácido retinoico
interés con el contenido de este artículo. -; Crabp1, proteína de unión al ácido retinoico celular I; Olig1, factor de transcripción
□
SEste artículo contieneArchivo complementario 1 y Video 1. de oligodendrocitos 1; Gpr126, receptor acoplado a proteína G 126; Ncam1, molécula
1A quién debe dirigirse la correspondencia: Dpto. de Neurología y de adhesión de células neurales 1; Nrcam, molécula de adhesión celular relacionada
Centro de Medicina Genética, Facultad de Medicina Feinberg de la Universidad con neuron-glia-CAM; Cdh2, cadherina 2; Tnc, tenascina C; Smoc1, enlace de calcio
Northwestern, 7-113 Lurie, 303 E. Superior St., Chicago, IL 60611. Tel.: 312-503-0690; modular relacionado con SPARC 1; MUT, mutante; iKO, knock-out inducido; IQR: rango
Correo electrónico: [email protected]. intercuartílico; P, día postnatal.
24294REVISTA DE QUÍMICA BIOLÓGICA VOLUMEN 290 • NÚMERO 40 •2 DE OCTUBRE DE 2015

Dgcr8 en células de Schwann
que la mielina está poco desarrollada o no se mantiene, tienen una ablaciónDicer1en las SC adultas no afecta el mantenimiento de la
disfunción concomitante del sistema nervioso periférico (4, 5). mielina pero dificulta el proceso de mielinización y remielinización.
Desconcertado en parte por la falta de un fenotipo enDicer1iKO SCs
Cada etapa de la diferenciación SC, además de caracterizarse por (31), buscamos examinar el papel de los miRNA en el desarrollo de SC
una morfología distintiva, también se caracteriza por la expresión de utilizando un mutante condicional diferente. En este estudio
distintos conjuntos de marcadores moleculares y factores de eliminamos condicionalmenteDgcr8en SC en desarrollo y adultas para
transcripción (1, 2, 6, 7). Reguladores positivos de la diferenciación, examinar su papel en la mielinización de SC y el mantenimiento de
comoEgr2, se regulan al alza durante el desarrollo y actúan sobre las mielina. Los nuevos hallazgos de este estudio son que (i)Dcgr8cKOs SCs
vías de señalización intrínsecas de las células para impulsar la están estancados en la diferenciación, comoDicer1cKOs (28), pero el
mielinización (8 -13); los reguladores negativos complementarios de la fenotipo deDgcr8mutantes parece ser más grave, (ii) unde novo
diferenciación y los genes característicos de la etapa inmadura, como programa específico para lesiones es elevado enDgcr8mutantes a una
SOX2 y el protooncogén Jun (JUN), se regulan a la baja durante el edad muy temprana, y (iii) la ablación deDgcr8en SC adultos da como
desarrollo y se regulan al alza tras la lesión, lo que podría funcionar resultado profundos cambios en la expresión génica, incluida la
para prevenir la formación o el mantenimiento de mielina (6). El activación de lade novoprograma de expresión génica específica de
maestro regulador positivo de la mielinización SC,Egr2, es necesario y lesión, así como degeneración SC, la última de las cuales no se observa
suficiente para impulsar la mielinización (14 –17). Activa directamente en equivalente Dicer1mutantes (28). Estos resultados sugieren que
genes SC maduros que codifican proteínas clave de mielina (8-13) y Dgcr8juega un papel importante en la mielinización y el mantenimiento
reprime transcripcionalmente la expresión de genes característicos de de la mielina y queDgcr8yDicer1, además de procesar pasos
secuenciales en la biogénesis de miARN, también puede tener algunas
la etapa inmadura comomedias2yjun(14, 18, 19).Egr2es antagonizado
funciones distintas.
por SOX2 y JUN en un circuito antagónico cruzado que modula el
momento adecuado de la mielinización y gobierna la desmielinización
Procedimientos experimentales
activa después de un traumatismo nervioso (14, 18, 20-22). Pérdida de
Para los estudios de desarrollo,P0::Cre/ (45) yDgcr8flujo/peso
Egr2 da como resultado la detención de la diferenciación SC en la
(46) ratones fueron criados paraDgcr8hilo dental/floxratones en un fondo
transición entre las etapas de promielinización y mielinización y
mixto FVB/B6. Los nervios ciáticos (SN) se recolectaron en diferentes
conduce a una reducción drástica de la formación de mielina en los
momentos y se procesaron para el ensayo apropiado. Cuando fue
nervios periféricos (hipomielinización congénita) (14, 15, 18, 23–27).
necesario, se administraron 50 mg/kg de 5-etinil-2-desoxiuridina (EdU)
Se han informado perfiles de microARN de SC (28-36). Los
(Molecular Probes) mediante inyección intraperitoneal 2 h antes de la
microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que
disección. Según las pautas del Comité Institucional de Cuidado y Uso
regulan la expresión génica global en diversos escenarios
de Animales (IACUC), no llevamosDgcr8Ratones cKO mayores de 4
de desarrollo, fisiológicos, de estrés, de envejecimiento y de
semanas por razones humanitarias. Para estudios de mantenimiento de
enfermedades (37–39). Se transcriben como miARN /
mielina y lesiones nerviosas,Por favor::CreERT (47),
primarios largos procesados por el complejo de
Dgcr8flujo/peso, yAi9/ (48) ratones fueron criados paraDgcr8hilo dental/flox
microprocesador (formado por drosha ribonucleasa tipo III,
ratones sobre un fondo B6. La inyección de TAM y la cirugía de SN se
DROSHA y DGCR8) en miARN precursores, exportados al
realizaron como se describió anteriormente (31).Dgcr8Los mutantes
citoplasma y escindidos por la ribonucleasa dicer1 tipo III iKO desarrollaron un fenotipo grave relacionado con el SNC y no se
(DICER1) en -22 nucleótidos maduros. -miRNAs largos (40). mantuvieron más de 12 semanas después de la administración de TAM.
Los miARN pueden silenciar cientos de genes objetivo Para el estudio del linaje Shh,Shh::Cre/ ratones (49), conCregolpeado en
mediante el emparejamiento de bases con el ARNm un endógenoShhlocus, fueron criados paraR26NZG /ratones (50) sobre un
objetivo, lo que da como resultado la desestabilización del fondo mixto de FVB/B6. Para obtenerEgr2ratones nulos (Egr2/
ARNm y la represión de la traducción. Aunque la expresión oEgr2cre/cre),Egr2Cre/Pesolos ratones se cruzaron en un fondo mixto
de genes diana está sutilmente regulada por miRNAs, 129Sv/B6/DAB (51).
Análisis semifinos y microscopía electrónica (EM)—Las muestras
Recientemente, nuestro grupo y otros han descubierto que de SN se sumergieron en fijador (2 % de paraformaldehído, 2,5 %
Dicer1es crucial para la mielinización SC (28 -31, 44). Ratones que de glutaraldehído, 0,1METROcacodilato de sodio); El análisis
carecen de SCDicer1 durante el desarrollo (P0::Cre/,Dicer1hilo dental/flox, semidelgado con EM se realizó en el Centro de Microscopía
oDicer1 cKOs) muestran un deterioro neurológico severo. La Avanzada de la Universidad Northwestern o en el laboratorio del
mayoría de Dicer1Las cKO SC logran relaciones 1:1 con los axones, Dr. Wrabetz como se describió anteriormente (52).
pero se estancan en la transición entre las etapas de diferenciación Extracción de ARN y qRT-PCR—La extracción de ARN se realizó
promielinizante y mielinizante, imitando parcialmente el fenotipo utilizando el kit de aislamiento de miARN mirVana (Life Technologies,
de Egr2mutantes Por otro lado, los ratones con tamoxifeno (TAM)- Inc.) como se describió anteriormente (28). Se sintetizaron ADNc
eliminación tardía inducida deDicer1(Por favor::CreERT
/
, Dicer1hilo dental/flox, a partir de ARN tratado con ADNasa (kit libre de ADN; Life Technologies)
oDicer1iKOs) en SC que han completado la mielinización no muestran muestras utilizando SuperScript VILO Master Mix (Life
patología aparente hasta 14 semanas después de la eliminación, pero Technologies). qRT-PCR se realizó utilizando TaqMan Universal
demuestran una transición tardía de la proliferación a la remielinización Master Mix II, sin UNG, y Taqman Gene Assays o Taqman MicroRNA
después de la lesión nerviosa (31). Juntos, estos estudios sugieren que los Assay en el sistema de PCR en tiempo real 7500HT (Life
miARN modulan la transición entre los estados de diferenciación en las SC. Technologies). Se utilizaron varios controles internos, incluidos
gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh), hipoxemia
2 DE OCTUBRE DE 2015 •VOLUMEN 290 • NÚMERO 40 REVISTA DE QUÍMICA BIOLÓGICA24295

