Caracas, 23 de mayo de 2016

Microbiología de Alimentos.
Microorganismos indicadores, Aerobios Mesófilos, Coliformes y
Enterococos.
Calanche P., Joely C. - C.I.-V-20.615.586
Turipe M., Sol M. - C.I.-V-20.875.653
Profesor: Rosa Raybaudi
Escuela de Biología. Facultad de Ciencias. Universidad Central de Venezuela.
[email protected]
[email protected]

INTRODUCCIÓN

La calidad microbiológica de los alimentos es fundamental porque influye en su

conservación y vida de anaquel y, sobre todo, porque los microorganismos presentes en ellos,
pueden ser causantes de enfermedades transmitidas por alimentos ó ETA’s (en inglés se
denominan “foodborne illness” ó FBI).

La detección en el laboratorio de los microorganismos patógenos puede ser muy

complicada, muy lenta y/o muy costosa para determinaciones rutinarias. Además, es concluyente
cuando se encuentra un microorganismo patógeno pero puede haber casos en que no se detecte
por razones circunstanciales como el clima o la cantidad de individuos infectados que están
contaminando, a pesar de que el manejo del alimento implique el riesgo de que el patógeno
aparezca en cualquier momento (Camacho A. y col., 2009). En todo caso, la investigación de
microorganismos patógenos en alimentos no facilita un enfoque preventivo.

Por esas razones, las normas en materia de alimentos, generalmente establecen la calidad
microbiológica en términos de microorganismos indicadores. Éstos son organismos (o grupos) que
advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminación que incrementan el riesgo de
presencia de microorganismos patógenos en alimentos. Además de que su detección en el
laboratorio es más sencilla, rápida y/o económica, los microorganismos indicadores permiten un
enfoque de prevención de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o contaminación
(James M. Jay, 2002).

Los principales microorganismos indicadores en alimentos son:

 Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de proceso:
-Mesófilos aerobios (o cuenta total)
-Cuenta de hongos y levaduras
1
 -Cuenta de coliformes totales
 Indicadores de contaminación fecal:
-Coliformes fecales,
-E. coli
-Enterococos.
-Cl. Perfringens.

La selección de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de los riesgos

implicados y de lo que se requiera saber para liberar, controlar o mejorar el alimento, manteniendo
el enfoque preventivo.

Aerobios mesófilos.
Según Vanderzant y Splittstoesser (1992), se agrupan en dos géneros importantes:
Bacillus y Sporolactobacillus formadores de endoesporas. Las especies encontradas en los
alimentos son generalmente extensas y no poseen un habitad definido y en general no provocan
enfermedades en el ser humano. Son utilizados como indicadores de la calidad del
procesamiento.

Coliformes totales.
Según la EPA (2002), los coliformes no constituyen una amenaza para la salud; su
determinación se usa para indicar si pudiera haber presentes otras bacterias posiblemente
patógenas. Su presencia indica que los alimentos podrían estar contaminados con heces fecales
humanas o de animales. Los microbios que provocan enfermedades (patógenos) y que están
presentes en las heces causan: diarrea, retortijones, náuseas, cefaleas u otros síntomas. Estos
patógenos podrían representar un riesgo de salud muy importante para bebés, niños pequeños y
personas con sistemas inmunológicos gravemente comprometidos.

Enterococos
Los estreptococos de origen fecal o enterococos también son un indicador de
contaminación fecal, debido a su abundancia en el tracto digestivo de animales y humanos;
aunque se encuentran en cantidades menores por un orden de magnitud, en comparación con E.
coli, tienen algunas ventajas como su mayor supervivencia. Se consideran indicadores en
alimentos procesados, como lácteos y cárnicos, en los cuales E. coli puede no sobrevivir (Salgado
V., 2002).

