CROMATOGRAFÍA: PRINCIPIOS GENERALES

La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos físicos y químicos de

separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. Una fase es estacionaria y la
otra móvil. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que
contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones
repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en
forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Al
final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase
estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al
último. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de
los componentes de la muestra.
La columna de separación es el corazón del cromatógrafo. Proporciona
versatilidad en los tipos de análisis que pueden realizarse. Esta característica, debida a
la amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria, permite
separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. En un
sentido amplio, la distribución de un soluto entre dos fases es el resultado del balance
de fuerzas entre las moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la
atracción o repulsión relativas que presentan las moléculas o iones de las fases
competidoras por el soluto y entre sí. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar,
proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden deberse a
fuerzas de dispersión del tipo London. En cromatografía de intercambio iónico, las
fuerzas en las moléculas del soluto son sustancialmente de naturaleza iónica; pero
incluyen también fuerzas polares y no polares.

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

La fase móvil puede ser un gas o un líquido, mientras que la fase estacionaria
sólo puede ser un líquido o un sólido (Tabla 2. l) dando lugar a la cromatografía de
gases y a la cromatografía líquida
En la cromatografía líquida, cuando la separación involucra predominantemente
un reparto simple entre dos fases líquidas inmiscibles, una estacionaria y la otra móvil,
el proceso se llama cromatografía líquido-líquido (LLC). Cuando en la aptitud retentiva
de la fase estacionaria intervienen principalmente fuerzas físicas de superficie, el
proceso se denomina cromatografía líquido-sólido (LSC, de liquid-solid
chromatography) (o de adsorción).
Otros dos métodos de cromatografía líquida difieren un poco en su modo de
acción, En cromatografía de intercambio iónico (IEC, de ionic-exchange
chromatography), los componentes iónicos de la muestra se separan por el intercambio
selectivo con contraiones de la fase estacionaria. En cromatografía de exclusión (EC, de
exclusión cromatography), la fase estacionaria proporciona una clasificación de
moléculas basadas en su mayor parte en la geometría y el tamaño molecular. Este
método también se llama cromatografía de permeación en gel, en la química de los
polímeros, y de filtración en gel, en la bioquímica
Cuando la fase móvil es un gas, los métodos se llaman cromatografía
gas-líquido (GLC), y cromatografía gas-sólido (GSC). Los métodos que implican fases
móviles gaseosas y líquidas, serán tratados en forma individual. Aun cuando hay pocas
razones fundamentales para estudios separados, las diferencias en las técnicas de
operación y en el equipo justifican su análisis en capítulos individuales.
Tabla 2.1. Métodos cromatográficos

COMPORTAMIENTO CROMATOGRÁFICO DE LOS SOLUTOS

El comportamiento cromatográfico de un soluto puede describirse de diversas

formas. Para cromatografía en columna, el volumen de retención, V R, (o el
correspondiente tiempo rentención, tR) y la razón de reparto, k', son los términos que se
utilizan con más frecuencia. Variando las combinaciones de fase estacionaria - fase
móvil y varios parámetros operación, el grado de retención se puede cambiar de cerca
de la retención total hasta estado de migración libre.

Comportamiento de retención

El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase

móvil y estacionaria. La Fig. 2.1 muestra la separación de dos alquenos isoméricos. El
volumen de fase móvil necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de
inyección a través de la columna, hasta el detector (en el máximo del pico del soluto) se
define como volumen de retención, VR. Se puede obtener directamente del
cromatograma multiplicando el tiempo de retención correspondiente, tR , por el gasto o
flujo volumétrico, Fc expresado como el volumen de fase móvil por unidad de tiempo:

VR = tR·Fc
Separación de 2-metil-1-buteno y 2-metil-2-buteno por cromatografía de gases

De marcada influencia en el flujo volumétrico es la porosidad total del relleno

(empaque) de la columna. La porosidad expresa la razón del volumen intersticial del
relleno respecto al volumen de su masa total. Para empaques sólidos la porosidad total
es 0.35-0.45, mientras que para empaques porosos es de 0.70-0.90. En las columnas
capilares el valor de la porosidad, es la unidad.
La velocidad lineal promedio, u, de la fase móvil,

u = L/tM
donde tM representa el tiempo de tránsito de un soluto no retenido,. (L representa la
longitud de la columna). En cromatografía interactiva ningún material puede eluir antes
de este tiempo. Cuando se convierte a volumen, VM representa lo que se conoce como
espacio muerto, volumen vacío o de retraso de la columna. Incluye las contribuciones
efectivas del volumen del inyector, de cualquier tubería de conexión, de la columna en
sí y del detector.
El volumen, V´R o el tiempo, t´R de retención ajustados, están dados por'