antina guanina fosforribosiltransferasa (Hprt),-actina (Actb) La toquímica fue realizada por el Laboratorio de Histología y
y ARN nucleolar pequeño-202 para miARN. Fenotipado de Ratones de la Universidad Northwestern. Los
Los ensayos del gen Taqman utilizados incluyen: receptor del portaobjetos se incubaron con peróxido de hidrógeno al 3 % en H2
factor de crecimiento nervioso (Ngfr) (Mm01309638_m1); vimentina doblemente destilada2O para bloquear la peroxidasa endógena y con
(Vim) (Mm01333430_m1); respuesta de crecimiento temprano 1 solución bloqueadora de avidina/biotina para bloquear la biotina
(Egr1) (Mm00656724_m1); respuesta de crecimiento temprano 3 endógena. La amplificación se realizó con el kit Vectastain ABC (Vector
(Egr3) (Mm00516979_m1); factor de transcripción 4 (Tcf4) Laboratories) seguido de la solución de trabajo Biotinyl Tyramide y
(Mm00443210_m1); proteína de mielina periférica 22 (Pmp22) Streptavidin-Alexa 488.
(Mm00476979_m1); factor neurotrófico derivado de la línea de Cuantificación y Estadística—Si no se indica lo contrario,pagsLos valores
células gliales (Gdnf) (Mm00599849_m1); Shh (Mm00436528_m1); se determinaron mediante la prueba de Student no pareada, de dos colas,
proteína básica de mielina (Mbp) (Mm01266402_m1); proteína de de varianza igual o de varianza desigual.tpruebas usando Microsoft Excel. La
mielina cero (Mpz) (Mm01290519_m1); Egr2 (Mm00456650_m1); igualdad de las varianzas se determinó con pruebas F. Los resultados se dan
erizo del desierto (Dhh) (Mm01310203_m1); homólogo parcheado 2 como la media SE de la media. Benjamini-Hochberg
(Ptch2) (Mm00436047_m1); Se utilizaron correcciones de proteínas que interactúan con hedgehog para ajustarpagsvalores de tasa de descubrimiento falso
(Hhip) (Mm00469580_m1); Cuadro SRY (región Y determinante del sexo) con arreglos de miARN.2Se usaron pruebas y análisis de varianza de un
10 (Medias10) (Mm01300162_m1); homólogo suavizado (Smo) factor para probar la significancia en casos de comparación categórica.
(Mm01162710_m1); proteína de unión gap,-1 (Gja1) parisones y comparaciones múltiples. Para cuantificación de mea-
(Mm00439105_m1); tipo delta 1 (Dll1) (Mm01279269_m1); seguro enDgcr8cKO y nervios de control, los recuentos se obtuvieron
caja pareada 3 (Pax3) (Mm00435491_m1); un dominio 17 de manualmente en tres campos representativos (inmunofluorescencia
desintegrina y metalopeptidasa (Adam17) (Mm00456428_m1); junio 20 , semifino 100 , EM 440 ) de al menos tres animales de control y tres
(Mm00495062_s1); Hprt (hipoxantina guanina fosforribosil transferasa; mutantes. Para la cuantificación de la tinción F4/80 en Dgcr8iKO y
Mm00446968_m1); ciclina D1 (Ccnd1) (Mm00432359_m1); Muesca1 nervios de control, se obtuvieron mediciones de F4/80 y el área del
(Mm00435249_m1); Medias2 (Mm03053810_s1); Actb (--actina; nervio en 10 campos aleatorios no superpuestos (20 ) usando ImageJ.
mm00607939_s1); homólogo 2 del oncogén viral de la leucemia Para la cuantificación de axones que carecen de vainas de mielina y SC
eritroblástica v-erb-b2 (Erbb2) (Mm00658541_m1); irregular 1 (Jag1) severamente degenerados enDgcr8iKO y nervios de control, los
(Mm00496902_m1); oncogén ras de neuroblastoma (Nras) recuentos se obtuvieron de 10 campos aleatorios que no se
(Mm03053787_s1); potenciador del gen del factor nuclear del superponen (890). Las pruebas de Wilcoxon-Mann-Whitney se
polipéptido ligero kappa en células B 1 (Nfkb1) (Mm01316099_m1); realizaron utilizando Microsoft Excel con Analyze-it, Standard Edition
peludo y potenciador de split 1 (Hes1) (Mm01342805_m1); inhibidor de (Analyze-it Software, Ltd). Se realizó morfometría computarizada
la unión al ADN 2 (Id2) (Mm00711781_m1); 2-,3--nucleótido cíclico 3- semiautomática en secciones semidelgadas de nervios ciáticos para
fosfodiesterasa (Cnp) (Mm01306640_m1); dominio POU, clase 3, factor determinar la relación G y la distribución de diámetros de fibra para
de transcripción 1 (Pou3f1) (Mm00843534_s1); dominio POU, clase 3, axones mielinizados utilizando el software Leica Q-Win/Pro (Leica
factor de transcripción 2 (Pou3f2) (Mm00843777_s1); inhibidor de la Microsystems). La relación G se determinó dividiendo el diámetro
unión al ADN 4 (Id4) (Mm00499701_m1); factor neurotrófico derivado medio de un axón (sin mielina) por el diámetro medio del mismo axón,
del cerebro (Bdnf) (Mm04230607_s1); proteína proteolipídica 1 (Plp1) incluida la mielina.
(Mm00456892_m1); homólogo 3 del oncogén viral de la leucemia
Resultados
eritroblástica v-erb-b2 (Erbb3) (Mm01159999_m1); miembro de la
familia GLI-Kruppel GLI1 (Gli1) (Mm00494654_m1); receptor de ácido La eliminación de Dgcr8 en SC durante el desarrollo da como resultado
retinoico- (Rara) (Mm01296312_m1); proteína de unión al ácido una reducción de la mielinización del nervio periférico:Para obtenerDgcr8
retinoico celular I (Crabp1) (Mm00442776_m1); factor de transcripción deleciones en SC, cruzamosDgcr8hilo dental/floxratones aP0::Creratones para
de oligodendrocitos 1 (Olig1) (Mm00497537_s1); proteína 43 asociada al generarP0::Cre/,Dgcr8hilo dental/flox(Dgcr8cKO) ratones (28, 45). ElP0::CreLa cepa
crecimiento (Gap43) (Mm00500404_m1); receptor acoplado a proteína G muestra actividad a partir de aproximadamente E14 (45, 52) en la mayoría, si
126 (Gpr126) (Mm01193797_m1); molécula de adhesión de células no en todas, las SC de los nervios periféricos.P0::CreLa recombinación
neurales 1 (Ncam1) (Mm01149710_m1); molécula de adhesión celular mediada por β es específica de las SC y no se observa en las neuronas de los
relacionada con neurona-glia-CAM (Nrcam) (Mm00663607_m1); GRD (52). Tras la exposición a la recombinasa Cre en la mitad de la gestación,
cadherina 2 (Cdh2) (Mm01162497_m1); cadherina 1 (Cdh1) el exón 3 deDgcr8fue eliminado de laDgcr8hilo dental/floxalelo en SC, generando
(Mm01247357_m1); hendidura ho- una mutación de cambio de marco que resultó en la pérdida
molog 2 (Slit2) (Mm00662153_m1); tenascina C (Tnc) de la interacción proteína-proteína WW y unión al ARN
(Mm00495662_m1); Unión de calcio modular relacionada con SPARC 1 deDgcr8. Esta eliminación condicional fue diseñada para
dominios
(Smoc1) (Mm00491564_m1). interrumpirDrosha/Dgcr8escisión dependiente de miARN
Matrices de miARN de PCR en tiempo real:Las matrices de miARN de precursores en miARN maduros y, por lo tanto, inhibe canónico
PCR en tiempo real se realizaron en el juego de tarjetas TaqMan Rodent Dgcr8-biogénesis de miARN dependiente en SC (46).
MicroRNA AB v3.0 (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones Para verificar la interrupción exitosa de la biogénesis de miARN en SC,
del fabricante. analizamos los niveles de miARN en SN en el día postnatal (P) 7 en con-
Inmunofluorescencia—La inmunohistoquímica fue per- trol yDgcr8Los ratones cKO que usaban TaqMan Array Rodent se formaron
como se describió anteriormente (18, 28). Un Click-iT EdU Alexa Tarjetas MicroARN (archivo suplementario 1). similar aDicer1 cKOs,
Se usó el kit de imágenes Fluor (Molecular Probes) para marcar la expresión de solo un pequeño subconjunto de miRNAs se redujo
EdU. Para el etiquetado SN adulto de F4/80 y CCND1, inmunohisto- drásticamente enDgcr8cKO. 12 de 641 ratones únicos

