Proceso Kraft

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

Departamento de Ingeniería Química
INTEGRACIÓN DEL PROCESO KRAFT DE OBTENCIÓN

DE PASTA DE CELULOSA EN EL ESQUEMA DE UNA
BIORREFINERÍA
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

PRESENTADA POR
Raquel Martín Sampedro
Bajo la dirección de los doctores
Juan Carlos Villar Gutiérrez

Juan Antonio Martín Parra
Madrid, 2012
©Raquel Martín Sampedro, 2011

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
INTEGRACIÓN DEL PROCESO KRAFT DE OBTENCIÓN

DE PASTA DE CELULOSA EN EL ESQUEMA DE UNA
BIORREFINERÍA
MEMORIA
Que para optar al grado de Doctor

por la Universidad Complutense de Madrid presenta
Raquel Martín Sampedro
Madrid, 2011
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
Laboratorio de Celulosa y Papel (CIFOR)

Instituto Nacional de Investigación y Tecnología
Agraria y Alimetaria (INIA)
INTEGRACIÓN DEL PROCESO KRAFT DE PRODUCCIÓN DE

PASTA DE CELULOSA EN EL ESQUEMA DE UNA BIORREFINERÍA
RAQUEL MARTÍN
MADRID, 2011
Juan Carlos Villar Gutiérrez, Investigador del Instituto Nacional de
Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), y Juan Antonio Martín Parra,
Investigador Ramón y Cajal del mismo centro,
INFORMAN:
Que el trabajo de investigación recogido en la memoria titulada “Integración del

proceso Kraft de obtención de pasta de celulosa en el esquema de una biorrefinería” ha
sido realizado, bajo su dirección, por Raquel Martín Sampedro en los laboratorios de
Celulosa y Papel del Centro de Investigación Forestal (CIFOR) perteneciente al
Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA). Dicho
trabajo cumple con los requisitos exigidos para optar al Grado de Doctor, autorizando
su presentación en la Universidad Complutense de Madrid.
Madrid, 29 de Agosto de 2011.
Juan Carlos Villar Gutiérrez Juan Antonio Martín Parra

A los que siempre están
A mi familia
A Mario
AGRADECIMIENTOS
Quisiera expresar mi más sincero agradecimiento a todos aquellos que de alguna

manera han contribuido en esta tesis, bien sea con su ayuda en el trabajo o mediante su
apoyo incondicional. Sé que esta va a ser una de las partes de la tesis que más me cueste
escribir, y no porque no tenga claro las personas a las que quiero agradecer o lo que
quiero decirles, sino porque no sé si seré capaz de expresar con palabras la gratitud que
siento.
En primer lugar, gracias a mis directores de tesis Dr. Juan Carlos Villar y Dr.
Juan Antonio Martín. Gracias Juan Carlos por haber hecho posible que llevase a cabo
este trabajo en el INIA y por haberme no sólo permitido, sino animado, a realizar
estancias fuera del INIA, para poder completar así mi formación. En estos cuatro años
he aprendido muchas cosas y directa o indirectamente han sido gracias a ti. Gracias por
demostrarme tu confianza en mí para llevar a cabo los diferentes trabajos, experimentos,
etc. En resumen, gracias por creer en mi como futura investigadora.
Gracias a los doctores Jiebing Li y Göran Gellerstedt del KTH (Suecia), Orlando
Rojas y Ewellyn Capanema de NCSU (EEUU), Manuel Jesús Díaz y Juan Carlos
García de la Universidad de Huelva, e Ilari Filpponen y Janne Laine de Aalto University
(Finlandia). Gracias a todos ellos por la buena acogida en sus grupos de investigación,
por su dedicación y paciencia y por todo lo que he aprendido con ellos. Quisiera
expresar mi especial agradecimiento al Dr. Orlando Rojas, ya que él me ha acogido no
una sino dos veces, tanto en NCSU como en Aalto University, guiándome siempre en
mi trabajo con buenas ideas y atendiendo todas mis dudas con increíble rapidez.
Sinceramente, no sé como puedes organizarte tan bien y abarcar todo el trabajo que
llevas a cabo. Eres un ejemplo a seguir.
Gracias también a todas las personas que han sido mi familia, mis amigos y mis
compañeros de trabajo en estas estancias. Gracias a David, Vivi, Cristiane y Helena en
KTH; a Sole, Ingrid, Carlos, Ronalds y toda la banda en NCSU; a Quique, Minerva e
Isabel en Huelva; y a Tiina, Laura, Xiaomeng, Ingrid y Sole (che! vosotras dos otra vez,
y espero que coincidamos muchas más veces!) en Aalto. Sin todos vosotros no hubiese
podido integrarme tan bien tanto dentro como fuera del laboratorio. Habéis hecho que
siempre tenga ganas de irme de estancia, y que la distancia de mis seres queridos sea
mucho más llevadera.
Y por supuesto, gracias a mis compañeros del INIA. Gracias Esteban por tus
ideas, tus reactores, tu ayuda, tu coche (jeje) y tu amistad. Gracias Chema por tener
siempre un ratito para ayudarme, no solo a mí, sino a todos en el laboratorio, por estar
siempre ahí para lo que necesitemos. Gracias Sara por tu sonrisa y por tus
conversaciones, aunque hayamos trabajado poco juntas, creo que nos compenetraríamos
muy bien. Y Luisa!! Aunque llegaste ya con mi tesis a la mitad espero que podamos
seguir compartiendo laboratorio mucho tiempo, y sino, por lo menos sigamos
compartiendo emails, cañas o lo que haga falta! Y gracias a todos los demás, a “los de
arriba” Nuria, Reme, Ester y Carlos, a Serfaty, Ángela, Jesús, Pedro, etc. Todos, de una
forma u otra, habéis puesto vuestro granito de arena.
Y como no, mil gracias a María. Gracias por tu ayuda y apoyo incondicionales,
por tu alegría, tu sinceridad, tu compañerismo, y sobre todo gracias por tu amistad.
Sabes que esta tesis no hubiese sido posible sin ti. Siempre has sacado tiempo de donde
hiciese falta para ayudarme y aconsejarme, aunque tuvieses mil cosas más en la cabeza.
Contigo he aprendido muchísimo y me has contagiado las ganas de investigar, de
trabajar, de seguir en este mundillo. Sin duda puedo decir que estos 4 años no hubiesen
sido lo mismo sin ti. No cambies nunca, y sobre todo, no dejes que te quiten esas ganas
de aprender y de avanzar.
No se me olvidan mis compañeros de comidas en el INIA, gracias por las risas,

el poder desconectar un rato del trabajo, por las cañas y las tapas. Gracias Juanan,
Laura, Fede, David, Javi, Ana, etc. En estos cuatro años hemos pasado de mesas
enormes a mesas para 2 o 3, como este verano, pero siempre ha seguido el contacto bien
directo o por medio de otros. Espero poder celebrar con todos vosotros el ser Doctora!
Y gracias a mis amigos, porque la distancia física no siempre equivale a

distancia sentimental. Gracias Gemma, Sara y Vero por vuestras visitas por el mundo, y
a ti también Lolo! Pero tened cuidado con los trenes a Akala… que nunca se sabe cómo
ni donde podéis acabar, incluso sin “my papers, my documentation!” jeje. Y a los que
no habéis podido ir a visitarme, gracias también, porque siempre habéis estado ahí,
gracias Judith (mi primilla) y todas mis niñas de Palencia.
Y de distancias saben mucho mis padres, que han aprendido a usar el skype y
todo lo que haga falta sólo por estar siempre ahí conmigo, apoyándome en todo mi
camino, tanto en los aciertos como en los errores. Gracias por todas y cada una de las
pequeñas y grandes cosas que hacéis por mi y mis hermanos. Ah! y gracias por
atreveros a volar e incluso a chapurrear inglés sólo por visitarme. Me alegra que gracias
a esta tesis os hayáis animado a viajar más, y ahora ya no tenéis excusa para no seguir!
Gracias también a mis hermanos, que siempre están ahí si los necesito, aunque sea con
su apoyo silencioso. Y gracias también por haber elegido bien, y haberme dado dos
cuñadas bien majas!
Y por último, gracias a ti, Mario. Gracias por ser como eres, por todo lo que
haces por mí, por hacerme sentir feliz a cada momento. Gracias por las largas
conversaciones a altas horas de la noche, las risas, los abrazos, la complicidad, etc.
Gracias no sólo por no cortarme las alas, sino por volar conmigo. Tú sabes, casi mejor
que yo, lo que necesito siempre. Te necesito a ti. ALB.
ÍNDICE GENERAL
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... v
1 - RESUMEN / ABSTRACT............................................................................................. 1
2 - INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 9
2.1 - Composición de la biomasa lignocelulósica .................................................... 11
2.1.1 - Celulosa .................................................................................................... 13
2.1.2 - Hemicelulosa ............................................................................................ 14
2.1.3 - Lignina ...................................................................................................... 16
2.2 - Procesos implicados en la fabricación de pastas Kraft..................................... 18
2.2.1 - Materias primas utilizadas ........................................................................ 19
2.2.2 - Pasteado .................................................................................................... 21
2.2.3 - Blanqueo ................................................................................................... 25
2.3 - Concepto de biorrefinería ................................................................................. 27
2.4 - Adaptación de un proceso Kraft al concepto de biorrefinería lignocelulósica . 32
2.4.1 - Extracción de hemicelulosas previa al pasteado Kraft ............................. 34
2.4.2 - Pre-tratamiento de explosión por vapor ................................................... 36
2.5 - Biotecnología aplicada a la producción de pasta Kraft y bioetanol ................. 41
2.5.1 - Biopulpeo ................................................................................................. 45
2.5.2 - Bioblanqueo .............................................................................................. 47
2.5.3 - Producción de bioetanol ........................................................................... 49
3 - OBJETIVOS................................................................................................................ 53
4 - DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS.......................................................................... 57
4.1 - Cambios químicos y estructurales debidos al pre-tratamiento de explosión por

vapor ................................................................................................................... 62
4.1.1 - Cambios en la composición química ........................................................ 64
i
4.1.2 - Estudio termogravimétrico ....................................................................... 68
4.1.3 - Cambios en las estructuras de lignina ...................................................... 70
4.1.4 - Análisis de la capacidad de retención de agua de las muestras ................ 78
4.1.5 - Cambios de la porosidad relativa y área superficial ................................. 79
4.2 - Hidrólisis de las fracciones líquida y sólida generadas en el pre-tratamiento de

explosión por vapor. ........................................................................................... 83
4.2.1 - Hidrólisis ácida y enzimática de la fracción líquida ................................. 84
4.2.2 - Hidrólisis enzimática de la fracción sólida ............................................... 87
4.2.3 - Rendimiento global del proceso de hidrólisis enzimática ........................ 90
4.3 - Efecto del pre-tratamiento de explosión por vapor en el pasteado Kraft y en el

bioblanqueo......................................................................................................... 92
4.3.1 - Efecto del pre-tratamiento en el pasteado Kraft ....................................... 93
4.3.2 - Efecto del pre-tratamiento en el bioblanqueo ......................................... 100
4.4 - Combinación de tratamientos de explosión por vapor y LMS antes del pasteado
como alternativa al biopulpeo con hongos ....................................................... 110
4.4.1 - Biopulpeo basado en explosión por vapor y tratamiento enzimático ..... 111
4.4.2 - Biopulpeo con hongos ligninolíticos ...................................................... 116
4.4.3 - Comparación entre biopulpeo SE+LMS y biopulpeo fúngico ............... 119
4.5 - Utilización de Hesperaloe funifera en el esquema de biorrefinería forestal

planteado ........................................................................................................... 121
4.5.1 - Caracterización de Hesperaloe funifera ................................................. 122
4.5.2 - Pre-tratamiento de explosión por vapor ................................................. 122
4.5.3 - Efecto del pre-tratamiento en el pasteado Kraft y en el biopulpeo de H.

funifera ................................................................................................................ 124
4.5.4 - Efecto del pre-tratamiento en el bioblanqueo de H. funifera ................. 129
5 - CONCLUSIONES / CONCLUSIONS ........................................................................ 135
6 - TRABAJOS FUTUROS ............................................................................................. 143
7 - BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................... 147

ii
ANEXOS: Publicaciones .............................................................................................. 169
PUBLICACIÓN I: ............................................................................................ 171
PUBLICACIÓN II: ........................................................................................... 187
PUBLICACIÓN III: .......................................................................................... 199
PUBLICACIÓN IV: .......................................................................................... 227
PUBLICACIÓN V: ........................................................................................... 245
PUBLICACIÓN VI: .......................................................................................... 253
PUBLICACIÓN VII: ......................................................................................... 263
iii
LISTA DE ABREVIATURAS
[A] Concentración de monómeros

[AO] Concentración de oligómeros
AA Alcali activo
ABTS 2,2-azinobis-3-etilbenzotiazolin sulfónico
AC Extracción con acetona
AC + W Extracción con acetona seguida de extracción con agua
AH Hidrólisis ácida
Ar Anillo aromático
BG b-Glucosidasas
CBH Celobiohidrolasas
CIFOR Centro de Investigación Forestal
CMP Pasteado quimico-mecánico
Control+O2 y Pasta control sin pre-tratamiento de explosión por vapor deslignificada
NoSE con oxígeno
CTMP Pasteado quimico-termo-mecánico
DC Grado de condensación
E Extracción alcalina
ECF Secuencia de blanqueo libre de cloro elemental
ECN Centro de Investigación Energética de los Países Bajos
EG Eucalyptus globulus
EH Hidrólisis enzimática
G Unidad guayacilo de la lignina
H Unidad 4-hidroxifenilo de la lignina
HBT 2-hidroxibenzotriazol
HMF Hidroximetil furfural
HMQC Espectroscopía de correlación heteronuclear múltiple cuántica
(Heteronuclear Multiple Quantum Correlation)
HP Hesperaloe funifera
HSQC Espectroscopía de correlación heteronuclear simple cuántica
(Heteronuclear Single Quantum Correlation)
v
IFPB Biorefinería Integrada de Productos Forestales (Integrated Forest
Product Biorefinery)
Ind Pasta industrial
INIA Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y
Agrolimentaria
ISO Organización Internacional de Normalización
L Tratamiento enzimático con LMS
Lc Tratamiento enzimático control sin adición de LMS
LCC Complejo lignina - carbohidratos
LiP Lignina peroxidasa
LM-NoO2 Tratamiento enzimático con LMS sin adición de oxígeno
LMO2 Tratamiento enzimático con LMS y oxígeno
LMS Sistema laccasa - mediador
MnP Manganeso peroxidasa
MWL Milled Wood Lignin
nd No disponible
Nº Rev Número de revoluciones
NoE Muestras sin tratamiento de extracción
No-LMO2 Tratamiento enzimático control sin adición de LMS ni oxígeno
NREL Laboratorio Nacional de Energías Renovables del departamento de
Energía de EEUU
OHph Grupos hidroxilo fenólicos
OHpr Grupos hidroxilo primarios
OHsec Grupos hidroxilo secundarios
OMe Grupos metoxilo
P Blanqueo con peróxido de hidrógeno
Relación L/D Relación longitud / diámetro
RMN Resonancia Magnética Nuclear
Rto Rendimiento
S Sulfidez
S Unidad siringilo de la lignina
S0 Factor de severidad del tratamiento de explosión por vapor
SE Explosión por vapor (steam explosion)
vi
SEi Tratamiento “i” de explosión por vapor de Eucalyptus globulus
SEi’ Tratamiento “i” de explosión por vapor de Hesperalo funifera
SEM Microscopio de barrido electrónico
ºSR º Schopper - Riegler
T Temperatura
t Tiempo
TCF Secuencia de blanqueo totalmente libre de cloro
TGA Análisis termogravimétrico
UA Unidades de actividad
W Extracción con agua
X Tratamiento con xilanasa
XL Tratamiento en serie con xilanasa y lacasa
vii
1
RESUMEN / ABSTRACT
1 – Resumen / Abstract
1. RESUMEN / ABSTRACT
El concepto de biorrefinería se basa en el uso eficiente de la biomasa

lignocelulósica como materia prima en la producción integrada de combustibles, energía
y productos químicos. En una biorrefinería lignocelulósica se busca fragmentar un
material con alto contenido en celulosa, como paja, madera o residuos de papel, en tres
componentes principales: celulosa, hemicelulosa y lignina, y obtener a partir de ellos
distintos productos: combustibles, productos químicos, bio-polímeros y otros.
Basándonos en este concepto, una fábrica de pastas celulósicas podría

convertirse en una biorrefinería en la que, además de pasta de celulosa, se obtendrían
otros productos como etanol, bio-polímeros y otros compuestos químicos. En una
fábrica Kraft convencional, la mayor parte de las hemicelulosas y de la lignina presente
inicialmente en la madera son extraídas por la lejía de cocción y llevadas a la caldera de
recuperación donde se queman para producir vapor y electricidad y recuperar los
reactivos de cocción. Estos componentes suponen en su conjunto casi un 50% del peso
de la madera y mientras la lignina tiene un alto poder calorífico, las hemicelulosas solo
aportan la mitad de energía que aquella. Por ello, éstas podrían utilizarse para obtener
etanol o compuestos de mayor valor añadido que aumenten la rentabilidad de la fábrica.
Para conseguir dicho objetivo, sería necesaria una pre-extracción de las hemicelulosas
previa al pasteado químico, que permita su recuperación sin degradación y su
utilización en la síntesis de otros productos.
Dentro de este esquema se sitúa la presente tesis doctoral, cuyo objetivo

principal es estudiar y evaluar la posible integración del proceso de pasteado Kraft en
una biorrefinería lignocelulósica. Para ello se aplicó como método de extracción de
hemicelulosas un proceso de explosión por vapor (SE) previo al pasteado químico de
Eucalyptus globulus. Comparado con otros métodos, la explosión por vapor no utiliza
reactivos químicos, evitando los costes de recuperación y/o neutralización y
disminuyendo el impacto ambiental. Además, como se comprobó en esta tesis doctoral,
proporciona una fracción sólida con una estructura más abierta (mayor volumen de
macroporos y mayor capacidad de retención de agua), que facilitará la difusión de los
reactivos durante el pasteado. Por otro lado, tras el pre-tratamiento SE, se observó una
disminución del contenido en enlaces β-O-4 en la lignina presente en la fracción sólida,
debido a reacciones de despolimerización. Sin embargo, se produjeron también
3
Proceso Kraft en Biorrefinería
reacciones de repolimerización, cuyo resultado fue la presencia de lignina condensada

en dicho sólido. Por último, se observó una extracción del 47% de los xilanos, mientras
el contenido en celulosa del sólido se mantuvo prácticamente inalterado.
Con objeto de evaluar el potencial de la corriente de hemicelulosas extraídas

durante el pre-tratamiento SE para su uso como fuente de azúcares en la producción de
bioetanol, se sometió dicha corriente a hidrólisis enzimática e hidrólisis ácida. Se
obtuvieron mejores rendimientos mediante hidrólisis enzimática (conversión a azúcares
del 83% de los xilooligosacáridos en la fracción líquida). Además, se evaluó por otro
lado la hidrólisis enzimática de las fracciones sólidas, planteando la producción de
bioetanol como alternativa a la producción de pastas. Se observó que el rendimiento de
la hidrólisis aumentaba al aumentar la intensidad del pre-tratamiento de SE. Sin
embargo, para optimizar el proceso global, se debe tener en cuenta también el
aprovechamiento de la corriente líquida de hemicelulosas, que se ve perjudicado al
aumentar la intensidad del pre-tratamiento ya que provoca la degradación de la
hemicelulosa en el líquido y la generación de compuestos inhibidores de las etapas
consecutivas de hidrólisis y fermentación. Por ello, la aplicación de un pre-tratamiento
SE no muy severo (como los llevados a cabo en esta tesis) puede ser una buena opción
para aumentar el rendimiento global del proceso. Además, la aplicación de un
tratamiento con sistema lacasa mediador (LMS) antes de la hidrólisis enzimática de la
fracción sólida mejoró el rendimiento de obtención de glucosa, debido probablemente a
la eliminación de compuestos fenólicos inhibidores. A pesar de estas mejoras, la
cantidad de azúcares obtenidos a partir de la fracción sólida sólo representó el 12,3%
del peso de la materia prima original. Este dato, junto con el alto precio actual de la
pasta Kraft, señaló el pasteado Kraft como la mejor opción para aprovechar la fracción
sólida obtenida en el pre-tratamiento de explosión por vapor.
El estudio del pasteado Kraft mostró un aumento en la deslignificación del 70%,

debido a la mejor difusión de los reactivos de cocción dentro de la fracción sólida pre-
tratada mediante SE. De esta forma, el tiempo de cocción pudo reducirse en un 60%
para obtener pastas con una calidad similar a la comercial, permitiendo un aumento de
la productividad de la fábrica. Debido a la eliminación de hemicelulosas durante este
pre-tratamiento, la energía consumida por las pastas durante el refino fue mayor y las
propiedades mecánicas ligeramente inferiores a las de la pasta control. Sin embargo, las
propiedades ópticas fueron mayores, mostrando mayor blancura y menor índice de
4
amarilleamiento, además de menor contenido en ácidos hexenurónicos. Por otro lado, al

someter estas pastas pre-tratadas a una secuencia de bioblanqueo LEP (siendo L el
tratamiento LMS, E la extracción alcalina y P el blanqueo con peróxido de hidrógeno)
se observó una mayor blanqueabilidad de las mismas, obteniéndose pastas con menor
número kappa, mayor blancura y mejores propiedades colorimétricas que las pastas
bioblanqueadas control (sin pre-tratamiento SE). Además, se redujo el consumo de
peróxido de hidrógeno en un 20%. Por tanto, las pastas obtenidas mediante este
esquema de biorrefinería (SE+Kraft+bioblanqueo) podrían utilizarse para aplicaciones
en las que las propiedades ópticas sean importantes y no se necesite una gran resistencia
mecánica, consiguiendo además reducir el tiempo de cocción y el consumo de reactivos
químicos y obteniendo como subproducto una corriente rica en hemicelulosas.
Por otro lado, el pre-tratamiento de explosión por vapor mejoró la accesibilidad

de las astillas, como se ha comentado previamente, haciendo más eficaz la aplicación de
un tratamiento enzimático LMS previo al pasteado Kraft. Mediante esta forma de
biopulpeo, se evitan los inconvenientes de la aplicación industrial de biopulpeo con
hongos ligninolíticos, como son los largos tiempo de tratamiento y la pérdida de
rendimiento debido a la degradación de carbohidratos. Aplicando dicho LMS sobre las
astillas pre-explosionadas, se obtuvo un incremento en la deslignificación del 13,9% y
una reducción en el consumo de reactivos (12% y 6% para Na2S y NaOH
respectivamente) comparado con el proceso sin pre-tratamiento enzimático.
Por último, se evaluó el uso de Hesperaloe funifera, especie no maderera con

alto potencial papelero, en el esquema de biorrefinería planteado. Para ello se llevo a
cabo un pre-tratamiento SE seguido de un biopulpeo y bioblanqueo, esperando una
mayor eficacia de las etapas enzimáticas (LMS) debido a la estructura menos compacta
del H. funifera comparado con E. globulus. Mediante el pre-tratamiento se extrajo el
57% de los xilanos del material original y se obtuvieron pastas Kraft de calidad similar
a las obtenidas a partir de E. globulus. Además, el consumo de reactivos durante el
pasteado se redujo comparado con el control sin SE. Sin embargo, el efecto de la SE en
la deslignificación durante el pasteado fue menor que el observado para E. globulus. Por
otro lado, el tratamiento LMS durante el biopulpeo no proporcionó las ventajas
esperadas, pero sí lo hizo al aplicarlo en el bioblanqueo. Así, durante el bioblanqueo se
observó un aumento en la deslignificación debido a la SE y al LMS y una reducción del
consumo de peróxido de hidrógeno del 25%.
5
ABSTRACT
The concept of a forest biorefinery is based on the effective use of

lignocellulosic biomass as feedstock in the integrated production of fuels, energy and
chemical products. In a lignocellulosic biorefinery, a raw material with high cellulose
content, such as straw, wood or paper residues, is fragmented into three main
components: cellulose, hemicelluloses and lignin, that will be converted into different
products: fuels, chemical products, bio-polymers and others.
Based on this concept, a chemical pulp mill could be transformed into a forest
biorefinery, where ethanol, bio-polymers and other chemical products could be
produced in addition to pulp. In a conventional Kraft pulp mill, most of the
hemicelluloses and lignin present in the wood initially are extracted by the cooking
liquor and burned in the recovery boiler to produce steam and electricity and to
regenerate the pulping chemicals. These compounds represent about 50% of the wood
weight, and while lignin has a high heating value, hemicelluloses only provide half the
energy that lignin does. Therefore, the hemicelluloses could be used to produce ethanol
or other high value-added products, increasing the total revenue stream for the pulp
mill. To achieve this goal, the hemicelluloses should be extracted from wood prior to
pulping, allowing for their recovery without degradation and their utilization in the
synthesis of other products.
This is the context that frames the present doctoral thesis, whose main objective
is to study and to evaluate the potential integration of the Kraft pulping process into a
lignocellulosic biorefinery. To this end, a steam explosion process (SE) was used as
method for hemicelluloses extraction prior to chemical pulping of Eucalyptus globulus.
Compared to other methods, steam explosion does not use chemical reagents, avoiding
the recovery and/or neutralization costs and reducing the environmental impact.
Furthermore, as it has been proved in this doctoral thesis, this method yields a solid
fraction with a more open structure (greater macropore volume and increased water
retention capacity) that might favor an efficient diffusion of cooking liquor into the
fibers during pulping. On the other hand, depolymerization reactions led to a decrease in
the β-O-4 structure of the lignin remaining in the solid fraction after the SE pre-
treatment. Nevertheless, repolymerization reactions also took place, resulting in the
6
presence of condensed lignin in the solid fraction. Finally, a 47% of the wood xylan was
extracted, while the cellulose content remained almost constant.
To assess the potential of the hemicelluloses extracted in the SE pre-treatment to

be used as a source of sugar for the production of bioethanol, this liquid fraction was
subjected to enzymatic and acid hydrolysis. The best yield was obtained by enzymatic
hydrolysis (83% of the xylooligosaccharides in the liquid fraction were converted to
sugars). In addition, the enzymatic hydrolysis of the solid fractions was also evaluated,
considering the bioethanol production as an alternative to pulp production. It was
observed that the hydrolysis yield increased whit the severity of the SE pre-treatment.
However, to optimize the overall process, it should also be taken into account the
utilization of the hemicelluloses liquid current. And, when the severity of the pre-
treatment increases, so does the degradation of hemicelluloses and the generation of
inhibiting compounds, which reduces the yields of the subsequent enzymatic hydrolysis
and fermentation stages. Therefore, the use of a mild SE pre-treatment (like those
applied in this thesis) can be a good option to increase the overall yield of the process.
Moreover, the application of a laccase mediator system (LMS) treatment before the
enzymatic hydrolysis of the solid fractions increased the glucose yield, likely as a
consequence of the removal of inhibiting phenolic compounds. Despite these
improvements, the amount of sugars obtained from the solid fraction represented only a
12.3% of the original raw material weight. This finding, and the current high price of
Kraft pulp, makes Kraft pulping stand out as the best option to exploit the solid fraction
obtained in the SE pre-treatment.
The study of the Kraft pulping process showed an increase in delignification by

up to 70% caused by a more efficient diffusion of cooking liquor into the SE pre-treated
solid fraction. Thus, the cooking time could be shortened by 60% obtaining pulps of a
quality similar to commercial standards, and allowing an increase in the production rate.
Due to the removal of hemicelluloses in the pre-treatment, the exploded pulp required
more energy during refining and the mechanical properties were slightly worse than
those of the control pulp. However, the optical properties were better, showing higher
brightness and a smaller yellowness index, as well as less hexenuronic acid content.
Moreover, when these pulps were subjected to a LEP biobleaching sequence (L
standing for LMS treatment, E for alkaline extraction, and P for hydrogen peroxide
bleaching), exploded pulps proved to have more bleachability. Thus, biobleached
7
exploded pulps had lower kappa number, higher brightness and better colorimetric
properties than the biobleached control pulp (without SE pre-treatment). In addition,
there was a reduction in hydrogen peroxide consumption of 20%. Therefore, pulps
obtained by this biorefinery process (SE+Kraft+biobleaching) could be used in
applications for which optical properties are important but not so mechanical strength,
achieving also a reduction in cooking time and chemical consumption and obtaining as
a byproduct a liquid current rich in hemicelluloses.
On different note, the steam explosion pre-treatment improved the accessibility

of chips, as mentioned previously, and consequently, the implementation of a LMS
enzymatic treatment prior to Kraft pulping was more effective. This biopulping process
avoided some of the drawbacks of the industrial application of biopulping using
ligninolytic fungi, such as long treatment times and yield loss due to degradation of
carbohydrates. Applying this LMS treatment to pre-exploded chips, an increase in the
delignification of 13.9% and a reduction in the chemical consumption (12% and 6% of
Na2S and NaOH respectively) were achieved compared to the same process without
enzymatic treatment.
Finally, Hesperaloe funifera, a non-wood material with high potential in pulp

and paper applications, was evaluated as feedstock for the biorefinery process proposed
in this doctoral thesis. To this end, a SE pre-treatment followed by biopulping and
biobleaching was carried out, expecting that the relatively less compact structure of H.
funifera, compared with E. globulus, would results in higher efficiency of the enzymatic
steps (LMS). The SE pre-treatment allowed for the extraction of 57% of the xylan
present in the raw material, leading to Kraft pulps of a quality similar to that of E.
globulus. Furthermore, chemical consumption during the pulping process was reduced
compared to the control process without SE pre-treatment. However, the effect of the
SE pre-treatment in terms of delignification during pulping was smaller than that
observed for E. globulus. On the other hand, the LMS treatment in biopulping did not
result in the expected benefits, but did so when applied in biobleaching. Thus, the
combination of SE and LMS led to an increase in delignification during biobleaching
and a reduction in hydrogen peroxide consumption by up to 25%.
8
2
INTRODUCCIÓN
2 - Introducción
2. INTRODUCCIÓN
2.1 - Composición de la biomasa lignocelulósica
La biomasa lignocelulósica está formada básicamente por tres componentes

principales (celulosa, hemicelulosa y lignina) junto con otros componentes minoritarios
que no forman parte de la pared celular como son los extractivos y los compuestos
inorgánicos. Estos compuestos minoritarios representan el 4-10% del peso seco, e
incluyen diferentes grasas, terpenos, alcaloides, proteínas, fenoles, pectinas, gomas,
resinas, etc., cuyas proporciones y composición dentro de un mismo tipo de material
varían en función de la edad, estado de crecimiento u otros factores.
La proporción de los diferentes componentes principales de la biomasa

lignocelulósica varía con el tipo de planta, la edad o la parte del tejido vegetal de donde
provengan (Fengel y Wegener, 1989). En la tabla 2.1 se muestra la composición típica
de diferentes especies lignocelulósicas.
Tabla 2.1. Composición química porcentual de algunas especies lignocelulósicas (% en peso)
Lignocelulosa Extractos Lignina Celulosa Xilanos Mananos Arabanos

Abeto 1 9,6 27,1 41,9 6,1 14,3 1,2
1
Pino 10,8 27,5 37,7 4,6 7,0 nd
2
Abedul 4,8 22,8 38,2 18,5 1,2 nd
Álamo 2 nd 18,1 49,9 17,4 4,7 1,8
Eucalipto 3 2,8 31,3 45,0 14,1 3,1 2,0
3
Arce 3,2 25,4 42,0 22,1 3,1 3,7
4
Paja de trigo 15,3 18,1 37,8 22,8 0,3 1,6
Paja de cebada 5 nd 16,1 33,1 20,2 nd 3,8
nd: no disponible
1
Hayn et al. (1993)
2
Wiselogel et al. (1996)
3
Henriksson et al. (2007)
4
Perez et al. (2008)
5
Garcia-Aparicio et al. (2006)
La pared celular de los materiales lignocelulósicos está compuesta por multitud

de filamentos enrollados helicoidalmente con relación al eje de la célula
(macrofibrillas); estas macrofibrillas son agregados de unos 250 filamentos más finos
11
denominados microfibrillas y constituidos a su vez por unas 20 fibrillas elementales.

Las fibrillas elementales están formadas por entre 40 y 100 largas cadenas de celulosa
simples, dispuestas paralelamente, que se unen transversalmente entre sí por enlaces
tipo puente de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals.
En la pared celular se distinguen la pared primaria (P) y la pared secundaria

(Figura 2.1). Las paredes primarias de dos células adyacentes están unidas entre sí por
lignina, denominándose a esta capa de unión laminilla media (LM). La cavidad interior
de la célula se llama lúmen y conecta unas células con otras formando el tejido
conectivo. La pared secundaria está constituida por tres capas que se diferencian en la
orientación de las fibrillas de celulosa. En las capas exterior e interior (S1 y S3) las
fibrillas están dispuestas formando un amplio ángulo con el eje de la célula, mientras
que la disposición de las fibrillas en la capa intermedia gruesa (S2) es prácticamente
paralela al eje. Algunas especies madereras (principalmente algunas coníferas) tienen
una capa adicional sobre S3 en forma de revestimiento interior con irregularidades a
modo de verrugas (capa verrugosa V).
S3
S2
S1
LM
Figura 2.1. Capas de la pared celular de las fibras vegetales. (Côte, 1977)
Los tres componentes principales de la biomasa (celulosa, lignina y

hemicelulosa) se encuentran presentes en las distintas capas de la pared celular,
aumentando el contenido en lignina y disminuyendo el contenido en celulosa al ir de las
12
2 - Introducción
capas interiores a las exteriores. En la figura 2.2 se muestra una representación

esquemática de la disposición y uniones entre los principales constituyentes de la pared
secundaria, pudiendo observarse las microfibrillas de celulosa inmersas en una matriz
de lignina en la que también está presente la hemicelulosa.
Figura 2.2. Representación esquemática de las relaciones entre los principales constituyentes de
la pared secundaria (celulosa, lignina y hemicelulosa) de una angiosperma herbácea. Las
uniones entre estos polímeros se completan mediante puentes intermoleculares formados por los
ácidos p-hidroxicinámicos (Bidlack et al., 1992).
2.1.1 - Celulosa
La celulosa es el constituyente principal de la pared celular vegetal y representa

entre un 40 a 46% en madera de coníferas, entre un 41 a un 50% en madera de
frondosas y entre un 40 a 60% en especies no madereras (Aitken et al., 1988). Es un
biopolímero homogéneo lineal, muy regular, constituido por cadenas lineales de D-
13
glucosa unida mediante enlaces β-(1→ 4) para formar la molécula de celobiosa, el

disacárido que representa la unidad constitutiva de la celulosa.
HOH 2C OH HOH 2C OH HOH 2C

O O HO O O HO O O
HO O HO O O HO O
O
OH OH OH
HOH 2C HOH 2 C
Figura 2.3: Esquema de la cadena de celulosa.
El grado de polimerización de la celulosa en la madera oscila entre 7.000 y

14.000. La unión de estas macromoléculas alterna la sucesiva formación de regiones
cristalinas y regiones amorfas. En las zonas cristalinas, inaccesibles a los reactivos
químicos, las cadenas de celulosa se mantienen unidas por puentes de hidrógeno y
fuerzas de Van der Waals. En las regiones amorfas, la disposición de las moléculas es
menos compacta, y la unión entre las cadenas es menor que en las regiones cristalinas.
La fracción amorfa es la más accesible al agua y a los agentes químicos, siendo por tal
razón la más reactiva. Es importante señalar la existencia de grupos H-C-OH y H-C-
CH2OH, en el polímero de celulosa, los cuales dado su carácter polar condicionan las
relaciones entre el agua y la madera (Aitken et al., 1988; Higuchi, 1990; Peraza et al.,
1993). Las diferencias en el grado de polimerización y peso molecular también influyen
en el comportamiento de la celulosa frente a diferentes reactivos químicos o enzimas.
Además, el componente celulósico del tejido vegetal se encuentra embebido en

una matriz formada por hemicelulosa y lignina, estando por tanto, protegido del ataque
enzimático y químico. Esta resistencia, unida al alto grado de organización de la
celulosa, que aporta resistencia química y mecánica, es la causa de que este polímero
sea el material estructural de las plantas.
2.1.2 - Hemicelulosa
La hemicelulosa actúa junto con la lignina como matriz soporte para las
microfibrillas de celulosa en la pared celular, por tanto se encuentra unida tanto a
celulosa como a lignina por distintos tipos de enlace. Son un grupo de polisacáridos
bien diferenciados de la celulosa, fácilmente extraíbles con álcali y mucho menos
resistentes a la hidrólisis que la celulosa (Tenkanen et al., 1995). A diferencia de la
celulosa, son heteropolímeros que pueden estar ramificados con mono-, di- u
14
2 - Introducción
oligosacáridos de cadena corta, dando lugar a una estructura no cristalina. Su grado de

polimerización es mucho menor que el de la celulosa y varía entre 70 y 200, con valores
medios de 150.
Estos polisacáridos ramificados están formados por una cadena lineal de

monosacáridos unidos principalmente por enlaces β-(1→ 4) (en el caso de la D-
galactosa: β-(1→ 3)), a la cual se unen cadenas laterales cortas a menudo de azúcares
distintos a los de la cadena principal. Los residuos de monosacáridos incluyen pentosas
(D-xilosa y L-arabinosa), hexosas (D-glucosa, D-galactosa, L-galactosa, D-manosa, L-
ramnosa y L-fucosa) y ácidos urónicos (ácido D-glucurónico y ácido D-galacturónico),
que pueden encontrarse acetilados o en forma de ésteres metílicos. Las hemicelulosas, al
igual que la celulosa, presentan grupos H-C-OH, por lo que tienen carácter hidrófilo.
(Aitken et al., 1988; Peraza et al., 1993).
HOOC
OH 3 C O
HO
OH COH 3 C
O OH
O O HO O O O O O
HO O O O O HO O
O O
OH OH
OH O
O
HOH 2 C
OH OH
HOH 2 C
OH
Figura 2.4. Esquema de la estructura de las hemicelulosas.
Mientras que la estructura de la celulosa es la misma en los diferentes tipos de

madera y otros materiales lignocelulósicos, en las hemicelulosas existe una considerable
variación entre las diferentes maderas. En las frondosas se encuentran principalmente
hemicelulosas con unidades de cinco carbonos (pentosas), principalmente xilanos, con
numerosos por grupos acetilo en su estructura, y representan entre un 20 y 35% de la
masa total de la madera (Dahlman et al., 2003; Fengel y Wegener, 1989). En cambio, en
las coníferas abundan más las hemicelulosas con unidades de seis carbonos (hexosas),
principalmente manosas (glucomananos), representando entre un 25 y 30% de la masa
total (Dahlman et al., 2003). Las plantas herbáceas presentan, al igual que las maderas
de frondosas, un mayor porcentaje de pentosanos, pero presentando menor proporción
de grupos acetilo (Fengel y Wegener, 1989).
15
2.1.3 - Lignina
La lignina representa entre un 25 y 31% de la biomasa de las maderas de

coníferas, entre un 17 y 26% de las maderas frondosas y entre un 7 y 21% de las
especies no madereras (Aitken et al., 1988). La lignina es un polímero heterogéneo
complejo, de naturaleza fenilpropanoide, covalentemente asociado a la celulosa, las
hemicelulosas y las proteínas. Es un biopolímero tridimensional amorfo, aunque
algunos autores han descrito cierta ordenación tridimensional (Faulon et al., 1994), cuya
naturaleza aromática y baja proporción de grupos polares le confiere carácter hidrófobo.
Se sintetiza por la polimerización deshidrogenativa de tres alcoholes aromáticos de tipo
fenilpropano, denominados alcoholes cinamílicos. Estos alcoholes (figura 2.5) se
diferencian entre sí por las distintas sustituciones que presenta el anillo aromático:
alcohol p-cumarílico que no presenta ningún sustituyente y que va a dar lugar a las
unidades 4-hidroxifenilo de la lignina (unidades H); el alcohol coniferílico, que presenta
un grupo metoxilo en la posición 3 del anillo aromático y que va a dar lugar a las
unidades guayacilo de la lignina (unidades G); y el alcohol sinapílico, que presenta
sustituidas las posiciones 3 y 5 del anillo aromático con sendos grupos metoxilos y que
dará lugar a las unidades siringilo de la lignina (unidades S).
CH 2OH CH 2OH CH 2OH
CH 3O OH3C CH 3O
OH OH OH
Alcohol p-cumarílico Alcohol coniferílico Alcohol sinapílico
Unidad 4-hidroxifenilo Unidad Guayacilo Unidad Siringilo
Figura 2.5. Monómeros precursores de la lignina.
Las unidades fenilpropano están interconectadas entre sí por una serie de enlaces
de tipo éter (C-O-C) y carbono-carbono (C-C), en los que participan tanto los anillos
aromáticos como las cadenas laterales, dando lugar a una serie de subestructuras tales
como: guayacilglicerol-β-aril éter, fenilcumarano, diarilpropano, resinol, bifenilo y
difenil-éter, así como otras menos abundantes (figura 2.6). El enlace intermonomérico
más frecuente, β-O-4’, está presente en la subestructura guayacilglicerol-β-aril éter y es
16
2 - Introducción
frecuentemente la clave de los procesos de despolimerización. Por el contrario, otros

enlaces como β-5’ (en fenilcumarano), β-1’ (en diarilpropano), β-β’ (en resinol), 5-5’
(en bifenilo) y 4-O-5’ (en difenil-éter), son muy resistentes.
R1, R2, R3 = H o OMe

