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Moléculas2013,18, 6852-6865; doi:10.3390/moléculas18066852

ACCESO ABIERTO

moléculas
ISSN 1420-3049
www.mdpi.com/journal/molecules
Artículo

Aplicación y Análisis del Método Folin Ciocalteu para la

Determinación del Contenido Fenólico Total de Limonium
Brasiliensel.
Andressa Blainski, Gisely Cristiny Lopes y João Carlos Palazzo de Mello *

Programa de Postgrado en Ciencias Farmacéuticas, Universidad Estatal de Maringá,

Av. Colombo, 5790, BR-87020-900, Paraná, Brasil; Correos electrónicos: andr [email protected] (AB)
[email protected] (GCL)

* Autor a quien debe dirigirse la correspondencia; Correo electrónico: [email protected] ;

Tel.: +55-44-3011-4816; Fax: +55-44-3011-5050.

Recibido: 1 de abril de 2013; en forma revisada: 1 de junio de 2013 / Aceptado: 6 de junio de 2013 /

Publicado: 10 de junio de 2013

Abstracto:limonium brasileñoEs una planta común en la costa sur de Brasil. Las raíces se utilizan
tradicionalmente para el tratamiento del síndrome premenstrual, trastornos menstruales e
infecciones genitourinarias. En las décadas de 1980 y 1990 se comercializaron en Brasil preparados
farmacéuticos obtenidos de sus raíces y utilizados con estos fines. Actualmente, la Agencia
Brasileña de Medicamentos (Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria, ANVISA) canceló el registro
de estos productos y su uso fue discontinuado por falta de estudios que caractericen la materia
prima vegetal y garanticen la eficacia y seguridad de su uso. El objetivo del presente estudio fue
desarrollar y validar un método analítico para determinar el contenido de polifenoles totales (TP)
en un extracto deL. brasileñoraíces, por el método espectrofotométrico UV/Vis.L. brasileñolas
raíces se extrajeron en acetona:agua (7:3, v/v-10% p/v). El extracto crudo se utilizó para desarrollar
un método para el ensayo de TP. El método fue validado según directrices nacionales e
internacionales. Las condiciones óptimas para el tiempo de análisis, la longitud de onda y la
sustancia estándar fueron 30 min, 760 nm y pirogalol, respectivamente. En estas condiciones, la
validación mediante espectrofotometría UV/Vis demostró que el método es lineal, específico,
preciso, exacto, reproducible, robusto y fácil de realizar. Esta metodología cumple con los
requisitos de aplicación analítica y para asegurar la confiabilidad de los resultados.
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Palabras clave:limonium brasileño; optimización de metodología; polifenoles totales; validación

espectrofotométrica UV/Vis; Folin-Ciocalteu

1. Introducción

Los fenólicos incluyen fenoles simples, ácidos fenólicos (derivados del ácido benzoico y cinámico), cumarinas,
flavonoides, estilbenos, taninos hidrolizables y condensados, lignanos y ligninas. Estos compuestos se encuentran
entre los metabolitos secundarios más presentes en el reino vegetal y actúan principalmente como fitoalexinas,
atrayentes para los polinizadores, contribuyentes a la pigmentación de las plantas, antioxidantes y agentes
protectores contra la luz ultravioleta, entre otros [1]. Entre las muchas variedades de compuestos fenólicos naturales,
las procianidinas son un subgrupo importante. Estas sustancias están compuestas de oligómeros y polímeros que
constan de unidades de catequina y/o epicatequina unidas principalmente a través de C4.→C8 y/o C4→Bonos C6 (tipo
B). Las unidades de flavan-3-ol pueden estar doblemente unidas por un C4→Enlace C8 y/o un enlace éter adicional de
O7→C2 (tipo A) [2,3].
Aunque la determinación cuantitativa de polifenoles se ve obstaculizada por su complejidad y diversidad estructural, se

han utilizado varios métodos para determinar los polifenoles en extractos de plantas [4-7]. Suponiendo que la cuantificación

de polifenoles individuales no revela adecuadamente la proporción de procianidinas poliméricas, entonces la

espectrofotometría en la región ultravioleta puede ser una herramienta útil para ayudar a resolver este problema [8,9].