FIGURA 1.NoquearDgcr8en SC durante el desarrollo da como resultado una reducción de la mielinización de los nervios periféricos.A, cuantificación de la expresión de miARN
3). Se muestran
en control yDgcr8cKO SN en P7 utilizando tarjetas de microARN Taqman Array (norte control S;barra gris12 miARN estudiante
mutantes cuya expresión
de dosse reduce
colas 10 veces
tprueba, *pagsen mutantes.
0,05, ** barra negra p
0.01.B, análisis qRT-PCR de la expresión de miR-320, miR-484 y miR-70 enDicer1
yDgcr8cKO SN en P7 (norte3). Como era de esperar, la expresión de mirtrons miR-320 y miR-484 depende solo deDicer1, noDgcr8. *** pags0.001.C, bruto
examen de SN.Dgcr8Los SN de cKO en P14 son transparentes, mientras que los nervios de control son opacos.D, análisis semidelgado de control yDgcr8cKO SN en P14 teñido con azul
de toluidina, secciones transversales (norte3). Los nervios mutantes tienen un número reducido de vainas de mielina; estudiante de dos colastprueba, WT 592 20, MUT 13 4,pags
0.0008.mi, análisis ultraestructural de control yDgcr8cKO SNs en P14 con EM. Células mielinizantes (metro) y paquetes Remak (r) se observan en los controles. Por el contrario,Dgcr8Los
SN cKO tienen pocas células mielinizantes (metro) y paquetes Remak (r). MásDgcr8cKO SC detenidos en la etapa de diferenciación promielinizante 1: 1 (pags), mientras que algunos son
detenidos antes en la etapa inmadura, con haces de axones sin clasificar (tu).F, cuantificación de diferentes tipos de SC en control yDgcr8cKO SN en P14 (norte
3).Dgcr8Los cKO tienen una composición general diferente de tipos de SC (2prueba,pags 0,001). Recuentos de células de SC mielinizantes, SC promielinizantes,
Los SC no mielinizantes y los SC no clasificados por campo son significativamente diferentes entre los nervios de control y los mutantes (por pares).2pruebas, todopags0,001).
Los miARN mostraron una reducción de 10 veces en la expresión y 50 análisis delgado reveló queDgcr8Los nervios cKO tenían un número reducido
de 641 mostraron una reducción de 3 veces en la expresión, mientras de vainas de mielina en P14 (pags 0.001) (Figura 1D). la oca-
que 339 miARN mostraron una reducción de 2 veces o ninguna Las vainas de mielina que se observaron en mutantes podrían
reducción en la expresión (Fig. 1Ayarchivo suplementario 1). Las SC son representar células que escaparon de la recombinación temprana o
el tipo de célula más abundante en las muestras de nervio ciático, y se valores atípicos que escaparon del fenotipo de hipomielinización a
esperaba que la mayoría, si no todas, las SC hubieran sido pesar de la recombinación exitosa.
recombinadas por el robusto P0::Cre-cepa eliminada, lo que hace Análisis ultraestructurales de control yDgcr8cKO y nervios con EM
sorprendente la gran cantidad de miARN no perturbados. Este confirmaron una detención en la diferenciación SC en nervios
resultado, obtenido de forma independiente en ambosDicer1yDgcr8 mutantes. Aunque se observaron células mielinizantes y haces de
mutantes, también disminuye la probabilidad de que estos miARN Remak en los controles en P14, pocas SC enDgcr8Los cKO habían
remanentes sean el resultado de alelos hipomórficos. Es probable que formado vainas de mielina (Fig. 1mi). La mayoría de las SC se detuvieron
muchos de los miARN no perturbados representen miARN que se en la etapa de diferenciación de promielinización 1: 1, mientras que
producen en otros componentes celulares de la muestra nerviosa, algunas se detuvieron antes y mostraron una clasificación incompleta
como los axones o el endoneuro, o miARN con mayor estabilidad.Dgcr8 (Fig. 1F). Este fenotipo de clasificación parecía ser más severo enDgcr8
-mirtrons independientes como miR-320 y miR-484, por ejemplo, se cKOs que Dicer1cKO (28). El comportamiento general y el fenotipo
redujeron enDicer1 cKO pero noDgcr8cKO (Fig. 1B) (28, 53). anatómico macroscópico deDgcr8cKO parece ser similar a los modelos
Comportamiento,Dgcr8Los ratones cKO se desarrollaron normalmente durante de hipomielinización congénita en ratones (15, 18, 28, 30, 44).
la primera semana postnatal pero mostraron debilidad en las extremidades en Las SC Dgcr8 cKO no regulan a la baja Sox2 ni regulan al alza a
P14. por P21,Dgcr8Los ratones cKO mostraron paresia severa de las extremidades Egr2, siguen proliferando y carecen de expresión génica de
anteriores y posteriores (Video complementario 1). Este déficit de la extremidad mielina:Se predice que varios miARN que se expresan
anterior parecía ser más grave enDgcr8cKOs queDicer1cKO (28). El examen canónicamente en SC se dirigen a genes característicos de la etapa
macroscópico del SN en P14 reveló que, mientras que los nervios de control eran inmadura, comomedias2yjun, cuyos productos son suficientes para
opacos,Dgcr8Los nervios cKO eran transparentes, muy probablemente reducirEgr2niveles para suprimir la mielinización. Examinamos
representativos de defectos en la mielinización (Fig. 1C). Semi- SOX2,Egr2, y la expresión de MBP en control yDgcr8cKO