V´R = VR - VM y t´R = tR – tM

Coeficiente de distribución o de reparto

Cuando un soluto entra al sistema cromatográfico inmediatamente se reparte o

distribuye entre la fase móvil y la estacionaria. Si la fase móvil se para en cualquier
momento, el soluto establece un equilibrio de distribución entre las dos fases. La
concentración en fase está dada por el coeficiente termodinámico de reparto:
K = CS/CM
donde CS, y CM son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y móvil,
respectivamente. Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las
dos fases. El coeficiente de reparto determina la velocidad promedio de cada zona de
soluto conforme la fase móvil avanza a lo largo de la columna.

Factor de capacidad

El factor de capacidad k´ es la cantidad más importante en cromatografía en

columna. Relaciona el equilibrio de distribución de la muestra dentro de la columna con
las propiedades termodinámicas de la columna y con la temperatura. Para un conjunto
dado de parámetros de operación, k´ es una medida del tiempo transcurrido en la fase
estacionaria en relación con el tiempo transcurrido en fase móvil. Se define como el
cociente de los moles de un soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fase
móvil:

k´= (CS VS )/( CM VM ) = K VS / VM

La razón volumétrica de fases VM / VS, se denota usualmente por . Así, k' =K/.
Dicho de otra forma, el factor de capacidad es el tiempo adicional que una banda de
soluto requiere para eluir, en comparación con un soluto no retenido (para el cual k
´=0), dividido entre el tiempo de elución de una banda no retenida:

Para valores de k' mayores que 10 se desperdicia tiempo analítico valioso. Los
valores menores que la unidad no proporcionan una resolución adecuada entre los
solutos de elución temprana.

Retención relativa o factor de selectividad

La retención relativa o factor de selectividad,  de dos solutos, donde el soluto

1 eluye antes del soluto 2, es

 = k´2 / k´1 = K2 / K1 = V´R,2 / V´R,1= t´R,2/ t´R,1

La retención relativa depende de 1) la naturaleza de las fases estacionaria y
móvil, y 2) la temperatura de operación de la columna. Al escoger un par de fases para
los solutos adyacentes más difíciles de separar se debe ser tan selectivo como sea
posible.
EFICIENCIA DE LA COLUMNA Y RESOLUCIÓN

Bajo condiciones de operación donde el reparto del soluto entre la fase

estacionaria y móvil es lineal (esto es se sigue la ley de Henry), K y k' son
independientes de la concentración total de soluto. Después de 50 o más repartos entre
las fases, el perfil resultante de la banda se aproxima muy de cerca al dado por una
curva de distribución gaussiana (Fig. 2.2). De todas maneras, conforme la banda de
soluto pasa a través de la columna cromatográfica se ensancha y la concentración en el
máximo del pico disminuye. Este ensanchamiento finalmente afecta la resolución de las
bandas de soluto adyacentes.

Perfil de una banda de soluto

Resolución

El grado de separación o resolución de dos bandas adyacentes se define como la

distancia entre los picos de las bandas (o centros) dividida entre el ancho promedio de
las bandas. Si la retención y el ancho de la banda se miden en unidades de tiempo,
como en la Fig. la resolución está dada por:

Rs = (t´R,2 - t´R,1)/(0.5·(W2+W1))
 Definición de la resolución

Las bandas de soluto se ensanchan gradualmente conforme emigran a través de

la columna cromatográfica. La resolución de los solutos individuales en bandas
discretas ocurre solamente si las bandas se ensanchan en menos medida que lo que se
separan los máximos de los picos. Los valores en la línea base de los anchos de bandas
adyacentes son casi constantes, esto es, W2 = W1. Puesto que el ancho de la banda en la
línea base es igual a cuatro desviaciones estándar, para una banda dada la resolución
también se puede expresar como