Las reacciones colorimétricas se utilizan ampliamente en el método espectrofotométrico UV/VIS, que es fácil de realizar, rápido y aplicable en el uso rutinario

de laboratorio, y de bajo costo [10]. Sin embargo, es importante que el ensayo colorimétrico necesite utilizar una sustancia de referencia, luego este método mide

la concentración total de grupos hidroxilo fenólicos en el extracto de la planta. Los polifenoles en extractos de plantas reaccionan con reactivos redox específicos

(reactivo de Folin-Ciocalteu) para formar un complejo azul que puede cuantificarse mediante espectrofotometría de luz visible [11]. El método Folin-Ciocalteu se

describe en varias farmacopeas [12,13]. La reacción forma un cromóforo azul constituido por un complejo fosfotungsticofosfomolibdeno [11,14], donde la máxima

absorción de los cromóforos depende de la solución alcalina y de la concentración de compuestos fenólicos [11]. Sin embargo, este reactivo se descompone

rápidamente en soluciones alcalinas, lo que hace necesario utilizar un enorme exceso del reactivo para obtener una reacción completa. Este exceso puede

provocar precipitados y alta turbidez, lo que imposibilita el análisis espectrofotométrico. Para solucionar este problema, Folin y Ciocalteu incluyeron sales de litio

en el reactivo, lo que evitó la turbidez [15]. La reacción generalmente proporciona datos precisos y específicos para varios grupos de compuestos fenólicos, porque

muchos compuestos cambian de color de manera diferente debido a diferencias en la unidad de masa [16] y la cinética de reacción [15]. Para solucionar este

problema, Folin y Ciocalteu incluyeron sales de litio en el reactivo, lo que evitó la turbidez [15]. La reacción generalmente proporciona datos precisos y específicos

para varios grupos de compuestos fenólicos, porque muchos compuestos cambian de color de manera diferente debido a diferencias en la unidad de masa [16] y

la cinética de reacción [15]. Para solucionar este problema, Folin y Ciocalteu incluyeron sales de litio en el reactivo, lo que evitó la turbidez [15]. La reacción

generalmente proporciona datos precisos y específicos para varios grupos de compuestos fenólicos, porque muchos compuestos cambian de color de manera

diferente debido a diferencias en la unidad de masa [16] y la cinética de reacción [15].

Muchos estudios han discutido el uso del reactivo de Folin-Ciocalteau para determinar polifenoles y el valor
general o específico del método, porque algunos detalles específicos pueden modificarse [9,14,17,18].
limonium brasileño(Boiss.) Kuntze (Plumbaginaceae) es una hierba perenne que se encuentra en Argentina,
Uruguay y la costa sur de Brasil. Se le conoce popularmente en Brasil como “baicuru” o “guaicuru”, y se utiliza
tradicionalmente para tratar el síndrome premenstrual, trastornos menstruales e infecciones genitourinarias
[19-21]. Preparaciones farmacéuticas obtenidas de sus raíces y utilizadas para
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estos fines se comercializaron en Brasil en las décadas de 1980 y 1990 [22,23]. Actualmente, la Agencia
Brasileña de Medicamentos (Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria, ANVISA) canceló el registro de estos
productos y su uso fue discontinuado por falta de estudios que caractericen la materia prima vegetal y
garanticen la eficacia y seguridad de su uso.
Los pocos estudios deL. brasileñodescriben sus actividades biológicas, incluyendo bacteriostática,
antiinflamatoria y antioxidante, las cuales se relacionaron con la presencia de taninos condensados e
hidrolizables, leucoantocianinas, flavonoides, β-sitosterol, saponinas y cumarina en los extractos
evaluados [20-24].
Este informe describe el primero de una serie de estudios químicos deL. brasileño, encaminado a
caracterizar el fármaco vegetal y estandarizar y normalizar el contenido de polifenoles en los extractos.
Este estudio aborda la optimización de un método para la determinación de polifenoles totales y una
evaluación de posibles variaciones del método Folin-Ciocalteau aplicado al extracto crudo.

2. Resultados y Discusión

2.1. Optimización del método

Según Glasl [16], cada planta tiene una composición química característica, con grupos fenólicos uniformes
presentes en una misma especie. Estructuras químicas similares pueden mostrar las mismas interacciones químicas
con reactivos específicos durante la reacción [16]. Todas las sustancias de referencia utilizadas muestran
aproximadamente los mismos espectros que el CE deL. brasileño, por lo que no es posible determinar el mejor
compuesto de referencia para este extracto mediante sus espectros (Figura 1).