FIGURA 2.Dgcr8Los cKO SC continúan proliferando, no regulan a la baja SOX2 y regulan al alzaEgr2y muestran un aumento en la proliferación.A, análisis de inmunomarcaje de
control yDgcr8cKO SNs en P14, secciones longitudinales. Aumento de la tinción de KI67 y EdU enDgcr8Los nervios cKO indican una mayor proliferación SC en los nervios mutantes.
Disminución de la PAM- yEgr2Se observaron células positivas para SOX2 y un aumento de células positivas para SOX2 en mutantes.B, cuantificación de análisis de inmunomarcaje en
control yDgcr8cKO en P14 (WT,norte5; MUT,norte3). Hay un número significativamente mayor de EdU-, KI67- y SOX2 positivo y un número significativamente menor deEgr2SC positivos
en nervios mutantes. estudiante de dos colastprueba, *pags0.05, ***pags0.001.C, Análisis de transferencia Western de la expresión de MBP y p-ERK en control yDgcr8cKO SN en P14 (
norte3). Los niveles de MBP se redujeron fuertemente en los nervios mutantes, mientras que los niveles de p-ERK fueron similares a los niveles en los controles. Se usó tubulina como
control de carga.
nervios ciáticos con marcaje de inmunofluorescencia (18, 28). Me gusta similar aDicer1cKO, análisis de inmunomarcaje realizados con
Dicer1ckos,Dgcr8Los nervios cKO tenían un mayor número de células KI67 y tinción EdU en control yDgcr8Los nervios cKO mostraron un
que expresaban SOX2 y un menor número de células que expresaban marcado aumento en el número de células en proliferación en
Egr2y MBP. (Figura 2,A–C) (28).Dgcr8Los cKO también parecían tener un Dgcr8cKO en P14 (Fig. 2,AyB) (28). Aumento de la proliferación en
mayor número de células que expresaban JUN (no se muestra). En Dgcr8cKOs es consistente con la incapacidad de Dgcr8-CS
ambosDicer1cKO yDgcr8Los cKO, la desrepresión de SOX2 y JUN y otros deficientes para diferenciar terminalmente. Varios miARN
reguladores negativos de la mielinización debido a una deficiencia en canónicos que están muy reducidos enDgcr8cKO (p.ejmiR-138,
los miARN podrían sustentar en parte su drástico fenotipo de miR-34a, miR-20b) regulan a la baja genes del ciclo celular como
hipomielinización. Ccnd1. El cese de la proliferación durante el desarrollo

FIGURA 3.Dgcr8Los nervios cKO muestran mayores niveles de genes inmaduros y específicos de denervación, una característica que no está presente enEgr2mutantes nulos.
A, qRT-PCR análisis de expresión génica en control yDgcr8cKO SN en P14, presentado en escala log 2 (WT,norte 9; MUT,norte 3). Los genes relacionados con la mielina son
regulan a la baja, mientras que los genes inmaduros/promielinizantes y asociados a la denervación están regulados al alza enDgcr8cKO.barra negra control S;barra gris
mutantes estudiante de dos colastprueba, *pags0,05, **pags0.01, ***pags0.001.B, qRT-PCR análisis de la expresión génica enEgr2nulo yDgcr8cKO SN en P5 (norte5 cada uno). Genes
asociados a la denervaciónShh,Gdnf, yTncestán regulados al alza enDgcr8cKO pero no enEgr2ratones nulos.Cangrejo1ySmoc1están regulados al alza enDgcr8nervios cKO pero
regulados a la baja enEgr2nervios nulos.C, tinción con X-gal de secciones transversales de SN obtenidas de adultos seccionados o ilesosShh::Cre,R26NZG
ratones (norte3). Solo las SC en el lado seccionado están marcadas con X-gal, lo que sugiere que, al menos mediante este ensayo, la expresión deShhno es detectable en SC durante el
desarrollo, pero solo se activa después de la transección.
Se cree que el oment está acoplado con la formación de mielina (28, 30, 31, resultados fueron similares a los deDicer1cKO yEgr2mutantes nulos.
54-56), lo que significa que una falla en la regulación negativaCcnd1y otros Genes que codifican muchos componentes diferentes de mielina
genes del ciclo celular pueden estar vinculados a una falla de las SC para (incluidos Mpz, Mbp, Pmp22, Plp1 y Cnp), la mayoría de los reguladores
diferenciarse terminalmente. También examinamos la apoptosis en control y positivos de la mielinización (incluidosEgr2, Sox10, Pou3f1 y Pou3f2) y
Dgcr8cKO en P14. No hubo una diferencia significativa en el número de receptores de neurregulina (incluyendo Erbb2yErbb3) fueron regulados
células inmunopositivas para caspasa 3 escindidas en nervios mutantes y de a la baja enDgcr8cKO SN (1, 6). Muchos genes característicos de las SC
control (WT 0,0017 0,0014; MUT 0,0161 0,0142,pags indiferenciadas y la mayoría de los reguladores negativos de la
0,4178; no mostrada). mielinización, incluidosmedias2,Ccnd1,Egr1, Id2,Id4,ngfr,Ncam1,
La vía de transducción de señalización de ERK se ha implicado en Muesca1,Hes1, yJag1estaban regulados al alza en mutantes (6). Aunque
la regulación de la diferenciación y proliferación SC (57–61). Se los niveles de proteína de adhesión Cdh2 (N-cadherina) no fueron
encontró que los niveles de fosfo-ERK estaban aumentados en significativamente diferentes de los niveles en los controles, los niveles
Dicer1SCs ablacionados (30). Para probar si la señalización de ERK deCdh1(E-cadherina) yNrcam, los cuales normalmente aumentan
se alteró enDgcr8cKOs, probamos la expresión de fosfo-ERK por durante el desarrollo, se redujeron significativamente enDgcr8cKO (Fig.
Western blot. Aunque los niveles de MBP eran extremadamente 3A).
bajos en Dgcr8cKO, los niveles de fosfo-ERK no parecían aumentar Había genes cuyos niveles no estaban alterados como se esperaba
significativamente enDgcr8cKOs, ya que están enDicer1cKO (Fig. 2C enDgcr8cKO. Niveles deNfkb1, entre los reguladores positivos de la
) (30). diferenciación, no fueron significativamente inferiores enDgcr8cKO (62–
Los SC Dgcr8 cKO muestran perfiles de expresión génica alterados y 65). Niveles degpr126, un receptor acoplado a proteína G esencial para
expresan genes asociados a la denervación:Para analizar más a fondo la la clasificación axonal, la formación de SC maduras no mielinizantes y la
expresión génica enDgcr8cKOs, realizamos análisis qRT-PCR para organización del perineuro (66 - 68), aumentaron en los mutantes.
control yDgcr8cKO SN en P14. Como era de esperar, el Niveles deTcf4yraro, un receptor de