E. coli.
2
 Se considera indicador de contaminación fecal reciente, humana o animal en productos
como agua embotellada, leche y jugos, alimentos infantiles, y alimentos procesados, en general.
Se caracteriza por ser coliforme termotolerante (fermenta lactosa a 44.5°C) que produce indol a
partir de triptófano y produce β-glucuronidasa, características que se usan para su identificación
en laboratorio, generalmente en la etapa final del NMP o de alguno de los otros métodos,
incluyendo Petrifilm (Salgado V., 2002).

El queso se define como un producto blando, semiduro, duro y extraduro, madurado o no

madurado, y que puede estar recubierto, en el que la proporción entre las proteínas del suero y la
caseína no sea superior a la de la leche obtenido de dos 8 formas: La primera, por coagulación
total o parcial de leche y/o productos obtenidos de la leche por efecto del cuajo u otros
coagulantes idóneos, y por escurrimiento parcial del suero que se desprende como consecuencia
de dicha coagulación; la segunda, por técnicas de elaboración que comportan la coagulación de la
leche y/o productos obtenidos de leche y que dan un producto final que posee características
físicas, químicas y organolépticas similares al obtenido por el primer método (COVENIN, 2000).

En Venezuela, la experiencia epidemiológica coloca a los quesos blancos duro, semiduro,

blando, criollo, llanero, de cincho y pasteurizado, entre los vehículos que producen enfermedades
alimentarias con mayor frecuencia, debido a su deficiente calidad microbiológica (Ortiz, M. y Ríos,
M., 2006).

Con la finalidad de conocer la calidad sanitaria a través de parámetros microbiológicos en

el queso de cuajada, se planteó este estudio para determinar microorganismos indicadores de
interés sanitario en el queso.

OBJETIVOS

 Comparar diferentes técnicas de plaqueo.

 Contar las colonias de acuerdo a las reglas estándar de contaje y cálculo apropiado del
título.
 Familiarizarnos con la metodología inherente a la determinación de coliformes totales,
coliformes fecales y E. coli por la técnica del Número Más Probable (NMP).
 Comparar la técnica de siembra en placas de agar Violeta Rojo Bilis por profundidad y el
método de NMP para coliformes.

3
 MATERIALES Y MÉTODOS

 Materiales

Localización

El presente estudio se llevó a cabo en la ciudad de Caracas, en el Instituto de Ciencias y

Tecnologías de Alimento (ICTA) de la Facultad de Ciencias-UCV.

Procedencia de la materia prima

Los 10 g de queso de cuajada que se usó durante la práctica fueron adquiridos en el

mercado de Quintacrespo de la ciudad de Caracas.

Equipos

-Cuenta colonias
-Stomacher
-Asa de platino
- Incubador
-Baño de temperatura regulada
-Pipetas, frascos de dilución estériles
-Placas de petri
-Medios de cultivos: Plate count Agar PCA, Violeta-Rojo-Bilis Agar (VRBA) y Agar KF
-Tubos con caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST)
-Tubos con caldo Bilis Verde Brillante
-Tubos col caldo EC
-Frascos con agua peptonada al 0,1%
-Diluyentes, muestras Marcador Indeleble y Tirro

 Métodos

A. Método directo de contaje de aerobios mesófilos, enterococos y coliformes mediante

plaqueo en superficie, por profundidad y doble capa.

En el siguiente esquema se presenta los pasos a seguir para el contaje de aerobios mesófilos
sembrados por plaqueo y por profundidad en el medio PCA, enterococos sembrados por
profundidad en el medio KF y coliforme sembrados por doble capa en el medio VRBA.
10 g de muestra
90 mL de agua
peptonada

4
 Homogenizar en el Stomacher
por un lapso de 1 a 2 min

10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL 10 mL

90 mL de
agua
peptonada

10 -6 10 -7

0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

Superficie Medio PCA

1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
Profundidad Medio PCA

1 mL 1 mL 1 mL

Doble capa (Medio VRBA)

1 mL 1 mL 1 mL

Profundidad (Medio KF)

Se incubaron las placas a 37ºC por 24 horas.