Figura 1.Espectros de absorción (400 a 900 nm) de compuestos de referencia (ácido gálico, ácido
tánico, catequina y pirogalol) y CE deL. brasileñopor reacción de Folin-Ciocalteu después de 30 min.
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El aumento porcentual en la absorbancia de cada solución se comparó en las longitudes de onda de 691,
715, 760 y 800 nm. El análisis estadístico indicó un aumento significativo en la absorbancia a 760 nm en
comparación con los datos de 691 y 715 nm para todas las soluciones (ácido gálico, F60.3= 1.081,9,PAG<0,001;
ácido tánico, F60.3= 1.213,8,PAG<0,001; catequina, F60.3= 1.033,2,PAG<0,001; pirogalol, F60.3= 1.337,4, PAG<0,001;
CE deL. brasileño, f60.3= 4.910,0,PAG<0,001). La absorbancia a 800 nm fue mayor que en las otras longitudes de
onda; sin embargo, este aumento no fue estadísticamente significativo para la relación a 760 nm, lo que
sugiere que este parámetro es estable, según lo determina la Farmacopea Europea.
Utilizando la longitud de onda de 760 nm, que parecía ser la más adecuada para producir la máxima
absorción de las sustancias en estudio, el siguiente paso fue determinar la cinética de la reacción con
respecto al período de tiempo anterior a la medición espectrofotométrica. Se determinó el aumento en el
porcentaje de absorbancia de cada solución con respecto a los períodos de tiempo de 10, 20, 30 y 40 min.
Estos datos mostraron que la reacción de Folin-Ciocalteu fue estable durante el período analizado, ya que
después de 30 min la absorbancia aumentó menos del 5% del valor a los 10 min, y no disminuyó entre 30
y 40 min. El análisis estadístico no indicó diferencias significativas en relación al momento (ácido gálico, F
8.3= 0,0108,PAG=0,9983; ácido tánico, F8.3= 0,0483,PAG=0,9849; catequina, F8.3= 0,0042, PAG=0,9996;
pirogalol, F8.3= 0,0630,PAG=0,9777). Estos resultados sugirieron un período de 30 min para la medición
espectrofotométrica de la CE.

Figura 2.Estructuras químicas de compuestos de referencia: (1) ácido gálico (C7h6oh5), (2)
catequina (C15h14oh6), (3) pirogalol (C6h6oh3) y (4) ácido tánico (C76h52oh46).

Con respecto al estándar, se observaron diferentes absortividades específicas (760 nm; 30 min).
para cada compuesto de referencia: A1% ácido gálico= 970,8 ± 31,46; A1% ácido tánico= 830,0 ± 39,29;
A1% catequina= 1.188,7 ± 62,50 yA1% pirogalol= 1.551,8 ± 93,95. Estos resultados mostraron que la intensidad
de la reacción de compuestos fenólicos con el reactivo de Folin-Ciocalteu sigue el principio clásico de relación
estructura-actividad, en el que el orden de actividad es proporcional a la disponibilidad de grupos hidroxilo
presentes en el anillo aromático e influenciados por grupos que pueden disminuir o aumentar la potencial
reductor de la molécula [25]. De las sustancias en este estudio (Figura 2), el pirogalol tiene
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el mayor número de grupos hidroxilo proporcional a su masa molar. Además, el pirogalol tiene un solo anillo y
ningún grupo sustituido, formando una estructura tridimensional con un hidroxilo que está menos influenciado por
interacciones electrónicas como los efectos estéricos o de resonancia. Por lo tanto, el pirogalol tiene la mayor
absortividad específica y es probablemente la mejor sustancia de referencia para la determinación de TP. Además, el
pirogalol representa indirectamente el potencial de reducción del fármaco vegetal, considerando la disponibilidad
total de hidroxilos unidos al anillo aromático. El método fue optimizado para una extracción de Caesalpinia
peltophoroidesBenth., y se obtuvieron resultados similares [18].

2.2. TP de CE de L. brasiliense y Curva de Calibración del Estándar de Pirogalol

La ecuación de calibración fue y = 0,14073x + 0,0044 (n = 5, rdos= 0,996) para pirogalol. Las desviaciones estándar

relativas (RSD) de las pendientes fueron ≤5% para el analito (n = 5). La Tabla 1 muestra los cálculos de ajuste posterior para

los datos de la curva para el estándar utilizado en las ejecuciones de validación, así como la precisión y exactitud de los
cálculos de ajuste posterior.
La absortividad específica es la absorbancia de una solución en una concentración de 1 g/100 ml
(1%-10.000 µg/ml). La absortividad específica del pirogalol se calculó mediante la ecuación lineal (y =
0,14073x + 0,0044), obteniendo un valor de 1,407,3. Por lo tanto, la absorbancia media para CE de
L. brasileñofue (0,550 ± 0,03 [5,38]), y el TP expresado como pirogalol fue del 23,5%.