R’ = H, carbohidrato o Ar
Figura 2.6. Enlaces más comunes en la lignina.
El tipo de unidades presentes en la lignina, así como los tipos de unión entre las
mismas puede variar entre los distintos grupos de plantas (coníferas, frondosas y
herbáceas). Incluso en una misma planta la composición de la lignina puede variar en
los distintos tejidos y capas de la pared celular. La lignina de coníferas se forma
mayoritariamente a partir del alcohol coniferílico (unidad G), mientras que la lignina de
frondosas se sintetiza a partir de los alcoholes coniferílico y sinapílico (unidades G y S,
respectivamente). La lignina de las plantas herbáceas está compuesta de unidades H
procedentes del alcohol p-cumarílico, además de las unidades G y S en distintas
proporciones. La existencia de dos, una o ninguna posición libre en las posiciones orto
del grupo fenólico de las unidades H, G y S respectivamente es la causa de la distinta
reactividad de cada tipo de lignina. Así por ejemplo, los dos grupos metoxilo de las
unidades S evitan la condensación de lignina en los procesos de cocción.
Dado que la formación de los enlaces monoméricos que constituyen el polímero

de lignina en la naturaleza es un proceso aleatorio, es difícil atribuirle una estructura
definida. La complejidad de este polímero marca su gran resistencia al ataque de los
microorganismos, a la vez que protege a los polisacáridos del ataque de los mismos
17
(Howard et al., 2003). Así mismo, su estructura proporciona rigidez y dureza a los
tejidos vegetales, a la vez que minimiza la permeabilidad de dichos tejidos al agua
(Evans y Betts, 1991). Sin embargo, es esta misma complejidad la que hace que el
polímero sea difícilmente biodegradable.
La fuerte asociación encontrada entre la lignina y los carbohidratos de la madera

sugiere la existencia de enlaces químicos y físicos entre ellos, dando lugar a los
llamados complejos lignina – carbohidratos (LCC). Estos enlaces son más frecuentes
entre lignina y hemicelulosa que entre lignina y celulosa, ya que las hemicelulosas son
más reactivas y el área de contacto físico entre lignina y celulosa es menor que el
existente entre lignina y hemicelulosas. Las uniones lignina-hemicelulosa se realizan
mediante intermediarios cinamílicos como el ácido ferúlico, el ácido diferúlico y el
ácido ρ-cumárico (Iiyama et al., 1990; Lam et al., 2001) los cuales se unen mediante
diferentes intermediarios monoméricos a la cadena principal del xilano. Debido a estos
enlaces, se forma una matriz compleja que juega un papel importante en las propiedades
físicas y reactivas de la madera.
2.2 - Procesos implicados en la fabricación de pastas Kraft
En 2010, la producción total en la industria española de la pasta y el papel fue de

8 millones de toneladas, que se distribuyen en 1,8 millones de pasta de celulosa y 6,2
millones de papel y cartón. Así, España se sitúa en el sexto lugar de Europa, con 11
instalaciones de fabricación de pasta de celulosa y 83 de papel y cartón (ASPAPEL,
2011).
Existen muchos tipos de papel destinados a diferentes aplicaciones como libros,

periódicos, usos higiénicos y sanitarios, cajas, envases y embalajes, sacos, etc.
Dependiendo del producto final deseado, varían tanto la materia prima utilizada, como
el proceso de producción. Por ejemplo, para producir papel prensa se utiliza
normalmente fibra reciclada. En cambio, para la elaboración de papeles de impresión y
escritura o papeles higiénicos y sanitarios, se utiliza fibra virgen, siendo el proceso de
pasteado más utilizado el proceso Kraft. En los siguientes apartados se describen las
materias primas más utilizadas y los procesos implicados en la producción de pasta
Kraft.
18
2 - Introducción
2.2.1 - Materias primas utilizadas
 Materias primas madereras

En la actualidad, más del 90% de las fibras vírgenes usadas para la producción
de papel provienen de la madera, aunque hasta mediados del siglo pasado, las fibras no
madereras fueron la fuente exclusiva de fibras para la fabricación de papel.
Los fabricantes de pasta y papel suelen clasificar las plantas madereras en

especies de fibra corta (frondosas) y de fibra larga (coníferas). Desde un punto de vista
estructural, la diferencia principal entre coníferas y frondosas se sitúa en sus sistemas de
conducción. En las coníferas, más primitivas y menos evolucionadas, son las fibras las
responsables del soporte y la conducción. En las frondosas, de origen más reciente,
estas funciones se realizan por separado y más eficientemente por células
especializadas: las fibras son responsables del soporte y los vasos de la conducción. Las
fibras de coníferas son largas (longitud 2-5 mm, anchura 30-60 μm), tienen una pared
relativamente delgada y colapsan fácilmente. Las pastas elaboradas a partir de ellas son
muy homogéneas, están constituidas casi exclusivamente por fibras y proporcionan
papeles con elevadas resistencias mecánicas. Por el contrario, las maderas de especies
frondosas tienen fibras más cortas (longitud 1 mm, anchura 10-20 μm), de pared gruesa
y lumen estrecho. La proporción de fibras en las especies frondosas varía del 40 al 78%,
con un contenido considerable en otras células especializadas de naturaleza no fibrosa.
Estos elementos que aparecen en las pastas, no aportan mucha resistencia al papel y
pueden presentar problemas en la posterior impresión. Sin embargo, las pastas de
frondosas mejoran la formación de la hoja, lisura, volumen específico y opacidad,
comparado con las pastas de coníferas.
Entre las distintas especies madereras, el Eucalyptus globulus es la más utiliza

en la península Ibérica y en Iberoamérica. En España, existen unas 550.000 ha
dedicadas al eucalipto, distribuidas entre Andalucía (44 %), Galicia (27 %),
Extremadura (14 %) y la cornisa Cantábrica (11 %). Es una frondosa de crecimiento
rápido (10-14 años), con una productividad media situada en 10 m3/ha año y con una
madera de alta calidad, que confiere unas propiedades especiales al producto final. Su
lignina contiene más unidades siringilo que guayacilo, lo que facilita la cocción y el
blanqueo (Ibarra et al., 2006). Además, su alto contenido en xilanos hace del eucalipto
una materia prima muy adecuada en una biorrefinería con recuperación de
19
hemicelulosas. Por todas estas características, el E. globulus es la materia prima

utilizada en la presente tesis doctoral.
 Materias primas no madereras

Las materias primas no madereras podrían suponer una alternativa, al menos
parcial, al uso de madera para la producción de pasta de celulosa. Bajo esta
denominación se incluyen una gran variedad de especies no arbóreas (lino, cáñamo,
abacá, sisal y bambú, entre otros), así como los residuos generados en labores agrícolas
(paja de cereal) e industriales (bagazo de caña de azúcar) (Alaejos et al., 2004). La
producción de pasta de celulosa a partir de materias no madereras ha aumentado un
14,6% en el periodo 2000 – 2009, mientras que la producción de pasta de celulosa a
partir de madera ha disminuido un 6,9% en el mismo periodo (FAO, 2011). Este hecho
se debe principalmente a: 1) el valor añadido que se da a los cultivos agrícolas cuando
se utilizan sus residuos para la producción de pasta; 2) la disponibilidad de estos
materiales en países con limitados recursos forestales; 3) la posibilidad de obtener
diferentes papeles especiales debido a la amplia variedad morfológica y en composición
química que muestran las fibras no madereras; y 4) la reducción del consumo de
reactivos químicos y energía en el pasteado y blanqueo debido a su estructura más
porosa y accesible (Alaejos et al., 2004; Sánchez et al., 2011). Pese a estas ventajas, la
producción de pasta a partir de materias no madereras sólo representaba un 8,4% de la
producción total en 2009 (FAO, 2011), debido a los problemas asociados a su cultivo y
uso. Entre las principales desventajas se encuentran: 1) los problemas de almacenaje y
disponibilidad derivados de la estacionalidad de estas materias, es decir, de su cosecha
en un periodo determinado del año; 2) su baja densidad, que complica y encarece su
transporte hasta las fábricas; 3) su alto contenido en cenizas y extractos, que disminuye
el rendimiento de producción de pasta; y 4) la necesidad, en muchos casos, de etapas de
separación de las fibras previas al pasteado.
Dentro de las especies no madereras, algunas de las más utilizadas son sisal,
lino, cáñamo, abacá, bambú, etc. Estudios recientes han demostrado el potencial de
Hesperaloe funifera para la producción de papel (McLaughlin, 2000; Sanchez et al.,
2010; Wong y McLaughlin, 2000). Las principales características de esta planta son sus
largas y delgadas fibras (longitud 3,5-4,5 mm y anchura 7,0-10 μm) y su bajo contenido
en lignina (10% lignina Klason). Estas características, junto con sus bajos
20
2 - Introducción
requerimientos hídricos (debido a su metabolismo ácido crasuláceo) hacen que sea una
planta con gran potencial papelero en áreas con escasos recursos acuíferos. Tras 5 años
de cultivo, se puede recoger la primera cosecha, y posteriormente se recogen cosechas
cada 3 años. Así, en plantaciones de alta densidad (27.000 plantas por hectárea) se
pueden obtener aproximadamente 20 toneladas de biomasa seca por hectárea y año, tras
la primera cosecha (Wong y McLaughlin, 2000). Por todas estas características, en la
presente tesis doctoral se ha evaluado el uso de H. funifera en el esquema de
biorrefinería forestal planteado, comparando las pastas obtenidas con aquellas obtenidas
a partir de E. globulus.
2.2.2 - Pasteado
La transformación de la madera en papel puede realizarse por dos vías

principales: tratamiento mecánico o tratamiento químico. En ambos procesos la materia
prima que contiene la celulosa se separa en sus fibras individuales.
En los procesos de fabricación de pasta mecánica se aplican esfuerzos mecánicos

de compresión y cizalla para separar las fibras y dejar la mayoría de la lignina en ellas,
aunque hay disolución de algunos compuestos. En consecuencia, es un proceso con un
alto rendimiento en cuanto a la producción de pasta, pero el consumo de energía es muy
elevado y la capacidad de enlace fibra-fibra es baja.
En la fabricación de pasta química, se utilizan productos químicos para

fraccionar y disolver la lignina y liberar las fibras. Dentro del pasteado químico, el
proceso más utilizado a nivel industrial es el proceso Kraft, que representa
aproximadamente el 80% de la producción mundial de pasta. Esto se debe a que, con
este proceso, se obtienen pastas más resistentes y blanqueables hasta altos niveles de
blancura, es posible aplicarlo a todas las especies de madera, utiliza ciclos cortos de
cocción (comparado con los procesos a la sosa y al sulfito), y dispone de sistemas
eficaces de recuperación de lejías negras (recuperando tanto productos químicos como
energía). En cambio, presenta también una serie de desventajas como el alto costo de
inversión, la polución por mal olor, el bajo rendimiento del pasteado y el alto costo del
blanqueo (económico y medioambiental).
Existen también procesos semiquímicos, semimecánicos o químico-mecánicos

de producción de pasta. Estos procesos constan de una etapa de cocción con un reactivo
21
químico bajo condiciones suaves, y una etapa mecánica de separación y fibrilación de

las fibras celulósicas. Dependiendo de cuál de las dos etapas sea la predominante estos
procesos estarán más próximos a los químicos o a los mecánicos.
Previo al pasteado, se deben llevar a cabo una serie de etapas comunes para los
distintos tipos de pasteado. Así, los troncos de madera que llegan a la fábrica se
descortezan y se astillan. Las astillas obtenidas se tamizan para seleccionar aquellas de
10-30 mm de longitud y 2-8 mm de espesor. Tanto las cortezas como las astillas de
tamaño más pequeño se llevan a una caldera de biomasa, donde son quemadas para
generar vapor y a partir de él, energía eléctrica. Las astillas seleccionadas se introducen
en el esquema de producción de pasta Kraft que se detalla en la figura 2.7.
Agua de lavado
Pasta
Lavadores de cruda Pasta
Astillas Digestor Kraft Blanqueo
pasta blanqueada
Lejía negra Na2SO4

Lejía blanca Condensado
diluida
(NaOH, Na2S)
Vapor
Caldera de
Evaporadores Vapor
recuperación
Lejía negra
concentrada
Condensado
contaminado Gases no Fundido
p/ Columna condensados
Destilación p/ Incineración Tanque de
disolución de
Lejía blanca fundido
débil
Lejía Verde
Planta de (Na2CO3, Na2S) Residuos,
caustificación impurezas
Lodo de Cal Cal

(CaCO 3) (CaO)
CaCO3 Horno de cal
Figura 2.7. Esquema del proceso de pasteado Kraft, incluyendo el circuito de recuperación de
lejía negra.
22
2 - Introducción
Las astillas pueden ser precalentadas con vapor previamente a su entrada al

digestor, de manera que se elimina el aire, el cual interfiere en los procesos de
impregnación. Tras entrar en el digestor, las astillas son impregnadas con la lejía blanca
o licor de cocción (solución acuosa de hidróxido sódico y sulfuro sódico) a una
temperatura de 155-175 ºC. El tiempo de cocción, en condiciones de máxima
temperatura, se encuentra alrededor de 1-2 horas. En estas condiciones, las fibras se
liberan de la matriz de lignina y hemicelulosa mediante la disolución de la lignina y de
buena parte de las hemicelulosas por la reacción con la lejía blanca. El grado de
deslignificación obtenido depende de la carga de madera / reactivo químico (álcali
activo, sulfidez e hidromódulo) y del tiempo y la temperatura de cocción, pero también
de si se va a blanquear (número kappa bajo) o no el producto final. En procesos de
cocción convencionales, la deslignificación de la madera de coníferas puede llegar a un
número kappa de 30-35, permitiendo una resistencia de la pasta aceptable. En el caso de
madera de frondosas el número kappa puede ser de 14-22.
La selectividad de la deslignificación cambia durante el proceso (Gellerstedt y

Lindfors, 1984; Lindgren y Lindström, 1996) identificándose 3 fases: fase inicial
(rápida), fase principal o masiva (media) y fase final o deslignificación residual (lenta).
Aproximadamente el 20% de la lignina se disuelve durante el calentamiento de las
astillas y de la lejía de cocción (fase inicial). La mayor parte de la lignina (60-70%) se
disuelve durante la cocción a máxima temperatura (160-170 ºC) (fase principal).
Durante la fase final, la disolución de la lignina empieza a ser menos selectiva y es
difícil eliminar la lignina residual prolongando el tiempo de cocción sin disminuir de
manera importante el rendimiento del proceso y la resistencia de la fibra. Por ello, la
cocción Kraft debe pararse cuando la deslignificación es aproximadamente del 90%
(aunque puede depender de las condiciones de cocción). La lignina residual puede
eliminarse por medio de procesos de deslignificación selectiva con oxígeno y durante
las distintas etapas de blanqueo donde también se emplea oxígeno, ozono, peróxido de
hidrógeno, dióxido de cloro y otros. Sin embargo, incluso con los reactivos más
selectivos, la deslignificación es lenta y difícil. La presencia de estructuras de lignina
nativas estables frente a soluciones alcalinas, las reacciones de condensación de la
lignina, y la presencia de enlaces lignina – carbohidratos estables frente a soluciones
alcalinas, son las principales razones para esta difícil y lenta eliminación de la lignina
residual.
23
Tras la cocción, la pasta se tamiza para separar los trozos de madera que hayan
quedado sin digerir, se lava para separar la mezcla de cocción utilizada (lejía negra) y se
envía bien al proceso de blanqueo o a la máquina de producción de papel. La madera sin
digerir se devuelve al digestor o a la caldera de biomasa para quemarla y producir
energía.
Una de las ventajas importantes del método Kraft es la recuperación de sus lejías
negras, que no sólo permite la recuperación de los productos químicos, sino que,
además, aprovecha el poder calorífico de las mismas para generar el vapor necesario
para el proceso, incluso obteniendo un excedente de energía. La lejía negra recogida del
digestor contiene sustancias orgánicas disueltas cuya composición química exacta
depende de las características de la especie de la madera y de las condiciones de la
cocción. Normalmente la lejía negra presenta un contenido en sólidos disueltos del 14-
18%, que debe concentrarse considerablemente previamente a su combustión. Para ello
la lejía negra se concentra mediante una evaporación multiefecto hasta un contenido en
sólidos de 65-75%. A medida que el contenido en sólidos se incrementa se debe tener
en cuenta que la viscosidad de la lejía negra también se incrementa, y puede ser
demasiado alta para ser bombeada. A presión atmosférica el límite se encuentra
alrededor de 72-74% de sólidos. La lejía negra puede ser concentrada hasta un
contenido en sólidos del 80% en superconcentradores, que operan a mayor presión y
temperatura.
Los condensados procedentes de la evaporación de las lejías negras presentan un

grado de contaminación diferente en función de su origen, típicamente contienen
compuestos de azufre total reducido, metanol y otros componentes volátiles. Antes de
su utilización como agua en el proceso o su vertido, se efectúa una desorción o
“stripping”. Los vapores de esta operación se incorporan en la caldera de cortezas, o de
lejía, para su eliminación.
La lejía negra concentrada, con adición de sulfato de sodio (Na2SO4), es

introducida en la caldera de recuperación para su posterior combustión, para recuperar
el sodio y el azufre, así como obtener energía procedente de los gases de combustión.
Un incremento en el contenido de sólidos en las lejías negras concentradas de 65-70% al
80-85% provoca un cambio en los balances de materia y energía, así como en las
condiciones de combustión de la caldera de recuperación. Cuanta menos agua entra en
24
2 - Introducción
la caldera menor flujo de gases de combustión se obtiene, y cuanto mayor es el

contenido en sólidos de la lejía negra, mayor temperatura de combustión se obtiene, lo
cual hace que mayor cantidad de sodio sea vaporizado, que reacciona con el azufre y
queda retenido en las cenizas. Se reducen así las emisiones de azufre procedentes de la
caldera.
La materia fundida procedente de la caldera de recuperación se disuelve en agua

o lejía blanca débil para producir lejía verde, compuesta principalmente de sulfuro de
sodio (Na2S) y carbonato sódico (Na2CO3). La lejía verde se clarifica y caustifica con
hidróxido de calcio convirtiendo el carbonato de sodio en hidróxido de sodio para
producir lejías blancas para la digestión.
Las cenizas y otras impurezas son eliminadas del proceso por decantación de la
lejía verde. Los lodos de carbonato cálcico procedentes del proceso de caustificación se
separan por filtración de las lejías blancas, se lavan y se calcinan en un horno de cal
para regenerar la cal viva. El óxido de calcio se hace reaccionar con agua y se obtiene
hidróxido de calcio, que se emplea en el proceso de caustificación. La calcinación de los
lodos se efectúa en un horno rotatorio, con aporte de combustible (coque, carbón, fuel o
gas).
2.2.3 - Blanqueo
Para producir pastas químicas de alta calidad con elevados grados de blancura es
necesario utilizar métodos de blanqueo que continúen la deslignificación de la pasta
iniciada en la cocción y reduzcan el color. El blanqueo total de una pasta química se
realiza en sucesivas etapas, utilizando diferentes productos químicos (cloro, hidróxido
sódico, hipoclorito sódico, dióxido de cloro, peróxido de hidrógeno, oxígeno, ozono,
hidrosulfitos de sodio o ditiosulfato sódico) y diferentes condiciones de consistencia,
concentración del reactivo químico, pH, temperatura, tiempo de retención, etc. Las
condiciones y/o reactivos varían en cada etapa pero siempre teniendo en cuenta el
compromiso entre el aumento del grado de blancura y la pérdida de propiedades
mecánicas debido a la degradación de las fibras de celulosa. Se ha observado que se
puede conseguir una mayor blancura con una menor degradación de las fibras si se
aplican varias etapas en serie con cantidades más pequeñas de reactivos y con un lavado
entre etapas. En las primeras etapas se utilizan reactivos que contribuyen a la
25
deslignificación de las pastas, mientras en las últimas etapas se utilizan agentes que
eliminen el color residual. El blanqueo se consigue eliminando los compuestos que son
capaces de adsorber luz visible o modificándolos para reducir esta capacidad.
Los reactivos clorados (cloro, hipoclorito y dióxido de cloro) utilizados para el

blanqueo de pasta cloran la lignina residual, solubilizándola y generando cloroligninas
tóxicas. Estos productos clorados imposibilitan, por problemas de corrosión, la
recuperación de los efluentes de blanqueo de forma análoga a lo que se hace con las
lejías residuales de cocción. Por estas razones se justifica eliminar, o al menos reducir,
el uso de agentes clorados en el blanqueo. En este sentido, los blanqueos ECF
(elemental chlorine free) proponen evitar el uso del cloro molecular en las secuencias de
blanqueo, mientras que los blanqueos TCF (totally chlorine free) prescinden de
cualquier blanqueante clorado y recurren en su lugar a compuestos oxigenados
(oxígeno, peróxido de hidrógeno y ozono). En cualquier caso, las secuencias
anteriormente mencionadas no resultan tan selectivas pues se produce un ataque
apreciable a las cadenas de celulosa, perdiéndose calidad en el producto final
(Kishimoto y Nakatsubo, 1998; Quesada et al., 1998) y además algunos reactivos, como
el peróxido de hidrógeno, son costosos. En esta situación, la biotecnología se ha
presentado como una posible solución e investigadores de todo el mundo han buscado la
forma de transferir al blanqueo los procesos de degradación selectiva de la lignina que
realizan en la naturaleza hongos y bacterias, como se verá en el apartado 2.6.2.
Entre los agentes blanqueantes no clorados, el peróxido de hidrógeno es uno de

los más utilizados. En condiciones relativamente moderadas, el peróxido actúa como un
agente de blanqueo no deslignificante que mejora la blancura de las pastas con pérdidas
insignificantes de rendimiento, aunque bajo condiciones más severas, puede
comportarse como un agente deslignificante. Las principales ventajas de este reactivo
son su facilidad de trasporte, almacenamiento, manipulación y aplicación, su
versatilidad y la naturaleza no tóxica e inocua tanto del reactivo como de sus productos
de reacción. Entre sus desventajas se encuentra la necesidad de aplicarlo en condiciones
alcalinas y su susceptibilidad a la descomposición.
El peróxido de hidrógeno, debido a las ventajas mencionadas, será el reactivo de

blanqueo utilizado en la presente tesis. Además se utilizará una etapa de extracción
alcalina previa al blanqueo con peróxido de hidrógeno. Esta etapa no es propiamente un
26
2 - Introducción
blanqueo, pero se considera una etapa dentro de diferentes secuencias de blanqueo y

tiene como objetivo eliminar lignina modificada. Inmediatamente después de la
extracción alcalina la pasta queda visiblemente más oscura, debido a la oxidación de
fenoles a quinonas. Por ello, se evita utilizar esta etapa al final de la secuencia de
blanqueo. Sin embargo, cuando se utiliza en etapas intermedias, esta etapa favorece la
producción de pastas blanqueadas más resistentes e incrementa la blancura de las pastas
al final de la secuencia de blanqueo. Además, aumenta la limpieza de las pastas, ya que
no sólo disuelve la lignina oxidada sino que también elimina resinas y otras impurezas.
2.3 - Concepto de biorrefinería
En los últimos años, la necesidad de fuentes de energía renovables, el gran

aumento y la fluctuación del precio del petróleo y los incentivos de las administraciones
públicas para trabajar en bioenergías han contribuido al desarrollo del concepto de
biorrefinería (Chirat et al., 2010). Se basa en desarrollar un modelo similar al de una
refinería petrolífera, en el que se obtengan combustibles y diversos productos químicos,
pero usando como materia prima una fuente renovable: la biomasa. Así, el Laboratorio
Nacional de Energías Renovables (NREL) del Departamento de Energía de EE.UU.
define la biorrefinería como una estructura que integra procesos de conversión de
biomasa y equipamiento para producir combustibles, energía y productos químicos de
valor añadido a partir de biomasa. De manera análoga, el Centro de Investigación
Energética de los Países Bajos (Energy Research Center of the Netherlands, ECN)
define la biorrefinería como aquellas instalaciones en las que tiene lugar el
fraccionamiento de la biomasa en diferentes componentes, que pueden dirigirse al
mercado directamente o ser transformados previamente mediante diferentes
tratamientos.
Mediante la producción de múltiples productos, una biorrefinería puede

beneficiarse de los diferentes componentes de la biomasa y maximizar su valor como
materia prima. Una biorrefinería puede, por ejemplo, producir uno o varios productos
químicos de gran valor añadido en pequeñas cantidades junto grandes cantidades de
combustibles de bajo valor, a la vez que genera electricidad y calor de proceso para su
propio uso y/o exportación. De esta forma, la producción de productos de alto valor
mejora la rentabilidad, la obtención de altos volúmenes de combustibles ayuda a
27
solventar las necesidades energéticas del país, y la generación de electricidad reduce los
costes y reduce emisiones de gases de efecto invernadero.
Existen distintas clasificaciones de las biorrefinerías, en función de la materia

prima utilizada y de las tecnologías empleadas. Kamm y Kamm (2007) definen 3
sistemas de biorrefinerías:
1) Biorrefinería lignocelulósica: utiliza materias primas celulósicas procedentes

de la biomasa y en los residuos agroindustriales.
2) Biorrefinería de cultivo integral: emplea como materia prima cereales como el
maíz.
3) Biorrefinería “en verde”: se basa en la utilización de cultivos vegetales

inmaduros, como la hierba o los cereales.
Por otro lado, el Laboratorio Nacional de Energías Renovables (NREL) del

Departamento de Energía de EEUU (Wright et al., 2006) establece otra clasificación de
las biorrefinerías, dividiéndolas en 5 plataformas en función de la materia prima
utilizada, las tecnologías empleadas y los productos obtenidos:
1) Plataforma Bioquímica (Plataforma de procesado de azúcares): Utiliza

como materia prima materiales lignocelulósicos y biomasa con almidón.
Desarrolla tecnologías para romper la celulosa, el almidón y la hemicelulosa en
azúcares que pueden ser procesados para producir bioetanol o productos
químicos. La lignina puede quemarse para generar electricidad y calor de
proceso o puede convertirse en combustibles y productos químicos. Los
principales procesos incluyen: hidrólisis química o enzimática, fermentación,
biotransformación y procesos químicos y catalíticos.
2) Plataforma termoquímica (Plataforma de procesado de gas de síntesis):

Utiliza como materia prima materiales lignocelulósicos, pero también plásticos,
caucho, etc. Se basa en la conversión de biomasa sólida en combustibles
gaseosos o líquidos mediante calentamiento en una atmósfera limitada de
oxígeno (gasificación) o en ausencia de oxígeno (pirólisis). Este proceso puede
aumentar de manera importante la eficacia global y además permite como
alternativa convertir la biomasa en productos químicos o materiales de valor
añadido. Así, los productos obtenidos con en esta plataforma serán: gas de
28
2 - Introducción
síntesis, aceite de pirólisis, productos químicos de alto valor y combustibles

líquidos o gaseosos.
3) Plataforma de procesado de biogás: La materia prima utilizada son efluentes

líquidos o estiércol. Mediante digestión anaerobia con microorganismos,
descompone la biomasa produciendo metano y dióxido de carbono. El gas rico
en metano generado se puede utilizar como combustible o para obtener
productos químicos.
4) Plataforma de cadenas ricas en carbono (Plataforma de procesado de

aceite): Utiliza como materia prima aceites de plantas como soja, colza, maíz o
palma. La transesterificación de estos aceites vegetales produce biodiesel.
Además, los ácidos grasos y la glicerina derivada del biodiesel pueden utilizarse
para obtener productos químicos.
5) Plataforma de productos de plantas: La reproducción selectiva y la ingeniería

genética puede desarrollar plantas que produzcan gran cantidad de materia prima
o productos químicos o incluso compuestos que la planta no produce
naturalmente. De esta forma la biorrefinería tiene lugar en la misma planta y no
en una fábrica.
El NREL señala como plataformas más prometedoras aquellas que utilizan

biomasa lignocelulósica: la plataforma bioquímica y la plataforma termoquímica. En
base a ellas, define el concepto de biorrefinería lignocelulósica que se muestra en la
figura 2.8.
Alimentación de azúcares
Plataforma de procesado de azúcares
Bioquímica
Residuos
Producción Combustibles,
BIOMASA combinada de productos químicos
calor y electricidad y materiales
Gas limpio
Plataforma de procesado de gas de síntesis

Termoquímica
Gas tratado
Figura 2.8. Concepto de biorrefinería basado en la plataforma de procesado de azúcares

(bioquímica) y la plataforma de procesado de gas de síntesis (termoquímica) (NREL, 2011).
29
Las ventajas de la biorrefinería lignocelulósica incluyen el carácter asequible y

abundante de las materias primas y la posibilidad de producción de una amplia variedad
de productos, como se puede observar en la figura 2.9. Las dificultades que presenta son
fundamentalmente tecnológicas y sobre el aprovechamiento de la lignina.
 Resinas furánicas
Furfural  Productos químicos
 Nylos-6, 6-6
Xilosa (pentosa)
Xilitol
Hemicelulosas
 Espesantes
Derivados de las  Aditivos
hemicelulosas  Estabilizadores
 Emulsionantes
Combustible sólido
BIOMASA Lignina Formulación de polímeros
Productos químicos
 Hidroximetilfurfural
 Productos de fermentación
Glucosa (hexosa)  Combustible: bioetanol
 Ácidos orgánicos: ác. láctico
 Disolventes: acetona
Celulosa
 Papel y cartón
 Emulsificante
Derivados de la
 Estabilizante
celulosa
 Gelificante
 Dispersante
Figura 2.9. Productos que pueden obtenerse en una biorrefinería lignocelulósica.
El desarrollo de estas biorrefinerías a nivel industrial ya es una realidad en

algunos países. Ejemplos de biorrefinerías industriales, piloto o demostraciones que
utilizan plataformas bioquímica o termoquímica se muestran en las tablas 2.2. y 2.3
respectivamente.
30
2 - Introducción
Tabla 2.2. Ejemplos de biorrefinerías bioquímicas industriales, piloto o demostraciones.

Planta País Materia Prima
Lignol Innovations, IN Colorado, EEUU Residuos de madera
BIOCentrum DTU Dinamarca Residuos agrícolas, biomasa residual
Biogasol Dinamarca Paja de cereal, bagazo de caña y madera
IBUS pilot plant Dinamarca Paja de trigo, biomasa residual
Inbicon – DONG Energy Dinamarca Paja de cereal
Abengoa Bioenergía España Paja de cereal
VTT Finlandia Madera, residuos, lignocelulosa, etc.
SMBE- Soufflet Group Francia Trigo
Royal Nedalco Holanda Paja de cereal
Old Town Fuel and
Main, EEUU Hemicelulosa extraída de la madera
Fibers
Pacific Ethanol Oregon, EEUU Madera y residuos agrícolas
ZeaChem, Inc Oregon, EEUU Residuos forestales y agrícolas
Tabla 2.3. Ejemplos de biorrefinerías termoquímicas industriales, piloto o demostraciones.