ácido retinoico, también aumentaron relativamente. Entre los supuestos mosaico de moda (47).Por favor::CreERTLa recombinación mediada por
reguladores negativos de la mielinización, los niveles dejun,Egr3,Pax3, dll1, y β es específica de las SC y no se observa en las neuronas de los GRD
Nras(6) no fueron significativamente mayores en los mutantes (Fig. 3A). En el (47, 75). Tras la exposición a TAM, se esperaba que CreERT se trasladara
caso dejun, nuestros datos sugieren un posible desacoplamiento entre el al núcleo, donde el exón 3 delDgcr8hilo dental/floxSe esperaba que el alelo se
ARNm y la expresión de proteínas enDgcr8cKO, lo que sugiere que los eliminara a través de la recombinación mediada por Cre de una manera
miARN pueden desempeñar un papel clave en la supresión restringida espacial y temporalmente. envejecemosDgcr8 iKOs y sus
postranscripcional de los niveles de JUN sin afectar la abundancia de ARNm. compañeros de camada controles hasta las 4 semanas de edad y luego
les inyectaron diariamente durante 10 días 100 g/g de TAM o un
También examinamos la expresión de los genes que expresan las SC en vehículo (aceite de maíz), el mismo régimen utilizado paraDicer1iKO
modelos de lesiones nerviosas (en lo sucesivo, denominadas indistintamente (31). Para visualizar el grado de recombinación después de la inyección,
SC denervadas). Análisis qRT-PCR para genes seleccionados asociados a la cruzadoPor favor::CreER
T
/
, Dgcr8flujo/pesoratones aAi9ratones.Ai9es un
denervación en control yDgcr8Los cKO en P5 revelaron la regulación positiva informador sensible de la recombinación mediada por Cre (48). Cuatro semanas
deShhyGdnf(genes asociados a la denervación), Cangrejo1(una proteína de después de la inyección de TAM, expresión generalizada de tdTomato
unión celular del ácido retinoico),Tnc(una glicoproteína de la matriz , Dgcr8flujo/peso,Ai9/ SN, confirme-
fue visto enPor favor::CreER
T
/
extracelular), ySmoc1(una proteína ECM de calcio modular relacionada con ing recombinación exitosa, aunque el porcentaje de
SPARC). La distintiva regulación positiva deShhyGdnfocurre recombinación fue difícil de determinar debido a la
sorprendentemente temprano enDgcr8cKO; la primera semana posnatal es expresión citoplasmática de la tdTomato (Fig. 4A).
un momento en el que muchas SC en los controles ni siquiera han Para evaluar la eficacia de laDgcr8eliminación, realizamos
comenzado la mielinización. A continuación, queríamos determinar si la análisis de expresión génica usando qRT-PCR en control yDgcr8
activación temprana de genes específicos de denervación es una iKOs 4 semanas después de la exposición a TAM. Hubo una
característica común de otros modelos de hipomielinización. Realizamos reducción significativa en los niveles deDgcr8en mutantes. Los
análisis qRT-PCR para genes asociados a la denervación en control yEgr2SN niveles de miR-138 y miR-338 –3p también se redujeron (Fig. 4B).
mutantes nulos en P5. No hubo cambio enShhyGdnfniveles enEgr2mutantes, Niveles remanentes deDgcr8y los miARN probablemente reflejan la
yCangrejo1los niveles eran de hecho más bajos enEgr2mutantes que en los naturaleza de mosaico delDgcr8eliminación usando elPor favor::
controles (Fig. 3B). Juntos, estos resultados sugieren que, aunqueDgcr8Los CreERTtensión. La expresión génica se analizó enDgcr8iKO SN 4
mutantes son similares aEgr2mutantes en términos de hipomielinización, semanas después de la exposición a TAM usando qRT-PCR. La
Dgcr8 Los mutantes demuestran cambios en la expresión génica que son expresión de la mayoría de los genes probados no difirió de su
diferentes de los que se encuentran enEgr2ratones nulos. Ya sea a través de expresión en los controles excepto por la expresión de genes
mecanismos directos o indirectos,Dgcr8Las SC cKO parecen no poder característicos de la etapa inmadurangfr yCangrejo1, que fueron
reprimir un programa de expresión génica asociado a una lesión, que es otro reguladas al alza enDgcr8iKOs, y Dhh y Smo, miembros de la vía
modelo de hipomielinización, elEgr2mutante nulo, no lo hace. Dhh, que estaban regulados a la baja (Fig. 4C).
Para evaluar la expresión génica enDgcr8iKO en un momento
Shh se expresa de novo en SC denervados:La primera expresión de posterior, se realizó qRT-PCR en SN 11 semanas después de la inyección
ShhenDgcr8Los nervios de cKO nos llevaron a preguntarnos si esto de TAM. Hubo una reducción significativa en los niveles de miR-138 y
representaba una falla en la regulación a la baja.Shhde una etapa miR-338 –3p (Fig. 4D). La desregulación de genes se pronunció en este
anterior de desarrollo o si representaba la expresión de unade novo punto. La expresión de proteínas compactas de mielina (como Mbp y
programa de expresión génica asociada a la denervación. Expresión de Mpz), Gja1 y Smo se redujo significativamente enDgcr8iKOs mientras
Shhse ha informado previamente en situaciones que involucran que la expresión de Pmp22, Mag yEgr2permaneció sin cambios (datos
denervación pero no desarrollo (69-73). Sin embargo, en el pez cebra, no mostrados). Muchos genes característicos de inmaduros (incluyendo
se ha descubierto que las células de la placa del suelo SHH del sistema ngfr,medias2,Ccnd1, Muesca1, Tnc y Crabp1) y específicos de
nervioso central embrionario contribuyen al desarrollo del sistema denervación (incluyendo Olig1,Shh, yGdnf) los estados estaban
nervioso periférico (74). Para confirmar definitivamente siShhes significativamente regulados (Fig. 4mi). En general, la expresión génica
realmente un gen específico de la denervación en SC y no se expresa en cambia enDgcr8Los iKO a las 11 semanas posteriores a la ablación
ningún momento durante el desarrollo de SC, realizamos una cirugía fueron más pronunciados que los encontrados a las 4 semanas
simulada y de transección en SN de adultosShhratones rastreadores de posteriores a la ablación y fueron similares a los encontrados enDgcr8
linaje (Shh::Cre/,R26NZG /). Células que expresaronShhen cualquier punto cKO.
se marcaron con nuclear lacZ. Múltiples SC se marcaron con LacZ en Para investigar si los cambios en la expresión génica observados
nervios seccionados, mientras que muy pocas células se marcaron en también podrían verse a nivel de proteína, realizamos análisis de
nervios simulados (Fig. 3C). Estos resultados sugieren queShh::Crela inmunomarcaje. Observamos una expresión escasa pero aumentada de
actividad es en gran medida indetectable en SCs durante el desarrollo, CCND1 enDgcr8SN de iKO 11 semanas después de la exposición a TAM
pero aumenta después de la transección, lo que confirma queShhes (Fig. 4F). Sin embargo, los cambios en los niveles de proteína MBP, MPZ,
parte de un programa de expresión génica que se activade novoen SC fosfo-ERK y fosfo-AKT no fueron detectables mediante análisis de
denervados. transferencia Western (Fig. 4GRAMO).
Se requiere Dgcr8 para el mantenimiento de mielina:Para probar si Dgcr8 Para determinar si los cambios en la expresión de genes y
se requiere para el mantenimiento de la mielina, cruzamosDgcr8hilo dental/flox proteínas enDgcr8iKOs condujo a cambios estructurales en el SN,
ratones aPor favor::CreERT ratones para generarPor favor::CreER/ T , realizamos análisis semidelgado y EM en SN de 10 a 11 semanas
Dgcr8hilo dental/flox(Dgcr8iKO) ratones.Por favor::CreERTratones muestran exposición posterior a TAM. Sorprendentemente, las secciones semifinas
recombinación en SC después del tratamiento con TAM, aunque en un revelaron defectos de fasciculación del tronco nervioso enDgcr8iKO con el