*Medio PCA= Cuantificación de aerobios mesófilos
*Medio VRBA= Cuantificación de Coliformes
*Medio KF= Cuantificación de Enterococos

B. Determinación del número más probable de Coliformes Totales y Fecales

5
 10 g

Diluciones seriadas hasta 10-7

NMP presuntivo de
Coliformes totales
Incubación en tubos
con LST a 37ºC por
24 horas

Positivos: Formación de turbidez y gas

Baño con
agitación

Tubos con CBVB Incubación por Tubos con EC Incubación por a

a 37ºC 44,5ºC

Positivo: Cálculo definitivo del NMP Positivos: Cálculo del NMP de

de coliformes totales confirmados coliformes fecales confirmados

Tubos positivos: pasar a placas (por

agotamiento) de EMB e incubar a 37ºC
Cálculo del NMP de E. coli (presuntivo
hasta que se hagan las pruebas INVIC:
Indol, Rojo de Metilo, Voges-Proskaver y
Simon Citrato)

RESULTADOS Y DISCUSIONES

6
 A. Método directo de contaje:
 Recuento de aerobios mesófilos en queso fresco, mediante siembra en profundidad
y superficie.

En la tabla 1 se puede observar el contaje de Aerobios Mesófilos en el medio del cultivo

PCA, por duplicado (A) y (B) mediante siembra por superficie y profundidad en el cual el cálculo
del título fue de 4,1x 107 UFC/mL y 7,5x106 UFC/mL respectivamente.

Tabla 1
Título de Aerobios mesófilos en queso fresco mediante siembra por superficie y siembra por
profundidad
Método de UFC (A) UFC (B) Cálculo del Título
siembra
UFC x Factor de dilución 41 UFC x 10⁵
Título (ufc/mL)= =
Volumen de siembra 0,1ml
Superficie 43 39 =4,1x107 ufc/ml

Profundidad 74 76 UFC x Factor de dilución 75UFC x 10⁵

Título (ufc/ml)= = =7,5x106
Volumen de siembra 1 ml
ufc/ml

La siembra de aerobios mesófilos se realizó en el medio de cultivo PCA (plate count agar).
Se sembró tanto por superficie como por profundidad. En la siembra por superficie las colonias
crecen sobre la superficie del medio. Generalmente se utiliza esta técnica para el recuento de
bacterias aerobias. Mientras que en siembra por profundidad, las colonias se desarrollan tanto
dentro del agar como en la superficie. Es un método generalmente utilizado para el recuento de
microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos, también se utiliza para disminuir la
carga microbiana que se formará en el medio.

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se

desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas
en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como
recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de
crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones

7
variando la temperatura, la atmósfera, la composición del medio y el tiempo de incubación (Cano
R., 2006).

En el recuento de aerobios mesófilos, se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras

capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En este recuento se estima la
microflora total sin especificar tipos de microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un
alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Un
recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus
toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa presencia de flora patógena. Ahora
bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados.

El recuento de aerobios mesófilos se realizó como lo indica la norma COVENIN 3398-97, la

cual indica que para productos lácteos debe hacerse un contaje de las placas entre 25 y 250 UFC,
el agar utilizado fue PCA en sus siglas Plate Conut Agar, el cual es un agar no selectivo por lo que
pueden crecer los organismos viables para un este tipo de muestra, el título en este caso fue alto,
osciló entre 7,5x106 UFC/mL y 4,1x 107 UFC/mL. Según los dos tipos de siembras usadas, estos
valores son elevados, lo cual indica excesiva contaminación de la materia prima, una deficiente
manipulación durante el proceso de elaboración, la posibilidad de que existan patógenos, y la
inmediata alteración del producto (Métodos de análisis microbiológicos, Normas ISO, 2006).

En las normas COVENNIN 1813-2000 y COVENNIN 3821-2003 no se cuantifican los

aerobios mesófilos, por lo cual no se puedo obtener un valor mínimo o máximo para aceptar o
rechazar el producto mediante este análisis, sin embargo, el mismo da una idea de a cantidad de
microorganismos presentes en la misma y de la mala manipulación, reflejando una mala calidad
sanitaria.