Planta País Materia Prima
Bioliquid ITC-CPV Alemania Biomasa
IEC-TU Freiberg Alemania Biomasa
Gussing Austria Madera
VTT Finlandia Madera, residuos, lignocelulosa, etc.
Range Fuels Georgia, EEUU Biomasa forestal
Bio-MCN / Biorefinery
Paises Bajos Biomasa lignocelulósica, glicerol
cluster
Chemrec AB Suecia Lejía negra
Växjö Värnamo Biomass
Suecia Biomasa lignocelulósica
Gasification Centre
Flambeau River Biofuels Wisconsin, EEUU Residuos forestales
New Page Wisconsin, EEUU Residuos forestales
31
2.4 - Adaptación de un proceso Kraft al concepto de biorrefinería

lignocelulósica
Las instalaciones de la industria de la pasta y el papel constituyen una base ideal

para la biorrefinería lignocelulósica ya que están situadas cerca de numerosas fuentes de
biomasa, como madera y residuos forestales y agrícolas, y disponen de la infraestructura
necesaria para distribuir el producto final (Marinova et al., 2009). Además, buena parte
de sus instalaciones pueden ser usadas en la nueva biorrefinería, minimizando el
incremento en el coste adicional de convertir una fábrica de pasta en una biorrefinería
(Helmerius et al., 2010).
Actualmente, existen biorrefinerías que se centran en la producción de

combustibles líquidos para el transporte, como el etanol, a partir de materiales
lignocelulósicos (bioetanol de segunda generación). Sin embargo, teniendo en cuenta
que el precio de la pasta química se encuentra en torno a 500-600$ por tonelada, sería
necesario que el etanol obtenido a partir de los polisacáridos de dicha pasta (con un
rendimiento del 50%) fuese al menos 3-3,5$/galón, para ser económicamente
competitivo (Helmerius et al., 2010; Van Heiningen, 2006). Por ello, en lugar de
centrarse en la fracción celulósica de la biomasa, que tiene un alto valor en aplicaciones
papeleras, las investigaciones en este campo deben ser dirigidas hacia el
aprovechamiento de las fracciones de hemicelulosa y lignina. Además, al utilizar estas
fracciones para la generación de productos químicos y/o etanol, los beneficios de las
actuales fábricas de pasta se verían incrementados de manera significativa (Ragauskas
et al., 2006; Van Heiningen, 2006).
De acuerdo con esta idea, el Departamento de Energía de EE.UU. en su

documento Agenda 2020, señala que la industria de los productos forestales
(principalmente la industria de la pasta y el papel) puede utilizar la infraestructura
existente para desarrollar una Biorrefinería Integrada de Productos Forestales
(Integrated Forest Products Biorefinery, IFPB). Una IFPB utiliza tecnología avanzada
para producir, a partir de materiales forestales, bio-energía y bioproductos además de
productos tradicionales de esta industria (Agenda-2020, 2010). De manera similar, la
Unión Europea en su documento Visión 2030 del séptimo Programa Marco señala como
una de las áreas de investigación importantes la producción integrada de pasta, energía y
productos químicos a partir de madera (Vision-2030, 2006). Los objetivos de estas
32
2 - Introducción
biorrefinerías son la sostenibilidad, obtener productos de valor antes del pasteado,

valorizar el proceso global desde un punto de vista químico y aprovechar las corrientes
residuales y su potencial tanto químico como térmico.
Como se ha visto en el apartado 2.2.2, en una fábrica Kraft convencional, la

mayor parte de las hemicelulosas y de la lignina presentes inicialmente en la madera son
extraídas por la lejía blanca y llevadas a la caldera de recuperación donde se queman
para producir vapor y electricidad y recuperar los reactivos de cocción. Estos
componentes suponen en su conjunto casi un 50% del peso de la madera y mientras la
lignina, con elevada relación C/H, tiene un alto poder calorífico (27 MJ/kg), las
hemicelulosas sólo aportan 13,6 MJ/kg. Por tanto, si se extraen las hemicelulosas antes
del pasteado, podrían recuperarse sin ser degradadas y utilizarse para obtener etanol o
compuestos de mayor valor añadido como acido acético, furfural xilitol o polímeros, sin
modificar de manera importante la generación de energía en la caldera de recuperación
(Agenda-2020, 2010; Mendes et al., 2009; Van Heiningen, 2006).
La lignina disuelta en las lejías de cocción podría seguir usándose como

combustible. Si bien, con la tecnología actual, el balance energético en la industria de
pasta es positivo y cabe la posibilidad de disponer de un excedente de lignina que
podría extraerse de la lejía negra o en una extracción previa al pasteado, para obtener
productos químicos derivados (Helmerius et al., 2010; Van Heiningen, 2006).
Alternativamente, la lejía negra podría gasificarse obteniendo gas de síntesis que podría
convertirse en electricidad, combustibles como hidrógeno u otros combustibles para
transporte, y/o productos químicos de alto valor añadido (Agenda-2020, 2010;
Helmerius et al., 2010; Van Heiningen, 2006).
Los residuos de madera obtenidos en distintos puntos de la fábrica, como

cortezas, astillas de pequeño tamaño, incocidos, etc., también podrían ser sometidos a
gasificación para obtener gas de síntesis, y a partir de él electricidad, combustibles, etc.
A través de todas estas tecnologías, la fábrica Kraft se transformaría en una

Biorrefinería Integrada de Productos Forestales (figura 2.10). Estas biorrefinerías
pueden convertirse en las biorrefinerías lignocelulósicas más importantes, debido a la
disponibilidad de residuos forestales, la sinergia con las infraestructuras existentes y los
costes de capital y operación (Huang et al., 2010).
33
Pasta
Extracción de Sólido Lavadores de cruda Pasta
Madera Digestor Kraft Blanqueo
hemicelulosas pasta blanqueada
Líquido Químicos
(hemicelulosas) Lejía blanca Lejía negra
derivados de
(NaOH, Na2S) Lignina
Madera Conversión de Gas de

Gasificador Combustibles
sólida hemicelulosas síntesis
Polímeros
basados en Energía Vapor
azúcares
Gasificador Energía y
Bioetanol de biomasa Vapor
Modificación Biocompuestos
de la madera de Madera
Figura 2.10. Esquema de una Biorrefinería Integrada de Productos Forestales (Van Heiningen,
2006).
2.4.1 - Extracción de hemicelulosas previa al pasteado Kraft
La extracción de hemicelulosas antes del pasteado puede llevarse a cabo con

tratamientos alcalinos, tratamientos ácidos o tratamientos con vapor o agua a alta
temperatura (Al-Dajani y Tschirner, 2008; Al-Dajani et al., 2009; Carvalheiro et al.,
2008; Mao et al., 2010; Marinova et al., 2009; Vila et al., 2011; Wu et al., 1999). Los
métodos de extracción deben integrarse de manera adecuada en el proceso Kraft, y
además facilitar la utilización de la corriente extraída. Por ello deben utilizar soluciones
acuosas con reactivos compatibles con el proceso y que puedan separarse fácilmente
permitiendo la utilización de las hemicelulosas. Además, la degradación que generen en
la fracción celulósica debe ser mínima para permitir obtener un papel con unas
propiedades mecánicas adecuadas. Por otro lado, desde un punto de vista
medioambiental, los tratamientos con vapor o agua presentan la ventaja de no utilizar
reactivos químicos, evitando los costes de recuperación, neutralización y/o corrosión y
disminuyendo el impacto ambiental.
Independientemente del método utilizado, la fracción líquida extraída puede

contener oligosacáridos que deben ser convertidos en monómeros en una segunda etapa
de hidrólisis, antes de que puedan utilizarse como fuente de carbono y energía en el
34
2 - Introducción
proceso de fermentación. Además, esta fracción líquida también puede contener lignina
y productos de degradación que podrían inhibir los procesos biológicos consecutivos
(hidrólisis enzimática y fermentación). Todos estos factores deben tenerse en cuenta a la
hora de seleccionar y optimizar el método de extracción de hemicelulosas. Así,
tratamientos menos efectivos en la hidrólisis de hemicelulosas pueden ser más
adecuados para el proceso global. En este sentido, los tratamientos con vapor o agua a
temperaturas altas (explosión por vapor y autohidrólisis) pueden ser más adecuados
(Carvalheiro et al., 2008). Por otro lado, comparado con la autohidrólisis, la explosión
por vapor proporciona un residuo sólido con una estructura más abierta, que facilitará la
difusión de reactivos durante el pasteado (Ahvazi et al., 2007).
Agua de lavado
Pasta
Explosión por Sólido Lavadores de cruda Pasta
vapor pasta blanqueada
Líquido Lejía negra Na2SO4

(hemicelulosas) Lejía blanca Condensado
diluida
(NaOH, Na2S)
Vapor
Hidrólisis Caldera de
Evaporadores Vapor
enzimática recuperación
Lejía negra
concentrada
Condensado
Xilosas contaminado Gases no Fundido
p/ Columna condensados
Destilación p/ Incineración Tanque de
Fermentación disolución de
Lejía blanca fundido
débil
Lejía Verde
Planta de (Na2CO3, Na2S) Residuos,
Bioetanol
caustificación impurezas
Lodo de Cal Cal

(CaCO 3) (CaO)
CaCO3 Horno de cal
Figura 2.11. Integración del proceso Kraft en una biorrefinería lignocelulósica basada en la
extracción de hemicelulosas mediante un proceso de explosión por vapor.
Basándonos en estas premisas, el método seleccionado para llevar a cabo la

extracción de hemicelulosas en la presente tesis doctoral es el tratamiento de explosión
por vapor. A través de este pre-tratamiento de las astillas, la fábrica Kraft se convertirá
en una biorrefinería lignocelulósica en la que además de pasta de celulosa y energía se
podrá obtener bioetanol y/o acido acético, furfural, xilitol, etc. En la figura 2.11 se
35
muestra el esquema de la nueva biorrefinería basado en el esquema de una planta Kraft

(Figura 2.7). El ciclo de recuperación de lejías negras, podría sustituirse por un proceso
de gasificación, como se ha señalado anteriormente.
2.4.2 - Pre-tratamiento de explosión por vapor
Como se ha indicado en el apartado anterior, existen distintos pre-tratamientos

de extracción de hemicelulosas, tales como autohidrólisis, explosión por vapor,
hidrólisis ácida, extracción alcalina, etc. Entre ellos, destaca la explosión por vapor ya
que permite la recuperación de todos los componentes de la madera sin provocar una
degradación completa de ninguno de ellos en favor de otro (Britt, 1970). Además,
comparado con otros pre-tratamientos, no utiliza reactivos químicos peligrosos y origina
un menor impacto ambiental, menor consumo de energía y menor coste inmovilizado
(Avellar y Glasser, 1998; Focher y Marzetti, 1991).
El pre-tratamiento de explosión por vapor es un proceso hidrotérmico que

consiste en un tratamiento con vapor saturado a relativamente alta presión, seguido de
una rápida descompresión. La intensidad o severidad del tratamiento depende tanto de
la temperatura como del tiempo de tratamiento y se determina según la ecuación [1]
definida por Overend y Chornet (1987), donde T es la temperatura en ºC y t es la
duración del tratamiento en minutos.
T −100
S0 = log e 14 .75 ∙ t
[1]
Este tratamiento modifica el material lignocelulósico tanto químicamente,

debido al tratamiento con vapor, como física o mecánicamente debido a la rápida
descompresión.
La despresurización final provoca una evaporación del agua interna, creando

fuerzas de cizalladura que producen separación de fibras, principalmente en las zonas de
celulosa amorfa más débil. Además se produce una rotura de las paredes de las fibras,
que aumenta la accesibilidad del material (Li et al., 2005). En la figura 2.12 se puede
observar una imagen tomada con microscopio de barrido electrónico (SEM) de fibras de
roble tras un tratamiento de explosión de vapor.
36
2 - Introducción
Figura 2.12. Imagen SEM de fibras de roble tras un tratamiento de explosión de vapor a 230ºC
durante 5 minutos. En el recuadro se muestra la imagen de la superficie de la fibra a escala 1μm
(Renneckar et al., 2005).
Cuando no se añaden otros reactivos, los cambios químicos originados son los
mismos que los debidos a un tratamiento con vapor. Así, el vapor a alta temperatura,
debido al alto grado de disociación del agua, provoca la hidrólisis de grupos acetilos de
la hemicelulosa, liberándose ácido acético. Éste ácido disminuye ligeramente el pH del
agua y, a la temperatura del proceso, cataliza la hidrólisis de la hemicelulosa. De esta
forma se produce una autohidrólisis del material lignocelulósico, que origina una
pérdida de hemicelulosa al solubilizarse en la fracción líquida. En la figura 2.13 se
muestra la reacción de hidrólisis de la hemicelulosa y la posterior degradación de la
xilosa a furfural que tiene lugar cuando las condiciones del tratamiento son severas
(Josefsson et al., 2001; Li et al., 2005).
O
O O OH
O H+ H+ O
O OH OH
O Hidrólisis Degradación
OH HO
OH OH
OH
n
Hemicelulosa (xilano) Xilosa Furfural
Figura 2.13. Reacciones de hidrólisis y degradación de la hemicelulosa durante el tratamiento

de explosión por vapor. (Li et al., 2005)
La celulosa no se degrada durante la autohidrólisis, excepto a altas temperaturas

y largos tiempos de tratamiento (temperaturas superiores a 210 ºC) debido a su alto
grado de cristalinidad y a la presencia de microfibras menos accesibles (Heitz et al.,
1991; Josefsson et al., 2001; Li et al., 2005). Sin embargo, su grado de polimerización sí
37
disminuye durante la autohidrólisis, observando un decrecimiento continuo con la

severidad del tratamiento, hasta valores del índice de polimerización 4 o 5 veces menor
que el inicial (Heitz et al., 1991; Martinez et al., 1995). Las reacciones de hidrólisis de
celulosa y posterior degradación de la glucosa que tendrían lugar durante tratamientos
de alta severidad se muestran en la figura 2.14.
OH
OH OH
HO O
O
O H+ O OH H+ O
O OH
OH
O Hidrólisis Degradación
OH HO
OH
OH
OH
n Hidroximethilfurfural
Celulosa Glucosa
(HMF)
Figura 2.14. Reacciones de hidrólisis y degradación de la celulosa durante el tratamiento de

explosión por vapor a altas temperaturas. (Li et al., 2005)
En la lignina se produce una disminución del contenido en estructuras β-O-4 y

un aumento de su solubilidad en álcali y disolventes orgánicos (Jakobsons et al., 1995;
Josefsson et al., 2001; 2002; Robert et al., 1988). Debido a la rotura de enlaces β-O-4, el
peso molecular de la lignina debería disminuir como consecuencia del tratamiento de
explosión por vapor. Sin embargo, se ha observado un aumento gradual del peso
molecular al aumentar la severidad del tratamiento, debido a reacciones de
repolimerización que dan lugar a estructuras más heterogéneas de lignina (Li et al.,
2007). Un ejemplo de reacciones de despolimerización y repolimerización de la lignina,
que tienen lugar durante la explosión por vapor, se muestra en la figura 2.15. En los
tratamientos poco severos, o en los primeros momentos de los tratamientos más severos,
se produce una solubilización de fragmentos de lignina de bajo peso molecular y alta
reactividad debido a reacciones de despolimerización y de rotura de enlaces lignina-
carbohidratos (LCC) (Burtscher et al., 1987). Si el tratamiento continúa (tratamientos de
severidad S0 entorno a 3,2 – 4,5), la reacción dominante es la de repolimerización (Li et
al., 2007). A mayor severidad, se produce también la reacción de eliminación de los
grupos metoxilos, produciéndose catecoles (Heitz et al., 1995). Diferentes autores han
sugerido también que los azúcares hemicelulósicos y/o sus productos de degradación
(como el furfural) pueden reaccionar con la lignina (Aoyama et al., 1995; Dekker y
Wallis, 1983; Heitz et al., 1991; Montane et al., 1994; Schultz et al., 1983).
38
2 - Introducción
OH
R
O
OH R OH R + HO
R
ón
aci O
O eriz CH3 H3C
+
lim O
spo
O HC O
De O
O O
H3C H + H3C
CH3 - ROH CH3
OH
O O Re
p ol OH
O O im O R
eri H3C
zac
i ón
O
R O
H3C
CH3
O
O
Figura 2.15. Reacciones de despolimerización y repolimerización de la lignina durante el

tratamiento de explosión de vapor (Li et al., 2007).
Otros autores han observado también una redistribución de la lignina debido a su

fluidización y aglomeración durante el tratamiento a temperaturas altas seguido de un
rápido enfriamiento. Así, se han observado partículas esféricas de lignina que migran
desde la pared celular a la superficie de la biomasa (Donaldson et al., 1988). Un efecto
similar se ha observado en tratamientos con vapor a alta temperatura y en tratamientos
con ácido diluido (Donohoe et al., 2008; Selig et al., 2007). La hipótesis que reportan
estos autores sobre la formación de estas partículas de lignina es la siguiente: durante
los tratamientos a temperatura superiores a la temperatura de transición de la lignina
(120-200ºC), este polímero pasa a un estado más fluido y la lignina de la pared celular
puede ser forzada a coalescer en un ambiente acuoso. Este efecto, combinado con
fuerzas de capilaridad e hidrofóbicas, permitiría la migración de la lignina desde la
pared celular nativa a la fase líquida. Debido al enfriamiento tras del pre-tratamiento, la
partículas de lignina se endurecen y quedan atrapadas entre las capas de la pared celular
o se redepositan en la superficie de la biomasa (Selig et al., 2007).
39
Figura 2.16. Imágenes SEM de la superficie de la pared celular de bagazo de maíz antes (A) y
después (B y C) de un tratamiento ácido con 0,8% H2SO4 a 150ºc durante 20 minutos. La
imagen C es una ampliación de la región recuadrada en la imagen B (Donohoe et al., 2008).
 Aplicaciones del proceso de explosión por vapor

La primera aplicación en la industria papelera del proceso de explosión por
vapor la desarrolló Mason en 1926, quien propuso utilizar un tratamiento con vapor
seguido de una descompresión para fabricar cartón de alta densidad (Masonite board)
(Mason, 1926). Posteriormente, Babcock (1932) propuso utilizar este proceso como pre-
tratamiento en la producción de etanol.
Basándose en la idea de Mason, varios autores han estudiado el proceso de

explosión por vapor como alternativa a los procesos de pasteado químico-mecánico
(CMP) o químico-termo-mecánico (CTMP) tradicionales (Delong, 1981; Mamers y
Rowney, 1979; Mamers et al., 1981). Sin embargo, este método de pasteado no ha sido
implementado industrialmente ya que la pasta obtenida no mostró propiedades
superiores a la pasta CMP o CTMP (Heitner et al., 1993).
Siguiendo la idea de Babcock, el proceso de explosión por vapor se ha utilizado

como pre-tratamiento en la producción de etanol a partir de diferentes materias primas
como chopo (Oliva et al., 2003), eucalipto (Ramos et al., 1992), bagazo de maíz
(Ohgren et al., 2006), bagazo de caña de azúcar (Glasser y Wright, 1998) y paja de trigo
(Tomás-Pejó, 2010). Se ha demostrado que este pre-tratamiento aumenta la
accesibilidad de la celulosa potenciando la posterior hidrólisis enzimática de la celulosa
a glucosa. Sin embargo, se debe tener en cuenta también que al aumentar la severidad
del tratamiento se potencia la degradación de los azúcares hemicelulósicos y la
generación de compuestos tóxicos potencialmente inhibidores de las etapas posteriores
de hidrólisis y fermentación (Jurado et al., 2009; Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000a; b).
40
2 - Introducción
Por otro lado, este pre-tratamiento se muestra menos eficaz con las maderas de coníferas
debido a su mayor contenido en lignina y menor número de grupos acetilo, lo que
provoca que el proceso de autohidrólisis no sea tan efectivo. Con este tipo de maderas
es necesario añadir un catalizador ácido, lo que implica mayor generación de productos
tóxicos.
Por otro lado, el proceso de explosión por vapor puede utilizarse para extraer
hemicelulosas y utilizar esta corriente como fuente de hexosas y pentosas que pueden
convertirse en combustibles como etanol, u otros productos de valor añadido (Li et al.,
2010) , como se ha indicado previamente. Además, el residuo sólido obtenido tras el
tratamiento, podría ser pasteado más fácilmente, debido a que su estructura más abierta
(comparado con la madera original) permitirá una mejor difusión de los reactivos de
cocción en las fibras (Ahvazi et al., 2007). Por tanto este proceso podría utilizarse como
pre-tratamiento al pasteado químico para aumentar los beneficios económicos de una
fábrica Kraft convencional, transformando esta fábrica en una biorrefinería integrada de
productos forestales (Ragauskas et al., 2006; Van Heiningen, 2006).
2.5 - Biotecnología aplicada a la producción de pasta Kraft y

bioetanol
En las últimas décadas, la biotecnología está siendo una de las áreas más
estudiadas en la industria de la pasta y el papel. A través del uso de microorganismos y
enzimas, se busca el desarrollo de tecnologías limpias que mejoren y optimicen los
tradicionales procesos de pasteado y blanqueo y que reduzcan tanto los consumo de
energía y de reactivos químicos como las corrientes contaminantes generadas. Además,
la búsqueda de nuevos combustibles menos contaminantes obtenidos a partir de fuentes
renovables, ha potenciado el uso de la biotecnología en la producción de etanol a partir
de material lignocelulósico (bioetanol), cambiando el concepto tradicional de la
industria de la pasta y el papel hacia un concepto más amplio de biorrefinerías
forestales, como se ha señalado anteriormente.
Dentro del esquema de producción planteado en esta tesis doctoral: una

biorrefinería con extracción de hemicelulosas previa al pasteado Kraft, existen tres
puntos principales en los que se podría aplicar la biotecnología: el pasteado (biopulpeo),
41
el blanqueo (bioblanqueo) y la producción de etanol lignocelulósico (bioetanol), como

muestra la figura 2.17.
Agua de
Enzimas Biopulpeo Enzimas Bioblanqueo
lavado
Explosión por Lavadores de Pasta

Enzimas
Lejía negra
Detoxificación diluida
(NaOH, Na2S)
Enzimas Hidrólisis Circuito de
enzimática recuperación Vapor
de lejías negras
Xilosas
Levaduras
Fermentación
Bioetanol
Figura 2.17. Aplicación de biotecnología en una biorrefinería lignocelulósica basada en la

extracción de hemicelulosas mediante un proceso de explosión por vapor.
Las enzimas son catalizadores proteicos producidos a partir de organismos

vivos, que aceleran la velocidad de las reacciones químicas y son altamente específicos
del tipo de reacción que catalizan. Existen diferentes hongos y bacterias capaces de
generar una batería de enzimas hidrolíticas y oxidativas que degradan el material
lignocelulósico, siendo necesaria una mezcla de enzimas para degradar completamente
el material. Las aplicaciones biotecnológicas en la industria de los productos forestales,
se basan en la utilización de estas enzimas en distintas partes del proceso para degradar
o eliminar un compuesto en concreto. Por ello, la aplicación directa de las enzimas, en
lugar de la del microorganismo completo, mejora el proceso debido a su alta
especificidad, evitando la degradación de otros compuestos. En función del polímero
lignocelulósico que ataquen, las enzimas se pueden dividir en celulasas, hemicelulasas y
ligninasas o enzimas ligninolíticas.
42
2 - Introducción
 Celulasas
Las celulasas son enzimas que hidrolizan el enlace 1,4-β-D-glucosidico de las
cadenas de celulosa. Se dividen en tres grupos principales: endoglucanasas (EG),
exoglucanasas o celobiohidrolasas (CBH) y β-glucosidasas (BG).
Las EGs actúan hidrolizando aleatoriamente los enlaces β-(1→4) centrales de la

cadena de celulosa creando extremos libres. Las CBHs actúan sobre los extremos
reductores (CBH-I) o no reductores (CBH-II) de las cadenas liberando monómeros de
glucosa, celobiosa y oligosacáridos de bajo peso molecular. Las BGs, son las
encargadas de hidrolizar las moléculas de celobiosa en dos moléculas de glucosa.
Cuando estos grupos de enzimas trabajan conjuntamente se produce un efecto sinérgico
que da lugar a una degradación eficiente de las cadenas de celulosa (Figura 2.18). La
actividad enzimática de este tipo de enzimas depende no sólo de las condiciones de
operación, como pH y temperatura, sino también de propiedades del sustrato (celulosa)
como morfología, composición, grado de polimerización, cristalinidad y área superficial
accesible (Eriksson et al., 2005; Josefsson et al., 2007).
β-glucosidasas
Exoglucanasas Endoglucanasa
(CBH-II)
Exoglucanasas
(CBH-I)
Cristalina Amorfa Cristalina
Figura 2.18. Representación esquemática de la degradación enzimática de la celulosa.
 Hemicelulasas: Xilanasas
Debido a la variedad de enlaces entre los diferentes azúcares de las
hemicelulosas, existe un gran número de grupos de hemicelulasas con actividad
específica para cada tipo de enlace. Así por ejemplo, las xilanasas o endoxilanasas
atacan la cadena principal de las hemicelulosas y las β-xilosidasas hidrolizan
xilooligosacáridos a xilosa. Otras enzimas rompen las ramificaciones, como las α-D-
glucuronosidasas y las α-L-arabinosidasas que hidrolizan los enlaces entre los xilanos y
los ácidos acéticos y fenólicos (Teeri y Henriksson, 2007). La hidrólisis de la
43
hemicelulosa es complicada, no sólo por su compleja estructura, sino también debido a

las propiedades de las enzimas hemicelulósicas que requieren una acción coordinada de
diversas enzimas para su correcta actuación.
Además de hidrolizar la hemicelulosa, las hemicelulasas favorecen la hidrólisis

de la celulosa aumentando la accesibilidad del sistema celulolítico a las fibras de
celulosa (Alvira et al., 2011). Su acción también potencia una posterior deslignificación
debido a la rotura de enlaces lignina-carbohidratos, a la eliminación de xilanos
reprecipitados que dificultan el acceso de los reactivos de blanqueo y/o a la eliminación
de regiones de hemicelulosa con alto contenido en ácidos hexenurónicos (Henriksson y
Teeri, 2007), como veremos en la sección 2.6.3.
 Ligninasas
Las enzimas que juegan un papel clave en la degradación de la lignina son
lignina peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa (MnP) y lacasa. Las lacasas usan
oxígeno molecular como sustrato y lo reducen hasta agua. Por el contrario, la LiP y
MnP emplean peróxido de hidrógeno como aceptor final de electrones, por tanto es
esencial la presencia en el medio de peróxido de hidrógeno, que a su vez es generado
por la actividad de enzimas glioxal oxidasa, glucosa oxidasa y aril alcohol oxidasa.
Las lacasas son enzimas de tipo fenoloxidasa, que contienen cuatro átomos de
cobre en su estructura, uno de los cuales está implicado en la oxidación de los sustratos,
mientras el resto participan en el transporte de electrones hasta el oxígeno. En la figura
2.19 se muestra el mecanismo catalítico propuesto por Malmström (1982) para la lacasa.
e- e-
Cu2+Cu2+(Cu2+)2 Cu+Cu2+(Cu2+)2 Cu+Cu+(Cu2+)2
H2 O
2H+
Cu+Cu2+[(Cu2+)2O-] Cu2+Cu2+(Cu+)2
O2
e- H2O 2H+
e-
Cu2+Cu2+[(Cu2+)2O-] Cu+Cu2+[(Cu2+)2O22-] Cu2+Cu2+[(Cu2+)2O22-]
Figura 2.19. Mecanismo catalítico de las lacasas (Malmstrom, 1982).
44
2 - Introducción
El bajo potencial redox de las lacasas (entre 400 y 800 mV) sólo las permite
oxidar compuestos fenólicos. Sin embargo, en presencia de mediadores redox son
capaces de oxidar unidades no fenólicas. Además, los mediadores son compuestos de
bajo peso molecular, que son capaces de difundir mejor en la fibra y reaccionar con las
fracciones de lignina a las que la enzima no tiene acceso debido a su alto peso
molecular. Esta cooperación de la enzima y los mediadores es lo que se denomina
sistema lacasa mediador, en el cual la enzima oxida un mediador químico que, a su vez,
oxida la lignina, como se indica en la figura 2.20.
O2 lacasa [mediador]OX lignina
lignina
H2O [lacasa]OX mediador
oxidada
Figura 2.20. Mecanismo de actuación del sistema lacasa mediador sobre la lignina.
El 2-hidroxibenzotriazol (HBT) y el ácido 2,2-azinobis-3-etilbenzotiazolin

sulfónico (ABTS) son ejemplos de mediadores sintéticos. Sin embargo, debido al
elevado coste y la toxicidad de estos mediadores, la búsqueda de nuevos mediadores
naturales más eficaces que los ya existentes es uno de los objetivos más importantes en
este campo de investigación. Así, se han encontrado algunos metabolitos fúngicos que
actúan como mediadores, como el ácido 4-hidroxibenzoico y el alcohol 4-
hidroxibencílico (Cañas y Camarero, 2010). En los crudos enzimáticos secretados por
hongos ligninolíticos durante la biodegradación de biomasa, se han encontrado
diferentes compuestos que actúan como mediadores, demostrando la existencia del
sistema lacasa – mediador en la naturaleza. Algunos de estos compuestos son
siringaldehido, acetosiringona, vanilina, acetovanilona, vanilato de metilo o el ácido p-
cumárico. Estos compuestos fenólicos están presentes en las plantas herbáceas, o se
originan durante la degradación de lignina (Cañas y Camarero, 2010).
2.5.1 - Biopulpeo
El biopulpeo consiste en la aplicación de un pre-tratamiento biológico a las

astillas que modifique su estructura y composición con el fin de facilitar la separación
de las fibras o la deslignificación en una etapa posterior de pasteado mecánico o
45
químico, respectivamente. Se basa en la habilidad de los hongos de pudrición blanca

para degradar selectivamente la lignina en las etapas iniciales de la pudrición de la
madera, dejando un residuo de celulosa relativamente intacto (Bajpai et al., 2001; Ferraz
et al., 2008; Mendonça et al., 2008). Los hongos de pudrición blanca no sólo son
capaces de producir enzimas que degraden la lignina, sino que también penetran en la
madera para trasportar estas enzimas dentro de las astillas (Messner y Srebotnik, 1994).
Los beneficios del biopulpeo incluyen: ahorro energético durante el desfibrado o

refino, aumento de la deslignificación, disminución del consumo de álcali y del tiempo
de pasteado necesario, mejora de las propiedades de resistencia de las pastas obtenidas y
reducción del consumo de reactivos de blanqueo (Bajpai et al., 2001; Islam et al., 2008;
Mendonça et al., 2008; Messner y Srebotnik, 1994; Oriaran et al., 1990; Wolfaardt et
al., 2004). Sin embargo, el uso de hongos en estos pre-tratamientos tiene asociado una
serie de desventajas como son la pérdida de rendimiento debido a la degradación de
polisacáridos durante la deslignificación fúngica y la dificultad de asegurar condiciones
asépticas y óptimas durante los largos tiempos de tratamiento requeridos debido al lento
crecimiento de los hongos.
Para solucionar estos problemas, la aplicación directa de las enzimas a las

astillas se ha convertido en una alternativa más atractiva industrialmente, ya que los
tratamientos enzimáticos se llevan a cabo en unas pocas horas, son más selectivos y
encajan más fácilmente en los procesos de pasteado existentes. Por ello, se han llevado a
cabo diferentes trabajos para estudiar la viabilidad de los pre-tratamientos enzimáticos y
su efecto en el pasteado y en el producto final obtenido. Se ha demostrado que pueden
mejor tanto el pasteado mecánico como el químico, reduciendo el consumo de energía
(Maijala et al., 2008; Ramos et al., 2004) y aumentando la deslignificación (Dyer y
Ragauskas, 2004; Jacobs-Young et al., 1998; Zhao et al., 2002), respectivamente.
Una desventaja del uso de enzimas en el biopulpeo es su baja efectividad cuando

se aplican directamente sobre las astillas, debido a la dificultad de las enzimas para
penetrar en la madera. Esto se debe a que la mayoría de los capilares de la madera son
demasiado pequeños para permitir la entrada de moléculas enzimáticas y además a que
el área superficial de las astillas no es suficiente para permitir un tratamiento enzimático
efectivo (Grethlein, 1985). Por ello, las enzimas se han aplicado normalmente a
materias primas que han sido previamente desfibradas (Burton, 2001) o a pastas
46
2 - Introducción
químicas en procesos de bioblanqueo (Eugenio et al., 2010a). En los casos en los que se
quieren aplicar las enzimas directamente a la madera, es recomendable someter las
astillas a vacío para facilitar la adsorción de las enzimas (Jacobs-Young et al., 1998) o a
compresión para provocar fracturas en la madera que faciliten la penetración (Maijala et
al., 2008; Pere et al., 2005). Existen otros tratamientos que provocan efectos similares, y
por tanto podrían utilizarse como pre-tratamiento en el biopulpeo, aunque hasta el
momento han sido menos estudiados para este fin. Entre ellos se encuentra el
tratamiento de explosión por vapor. Como se ha indicado en el apartado 2.5, la rápida
descompresión final provoca una separación de las fibras en paquetes y una rotura de las
paredes de las fibras, que facilita la difusión de los reactivos o enzimas aplicados en
etapas posteriores. Así, este pre-tratamiento ha demostrado mejorar tanto procesos de
pasteado (Ahvazi et al., 2007; San Martin et al., 1995) como de hidrólisis enzimática
para la obtención de azúcares fermentables (Jurado et al., 2009; Ruiz et al., 2008; Wu et
al., 1999). Sin embargo, existen pocos trabajos sobre su efecto en un biopulpeo
enzimático.
Entre las enzimas aplicadas en el biopulpeo se encuentran las celulasas,

hemicelulasas (xilanasas), pectinasas y enzimas ligninolíticas como lignina peroxidasas
y manganeso peroxidasas. Sin embargo, la aplicación del sistema lacasa mediador
(SLM), ampliamente utilizado en el bioblanqueo, apenas se ha estudiado en el
biopulpeo sin combinar su efecto con el de otras enzimas (Dyer y Ragauskas, 2004;
Maijala et al., 2008; Petit-Conil et al., 2002). Por ello en esta tesis doctoral, se ha
estudiado la aplicación de un tratamiento LMS después de un pre-tratamiento de
explosión por vapor, y antes del pasteado Kraft, como alternativa al biopulpeo
convencional.
2.5.2 - Bioblanqueo
Varias razones han motivado la aplicación de enzimas en el proceso de

blanqueo. Por un lado, existen razones medioambientales, como la reducción de la carga
contaminante derivada de la disminución en el consumo de reactivos clorados (en
secuencias ECF). Por otro lado, las razones técnicas incluyen el aumento de selectividad
hacia la lignina (en las secuencias TCF), la economía de reactivos de blanqueo y la
mejora de la calidad de las pastas al obtenerse mayores blancuras. Sin embargo, la
eficacia de los tratamientos enzimáticos es, hoy día, limitada y el objetivo actual no es
47
sustituir completamente el blanqueo químico, sino reducir su uso para limitar la

contaminación hasta niveles asumibles y reducir el coste de reactivos químicos para
hacer rentable la inversión. Al mismo tiempo, se pretende que la blancura y las
resistencias mecánicas de las pastas no se resientan.
La aplicación directa de microorganismos tales como los hongos ligninolíticos

que se emplean en el biopulpeo, tendría consecuencias indeseables en el bioblanqueo,
como la degradación de la celulosa o la contaminación de las pastas con sustancias que
acompañan o son producidas por los hongos. Por ello, la búsqueda, selección y posible
modificación de enzimas implicadas en la degradación de lignocelulosa para adecuarlas
a las condiciones industriales del blanqueo de pastas representa uno de los campos de
investigación con mayor potencial en esta industria. El coste de las enzimas se ha ido
reduciendo a medida que el bioblanqueo abría nuevas expectativas y no parece suponer
un impedimento para el futuro.
Pese a que las xilanasas no degradan la lignina, éstas fueron las primeras
enzimas utilizadas en el blanqueo de pasta Kraft (Viikari et al., 1986) y son hoy día las
únicas que se aplican a nivel industrial. La aplicación de las xilanasas, previamente al
blanqueo, ha demostrado que es posible alcanzar el nivel deseado de blancura con un
ahorro de reactivos de blanqueo, reduciendo así la contaminación por cloroligninas. En
años posteriores, otros trabajos confirmaron la capacidad de las xilanasas para mejorar
los efectos de las etapas de blanqueo (Paice et al., 1988; Ragauskas et al., 1994; Senior
y Hamilton, 1992; Viikari et al., 1994). Para explicar cómo actúan las xilanasas en el
blanqueo de pasta Kraft se han descritos algunos mecanismos de actuación. Uno de
ellos supone que las xilanasas eliminan los xilanos precipitados, depositados sobre las
fibras y que dificultan el acceso de los reactivos de blanqueo. Una vez eliminada esta
barrera, la acción de los reactivos sería mucho más eficaz (Kantelinen et al., 1993; Shah
et al., 2000). Otra explicación supone que las hemicelulosas están unidas a la lignina por
enlaces covalentes y que la acción de la enzima libera estos compuestos permitiendo su
extracción del medio (Suurnäkki et al., 1996; Wong, 1997a). Por otro lado, existen
evidencias de que parte de los grupos cromóforos proceden de la degradación de
hemicelulosas durante el pasteado Kraft, como los ácidos hexenurónicos. Estas
sustancias que quedan unidas a las hemicelulosas, aumentan el número kappa,
consumen reactivos de blanqueo, retienen iones metálicos, favorecen el amarilleamiento
de la pasta y contribuyen a la formación de ácido oxálico (Roncero et al., 2003; Wong,
48
2 - Introducción
1997a). Gracias a la acción de las xilanasas, estos compuestos son liberados una vez que
se rompe su unión con las hemicelulosas (Valls et al., 2010; Wong, 1997b).
Posteriormente, se comenzó a prestar atención al empleo de enzimas

ligninolíticas, como las peroxidasas y lacasas, en el bioblanqueo. Se han conseguido
resultados interesantes utilizando peroxidasas que oxidan Mn2+, sin embargo los
resultados más prometedores tras comparar diferentes enzimas se han encontrado
utilizando lacasas en presencia de mediadores (Sigoillot et al., 2005). Este sistema
lacasa mediador, es capaz de oxidar tanto compuesto fenólicos como no fenólicos, como
se ha indicado en el apartado 2.6.1. Este hecho, justo con la utilización de O2 como
aceptor final de electrones (frente al H2O2 utilizado por las peroxidasas) hace a estas
enzimas altamente interesantes para el blanqueo de pasta celulósicas.
Desde su descripción, los sistemas lacasa mediador han sido investigados con
éxito para la deslignificación y blanqueo de diferentes pastas de papel, observando una
reducción del consumo de reactivos de blanqueo y una disminución de la carga
contaminante de los efluentes, mientras que las propiedades mecánicas de las pastas se
mantienen o mejoran. (Bourbonnais y Paice, 1996; Camarero et al., 2004; Eugenio et
al., 2010a; Ibarra et al., 2006; Moldes et al., 2008). Sin embargo, el proceso aún no se
ha implantado a escala industrial probablemente debido a las dificultades derivadas del
uso del mediador y a la falta de optimización del proceso. El elevado coste y los
posibles problemas de toxicidad de algunos mediadores han dirigido las investigaciones
a la búsqueda de mediadores alternativos, incluyendo algunos metabolitos fúngicos así
como productos resultantes de la degradación de la lignina (Cañas y Camarero, 2010;
Fillat et al., 2010; Moldes et al., 2008) como se ha indicado anteriormente.
2.5.3 - Producción de bioetanol
El bioetanol producido a partir de materias lignocelulósicas, también llamado

bioetanol de segunda generación, supone una buena alternativa a los biocombustibles de
primera generación. La biomasa lignocelulósica no compite con el mercado alimentario,
y, al estar ampliamente distribuida, podría obtenerse a un coste menor, lo que
contribuye a disminuir el precio final del biocombustible.
Los procesos de producción de etanol basados en hidrólisis enzimática son los

más prometedores, ya que evitan los problemas asociados al uso de ácidos diluidos
49
como son la generación de productos de degradación de la glucosa o la corrosión de los

equipos y problemas medioambientales. Así, la hidrólisis enzimática permite obtener
altos rendimientos de glucosa bajo condiciones de operación más suaves que la
hidrólisis ácida, disminuyendo por tanto los costes de operación (Duff y Murray, 1996).
Las etapas necesarias en este proceso son: pre-tratamiento, hidrólisis enzimática,
fermentación y destilación.
El pre-tratamiento es una etapa crucial que pretende romper las barreras físicas y
químicas que inhiben la susceptibilidad del material al bioprocesado, tal como la
hidrólisis enzimática y la fermentación. Este pre-tratamiento debe promover la
formación de azúcares, evitar la degradación o pérdida de polisacáridos y la formación
de productos inhibidores, y además, ser eficaz económicamente (Ruiz et al., 2008).
Entre los pre-tratamiento estudiados, la explosión por vapor es uno de los más
utilizados, ya que degrada parcialmente y solubiliza la lignina y hemicelulosas debido a
las condiciones de alta presión y temperatura (Josefsson et al., 2002). Sin embargo,
durante este pre-tratamiento pueden generarse compuestos inhibidores debido a
reacciones de degradación, como se ha señalado anteriormente. Por ello, en muchos
casos son recomendables etapas de detoxificación de los sustratos, que incluyen
métodos físicos, químicos y biológicos (Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000a; b). La
aplicación de lacasas es uno de los nuevos métodos biológicos usados, ya que son
capaces de eliminar compuestos fenólicos de la biomasa (Chandel et al., 2007; Jurado et
al., 2009).
Una vez pre-tratado el material lignocelulósico, se lleva a cabo la hidrólisis

enzimática. Para la fracción sólida rica en celulosa, se utilizan mezclas enzimáticas que
contienen endoglucasanas, exoglucanasas y β-glucosidasas. Las dos primeras liberan
celobiosa y glucosa del sustrato a la fase líquida, mientras que las β-glucosidasas
rompen la celobiosa en dos moléculas de glucosa (figura 2.18). La velocidad inicial de
la hidrólisis es relativamente rápida, pero disminuye a lo largo del tratamiento debido al
efecto inhibidor de los productos finales y a la pérdida de actividad de las enzimas. Por
ello, es importante añadir suficiente β-glucosidasas que conviertan las moléculas de
celobiosa (gran inhibidor) en glucosa, que es un compuesto menos inhibidor. En
aplicaciones industriales, se suelen utilizar sistemas de hidrólisis con eliminación de
azúcares, que permiten hidrolizar gran cantidad de material lignocelulósico utilizando
50
2 - Introducción
concentraciones más bajas de enzimas. En estos procesos, la eliminación de azúcares se

lleva a cabo por ultrafiltración o sistemas de hidrólisis y fermentación simultanea.
Para llevar a cabo la hidrólisis de la fracción líquida rica en hemicelulosas,

obtenida tras el pre-tratamiento, es necesaria una mezcla de enzimas que incluyan
endoxilanasas y β-xilosidasas. Además, otras enzimas como α-glucuronosidasas, α-L-
arabinosidasas o acetilesterasas, pueden mejorar el rendimiento de la hidrólisis (Um y
van Walsum, 2010).
Durante la etapa de fermentación, los azúcares liberados durante la hidrólisis

enzimática son fermentados con la consiguiente producción de etanol y CO2. La
conversión estequiométrica de la glucosa y xilosa a etanol es de 0,51 gramos de etanol
por gramo de azúcar. En la práctica es muy difícil obtener conversiones tan altas ya que
las levaduras derivan cierta parte de la energía que consumen hacia el metabolismo
celular y el crecimiento.
El microorganismo comúnmente empleado a nivel industrial en los procesos de

fermentación alcohólica es la levadura Saccharomyces cerevisiae, ya que puede usar
todo tipo de hexosas, produce etanol con unos rendimientos cercanos al máximo teórico
y presenta gran tolerancia a los productos tóxicos generados durante el pre-tratamiento.
No obstante, S. cerevisiae presenta una gran limitación cuando se quiere utilizar en la
fermentación de los azúcares hemicelulósicos ya que no es capaz de fermentar
eficazmente pentosas (Tomás-Pejó, 2010). Únicamente bacterias entéricas y algunas
levaduras como Candida shehatae, Pachysolen tannophilus y P. stipitis son capaces de
fermentar la xilosa a etanol, pero con rendimientos relativamente bajos. Además, las
levaduras fermentadoras de xilosa no toleran altas concentraciones de etanol, requieren
condiciones microaerófilas para su crecimiento y son muy sensibles a los inhibidores y
a los cambios de pH (Hahn-Hägerdal et al., 2007).
Actualmente no existen microorganismos que presenten todas las características

deseables para la fermentación eficiente de los azúcares procedentes de los materiales
lignocelulósicos (fermentación de hexosas y pentosas, altos rendimientos, alta
productividad, tolerancia al etanol y a los inhibidores). Puesto que la utilización de
forma eficiente de todos los azúcares hemicelulósicos es clave para reducir el coste de la
producción de etanol, se están obteniendo microorganismos fermentadores de xilosa y
hexosa mediante técnicas de ingeniería genética, ya sea por la introducción de los genes
51
relacionados con la producción de etanol en las bacterias entéricas como E. coli, o por la
introducción de los genes de la ruta de la fermentación de las pentosas en
microorganismos productores de etanol como la levadura S. cerevisiae o la bacteria
etanologénica Z. mobilis (Tomás-Pejó, 2010).
52
3
OBJETIVOS
3 - Objetivos
3. OBJETIVOS
El objetivo principal de esta tesis es evaluar el efecto del pre-tratamiento de

explosión por vapor tanto en el proceso de pasteado Kraft y blanqueo como en las
propiedades finales de la pasta obtenida. Se estudiará además la hidrólisis de la fracción
líquida rica en hemicelulosa obtenida en el pre-tratamiento, para su utilización como
fuente de azúcares en la producción de etanol. Paralelamente, se buscará la
implementación de etapas enzimáticas en dicho esquema de producción de pastas
celulósicas, para estudiar su eficacia como deslignificantes y su contribución a la
reducción del empleo de reactivos químicos. Además, se evaluará el efecto de la
explosión por vapor en la hidrólisis enzimática de la fracción sólida, planteando la
producción de etanol como alternativa a la producción de pastas celulósicas.
En todos estos tratamientos se utilizará como materia prima Eucalyptus

globulus, por ser la especie más utilizada en la producción de pastas Kraft en España.
Sin embargo, la utilización de una especie no maderera podría contribuir a reducir el
consumo de reactivos químicos debido a su estructura más accesible, y plantear una
alternativa en países con escasos recursos forestales. Por ello, se evaluará el uso de
Hesperaloe funifera, especie no maderera con alto potencial papelero, y con escasas
necesidades hídricas, dentro del esquema de biorrefinería para la producción de pasta
celulósica planteado.
Para alcanzar estos objetivos se han definido los siguientes objetivos concretos:
- Evaluar el efecto del proceso de explosión por vapor en la composición

química y la porosimetría de astillas de E. globulus (Publicación I).
- Estudiar los cambios producidos en la lignina de E. globulus debidos a

tratamientos de explosión por vapor y del sistema lacasa-mediador
(Publicación II).
- Estudiar la hidrólisis de la fracción líquida obtenida en el pre-tratamiento de

explosión por vapor de E. globulus, para evaluar su potencial en la
producción de bioetanol. Estudiar así mismo, la hidrólisis de las fracciones
sólidas obtenidas en el pre-tratamiento, planteando la producción de etanol
como alternativa al pasteado de dichas fracciones (Publicación III).
55
- Estudiar el efecto del pre-tratamiento de explosión por vapor en el pasteado

Kraft de E. globulus y en la calidad de las pastas obtenidas (Publicación IV).
- Estudiar la bioblanqueabilidad con sistema lacasa-mediador de las pastas

obtenidas mediante explosión por vapor y pasteado Kraft, y compararla con
la de pastas Kraft convencionales (Publicación V).
- Evaluar tratamientos combinados de explosión por vapor y enzimas previos

al pasteado y comparar estos resultados con los obtenidos en biopulpeo con
hongos lignocelulolíticos (Pycnoporus sanguineus y Trametes versicolor)
(Publicación VI).
- Estudiar la utilización de un material alternativo no maderero (H. funifera)

para la producción de pastas celulósicas en una biorrefinería mediante el
esquema explosión por vapor más pasteado Kraft y blanqueo. Evaluar
además el efecto del pre-tratamiento en el biopulpeo y el bioblanqueo con
sistema lacasa mediador (Publicación VII).
56
4
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
4 – Discusión de los resultados
4. DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
Los resultados obtenidos durante la realización de la presente tesis doctoral están

recogidos en una serie de publicaciones que se indican a continuación:
I. Martín-Sampedro, R., Martín, J.A., Eugenio, M.E., Revilla, E., Villar,

J.C. Steam explosion treatment of Eucalyptus globulus wood: Influence
of operational conditions on chemical and structural modifications.
BioResources. 2011. 6(4): 4922-4935.
II. Martín-Sampedro, R., Capanema, E.A., Hoeger, I.C., Villar, J.C., Rojas,
O.J. Lignin changes after steam explosion and laccase-mediator
treatment of eucalyptus wood chips. Journal of Agricultural and Food
Chemistry. 2011. 59(16): 8761-8769.
III. Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., García, J.C., Lopez, F., Villar,
J.C., Diaz, M.J. Steam explosion and enzymatic treatments as pre-
treatments to improve enzymatic hydrolysis of Eucalyptus globulus.
Manuscrito.
IV. Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., Revilla, E., Martín, J.A., Villar,
J.C. Integration of Kraft pulping on a forest biorefiney by the addition of
a steam explosion pretreatment. BioResources. 2011. 6(1): 513-528.
V. Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., Villar, J.C. Biobleaching of

Eucalyptus globulus kraft pulps: Comparison between pulps obtained
from exploded and non-exploded chips. Bioresource Technology. 2011.
102: 4530-4535.
VI. Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., Carbajo, J.M., Villar, J.C.