FIGURA 4.Dgcr8la ablación en SC maduros conduce a una expresión génica desregulada y una mayor infiltración de macrófagos.A, expresión de tdTomato en Plp::CreER/,Dgcr8
flujo/peso,Ai9/ control
T yPor favor::CreER/,Dgcr8flujo/peso,Ai9/ SN mutantesT4 semanas después de la inyección de TAM (norte 3). Tomate td generalizado
expresión enPor favor::CreER
T /nervios confirma la recombinación exitosa.B, análisis qRT-PCR de miR-138, miR-338 –3p yDgcr8expresión en control yDgcr8 iKO SN 4
semanas después de la inyección de TAM (WT,norte4; MUT,norte 5). Hay una reducción significativa enDgcr8iKOs en niveles de miR138 (40.0 7,5%,pags 0.0010),
miR338 –3p (26,2 6,1 %,pags0.0002), yDgcr8(71.1 5,4%,pags 0,0145).barra negra control S;barra grismutantesC, qRT-PCR análisis de la expresión génica
en control yDgcr8iKO SN 4 semanas después de la exposición a TAM (WT, 5; MUT,norte 4). Expresión dengfry Crabp1 aumentó en mutantes, mientras que la expresión pags
norte de Dhh y Smo se redujo. estudiante de dos colastprueba, * pags0,05, ** 0.01, *** pags0.001.D, análisis qRT-PCR de miR-138 y miR-338 –3p
expresión en control yDgcr8iKO SN 2 semanas después del simulacro, y el aplastamiento se realizó 8 semanas después de la exposición a TAM (WT TAM,norte 6; Aceite MUT,norte 3;
MUT TAM,norte3). Existe una diferencia general en la expresión de miR-138 y miR-338 –3p en nervios de control y mutantes tratados con TAM o aceite (análisis de varianza de un factor,
pags7.54 105ypags0,0124, respectivamente). Las comparaciones por pares revelan que los niveles de miR-138 son significativamente más bajos en los nervios mutantes tratados con
TAM que en los nervios de control tratados con TAM (58,0 ± 4,7 %,pags0.0116), y los niveles de miR-338 –3p son significativamente más bajos en los nervios mutantes tratados con TAM
que en los nervios de control tratados con TAM (52.4 3.1%,pags 0,0111). En nervios iKO aplastados, los niveles de miR-138 y miR-338 –3p no fueron significativamente
diferente de los niveles en los nervios de control aplastados.mi, qRT-PCR análisis de expresión génica en control yDgcr8SN de iKO 11 semanas después de la exposición a TAM (WT,
norte8; MUT,norte3). Los genes relacionados con la mielina están regulados a la baja, mientras que los genes inmaduros y específicos de la denervación están regulados al alza en los
mutantes.F, análisis de inmunomarcaje de control yDgcr8iKO SN 11 semanas después de la exposición TAM, secciones longitudinales (WT,norte7; MUT,norte3). Los macrófagos,
marcados por F4/80, están alargados y orientados longitudinalmente en los nervios de control. Algunos macrófagos permanecen alargados en los nervios mutantes, mientras que
otros se han redondeado, lo que sugiere que se han convertido en macrófagos ameboides. Hay un aumento general en la tinción F4/80 en nervios mutantes (prueba de Wilcoxon-
Mann-Whitney, F4/80 área/unidad de área WT, med 0,0085, rango intercuartílico (IQR) 0,0084; MUT, med 0,0407, IQR 0,6520;pags0,0167). La imagen es una región deDgcr8iKO con
mayor tinción F4/80. Se observaron células CCND1-positivas ocasionales enDgcr8iKO.GRAMO, análisis de transferencia Western de la expresión de MBP, MPZ, p-ERK y p-AKT enDgcr8
iKO SN 10 semanas después de la inyección de TAM (norte3). La expresión no cambió en los nervios mutantes. Se usó tubulina como control de carga.
tronco nervioso en algunos animales que contiene de cuatro a seis fascículos en tratamientos se terminaron a las 11 semanas debido a SNC significativo
/
una sección transversal SN a la mitad del muslo (datos no mostrados). Aunque la deficiencias relacionadas (debido aPor favor::CreER
T actividad en oligo-
mielinización parecía en gran medida normal según el análisis de la distribución dendrocitos) (47, 76); es probable que un inducible específico del SNP Dgcr8
del tamaño de los axones y la relación g (grosor de la mielina), se observó una El experimento iKO, recolectado después de un período de tiempo más
cantidad significativa de axones que carecían de vainas de mielina, así como SC largo, habría mostrado una mayor proporción de SC defectuosas.
desmielinizantes.Dgcr8iKO (Fig. 5A-F). Aunque el número de SC patológicas fue La presencia de macrófagos se analizó con EM. Hubo una mayor
bajo en comparación con el número de SC de apariencia normal, es probable que presencia de macrófagos enDgcr8iKO (Fig. 5B). El análisis de
nuestros resultados sean una subestimación del fenotipo completo deDgcr8iKO inmunomarcaje reveló un aumento de la tinción F4/80 en regiones
debido a la naturaleza de mosaico de las deleciones de Cre inducibles por contenidas en todoDgcr8SN de iKO (Fig. 4F) mientras que la tinción
tamoxifeno. Además, nuestra experiencia F4/80 estuvo ausente en gran medida en áreas fuera de estos

regiones (datos no mostrados). La cuantificación del área positiva/unidad de aumento de la infiltración de macrófagos, lo que confirma queDgcr8es necesaria
área F4/80 reveló un aumento general en la tinción F4/80 enDgcr8 nervios para el mantenimiento de la mielina.
mutantes iKO (pags 0,05). Juntos, estos resultados sugieren Para examinar si la pérdida deDgcr8afecta la respuesta de las SC a la
esa ablación deDgcr8en SC adultos conduce a la degeneración de SC y lesión nerviosa, realizamos una cirugía simulada y aplastante enDgcr8