2.3. Linealidad

Según el análisis de regresión lineal ponderado 1/x, las respuestas para la CE en rangos de concentración
relacionados fueron lineales (Figura 3). Los datos obtenidos en la prueba de linealidad para CE y pirogalol aparecen
en la Tabla 1.

Figura 3.absorciónversuscurva de concentración en el análisis de TP en CE de

L. brasileño; linealidad (6,40 a 26,88 µg/ml).
1.000

0.900

0.800

0.700
Absorción (nm)

0.600

0.500

0.400

0.300

0.200

0.100

0.000
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00

Concentración (μg/mL)
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Tabla 1.Datos estadísticos para las ecuaciones de regresión de la curva de calibración para pirogalol, y prueba de linealidad y prueba de especificidad para TP de
CE deL. brasileño.

Análisis de regresión Curva de calibración para pirogalol Prueba de linealidad para CE Prueba de especificidad para CE

Pendiente (SE) 0,1407 (0,00225) 0,029 (0,00040) 0,031 (0,00030)

Intercepción (SE) 0,0044 (0,0078) 0,046 (0,00010) 0,133 (0,0008)
Coeficiente de regresión (Rdos) 0.996 0.996 0,997
Valor F calculado (valor F crítico) 3,30 (3,71) 0,26 (3,71) 1,12 (3,71)
Suma de error puro 0.0990 0.0012 0.0009
Error de falta de ajuste 0.0097 0.0010 0.0008
Análisis de varianza F1.13= 3901,2,PAG<0.001 F1.13= 3999,8,PAG<0.001 F1.13= 5880,8,PAG<0.001
CL 0,1359; 0,1456 0,0286; 0.0307 0,0303; 0.0320
Intercepción CL − 0,0125; 0.0213 0,0284; 0.0652 0,1173; 0.1491
SE = error estándar; CL = límite de confianza
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2.4. Especificidad

El análisis de los resultados de la prueba de especificidad indicó que las condiciones fueron satisfactorias (Tabla 1).
En el caso de matrices complejas, si la matriz sin el analito no está disponible, los efectos del sistema matricial pueden
probarse comparando las pendientes de linealidad y especificidad [26-28]. Si las curvas son paralelas, podemos
afirmar que el método es específico [27]. La especificidad del método para CE se confirmó superponiendo las curvas
analíticas (Figura 4), porque las pendientes de las ecuaciones lineales (linealidad y especificidad, ver Tabla 1) eran muy
similares (aproximadamente 6,5% de diferencia).

Figura 4.Curva de linealidad y curva de especificidad, con coeficiente de correlación (Rdos) y

ecuación lineal, para TP de CE deL.brasiliense.

1.200

1.000 y = 0,0311x + 0,1332

R² = 0,9978

0.800
Absorbancia (uA)

0.600
Especificidad

Linealidad

0.400 y = 0,0297x + 0,0468

R² = 0,9968

0.200

0.000
0 5 10 15 20 25 30
Concentración (μg/mL)

2.5. Límites de detección y cuantificación

El rango de cuantificación fue de 3,68 a 26,88 µg/mL (absorbancia de 0,105 a 0,834), debido a que se
mantuvo la linealidad (Rdos= 0,996). Según la ecuación lineal de la prueba de linealidad, el LOQ fue de 3,34 µg/
ml. Según la ley de Lambert-Beer, para una determinada concentración de la muestra, la absorbancia no es
proporcional a la concentración [29]. El LOD fue de 1,84 µg/ml (absorbancia de 0,055), porque hubo una
diferencia significativa entre esta concentración y la siguiente concentración más baja (0,92 µg/ml; t1.4= −5,7,
PAG<0,001). Según la ecuación lineal de la prueba de linealidad, el LOD fue de 1,0 µg/ml. El LOD y LOQ
determinados por la ecuación lineal dieron resultados diferentes a los observados experimentalmente. Estas
diferencias sugieren ser mediante regresión lineal a partir de la curva de linealidad proporcionando un
resultado satisfactorio, que reduce la desviación estándar de layinterceptar, que es directamente proporcional
a ambos límites. La determinación experimental puede verse afectada por otros factores que interfieren, como
la manipulación humana y las diferencias en las condiciones estándar entre laboratorios.
Moléculas2013,18 6859

2.6. Precisión

La repetibilidad y la precisión intermedia para CE fueron 0,552 ± 0,027 [4,98%] y 0,530 ± 0,003
[0,65%], respectivamente, sin diferencias significativas entre ellas (t1.7= 1,34, PAG=0,22). Por
tanto, el método propuesto es suficientemente preciso.