Combination of steam explosion and laccase-mediator treatments prior to
Eucalyptus globulus kraft pulping. Bioresource Technology. 2011. 102:
7183-7189.
VII. Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., Villar, J.C. Effect of steam

explosion and enzymatic pre-treatments on pulping and bleaching of
Hesperaloe funifera. Manuscrito.
59
Todas las publicaciones están relacionadas entre sí y contribuyen al estudio del

sistema de biorrefinería forestal indicado en la figura 4.1. que se basa en la adición de
una etapa de pre-extracción de hemicelulosas previa al pasteado. Además, se ha
estudiado la adición de etapas enzimáticas que mejoren tanto el pasteado y el blanqueo,
como la hidrólisis, para contribuir a la sostenibilidad del proceso y reducir su impacto
ambiental.
Agua de
Enzimas Biopulpeo Enzimas Bioblanqueo
lavado
Material Explosión por Lavadores de Pasta

Digestor Kraft Blanqueo
lignocelulósico vapor pasta blanqueada
Sólido
Líquido (celulosa) Lejía negra
(hemicelulosas) Lejía blanca Condensado
diluida
(NaOH, Na2S)
Enzimas
Hidrólisis Circuito de
Hidrólisis recuperación Vapor
enzimática de lejías negras
Xilosas Glucosas
Fermentación
Bioetanol
Figura 4.1. Esquema del proceso estudiado en la presente tesis doctoral: biorrefinería basada en
la extracción de hemicelulosas previa al pasteado Kraft, introduciendo etapas enzimáticas que
mejoren la sostenibilidad del proceso.
A continuación se discuten conjuntamente los resultados obtenidos en los

distintos trabajos. Para ello se seguirán los siguientes puntos:
4.1) Cambios químicos y estructurales originados por el pre-tratamiento de

explosión por vapor, incluyendo los cambios causados en la lignina
(Publicaciones I y II).
4.2) Hidrólisis enzimática de las fracciones líquida y sólida generadas en el

pre-tratamiento de explosión por vapor. Incluye el aprovechamiento de la
fracción líquida para la producción de etanol y el estudio de la hidrólisis
enzimática de la fracción sólida, como alternativa al pasteado
(Publicación III).
60
4.3) Efecto del pre-tratamiento de explosión por vapor en el pasteado Kraft y

en el bioblanqueo (Publicación IV y V).
4.4) Combinación de tratamientos de explosión por vapor y sistema lacasa

mediador antes del pasteado como alternativa al biopulpeo con hongos
ligninolíticos (Publicación VI).
4.5) Utilización de Hesperaloe funifera en el esquema de biorrefinería

planteado, y evaluación del efecto del pre-tratamiento de explosión por
vapor en el biopulpeo y el bioblanqueo con LMS (Publicación VII).
61
4.1 - Cambios químicos y estructurales debidos al pre-tratamiento de

explosión por vapor
En este apartado se incluye el estudio de los cambios químicos y estructurales

causados por el pre-tratamiento de explosión por vapor en astillas de E. globulus. Para
el estudio de los cambios químicos se ha determinado la composición química de las
distintas muestras sólidas y se han realizado análisis termogravimétricos de las mismas
(Publicación I y II). Además, se ha caracterizado por resonancia magnética nuclear
(RMN) la lignina aislada de las muestras antes y después del pre-tratamiento
(Publicación II). Este estudio se completó con el análisis de una muestra sometida a un
tratamiento en serie de explosión por vapor y tratamiento LMS. Este tratamiento en
serie pretende mejorar el proceso de pasteado (biopulpeo) como se estudiará en el
apartado 4.4. Además, puede contribuir a la detoxificación de la fracción sólida antes de
su hidrólisis enzimática (apartado 4.2.2). Por último, para determinar los cambios
estructurales sufridos por las astillas, se han determinado la capacidad de retención de
agua, la porosidad relativa y el área superficial de las astillas antes y después de los
diferentes pre-tratamiento de explosión por vapor (Publicación I).
En la figura 4.2 se indica en qué partes del proceso de biorrefinería forestal se

centra este apartado.
Agua de
I, II Enzimas Biopulpeo
lavado
Enzimas Bioblanqueo
Astillas Explosión por Lavadores de Pasta

E. globulus vapor pasta blanqueada
Líquido Lejía negra

(hemicelulosas) diluida
(NaOH, Na2S)
Enzimas
Xilosas
Fermentación
Bioetanol
Figura 4.2. Esquema del proceso de biorrefinería forestal estudiado, indicando las partes del
proceso en las que se centran las publicaciones I y II.
62
Para estudiar el pre-tratamiento de explosión de vapor se llevó a cabo un diseño

experimental con 23 experimentos. Las variables consideradas fueron: la adición o no de
una pre-extracción (impregnación de la madera con agua a 25ºC durante 16 horas), la
duración del primer ciclo de tratamiento de explosión por vapor (5 o 10 minutos) y la
adición o no de un segundo ciclo de 3 minutos de duración. Se fijó una temperatura de
183ºC para todos los tratamientos con vapor (10 Kg/cm2 de presión) y una presión de
descarga o explosión de 6 Kg/cm2. La tabla 4.1 recoge las condiciones de operación de
los distintos pre-tratamientos. Se utilizaron dos controles: EG que corresponde al E.
globulus sin ningún tratamiento y SE0 que corresponde a la madera tras la pre-
extracción pero sin tratamiento de explosión por vapor.
Tabla 4.1. Condiciones de operación de los pre-tratamientos de explosión por vapor realizados.
Pre-extracción Número de Duración del Factor de

Experimento er
con agua a 25ºC ciclos 1 ciclo (min) severidad (S0)
EG No - - -
SE0 Sí - - -
SE1 No 1 5 3,14
SE2 Sí 1 5 3,14
SE3 No 1 10 3,44
SE4 Sí 1 10 3,44
SE5 No 2 5 3,35
SE6 Sí 2 5 3,35
SE7 No 2 10 3,56
SE8 Sí 2 10 3,56
La fracción sólida obtenida tras el pre-tratamiento más intenso (SE8) fue

sometida a un tratamiento en serie con LMS a 70ºC, pH 6 (tampón fosfato) y en
presencia de oxígeno (SE8+LMS), para evaluar el efecto de dicho tratamiento tanto en
el biopulpeo como en la detoxificación de la fracción sólida, como se ha indicado
anteriormente.
Después de cada pre-tratamiento, se determinó la composición química de las

fracciones líquidas y sólidas obtenidas. Además, la fracción sólida se estudió mediante
análisis termogravimétrico para determinar la influencia de la severidad del pre-
tratamiento en la temperatura de degradación de cada componente de la madera. Los
63
cambios inducidos por el pre-tratamiento en la lignina fueron estudiados mediante

análisis RMN de la lignina aislada a partir de una muestra antes y después de los
tratamientos SE8 y SE8+LMS.
Se estudiaron además los cambios sufridos en las fracciones sólidas en cuanto a

capacidad de retención de agua, para determinar la accesibilidad del material. También
se estudió mediante porosimetría de intrusión de mercurio la distribución del volumen
de poros y el área superficial según el tamaño de poro, para evaluar los cambios
estructurales inducidos por los distintos pre-tratamientos.
4.1.1 - Cambios en la composición química
La composición química de las astillas de E. globulus antes de ningún

tratamiento (EG) y de las fracciones sólidas obtenidas tras los distintos pre-tratamientos
(SE0-SE8), se determinó en base al contenido en extractos, lignina, grupos acetilo y
azúcares. A partir de estos datos, recogidos en las publicaciones I, II y III, y teniendo en
cuenta el rendimiento en base sólida del pre-tratamiento, se determinaron los
porcentajes de cada componente que permanecen en la fracción sólida obtenida tras la
explosión por vapor. En la figura 4.3 se recogen los porcentajes medios
correspondientes a las distintas repeticiones de los experimentos llevados a cabo en cada
publicación.
a) b)
100 100
% remanente en el sólido
% remanente en el sólido
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
EG SE1 SE3 SE5 SE7 SE0 SE2 SE4 SE6 SE8
Lignina Glucano Xilano Arabano Grupos Acetilo
Figura 4.3. Porcentaje de cada componente de la madera que se detectó en la fracción sólida
tras la explosión por vapor, respecto a la materia prima original EG: a) pre-tratamientos sin pre-
extracción previa; b) pre-tratamientos con pre-extracción previa.
64
El principal efecto del tratamiento de explosión por vapor fue la solubilización

de las hemicelulosas (xilanos y arabanos) provocadas por la autohidrólisis durante el
tratamiento con vapor a altas temperaturas. Al igual que en trabajos publicados por otros
autores (Josefsson et al., 2002; Li et al., 2005; 2007), se observó un aumento de la
hidrólisis de hemicelulosas al aumentar la severidad del tratamiento (aumento de la
temperatura y el tiempo de tratamiento). Así en el tratamiento más severo (SE8) sólo
permaneció en la fracción sólida el 53,4% de los xilanos y el 6,6% de los arabanos. Ruiz
et al. (2008) encontraron resultados similares, observando una solubilización completa
de los arabanos y del 50% de los xilanos tras someter tallos de girasol a un tratamiento
de explosión por vapor a 190ºC.
Junto con la solubilización de hemicelulosas se observó una eliminación de

grupos acetilo para severidades medias y altas (de SE4 a SE8), ya que éstos se
encuentran unidos a los xilanos en las hemicelulosas de las maderas frondosas, como el
eucalipto. Otros autores también han observado una disminución de los grupos acetilo
tras tratamientos de autohidrólisis (Leschinsky et al., 2009). Estos grupos acetilo pueden
eliminarse de la madera por medio de dos mecanismos: por hidrólisis directa, o por
disolución de los xilo-oligosacáridos acetilados (Maloney et al., 1985).
La explosión por vapor también puede originar un ablandamiento y

despolimerización de la lignina (Excoffier et al., 1991), provocando la solubilización de
una pequeña parte de la lignina presente en el material original. Se observó que su
eliminación también aumentaba con la severidad del tratamiento. Por el contrario, no se
observó solubilización de la celulosa, excepto un 4% para el tratamiento SE8. Similares
resultados fueron encontrados por otros autores, quienes observaron hidrólisis de la
celulosa, principalmente en regiones amorfas, sólo para tratamientos de severidad
superior a los estudiados en esta tesis doctoral (Li et al., 2005; Ruiz et al., 2008; Tunc et
al., 2010).
La pre-extracción con agua a 25ºC de las astillas de E. globulus no afectó

significativamente a su composición cuando no se llevó a cabo una explosión por vapor
consecutiva (EG-SE0), excepto una disminución en el contenido en extractos totales
(3,8% vs 2,7%) (ver publicación Publicación I). Sin embargo, al llevar a cabo la
explosión por vapor sí se observaron diferencias debidas a esta pre-extracción,
especialmente en los tratamientos de mayor severidad (SE3-SE4 y SE7-SE8),
65
aumentando la cantidad solubilizada de todos los componentes de la madera. Esto puede

deberse a que la eliminación de extractos durante la pre-extracción facilita la
penetración del vapor en las astillas haciendo más eficaz el tratamiento. Otra razón
podría ser el mayor contenido en agua de las muestras pre-extraídas, que puede
provocar una explosión más intensa debido al vapor generado a partir del agua de las
muestras.
Cuando no se realizó una pre-extracción inicial, la adición de un segundo ciclo

de explosión por vapor fue un factor más influyente en la solubilización de los
componenetes de la madera que la prolongación del primer ciclo, (SE3-SE5). Sin
embargo, la cantidad extraída de lignina, xilano y grupos arabanos fue mayor en SE4
que en SE6, indicando mayor influencia del tiempo de tratamiento frente a la adición de
un segundo ciclo cuando se llevó a cabo una pre-extracción inicial. Es decir, el efecto
global del pre-tratamiento dependerá de las tres variables de operación estudiadas, y su
combinación determinará la influencia de cada variable.
En la fracción líquida obtenida después de la pre-extracción (SE0) no se observó

apenas presencia de monómeros ni oligosacáridos. Sin embargo, en las fracciones
obtenidas después de los tratamientos de explosión por vapor (SE1-SE8), el contenido
de ambos, y especialmente el de oligosacáridos, aumentó al aumentar la severidad del
tratamiento. En la figura 4.4 se muestran los porcentajes de cada componente de la
madera, presentes en la fracción líquida. Como se observó a partir de la fracción sólida,
la celulosa apenas se extrajo mientras que la extracción de hemicelulosas (xilano,
arabano y grupos acetilo) aumentó al aumentar la severidad del tratamiento. Sin
embargo, la cantidad detectada en la fracción líquida fue inferior a la cantidad extraída
determinada a partir del análisis de la fracción sólida. Varios autores han observado la
degradación de oligosacáridos disueltos en la fracción líquida a furfural e
hidroximetilfurfural (HMF) durante tratamientos de explosión por vapor de severidad
superior a 3,5 y 4,3 respectivamente (Li et al., 2005), lo que explicaría la disminución
de oligosacáridos presentes en la fracción líquida. Sin embargo, los tratamientos de
explosión por vapor llevados a cabo en esta tesis doctoral tienen factores de severidad
iguales o inferiores a 3,5 y en las fracciones líquidas obtenidas no se detecto presencia
de furfural ni HMF, lo que indicaría un bajo porcentaje de reacciones de degradación.
No obstante, es posible que estos productos de degradación volátiles no se recuperen
cuantitativamente en la fracción líquida y se pierdan parcialmente a la atmósfera durante
66
la descompresión de la explosión por vapor (Emmel et al., 2003). Otra posible causa de
la disminución de los azúcares recuperados podría ser una recolección ineficiente de los
compuestos extraídos, ya que parte podrían estar disueltos en el líquido que impregna
las astillas después de la explosión y ser desechados con las aguas del lavado de las
astillas.
a) b)
50 50
45 45
% extraído en líquido
% extraído en líquido
40 40
35 35
30 30
25 25
20 20
15 15
10 10
5 5
0 0
Glucano Xilano Arabano Grupos Acetilo
Figura 4.4. Porcentaje de cada componente de la madera que se detectó en la fracción líquida
tras la explosión por vapor, respecto a la materia prima original EG: a) pre-tratamientos sin pre-
extracción previa; b) pre-tratamientos con pre-extracción previa.
La fracción sólida obtenida tras el pre-tratamiento SE8, que proporcionó una

mayor extracción de hemicelulosas y una estructura más abierta comparado con los
demás pre-tratamientos, como se verá en los siguientes apartados, se sometió a un
tratamiento con LMS a 70ºC durante 30 minutos con saturación de oxígeno y se estudió
su composición química (Publicación II y III). La cantidad de cada componente que
permaneció en la fracción sólida después de los tratamientos SE8+LMS, respecto a la
muestra original de E. globulus (EG) fue: 74%, 93%, 45%, 5% y 32% de lignina,
glucano, xilano, arabano y grupos acetilo respectivamente. Es decir, se observó una
pequeña solubilización de todos los componentes de la madera durante el tratamiento
enzimático, excepto para los grupos acetilos, en los que la solubilización fue más
acusada, seguida por la eliminación de xilanos. Esta solubilización puede deberse a la
degradación parcial de los componentes de la madera, principalmente hemicelulosas
(formadas por xilanos, arabanos y grupos acetilo) durante el tratamiento de explosión
por vapor SE8, que hace que sean solubles en el subsecuente tratamiento enzimático a
70ºC. Sin embargo, los resultados obtenidos cuando no se añadió LMS y se llevó a cabo
el tratamiento sólo con tampón (pH 6, 70ºC) fueron muy similares, por lo que esta
67
solubilización se debe principalmente al tratamiento a alta temperatura y no a la acción

de las enzimas. Por otro lado, se observó una disminución en el contenido de extractos
en etanol comparando las muestras SE8+LMS y SE8 (5,6% y 8,3% respectivamente),
que podría estar relacionado con la eliminación de extractos lipofílicos por la lacasa, ya
observado por otros autores que aplicaron lacasas para combatir problemas de pitch en
la producción de pasta y papel (Gutiérrez et al., 2007; Widsten y Kandelbauer, 2008;
Yang y Wyman, 2004; Zhang et al., 2005).
4.1.2 - Estudio termogravimétrico
Se llevaron a cabo análisis termogravimétricos (TGA) de las fracciones sólidas

obtenidas después de los tratamientos de explosión por vapor. En la figura 4.5 se
muestran las curvas de pérdida de peso en atmósfera de aire frente a la temperatura y
sus curvas derivadas tanto para la madera original (EG) como para la fracción sólida
obtenida tras el tratamiento de explosión de vapor más severo (SE8). Se observaron dos
franjas principales de degradación, la primera entre 250 y 350ºC corresponde a la
degradación de los polisacáridos, mientras que la segunda, entre 400 y 500 ºC, se
atribuye a la lignina (Rovira y Vallejo, 2000). En el caso de los polisacáridos la
degradación se produce por medio de dos reacciones consecutivas: una primera
descomposición térmica (volatilización) seguida de la oxidación de los compuestos
formados durante la descomposición térmica. En el caso de la lignina, se considera que
estas reacciones tienen lugar simultáneamente (Barneto et al., 2009).
a) b)
100 EG 2,0
EG
1,8
1ª Derivada peso (%/ºC)
SE8 SE8
80 1,6
1,4
Peso (%)
60 1,2
1,0
40 0,8
0,6
20 0,4
0,2
0 0,0
0 100 200 300 400 500 600 0 200 400 600
Temperatura (ºC) Temperatura (ºC)
Figura 4.5. Análisis termogravimétrico, en atmósfera de aire, de la madera original (EG) y

después del tratamiento de explosión de vapor (SE8): a) pérdida de peso frente a la temperatura;
b) primera derivada de la curva de pérdida de peso.
68
A partir de la primera derivada de las curvas de pérdida de peso, se puede

determinar la temperatura de degradación media para cada polímero (figura 4.6). Los
cambios en estas temperaturas de degradación se pueden atribuir a cambios en los
componentes de la madera. Así, mientras la temperatura de degradación de los
polisacáridos permaneció aproximadamente constante, se observó un aumento
progresivo de la temperatura de degradación de la lignina a medida que el tratamiento
de explosión por vapor se hizo más severo, llegando a 489 ºC para SE8 (frente 470ºC en
EG). Comparando los distintos tratamientos, se observó un aumento de la temperatura
de degradación de la lignina al añadir un segundo ciclo de tratamiento (SE1-SE4, SE2-
SE5, SE3-SE6 y SE4-SE8) o al aumentar la duración del primer ciclo (SE1-SE3, SE2-
SE4, SE6-SE8, excepto para SE5-SE7). Generalmente, cuanto menor sea el peso
molecular y/o la cristalinidad, menor será la temperatura de degradación de un polímero
(Turi, 1981). Por tanto, el aumento en la temperatura atribuida a la lignina sugiere que
durante la explosión por vapor tienen lugar reacciones de condensación, que son más
frecuentes cuanto mayor es la severidad del tratamiento (Li et al., 2007). Este aumento
de temperatura de degradación de la lignina, también podría atribuirse a la eliminación
de complejos lignina-carbohidratos (LCC) observada por otros autores durante la
explosión por vapor (Li et al., 2007) y que se confirmó con el estudio de la lignina
mediante RMN descrito en el siguiente apartado.
500 400
488 486 489
490 484 485 390
482
478 478
480 380
Temperatura (ºC)
Temperatura (ºC)
470
470 370
460 360
450 350
440 332 333 332 333 333 333 333 340
332 331
430 330
420 320
Lignina Polisacáridos
Figura 4.6. Temperaturas de degradación atribuidas a la lignina y a los polisacáridos en las

muestras analizadas antes (EG) y después del tratamiento de explosión por vapor (SE1-SE8).
Respecto a los polisacáridos, la temperatura de degradación atribuida a la

celulosa permanece aproximadamente constante después de la explosión por vapor
69
(332-333 ºC). Sin embargo, fijándonos en las curvas correspondientes a la primera

derivada de la pérdida de peso, se observó un hombro en torno a 280ºC en la muestra
original (EG) que fue desapareciendo progresivamente al aumentar la severidad de los
tratamientos de explosión por vapor. Este hombro se atribuyó a los xilanos, y su
desaparición concuerda con la solubilización de éstos, observada a partir de los análisis
de la composición química (figura 4.3).
Cuando la muestra SE8 se sometió a un tratamiento con LMS a 70ºC, las

temperaturas de degradación de la lignina y de los polisacáridos disminuyeron en 19 y
31ºC respectivamente. Cambios similares se observaron en la muestra control tratada
sólo con tampón a 70ºC (sin adición de LMS). Por tanto, al igual que ocurría al analizar
la composición química de las muestras, los cambios originados por el tratamiento
enzimático se deben principalmente al tratamiento a temperatura alta en presencia de
oxígeno y no a la acción enzimática. Así, durante este tratamiento, pequeños fragmentos
de lignina y polisacáridos (parcialmente degradados durante la explosión por vapor)
pueden solubilizarse pasando a la fase líquida (como se ha indicado en el apartado
4.1.1) y causar una disminución en el grado de polimerización de los polisacáridos y en
el contenido en lignina, que provocaría la disminución de sus temperaturas de
degradación.
4.1.3 - Cambios en las estructuras de lignina
Para estudiar los cambios sufridos por la lignina durante el tratamiento de

explosión por vapor, se aisló lignina de la muestra original (EG) y de la fracción sólida
obtenida después del tratamiento más severo (SE8) y se analizó mediante RMN.
También se estudiaron los posibles cambios inducidos por un tratamiento consecutivo
de SE8 y LMS a 70ºC, aislando lignina de la muestra SE8+LMS estudiada en los
apartados anteriores. El procedimiento seguido para aislar la lignina fue un
procedimiento modificado de Milled Wood Lignin (MWL), descrito previamente por
Capanema et al. (2007) y que se detalla en la publicación II. Durante dicho
procedimiento, se ajustó la intensidad de molienda (tiempo de molienda y relación bolas
por gramo de muestra) para conseguir un rendimiento en el aislamiento de lignina en
torno al 40%, siendo necesaria una molienda más intensa para la muestra SE8. Tras el
70
tratamiento con lacasa, la intensidad de la molienda requerida se redujo. Teniendo en

cuenta que una lignina menos condensada es más fácil de aislar, estos resultados
coinciden con los vistos en el análisis termogravimétrico. Dichos análisis indicaban una
condensación de la lignina durante el tratamiento de explosión de vapor y una reducción
de esta condensación durante el subsiguiente tratamiento con LMS debido a reacciones
de despolimerización.
Las tres ligninas aisladas se analizaron mediante 1H-13C 2D-RMN. A través de la

asignación de las diferentes señales en los espectros, comparadas con las de MWL de
eucalipto reportadas en otros trabajos (Capanema et al., 2004; 2005), pudieron
identificarse las unidades estructurales (G y S) y los diferentes enlaces entre ellas
(figura 4.7). Los espectros HSQC mostraron las tres regiones típicas de un espectro de
lignina: región alifática (CH saturado), alifática oxigenada (CH saturado unido a
oxígeno) y aromática (principalmente CH aromático pero también CH olefínico)
(figuras 4.8, 4.9 y 4.10).
OCH3
HO γ
HO 6' O
6' 5' 1' 1'
5' 1' 6' 2' 3'
2' 4'
R β 4'
3' 2' O
4'
3' 2' 5'
4'
3'
O 1'
6' 5'
α O O OCH3 OCH3
OCH3 HO O
1
OCH3 1
6 6 2
2
5 4 3 5 4 3 6 1
5
6
1 O
OCH3 OCH3 5
4 3
2
4
3
2
O O O
O OCH3 OCH3
A b -O-4/ a -OH, R=OH C b-O-4/ a -CO D E

B. b -O-4/ a -OAlk, R=Alk
O OH
COOH
H3 CO O
OH
HO
6
1
2 OAr
5 4 3
OCH3 OCH3
OCH3
O O
O
F H I
R=
O
HO Carb
5'
6'
1' O
4' O
HO O HO O
3' 2'
R
O OH Carb
OCH3 O
1
6 2 HO
5 4 3
OH OCH3 H3 CO OCH3
OCH3 O
O Carb O O
O O OH
O G S
OH Carb
J
Figura 4.7. Estructuras de lignina identificadas mediante RMN.
71
En la región alifática de las tres muestras se observaron señales en torno a δH 0,8

y δH 1,2-1,3, que corresponden a extractos, probablemente unidos químicamente a la
lignina (Balakshin et al., 2001). Se observó un conjunto de señales entre δH 1,5-2,5 y δC
20-43 que corresponden a CH alifático unido a alcoholes, carbonilos o éteres (Balakshin
et al., 2001). Se identificaron también algunas estructuras menores de lignina, como Ar-
COCH2-CH2OH y ácido dihidroferúlico (Ar-CH2-CH2-COOH). En la lignina aislada de
la muestra original de E. globulus se identificaron señales correspondientes a alcohol
dihidrocinámico (Ar-CH2-CH2-CH2OH) (estructura I), que no se observaron en las
ligninas aisladas a partir de las muestras tratadas.
En la región alifática oxigenada de los espectros de las tres ligninas aisladas, se

identificaron señales correspondientes a las estructuras principales de la lignina nativa
como subestructuras de tipo (β-O-4’) (A), fenilcumarano (β-5’) (D) y
pino/siringaresinol (β-β’) (E), aunque la intensidad de las estructuras β-O-4’ y β-β’
disminuyó en las muestras después de la explosión por vapor. Se observaron también en
las tres ligninas las señales correspondientes al β-CH en subestructuras β-O-4’ con
unidades S y grupos carbonilo en α-C a δC/ δH 83,5/5,28 (Cβ), y el γ-CH en unidades de
coniferil alcohol a 61,9/4,12 ppm (Capanema et al., 2005).
20
40
60
Carbohidratos δC
80
100
120
7 6 5 4 3 2 1
δH
Figura 4.8. Espectro HSQC de la lignina MWL aislada de la muestra original de Eucalyptus
globulus.
72
En el espectro de la lignina aislada de E. globulus sin tratar se identificaron

señales débiles correspondientes a subestructuras de espirodienona (F). Las señales a
δC/ δH 79,5/4,12 y 81,2/5,1 ppm se asignaron a β’-CH en estructuras de espirodienona
(Fβ) y α-CH en espirodienona (Fα) y lignina unida a xilano (Jα-xyl), respectivamente
(Capanema et al., 2005; Capanema et al., 2007). Estas señales se debilitaron, hasta
incluso desaparecer en las ligninas aisladas después de la explosión por vapor y después
del tratamiento en serie de explosión por vapor y LMS. Las señales de subestructuras β-
O-4’ unidas a carbohidratos mediante enlaces éteres en α-C o γ-C, revelan la presencia
de complejos lignina – carbohidratos (J). La disminución de intensidad de la señal
81,2/5,1 ppm asignada a enlaces bencil éter entre lignina y xilano (Jα-xyl), corrobora la
hipótesis de la eliminación de complejos lignina – carbohidratos (Capanema et al.,
2007) durante la explosión por vapor, señalada en el estudio termogravimétrico.
En la región aromática de las tres ligninas se observó un predominio de las

unidades siringilo (S) respecto a las guayacilo (G), lo que concuerda con la alta
proporción de unidades S en las maderas de frondosas.
Comparando los espectros HSQC de las tres ligninas aisladas, se encontró una
mayor presencia de polisacáridos en las ligninas tratadas (SE8 y SE8+LMS) a δC/ δH
63-75/3,2-3,8. Aparte de esta diferencia, los espectros fueron muy similares. Otros
autores que estudiaron lignina residual después de un tratamiento LMS seguido de una
extracción alcalina (Balakshin et al., 2001; Ibarra et al., 2007), encontraron también
espectros HMQC muy similares a los de la lignina original (lignina Kraft residual).
Estos autores atribuyeron estos resultados a la eliminación de la lignina alterada de la
pasta durante la extracción alcalina llevada a cabo tras el tratamiento LMS. Así, la
lignina que permanece en la pasta no muestra cambios sustanciales, porque sería
principalmente la lignina no oxidada. En nuestro caso, la lignina alterada podría
eliminarse durante la extracción alcalina que se lleva a cabo en el procedimiento de
aislamiento de la lignina con el objetivo de eliminar taninos. Así, la lignina soluble en
álcali eliminada en el caso de muestra original fue un 9,6% de la lignina inicial,
mientras que para la muestra tras explosión de vapor fue un 26,9%. En el caso de la
muestra tras explosión de vapor y tratamiento LMS, la lignina soluble en álcali fue un
25,0% de la lignina inicial. Esta disminución respecto a la muestra SE8 puede deberse a
la eliminación de lignina durante el tratamiento LMS, que se observó en el estudio de la
composición química.
73
a)
20
40
60
Carbohidratos δC
80
100
120
6 δH 4 2
b)
50
60
δC
70
Carbohidratos
80
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0
Figura 4.9. Espectro HSQC de la lignina aislada de la muestra tras el tratamiento de explosión
por vapor SE8 (a). Incluye una ampliación de la región alifática oxigenada (b).
74
a)
20
40
60
Carbohidratos δC
80
100
120
6 δH 4 2
b) 50
60
δC
70
80
Carbohidratos
5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0

δH
Figura 4.10. Espectro HSQC de la lignina aislada de la muestra tras el tratamiento de explosión
por vapor seguido del tratamiento con LMS (SE8+LMS) (a). Incluye una ampliación de la
región alifática oxigenada (b).
75
A partir de los espectros 13C-RMN se llevó a cabo un estudio cuantitativo de los

grupos funcionales principales en la lignina. Los cálculos se hicieron de acuerdo al
método propuesto por Capanema et al. (2005), y los resultados se muestran en la tabla
4.2.
Tabla 4.2. Grupos funcionales más importantes en la lignina, basados en 13

C NMR (por 100
unidades aromáticas Ar).
Lignina aislada COOR OHpr* OHsec* OHph β-O-4 OMe S/G DC

Original (EG) 5 69 57 23 64 177 3,2 13
SE8 16 66 54 47 36 170 3,1 14
SE8 + LMS 17 63 70 53 36 161 3,0 19
*Incluyen grupos OH de los carbohidratos.
La cantidad de grupos COOH alifáticos y conjugados estimada a partir del

espectro de la lignina MWL no acetilada de la muestra original E. globulus (EG) fue
similar a la reportada por otros autores (Evtuguin et al., 2001). Sin embargo, al someter
la madera a un tratamiento de explosión por vapor, la cantidad de grupos carboxílicos
aumentó significativamente.
La cantidad de grupos hidroxilo primarios, observada en las ligninas aisladas a

partir de las muestras tratadas (SE8 y SE8+LMS), fue ligeramente inferior a la de la
lignina aislada de la muestra original (EG). Sin embargo, la cantidad de OH secundarios
aumentó significativamente después del tratamiento con lacasa. Además, la cantidad de
OH fenólicos aumentó apreciablemente después del tratamiento de explosión por vapor,
coincidiendo con los resultados encontrados por otros autores (Robert et al., 1986;
Shimizu et al., 1998).
La cantidad de subestructuras β-O-4 se redujo significativamente después del

tratamiento de explosión de vapor, concordando con los resultados mostrados por otros
autores (Jakobsons et al., 1995; Li et al., 2007; Robert et al., 1988). Como se ha
indicado en el apartado 2.4.2 de la introducción, cuando el tratamiento de explosión por
vapor se lleva a cabo sólo en presencia de vapor, se produce una autohidrólisis
catalizada por el ácido acético formado a partir de los grupos acetilos de la madera. Las
reacciones predominantes en la lignina son la fragmentación por acidólisis de los
enlaces β-O-4 y la polimerización por reacciones de condensación entre el C6 o C5
aromático y un ión carbonio, normalmente localizado en α-C (Li et al., 2007). Estos
76
autores observaron un aumento del peso molecular de la lignina, que presentó una
estructura más heterogénea, debido al predominio de las reacciones de repolimerización
a medida que aumentaba la severidad del tratamiento. En nuestro caso, no se observó un
aumento del grado de condensación (DC) después del tratamiento de explosión por
vapor, probablemente debido a que, en las condiciones ensayadas (menos severas), las
reacciones de repolimerización pueden no ser predominantes.
Después del tratamiento con LMS, no se observó variación en la cantidad de

subestructuras β-O-4, pero se observó un aumento en el grado de condensación. Por el
contrario, los análisis termogravimétricos indicaban una disminución de la temperatura
de degradación de la lignina que estaría asociada a estructuras menos condensadas de
lignina. Sin embargo, se debe tener en cuenta que para los análisis termogravimétricos
se utilizó madera molina y no lignina aislada, por tanto, estos resultados se verán
afectados por cambios indirectos y colectivos de la lignina y otros componentes de la
madera. Así, los resultados indican una disminución global del peso molecular de la
lignina después del tratamiento de explosión por vapor y LMS, siendo la lignina de
menor peso molecular extraída durante la extracción alcalina (como se ha visto
anteriormente) y quedando la lignina más condensada como lignina aislada.
La cantidad de grupos metoxilo (OMe) se redujo de 1,77/Ar a 1,70/Ar después

del tratamiento de explosión por vapor, y de 1,70/Ar a 1,61/Ar en el subsiguiente
tratamiento con LMS. Reducciones similares fueron encontradas por otros autores
durante tratamientos de autohidrólisis (Chua y Wayman, 1979).
Por último, se observó una reducción significativa de la relación S/G después del
tratamiento de explosión por vapor y también después del tratamiento con LMS. Chua y
Wayman (1979) explicaron que esta reducción en la relación S/G durante condiciones
suaves de explosión por vapor podía deberse a una eliminación preferente de unidades
siringilo durante tiempos cortos de autohidrólisis. De igual forma, Ibarra et al. (2007)
observaron una reducción de la relación S/G después de tratamientos LMS.
77
4.1.4 - Análisis de la capacidad de retención de agua de las muestras
Los cambios estructurares causados con el tratamiento de explosión por vapor

fueron perceptibles a simple vista como se observa en la figura 4.11, en la que se
muestran las astillas antes y después del tratamiento SE8.
a) b) c)
Figura 4.11. Astillas sin pre-tratatar (a) y astillas después del pre-tratamiento SE8 (b); una
ampliación de la zona remarcada se muestra en (c).
Para estudiar de forma cuantitativa estos cambios en la estructura de las

muestras se utilizó la capacidad de retención de agua de las astillas. Este parámetro nos
da información acerca de los cambios en la estructura interna del material y en la
superficie específica de las fibras (Kokta y Ahmed, 1998). Como se observa en la figura
4.12, el tratamiento de explosión por vapor causa un aumento importante en la
capacidad de retención de agua de las astillas, mayor cuanto más severo es el
tratamiento (Kokta y Ahmed, 1998). Este hecho sugiere que la accesibilidad de las
astillas tratadas aumenta, lo que mejorará la difusión de los reactivos químicos o de las
enzimas que se apliquen en un tratamiento posterior (Ahvazi et al., 2007; Glasser y
Wright, 1998). La variable que más influyó en la capacidad de retención de agua fue la
adición de un segundo ciclo de explosión por vapor (incremento de 143% en SE4 a
272% en SE8), seguida de la duración del primer ciclo (aumento de 105% en SE2 a
143% en SE4). La adición de una pre-extracción con agua a 25ºC antes del tratamiento
de explosión por vapor también aumenta la capacidad de retención de agua, efecto
relacionado con el aumento de la intensidad del tratamiento que se observó también a
partir de los análisis químicos. Este efecto estaría relacionado con la mayor
homogeneidad de impregnación de las muestras y el aumento en el contenido en agua.
78
300
Sin pre-extracción
g agua retenida / 100 g madera

