INFORME PRÁCTICA DE LABORATORIO II DE

12-05-2023
ANÁLISIS QUÍMICO

PRÁCTICA N° 1
SEPARACIÓN DE PROTOCLOROFILIDA FLUORESCENTE DE
LAS SEMILLAS DE CALABAZA VERDE MEDIANTE
CROMATOGRAFÍA DE COLUMNA.

INTEGRANTES:
María Angelica Solano Gomez – 2211947
Juana María Amézquita Barahona – 2211340
Gabriela Grisales Castillejo – 2211612

1.1 OBJETIVOS fases inmiscibles distintas. Esto nos lleva a clasificar

sus tipos de la siguiente manera.
• Entender el funcionamiento de la Según fase estacionaria y móvil:
cromatografía de micro columna y Solido/Solido:
TLC para su correcto analisis. - Cromatografía de adsorción
• Conocer conceptos importantes sobre - Cromatografía de intercambio iónico
la cromatografía, tales como la fase - Cromatografía de exclusión (geles)
móvil, estacionaria, factor de - Cromatografía de afinidad
retención y polaridad. Liquido/liquido:
• Identificar la relación entre la - Cromatografía de partición
cromatografía TLC y micro columna y Liquido/gas:
sus principios subyacentes. - Cromatografía gas-liquido (de partición)
• Determinar los elementos presentes - Cromatografía gas-solido (de adsorción)
en las semillas de calabaza.
• Encontrar los pigmentos Según dispositivo utilizado:
fotosintéticos como la clorofila y - Cromatografía en columna
protoclorofilida la cual cuenta con - Cromatografía plana
propiedades de fluorescencia. - Cromatografía en papel
- Cromatografía en capa fina
- Cromatografía liquida
1.2 INTRODUCCIÓN - MARCO TEÓRICO - Cromatografía de gases
- Cromatografía de fluidos supercríticos
La cromatografía es una técnica de analisis químico En el presente informe nos enfocaremos en la
utilizada para la separación de sustancias puras de Cromatografía en capa fina (TLC) y la Cromatografía
mezclas complejas, basado en el principio de en micro columna debido a los fines de la práctica.
adsorción selectiva, este separa mezclas
homogéneas y sus dos componentes actúan con dos Cromatografía en capa fina (TLC):
 INFORME PRÁCTICA DE LABORATORIO II DE
12-05-2023
ANÁLISIS QUÍMICO