2.7. Exactitud

El resultado de la prueba de precisión arrojó un porcentaje de recuperación de 101,6, 90,2 y 89,9%,

respectivamente, para los niveles más bajo, intermedio y más alto. Estos porcentajes estaban dentro del rango
del 85% al 115% establecido en los informes publicados. Esto indica que el método tiene buena precisión para
determinar TP en CE a partir deL. brasileño.

2.8. Robustez

El cambio en NadosCO3La concentración en el ensayo de robustez tuvo en cuenta datos de la

literatura: 7,5% en la Farmacopea Brasileña [12], 14:05% en Glasl [16] y 10,75% en la Farmacopea
Europea [13]. Los valores de absorbancia medidos después de cambiar el NadosCO3la concentración y
la incidencia de la luz natural en la reacción de Folin-Ciocalteu fueron 0,530 ± 0,01 [1,82%]; 0,530 ±
0,005 [0,89%] y 0,531 ± 0,01 [1,81%], respectivamente, sin protección de la luz; EndosCO3
solución al 7,5% (p/v); y nadosCO3solución 14,06% (p/v); pH 11,0 para ambas soluciones. La comparación de
estos resultados con los obtenidos en el ensayo de linealidad no indicó diferencias significativas entre las
medias (F3.8= 4,2,PAG=0,05). Sin embargo, hubo una tendencia para las condiciones propuestas y validadas por
el método [protección de la luz y NadosCO3solución 10,75% (p/v)].

3. experimentales

3.1. Estándares y productos químicos

Todos los productos químicos eran de grado reactivo analítico y el agua estaba destilada. Los productos
químicos incluían acetona (Synth®, Diadema, Brasil), 2norteReactivo de Folin-Ciocalteu (Dinámica®, Diadema,
Brasil), carbonato de sodio anhidro (Synth®), pirogalol (Fluka, St. Louis, MO, EE. UU.), ácido gálico (Sigma-Aldrich
®, St. Louis, MO, EE. UU.), ácido tánico (Acros) y catequina (Sigma-Aldrich).

3.2. Material vegetal

raíces deL. brasileñofueron recolectados en Rio Grande, estado de Rio Grande do Sul, Brasil (S 32° 09'
22''/W 52° 06' 01'') en mayo de 2006. Un espécimen comprobante fue depositado en el Herbario de la
Universidad Federal de Río Grande con el número HURG-004208. IBAMA-SISBIO autorizó esta colección
bajo licencia otorgada a João Carlos Palazzo de Mello (n° 11995-2, 05/07/2007).

3.3. Extracción

El material vegetal se lavó con agua para eliminar la tierra, se secó en estufa de aire circulante (37 ± 2 °C) y
se pulverizó en un molino de martillos (Tigre ASN-5; diámetro medio 0,42 mm). Las raíces molidas (630 g)
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se extrajeron en 6,3 L de acetona:agua 7:3 (v/v) mediante turboextracción (Ultra-Turrax®, ika®Works,

Wilmington, Carolina del Norte, EE. UU., UTC 115KT, 30 min, <40°C). A continuación, la solución extractiva
se filtró, se lavó con 7,2 L de acetona:agua 7:3 (v/v), se concentró en un rotavapor a presión reducida, se
liofilizó (Martin Christ Alpha 1-4) para producir un extracto crudo (CE, 272 g) y se almacena a -20 °C.