250
Con pre-extracción
200
150
SE 8
100 SE 6 SE 7
SE 4 SE 5
50 SE 1 SE 2 SE 3
EG SE0
0
Control 1C: 5 1C: 10 2C: 5+3 2C: 10+3
Figura 4.12. Comparación de la capacidad de retención de agua de las astillas originales y las
astillas después de los tratamientos de explosión por vapor.
4.1.5 - Cambios de la porosidad relativa y área superficial
Para estudiar en mayor profundidad los cambios estructurales causados por el

tratamiento de explosión por vapor, se llevó a cabo un análisis de la porosidad y del área
superficial de las muestras mediante porosimetría de intrusión de mercurio (MIP),
considerando un modelo de poros cilíndricos.
Los resultados del volumen relativo de poros mostraron una banda heterogénea
para un diámetro de poro entre 10 y 100 µm que puede corresponder al lumen y a los
vasos de las células de la madera. Este volumen no se modificó de manera importante
tras los tratamientos de explosión por vapor. Por ello, el estudio se centró en el volumen
de poros con un diámetro comprendido entre 10 y 10000 nm (Figura 4.13).
Las astillas de E. globulus sin ningún tratamiento (EG) mostraron una banda
principal de volumen de poro para diámetros comprendidos entre 10 y 200 nm, y una
banda más pequeña entre 3000 y 4000 nm. Después de un tratamiento de explosión por
vapor de 1 ciclo de 5 minutos (SE1), la banda principal se desplazó hacia diámetros de
poro mayores. Al someter las astillas a un tratamiento de 10 minutos (SE3), el volumen
de poro aumentó respecto a EG y SE1, apareciendo dos picos para diámetro de poro
entorno a 400 y 1500 nm, seguidos de un tercer pico para poros de 10000 nm. Al añadir
un segundo ciclo (figura 4.13b), se generaron poros de diámetro entre 4000-6000 nm,
siendo mayor el volumen de poros para tratamientos más largos (SE7 vs SE5).
79
a) b)
0,05 0,05
EG EG
Volumen relativo, ml/g

SE1 SE5
0,04 SE3 0,04 SE7
0,03 0,03
0,02 0,02
0,01 0,01
0,00 0,00
10 100 1000 10000 10 100 1000 10000
Diámetro de poro, nm Diámetro de poro, nm
c) d)
0,05 0,05
SE0 SE0
SE2 SE6

0,04 SE4 0,04 SE8
0,03 0,03
0,02 0,02
0,01 0,01
0,00 0,00
10 100 1000 10000 10 100 1000 10000
Figura 4.13. Volumen relativo de poros en las astillas tras el tratamiento de explosión por
vapor: a) sin pre-extracción y con 1 ciclo, b) sin pre-extracción y con 2 ciclos, c) con pre-
extracción y con 1 ciclo d) con pre-extracción y con 2 ciclos.
En la figura 4.13c y d, se muestra el volumen de poros para muestras sometidas

a una pre-extracción en agua a 25ºC previa al tratamiento con vapor. Comparando la
muestra original (EG) con la muestra tras la pre-extracción (SE0), se observó la
aparición de una nueva banda para diámetros de poro en torno a 300 nm. Estos nuevos
poros pueden haberse generado debido a la extracción de compuestos de la madera
solubles en agua (Romero et al., 1992). Al someter esta muestra pre-extraída a los
consecutivos tratamientos de explosión por vapor, se observó un efecto mayor que el
encontrado para muestras sin pre-extraer. Estos resultados parecen indicar que los
nuevos poros generados durante la pre-extracción, permiten la penetración de mayor
cantidad de vapor en las astillas, aumentando el efecto tanto de la autohidrólisis como
de la explosión, como se observó también a partir de los datos de composición química
y de capacidad de retención de agua.
Estos resultados revelan una redistribución de la red de poros en las muestras

tratadas, disminuyendo el volumen de poros pequeños y aumentando el volumen de
80
poros grandes, pero sin prácticamente aumentar el volumen total de poros. Es decir,
debido al tratamiento de explosión por vapor varios poros pequeños darían lugar a un
poro de mayor tamaño. Así, en la figura 4.14 observamos cómo mientras el volumen de
mesoporos (diámetro de poro entre 7 y 50 nm) disminuyó, el volumen de macroporos
(entre 50 y 10000 nm) aumentó en todas las muestras tratadas, especialmente en las pre-
extraídas con agua, excepto después del tratamiento menos severo (SE1 y SE2). A partir
de estos resultados podría concluirse que el tratamiento de explosión por vapor tiene un
efecto positivo en la formación de poros de mayor tamaño aumentando de esta forma la
accesibilidad de las astillas que permitirá una mejor y más rápida penetración tanto de
reactivos químicos como de enzimas.
a) Sin pre-extracción
b)
Sin pre-extracción
0,25 0,7
Mesoporos: Vol. esp., ml/g
Macroporos: Vol. esp., ml/g

Con pre-extracción Con pre-extracción
0,6
0,20
0,5
0,15 0,4
0,10 EG SE0 0,3 SE3

SE6
0,2 SE4
SE8
0,05 SE2 SE5 EG SE0 SE5 SE7
0,1 SE1 SE2
SE1 SE3
SE6 SE7SE8
SE4
0,00 0,0
Control 1C:5 1C:10 2C:5+3 2C:10+3 Control 1C:5 1C:10 2C:5+3 2C:10+3
Figura 4.14. Volumen específico de a) mesoporos y b) macroporos en las astillas después de los
tratamientos de explosión por vapor, comparado con las astillas antes del tratamiento (control).
El área superficial del material es también un parámetro importante que puede

influir en la cinética de las reacciones tanto de las enzimas como de los reactivos
químicos con la madera. En la figura 4.15 se muestra la superficie relativa de las astillas
tratadas y sin tratar, observando una disminución importante de la superficie después
del tratamiento de explosión por vapor para poros de diámetro entre 10 y 100 nm. Esta
disminución de superficie se debe a la desaparición de poros de tamaño pequeño. La
formación de macroporos dio lugar a un aumento en la superficie relativa entorno a 100
– 1000 nm. Sin embargo, debido a que los poros de tamaño grande proporcionan un
área superficial pequeño, no se observó un aumento significativo en la superficie
relativa para diámetros superiores a 1000 nm. Por ello, se produjo una disminución
global del área superficial de las astillas tratadas, ya que la formación de poros grandes
a partir de poros pequeños, conlleva una disminución en el área superficial.
81
a) b)
7,0 7,0
EG SE0
Superficie relativa, m 2/g

Superficie relativa, m 2/g
6,0 SE1 6,0 SE2
SE3 SE4
5,0 5,0
SE5 SE6
4,0 SE7 4,0 SE8
3,0 3,0
2,0 2,0
1,0 1,0
0,0 0,0
10 100 1000 10000 10 100 1000 10000
Figura 4.15. Superficie relativa de las astillas tras el tratamiento de explosión por vapor: a) sin
pre-extracción, b) con pre-extracción.
En resumen, tras el tratamiento de explosión por vapor aumentó el volumen de

poros de mayor tamaño y disminuyó el volumen de mesoporos, aumentando la
accesibilidad pero disminuyendo el área superficial del material. Por ello, dependiendo
de la naturaleza de la reacción o del proceso al que se someta el material, el efecto del
tratamiento de explosión por vapor podrá ser positivo o negativo.
82
4.2 - Hidrólisis de las fracciones líquida y sólida generadas en el pre-

tratamiento de explosión por vapor.
En este apartado se estudia el potencial de la fracción líquida obtenida en el pre-

tratamiento de explosión por vapor para la producción de etanol. Para ello se han
evaluado los azúcares fermentables que pueden obtenerse a partir de dicha fracción por
medio de hidrólisis ácida e hidrólisis enzimática. Además se ha estudiado la hidrólisis
enzimática de las fracciones sólidas, planteando la producción de etanol a partir de la
fracción celulósica como alternativa al pasteado. Se ha analizado también el efecto
detoxificante de un tratamiento LMS antes de la hidrólisis de la fracción sólida
(Publicación III).
En la figura 4.16 se muestran las partes del proceso de biorrefinería forestal en

las que se centra este apartado. La línea de pasteado se ha sustituido por la hidrólisis
enzimática de las fracciones sólidas para la producción de bioetanol.
Agua de
III Enzimas Detoxificación
lavado
Enzimas Bioblanqueo

Sólido
(celulosa) Condensado
Enzimas Lejía blanca

Hidrólisis (NaOH, Na2S) Circuito de
Xilosas Glucosas
Fermentación
Bioetanol
proceso en las que se centran la publicación III.
A partir de los resultados estudiados en el apartado anterior, se seleccionó el

tratamiento SE8, que consiste en una pre-extracción en agua a 25ºC seguida de dos
ciclos de explosión por vapor de 10 y 3 minutos a 183ºC, como el pre-tratamiento más
adecuado. Esta selección se basó tanto en datos estructurales como de composición
química. Así, el tratamiento SE8 fue el que permitió una mayor extracción de xilanos,
83
sin llegar a degradar significativamente la celulosa, permitiendo de este modo

aprovechar la corriente líquida rica en hemicelulosas para obtener etanol (Li et al.,
2010; Ragauskas et al., 2006; Van Heiningen, 2006), y aprovechar la fracción sólida
para la producción de pasta de celulosa, sin reducir de manera importante sus
propiedades mecánicas. Además, fue el pre-tratamiento que provocó un mayor aumento
de la capacidad de retención de agua de la fracción sólida y, por tanto, será el que
permitirá una mejor difusión de los reactivos facilitando el pasteado. Asimismo,
también favorecerá la hidrólisis enzimática de la fracción sólida, en el caso de sustituir
la producción de pasta por la producción de bioetanol a partir de la fracción celulósica,
como se estudia en el apartado 4.2.2.
4.2.1 - Hidrólisis ácida y enzimática de la fracción líquida
El pre-tratamiento SE8 seleccionado consistió, como se ha indicado, en una pre-

extracción en agua a 25ºC seguida de dos ciclos de explosión por vapor de 10 y 3
minutos a 183ºC. Por tanto, en cada ciclo se obtuvo una fracción líquida (SE8.1 y
SE8.2), cuyo contenido en azúcares y grupos acetilo se muestra en la tabla 4.3. Se
determinó también el porcentaje de azúcares recogidos en dicha fracción respecto al
contenido potencial de azúcares en el E. globulus (EG). Durante el primer ciclo de
explosión por vapor se recuperó, en forma de oligosacáridos, un 8,2% de la xilosa y un
4,0% de la glucosa presente en EG. Durante el segundo ciclo se recuperó un porcentaje
mayor de xilooligosacáridos, pese a tratarse de un ciclo más corto (3 minutos frente a 10
minutos en el primer ciclo). Estos resultados pueden indicar que durante el primer ciclo
de explosión por vapor, algunos polisacáridos se degradaron parcialmente sin llegar a
solubilizarse en la fracción líquida, necesitando un tratamiento más largo, o un segundo
ciclo para solubilizarse completamente. Además, debido a la descompresión llevada a
cabo en el primer ciclo, se produjo una rotura física de la estructura de las astillas y las
paredes de las fibras, lo que probablemente favoreció la extracción de hemicelulosas en
el segundo ciclo. El porcentaje total de xilosa y xilooligosacáridos recuperados en las
dos fracciones líquidas resultó más pequeño que el estimado a partir de las
hemicelulosas extraídas del sólido (25,3% frente 46,6%). Como se ha comentado en el
apartado 4.1.1, la razón podría ser una recolección ineficiente de las hemicelulosas
extraídas, ya que parte podría haberse disuelto en el líquido que impregna las astillas
después de la explosión y ser desechada junto con el agua del lavado de las astillas. Otra
84
razón podría ser la degradación de los xilooligosacáridos disueltos a furfural, observada

para factores de severidad superiores a 3,5 (Li et al., 2005; Ramos et al., 1992). Sin
embargo, en las fracciones líquidas obtenidas en este estudio no se detectó presencia de
furfural ni de hidroximetil furfural (HMF), lo que indicaría un bajo porcentaje de
reacciones de degradación. No obstante, como se ha indicado previamente, es posible
que estos productos volátiles no se recuperen cuantitativamente en la fracción líquida y
se pierdan parcialmente a la atmósfera durante la descompresión de la explosión por
vapor (Emmel et al., 2003).
Tabla 4.3. Concentración de azúcares y ácido acético en las fracciones líquidas recogidas en el
tratamiento de explosión por vapor SE8, y porcentaje de azúcares recuperado en dichas
fracciones respecto al azúcar en la materia prima origina (EG). [A] hace referencia a los
monómeros y [AO] a los oligosacáridos.
Glucosa Xilosa Arabinosa Ácido acético % Recuperado

[A] [AO] [A] [AO] [A] [AO] [A] [AO] Glucosa Xilosa
SE8-1 0,32 1,45 0,07 1,14 0,04 0,28 0,06 0,01 4,1 8,2
SE8-2 0,19 0,08 0,03 2,48 0,05 0,07 0,12 0,02 0,6 17,1
Total 4,7 25,3
La conversión de los oligosacáridos de las fracciones líquidas a monómeros se

evaluó mediante hidrólisis ácida e hidrólisis enzimática. La figura 4.17 muestra los
rendimientos de conversión a glucosa y a xilosa durante la hidrólisis de las dos
fracciones líquidas mediante los dos métodos de hidrólisis. Se determinó también el
rendimiento total (a partir de la suma de los monómeros en las dos fracciones líquidas)
de la hidrólisis enzimática y de la hidrólisis ácida.
120
Glucosa
Rto. de la hidrólisis (%)
100 Xilosa
80
60
40
20
0
SE8.1-EH SE8.2-EH Total-EH SE8.1-AH SE8.2-AH Total-AH
Figura 4.17. Rendimiento de la hidrólisis enzimática (EH) y la hidrólisis ácida (AH) de las
fracciones líquidas obtenidas en el tratamiento de explosión por vapor SE8.
85
El rendimiento de conversión a xilosa mediante ambas hidrólisis fue menor en la

fracción líquida obtenida durante el segundo ciclo (SE8.2). Por el contrario, la
conversión a glucosa fue menor en la fracción SE8.1. Una posible explicación podría
ser la diferencia en la concentración de sustrato a hidrolizar (oligosacáridos). Así, para
una concentración inicial de oligosacáridos baja, se obtuvo un rendimiento alto en la
hidrólisis de dichos oligosacáridos. Sin embargo, la cantidad total convertida a glucosa
en la fracción SE8.1, y a xilosa en la fracción SE8.2 fue mayor que en SE8.2 y SE8.1
respectivamente. Por tanto, los rendimientos de hidrólisis más bajos podrían ser una
consecuencia de una alta concentración inicial de oligosacáridos (cuyo valor es el
denominador en la ecuación para determinar el rendimiento de hidrólisis).
Comparando los rendimientos totales de la hidrólisis enzimática con los de la

hidrólisis ácida, se observaron mayores rendimientos para la primera (65,3% frente
16,5% para glucosa y 82,7% frente 61,4% para xilosa). Sin embargo, la hidrólisis ácida
no fue optimizada, y podrían obtenerse rendimientos más altos aumentando la
temperatura, el tiempo de reacción y/o la concentración de ácido. No obstante, el
aumento de estas condiciones de operación podría también favorecer la degradación de
los monómeros, aumentando la cantidad de inhibidores como furfural e HMF (Garrote
et al., 2001; Um y van Walsum, 2009). Por otro lado, el rendimiento de la hidrólisis
enzimática también podría aumentarse modificando la relación enzima-sustrato y la
actividad enzimática. Por lo tanto, la hidrólisis enzimática tiene la ventaja de necesitar
condiciones operacionales menos severas (temperatura y pH), generando menos
productos inhibidores, lo que contribuiría a una mayor producción de bioetanol (Um y
van Walsum, 2010).
Sin embargo, durante el pre-tratamiento de explosión por vapor, la degradación

de azúcares y lignina también puede generar productos inhibidores (Ruiz et al., 2008).
Como estos inhibidores son principalmente productos solubles en agua, la fracción
líquida obtenida en el pre-tratamiento probablemente contendrá una alta concentración
de productos tóxicos, incluyendo fenoles (Jurado et al., 2009). Por tanto la
detoxificación de esta fracción, antes o después de la hidrólisis, podría aumentar el
rendimiento durante la fermentación. Con este objetivo, diferentes autores han utilizado
distintos métodos de detoxificación, siendo uno de los más prometedores el tratamiento
con LMS (Martin et al., 2002; Palonen y Viikari, 2004). El uso de pre-tratamientos de
explosión por vapor menos severos, como los utilizados en esta tesis doctoral, podría ser
86
también una alternativa para reducir la generación de productos inhibidores. Finalmente,

para la utilización de estas fracciones líquidas en la producción de bioetanol, es
necesario el desarrollo de levaduras capaces de fermentar pentosas con alto rendimiento
y de tolerar tanto altas concentraciones de etanol como pequeñas cantidades de
productos inhibidores (Hahn-Hägerdal et al., 2007).
4.2.2 - Hidrólisis enzimática de la fracción sólida
Como se verá en los apartados 4.3 y 4.4, la fracción solida obtenida en el pre-
tratamiento de explosión por vapor, presenta buenas características para ser utilizada en
la producción de papel. Sin embargo, muchos autores han utilizado el proceso de
explosión por vapor para mejorar la hidrólisis enzimática de la fracción sólida en el
proceso de obtención de bioetanol (Glasser y Wright, 1998; Ohgren et al., 2006; Oliva
et al., 2003; Ramos et al., 1992). Por ello, en este apartado se ha estudiado la hidrólisis
enzimática de las fracciones sólidas obtenidas durante los distintos tratamientos de
explosión por vapor estudiados en el apartado 4.1, planteando la producción de etanol a
partir de la fracción celulósica como alternativa al pasteado.
En la figura 4.18 se muestran los rendimientos de la hidrólisis enzimática de las

distintas muestras, calculados a partir de la concentración de monómeros en el líquido
hidrolizado y del contenido en azúcares de la fracción sólida antes de la hidrólisis.
40
Glucosa
Rto. hidrólisis enzimática (%)
35
Azúcares totales
30
25
20
15
10
0
EG SE 0 SE 1 SE 2 SE 3 SE 4 SE 5 SE 6 SE 7 SE 8
Figura 4.18. Rendimiento de la hidrólisis enzimática de la materia prima original (EG) y de las
fracciones sólidas obtenidas en los distintos tratamientos de explosión por vapor.
Las muestras no sometidas a explosión por vapor (EG y SE0) mostraron

rendimientos similares de hidrólisis de glucosa y de azúcares totales. Sin embargo, en
87
las muestras sometidas a explosión por vapor, se observó un aumento en el rendimiento

de hidrólisis de azúcares totales respecto al rendimiento de glucosa, debido a la
hidrólisis enzimática de los xilanos. Además, al aumentar la severidad del pre-
tratamiento de explosión por vapor, aumentaron los rendimientos de hidrólisis,
coincidiendo con lo observado por otros autores (Ballesteros et al., 2006; Donaldson et
al., 1988; Yang y Wyman, 2004). Estos autores atribuyeron el aumento de rendimiento
al aumento de la porosidad y a la eliminación de hemicelulosas, que aumenta la
accesibilidad a la celulosa.
Los rendimientos de hidrólisis más altos se observaron en las muestras

sometidas a los pre-tratamientos más largos después de una pre-extracción con agua
(SE4 y SE8, cuyos rendimientos en glucosa fueron 24,1% y 24,7%, y en azúcares
totales 35,8% y 35,6% respectivamente). Otros autores han utilizado pre-tratamientos de
explosión por vapor de severidad comparable, obteniendo rendimientos de hidrólisis
enzimática ligeramente superiores. Así por ejemplo, Varga et al. (2004) con bagazo de
maíz (explosión por vapor a 190ºC y 5 minutos, factor de severidad 3,35), Ruiz et al.
(2008) con tallos de girasol (180-190ºC, 5 min, factor de severidad 3,35-3,64) y Jurado
et al. (2009) con paja de trigo (190ºC, 10 min, factor de severidad 3,65) obtuvieron
rendimientos de glucosa del 31%, 32% y 35% respectivamente. Sin embargo estos
autores utilizaron materias primas no madereras, que tienen una estructura más porosa y
accesible (Alaejos et al., 2004) que puede mejorar el tratamiento enzimático. Para el
caso del eucalipto, se han publicado rendimientos de hidrólisis más altos, pero
utilizando pre-tratamientos de explosión por vapor con factores de severidad más
elevados o añadiendo un catalizador ácido (Emmel et al., 2003; Ramos et al., 1992). Sin
embargo si la severidad o acidez del pre-tratamiento se aumenta demasiado, se
producirá una degradación excesiva de polisacáridos que dará lugar a una menor
recuperación de glucosa y a mayor presencia de inhibidores tanto en la fracción líquida
como en la sólida (Ramos et al., 1992; Ruiz et al., 2008; Wu et al., 1999).
El pre-tratamiento más eficaz para mejorar la hidrólisis enzimática de la fracción

sólida se seleccionó considerando el rendimiento en glucosa y no en azúcares totales, ya
que se debe tener en cuenta la dificultad de encontrar microorganismos capaces de
fermentar a la vez celulosa y xilosa con altos rendimientos (Duff y Murray, 1996;
Tomás-Pejó, 2010). Así, el tratamiento SE8 fue el más eficaz, proporcionando un
rendimiento global de glucosa y de azúcares totales respecto a la materia original (EG)
88
de 23,7% y 30,2% respectivamente. Sin embargo, el rendimiento real fue mayor que
estos valores, ya que se deben considerar también los azúcares recogidos en la fracción
líquida, como se verá en el apartado 4.2.3.
 Detoxificación de la fracción sólida

Como se ha indicado anteriormente, durante el pre-tratamiento de explosión por
vapor se pueden generar inhibidores que disminuyen el rendimiento tanto de la
hidrólisis enzimática como de la fermentación. Aunque la mayoría de estos compuestos
son solubles en agua, muchos de ellos pueden quedar embebidos en la fracción sólida.
Por ello, los tratamientos de detoxificación se aplican también a la fracción celulósica,
siendo uno de los más prometedores el tratamiento con LMS (Jurado et al., 2009). Por
otro lado, las xilanasas han demostrado impulsar el efecto de la lacasa, cuando se
aplican en un tratamiento en serie, en aplicaciones como el blanqueo de pastas Kraft
(Valls y Roncero, 2009). Por ello, en este apartado se ha estudiado el efecto de un
tratamiento LMS (L), un tratamiento con xilanasa (X) y la combinación de ambos (XL)
en la detoxificación de la fracción sólida antes de la hidrólisis enzimática. Dicho efecto
se evaluó en función del aumento del rendimiento de hidrólisis enzimática de la fracción
sólida SE8.
Como se observa en la figura 4.19, el rendimiento de hidrólisis de glucosa

aumentó al aplicar un tratamiento LMS (27,1% frente a 24,7% para SE8), aunque el
rendimiento de azúcares totales fue ligeramente inferior. Otros autores han observado
también un aumento del rendimiento de hidrólisis después de un tratamiento con lacasa
o con hongos de pudrición blanca (Dias et al., 2010; Wan y Li, 2010). Este aumento
puede ser resultado de la modificación de la lignina por parte de la lacasa, que
probablemente disminuye la hidrofobicidad de la lignina y cambia las características de
la polaridad de la superficie, disminuyendo las uniones irreversibles entre la lignina y
las celulasas durante la subsecuente hidrólisis enzimática (Palonen y Viikari, 2004). Sin
embargo, Jurado et al. (2009) no observaron efecto del tratamiento LMS en el
rendimiento de la hidrólisis, aunque sí encontraron un aumento en la producción de
etanol durante la fermentación consecutiva, debido a la eliminación de productos
inhibidores (compuestos fenólicos) durante el tratamiento LMS.
89
Glucosa
40 Azúcares totales
Rto. hidrólisis enzimática(%)

35
30
25
20
15
10
5
0
SE 8 SE8-L SE8-X SE8-XL
Figura 4.19. Rendimiento de la hidrólisis enzimática de la fracción sólidas SE8 tras un

tratamiento enzimático con lacasa (L), xilanasa (X) o en serie xilanasa + lacasa (XL).
El tratamiento con xilanasas también aumentó el rendimiento de hidrólisis de

glucosa (28,3%), aunque este tratamiento no mejoró el efecto del LMS, como se
esperaba. Sin embargo, la falta de mejora en la hidrólisis enzimática no significa que
dichos tratamientos no mejoren el proceso de fermentación, como mostraron los
resultados de Jurado et at. (2009). Por lo tanto, se debería llevar a cabo un proceso de
fermentación para estudiar con más detenimiento el efecto del tratamiento LMS y del
tratamiento xilanasa – LMS en la producción de bioetanol.
Por otro lado, el efecto beneficioso del tratamiento con xilanasa en el

rendimiento de hidrólisis de glucosa pudo deberse a un aumento de la accesibilidad del
material debido a la eliminación de xilanos, como se observó después de tratamientos
de explosión por vapor y otros métodos de extracción de hemicelulosas. No obstante, el
rendimiento global de glucosa del proceso, teniendo en cuenta el pre-tratamiento de
explosión por vapor y el tratamiento con xilanasas, fue mayor que el observado para la
muestra SE8 y la muestra SE8-L (27,8% frente 23,7% y 26,7% respectivamente).
4.2.3 - Rendimiento global del proceso de hidrólisis enzimática
Para optimizar el proceso global de obtención de azúcares fermentables a partir

de la hidrólisis enzimática de ambas fracciones, se deben tener en cuenta diferentes
factores. El primero es la recuperación de celulosa en la fracción sólida y de
hemicelulosa en la fracción líquida durante el pre-tratamiento de explosión por vapor.
La cantidad de inhibidores generados durante dicho pre-tratamiento y el rendimiento de
hidrólisis tanto de la fracción sólida como de la fracción líquida son también factores a
90
tener en cuenta (Ruiz et al., 2008). Por tanto, se ha determinado el rendimiento global
del proceso teniendo en cuenta todas estas consideraciones.
Multiplicando el rendimiento de recuperación de xilooligosacáridos en la

fracción líquida (25,3% del xilano de la materia prima original EG) por el rendimiento
de la hidrólisis enzimática de la fracción líquida (82,7%), se determinó el rendimiento
de la hidrólisis de la fracción líquida respecto al contenido en xilanos de EG (21,0%).
Teniendo en cuenta también la hidrólisis de la fracción sólida (34.5%), el rendimiento
global de xilosa fue un 55,5% de las hemicelulosas presentes en la materia prima
original (8,6% del peso total de EG). Sin embargo, este rendimiento podría
incrementarse optimizando la recolección de hemicelulosas en la fracción líquida, ya
que aproximadamente un 20% de las hemicelulosas de la materia prima original se
perdió durante el proceso. Por otra parte, el rendimiento global de glucosa, incluyendo
la hidrólisis enzimática de ambas fracciones, fue un 26,8% de la glucosa presente en EG
(12,3% del peso total de la materia prima). Por tanto, a partir de 100 g de E. globulus se
obtuvieron 21g de azúcares, pudiéndose incrementar este rendimiento introduciendo
algunas modificaciones en el proceso, como la detoxificación con LMS de ambas
fracciones y la optimización de la recuperación de hemicelulosas en la fracción líquida,
como ya se ha mencionado. No obstante, rendimientos globales similares (22%) fueron
encontrados por otros autores (Ruiz et al., 2008) usando tallos de girasol y un pre-
tratamiento de explosión por vapor más severo, que podría producir más inhibidores
además de aumentar los costes operacionales del proceso.
91
4.3 - Efecto del pre-tratamiento de explosión por vapor en el pasteado

Kraft y en el bioblanqueo
En este apartado se recoge el estudio del efecto del pre-tratamiento de explosión

por vapor en la línea de producción de pastas de celulosa, ya que la introducción de una
pre-extracción de hemicelulosas en el proceso puede influir de manera importante tanto
en el proceso de pasteado (Publicación IV) como en el de blanqueo (Publicación V). Se
ha estudiado un sistema de blanqueo biológico, incluyendo una primera etapa con
sistema LMS, que contribuirá a disminuir el consumo de reactivos de blanqueo y a
mejorar las propiedades de la pasta obtenida.
En la figura 4.20 se indica en qué partes del proceso de biorrefinería forestal se

centra este apartado.
Agua de
lavado
Enzimas Bioblanqueo V
IV

(NaOH, Na2S)
Enzimas
Xilosas
Fermentación
Bioetanol
proceso en las que se centran las publicaciones IV y V.
Como se ha mencionado en el apartado 4.2, el pre-tratamiento seleccionado

como el más adecuado para un pasteado consecutivo fue el SE8, tanto por el aumento de
accesibilidad de la fracción sólida como por la cantidad de hemicelulosas extraídas en la
fracción líquida.
En este apartado se ha llevado a cabo el pasteado Kraft de astillas sin pre-tratar y

de astillas pre-tratadas SE8, comparando los resultados obtenidos en cuanto a
92
rendimiento del proceso, consumo de reactivos y calidad de las pastas obtenidas.

Posteriormente, la pasta obtenida a partir de astillas sin pre-tratar se sometió a una etapa
de deslignificación con oxígeno. El objetivo fue obtener una pasta con un contenido en
lignina más próximo al de la pasta pre-tratada, y poder comparar tanto la refinabilidad y
las propiedades mecánicas de las hojas formadas, como la blanqueabilidad de las pastas.
Además, se utilizó una pasta Kraft industrial, donada por La Montañanesa S.A., para
comparar ambos parámetros.
4.3.1 - Efecto del pre-tratamiento en el pasteado Kraft
Para estudiar el efecto del pre-tratamiento de explosión por vapor en el proceso

Kraft, se pastearon astillas pre-tratadas (SE) y astillas sin pre-tratatar (Control). Las
condiciones del pasteado fueron las mismas para ambos tipos de astillas (publicación
IV), variando el tiempo de cocción entre 24 y 56 minutos (correspondientes a un factor
H de 180 a 400).
El efecto principal del pre-tratamiento fue una gran reducción del número kappa
de las pastas obtenidas en todas las condiciones ensayadas (figura 4.21). La mayor
reducción, compando pastas con y sin pre-tratamiento, se observó bajo las condiciones
de pasteado más suaves (factor H de 180), obteniendo una pasta con un número kappa
un 70% menor que la pasta control obtenida en las mismas condiciones de pasteado
(número kappa de 16 frente a 49). Otros autores han encontrado también una reducción
en el número kappa de las pastas obtenidas con distintos pre-tratamientos de extracción
de hemicelulosas, aunque la mayoría de ellos observaron reducciones menores que las
conseguidas en este trabajo. Así, Helmerius et al. (2010) y Schild et al. (2010)
obtuvieron reducción del 40% y del 57% utilizando autohidrólisis como pre-tratamiento
de abedul y eucalipto respectivamente. La mayor reducción del número kappa
conseguida en esta tesis se debe probablemente a que la explosión por vapor, además de
extraer hemicelulosas, proporciona un residuo sólido con una estructura más abierta que
la autohidrólisis, debido al efecto de la rápida descompresión, como se estudió en el
apartado 4.1. Sin embargo, San Martin et al. (1995) obtuvieron una reducción del 49%
en el pasteado Kraft de Pinus radiata pre-tratado mediante explosión por vapor, aunque
en este caso el hecho de que utilizase una madera de conífera en lugar de una madera de
frondosa como el eucalipto, con mayor contenido en xilanos y grupos acetilo, pudo ser
el factor clave.
93
a) b) c)
60 40 1400
35
µmol HexA / g pasta

50 1200
Viscosidad (ml/g)
30
1000
Número Kappa
40 25
800
30 20
15 600
20
10 400
10 5 200
0 0 0
150 250 350 450 150 250 350 450 150 250 350 450
Factor H
Control Factor H Control Control Factor H
SE SE SE
Figura 4.21. Número kappa (a), contenido en ácidos hexenurónicos (b) y viscosidad (c) de una
pasta Kraft obtenida a partir de una muestra control (sin pre-tratamiento) y de una muestra pre-
tratada mediante explosión de vapor (SE).
Otro efecto importante del pre-tratamiento, fue la disminución del contenido en

ácidos hexenurónicos de las pastas obtenidas (figura 4.21b). Teniendo en cuenta la
solubilización de hemicelulosas durante el tratamiento de explosión por vapor y que los
ácidos hexenurónicos se forman durante el pasteado Kraft a partir de los ácidos
glucurónicos presentes en los xilanos, dicho pre-tratamiento prevendrá de la formación
de dichos ácidos hexenurónicos. Reducciones similares fueron encontradas por otros
autores mediante autohidrólisis y algo menores, pero también significativas, mediante
pre-tratamientos de extracción alcalina (Mendes et al., 2009; Schild et al., 2010). La
reducción del contenido en ácidos hexenurónicos es importante, ya que estos
compuestos consumen reactivos durante las secuencias de blanqueo (Ragnar, 2001;
Vuorinen et al., 1999) y aceleran el amarilleamiento del papel.
Respecto a la viscosidad de las pastas obtenidas (figura 4.21c), se obtuvieron

valores similares a los de pastas comerciales para la mayoría de las muestras. Sin
embargo, la viscosidad de las pastas con pre-tratamiento cayó bruscamente a partir de
un factor H mayor de 360, debido a la degradación de la celulosa provocada por un
pasteado demasiado largo (causando también una disminución del rendimiento de
pasteado, figura 4.23). Para un factor H de 270, se obtuvo el mismo valor de viscosidad
en la pasta pre-tratada y en la control, aunque el número kappa fue mucho menor en la
primera (11,2 frente 30,4). Por tanto, la adición de un pre-tratamiento de explosión por
vapor permitió una deslignificación elevada, sin degradar las cadenas de celulosa. De
hecho, algunos autores han reportado un pequeño aumento de la viscosidad en pastas
pre-tratadas mediante autohidrólisis, debido a la eliminación de polisacáridos de bajo
94
peso molecular (Mendes et al., 2009). En la figura 4.22b se muestran las fibras de la
pasta pre-tratada, no observándose rotura ni degradación de las mismas.
a) b)
Figura 4.22. Imágenes tomadas con microscopio óptico de la pasta Kraft obtenida a partir de
una muestra control (sin pre-tratamiento) (a) y de una muestra pre-tratada mediante explosión
de vapor (SE) (b) tras un pasteado Kraft con factor H igual a 190.
La figura 4.23 muestra el rendimiento global y el rendimiento útil obtenidos para

las dos muestras, sin tener en cuenta la pérdida de rendimiento durante el pre-
tratamiento, es decir, considerando sólo el proceso Kraft. El rendimiento global
disminuyó con el tiempo de cocción (y por tanto con el factor H) en las dos muestras
estudiadas, porque al prolongar el pasteado más cantidad de lignina, y también de
polisacáridos, se disolvió en la lejía de cocción. Los rendimientos global y útil de la
muestra control fueron mayores que los observados para la muestra pre-tratada excepto
para factores H menores de 200, valor a partir del cual el rendimiento útil de la muestra
pre-tratada fue mayor que el de la muestra control. Estos resultados se deben a que
tiempos de cocción tan cortos no permitieron una cocción completa de las astillas
control, presentando gran cantidad de incocidos o rechazos y paquetes de fibras (figura
4.22a), y dando lugar, por tanto, a rendimientos globales altos aunque con rendimientos
útiles bajos. Por el contrario, para tiempos de cocción largos, las astillas control
alcanzaron un grado de pasteado adecuado, mientras que las astillas pre-tratadas, que
permiten una difusión más rápida de los reactivos, fueron pasteadas en exceso,
disolviéndose mayor cantidad de polisacáridos en la lejía de cocción y disminuyendo de
esta forma el rendimiento del proceso, sin conseguir una caída tan importante en el
contenido en lignina (figura 4.21a). Esta reducción del rendimiento en el pasteado de
astillas sometidas a pre-extracción de hemicelulosas ha sido observada previamente por
otros autores (Mendes et al., 2009; Vila et al., 2011). Por otro lado, probablemente
debido a la mejor difusión de los reactivos en las astillas pre-extraídas, se observó una
95
reducción en la cantidad de incocidos en las pastas, igualándose el rendimiento global y

el rendimiento útil del pasteado. Un efecto similar fue observado por Schild et al.
(2010) en el pasteado alcalino de astillas pre-tratadas tanto mediante autohidrólisis
como mediante pre-extracción alcalina.
a) b)
70% 70%
Rendimiento global
60% 60%
Rendimiento útil
50% 50%
40% 40%
30% 30%
20% 20%
150 250 350 450 150 250 350 450
Control Factor H control Factor H
SE SE
Figura 4.23. Rendimiento global (a) y útil (b) del pasteado Kraft de una muestra control (sin
pre-tratamiento) y una muestra pre-tratada mediante explosión por vapor (SE).
Por otro lado, el pre-tratamiento de explosión por vapor incrementó el consumo

de Na2S y NaOH (figura 4.24) durante el pasteado, contrariamente a lo observado por
San Martin et al. (1995). Sin embargo, otros autores observaron también un aumento del
consumo de álcali, asociado a la degradación de polisacáridos durante el pasteado
(reducción del rendimiento) (Mendes et al., 2009). Además, debe tenerse en cuenta que
el mayor consumo de reactivos en las muestras pre-tratadas proporcionó pastas con
mucho menor número kappa (figura 4.21a), sugiriendo una mayor eficacia en el
aprovechamiento de los reactivos en la deslignificación.
a) b)
100% 100%
80% 80%
Consumo NaOH
Consumo Na2S
60% 60%
40% 40%
20% 20%
0% 0%
150 250 350 450 150 250 350 450
Control Factor H Control Factor H
SE SE
Figura 4.24. Consumo de reactivos durante el pasteado Kraft de una muestra control (sin pre-
tratamiento) y una muestra pre-tratada mediante explosión por vapor (SE).
96
A partir de los resultados anteriores, se puede concluir que bajo las mismas
condiciones de pasteado, las astillas pre-tratadas con explosión por vapor se pastean de
forma más rápida y eficaz que las astillas sin tratar, o alternativamente, pueden
pastearse a una temperatura menor o con menor carga de álcali manteniendo las misma
producción de pasta (Ahvazi et al., 2007; Al-Dajani et al., 2009; San Martin et al.,
1995). Bajo condiciones similares de pasteado, el tiempo de cocción puede reducirse de
60 a 25 minutos, obteniendo una pasta de calidad similar (número kappa ~16 y
viscosidad ~ 1000 ml/g) con un buen rendimiento (~50%). Incluso teniendo en cuenta la
pérdida de rendimiento debida al pre-tratamiento, que reduciría el rendimiento total del
proceso a ~40%, la producción de pasta podría mantenerse debido a la reducción del
tiempo de pasteado. Además, gran parte de las hemicelulosas se extraerían sin apenas
degradación antes del pasteado, pudiéndose utilizar para la producción de etanol u otros
compuestos de valor añadido. Por otro lado, se obtendrían pastas con un contenido muy
bajo en ácidos hexenurónicos, que podrían reducir el consumo de reactivos durante el
proceso de blanqueo. Sin embargo, la reducción del contenido en hemicelulosas de las
pastas, puede ser perjudicial en la refinabilidad de las pastas y en las propiedades
mecánicas de las mismas.
 Refinabilidad y propiedades de las hojas obtenidas