Por sus siglas en inglés (Thin Layer oscila entre 0 y 1, donde 0 da a entender que el
Chromatography) Es un método analítico compuesto no se movió en absoluto y 1 que el
usado para monitorear las reacciones, separar y compuesto recorrió la misma distancia de la
purificar los componentes presentes en las fase móvil, siendo de esta manera eficaz para la
muestras, y a la vez separa sus contaminantes; identificación de compuestos; por otro lado, los
es bastante versátil y económico dentro de los adsorbentes polares de TLC tienden a moverse
laboratorios, es usado para ensayos lentamente, dando valores pequeños de RF,
preparativos y analíticos, y en bastantes mientras que los adsorbentes apolares por el
campos científicos. contrario suben rápido sobre la placa, dando
Para su desarrollo, la muestra se coloca sobre valores grandes a RF.
una capa de material absorbente, que suele ser RF= Distancia recorrida por compuesto/
gel de sílice (fase estacionaria), pues, es distancia recorrida por disolvente
adecuado para moléculas con gran cantidad de
polaridades y grupos funcionales como lo son Fase móvil y estacionaria: Este refiere a una
las proteínas, vitaminas, alcaloides, etc; esta se capa uniforme de absorbente sobre una placa,
verte sobre una placa de plástico o vidrio, la la cual necesita de un adsorbente (como el
cual es puesta en una cámara cerrada donde el mencionado gel de sílice), un dispositivo que
solvente (fase móvil) asciende y separa los contenga las placas a lo largo del
componentes de la muestra según su procedimiento, otro donde se deposite la capa
solubilidad y adsorción, posteriormente de adsorbente y finalmente de una cámara
cuando el disolvente sube totalmente se retira donde estén las placas cubiertas. Esta fase es un
de la cámara y se seca, los componentes componente polar, mientras que el solvente o
separados pueden apreciarse como puntos en fase móvil será menos polar, Por otro lado, la
la placa, haciendo posible estudiar el factor de capa móvil es líquida, y corresponde al solvente
retención RF de los componentes. que se mueve a lo largo de la fase estacionaria.
Dicha separación sucede debido a la afinidad La elección de ambas surge de la naturaleza de
de las sustancias por el solvente y el material los componentes de la muestra y el objetivo de
adsorbente, por lo cual cada elemento presente su separación.
en la muestra sube una distancia diferente
sobre la capa, ya terminado este proceso y con
ayuda de la luz ultravioleta se pueden
identificar y estudiar los elementos de la
muestra. Gracias a su versatilidad puede
analizar gran variedad de compuestos
orgánicos e inorgánicos.
Factor de retención (RF): Es usado para
estudiar el movimiento de los compuestos
sobre la placa de TLC, o tambien usado para
medir la capacidad de cierto compuesto para
Cromatografía en micro columna:
moverse a lo largo de la capa en relación con la
Método usado para monitorear reacciones
velocidad de la fase móvil que avanza sobre la
orgánicas y separaciones sencillas debido a su
misma; este se calcula como la distancia
utilidad en la separación y purificación de
recorrida de un compuesto sobre la distancia
compuestos en pocas cantidades, es bastante
total recorrida por el disolvente, y su valor
 INFORME PRÁCTICA DE LABORATORIO II DE
12-05-2023
ANÁLISIS QUÍMICO

útil en la investigación farmacéutica para

purificación de proteínas y compuestos Sobre la protoclorofilida fluorescente: Por
bioactivos; esta maneja una técnica igual a la de otro lado, y teniendo claras las técnicas
la cromatografía en columna, pero se enfoca en cromatográficas usadas podemos entrar a
muestras mas pequeñas (hasta 20-25 mg de analizar la muestra utilizada, que en este caso
muestra) esta se puede construir con ayuda de fue la semilla de calabaza verde, en la cual
una pipeta Pasteur, esta se rellena con un encontramos la protoclorofilida fluorescente,
material de empaque estacionario, que es un pigmento fotosintético presente en
posteriormente la muestra se deposita en la las plantas, el cual se forma a lo largo del
parte superior de la columna y se pasa por esta proceso de biosíntesis de la clorofila, este
una solución disolvente (hexano), los pigmento no es estable y tiende a
componentes de la muestra se separan descomponerse rápido en la clorofila expuesto
dependiendo sus propiedades químicas y al sol. En las semillas de calabaza se encontró
físicas como carga, polaridad, tamaño que este se acumula en grandes cantidades;
molecular y solubilidad. Ya separados los este cuenta con propiedades antioxidantes, y es
compuestos se recogen en fracciones capaz de prevenir la oxidación celular. La
individuales para posteriormente ser protoclorofilida es fluorescente y emite luz en
analizados. la región del rojo cuando se excita con luz
Ya conociendo el significado de fase ultravioleta, esta propiedad ha hecho posible el
estacionaria y móvil es posible identificar que analisis de técnicas cromatográficas para su
en la cromatografía de micro columna se coloca separación y analisis.
un absorbente solido (fase estacionaria) en la
columna vertical, y posteriormente se introduce
un solvente orgánico (fase móvil) en la
superficie, el cual fluye hacia abajo (contrario a
la cromatografía TLC). Gracias a que los
componentes de la mezcla actúan de forma
distinta con el absorbente y solvente se
mueven con distinta velocidad, pasando a
través de la columna en diferentes momentos.