Rs = (t´R,2 - t´R,1)/(4·)

Si es inadecuada, la resolución de picos adyacentes puede mejorarse ya sea

aumentando la separación ente los picos o disminuyendo los anchos de los picos
individuales. Esto involucra la selectividad de la columna cuando se alejan más los
picos y la eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico. Mejorar la
selectividad implica alterar la termodinámica del sistema cromatográfico. Mejorar la
cinética del sistema aumenta la eficiencia de la separación. Como se muestra en la Fig.
del cromatograma superior, una columna puede tener una selectividad adecuada pero
mostrar poca eficiencia (comparada con el cromatograma de en medio). El
cromatograma inferior muestra una eficiencia excelente, pero podría tener una mejor
selectividad. Probablemente en este caso los valores de k' son muy pequeños.
La resolución es una función de tres factores separados: 1) un factor de la
selectividad de la columna que varía con , 2) una velocidad de migración o factor de
capacidad que varía con k' y 3) un factor de eficiencia que depende de L/H (o el número
de platos teóricos). Cada factor puede ser calculado directamente del cromatograma
registrado y se puede ajustar en forma más o menos independiente. Los primeros dos
factores son por esencia termodinámicos, mientras que el término L/H está
principalmente asociado a los aspectos cinéticos de la cromatografía.
Los cambios en  y k' se logran seleccionando diferentes fases estacionarias y
móviles o variando la temperatura y (con menor frecuencia) la presión. Adicionalmente,
k' puede variarse cambiando las cantidades relativas de las fases móvil y estacionaria
dentro de la columna. Cuando se optimiza una separación en particular el término de k'
debe ser considerado en primer lugar. El intervalo óptimo de valores de k' va de 1 hasta
10.
El término L/H se ajusta para proporcionar la máxima eficiencia compatible con
un tiempo de análisis razonablemente corto. Los valores más altos de L/H siempre
darán una mejor resolución, siendo los demás factores iguales. La resolución puede
mejorarse aumentando la longitud de la columna, pero sólo conforme a la raíz cuadrada
de la longitud de aquélla. La altura del plato debe disminuirse por medio de las
características cinéticas de la operación de la columna, quizá disminuyendo el flujo de
la fase móvil (pero no por debajo de un mínimo). Cualquier acción que aumente la
eficiencia de la transferencia de masa de los solutos entre las fases estacionaria y móvil
disminuirá la altura del plato y por lo tanto mejorará la resolución.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA

Determinaciones cualitativas: datos de retención para la caracterización de la

muestra
En un sistema cromatográfico estable, el tiempo de retención de un soluto
particular es constante, y por lo tanto puede utilizarse para identificar ese soluto. Así,
aunque la cromatografía es primordialmente una técnica de separación, es posible
identificar los compuestos separados de una mezcla compleja por medio de sus tiempos
de retención.
Los tiempos de retención pueden predecirse a partir de los tiempos conocidos de
otros miembros de la serie homóloga. La probabilidad de una coincidencia exitosa en
los valores de los tiempos de retención depende del conocimiento previo de la muestra,
y por tanto de la aptitud para prever la presencia de compuestos específicos. El éxito
también depende de la disponibilidad de compuestos de referencia a propósito.
El método de las adiciones estándar se puede utilizar para verificar el tiempo de
retención del compuesto en cuestión. El tiempo de retención del pico en la muestra no
debe cambiar después de efectuada la adición con respecto al valor original si ambos
compuestos (el problema y el estándar añadido) son el mismo
Cuando no se tienen disponibles los compuestos de referencia debe recurrirse a
la información estructural independiente que proporcionan otras técnicas
espectroscópicas. En muchos casos la identificación de compuesto puede hacerse
aislando el pico durante la obtención del cromatograma y analizándolo a continuación
por un método suplementario. La espectrometría de masas se ha acoplado con éxito a la
cromatografía tanto de gases como líquida. La información que se puede obtener
incluye el peso molecular y la fórmula empírica, información estructural y
confirmación de la estructura.
Determinaciones cuantitativas
En cromatografía en columna la señal analógica generada por el detector se
registra en la forma familiar de los picos cromatográficos. El área bajo estos picos
puede integrarse en una variedad de maneras y los datos resultantes relacionarse con la
composición de muestras desconocidas.