Para evaluar el efecto del pre-tratamiento de explosión por vapor en la respuesta
de las pastas ante el refino y en las propiedades finales de la pasta obtenida, se
sometieron las pastas a refino en PFI y se formaron hojas con las pastas resultantes. Se
compararon tres tipos de pasta Kraft: pasta pre-tratada (SE), pasta control obtenida en
las mismas condiciones de pasteado que la pasta SE y pasta industrial (Ind.). La pasta
control, fue sometida a una deslignificación con oxígeno tras el pasteado, para obtener
una pasta con menor contenido en lignina, más comparable a la pasta SE en términos de
refinabilidad y propiedades del papel. Así el número kappa y la viscosidad de las pastas
comparadas fueron respectivamente 15,5 y 1166 ml/g para la pasta SE, 26,4 y 915 ml/g
para la pasta Control+O2 y 14,0 y 1136 ml/g para la pasta industrial.
La figura 4.25 muestra la evolución del grado de refino (medido como

ºSchopper-Riegler, ºSR) frente a la intensidad del refino (número de revoluciones en
PFI) para las tres pastas estudiadas. Se observó un aumento menor del grado de refino al
aumentar el número de revoluciones del PFI en el caso de las pastas pre-tratadas. Es
97
decir, las pastas obtenidas a partir de astillas sometidas a explosión por vapor
consumieron más energía que las pastas sin pre-tratar (control e industrial) para alcanzar
un determinado ºSR, probablemente debido a la eliminación de hemicelulosas durante el
pre-tratamiento. Resultados similares fueron obtenidos por otros autores (Helmerius et
al., 2010; Schild et al., 2010).
60
50
40
ºSR
30
20
10
0
0 1000 2000 3000
Nº Rev. PFI
SE Control+O2 Ind.
Figura 4.25. Grado de refino (ºSchopper-Riegler) frente a la energía de refino (revoluciones

PFI) para una pasta Kraft industrial, una pasta Kraft obtenida a partir de una muestra control
(sin pre-tratamiento) y una pasta Kraft con pre-tratamiento de explosión de vapor (SE)
Las propiedades mecánicas y ópticas de las tres pastas refinadas y sin refinar se
muestran en la figura 4.26. Las tres pastas sin refinar presentaron un ºSR similar (17, 15
y 16 para SE, Control, Ind.) y propiedades mecánicas semejantes, excepto el índice de
tracción. Este índice está relacionado con la capacidad de unión entre las fibras. Por
ello, el bajo valor obtenido para la pasta pre-tratada puede deberse al bajo contenido en
hemicelulosas de dicha pasta, ya que este polímero es más amorfo y tiene mayor área
superficial por gramo que la celulosa, favoreciendo la unión entre fibras (Karlsson,
2006). El índice de desgarro de la pasta pre-tratada y la pasta industrial sin refinar fue
similar, lo que indica un grado similar de degradación de las fibras, de acuerdo con lo
publicado por San Martin et al. (1995).
98
a) b)
Densidad aparente (g/cm3)
0,8 100
Índice de tracción (Nm/g)

0,7 80
0,6 60
0,5 40
0,4 20
0,3 0
10 30 50 70 10 30 50 70
ºSR ºSR
SE Control Ind. SE Control Ind.
c) d)
12 6
Índice de estallido(KPam 2/g)

Índice de desgarro(mNm2/g)
10 5
8 4
6 3
4 2
2 1
0 0
10 30 50 70 10 30 50 70
ºSR ºSR
e) f)
45 50
Índice de amarilleamiento
45
40
Blancura (% ISO)
40
35
35
30
30
25 25
20 20
10 30 50 70 10 30 50 70
ºSR ºSR
Figura 4.26. Propiedades mecánicas y ópticas de la pasta Kraft industrial (Ind.), la pasta control
tras deslignificación con oxígeno (Control) y la pasta con pre-tratamiento de explosión por
vapor (SE): a) densidad aparente, b) índice de tracción, c) índice de desgarro, d) índice de
estallido, e) blancura y f) índice de amarilleamiento.
A medida que aumentó el grado de refino, la densidad aparente de las tres pastas
aumentó de manera análoga (figura 4.26a), indicando una cantidad de finos y un grado
de fibrilación similar (Helmerius et al., 2010). Las propiedades mecánicas de las pastas
también aumentaron con el refino, como se esperaba. Sin embargo la evolución fue
diferente para las distintas pastas. Así, las pastas pre-tratadas (SE) mostraron menores
índices de tracción y de estallido que las pastas control e industrial, debido al menor
99
contenido en hemicelulosas. Similares resultados fueron obtenidos por Helmerius et al.

(2010), quienes observaron menores índices a medida que aumentaba la duración del
pre-tratamiento de autohidrólisis. Respecto al índice de desgarro, pese a que las pastas
no refinadas pre-tratada e industrial mostraron valores similares, tras el refino la pasta
pre-tratada presentó valores inferiores comparada con la pasta industrial. Sin embargo,
la diferencia fue menor que las observadas para los índices de tracción y estallido. Por el
contrario, Helmerius et al. (2010) encontraron valores más bajos de índice de desgarro
en pastas refinadas sin pre-tratar comparados con los obtenidos en pastas sometidas a
pre-tratamientos de autohidrólisis o de extracción alcalina.
En cuanto a las propiedades ópticas, la pasta pre-tratada presentó las mejores

características ya que mostró un índice de amarilleamiento mucho menor que el de las
pastas control e industrial y una blancura mayor que la pasta industrial. A medida que
aumenta el grado de refino, el amarilleamiento aumenta y la blancura disminuye, debido
probablemente a la homogenización de las pastas tras la separación de pequeños
paquetes de fibras microscópicos presentes en las pastas y/o a la formación de grupos
cromóforos. Resultados similares para la blancura fueron obtenidos por otros autores
(Helmerius et al., 2010).
Por tanto, aunque las pastas pre-tratadas mostraron propiedades mecánicas algo
menores que las pastas control e industrial, las propiedades ópticas fueron mayores, y
no se observó degradación significativa de las fibras. Además, la evolución de las
propiedades mecánicas y ópticas tras un tratamiento de envejecimiento acelerado fue
mejor para las pastas pre-tratadas (Publicación IV).
4.3.2 - Efecto del pre-tratamiento en el bioblanqueo
Las pastas sin refinar utilizadas para el estudio de la refinabilidad y de las

propiedades físico-mecánicas fueron sometidas a una secuencia de blanqueo consistente
en una etapa enzimática con LMS y oxígeno (LMO2), una extracción alcalina (E) y un
blanqueo final con peróxido de hidrógeno (P). La adición de la primera etapa enzimática
pretende disminuir el consumo de reactivos de blanqueo y a mejorar las propiedades de
las pastas. Para evaluar este efecto, se añadió una secuencia control sin adición de LMS
ni oxígeno en la etapa enzimática para cada tipo de pasta (No-LMO2). Además, para
evaluar la importancia de la adición de oxígeno en la etapa enzimática, se añadió un
100
control para la pasta SE en el que se añadió LMS pero no oxígeno (LM-NoO2). Más
detalles sobre las condiciones del blanqueo se pueden encontrar en la publicación V.
Las características de las pastas sin blanquear utilizadas se incluyen en las

figuras 4.27 – 4.31. La nomenclatura utilizada es la siguiente: SE corresponde a la pasta
obtenida con pre-tratamiento de las astillas de explosión por vapor; NoSE se refiere a la
pasta control obtenida mediante el mismo pasteado Kraft que SE pero sin pre-
tratamiento, y sometida posteriormente a una deslignificación con oxígeno; e Ind
corresponde a la pasta Kraft industrial proporcionada por La Montañanesa.
En la figura 4.27 se puede observar que el número kappa de la pasta SE sin

blanquear fue menor que el de la pasta NoSE, es decir, un pre-tratamiento de explosión
por vapor seguido de un pasteado corto permitió alcanzar mayor grado de
deslignificación que dicho pasteado corto seguido de una deslignificación con oxígeno,
consiguiendo además una mayor viscosidad (1166 ml/g frente a 915 ml/g). Por otro
lado, la pasta industrial sin blanquear, utilizada como referencia, mostró un número
kappa ligeramente inferior que la pasta SE, sugiriendo una deslignificación similar en
ambos procesos.
30
26,8 26,4 Sin blanquear L LE LEP
26,4 25,6 26,2
25 22,5 23,0
Número Kappa
19,1
20
15,5 15,5 15,5
14,0 14,0 14,6
15 12,9
13,8 13,7
12,2 12,4
12,1 11,1 11,0
10,7
8,9 9,0
10
7,4 7,0 7,4
0
Ind: No-LMO2 Ind: LMO2 NoSE: No-LMO2 NoSE: LMO2 SE: No-LMO2 SE: LMO2 SE: LM-NoO2
Figura 4.27. Evolución del número Kappa durante la secuencia de blanqueo para los distintos
ensayos.
Cada etapa de blanqueo produjo una disminución en el número kappa, siendo

más acusada cuando se añadió LMS en la primera etapa de la secuencia, coincidiendo
con lo observado por otros autores (Eugenio et al., 2010a; Fillat et al., 2010; Valls et al.,
2010). Así, para la pasta NoSE se obtuvo una reducción del número kappa al final de la
secuencia del 27,7% cuando se añadió el LMS, (NoSE:LMO2) frente a 14,5% para su
control sin adición de LMS (NoSE:No-LMO2). Paralelamente, para la pasta industrial se
101
consiguió una reducción del 47,0% (Ind:LMO2) frente a 36,6% para su control sin LMS
(Ind:No-LMO2). Otros autores han obtenido mayores reducciones del número kappa
durante el bioblanqueo de pastas Kraft, pero utilizando más etapas en la secuencia TCF,
con etapas enzimáticas o de peróxido de hidrógeno más largas y/o con mayor
concentración de reactivos (Moldes et al., 2010).
Otra forma de aumentar deslignificación, podría ser la adición de un pre-

tratamiento de explosión por vapor antes del pasteado Kraft, como se observa en la
figura 4.21. Tanto la secuencia con adición de enzimas como la secuencia control
proporcionó mayores reducciones en el número kappa de la pasta pre-tratada (54,5%
para SE:LMO2 y 41,7% para SE:No-LMO2) que en las pastas sin pre-tratamiento (NoSE
e Ind). Estos resultados sugieren que un pre-tratamiento de explosión por vapor antes
del pasteado Kraft puede mejorar cualquier secuencia de blanqueo, corroborando los
resultados obtenidos por otros autores. Así, Josefsson et al. (2002) observaron una
mayor reducción del contenido en lignina en pastas blanqueadas químicamente cuanto
más severo fue el pre-tratamiento de explosión por vapor. Vila et al. (2011) también
señalaron que al menos parte de la lignina se modificó durante el tratamiento de
autohidrólisis haciéndola más susceptible a la deslignificación con oxígeno o en
consecutivas etapas de blanqueo.
Cuando se llevó a cabo una secuencia de blanqueo similar a aquella que

proporcionó mejores resultados (SE:LMO2), pero sin la adición de oxígeno en la etapa
enzimática (SE:LM-NoO2), se consiguió una reducción del número kappa ligeramente
menor (52,3% vs 54,5%). Este resultado sugiere que la presión de oxígeno no es un
factor muy influyente en la deslignificación, y aunque generalmente se considera
necesaria para mejorar el tratamiento LMS, su eficacia depende del tipo de pasta, del
tipo de lacasa y de las condiciones del tratamiento. Resultados similares fueron
encontrados por otros autores (Eugenio et al., 2010b),
Durante la secuencia de blanqueo, la viscosidad de las pastas se redujo

aproximadamente 100 ml/g en todas las muestras, excepto NoSE:LMO2 en la que la
reducción fue de 200 ml/g. Así, al final de la secuencia de blanqueo se observó una
viscosidad de 1040 y 1050 ml/g para la pasta industrial y la pasta pre-tratada SE
respectivamente. Estos resultados coinciden con los señalados por Oudia et al. (2008),
quienes demostraron que mediante secuencias de bioblanqueo se puede alcanzar una
102
alta deslignificación sin reducir de manera importante la viscosidad de las pastas. Más
detalles sobre la viscosidad se muestran en la publicación V.
La figura 4.28 muestra la evolución de la blancura durante las distintas etapas

del blanqueo. La pasta SE y la pasta NoSE sin blanquear presentaron una blancura muy
similar, pese al mayor contenido en lignina de la segunda, probablemente debido a la
eliminación de grupos cromóforos durante la deslignificación con oxígeno. Sin
embargo, la pasta industrial sin blanquear presentó una blancura menor, posiblemente
como resultado de un pasteado Kraft más largo.
80
Sin blanquear L LE LEP
67 68
70 66
63
58 59
60
Blancura (% ISO)
53
50
43 43 41 43 42 42 42 42
40 39 38 39 39 39
40 34 35 34 33 36
34
33
30
20
10
0
Figura 4.28. Evolución de la blancura durante la secuencia de blanqueo para los distintos
ensayos.
El mayor aumento de blancura tuvo lugar durante la etapa de peróxido de

hidrógeno, como se esperaba. En la etapa enzimática, la blancura se redujo, debido a la
formación de grupos cromóforos durante la oxidación de la lignina por el sistema lacasa
– mediador (Fillat et al., 2010). Sin embargo, al final de la secuencia LEP, el efecto del
LMS se invirtió, obteniéndose blancuras más altas cuando el sistema LMS fue usado en
la primera etapa del blanqueo. Por tanto, el tratamiento LMS aumentó la eficacia de las
etapas consecutivas en la secuencia de blanqueo, como han observado otros autores
(Moldes et al., 2010; Vivekanand et al., 2008).
Si se comparan las blancuras finales obtenidas con pastas pre-tratadas (SE) y con
pastas sin pre-tratamiento (NoSE), resulta evidente que el pre-tratamiento de explosión
por vapor favorece el aumento de blancura durante el proceso de blanqueo, obteniendo
aumentos del 25,2% para SE:LMO2 frente a 16,3% para NoSE:LMO2. La pasta
industrial bioblanqueada (Ind:LMO2) mostró también una blancura final inferior a la
pasta SE, aunque superior a la pasta NoSE. Por tanto, al igual que se observó en el
103
estudio del número kappa, la adición de un pre-tratamiento de explosión por vapor

previo al pasteado Kraft mejoró el proceso de blanqueo. Mejoras en la blancura tras el
blanqueo fueron observadas también por otros autores cuando se llevó a cabo un pre-
tratamiento de autohidrólisis (Vila et al., 2011).
La secuencia sin adición de oxígeno en la etapa enzimática (SE:LM-NoO2),

proporcionó una pasta final con una blancura ligeramente superior a la secuencia con
adición de oxígeno (SE:LMO2). Teniendo en cuenta que la primera proporcionó pastas
con un número kappa ligeramente mayor, y que ni las diferencias observadas en el
número kappa ni en la blancura fueron muy grandes, se puede concluir que la adición de
oxígeno en la etapa enzimática no es un parámetro influyente en el blanqueo en las
condiciones ensayadas.
La figura 4.29 muestra el índice de amarilleamiento de las pastas después de

cada etapa del blanqueo. Este índice se utiliza para estudiar la degradación del color
blanco. Es decir, el amarilleamiento del papel debido al envejecimiento (por exposición
a la luz y/o a altas temperaturas y humedad) se puede medir a través de los cambios en
el índice de amarilleamiento.
50 Sin blanquear L LE LEP

46 46
Índice de amarilleamiento (% ISO)
43 43 44
45 41
41
39 39 39 40 40
40
35 34 34 34
35 31
30 30 30 29
30 28 28 28
24
25
20 21 20
20
15
10
5
0
Figura 4.29. Evolución del amarilleamiento durante la secuencia de blanqueo para los distintos
ensayos.
Comparando las pastas sin blanquear, se observó menor índice de

amarilleamiento en las pastas pre-tratadas (SE) que en las pastas sin pre-tratamiento
(NoSE e Ind). Durante la secuencia de blanqueo LEP, se encontró un aumento del
índice de amarilleamiento después del tratamiento enzimático (L), siendo más
pronunciado en la presencia de LMS, e incluso mayor en las pastas pre-tratadas. Este
efecto puede deberse a la generación de compuestos que aportan color a la pasta durante
104
la etapa enzimática. El aumento fue más pronunciado en la pasta SE debido a que el

efecto de las enzimas se acentúa en este tipo de pasta, como se ha visto anteriormente.
Tras la etapa de extracción alcalina (E), el índice de amarilleamiento disminuyó hasta
valores más próximos a los de la pasta sin blanquear, probablemente debido a la
solubilización de los compuestos coloreados generados en la etapa anterior. Sin
embargo, es en la etapa final con peróxido de hidrógeno, donde se observaron las
mayores reducciones en el índice de amarilleamiento. Teniendo en cuenta la secuencia
completa, se obtuvo una reducción entre 7 y 15 unidades en las pastas blanqueadas,
respecto a las pastas sin blanquear. El menor índice de amarilleamiento se observó en
las pastas blanqueadas pre-tratadas, sugiriendo que el pre-tratamiento de explosión por
vapor contribuye a la obtención de pastas con menor color, y por tanto más próximas al
blanco ideal.
Para estudiar en mayor detalle el color de las pastas obtenidas, se determinaron

las coordenadas colorimétricas CIE L*a*b* y CIE L*C*, ya que una definición
numérica del color es esencial como parámetro de calidad de las pastas. En la figura
4.30 se recogen las coordenadas colorimétricas correspondientes a las pastas
blanqueadas obtenidas con la secuencia de blanqueo más eficaz (LEP incluyendo LMS
en la primera etapa) junto con las correspondientes a las pastas sin blanquear.
a) b)
95 SE 25 SE
SE: LMO2 SE: LMO2
90 20 NoSE
NoSE
NoSE: LMO2 NoSE: LMO2
85 15
Ind Ind
L* b* Ind: LMO2
80 Ind: LMO2
10
75 5
70
0
10 13 16 19 22
-5 0 5 10 15 20 25
C* a*
Figura 4.30. Propiedades colorimétricas de las pastas sin blanquear (símbolos oscuros) y
bioblanqueadas (símbolos claros): a) coordenadas CIE L*C*, b) coordenadas CIE L*a*b*.
Tras la secuencia de bioblanqueo, todas las pastas mostraron un aumento de L*

y una reducción de C*, es decir, un aumento en la luminosidad y una disminución del
color. Aunque la reducción del color fue menor para la pasta SE:LMO2, esta pasta
mostró el valor más bajo de color C* y el más alto de luminosidad L*, sugiriendo que la
105
explosión por vapor ayuda a producir pastas con mejores propiedades colorimétricas. A
la misma conclusión se llega a partir de las coordenadas CIE L*a*b* mostradas en la
figura 4.30b. La secuencia de bioblanqueo redujo tanto la coordenada a* como la b* y
los valores más bajos se encontraron en la pasta SE:LMO2.
La figura 4.31 muestra la reflectancia frente a la longitud de onda para las

distintas pastas bioblanqueadas y sin blanquear. Como se esperaba, la secuencia de
blanqueo LEP aumentó la reflectancia de las pastas sin blanquear, llevándola a valores
más cercanos al blanco ideal (100% reflectancia para todas las longitudes de onda en el
visible) después del blanqueo. La pasta pre-tratada con explosión por vapor, mostró la
reflectancia más alta tras el blanqueo (SE:LMO2), pese a que esta pasta sin blanquear
mostró valores de reflectancia para longitudes de onda superiores a 440nm más bajos
que aquellos mostrados por la pasta NoSE. Además, para una longitud de onda de
457nm (a la cual se mide la blancura), las diferencias en reflectancia entre la pasta
SE:LMO2 y las demás fueron mayores, como mostraron los valores de blancura (figura
4.28).
100
457
90
80
SE
70
Reflectancia (%)
60 NoSE
50 Ind
40 SE: LMO2
30 NoSE: LMO2
20
Ind: LMO2
10
0
380 420 460 500 540 580 620 660 700
Longitud de onda (nm)
Figura 4.31. Curvas de reflectancia de las pastas sin blanquear y bioblanqueadas.
 Consumo de peróxido de hidrógeno

El consumo de peróxido de hidrógeno se evaluó en todos los experimentos (tabla
4.4) observando un menor consumo en las pastas pre-tratadas mediante explosión por
vapor. Estas pastas presentaron un contenido en ácidos hexenurónicos muy bajo, debido
a la eliminación de hemicelulosas durante el pre-tratamiento, como se observó en el
apartado 4.3.1. Teniendo en cuenta que los ácidos hexenurónicos consumen reactivos de
106
blanqueo (Ragnar, 2001; Vuorinen et al., 1999), es lógico esperar un menor consumo de
peróxido de hidrógeno durante el blanqueo de dichas pastas. Otros autores también
observaron una reducción en el consumo de reactivos de blanqueo cuando se llevó a
cabo un pre-tratamiento con autohidrólisis (Mendes et al., 2009).
Tabla 4.4. Consumo de peróxido de hidrógeno en los diferentes ensayos llevados a cabo.
Consumo de peróxido
Ensayo
de hidrógeno (%)
Ind: No-LMO2 79,5%
Ind: LMO2 59,1%
NoSE: No-LMO2 77,6%
NoSE: LMO2 66,8%
SE: No-LMO2 55,7%
SE: LMO2 54,0%
SE: LM-NoO2 51,2%
Paralelamente, se observaron menores consumos cuando el sistema LMS se

añadió en la primera etapa de blanqueo, debido a la oxidación y eliminación de lignina
durante el tratamiento LMS y la consecutiva extracción alcalina. Además, parte de la
lignina que permanece en la pasta fue parcialmente oxidada por el sistema lacasa –
mediador, y como consecuencia, la necesidad de un reactivo de blanqueo oxidante,
como el peróxido de hidrógeno, fue menor.
Finalmente, se observó una pequeña disminución en el consumo de peróxido de

hidrógeno cuando no se añadió oxígeno en la etapa enzimática. Teniendo en cuenta los
resultados encontrados para el número kappa y la blancura, este resultado corrobora que
la adición de oxígeno no es un factor esencial ya que no reduce el consumo de reactivos
ni mejora la calidad de la pasta obtenida.
 Envejecimiento acelerado
Para estudiar el efecto del pre-tratamiento de explosión por vapor y del
tratamiento enzimático en la estabilidad de las propiedades ópticas de las pastas
blanqueadas, se sometieron las pastas a un envejecimiento acelerado. El envejecimiento
acelerado se llevó a cabo a 80ºC y 65% de humedad relativa durante 6 días, de acuerdo
con la norma ISO 5630-3.
107
En la tabla 4.5 se muestran los valores de índice de amarilleamiento y blancura

de las pastas blanqueadas antes y después del envejecimiento. En todos los casos se
observó un aumento del índice de amarilleamiento y una reducción de la blancura
debido al efecto del calor y la humedad en las pastas. Sin embargo, la respuesta al
envejecimiento de las pastas puede deberse a múltiples factores, como el contenido en
lignina, en ácidos hexenurónicos y en hemicelulosa (Sevastyanova et al., 2005;
Vuorinen et al., 1999). Así, el efecto mayor se observó en las pastas industriales,
mientras que las pastas SE y NoSE mostraron una estabilidad parecida frente al
envejecimiento, aunque algo superior en el caso de las pastas no pre-tratadas. No
obstante, las pastas pre-tratadas con explosión por vapor presentaron valores más bajos
de índice de amarilleamiento y más altos de blancura, incluso después del
envejecimiento. De forma análoga, Mendes et al. (2009) observaron una menor
reversión de la blancura en las pastas de eucalipto obtenidas con un pre-tratamiento de
autohidrólisis. Estos autores asociaron este comportamiento a la eliminación de
compuestos específicos de la madera y/o reacciones en la madera que previenen de la
formación de leuco-cromóforos, mejorando la estabilidad de la blancura en las pastas
blanqueadas.
Tabla 4.5. Influencia del envejecimiento acelerado en la blancura e índice de amarilleamiento

de las pastas blanqueadas industrial, control y con pre-tratamiento de explosión por vapor.
Blancura Índice de amarilleamiento

a b
Original Envej. Reducción Originala Envej.b Aumento
Ind: No-LMO2 52,9 38,9 15,3 29,7 40,1 10,4
Ind: LMO2 63,3 44,7 19,3 23,7 35,4 11,7
NoSE: No-LMO2 57,5 53,1 4,5 29,7 31,8 2,2
NoSE: LMO2 59,2 54,9 4,3 29,7 31,4 1,8
SE: No-LMO2 66,0 60,8 5,2 20,4 23,6 3,2
SE: LMO2 67,3 62,6 4,7 20,8 22,9 2,1
SE: LM-NoO2 68,5 61,8 6,7 20,2 23,9 3,7
a
Antes del envejecimiento acelerado
b
Después del envejecimiento acelerado
En la tabla 4.5 también se puede observar el efecto del tratamiento LMS en la

estabilidad de las propiedades ópticas frente al envejecimiento. A excepción de en las
pastas industriales, el tratamiento enzimático mejoró la estabilidad de las pastas,
108
reduciendo las variaciones en la blancura y el índice de amarilleamiento. Este efecto

fue más acusado en las pastas pre-tratadas con explosión por vapor, sugiriendo que la
combinación de ambos tratamientos puede ser más ventajosa en términos de estabilidad
óptica. Ambos tratamientos han demostrado su efecto en la reducción del contenido en
ácidos hexenurónicos de las pastas, lo que podría determinar la mayor estabilidad óptica
de dichas pastas, de acuerdo con lo observado por Cadena et al. (2010).
Finalmente, cuando no se añadió oxígeno en el tratamiento enzimático (SE:LM-

NoO2), tanto la blancura como el índice de amarilleamiento fueron menos estables que
en la pasta SE:LMO2. Por tanto, aunque la adición de oxígeno no mejoró las
propiedades ópticas de la pasta blanqueada obtenida, ni redujo el consumo de peróxido
de hidrógeno, sí aumentó la estabilidad de las propiedades ópticas de la pasta,
justificando así su adición en el tratamiento enzimático.
109
4.4 - Combinación de tratamientos de explosión por vapor y LMS

antes del pasteado como alternativa al biopulpeo con hongos
En este apartado se propone una alternativa al sistema de biopulpeo

convencional con hongos ligninolíticos. Como se ha indicado en el apartado 2.4.2, la
rápida descompresión en el pre-tratamiento de explosión por vapor provoca una
separación de fibras y rotura de las paredes de las fibras, que facilitará la penetración de
las enzimas en el biopulpeo. Por ello, y siguiendo dentro del esquema de biorrefinería
con extracción de hemicelulosa planteado en la presente tesis doctoral, se ha estudiado
si la aplicación de enzimas entre el pre-tratamiento de explosión por vapor y el pasteado
Kraft mejora la deslignificación y reduce el consumo de reactivos químicos, haciendo
más viable la aplicación industrial del biopulpeo enzimático (Publicación VI). De esta
forma se resolverían algunos de los problemas asociados al uso de hongos en el
biopulpeo, reduciendo el tiempo necesario para el pre-tratamiento de 2-3 semanas a
unas pocas horas.
La figura 4.32 muestra las partes del proceso de biorrefinería forestal en las que
se centra este apartado.
Agua de
VI Enzimas Biopulpeo
lavado
Enzimas Bioblanqueo


(NaOH, Na2S)
Enzimas
Xilosas
Fermentación
Bioetanol
proceso en las que se centran la publicación VI.
Por tanto, según se indica en la figura 4.32, las etapas del sistema de biopulpeo
propuesto serán: pre-tratamiento mediante explosión por vapor, seguida de un
110
tratamiento enzimático y de un pasteado Kraft. Para evaluar la eficacia de este proceso

de biopulpeo, los resultados obtenidos se compararon con aquellos obtenidos con la
muestra sin tratamiento enzimático, y también con la muestra sin tratamiento
combinado de explosión por vapor y enzimático. Además, se llevó a cabo un estudio
control de biopulpeo con dos hongos ligninolíticos, para comparar los resultados del
biopulpeo enzimático propuesto, con los obtenidos mediante un proceso de biopulpeo
convencional.
4.4.1 - Biopulpeo basado en explosión por vapor y tratamiento

enzimático (SE+LMS)
Antes del tratamiento enzimático, las astillas de E. globulus se sometieron a un

pre-tratamiento de explosión por vapor para obtener un material más accesible que
permita una actuación más eficaz de las enzimas. Las condiciones del pre-tratamiento se
seleccionaron en función de lo estudiado en el apartado 4.1, eligiendo aquellas que
proporcionaron una fracción sólida con una estructura más abierta y una mayor
extracción de hemicelulosas. Al igual que en el apartado 4.3, en el que se estudió el
pasteado Kraft, el pre-tratamiento seleccionado fue el SE8, que consiste en una pre-
extracción en agua a 25ºC seguida de dos ciclos de explosión por vapor de 10 y 3
minutos a 183ºC.
Después del pre-tratamiento de explosión por vapor, las astillas se sometieron a

tratamientos enzimáticos preliminares en los que se estudió la eficacia tanto de xilanasas
como del sistema lacasa – mediador para mejorar el pasteado consecutivo. A partir de
estos ensayos preliminares se seleccionó el tratamiento a 40ºC con sistema lacasa –
mediador como el más eficaz, y se planteó un diseño experimental para ajustar las
condiciones óptimas del tratamiento. Se estudiaron como variables el tiempo de
tratamiento (1, 3 o 5 horas) y la dosis de lacasa (3,0, 16,5 y 30,0 UA/g de biomasa
seca), evaluando su efecto en un pasteado Kraft posterior y en la calidad de las pastas
obtenidas. Se empleó como control un tratamiento consistente en pre-tratamiento de
explosión por vapor seguido de un pasteado Kraft, para poder diferenciar y cuantificar
las mejoras debidas al tratamiento enzimático y las debidas al pre-tratamiento de
explosión por vapor (estudiadas en el apartado 4.3.1).
111
En la figura 4.33 se muestra la influencia del tratamiento enzimático en el

rendimiento del pasteado, el consumo de reactivos y la calidad de las pastas (número
kappa y viscosidad).
a) b)
56% 54%
Rendimiento global Kraft
54%
Rendimiento útil Kraft

52%
52%
50%
50%
48%
48%
46%
46%
44% 44%
42% 42%
1h 3h 5h 1h 3h 5h
3 UA/g 16.5 UA/g 30 UA/g Control 3 UA/g 16.5 UA/g 30 UA/g Control
c) d)
100% 100%
80% 80%
Consumo NaOH
Consumo Na2S
60% 60%
40% 40%
20% 20%
0% 0%
1h 3h 5h 1h 3h 5h
e) f)
19 1400
18 1200
17
Viscosidad (ml/g)
1000
Número Kappa
16
15 800
14 600
13
400
12
11 200
10 0
1h 3h 5h 1h 3h 5h
Figura 4.33. Efecto en el pasteado del tratamiento con LMS tras un pre-tratamiento de
explosión por vapor: rendimientos global (a) y útil (b) del pasteado, consumo de Na2S (c) y
NaOH (d) y número kappa (e) y viscosidad (f) de las pastas obtenidas. El control consistió en un
tratamiento de explosión por vapor seguido de un pasteado Kraft, sin tratamiento enzimático.
112
Aunque no se observó una relación clara entre el tiempo de tratamiento

enzimático y el rendimiento del pasteado Kraft, los mayores rendimientos se obtuvieron
para los tratamientos más largos (5 horas). El rendimiento útil disminuyó al aumentar la
dosis de lacasa utilizada, excepto para 1 hora de tratamiento con 30 UA/g. Por tanto, se
obtuvo el mayor rendimiento útil para un tratamiento de 5 horas con una dosis de lacasa
de 3 UA/g, seguido del mismo tratamiento con una dosis de lacasa de 16,5 UA/g: 52,9%
y 52,4% respectivamente, frente a 50,1% para el tratamiento control. A partir de estos
resultados, se puede concluir que para aumentar el rendimiento del pasteado fueron
necesarias al menos 5 horas de tratamiento enzimático, y que incluso en este caso, dosis
altas de lacasa fueron perjudiciales.
El consumo de NaOH durante el pasteado de las astillas pre-tratadas

enzimáticamente fue menor que el consumo para el tratamiento control (en torno a 67%
en la mayoría de las muestras tratadas, frente a 74,2% para el control), observándose el
menor consumo de NaOH tras un tratamiento de 5 horas con 30UA/g (58%). Sin
embargo, el consumo de Na2S obtenido para las muestra tratadas con dosis altas y
medias de lacasa fue mayor que el encontrado para la muestra control, mientras que
para dosis de 3 UA/g se observó una reducción en el consumo. Por tanto, si se emplean
dosis bajas de lacasa se podrá reducir tanto el consumo de NaOH como el de Na2S, pero
éste último aumentará al aumentar la dosis de lacasa. Si la lacasa o el mediador se unen
a las fibras durante el tratamiento enzimático, podrían reaccionar con la lejía de cocción
durante el pasteado, explicando el aumento del consumo de reactivos al aumentar la
dosis enzimática. Por otro lado, la reducción del consumo de reactivos químicos durante
el pasteado se debe probablemente a que la lignina parcialmente oxidada durante el
tratamiento LMS necesitará menos reactivos para solubilizarse en la lejía cocción.
Comparada con el control, se obtuvo una mayor deslignificación de las muestras

pre-tratadas con LMS sin una degradación importante de las fibras, ya que las
diferencias en viscosidad no fueron significativas. El mayor grado de deslignificación se
observó cuando el tratamiento enzimático se llevó a cabo durante 3 horas con 3UA/g,
obteniéndose una pasta con un número kappa de 13,7 (aumento en deslignificación del
13,9% comparado con el control cuyo número kappa fue 16). Al prolongar el tiempo de
tratamiento, con la misma dosis enzimática, se obtuvo un número kappa mayor, pero
todavía significativamente menor que el control (14,8 frente 16,0). Aumentos
significativos en la deslignificación respecto al control fueron encontrados también al
113
utilizar una dosis enzimática de 16,5 UA/g, independientemente del tiempo de

tratamiento, obteniendo pastas con número kappa entre 14,2 y 14,4. Sin embargo,
cuando se utilizaron dosis altas de lacasa (30 UA/g) y tiempo de tratamiento de 3 y 5
horas, el número kappa de las pastas resultantes fue más alto que el de la pasta control.
Estos datos indican posible unión del LMS a las fibras (Dyer y Ragauskas, 2004), como
también parecía indicar el aumento en el consumo de reactivos. Por tanto, para
aumentar la deslignificación fueron necesarias al menos 3 horas de tratamiento cuando
se usaron dosis bajas de lacasa, mientras que 1 hora de tratamiento fue suficiente con
dosis medias de lacasa (16,5 UA/g). Sin embargo, tratamientos con altas dosis de lacasa
durante más de 1 hora causaron una disminución en el grado de deslignificación.
A partir de las pastas obtenidas se formaron hojas, y se determinaron sus

propiedades mecánicas y ópticas (figura 4.34). Las pastas no se refinaron antes de la
formación de las hojas y mostraron un grado de refino en torno a 15 ºSR. Todas las
hojas mostraron una densidad aparente semejante, en torno a 0,39 g/cm3, indicando una
cantidad de finos y un grado de fibrilación similar (Helmerius et al., 2010). Los índices
de tracción y de desgarro obtenidos para las distintas muestras fueron similares a los
presentados por la pasta control, aunque pequeñas variaciones se pudieron observar con
el tratamiento enzimático de 1 hora. Por el contrario, Petit-Conil et al. (2002)
observaron un aumento en las propiedades mecánicas al aplicar un tratamiento LMS
antes del pasteado termomecánico de madera de abeto. Esta diferencia de resultados se
deben probablemente al uso de una madera de conífera en lugar de una de frondosa
como el eucalipto, y de un proceso de pasteado diferente.
Respecto a las propiedades ópticas, los cambios en opacidad normalmente están

relacionados con cambios en la blancura del papel (papeles más oscuros muestran
opacidades más altas), sin embargo, la opacidad también depende de la capacidad para
dispersar la luz del papel (Maijala et al., 2008). Aunque las muestras tratadas
enzimáticamente presentaron propiedades ópticas muy próximas a las de la pasta
control, se pudo observar una disminución de la opacidad al aumentar la dosis de lacasa
y el tiempo de tratamiento, excepto para 5 horas de tratamiento. Por el contrario, la
blancura mostró un pequeño aumento con el tiempo de tratamiento en la mayoría de los
casos, pero no mostró relación con la dosis de lacasa. La blancura más alta (1 punto por
encima del control) se observó cuando se llevó a cabo un tratamiento de 5 horas con
dosis media de lacasa. Por tanto, a pesar de conseguir un aumento en la deslignificación
114
del 13,9% al aplicar un tratamiento enzimático de 3 horas y 3 UA/g, estas condiciones

no causaron un aumento en la blancura comparado con el tratamiento control. Estos
resultados corroboran los obtenidos por Dyer y Ragauskas (2004) quienes, no
encontraron diferencias en el color tras el pasteado Kraft, a pesar de observar un
oscurecimiento de las astillas tras el tratamiento LMS.
a) b)
17 0,45
Densidad Aparente (g/m3)