Los resultados obtenidos se relacionan con los de (Vásquez N y Col; 2012) los cuales sus
títulos oscilan entre 106 y 107 UFC/g y concluyeron que existe un alto porcentaje de contaminación
microbiana en los quesos almacenados en los distribuidores.

 Recuento de Enterococos en queso fresco, mediante siembra por profundidad.

8
 En la tabla 2 se puede observar el contaje de Enterococos en medio KF, por duplicado (A) y
(B) mediante siembra por profundidad en el cual el cálculo del título fue de y 1,5x10 4 UFC/mL
respectivamente.

Tabla 2
Título de Enterococos en queso fresco mediante siembra por profundidad.
Método de UFC (A) UFC (B) Cálculo del Título
siembra
Profundidad 113 184 UFC x Factor de dilución 149UFC x 102
Título (ufc/ml)= =
Volumen de siembra 1 ml
=1,5x104 ufc/ml

El contaje de enterococos se realiza principalmente en agar KF (Streptococos) como dicta

la norma COVENIN 2522-88. El agar KF es un medio para determinar Enterococs su
funcionamiento se basa en la fermentación de azúcares, y provocan un cambio de coloración de
los indicadores como resultado de la acidificación que producen algunas especies que pueden
metabolizarlas (Díaz Pérez M. y col., 2012).

El género enterococos forma parte de las llamadas bacterias ácido-lácticas (BAL), son

ubicuos y están normalmente presentes en el tracto digestivo de humanos y animales. Este grupo
se constituyen como el más polémico dentro de las BAL (Cabeza, 2006). Diversos estudios
microbiológicos han demostrado que ellos juegan un papel importante en la maduración de
algunas variedades de quesos tradicionales elaborados con leche cruda o pasteurizada y
producidos en zonas y países mediterráneos. Sin embargo, su papel en estos productos no se ha
aclarado totalmente. Además, la producción de bacteriocinas por los enterococos se ha
documentado bien. Es más, se usan los enterococos hoy día como microorganismos probióticos.
A pesar de todo esto, los enterococos también han sido asociados con varias infecciones
humanas (Díaz Pérez M. y col., 2012).

Los recuentos de enterococos fueron de 1,5x10 4 UFC/mL en 10 gramos de muestra de

queso, por lo que en 1 gramo se encontraron 1,5 x10 3 UFC, es un alto contaje de estas bacterias,
estas se encuentran normalmente presentes en las heces de mamíferos, también están
ampliamente distribuidos en el medio ambiente, que su significado como indicadores de
contaminación fecal está seriamente restringido, la presencia de gran número de Enterococos en

9
los alimentos, excepto en los fermentados por cepas específicas de estos microorganismos,
implica prácticas inadecuadas de higiene o bien exposición del alimento a condiciones que
pudieran haber permitido la multiplicación extensiva de bacterias no deseables.

Los Enterococos pueden tener un papel significativo como indicadores de prácticas de

limpieza y desinfección deficientes en las industrias alimentarias, debido a su gran resistencia a la
desecación, a las temperaturas elevadas y bajas y a los detergentes y desinfectantes.
Precisamente por su resistencia a la congelación, los Enterococos son los indicadores preferidos
de prácticas de sanitización deficientes en las industrias de congelación de alimentos. Y por su
resistencia al calor, pueden sobrevivir a los tratamientos térmicos que permitirían también la
supervivencia de virus en algunos alimentos pasteurizados o deshidratados. (Periago J., 2010).

 Recuento de Coliformes totales en queso fresco, mediante siembra por doble capa

En la tabla 3 se puede observar el contaje de Coliformes totales en medio VRBA, por

duplicado (A) y (B) mediante siembra por profundidad en doble capa en el cual el cálculo del título
fue de 2,9x 105 UFC/mL.