Básicamente una TLC generalmente se realiza

antes de realizar una micro columna, haciendo
1.3 MATERIALES
posible evaluar la situación y determinar la
• Vasos de precitado
cantidad correcta de solvente. Para tener una
• Soporte metálico con pinzas
buena separación de trayectorias el compuesto
• Placas de cromatografía en capa
a analizar debe tener un RF intermedio (de 0.35
fina
aproximadamente) y debe contar con una
• Columna de vidrio
separación de los otros compuestos de máximo
• Pipeta Pasteur
0.2, estos valores de RF son ideales puesto que
• Cubeta cromatográfica
el compuesto es lo suficientemente lento para
• Tubos para centrifuga
brindar un equilibrio en la fase estacionaria y
• Algodón
móvil, pero a su vez rápido para minimizar el
• Mortero
ensanchamiento de la banda por la difusión.
 INFORME PRÁCTICA DE LABORATORIO II DE
12-05-2023
ANÁLISIS QUÍMICO

1.4 REACTIVOS 1.5 EQUIPOS E INSTRUMENTOS

• Extracto del pigmento de • Cromatógrafo de TLC
semilla • Centrifugadora
• Acetato de etilo • Placa de calentamiento
• Silica gel
• Hexano 1.6 PROCEDIMIENTO
• Agua destilada
 INFORME PRÁCTICA DE LABORATORIO II DE
12-05-2023
ANÁLISIS QUÍMICO

Ilustración 1. Solución de Acetato de Etilo y semillas después del Ilustración 4. Placa TLC examinada con lámpara de fluorescencia.
paso por centrifugación.

1.7 ANALISIS DE RESULTADOS

- Se pudo evidenciar que la
cromatografía de microcolumna
presentó una mayor retención al
contener la muestra y mezcla A,
mostrando un color rojo al ser visto con
la lámpara de fluorescencia, mientras
que al añadir la mezcla B no se logró
evidenciar su total movimiento ya que
no fue totalmente afín con la fase móvil
utilizada.
- Para lograr una separación exitosa en
Ilustración 2. Preparación de la micro-columna.
cromatografía en columna se puede
utilizar una serie de sistema de
disolventes cada vez más polares, esto
eluye el compuesto menos polar, ya con
este fuera de la columna un compuesto
muy polar se agrega para eluir el polar,
y finalmente el acetato de etilo evapora
todo de la fase estacionaria.

1.8 CONCUSIONES
Ilustración 3. Lampara de fluorescencia para observación de color - La cromatografía TLC y micro columna
rojo en primera solución. pueden articularse en conjunto para
lograr un analisis mas preciso, teniendo
 INFORME PRÁCTICA DE LABORATORIO II DE
12-05-2023
ANÁLISIS QUÍMICO

en cuenta la obtención de valores laboratorio/cromatografia-en-

intermedios de RF que brindan un columna/
equilibrio en la fase estacionaria y móvil. - Admin. (2020, December 16).
- Según la fase estacionaria y móvil, y el Cromatografía en microcolumna.
dispositivo utilizado es posible https://quimicafacil.net/tecnicas-de-
encontrar el método cromatográfico laboratorio/cromatografia-en-
adecuado para la separación de la microcolumna/
mezcla.
- La cromatografía TLC y micro columna
son las adecuadas para el analisis de la
protoclorofilida fluorescente debido a
que permiten su correcta separación y
mediante la lampara de fluorescencia
permiten observar sus propiedades, lo
cual es ideal al tratarse de esta
sustancia.

1.9 BIBLIOGRAFIA
- Cromatografía en Capa Fina (TLC).
(2022). Silicycle.com.
https://www.silicycle.com/es/cromatog
rafia-en-capa-fina-tlc
- Bioonline. (2019). Cromatografía de
pigmentos fotosintéticos [YouTube
Video]. In YouTube.
https://www.youtube.com/watch?v=xz
EsAqR8Tbg
- (2016). Sigmaaldrich.com.
https://doi.org/dogri
- Artedinamico. (2022).
CROMATOGRAFÍA. Equipos Y
Laboratorio de Colombia.
https://www.equiposylaboratorio.com/
portal/inicio
- Admin. (2020, December 2).
Cromatografía en columna.
Quimicafacil.net.
https://quimicafacil.net/tecnicas-de-