16
º Schopper - Riegler
15 0,40
14
0,35
13
12 0,30
11
10 0,25
1h 3h 5h 1h 3h 5h
c) d)
16 2,5
Índice de desgarro (mNm 2/g)
Índice de tracción (Nm/g)
14
2,0
12
10 1,5
8
6 1,0
4
0,5
2
0 0,0
1h 3h 5h 1h 3h 5h
e) f)
44 101
100
42
99
Blancura (% ISO)
40 98
Opacidad
97
38
96
36 95
94
34
93
32 92
1h 3h 5h 1h 3h 5h
Figura 4.34. Efecto del tratamiento con LMS tras un pre-tratamiento de explosión por vapor en
las propiedades mecánicas y ópticas del papel: a) grado de refino, b) densidad aparente, c)
índice de tracción, d) índice de desgarro, e) blancura y f) opacidad. El control consistió en un
tratamiento de explosión por vapor seguido de un pasteado Kraft, sin tratamiento enzimático.
115
A partir de estos resultados, se puede concluir que al aplicar un tratamiento LMS

a 40ºC con 3 UA/g y durante 3 horas, después de un pre-tratamiento de explosión por
vapor y antes del pasteado Kraft de E. globulus, se obtuvieron pastas con menor número
kappa (reducción de 2,3 unidades) que aquellas obtenidas mediante un pre-tratamiento
de explosión por vapor seguido de un pasteado Kraft. Este tratamiento no mostró
efectos negativos en las propiedades mecánicas y ópticas de las pastas obtenidas,
proporcionó rendimientos útiles similares a los obtenidos con las pastas control y redujo
el consumo de Na2S y NaOH un 11,5% y un 6,3% respectivamente. El aumento en la
deslignificación (13,9%) fue mayor que el 8,7% obtenido por Dyer y Ragauskas (2004)
cuando aplicaron un tratamiento lacasa-HBT a 45ºC durante 2 horas antes del pasteado
Kraft de Pinus taeda. El mayor aumento en la deslignificación observado en la presente
tesis, puede deberse a pequeñas diferencias en las condiciones del tratamiento
enzimático y/o a diferencias en la materia prima usada. Sin embargo, es más probable
que este aumento se deba a la adición de un pre-tratamiento de explosión por vapor
antes del tratamiento enzimático, ya que dicho tratamiento ha demostrado mejorar la
difusión de los reactivos en el pasteado, como se ha visto en el apartado 4.3.1 (Ahvazi et
al., 2007) y favorecer la hidrólisis enzimática de biomasa, apartado 4.2.2 (Jurado et al.,
2009; Ruiz et al., 2008; Wu et al., 1999). Además, debido a la reducción del número
kappa como consecuencia sólo del pre-tratamiento de explosión por vapor antes del
pasteado, estudiada en el apartado 4.3.1 (67,8%), el aumento total en la deslignificación,
incluyendo el tratamiento enzimático se incrementó hasta un 72,4% respecto al pasteado
Kraft convencional. En otras palabras, al combinar ambos pre-tratamientos, el pasteado
podría acortarse de 60 a 25 minutos obteniendo una pasta con un número kappa menor
que la pasta control, que contribuiría al menor consumo de reactivos de blanqueo y al
aumento de la productividad.
4.4.2 - Biopulpeo con hongos ligninolíticos
Para comparar los resultados obtenidos mediante biopulpeo basado en explosión

por vapor y tratamiento LMS, con aquellos obtenidos mediante un proceso de biopulpeo
más convencional, las astillas de E. globulus se sometieron a tratamientos con hongos
ligninolíticos de pudrición blanca: Pycnoporus sanguineus y Trametes sp. I-62. Antes
del tratamiento con hongos no se aplicó un tratamiento de explosión por vapor, porque
los hongos son capaces de penetrar y trasportar las enzimas al interior de las astillas
116
(Messner y Srebotnik, 1994). Sin embargo, la presencia o ausencia de determinados

extractos puede afectar al tratamiento fúngico. Por ello, las astillas se sometieron a
extracción con acetona (AC), extracción con agua caliente (W) o a la combinación de
ambos (AC+W) antes del tratamiento fúngico, y los resultados se compararon con los
obtenidos con astillas sin extraer (NoE).
En primer lugar se estudió el efecto de las extracciones, sin inoculación del

hongo, en el pasteado Kraft, comparando los resultados con los obtenidos con astillas
sin ninguna extracción (tabla 4.6). Cuando se llevó a cabo una extracción con acetona,
el rendimiento del pasteado aumentó, mientras el número Kappa y el consumo de
reactivos disminuyó. Sin embargo, la reducción en el número Kappa fue más
significativa cuando se llevó a cabo una extracción en agua caliente, obteniendo
incrementos en la deslignificación del 29,4% después del pasteado Kraft. Al llevar a
cabo una extracción en acetona antes de la extracción en agua (AC+W), la reducción
observada en el número kappa fue prácticamente la misma que sólo con la extracción en
agua. El aumento de deslignificación puede explicarse por la eliminación de extractos,
que mejorará la difusión de la lejía de cocción (Ferraz et al., 2008). Además, durante la
extracción con agua caliente se produce una pequeña hidrólisis de los polisacáridos, que
facilitará la deslignificación.
Tabla 4.6. Influencia de las diferentes extracciones en la calidad de las pastas y en el proceso
Kraft.
Número ∆Kappab ∆Viscosi.b Rto Krafta ∆Rto Consumo de reactivos
Kappa (%) (%) (%) Kraftb ∆%Na2Sb ∆%NaOHb
NoE 15,6 49,9

AC 15,0 -4,1 +12,1 55,9 +6,0 -3,7 -1,9
W 11,0 -29,4 +5,9 51,8 +1,9 +7,0 +0,3
AC+W 11,3 -27,6 +13,1 51,9 +2,1 -0,4 -0,5
a
Rendimiento útil del proceso Kraft sin incluir el rendimiento del pretratamiento.
b
Respecto al control sin pre-tratamiento de explosión por vapor (NoSE)
Las astillas, extraídas y no extraídas, se sometieron a un tratamiento con

Pycnoporus sanguineus o Trametes sp I-62. En la figura 4.35 se muestra la colonización
del hongo en las astillas a los 28 días de tratamiento, observando mayor colonización y
actividad lacasa en las muestras extraídas con acetona o sin extracción.
117
NoE – P AC – P W– P AC+W – P
NoE – T AC – T W– T AC+W – T
Figura 4.35. Colonización de los hongos (P: Pycnoporus sanguineus; T: Trametes sp. I-62) tras
28 días de tratamiento en astillas sin extraer (NoE), extraídas con acetona (AC), extraídas con
agua (W) y extraídas con acetona y agua (AC+W).
Tras el tratamiento fúngico, se llevó a cabo un pasteado Kraft. Los resultados

observados se compararon con los de las pastas control obtenidas aplicando la misma
extracción pero sin inoculación fúngica (tabla 4.7).
Tabla 4.7. Influencia del tratamiento fúngico en la calidad de las pastas y en el proceso Kraft
comparado con controles con la misma extracción pero sin inoculación fúngica.
Número ∆Kappab ∆Viscosi.b Rto Krafta ∆Rto Consumo de reactivos
Kappa (%) (%) (%) Kraftb ∆%Na2Sb ∆%NaOHb
NoE –P 15,8 +0,8 +2,1 49,8 -0,1 +2,6 +0,2

NoE – T 14,2 -9,3 +3,4 48,4 -1,5 +5,9 +0,5
AC – P 14,5 -3,7 -5,1 51,9 -4,0 +4,3 +1,7
AC – T 13,6 -9,5 -15,0 53,3 -2,6 +5,6 +2,4
W–P 11,9 +7,9 +1,6 50,0 -1,8 -3,4 +0,3
W–T 10,8 -2,0 -1,8 50,4 -1,4 +0,5 +0,9
AC + W - P 12,4 +9,0 -20,4 51,6 -0,3 +5,7 +1,2
AC + W - T 12,5 +10,2 -3,0 52,4 +0,5 +4,9 +1,4
a
Rendimiento útil del proceso Kraft sin incluir el rendimiento del pretratamiento.
b
Respecto al control con la misma extracción pero sin inoculación fúngica
118
Se encontraron pequeñas diferencias en el rendimiento útil del pasteado de las

muestras biotratadas y las muestras control; sin embargo, si se tienen en cuenta las
pérdidas de peso durante el tratamiento fúngico, el rendimiento total del biopulpeo fue
aproximadamente un 5% menor que el rendimiento para las pastas control, debido a la
degradación de los polisacáridos por parte de los hongos. Por otro lado, el consumo de
NaOH y especialmente el de Na2S fue mayor en las pastas biotratadas comparado con
sus controles. A pesar de estas desventajas, el tratamiento con Trametes sp. I-62 mejoró
el pasteado, ya que gracias a este pre-tratamiento se obtuvieron pastas con menor
número kappa en todos los casos, excepto en las muestras AC+W. En cambio, el
tratamiento con Pycnoporus sanguineus no mejoró la deslignificación en las
condiciones ensayadas, contrariamente a lo observado por Wolfaardt et al. (2004). Sin
embargo estos autores usaron una cepa distinta de Pycnoporus sanguineus, lo que puede
influir de manera importante en los resultados, como han observado otros autores con
distintas cepas de hongos de pudrición blanca (Akhtar et al., 1993; Blanchette et al.,
1992).
Al comparar las pastas biotratadas con las pastas control sometidas a la misma
extracción, las mayores reducciones en el número kappa debidas al efecto del hongo se
encontraron cuando las astillas no habían sido pre-extraídas y después de una extracción
con acetona. Estas muestran fueron las que mayor colonización del hongo y mayor
actividad lacasa mostraron, como se ha visto anteriormente. Sin embargo, considerando
el proceso global, el número kappa más bajo se obtuvo con las astillas pre-extraídas con
agua caliente y tratadas con Trametes sp. I-62.
4.4.3 - Comparación entre biopulpeo SE+LMS y biopulpeo fúngico
El biopulpeo más eficaz de entre los ensayados en esta tesis, consistió en un pre-
tratamiento de explosión por vapor seguido de un tratamiento LMS a 40ºC durante 3
horas, con una dosis de lacasa de 3 UA/g, como se concluyó en el apartado 4.4.1. Este
tratamiento con LMS, aplicado después de un pre-tratamiento de explosión por vapor,
proporcionó pastas con menor número kappa y menor consumo de reactivos que los
tratamientos con xilanasa llevados a cabo en los ensayos preliminares y que los
tratamientos con xilanasa llevados a cabo por Zhao et al. (2002) antes de un pasteado
alcalino de paja de trigo.
119
Comparado con los tratamiento fúngicos (apartado 4.4.2), el tratamiento de

explosión por vapor más LMS resultó más eficiente en términos de tiempo de
tratamiento, deslignificación, ahorro de reactivos químicos y rendimiento del pasteado.
Resultados similares fueron encontrados por Ramos et al. (2004) quienes compararon
un tratamiento enzimático usando un crudo de Phanerochaete chrysosporium con el
tratamiento directo con dicho hongo antes de un pasteado termo-mecánico y de un
pasteado quimi-termo-mecánico.
Aunque con el pre-tratamiento de explosión por vapor, el rendimiento total del

proceso (SE, LMS y pasteado) se reducirá hasta aproximadamente un 40%, la
producción de pasta en una hipotética fábrica podría mantenerse debido a la reducción
del tiempo de pasteado necesario. Además, la corriente de hemicelulosas podría
utilizarse para obtener productos de valor añadido, como se ha comentado
anteriormente, aliviando además la carga de la caldera de recuperación. Esta es una de
las principales ventajas frente al tratamiento con hongos, en el que la pérdida de
rendimiento se debe a la degradación de los polisacáridos, que imposibilita su posterior
utilización.
120
4.5 - Utilización de Hesperaloe funifera en el esquema de biorrefinería

forestal planteado
En este apartado se evalúa la utilización de Hesperaloe funifera en el esquema

de biorrefinería forestal planteado (Publicación VII). Su uso podría ser una buena
alternativa en áreas secas y/o con escasos recursos forestales, debido a sus propiedades
hídricas y a las buenas propiedades que presentan las pastas obtenidas a partir de esta
especie (McLaughlin, 2000; McLaughlin y Schuck, 1991; Wong y McLaughlin, 2000).
Además, este material se ha elegido para evaluar las posibles ventajas derivadas de su
estructura menos compacta, en comparación con el E. globulus, esperando una mayor
eficacia de las etapas enzimáticas (biopulpeo y bioblanqueo).
En la figura 4.36 se indican las partes del proceso de biorrefinería forestal en las
que se centra este apartado, en el cual el E. globulus ha sido sustituido por el H. funifera
como materia prima.
VII Enzimas Biopulpeo

Agua de
Enzimas Bioblanqueo
lavado
Explosión por Lavadores de Pasta

H. funifera Digestor Kraft Blanqueo
Líquido Lejía blanca Condensado Lejía negra

(hemicelulosas) (NaOH, Na2S) diluida
Enzimas
Xilosas
Fermentación
Bioetanol
Figura 4.36. Esquema del proceso de biorrefinería forestal, indicando las partes del proceso en
las que se centran la publicación VII que utiliza H. funifera como materia prima.
Como se observa en la figura 4.36, en esta apartado se ha llevado a cabo un pre-

tratamiento de explosión por vapor seguido de un pasteado Kraft y un blanqueo.
Además, se ha evaluado el efecto de añadir una etapa enzimática LMS entre el pre-
tratamiento y el pasteado, siguiendo el esquema de biopulpeo propuesto en el apartado
4.4. Por último, se evaluó también el efecto de la adición de una etapa LMS en el
121
blanqueo de las pastas Kraft pre-explosionadas y no pre-tratadas, para determinar si da

lugar a una mejora en las propiedades de la pasta y una reducción en el consumo de
reactivos de blanqueo, como se observó con E. globulus en el apartado 4.3.2.
4.5.1 - Caracterización de Hesperaloe funifera
H. funifera mostró un alto contenido en cenizas (5,2%), extractos en acetona

(3,1%) y extractos en agua caliente (15,9%), lo que indica que el rendimiento del
pasteado será bajo. Sin embargo, el bajo contenido en lignina (9,4% lignina Klason y
3,6% lignina soluble) comparado con otras materias primas madereras y no madereras,
hará que el pasteado sea más fácil, compensando la reducción en el rendimiento. En
cuanto al contenido en azúcares, mostró un contenido en glucosa similar al E. globulus
(44,7% frente 46,0%) y un contenido en xilanos y grupos acetilos algo menor (10,1%
frente 15,6%, y 2,2% frente 4,1% respectivamente), aunque obviamente mayor que el
de las maderas de coníferas.
En cuanto a las características de las fibras de H. funifera, el análisis biométrico

mostró unas fibras muy largas y delgadas (4,2 mm de longitud y 7,2 µm de anchura)
comparado no solo con especies madereras, como Picea abies (3,5 mm y 36 µm), Pinus
taeda (4,0 mm y 43 µm) o Eucalyptus saligna (1,0 mm y 19 µm) (McLaughlin y
Schuck, 1991), sino también con materiales no madereros, como el sisal (3,0 mm y 17
µm) o la paja de trigo (1,5 mm y 13 µm) (Fairbank y Detrick, 2000). Debido a la alta
relación L/D del H. funifera se espera que proporcione más uniones entre fibras
mejorando la resistencia del papel.
4.5.2 - Pre-tratamiento de explosión por vapor
Los tallos de H. funifera se sometieron a dos pre-tratamientos de explosión por

vapor, cuyas condiciones se muestran en la tabla 4.8. Las condiciones del tratamiento
SE2’ se seleccionaron en base al estudio llevado a cabo con E. globulus en el apartado
4.1, y corresponden al tratamiento SE8. Sin embargo, debido a que los materiales no
madereros presentan una estructura menos compacta y más porosa que las maderas
(Sánchez et al., 2011), es razonable esperar que necesiten un tratamiento de explosión
por vapor menos intenso. Por ello, el tratamiento SE1’ consistió en 1 ciclo de 3 minutos
a 183ºC, en lugar de los dos ciclos del tratamiento SE2’. En ambos tratamientos se llevó
122
a cabo una pre-extracción en agua fría similar a la llevada a cabo en los tratamientos con
E. globulus.
Como se observa en la tabla 4.8, al aumentar la severidad del pre-tratamiento

disminuyó el rendimiento del mismo, como se esperaba, ya que aumenta también la
cantidad de hemicelulosas extraídas (Al-Dajani et al., 2009; Li et al., 2010). El
rendimiento obtenido con H. funifera en las condiciones SE2’ fue menor que el
obtenido con E. globulus en las mismas condiciones (SE8) (62,5% frente 79,3%). La
extracción de hemicelulosas no explicó esta pérdida de rendimiento, ya que aunque el
porcentaje de hemicelulosas extraído en el H. funifera fue algo mayor (56,8% frente
46,6%) el contenido inicial fue menor, como se ha indicado en el apartado anterior. Sin
embargo, el H. funifera presentó un alto contenido en material extraíble en agua caliente
(15,9% frente a 1,8% en el E. globulus), lo que sí conlleva una reducción del
rendimiento en el pre-tratamiento de explosión por vapor.
Tabla 4.8. Condiciones y rendimiento del pre-tratamiento de explosión por vapor y capacidad
de retención de agua de las fracciones sólidas obtenidas.
HP SE1’ SE2’
Pre-extracción No Sí Sí
er
1 ciclo (min) - 3 10
2º ciclo (min) - - 3
Severidad S0 - 2,92 3,56
Rendimiento (%) - 81,9 62,5
a
% agua retenida 267 359 434
a
Capacidad de retención de agua expresada como gramos de agua por 100 gramos de muestra
seca.
El H. funifera sin pre-tratar (HP) mostró una capacidad de retención de agua

mucho más alta que el E. globulus sin pre-tratar (267 frente 65 g de agua por 100 g de
muestra seca) y similar a la del E. globulus tras un pre-tratamiento de explosión por
vapor equivalente a SE2’ (272 g de agua por 100 g de muestra seca). Puesto que la
capacidad de retención de agua proporciona información acerca de los cambios en la
estructura interna del material y de su accesibilidad a los reactivos, estos resultados
sugieren que el H. funifera sin ningún pre-tratamiento ya muestra una estructura igual
de accesible que la del E. globulus sometido a una explosión por vapor equivalente a
123
SE2’ (SE8). Otros autores ya observaron en los materiales no-madereros una estructura
más porosa y accesible que los madereros (Alaejos et al., 2004; Sánchez et al., 2011).
Tras someter el H. funifera a un pre-tratamiento de explosión por vapor se

observó un aumento de la capacidad de retención de agua, mayor cuanto más severo fue
el pre-tratamiento. Así, se alcanzaron valores de 359 y 434 g de agua por 100 g de
muestra seca tras los pre-tratamientos SE1’ y SE2’ respectivamente.
4.5.3 - Efecto del pre-tratamiento en el pasteado Kraft y en el

biopulpeo de H. funifera
H. funifera sin tratar (HP) y pre-tratado (SE1’ y SE2’) se sometió a un pasteado

Kraft para estudiar el efecto del pre-tratamiento de explosión por vapor. Estos ensayos
sirvieron de control para estudiar el efecto del biopulpeo, basado en la adición de una
etapa enzimática con LMS entre el pre-tratamiento y el pasteado. Se utilizó además un
segundo control, en el cual se llevó a cabo un tratamiento idéntico al tratamiento
enzimático pero sin adición de LMS, es decir, sólo en presencia de tampón (control-
tampón).
a) b)
55% 50% 46,2
45,4
Rendimiento global Kraft
47,5 43,9 43,7 43,7 45,0

50% 46,7 45%
Rendimiento útil Kraft
44,8 46,0
45,0 39,9
44,2
45%
40,2 40% 35,7 36,3
40% 37,0 36,6
35%
35%
30%
30%
25% 25%
20% 20%
HP SE1' SE2' HP SE1' SE2'
Control Control-Tampón LMS Control Control-Tampón LMS
Figura 4.37. Rendimiento global (a) y útil (b) del pasteado para H. funifera tras un pre-
tratamiento de explosión por vapor (SE1’ y SE2’) y un tratamiento con LMS. Se incluyen los
controles sin explosión por vapor (HP), sin adición de LMS (control-tampón) y sin etapa
enzimática (control).
En la figura 4.37 se muestran los rendimientos global y útil del proceso de

pasteado para cada muestra. Ambos rendimientos fueron muy similares, debido al bajo
contenido en incocidos o rechazos de todas las muestras (aprox. 1%). La eliminación de
extractos durante el tratamiento de explosión por vapor aumentó el porcentaje relativo
124
de celulosa antes del pasteado (de 44,7% en HP a 49,5% en SE2’) aumentando tanto el
rendimiento global como el útil en SE1’ y SE2’. Sin embargo, si se tiene en cuenta el
rendimiento del pre-tratamiento, el rendimiento total del proceso para HP, SE1’ y SE2’
fue 37%, 36% y 29% respectivamente. En cuanto al tratamiento enzimático, no supuso
diferencias significativas en el rendimiento del proceso.
La calidad de las pastas obtenidas se muestra en la figura 4.38, donde se observa

una reducción del número kappa cuando se llevó a cabo el pre-tratamiento de explosión
por vapor. Esta reducción fue más pronunciada al aumentar la severidad del pre-
tratamiento (17,8% y 28,4% para SE1’ y SE2’ respectivamente). Sin embargo, estas
reducciones fueron mucho más pequeñas que las observadas con E. globulus, donde se
obtuvo una reducción del 67,8% después de un tratamiento equivalente a SE2’ (SE8).
Estos resultados pueden deberse a que el H. funifera ya tiene una estructura accesible,
como mostró la capacidad de retención de agua, y un aumento en esta accesibilidad no
implica una mejora en la difusión de los reactivos tan grande como en el caso del E.
globulus. A pesar de ello, el aumento de deslignificación durante el pasteado de H.
funifera, debido al pre-tratamiento de explosión por vapor fue mayor que los observados
por Sánchez et al. (2011) con otros pre-tratamientos, como autohidrólisis e hidrólisis
ácida, antes del pasteado sosa-antraquinona de H. funifera.
a) b)
16 1400
14,1 1124
1134
1200 1114
14 1064 1020
Viscosidad (ml/g)
1010
11,6 1000
Número Kappa
12 11,1
798 832 817
10,3 10,4
10,1 800
9,6
10
600
7,9 8,2
8
400
6 200
4 0
HP SE1' SE2' HP SE1' SE2'
Control Control-Tampón LMS Control Control-Tampón LMS
Figura 4.38. Número kappa (a) y viscosidad (b) de las pastas Kraft de H. funifera tras un pre-
tratamiento de explosión por vapor (SE1’ y SE2’) y un tratamiento con LMS. Se incluyen los
controles sin explosión por vapor (HP), sin adición de LMS (control-tampón) y sin etapa
enzimática (control).
Por otro lado, se observó una reducción en el número kappa cuando se llevó a
cabo un tratamiento enzimático. Esta reducción fue una consecuencia del tratamiento
125
con tampón (pH 6) a 40ºC durante 5 horas y no de la acción enzimática, ya que no se

observó aumento en el efecto al añadir LMS en el tratamiento. Es decir, el aumento en
la deslignificación debido al tratamiento de explosión por vapor y al tratamiento
enzimático se debió probablemente a la eliminación de extractos durante el tratamiento
con vapor o agua a temperatura alta o moderada, respectivamente. Así, con el
tratamiento enzimático de H. funifera no pre-tratado, se observó una reducción en el
número kappa similar a la debida al pre-tratamiento de explosión por vapor, señalando
que un tratamiento a 183ºC durante 13 minutos dio lugar a resultados similares a los
causados por un tratamiento a 40ºC durante 5 horas. Cuando se llevaron a cabo ambos
pre-tratamientos, la reducción en el número kappa fue mayor cuanto más severo fue la
explosión por vapor. Sin embargo, la adición de LMS en las muestras HP supuso un
aumento en el número kappa, comparado con el control sólo con tampón. Este resultado
puede indicar enlaces entre el LMS y las fibras de las pastas, que producen un mayor
consumo de permanganato potásico en la determinación del número kappa (Dyer y
Ragauskas, 2004). Para conseguir un aumento de la deslignificación mediante el pre-
tratamiento LMS se deberán llevar a cabo más experimentos que permitan optimizar las
condiciones de operación (dosis de lacasa, tiempo de tratamiento, etc.) de manera
similar al estudio llevado a cabo con el E. globulus en el apartado 4.4.1.
La figura 4.38b) muestra una reducción de la viscosidad asociada al pre-

tratamiento de explosión por vapor, que aumenta al aumentar la severidad del pre-
tratamiento. Sin embargo, la degradación de las fibras no fue tan intensa como la
observada al llevar a cabo pre-tratamientos de autohidrólisis e hidrólisis ácida antes del
pasteado sosa-antraquinona de H. funifera (Sánchez et al., 2011). Por otro lado, el
tratamiento enzimático no causó variaciones significativas en la viscosidad.
El consumo de reactivos durante el pasteado se evaluó por medio del álcali

activo (AA) y la sulfidez (S) residuales en la lejía negra. El uso del pre-tratamiento de
explosión por vapor originó un aumento en el AA residual (4,0, 4,6 y 5,4 para los
controles HP, SE1’ y SE2’ respectivamente) como se observa en la tabla 4.9, indicando
una reducción en el consumo de reactivos (NaOH y Na2S). Estos resultados se deben
probablemente a la eliminación de hemicelulosas durante el pre-tratamiento, que se
degradarían durante el pasteado Kraft a ácidos carboxílicos consumiendo cantidades
significativas de álcali (San Martin et al., 1995). Por otro lado, la adición del
tratamiento LMS aumentó el consumo de Na2S (reducción de la sulfidez residual desde
126
aproximadamente 23 para los controles y controles-tampón hasta 17,0, 17,4 y 18,0 para
HP-LMS, SE1’-LMS y SE2’-LMS respectivamente). Un efecto similar se observó en el
biopulpeo con LMS de E. globulus (apartado 4.4.1) cuando se utilizaron dosis altas de
lacasa. Sin embargo, el álcali activo residual mostró que el consumo total de reactivos
no varió de manera significativa al añadir LMS en el tratamiento enzimático.
Tabla 4.9. Álcali activo (AA) y sulfidez (S) residual en las lejías negras obtenidas tras el
pasteado Kraft de las distintas muestras.
Muestra AA residual S residual
HP - Control 4,0 23,1
HP - Control-tampón 4,9 24,4
HP - LMS 4,7 17,0
SE1’ - Control 4,6 25,0
SE1’ - Control-tampón 3,9 20,3
SE1’ - LMS 3,8 17,4
SE2’ - Control 5,4 19,8
SE2’ - Control-tampón 4,5 22,1
SE2’ - LMS 5,1 18,0
A partir de estos resultados, se puede concluir que el pre-tratamiento de

explosión por vapor aumentó la deslignificación en un consecutivo pasteado Kraft
reduciendo el consumo de reactivos, siendo SE2’ el pre-tratamiento más eficaz. Las
pastas obtenidas mostraron números kappa inferiores y viscosidades superiores a las
obtenidas por otros autores mediante otros pre-tratamientos como autohidrólisis o
hidrólisis ácida. Sin embargo, el efecto del mismo pre-tratamiento de explosión por
vapor en el E. globulus fue mayor. Por otro lado, la adición de un pre-tratamiento LMS
entre la explosión por vapor y el pasteado Kraft no mostró mejoras significativas en la
calidad de las pastas obtenidas, siendo necesario un estudio más detallado de las
variables de operación.
En cuanto a las propiedades mecánicas del papel obtenido, se observó un

aumento del índice de desgarro y una reducción del índice de estallido debido al pre-
tratamiento de explosión por vapor. El mismo efecto fue observado por Sánchez et al.
(2011) tras pre-tratamientos de autohidrólisis e hidrólisis ácida de H. funifera.
Helmerius et al. (2010) también obtuvieron resultados similares tras diferentes pre-
127
tratamientos de extracción de hemicelulosa de abedul. Sin embargo, en el caso del E.

globulus, aunque se observó una reducción en el índice de estallido debido a la
eliminación de hemicelulosas durante el pre-tratamiento, se obtuvieron índices de
desgarro similares para la pasta pre-tratada y la pasta control, como se indicó en el
apartado 4.3.1. En la figura 4.39 se pueden comparar los valores de ambos índices
obtenidos para el E. globulus a distintos grados de refino y para el H. funifera sin
refinar. Como puede observarse, el H. funifera sin refinar mostró un índice de desgarro
muy superior a todas las muestras de E. globulus. Dicho índice para el H. funifera sin
pre-tratar fue similar al obtenido por McLaughlin (2000) en pastas sin refinar del mismo
material obtenidas mediante pasteado sosa-antraquinona. Cuando dicho autor sometió
las pastas a refino, el índice de desgarro disminuyó progresivamente, efecto contrario al
observado con E. globulus. Por otro lado, el índice de estallido del H. funifera pre-
tratado fue similar al obtenido tras 3000 revoluciones en refino PFI con pasta E.
globulus pre-tratada. Así mismo, dicho índice para el H. funifera sin pre-tratar fue
similar al de la pasta industrial de E. globulus tras 1000 revoluciones PFI. Por tanto, el
H. funifera puede proporcionar pastas con una resistencia mecánica elevada, similar a la
de pastas madereras refinadas, debido a las propiedades morfológicas de sus fibras
(largas, delgadas y con una pared celular muy fina) que aumentan los puntos de unión
entre fibras (Fairbank y Detrick, 2000; McLaughlin, 2000; Wong y McLaughlin, 2000).
a) b)
42 6
Índice estallido (KPam2/g)
Índice desgarro (mNm 2/g)
37 5
32
27 4
22 3
17 2
12
7 1
2 0
10 30 50 70 10 30 50 70
ºSR ºSR
SE Control Indust. HP HP-SE
Figura 4.39. Índices de desgarro (a) y de estallido (b) para pastas de Hesperaloe funifera sin
refinar sometidas al pre-tratamiento SE2’ (HP-SE) y no pre-tratadas (HP). Se muestran también
los índices obtenidos a distintos grados de refino con pastas de E. globulus sin pre-tratar
(control e industrial) y sometida a un pre-tratamiento similar a SE2’ (SE).
128
4.5.4 - Efecto del pre-tratamiento en el bioblanqueo de H. funifera
Las pastas control HP, SE1’ y SE2’ se sometieron a una secuencia TCF de
blanqueo, incluyendo una primera etapa enzimática para estudiar el efecto del pre-
tratamiento de explosión por vapor en el bioblanqueo de H. funifera. Como control, se
utilizó la misma secuencia LEP pero sin adición de LMS en la etapa enzimática (-Lc).
En la figura 4.40 se muestra la evolución del número kappa y la viscosidad

durante las distintas etapas del blanqueo. Para todas las pastas ensayadas, se observó
una reducción del número kappa después de cada etapa, mientras la viscosidad
permaneció aproximadamente constante durante todo el proceso de blanqueo. El
tratamiento LMS contribuyó en todas las pastas a aumentar la reducción del número
kappa sin disminuir la viscosidad. Lo que indica que, al igual que otros autores
observaron con otras materias primas (Eugenio et al., 2010a; Fillat et al., 2010; Oudia et
al., 2008), se puede conseguir una biodeslignificación significativa del H. funifera sin
degradar las cadenas de celulosa.
Al aumentar la severidad del pre-tratamiento de explosión por vapor, se observó

una mayor deslignificación durante el blanqueo LEP, coincidiendo con lo observado por
Josefsson et al. (2002) después de blanqueo químico de pastas de álamo pre-tratadas
con explosión por vapor. Así, al final de la secuencia de blanqueo, se obtuvieron
reducciones en el número kappa del 48,1% y 53,1% para SE2’-Lc y SE2’-L
respectivamente, mientras que la pasta sin pre-tratar mostró unas reducciones del
número kappa de 36,6% y 42,4% para HP-Lc y HP-L respectivamente. Por tanto, la
adición de un pre-tratamiento de explosión por vapor antes del pasteado Kraft mejoró
tanto el blanqueo químico como el bioblanqueo de H. funifera. Los resultados obtenidos
con esta materia prima, fueron muy similares a los obtenidos mediante el mismo
proceso con E. globulus, en el que se obtuvieron reducciones del número kappa del
41,7% y 54,5% para las pastas pre-tratadas blanqueadas sin y con adición de LMS en la
primera etapa del blanqueo, respectivamente.
129
a)
16
14,1 14,1 Sin blanquear L LE LEP
14
12,5
12,1 11,6
12 11,6 11,2
11,2
10,1 10,1
Número Kappa
10,2 9,6 9,8 9,5

10 8,9
8,1 8,3 8,3
7,7
8 7,1
6,4 6,3
6 5,2
4,7
0
HP-Lc HP-L SE1'-Lc SE1'-L SE2'-Lc SE2'-L
b)
1400
Sin blanquear L LE LEP
1134 1134 1121
1200 1105 1076 1042 1051
1082 1010
1051 1040 1033 988
989 1006 989
Viscosidad (ml/g)
1000 846
829 837 834
823
798 798 780
800
600
400
200
0
Figura 4.40. Evolución del número kappa (a) y la viscosidad (b) durante la secuencia de
bioblanqueo (LEP) para H. funifera sin tratar (HP) y con pre-tratamiento de explosión por vapor
(SE1’ y SE2’). Se incluye un control sin adición de LMS (-Lc).
Los cambios en las propiedades ópticas de las pastas se muestran en la figura