3.4. Optimización y estandarización de métodos para la determinación de polifenoles totales (TP)

Para la optimización y estandarización del método espectrofotométrico utilizando el reactivo de Folin-

Ciocalteau, se analizaron tres parámetros: (1) cinética de reacción, (2) longitud de onda de máxima absorción y
(3) el estándar que mejor caracteriza la CE deL. brasileño. El método utilizado para la prueba fue un ensayo
colorimétrico, basado en los procedimientos generales recomendados por la Farmacopea Europea [9] para la
determinación de taninos totales, con ligeras modificaciones. Se utilizó una solución de carbonato de sodio
anhidro al 10,75%, correspondiente al 29% de carbonato de sodio decahidratado.
Para la selección de un estándar químico de referencia, se prepararon soluciones madre de cada estándar (ácido
gálico, ácido tánico, catequina y pirogalol, 20 µg/mL) y CE (300 µg/mL) en agua destilada. Se transfirieron dos
mililitros de cada solución a un matraz volumétrico de 25 ml que contenía agua destilada (10 ml) y reactivo de Folin-
Ciocalteu (1 ml) [9]. El volumen se completó con carbonato de sodio anhidro al 10,75% (p/v), lo que resultó en
concentraciones finales de 1,6 µg/mL de cada estándar y 24 µg/mL de CE. Las muestras se escanearon en un
espectrofotómetro UV/Vis (Shimadzu PC-1650, Kyoto, Japón) comenzando de 10 a 40 minutos después de la adición
de la solución de carbonato de sodio, y escaneando de 400 a 900 nm a intervalos de 2 minutos entre cada lectura. ,
para determinar los espectros. Se utilizó agua destilada como blanco, con una celda de cuarzo (longitud de
trayectoria de 1 cm).
La reacción cinética se evaluó (ANOVA) comparando el porcentaje de aumento en la absorbancia de
cada solución, para las longitudes de onda de 691 [16], 715 [13], 760 [12] y 800 nm. Este aumento
porcentual se calculó dividiendo la diferencia de absorbancia entre dos longitudes de onda por la
absorbancia media de la longitud de onda más corta y multiplicando por 100.
Los tiempos de reacción se observaron y compararon estadísticamente, utilizando el porcentaje de aumento entre
los tiempos de reacción (10, 20, 30 y 40 min) a 760 nm. La absortividad específica de cada estándar se calculó con
base en la Ley de Lambert-Beer [29].

3.5. Validación del método analítico

Para la validación del método analítico se utilizaron las directrices establecidas por la ICH (Conferencia
Internacional sobre la Armonización de Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos
de Uso Humano) y por la norma brasileña RE nº 899/2003 de ANVISA [28,30] .

3.6. Método para análisis TP de CE de L. brasiliense y curva de calibración del estándar de pirogalol

Todas las operaciones de extracción y dilución se protegieron de la luz.Soluciones CE: el CE (26,0 mg)
se transfirió a un matraz volumétrico de 25 ml y se diluyó con agua, y 5 ml de esta solución madre de CE
se diluyeron a 25 ml con agua. Luego se preparó una mezcla con 2 mL de esta solución, 1 mL de 2norte
reactivo de Folin-Ciocalteu y 10 ml de agua, y se diluyó volumétricamente a 25 ml con carbonato de sodio
anhidro al 10,75 % p/v (p/v).Después de 30 min, se midió la absorbancia a 760 nm, usando agua.
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como líquido de compensación y una celda de cuarzo (longitud de paso de 1 cm) en un espectrofotómetro
UV-Vis. Curva de calibración: En tres réplicas, se disolvieron 50,0 mg de pirogalol en agua,
inmediatamente antes de su uso, y se diluyeron a 25 ml. Se diluyeron alícuotas de 1,0, 1,75, 2,5, 3,25 o 4,0
ml hasta 25 ml en agua, y alícuotas de 5,0 ml de estas soluciones se diluyeron aún más hasta 25 ml
(solución madre). Cada solución madre se preparó según el procedimiento descrito anteriormente para la
CE. Las concentraciones finales fueron 1,28, 2,24, 3,20, 4,16 o 5,12 µg/mL de pirogalol..La absorbancia se
midió en las mismas condiciones que para el CE. La absortividad específica se determinó a partir de la
ecuación lineal. El TP expresado como pirogalol de la CE deL. brasileñose calculó mediante la Ecuación (1):

TP = 1562,5 A/A1%metro (1)

donde A = Absorbancia de la muestra para TP; A1%= Absortividad específica del pirogalol; m = masa de la
muestra examinada, en gramos; 1562,5 = factor de dilución de la muestra.