SN de iKO 8 semanas después de la exposición a TAM. Sorprendentemente, en el que muchas SC no han comenzado la mielinización en los controles. La
los niveles de miARN enDgcr8Los iKO en los nervios aplastados 2 semanas sobrerregulación de genes asociados a la denervación puede ocurrir debido
después de la cirugía eran indistinguibles de los niveles en los controles (Fig. a mecanismos autónomos o secundariamente debido a la pérdida de axones
4D). La reposición de miRNAs enDgcr8Los iKO después de la cirugía por o señales axonales. Varios genes específicos de denervación, comoShh,Gdnf,
aplastamiento probablemente se deban a la repoblación del nervio por SC yOlig1, son objetivos directos de JUN (82).jun parece estar regulado al alza en
recombinadas de forma incompleta y, por lo tanto, de tipo salvaje. Se ha Dgcr8cKO; es probable que la inducción de genes específicos de denervación
observado repoblación de este tipo en ablaciones en mosaico deDicer1 en enDgcr8mutantes requiere JUN a nivel transcripcional. Sin embargo, Jun
oligodendrocitos (77). Debido a este efecto de confusión significativo, no fue también está regulado al alza enEgr2mutantes nulos, lo que sugiere que
posible evaluar el papel deDgcr8en remielinización. otros factores también deben estar involucrados en la modulación de los
niveles de genes específicos de denervación enDgcr8mutantes
Discusión
Porquejunno es suficiente para explicar la elevación en la expresión
Para investigar si DGCR8 juega un papel en la regulación de la de genes asociados a la denervación, ¿cuáles pueden ser los posibles
mielinización SC y el mantenimiento de la mielina, eliminamos mecanismos por los cuales los genes denervados son inducidos en
condicionalmenteDgcr8en SC adultos y en desarrollo. En ambos
Dgcr8¿cKO e iKO? En primer lugar, varios miARN cuya expresión está
escenarios, se observó desrepresión de genes inmaduros y asociados a
muy reducida enDgcr8Se prevé que los cKO se dirijan directamente a
denervación (lesión), y se interrumpieron respectivamente la formación
genes específicos de denervación.Shhse predice bioinformáticamente
y el mantenimiento de mielina. Sin queDgcr8, las SC no pueden avanzar
que será el objetivo de miR-340 –5p,Gdnfse predice que será el objetivo
adecuadamente a través de las etapas de diferenciación o mantener su
de miR-9, miR-146b, miR-204 y miR-340 –5p, y se prevé que Olig1 será el
estado diferenciado en la edad adulta.
objetivo de miR-138 y miR-146b (Targetscan y MiRanda). La deficiencia
La pérdida de Dgcr8 altera el equilibrio entre los reguladores
en estos miARN canónicos probablemente subyace en parte a la
positivos y negativos de la mielinización y desreprime un programa de
desrepresión de genes específicos de denervación, comoShh,Gdnf, y
expresión génica asociado a la denervación—La diferenciación SC está
Olig1directamente en Dgcr8mutantes De hecho, un papel bien
sujeta al control de reguladores de mielinización tanto negativos como
reconocido de los miARN es funcionar como un mecanismo a prueba de
positivos (1, 6, 7, 62). El maestro regulador positivo de la mielinización,
fallas para eliminar el efecto de los niveles de transcripción de
Egr2, se asocia con coactivadores y correpresores para activar directa o
referencia (81, 83, 84). En segundo lugar, también es posible que el
indirectamente genes relacionados con la mielina, así como para
propio DGCR8 desestabilice directamente ciertos ARNm (85), y dichos
reprimir los reguladores negativos de la mielinización (12, 15, 20, 78,
objetivos se desreprimirían enDgcr8mutantes cKO. En tercer lugar, los
79). Egr2Las SC deficientes tienen una expresión aumentada de
genes asociados con la denervación pueden aumentar indirectamente
reguladores negativos y una expresión disminuida de reguladores
debido a la pérdida de axones o la recepción de señales axonales. A
positivos de mielinización y proteínas de mielina y se detienen en la
este respecto,Erbb2yErbb3están regulados a la baja enDgcr8KO
etapa de diferenciación promielinizante (15, 18).
Expresión deEgr2se reduce fuertemente enDgcr8cKO SC. De acuerdo nervios. Aunque no vemos una patología axonal evidente en P5, se ha
con esto,Dgcr8Los SC cKO muestran expresión génica y cambios informado degeneración de axones y unidades de axón-SC en Dicer1
fenotípicos similares a los que se encuentran enEgr2nulo y Dicer1cKO cKO SNs en P24 a través de tinción SMI32 (44). Curiosamente, Pereiraet
SC. Debido a que la sobreexpresión de ciertos reguladores negativos de al.(44) también encontró usando EM en serie que el mismo axón podría
la mielinización, comoMuesca1ymedias2, puede suprimir activamente estar agrupado, enganchado por un SC promielinizante, SC mielinizante
la actividad deEgr2(18, 22, 80), la desrepresión de los reguladores o SC desmielinizante enDicer1cKO SNs en P24 dependiendo del nivel
negativos de la mielinización debido a una deficiencia en los miARN del que se tomaron imágenes, lo que indica que la explicación de los
canónicos podría en parte ser la base de la detención del desarrollo mecanismos autónomos es más probable.
observada enDgcr8cKO. Varios miARN que se reducen en Dgcr8Se Comparación de fenotipos mutantes Dicer1 versus Dgcr8 en SC—Los
predice que los mutantes, como miR-138, miR146b y miR-34a, suprimen efectos de la deficiencia de miARN en varios sistemas se han estudiado
los reguladores negativos de la mielinización (28, 30, 81). Una utilizandoDgcr8yDicer1nocauts condicionales (46, 86, 87). Aunque
explicación alternativa del aumento en la expresión de genes DGCR8 y DICER1 son necesarios para la biogénesis de la mayoría de los
característicos de la etapa inmadura puede ser la comunicación miARN, sus knockouts condicionales pueden, curiosamente, exhibir
defectuosa entre el axón y el SC (ver más adelante). fenotipos similares o distintos. Por ejemplo, defectos enDicer1- yDgcr8
Encontramos expresión génica asociada a la denervación enDgcr8 -las células nulas de la piel son indistinguibles en los ratones (53).
mutantes pero no enEgr2mutantes nulos ya en P5, un punto de tiempo Debido a que la mayoría de los miARN que son
FIGURA 5.AlgunosDgcr8Los iKO no logran mantener la mielina.A, análisis semidelgado de control yDgcr8SN de iKO 11 semanas después de la exposición a TAM teñidas con azul de
toluidina, secciones transversales (WT,norte5; MUT,norte4). La mielinización es muy normal en los mutantes.B, análisis ultraestructural deDgcr8iKO SN 11 semanas después de la
exposición TAM con EM, secciones transversales (WT,norte5; MUT,norte4; WT no mostrado). Algunos macrófagos (metro) y SC desmielinizantes (Carolina del Sur) se observan en
mutantes así como axones sin vainas de mielina (*); los macrófagos se caracterizan por filopodios y citoplasmas oscuros que contienen mielina fagocitada, y las SC desmielinizantes se
caracterizan por vainas multilamelares, citoplasmas ricos en ribosomas y mielina fagocitada. Hay un mayor número de SC desmielinizantes enDgcr8 iKO (prueba de Wilcoxon-Mann-
Whitney, WT, med 0,0, rango intercuartil (IQR) 0,7; MUT, med 12,5, IQR 58,3;pags0,0159).C–F, control yDgcr8SN de iKO 10 semanas después de la exposición a TAM (WT,norte
7; MUT,norte 3).C, porcentaje (%) de axones en rangos de diámetro de axón (m). No hay diferencia significativa en el axón.
distribución de diámetro enDgcr8nervios iKO.D, diagrama de dispersión de la relación g (diámetro del axón/diámetro de la fibra)versusdiámetro del axón. La relación G se usa
ampliamente como un índice funcional y estructural de la mielinización axonal óptima. No hay diferencia significativa en la relación entre el diámetro del axón y el espesor de mielina
enDgcr8 nervios iKO.mi, razón g promedio. Cada punto de datos denota un animal. No hay una diferencia significativa en el espesor promedio de mielina enDgcr8nervios iKO.F,
porcentaje (%) de axones en rangos de cocientes g. No hay diferencia significativa en la distribución del espesor de mielina enDgcr8nervios iKO. Se obtuvieron resultados similares en
control yDgcr8SN de iKO 11 semanas después de la exposición a TAM (norte3, datos no mostrados).