Tabla 3
Título de Coliformes Totales en queso fresco mediante el método de siembra por doble capa.

Método de UFC (A) UFC (B) Cálculo del Título

Siembra
Doble Capa 284 293 UFC x Factor de dilución 289UFC x 103
Título (ufc/ml)= =
Volumen de siembra 1 ml
=2,9x105 ufc/ml

El medio de VRBA (Violeta Rojo y Bilis Agar), este es un medio selectivo para la
investigación presuntiva y recuento de coliformes en alimentos y productos lácteos, la peptona y el
extracto de levadura aportan los nutrientes necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales
biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa es el hidrato de
carbono fermentable, y el rojo neutro es el indicador de pH. En este caso los organismos
fermentadores de lactosa, las colonias crecen de color rojo, mientras que los microorganismos no
fermentadores de lactosa desarrollan colonias incoloras (Procedimiento recuento de coliformes en
medio sólido, 1992).

10
 La definición generalmente aceptada para el término “coliformes” describe a estos
microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios
facultativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas, aunque algunos pueden ser
fermentadores tardíos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia, respectivamente. La
mayoría de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del hombre o
animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por ejemplo Escherichia coli.
Por esta razón, su presencia constante en la materia fecal, los coliformes son el grupo más
ampliamente utilizado en la microbiología de alimentos como indicador de prácticas higiénicas
inadecuadas. Como los coliformes también pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre
coliformes totales y coliformes fecales (Camacho A. y col., 2009).

La demostración y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante el

empleo de medios de cultivos líquidos o sólidos con características selectivas o diferenciales. Para
la cuenta en placa se usa el medio de cultivo VRBA por profundidad doble capa.

La existencia de Coliformes Totales en la muestra de queso, tal como se evidenció en este

estudio, no implica necesariamente presencia de materia fecal en el alimento o presencia de
patógenos entéricos, indica más bien contaminación post-proceso térmico como pueden ser fallas
en la refrigeración. El título para los 10 gramos de la muestra de queso utilizados fue de 2,9 x10 5
UFC/mL lo que quiere decir que en 1 gramo de queso habrán 2,9x10 4 UFC, en LA Norma
COVENIN 3821-2003 indica que el límite máximo de UFC/mg para coliformes es de 1,0 x10 3 por lo
cual el queso analizado no está apto para el consumo humano sin embargo se recomienda haber
estudiado 5 muestras, pero debido a que la muestra de queso pasa el límite máximo se puede
tomar la decisión de rechazar el queso. Los resultados guardan relación con los encontrados en
(Vásquez N y Col; 2012) donde la muestras analizadas están entre 1x10 2 y 1x104 UFC/g quienes
concluyeron que la muestra está contaminada y representa un riesgo para la salud de quien lo
consuma.

B. Determinación del número más probable de Coliformes Totales y Fecales

En el presente estudio se investigó la presencia de microorganismos indicadores de interés

sanitario en una muestra de queso tipo cuajada. Para ello se realizaron determinaciones de
recuentos de coliformes totales y fecales, como indicadores de contaminación fecal.

11
 En la tabla 4 se expone el recuento de los Coliformes totales y fecales en la muestra de
queso tipo cuajada, por el método del número más probable, los cuales fueron de 2100 + y < 30
NMP/mL, siendo los resultados para 3 tubos en Coliformes totales 3-2-2 y en coliformes fecales
0-0-0.

Tabla 4
Número más probables para coliformes totales y fecales.

Coliformes Tubos positivos Número más Probable

Totales 3-2-2 2100+ NMP/mL

Fecales 0-0-0 < 30 NMP/mL

Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en heces están formados

por Escherichia coli y ciertas especies de Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran
casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se considera que reflejan
mejor la presencia de contaminación fecal. Éstos últimos se denominan termotolerantes por su
capacidad de soportar temperaturas más elevadas. Esta es la característica que diferencia a
Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse fuera del
intestino de los animales homeotérmicos es favorecida por la existencia de condiciones
adecuadas de materia orgánica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado como
indicador ideal de contaminación fecal. Su presencia se interpreta como una indicación de que los
organismos patógenos pueden estar presentes y su ausencia indica que el alimento estudiado se
hallan exentos de organismos productores de enfermedades (Araya V. y col., 2008).