3.7. Linealidad

Para establecer la linealidad del método propuesto, se prepararon cinco soluciones madre, en tres
réplicas, a partir de 10,0, 18,0, 26,0, 34,0 o 42,0 mg de EC. Se obtuvieron concentraciones de 6,40, 11,52,
16,64, 21,76 y 26,88 µg/mL.

3.8. Especificidad

La especificidad se determinó añadiendo 1 ml de una solución de pirogalol (1,0 mg/ml) a cada solución madre
descrita en la prueba de linealidad. El método se considera específico si las pendientes de las ecuaciones lineales en
las pruebas de linealidad y especificidad son iguales o muy similares.

3.9. Límites de detección y cuantificación

Los límites de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) se calcularon a partir de la relación

entre la desviación estándar (SD) de la linealidad CE y la pendiente, utilizando el
multiplicador apropiado. Estos resultados se compararon con el LOD y LOQ obtenidos por
extensión de la curva de linealidad de CE: se preparó una solución madre, en tres réplicas,
de CE (4,56 mg/mL) y alícuotas de 5,0, 3,7, 2,4, 2,1, 0,2. , 0,1, 0,05 y 0,025 ml se diluyeron, por
separado, hasta 25 ml. Se preparó una mezcla de reacción como se describe en el método
TP, con 2 ml de cada solución. Los resultados, junto con los resultados de linealidad, fueron
sometidos a análisis estadístico. El rango de cuantificación se determinó en base a las
concentraciones más bajas y más altas que mantuvieron la linealidad.

3.10. Precisión

Se evaluaron dos niveles: repetibilidad (intradiario) e intermedia (interdiario). La repetibilidad se evaluó

utilizando seis muestras de 26,0 mg de EC y el nivel intermedio se evaluó utilizando tres muestras y en al
menos dos días diferentes. Se consideró inaceptable un coeficiente de variación superior al 15% y una
diferencia significativa entre días.
Moléculas2013,18 6862

3.11. Exactitud

La precisión se evaluó utilizando diferentes niveles de concentración: concentración más baja (LC),
concentración intermedia (IC) y concentración más alta (HC), luego de la adición de 1, 2 o 3 ml de solución
de pirogalol (1 mg/mL) al CE. solución madre, en tres repeticiones. La precisión se evaluó como el
porcentaje de recuperación, que se calculó a partir de la Ecuación (2):

A.100
% recuperación =
At (dos)

donde A = absorbancia de la muestra después de la adición del estándar; At= absorbancia teórica
calculada para la suma de la absorbancia de CE deL. brasileñoy la absorbancia esperada de pirogalol,
según la curva de calibración para cada nivel. El método se considera exacto si los porcentajes de
recuperación están entre 85% y 115%.

3.12. Robustez

La robustez se demostró analizando la estabilidad de la solución bajo la influencia de la luz

natural y un rango de cambios de pH (soluciones de carbonato de sodio anhidro al 7,5 y 14,06% (p/v),
evaluada en tres réplicas.

3.13. Análisis estadístico

Los datos fueron analizados por el programa Statistica.®8.0 (StatSoft, Inc., Tulsa, OK, EE. UU., 1984–2007) mediante
análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey, considerandoPAG<0,05 como
significativo. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar [desviación estándar relativa (%)]. Las
pruebas de correlación lineal y análisis de residuos se realizaron mediante regresión lineal simple, considerando Rdos
igual o superior a 0,98, y se evaluó la suma de cuadrados residual.

4. Conclusiones

Tras la optimización de las condiciones para la determinación espectrofotométrica de fenólicos utilizando el

reactivo de Folin-Ciocalteu, todos los parámetros analizados mostraron resultados adecuados. El método
espectrofotométrico UV-Vis descrito aquí fue validado con éxito como adecuado para la determinación de TP de
CE a partir deL. brasileño. Esta metodología que utiliza la reacción de Folin-Ciocalteu cumple con los requisitos
de uso analítico y para garantizar la confiabilidad de los resultados.

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen el apoyo financiero de CAPES, FINEP, CNPq, INCT_if y Fundação
Araucária. Se agradece la asistencia técnica brindada por A. Arantes y CR Novello. Se
agradece a Janet W. Reid, JWR Associates, Trumansburg, Nueva York, por la revisión en
inglés.
Moléculas2013,18 6863

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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Disponibilidad de muestras: Los autores tienen disponibles muestras de los extractos.

© 2013 por los autores; licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso
abierto distribuido bajo los términos y condiciones de la licencia Creative Commons Attribution
(http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/).