abundantemente expresado en las células de la piel dependen de la modelos indicativos de que la presencia de nuevas especies de ARN no
función de DICER1 y DGCR8, los fenotipos similares de Dicer1-yDgcr8 codificantes, así como otras funciones importantes de DICER1 y DGCR8,
-los mutantes nulos probablemente se deban a una deficiencia en estos pueden dilucidarse aún más. Determinación de los sustratos deDgcr8y
miARN canónicos (53). Por el contrario, la ablación de Dicer1yDgcr8 Dicer1en SC arrojará luz no solo sobre la biología SC y la comunicación
durante la neurogénesis del prosencéfalo da como resultado distintos SC-axon, sino también sobre la maquinaria de la biología del ARN y el
fenotipos. En las primeras etapas de la neurogénesis del prosencéfalo repertorio de funciones reguladoras del ARN en la modulación de la
de los mamíferos, el complejo del microprocesador se une expresión génica durante la diferenciación y el mantenimiento celular.
directamente al ARNm de Neurog2 y lo desestabiliza. La ablación de
DGCR8 en este sistema estabiliza la expresión de tales genes
proneurales y conduce a una diferenciación precoz que no se ve en Contribuciones de autor—RA concibió y coordinó el estudio. H.-PL
Dicer1nocauts (85). De hecho, también se ha demostrado que los escribió el artículo. H.-PL e IO diseñaron, realizaron y analizaron los
miARN no canónicos dependientes de DICER1 e independientes de experimentos que se muestran en las Figs. 1– 4. LW y EH diseñaron,
DGCR8, como el shARN endógeno, el siARN, los mirtrons y el ARN realizaron y analizaron los experimentos que se muestran en la Fig. 5.
Todos los autores revisaron los resultados y aprobaron la versión final
pequeño derivado del ARN nucleolar pequeño H/ACA, sustentan
del manuscrito.
fenotipos que son más graves enDicer1nocauts que enDgcr8nocauts
(88 –90).
Agradecimientos—Parte de este trabajo fue realizado en el Centro de
ablaciónDgcr8yDicer1en el desarrollo de SC da como resultado
Microscopía Avanzada y el Laboratorio de Histología y Fenotipado de
defectos en su mayoría similares, aunqueDgcr8Los cKO tienen defectos Ratones de la Universidad de Northwestern, generosamente respaldado por
de clasificación SC más graves. Por el contrario, la ablaciónDgcr8en SC el Instituto Nacional del Cáncer, los Institutos Nacionales de Salud Cancer
maduros da como resultado una expresión génica desregulada y Center Support Grant P30 CA060553 (a la Robert H. Lurie Comprehensive
evidencia de patología SC. Aunque la expresión génica no se analizó en Cancer Centrar). Agradecemos a Courtney Williamson, al Dr. Lin Li, al Sr.
Dicer1iKOs, no se observó la presencia de SC defectuosos equivalentes Lennell Reynolds Jr. y al Dr. Wensheng Liu por su asistencia técnica. También
enDicer1iKO incluso 14 semanas después de la exposición a TAM (31), lo agradecemos a la analista estadística Amy Yang del Northwestern
que sugiere que la ruptura del mantenimiento de la mielina después de Biostatistics Collaboration Center y a Yannick Poitelon por su ayuda con
la ablación es específica deDgcr8cKO. Juntos, estos estudios introducen nuestros análisis estadísticos.
la posibilidad de queDgcr8yDicer1, además de procesar miARN
canónicos como una función principal, también puede tener Referencias
interacciones dispares con otros objetivos únicos de ARN pequeño y 1. Jessen, KR y Mirsky, R. (2005) El origen y desarrollo de las células gliales
ARNm que dan como resultado sus distintos fenotipos en el en los nervios periféricos.Nat. Rev. Neurosci.6,671– 682
mantenimiento de la mielina. 2. Monk, KR, Feltri, ML y Taveggia, C. (2015) Nuevos conocimientos sobre el
Los SC denervados activan un programa de expresión génica de desarrollo de células de Schwann.glía63,1376 –1393
3. Nave, KA (2010) Mielinización y soporte trófico de axones largos.Nat. Rev.
novo:Tradicionalmente, la diferenciación durante el desarrollo y la
Neurosci.11,275–283
desdiferenciación tras la lesión se consideran imágenes especulares del
4. Scherer, SS y Wrabetz, L. (2008) Mecanismos moleculares de las neuropatías
mismo proceso (6, 7); Las SC denervadas en los nervios lesionados se desmielinizantes heredadas.glía56,1578 –1589
consideran similares a las SC inmaduras en los nervios en desarrollo. 5. Nave, KA, Sereda, MW y Ehrenreich, H. (2007) Mecanismos de la enfermedad:
Sin embargo, las SC denervadas también procesan funciones neuropatías desmielinizantes heredadas, desde la investigación básica hasta
adicionales de guía de axones, ruptura de mielina y reclutamiento de la clínica.Nat. clin. Practica Neurol.3,453– 464
6. Jessen, KR y Mirsky, R. (2008) Regulación negativa de la mielinización:
macrófagos (6, 91). Recientemente, se ha demostrado que la regulación
relevancia para el desarrollo, lesiones y enfermedades desmielinizantes.glía
negativa de los reguladores negativos de la mielinización comojun 56, 1552-1565
puede ser prescindible durante el desarrollo pero necesario para la 7. Mirsky, R., Woodhoo, A., Parkinson, DB, Arthur-Farraj, P., Bhaskaran,
activación de genes asociados a la denervación (72, 92). No estaba claro A. y Jessen, KR (2008) Señales novedosas que controlan el desarrollo, la mielinización
en este conjunto de datos si los genes específicos de denervación se y la desdiferenciación de las células de Schwann embrionarias.J. Periférico. Nerv. sist.
13,122–135
expresaron en el linaje SC durante el desarrollo. Nuestra Shh::CreEl
8. Bondurand, N., Girard, M., Pingault, V., Lemort, N., Dubourg, O. y Goossens, M. (2001)
análisis de linaje indica que los genes asociados a la denervación, como
Conexina 32 humana, una proteína de unión gap alterada en la forma ligada a X de
Shhno son detectables durante el desarrollo de SC y realmente la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, está directamente regulada por el factor de
representan unde novoel programa de expresión génica se activa sólo transcripción SOX10.Tararear. mol. Gineta.10,2783–2795
tras la lesión del nervio. Nuestros resultados también demuestran que 9. Musso, M., Balestra, P., Bellone, E., Cassandrini, D., Di María, E., Doria,
laShh::Crecepa puede ser una herramienta útil para la ablación LL, Grandis, M., Mancardi, GL, Schenone, A., Levi, G., Ajmar, F. y Mandich,
P. (2001) La mutación D355V disminuyeEgr2unión a un elemento dentro
inducible de genes específicamente después de la denervación.
del promotor Cx32.Neurobiol. Dis.8,700 –706
DICER1 y DGCR8 son componentes importantes de la ruta de
10. Parkinson, DB, Dickinson, S., Bhaskaran, A., Kinsella, MT, Brophy, PJ, Sherman, DL,
biogénesis de miARN. Es lógico suponer que noquearDicer1yDgcr8 Sharghi-Namini, S., Duran Alonso, MB, Mirsky, R. y Jessen, KR ( 2003) La regulación
dará como resultado el mismo fenotipo, y esto ha sido demostrado del gen de la mielina periaxina proporciona evidencia de la señalización relacionada
en algunos estudios (53). Sin embargo, otros estudios hasta la con la mielina independiente de Krox-20 en las células de Schwann.mol. Celda.
fecha han demostrado lo contrario en varios sistemas (85, 88-90). Neurosci.23,13–27

11. Taveggia, C., Pizzagalli, A., Fagiani, E., Messing, A., Feltri, ML y Wrabetz, L. (2004)
Nuestros datos, en comparación con la literatura publicada sobre
Caracterización de un potenciador de células de Schwann en el gen de la proteína
Dicer1mutantes (28), señalan el hecho de queDgcr8 yDicer1, básica de mielina.J. Neuroquímica.91,813– 824
además de su papel en la biogénesis de miARN, también puede 12. LeBlanc, SE, Jang, SW, Ward, RM, Wrabetz, L. y Svaren, J. (2006) Regulación
tener algunas funciones distintas. Es a través de tal comparación directa de la expresión cero de proteína de mielina por elEgr2transacción

vatorJ. Biol. química281,5453–5460 (2012) Regulación del desarrollo de la expresión de microARN en células de
13. LeBlanc, SE, Ward, RM y Svaren, J. (2007) Neuropatía asociada Egr2mutantes Schwann.mol. Celda. Biol.32,558 –568
interrumpen la activación cooperativa de la proteína cero de mielina por Egr2 33. Yu, B., Zhou, S., Wang, Y., Ding, G., Ding, F. y Gu, X. (2011) Perfil de los microARN
y Sox10.mol. Celda. Biol.27,3521–3529 después de la lesión del nervio ciático en ratas por secuenciación profunda:
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Subunidad del complejo del microprocesador Síndrome de DiGeorge Región

Fondo:Dgcr8regula el procesamiento primario de miARN en el núcleo.

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fecha han demostrado lo contrario en varios sistemas (85, 88-90). Neurosci.23,13–27

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