Con relación a la inocuidad de la muestra de queso tipo cuajada, según los criterios
microbiológicos establecidos para quesos madurados, se encontró en cuanto a Coliformes Totales
que en tres diluciones evaluadas se obtuvieron muestras positivas como 3-2-2 las cuales al
determinarlas en la tabla del NMP y límite de confianza 95%, en pruebas con tubos de
fermentación cuando son utilizados tres tubos con volúmenes de 0,1; 0,01 y 0,001 g, obtenemos
un NMP/g de 2100+. Según la Norma COVENIN 3821-2003, el resultado obtenido pasa el límite
máximo, el cual es de 930 NMP/mg por lo cual se puede rechazar el queso. En cuanto al subgrupo

12
los Coliformes Fecales, no se presentó presencia de estos. Esto pone en entredicho la inocuidad
de este producto.

Con los resultados obtenidos, a pesar de que no se aislaron microorganismos patógenos,

las muestras evaluadas presentan altas concentraciones de microorganismos indicadores,
representando un riesgo para la salud pública. Además, estas altas concentraciones de
microorganismos también propician un deterioro acelerado del producto.

CONCLUSIONES

 La carga microbiana de coliformes totales, que supera los criterios microbiológicos para
este alimento, indica que el producto se contaminó luego del proceso de elaboración.
 La muestra de queso analizada no posee residuos de materia fecal, por la ausencia de
coliformes fecales.
 La muestra de queso tipo cuajada que se evaluó, por no cumplir con la norma sanitaria, se
considera un producto de alto riesgo microbiológico para el consumidor.
 La detección de microorganismos indicadores es relativamente sencilla y económica.
 NMP es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente
cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. UFC es el número
mínimo de células separables sobre la superficie, o dentro, de un medio de agar semi-
sólido que da lugar al desarrollo de una colonia visible del orden de decenas de millones de
células descendientes.  Son cuantificaciones distintas, por lo tanto no hay una relación. 

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14
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[Consultado el 20 de mayo de 2016].

ANEXOS

 ¿Cuál procedimiento recomendaría Ud. para realizar un contaje total en placas y por qué?

Cada tipo de recuento de microorganismos viables es potencialmente útil para fines

específico. Tales recuentos se denominan, en algunos casos con evidente error, recuentos
totales en placas, cuando en realidad únicamente pueden contarse aquellas bacterias que
pueden crecer en condiciones ambientales elegidas; pues se pueden cambiar las
condiciones ambientales, las de incubación, la composición del medio (añadiendo
inhibidores selectivos al medio o agentes con actividad de superficie o colorantes)
favoreciendo así el crecimiento de uno u otro microorganismo.

 ¿Cuáles son las diferencias básicas entre coliformes totales y fecales?

Los coliformes totales son todas aquellas bacterias que tienes características
bioquímicas en común y son de gran importancia como indicador de contaminación del
agua y alimento; los coliformes fecales son todos aquellos que son de origen intestinal en
el cual la principal es la Escherichia Coli además los coliformes fecales son termotolerates
y son capaces de fermentar lactosa a 44,5 °C.

 ¿Quiénes son mejores indicadores en productos congelados?

Por la resistencia a la congelación los Enterococos son los indicadores de

preferencia en las industrias de congelación de alimentos.

15
 Señale otra técnica mediante la cual se pueden determinar los Enterococos fecales.

Los enterococos fecales se podrán determinar mediante la técnica del NMP,

utilizando caldo de glucosa aizada, los tubos positivos deberán sembrar en Agar KF, en el
cual las colonias de color rojo oscuro serán enterococos fecales.

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