4.41. Como cabía esperar, se observó un aumento de la blancura después de cada etapa
de la secuencia de blanqueo LEP, produciéndose el mayor aumento en el tratamiento
con peróxido de hidrógeno (P). Al añadir LMS, la blancura de las pastas finales
aumentó en todos los casos, por lo que se probó que el tratamiento LMS mejora el
blanqueo de las pastas Kraft de H. funifera, al igual que se ha observado previamente
con otras materias primas (Eugenio et al., 2010a; Fillat et al., 2010; Vivekanand et al.,
2008).
130
a)
80 Sin blanquear L LE LEP
67 68
70
60 61 62
58
60
Blancura (% ISO)
53
51
50 45 45 46 46
44 45 44
43 43 43
40 42
40 36 36 36 36
30
20
10
0
b) c)
13 95
90
12
HP HP
HP-LEP 85 HP-LEP
b* 11 SE1' L* SE1'
SE1'-LEP 80 SE1'-LEP
SE2' SE2'
10
SE2'-LEP 75 SE2'-LEP
9 70
-1 0 1 2 3 4 10 11 12 13
a* C*
Figura 4.41. Propiedades ópticas de las pastas bioblanqueadas de H. funifera sin tratar (HP) y
con pre-tratamiento de explosión por vapor (SE1’ y SE2’): a) evolución de la blancura en la
secuencia LEP; b) coordinadas CIE L*a*b* y c) coordinadas CIE L*C* para pastas sin
blanquear (símbolos oscuros) y bioblanqueadas (símbolos claros).
Las pastas pre-tratadas mediante explosión por vapor presentaron una blancura
mayor que las pastas sin pretratar, que aumentó al incrementar la severidad del pre-
tratamiento y al incluir un tratamiento con LMS en la secuencia de blanqueo. Además
de la blancura, el color del papel es una propiedad muy importante en diferentes
aplicaciones y una buena base blanca es necesaria cuando los productos se van a teñir,
imprimir o colorear. Por esta razón, se midieron también las coordenadas CIE L*a*b* y
CIE L*C* en las pastas antes y después del bioblanqueo (figura 4.41b y 4.41c). En
todas las pastas se observó una reducción de la coordenada a* (que indica la posición
entre el rojo y el verde) después del bioblanqueo, llegando a valores de a* muy
próximos al valor neutro ideal (0). Sin embargo, en las muestras sin pre-tratar (HP) la
coordenada b* (posición entre el amarillo y el azul) apenas cambia durante el blanqueo,
e incluso aumenta (más amarillo) para las pastas pre-tratadas SE1’. Por el contrario,
cuando se llevó a cabo un pre-tratamiento más intenso (SE2’), se observó una
131
disminución de la coordenada b* al final de la secuencia de blanqueo. De esta forma, la

coordenada C*, que indica la distancia al color neutro perfecto, disminuye en la pasta
bioblanqueada SE2’ pero permanece aproximadamente constante para las pastas SE1’ y
HP. En cuanto a la luminosidad, la coordenada L* aumenta en todas las muestras
después del bioblanqueo. De acuerdo con estos resultados, el pre-tratamiento de
explosión por vapor más severo (SE2’) mejoró las propiedades ópticas de la pasta final
blanqueada de H. funifera, no sólo aumentando la blancura y la luminosidad, sino
también reduciendo el color, al igual que se observó en el caso del E. globulus. Sin
embargo, un pre-tratamiento menos severo (SE1’) no mejoró las propiedades
colorimétricas de las pastas bioblanqueadas comparado con las pastas no pre-tratadas.
Tabla 4.10. Consumo de peróxido de hidrógeno medido a partir de los efluentes de la etapa P.
Muestra Consumo H2O2 (%)
HP-Lc 90,3
HP-L 92,7
SE1-Lc 87,5
SE1-L 88,0
SE2-Lc 66,1
SE2-L 68,1
Otra ventaja del pre-tratamiento de explosión por vapor fue la reducción del
consumo de peróxido de hidrógeno durante el blanqueo. Como se puede observar en la
tabla 4.10, un pre-tratamiento más intenso dio lugar a un consumo menor de peróxido
de hidrógeno, observando una reducción del 24,6% con el pre-tratamiento SE2’. Un
comportamiento similar se observó en el caso del E. globulus, en el que el pre-
tratamiento de explosión por vapor redujo la cantidad de ácidos hexenurónicos en la
pasta sin blanquear, reduciendo por tanto el consumo de reactivos de blanqueo. Sin
embargo, cuando se llevó a cabo un tratamiento LMS, se observó un pequeño aumento
del consumo de peróxido de hidrógeno en todas las pastas de H. funifera,
contrariamente a lo observado en el caso del E. globulus y por otros autores utilizando
distintas materias primas (Eugenio et al., 2010a; Valls y Roncero, 2009). Sin embargo,
se debe tener en cuenta, que las pastas obtenidas al final de la secuencia que incluye
LMS presentaron un número kappa menor y una blancura mayor, y por tanto, si se
comparan pastas con similar deslignificación y nivel de blancura, el consumo de
132
reactivos en las pastas con tratamiento LMS sería probablemente menor que en las
pastas control.
Por tanto, el LMS contribuyó a aumentar la blancura y reducir el número kappa

al final de la secuencia de blanqueo, consumiendo sólo en torno a un 2% más de
peróxido de hidrógeno. Estas mejoras en la calidad de la pasta blanqueada se vieron
incrementadas al añadir un pre-tratamiento de explosión por vapor antes del pasteado
Kraft, consiguiendo además disminuir el consumo de peróxido de hidrógeno un 24,6%.
Es decir, la combinación de ambos tratamientos permite obtener pastas con bajo
contenido en lignina y buenas propiedades colorimétricas y de blancura, utilizando
menor cantidad de reactivos de blanqueo.
133
5
CONCLUSIONES / CONCLUSIONS
5 – Conclusiones / Conclusions
5. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS
Las principales conclusiones que se desprenden del trabajo realizado en la

presente tesis doctoral son las siguientes:
1) El tratamiento de explosión por vapor es un método eficaz para extraer

selectivamente las hemicelulosas del material lignocelulósico, aumentando su
extracción al aumentar la severidad del tratamiento. Mediante un tratamiento
consistente en una pre-extracción con agua fría seguido de dos ciclos de
explosión por vapor de 10 y 3 minutos a 183ºC, se extrajo el 47% de los xilanos
y el 93% de los arabanos presentes en Eucalyptus globulus sin degradar
significativamente la celulosa. Además, provocó la solubilización de una
pequeña parte de la lignina presente en el material original. La lignina remanente
en la fracción sólida mostró un menor contenido en subestructuras β-O-4 debido
a reacciones de despolimerización, aumentando la fracción de lignina soluble en
álcali. Sin embargo, también tuvieron lugar reacciones de repolimerización, que
provocaron la condensación de la lignina, aumentando su temperatura de
degradación y haciendo más difícil la extracción de la lignina residual.
2) Dicho tratamiento modificó también la estructura interna del material

lignocelulósico, proporcionando una fracción sólida con una estructura más
abierta y accesible. Por ello, se observó un aumento en la capacidad de retención
de agua de la fracción sólida, que se incrementó al aumentar la severidad del
tratamiento. Se observó también un aumento del volumen de macroporos,
mientras el volumen de mesoporos disminuyó, aumentando la accesibilidad pero
disminuyendo el área superficial del material. Por ello, dependiendo de la
naturaleza del proceso al que se someta el material, se deberán ajustar las
condiciones del tratamiento.
3) El conjunto de cambios químicos y estructurales causados por el tratamiento de

explosión por vapor, lo convierte en un pre-tratamiento adecuado en el proceso
de pasteado Kraft. Se consigue de esta forma adaptar dicho proceso al concepto
de biorrefinería lignocelulósica en el que se obtiene una fracción líquida rica en
hemicelulosas que podrá utilizarse para la obtención de bioetanol u otros
productos de alto valor añadido.
137
4) En la fracción líquida recogida durante el pre-tratamiento de explosión por

vapor, se detectaron principalmente xilooligosacáridos, que pueden ser
utilizados como fuente de azúcares para la producción de bioetanol. La hidrólisis
enzimática de dicha fracción proporcionó mejores rendimientos que la hidrólisis
ácida y además permitió operar en condiciones suaves que no favorecen la
generación de productos inhibidores. El rendimiento alcanzado en la hidrólisis
enzimática fue del 83%. Para aumentar el rendimiento de la hidrólisis y sobre
todo de la posterior fermentación, sería interesante estudiar el efecto de
detoxificación de esta corriente líquida mediante la aplicación de tratamientos
con sistema lacasa-mediador.
5) Se estudió también la hidrólisis enzimática de la fracción sólida, planteando la

producción de bioetanol como alternativa a la producción de pastas. Se observó
un aumento del rendimiento de hidrólisis al aumentar la severidad del pre-
tratamiento y al añadir un tratamiento LMS antes de la hidrólisis enzimática. Sin
embargo, se debe tener en cuenta que el aumento de la severidad favorecerá las
reacciones de degradación de los polisacáridos, reduciendo la recuperación de
xilooligosacáridos en la fracción líquida y aumentando la generación de
productos inhibidores. Por ello, la aplicación de un pre-tratamiento no muy
severo junto con tratamientos de detoxificación con LMS mejorarán el
rendimiento global de obtención de azúcares. Sin embargo, con los pre-
tratamientos estudiados, la cantidad de azúcares obtenidos a partir de la fracción
sólida sólo representó el 12,3% del material original. Este dato, junto con el alto
precio de la pasta Kraft, señalan el pasteado Kraft como la mejor opción para
aprovechar esta fracción sólida y dejaría la opción del bioetanol para el
aprovechamiento de la fracción líquida.
6) La estructura abierta del residuo sólido obtenido tras el pre-tratamiento de

explosión por vapor mejoró la difusión de los reactivos en un consecutivo
pasteado Kraft, aumentando la deslignificación en un 70%. Alternativamente, el
tiempo de pasteado podría reducirse de 60 a 25 minutos obteniendo pastas de
similar grado de deslignificación, disminuyendo el consumo de energía de
pasteado y pudiendo aumentarse la productividad de un hipotética fábrica. Sin
embargo, el rendimiento en pasta del proceso disminuyó desde un 50% hasta un
138
40%. Aunque las pastas obtenidas necesitaron mayor energía durante el refino,
las propiedades mecánicas fueron sólo ligeramente inferiores.
7) El proceso de blanqueo se vio favorecido por el pre-tratamiento, debido a la

disminución de ácidos hexenurónicos en las pastas. Al añadir una etapa
enzimática (LMS) en la secuencia de blanqueo, se combinaron las ventajas del
pre-tratamiento SE y del tratamiento enzimático, obteniendo pastas con un
número kappa inferior, una blancura superior y propiedades colorimétricas
mejores que las de las pastas control. Además, se redujo el consumo de peróxido
de hidrógeno en un 20%.
8) Añadiendo una etapa enzimática con LMS entre el pre-tratamiento de explosión

por vapor y el pasteado Kraft, se obtuvo una alternativa viable al biopulpeo
convencional con hongos ligninolíticos. La adición de esta etapa enzimática
mejoró la deslignificación en un 13,9% sin afectar el rendimiento del pasteado ni
las propiedades mecánicas de las pastas obtenidas, y reduciendo el consumo de
reactivos de cocción. Con este proceso se evitan algunas de los inconvenientes
de la aplicación del biopulpeo con hongos a nivel industrial, como son los largos
tiempos de tratamiento, pasando de semanas a horas, y la pérdida de rendimiento
del proceso debido a la degradación de los polisacáridos por los hongos.
9) La utilización de Hesperaloe funifera como materia prima en el esquema de la

biorrefinería propuesto puede ser una buena alternativa en áreas secas y/o con
escasos recursos forestales. Mediante el pre-tratamiento de explosión por vapor
se consiguió extraer el 57% de los xilanos y las pastas Kraft obtenidas sin refinar
mostraron unas propiedades similares a las del E. globulus refinado. El efecto
del pre-tratamiento SE en el pasteado fue menor que el observado en el caso del
E. globulus, mientras que el efecto en el blanqueo fue similar con ambas
materias primas. Por otro lado, la adición de un tratamiento LMS entre el pre-
tratamiento SE y el pasteado Kraft no mejoró la deslignificación en las
condiciones ensayadas. Sin embargo, la adición del tratamiento LMS en la
primera etapa de la secuencia de blanqueo mejoró el efecto positivo del pre-
tratamiento SE, obteniéndose mayores incrementos de blancura y mayores
reducciones en el número kappa y en el consumo de peróxido de hidrógeno.
139
CONCLUSIONS
The main conclusions of the work conducted in this doctoral thesis are the
following:
1) Steam explosion is an efficient method to selectively extract the hemicelluloses

of the lignocellulosic material, increasing the extraction by intensifying the
severity of the treatment. A treatment consisting of cold water pre-extraction
followed by two steam explosion cycles of 10 and 3 minutes at 183ºC, 47% of
the xylan and 93% of the arabinan present in Eucalyptus globulus wood were
extracted while the cellulose remained almost undegraded. In addition, this
treatment caused the solubilization of a small part of the lignin in the raw
material. The lignin remaining on the solid fraction proved to have less β-O-4
substructures as a result of depolymerization reactions, which augmented the
alkali soluble lignin fraction. However, repolymerization reactions also took
place, causing lignin condensation, increasing its degradation temperature and
hindering the extraction of the residual lignin.
2) This treatment also modified the internal structure of the lignocellulosic

material, yielding a solid fraction with a more open and accessible structure. As
a result, the water retention capacity of the solid fraction increased, and rose
with the severity of the treatment. An increase in the volume of macropores was
also observed, while the volume of mesopores decrease, increasing the
accessibility but reducing the superficial area of the material. Consequently, the
conditions of the treatment should be adjusted based on the nature of the process
that the material is to be subjected to.
3) The chemical and structural changes caused by the steam explosion treatment,
makes it a suitable pre-treatment for Kraft pulping. That way, this process could
be transformed into a lignocellulosic biorefinery with a liquid fraction rich in
hemicelluloses to be used for the production of bioethanol or other high value-
added products.
4) The main components of the liquid fraction obtained in the steam explosion pre-
treatment were xylooligosacharides, which can be used as a sugar source for
bioethanol production. Enzymatic hydrolysis of this fraction provided better
140
yields than acid hydrolysis, allowing also for milder operational conditions that
would not favor the generation of inhibiting compounds. The enzymatic yield
achieved was 83%. To improve the hydrolysis and the subsequent fermentation
yields, it would be of interest to study the detoxification of this liquid fraction by
pre-treatments based on the laccase-mediator system.
5) The enzymatic hydrolysis of the solid fraction was also evaluated, considering
the bioethanol production as an alternative to the pulp production. The
hydrolysis yield was observed to increase with the severity of the pre-treatment
and, also, when applying LMS before the enzymatic hydrolysis. However, it
should be noted that a more severe pre-treatment would elicit degradation of the
polysaccharides, reducing the recovery of xylooligosaccharides in the liquid
fraction and increasing the generation of inhibiting products. Therefore, a mild
pre-treatment, and detoxification with LMS treatments, would increase the
overall sugar yield. However, the amount of sugar obtained from the solid
fraction using the studied pre-treatments represents only 12.3% of the raw
material. This finding and the high price of the Kraft pulp, makes Kraft pulping
stand out as the best option to exploit the solid fraction, using only the liquid
fraction for the production of bioethanol.
6) The open structure of the solid residue obtained after the steam explosion pre-
treatment improved the diffusion of the reagents during a subsequent Kraft
pulping, increasing the delignification by up to 70%. Alternatively, the cooking
time was reduced from 60 to 25 minutes obtaining pulps with similar
delignification grades, reducing the pulping energy consumption and increasing
the productivity of a hypothetical mill. Nevertheless, the pulp yield of the
process decreased from 50% to 40%. Although the pulp obtained required more
energy during refining, the mechanical properties were only slightly worse.
7) The bleaching process was boosted by the pre-treatment, as a result of the

reduction of the hexenuronic acid content in the unbleached pulps. When an
enzymatic stage (LMS) was added to the bleaching sequence, the advantages of
both the SE pre-treatment and the enzymatic treatment were combined,
obtaining pulps with a lower kappa number, higher brightness and better
141
colorimetric properties than the control pulps. Furthermore, the hydrogen

peroxide consumption was reduced by 20%.
8) Applying a LMS enzymatic stage between the steam explosion pre-treatment

and the Kraft pulping was a viable alternative for conventional biopulping with
ligninolytic fungi. The addition of this enzymatic stage increased the
delignification by 13.9% with no detriment to the pulp yield and the mechanical
properties of the pulps obtained, and reducing the chemical consumption. This
process avoided some of the drawbacks of the industrial application of fungi,
such as long treatment times, reducing it from weeks to hours, and yield loss due
to polysaccharides degradation by the fungi.
9) The utilization of Hesperaloe funifera as raw material in the proposed

biorefinery process could be a good alternative in areas with scant water and/or
forest resources. In the steam explosion pre-treatment, 57% of the xylan present
in the raw material was extracted. After the Kraft pulping, the unrefined pulps
obtained showed similar properties to those of refined E. globulus pulps. The
effect of the SE pre-treatment on pulping was less intense than that observed
with E. globulus, whereas the effect on bleaching was similar with both raw
materials. On the other hand, the addition of a LMS treatment between the SE
pre-treatment and the Kraft pulping did not improve the delignification in the
assayed conditions. However, the addition of LMS in the first stage of the
bleaching sequence boosted the positive effect of the SE pre-treatment, with
higher brightness and smaller kappa number and hydrogen peroxide
consumption.
142
6
TRABAJOS FUTUROS
6 –Trabajos futuros
6. TRABAJOS FUTUROS
A partir de los resultados y conclusiones obtenidos en esta tesis doctoral se

plantean varias líneas futuras de trabajo.
La primera de ellas sería ahondar en la recuperación de la corriente de

hemicelulosas y su utilización en la producción de bioetanol. Para ello se propone
estudiar la detoxificación de dicha corriente con tratamientos con LMS, antes y después
de la hidrólisis enzimática, y estudiar su efecto en la fermentación. Para llevar a cabo
esta fermentación se deberán utilizar bacterias o levaduras capaces de fermentar la
xilosa a etanol, como Candida shehatae, Pachysolen tannophilus y P. stipitis. Además,
se deberá optimizar la recogida de las hemicelulosas extraídas, para evitar las pérdidas
observadas en los balances de materia del proceso realizados en la tesis doctoral.
La segunda línea importante que se propone estudiar en un futuro, es la

recuperación de las lejías negras obtenidas en el pasteado. En este sentido se plantea
estudiar el efecto de la extracción de hemicelulosas antes del proceso Kraft en el poder
calorífico de las lejías negras y por tanto, en la energía que podría obtenerse a partir de
ellas. Además, se propone estudiar el efecto del pre-tratamiento en el consumo de
energía del proceso global, para estimar de este modo el balance total de energía y
comprobar si el proceso continúa siendo autosuficiente energéticamente. Otro trabajo
futuro en relación al aprovechamiento de las lejías negras, sería el estudio de la
gasificación de las mismas.
La tercera línea de trabajo futuro sería la aplicación de los pre-tratamientos

estudiados en la presente tesis doctoral en el pasteado mecánico. Tanto el pre-
tratamiento de explosión por vapor como el tratamiento LMS antes del pasteado, se
espera que contribuyan a reducir el consumo de energía durante el pasteado mecánico.
Por último, se propone ampliar el estudio de biopulpeo enzimático del

Hesperaloe funifera. En la presente tesis, no se obtuvieron beneficios al aplicar un
sistema LMS entre el pre-tratamiento de explosión por vapor y el pasteado Kraft, al
contrario de lo observado con Eucalyptus globulus. Por ello, sería necesario ampliar el
estudio de dicho tratamiento enzimático estudiando la influencia al menos de la dosis
enzimática y del tiempo de tratamiento.
145
7
BIBLIOGRAFIA
TRABAJOS FUTUROS
7. BIBLIOGRAFÍA
Agenda-2020. 2010. Forest products industry technology roadmap. American Forest &
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Ahvazi, B., Radiotis, T., Bouchard, J. y Goel, K. 2007. Chemical pulping of steam-
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ANEXOS:
PUBLICACIONES
PUBLICACIÓN I:
Steam explosion treatment of Eucalyptus globulus wood: Influence of operational
conditions on chemical and structural modifications.
Martín-Sampedro, R., Martín, J.A., Eugenio, M.E., Revilla, E., Villar, J.C.
BioResources. 2011. 6(4): 4922-4935.
171
PEER-REVIEWED ARTICLE bioresources.com
STEAM EXPLOSION TREATMENT OF EUCALYPTUS GLOBULUS

WOOD: INFLUENCE OF OPERATIONAL CONDITIONS ON
CHEMICAL AND STRUCTURAL MODIFICATIONS
Raquel Martín-Sampedro, Juan Antonio Martín, Maria E. Eugenio, Esteban Revilla, and
Juan Carlos Villar*
This study evaluates the use of steam explosion (SE) as a pre-treatment

of Eucalyptus globulus chips, aimed at making this wood suitable as
feedstock in biorefineries or alternative processes such as biopulping.
Several SE treatments were applied, modifying the following variables:
previous hydration of the chips, number of SE cycles, and duration of the
first cycle. Chemical composition and structural properties were analyzed
after all treatments. Our results show that acetone and hot water
extractives contents increased between 1.0% and 6.2% and between
3.6% and 7.1%, respectively, depending on SE operational conditions.
Holocellulose content was also observed to decrease (9.4 to 15.6%),
while the Klason lignin underwent a slight solubilization. Furthermore,
greater water retention capacity and new bigger sized pores were found
in the exploded samples. It is reasonable to expect that these changes
would facilitate the subsequent implementation of chemical or biological
treatments of the cellulose fraction in the biorefinery design.
Keywords: Eucalyptus globulus; Biorefinery; Steam explosion; Porosity
Contactinformation: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria INIA.

Carretera de la Coruña, km 7.5, 28040, Madrid (Spain); * Corresponding author: [email protected]
INTRODUCTION
Extensive research efforts to improve the processing and digestion of biomass for
several applications have been pursued in the last few years. Steam explosion (SE) is one
of the most widely used treatments for fractionation of lignocellulosic components. It is
defined as a process by which the lignocellulosic material is exposed to high pressure
steam before it undergoes very rapid decompression. This sudden decompression leads to
an “explosion” of the steam inside the lignocellulosic matrix, which promotes breakdown
and defibrillation of its structure, hydrolysis of the hemicelluloses, and depolymerisation/
repolymerization of the lignin (Ruiz et al. 2008). Thus, the accessibility of the material to
chemical or enzymatic degradation is greatly increased (Moniruzzaman 1996; Martin-
Sampedro et al. 2011). The advantages of SE include a significantly lower environmental
impact, low capital investment, and fewer hazardous chemicals applied in the process
compared to other methods for hemicelluloses extraction (Li et al. 2001). On the other
hand, the presence of degradation products from sugar and lignin is unavoidable and must
be taken into account in order to minimize the potential inhibitory effect on subsequent
steps such as the enzymatic hydrolysis (Tengborg et al. 2001).
Martín-Sampedro et al. (2011). “Steam explosion,” BioResources 6(4), 4922-4935. 4922

The use of SE in wood processing has increased considerably in the last years due
to its potential to produce chemical and structural changes in the lignocellulosic material
(Ruiz et al. 2008; Viola et al. 2008; Sun and Chen 2008; Cara et al. 2008). This potential
means that SE can be exploited in a way that opens new opportunities in several
industrial, energetic, and environmental fields. For instance, this technology has been
considered an alternative to conventional chemi-mechanical (CMP) and chemi-thermo-
mechanical pulping (CTMP) (Ahvazi et al. 2007). The SE softens lignin, which favours a
more intense defibrillation. However, SE pulping has not been industrially implemented
yet, because the steam exploded pulps have failed so far to show any superior properties
over those from CMP or CTMP (Heitner et al. 1993). Other authors have used SE as a
pre-treatment in chemical pulping, and have suggested that, because it facilitates a more
efficient diffusion of cooking liquor into the chips, the open structure of the exploded
chips might lead to a higher yield and lower rejects in kraft pulping (Ahvazi et al. 2007;
Martin-Sampedro et al. 2011a). SE has also been applied to improve delignification
during the laccase treatment prior to kraft pulping or in biobleaching sequences (Martin-
Sampedro et al. 2011b,c).
Similarly, a considerable research effort is being applied to develop new strategies
designed to find renewable bio-fuels extracted from the biomass. The biomass types
considered for ethanol production include lignocellulosic material such as wood, annual
crops, and agricultural and forestry residues. It has been widely recognized that the rate
and extent of enzymatic hydrolysis of lignocellulosic substrates are influenced not only
by the effectiveness of the enzymes but also by the chemical, physical, and morpho-
logical characteristics of the substrates (Chandra et al. 2007). Thus, a pre-treatment of the
lignocellulosic material is required to improve all these aspects. SE is suitable for this end
because it is known to induce autohydrolysis and defibrillation. Therefore, several
authors have reported on the use of SE in bioethanol production as pre-treatment of
different biomass sources, such as sunflower stalks (Ruiz et al. 2008), wheat straw (Sun
and Chen 2008), olive tree pruning (Cara et al. 2008), soybean hulls (Corredor et al.
2008), logdepole pine (Cara et al. 2008), or eel grass (Zostera marina) (Viola et al. 2008).
For all the reasons above mentioned, the SE pre-treatment of lignocellulose
appears to be an excellent tool for improving the production of the two main cellulose
derivatives: pulp and ethanol. Consequently the aim of this study was to assess the effect
of the SE pre-treatment on the chemical and structural modifications of Eucalyptus
globulus chips. To achieve that goal the chemical composition, water retention capacity,
relative porosity, and relative surface of the material were determined.
EXPERIMENTAL
Raw Material
E. globulus chips were kindly supplied by La Montañanesa pulp mill (Spain). The
material was air dried until reaching constant moisture, and then homogenized in a single
stock (by conditioning inside polyethylene bags) to avoid differences in composition and
water content. The chips were stored in polyethylene bags at 25º C.

PEER
R-REVIEWED A
ARTICLE biioresources.com
Steeam Explo osion Treatment
The SEE treatment was perforrmed in a 26 2 litre stainnless steel ddigester cappable of
reacching a tem M (14 kg ccm-2). The digester
mperature off 190 ºC andd a pressuree of 1.37 MPa
wass equipped with a tubuular heat exxchanger, electrovalve
e es for steamm admission n, and a
balll valve of diischarge. Thhe steam geenerator waas a Babcock Wanson V VAP 250RR R boiler
(Eraandio, Spainn), with a maximum
m steeam producction of 270 kg h-1 and a working pressure
p
of 1.37
1 MPa. A sketch of the
t digesterr is shown inn Fig. 1.
Sketch of the digester use

Fig. 1.S ed in the SE experimentss
The SEE conditionss assayed were:

w numbeer of cycless of treatmeent (once orr twice),
duraation of thee first cyclee (5 or 10 minutes),
m annd presencee or absencce of pre-hyydration
(preesence: immmersion in water
w for 166 hours at 255º C; absen
nce: no prevvious immeersion in
water). This last variable was studiedd in order too evaluate the t effect oof the uniforrmity of
imppregnation oon the subseequent steam m explosionn treatment.
The expperimental design wass as followss: the raw material waas divided into ten
mples of 5000 g, which were used in eight exxperiments (23) and tw
sam wo controls, corres-
ponnding to hyddrated and non-hydratted sampless. Commonn operationaal condition ns to all
treaatments werre: temperatture of operration, 183 ºC; treatmeent pressuree, 0.98 MPaa (10 kg
cm-22); dischargge pressure, 0.59 MPaa (6 kg cm m-2); and duuration of thhe second cycle,
c 3
minnutes. All thhe specific variable
v vallues for thee two controols and all tthe treated samples
are listed in Taable 1. Chipps were intrroduced intoo the digestter, and opeerational con nditions
werre reached and
a maintainned by charrging steam m. At the endd of the steaam treatmen nt (after
5 or 10 minuttes, accordiing to Tablle 1), the ppressure waas reduced to 0.59 MPa M (for
secuurity reasonns), and then the chips were sudddenly dischaarged into thhe blowing g tank at
Marttín-Sampedrro et al. (2011). “Steam explosion,”

e BioResourcees 6(4), 49222-4935. 4924
atmospheric pressure. When a second cycle was carried out, the exploded chips obtained
in the first cycle were washed with cold water and then subjected to a second cycle
following the same procedure. After treatment, the samples were thoroughly washed with
water, dried at room temperature and stored in sealed polyethylene bags.
Table 1. Variable Values for Each Control and SE Treated Sample

Previous Number of cycles Duration the first
Sample
hydration of treatment cycle
C1 No - -
C2 Yes - -
NH-5 No 1 5
H-5 Yes 1 5
NH-10 No 1 10
H-10 Yes 1 10
NH-5+3 No 2 5
H-5+3 Yes 2 5
NH-10+3 No 2 10
H-10+3 Yes 2 10
Chemical Analysis
In order to carry out the chemical analysis, all the samples were dried at room
temperature and then milled in a Wiley mill. The samples were sieved using standard
sieves to obtain 20 g of wood meal sized between 0.30 and 0.40 mm. Acetone extractives
(UNE-EN ISO 14453), hot water extractives (UNE 57-013-82), lignin content (TAPPI T
222 om-88), and holocellulose content (Wise et al. 1946) were then measured on the
wood meal. All determinations were duplicated.
The concentrations of furfural and hydroxymethyl furfural (HMF) in the liquid
fractions obtained during the experiments were also determined by High Performance
Liquid Chromatography (HPLC) using the Agilent Technology 1200 series RID (Las
Rozas, Spain) with an Aminex HPX-87H column (Bio-Rad, Alcobendas, Spain). The
equipment was operated at 50 ºC with a mobile phase containing 5 mM sulfuric acid
pumped at a rate of 0.6 mL min-1.
Water Retention Capacity

The water retention, or hydration capacity of the treated and untreated chips was
defined as the weight of water absorbed by the chips after being immersed in water at 25
ºC for 6 hours (Martin-Sampedro et al. 2011a). It was expressed as grams of water per
100 grams of oven-dry wood.

Porosity and Surface Analysis
The relative pore volume and the relative surface of the samples were determined
by mercury intrusion porosimetry (MIP) using a CEI instrument, Pascal 140 / 240
porosimeter, equipped with the Software version 1.03B-2. The samples were dried at 60
ºC overnight. IUPAC (Rouquerol et al. 1994) values for mercury contact angle (141º), Hg
surface tension (484 m N m-1), Hg density (13.534 g mL-1), and Hg temperature (25°C)
were used for these measurements. A cylindrical model of the pores was used in the
assays.
RESULTS AND DISCUSSION
Chemical Analysis
The SE had a clear effect on the chemical composition of the treated chips.
Figures 2a and 2b show the acetone and hot water extractives. As can be observed in Fig.
2a, there was a clear increase in the percentage of acetone extractives in all the exploded
samples. This increase could be partly associated with the degradation of lignin caused by
the treatments (Chandra et al. 2007). Longer times of treatment resulted in higher extrac-
tive percentages (increase of 1.3-3.1% and 2.4-6.2% for 5-10 min of treatment, for
hydrated and non-hydrated samples, respectively), but when a second SE cycle was
added, similar or even lower percentages of acetone extractives were found (increase of
1.0-4.5% and 3.2-4.2% for 5-10 min of treatment, for hydrated and non-hydrated samples
respectively). This is likely to be caused by the removal effect of the second cycle. The
pre-hydration of chips did not always show a meaningful effect but seemed to be more
relevant during the first cycle with long times of treatment.
As Fig. 2b reveals, SE also increased the percentage of hot water extractives in all
the treated samples, with differences of 3.6% to 7.1%. The increase seemed to be
independent of the treatment duration, number of cycles, and previous hydration, which
suggests that a threshold severity value, causing the maximum formation of water soluble
compounds, was reached even with the mildest treatment.
There was a significant decrease in the holocellulose content after every treatment
(Fig. 2c). The relative value was reduced from the 74-77% (controls) down to 61-65%,
regardless of the SE conditions. A similar reduction of holocellulose content took place in
all the treated samples, which could indicate that the severity of the treatments was
enough to reach a constant degree of holocellulose degradation, causing an increase in
hot water extractives, as already described. However, if steam explosion yield is taken
into account, it is possible to determine the percentage of the original holocellulose that
remains in the solid after treatment, and therefore, estimate the real holocellulose
degradation. Table 2 shows the treatment yields and the percentages of holocellulose and
Klason lignin that remain in the solid fraction after each steam explosion treatment,
compared to the original amount in the raw material (C1). As can be observed, the
percentage of holocellulose underwent a progressive reduction (due to hemicelluloses
solubilization) when the severity of the treatment increased (longer treatment and/or
addition of a second SE cycle). The pre-hydration of the chips, also contributed to the
solubilization of hemicelluloses.

10% 15%
a Without previous hydration b Without previous hydration
Hot water extractives, %

Acetone extractives, %
8% With previous hydration 12% With previous hydration
6% 9%
4% 6%
2% 3%
0% 0%
0 5 10 5+3 10+3 0 5 10 5+3 10+3
Time of treatment, min. Time of treatment, min.
90% 30%
c Without previous hydration d Without previous hydration
80%
With previous hydration 25% With previous hydration
70%
Holocellulose ,%
Klason lignin, %
60% 20%
50%
15%
40%
30% 10%
20%
5%
10%
0% 0%
0 5 10 5+3 10+3 0 5 10 5+3 10+3
Time of treatment, min. Time of treatment, min.
Fig. 2. Relative percentages of acetone extractives (a), hot water extractives (b), holocellulose
(c), and Klason lignin (d).
Removal of hemicelluloses with SE under different severity treatments has been

well reported. Hendriks and Zeeman (2009) have described the degradation of isolated
hemicellulose with steam and the formation of acids that could catalyze further
hydrolysis (autohydrolysis). Ruiz et al. (2008) have also reported the degradation of
cellulose and mainly hemicelluloses of sunflower stalks but at higher temperatures (180
to 230 ºC) than those used in our assays. Other authors have found a loss of 30% of
xylose in bamboo (Phyllostachys pubescens) treated with SE; xylose is the major
component of hemicellulose (Shao et al., 2008). A removal of 47% of xylan was also
found after SE of E. globulus in a previous report (Martin-Sampedro et al. 2011d).
In the biorefinery, SE poses the risk of producing compounds such as furfural,
HMF, and soluble phenolic compounds, which can inhibit enzyme activity (Punsuvon et
al. 2008; Ximenes et al. 2010). Formation of these compounds would partly explain the
changes in the percentages of acetone and hot water extractives shown in Fig. 2 and
would be consistent with the decrease in holocellulose content observed in all the treated
E. globulus samples. However, in the liquid fractions obtained in our study, neither
furfural nor HMF was detected in the HPLC analysis, indicating that hydrolysis reactions

largely predominated over degradation reactions such as dehydration. This finding was
probably due to the fact that milder steam explosion conditions were used in the present
study (severity factor from 3.1 to 3.5) compared to those applied by other authors (from
3.5 to 4.3) (Li et al. 2005). Therefore, the use of a less intensive steam explosion pre-
treatment before enzymatic hydrolysis in bioethanol production could be an alternative
option to reduce the inhibiting products. Nevertheless, it is also possible that these
volatile products were not quantitatively recovered in the liquid fraction because they
were partially lost to the atmosphere after explosive decompression (Emmel et al. 2003).
Finally, Fig. 2d shows that there were no significant changes in the Klason lignin
content. The results could indicate that no quantitative changes occurred in the lignin
fraction after SE. However, the darkening of the treated chips suggests that some kind of
reaction, possibly condensation, took place, making the lignin macromolecule more
resistant to solvent extraction. Several authors (Donaldson et al. 1988; Michalowicz et al.
1991) have reported that SE did not remove lignin but induced a redistribution of lignin
as a result of melting and agglomeration due to surface tension effects generated during
the SE treatment. However, other authors (Excoffier et al. 1991) have reported that lignin
softens under the heat and slowly depolymerizes, causing the solubilization of a small
part of the original lignin. Thus, Table 2 shows that the percentage of Klason lignin
remaining in the solid (compared to the original amount in the raw material) decreased
when the severity of the treatment increased. This lignin solubilization agrees with the
increase in acetone extractive above mentioned.
Table 2. Steam Explosion Yield and % of Holocellulose and Klason Lignin

Remained in the Solid after the SE Treatment, Compared to Raw Material (C1)
Steam % Holocellulose % Klason lignin
Sample
explosion Yield remained remained
C1 100 100 100
C2 99.9 100 96.2
NH-5 94.6 80.0 97.2
H-5 94.8 81.3 100
NH-10 93.8 81.9 96.6
H-10 85.5 71.0 86.5
NH-5+3 90.4 78.4 89.7
H-5+3 88.1 74.8 86.9
NH-10+3 87.6 74.9 87.9
H-10+3 79.7 69.8 81.8
Water Retention Capacity

The hydration capacity of the steam-exploded chips during a time interval gave
evidence of changes in the internal structure of the material and the macro-structural
effects of the different SE treatments. As shown in Fig. 3, there was a significant increase
in the water retention capacity of all samples after SE, both in non-hydrated and hydrated

samples. This effect was more pronounced for more intense treatments: two cycles or
longer durations.
300
g water adsorbed / 100 g wood without previous hydration
250 with previous hydration
200
150
100
50
0
0 5 10 5+3 10+3
Time of treatment, min.
Fig. 3.Water retention capacity
Longer treatments enabled a higher amount of saturated steam to penetrate into

the chips, and so decompression resulted in a more intense defibration of the chips. Two
cycles of SE also increased the internal rupture of wood, and its effect was even more
outstanding than that of extending the treatment. The consequence, in both cases, was an
improved capacity of the eucalyptus chips to retain water because there was more
available surface inside them.
An increase in water retention was also observed when the chips were hydrated
before SE. Previous hydration replaced air by water inside the wood chips. It is supposed
that, in non-hydrated wood chips, occluded air partially prevents steam penetration into
the material. As a result, decompression brings about a less intense decomposition in
non-hydrated chips, which consequently, show lower water retention. Pre-hydration is
also likely to have caused a removal of extractives, making steam penetration easier and
increasing the hydrophilicity of the material.
Since the increase in water retention capacity is a consequence of the opening of
new spaces within the material, SE can be used either to improve the accessibility of
chemicals in kraft pulping, as previously reported (Martin-Sampedro et al. 2011a), or, as
some postulate (Ruiz et al. 2008), to facilitate enzyme penetration into the lignocellulose,
in the biorefinery concept. In this last scenario, a more detailed description of the size and
distribution of new pores in the wood will be needed to estimate the probability of
enzyme penetration (see next section).
Structural Properties
A structural characterization, assessing the changes in the porous network and the
surface configuration of the material, was developed as part of our research. This part of
our study was intended to reveal structural modifications in the treated material that
might be related with changes in the pore size distribution and accessible surface. As the

accessibility of the material to penetration of chemical reagents and enzymes can be
directly related with the effectiveness of the chemical or biological processes, these
structural changes would have a great relevance.
The results showed a heterogeneous and broad band of relative pore volumes,
with pore size diameters ranging from 20 to 100 micrometers (data not shown) that would
correspond to the lumen space of the cell and vessels.
0,050 0,050
a C1 b C1
NH-5 NH-5+3
Relative vol, mLg-1

0,040 NH-10 0,040
Relative vol, mLg-1
NH-10+3
0,030 0,030
0,020 0,020
0,010 0,010
0,000 0,000
10,00 100,00 1000,00 10000,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00
Pore size diameter, nm Pore size diameter, nm
0,050 0,050
c C2 d C2
H-5 H-5+3
H-10+3
Relative vol, mLg-1
0,040 H-10 0,040

Relative vol, mLg-1
0,030 0,030
0,020 0,020
0,010 0,010
0,000 0,000
10,00 100,00 1000,00 10000,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00
Fig. 4.Relative pore volume versus pore size diameter. Samples without previous hydration (NH)
(a and b), samples previously hydrated (H) (c and d). C1 and C2 indicate control without and with
precious hydration respectively. The numbers after NH or H indicate the duration of the cycles in
minutes.
Figure 4 shows changes in relative pore volume (mL g-1) versus pore diameter of
samples without previous hydration, and with one (Fig. 4a) and two cycles (Fig. 4b) of
SE. It should be noted that the control is a unique sample in both figures, and that it
exhibits a band with a maximum ca. 33 nm. This broad band included the greater pore
volume of the control sample and ranged from 10 to 200 nm of pore diameter. The
control also showed a lower peak, between 3 and 4 µm, which corresponds to bigger but
less abundant pores. In the two samples treated with one cycle of SE (5 and 10 minutes),
there was a significant displacement of the band to greater pore size diameters. In this
pore size diameter range, the 10 minute treatment produced the biggest pore volume. The
addition of a second cycle generated pores with diameters between 3-4 and 6 µm. Again,

the biggest pore volume in this range resulted from the longest treatment. The structural
analysis of previously hydrated samples (Figs. 4c and 4d) showed also a significant
displacement of the pore volume band from a smaller pore size to a greater pore diameter.
In comparison to the non-hydrated control, the hydrated control sample reveals an
additional band around 300 nm. These pores would have been produced during pre-
hydration of the sample, caused by solubilization of some wood components in water
(Romero et al. 1992). This new type of pores is related to the greater effect that SE has on
hydrated samples, as penetration of steam into these newly formed pores leads to the
formation of bigger pores than those originated when there is no previous hydration.
0,70
Specific volume, mLg-1
a Without previous hydration

0,60 With previous hydration
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0 5 10 5+3 10+3
0,70
Specific volume, mLg-1
Without previous hydration

0,60 b With previous hydration
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0 5 10 5+3 10+3
Fig. 5.Mesopore (a) and macropore (b) specific volume for every sample
These results revealed a redistribution of the pore network in the treated material,
with a decrease of volume of small pores and an increase of volume of bigger pores.
Since there was not an increase of the total pore volume in the pore size range between
10 and 10,000 nm (data not shown), these results can be explained by assuming the
formation of pores of longer diameters derived from small pores. This can be observed in
Fig. 5, which shows the mesopore (pore diameter: 7-50 nm) and macropore (pore
diameter: 50-10,000 nm) specific volume (mL g-1) for every sample analyzed. The results
reveal a clear decrease of the mesopore relative volume in all treated samples, both
previously hydrated and non-previously hydrated (Fig. 5a). The relative volume of
macropores (Fig. 5b) increased in all treated samples, except for those exposed to the
mildest SE. In these cases (1 only cycle of 5 minutes), the results were similar to those
obtained with the control samples. These results confirm the possibility that there is a
reorganization of the pore network rather than creation of new pore volume, in this pore
size range. Thus, we may conclude that there is a global positive effect of SE on the

formation of new bigger sized pores that improves the accessibility of chemical reactants
and enzymes to the wood chips.
Considering the fact that the analysis of the hydration capacity (Fig. 3) revealed
greater water absorption conferred by SE, and taking into account that there is no
significant increase of the total pore volume in the diameter range studied here, it is
reasonable to conclude that there must be a direct relationship between the new pore
matrix of the material and the kinetics of water penetration. The increase in water
retention/hydration capacity of the exploded samples indicates that water absorption lasts
long enough (6 hours) for water to fill the new bigger pores formed. In the control
samples, this phase is not long enough for water to penetrate into the smaller pores,
which manifests itself as a clear difference between control and treated samples.
7,0 7,0
a C1 b C1
6,0 NH-5 Relative surface, m 2g-1 6,0 NH-5+3
Relative surface, m 2g-1
NH-10 NH-10+3
5,0 5,0
4,0 4,0
3,0 3,0
2,0 2,0
1,0 1,0
0,0 0,0
10 100 1000 10000 10 100 1000 10000
7,0 7,0
c C2 d C2
6,0 H-5 6,0 H-5+3

H-10
H-10+3
5,0 5,0
4,0 4,0
3,0 3,0
2,0 2,0
1,0 1,0
0,0 0,0
10 100 1000 10000 10 100 1000 10000
Fig. 6.Relative surface versus pore size diameter. Samples without previous hydration (NH) (a
and b), samples previously hydrated (H) (c and d). C1 and C2 indicate control without and with
precious hydration respectively. The numbers after NH or H indicate the duration of the cycles in
minutes.
The relation between pore size and accessible surface was also evaluated in order
to get clear knowledge of the cost, in terms of surface, posed by the formation of bigger
pores derived from smaller pores. In Fig. 6 the relative surface area (m2 g-1) has been
plotted versus pore size diameter (nm) for every sample tested. When the pore diameter
ranged between 10 and 100 nm, there was a clear decrease in the relative surface in all
the treated samples, which corresponds to the disappearance of small pores in these

samples, as it has been explained above. These results correlated with those shown in
Figs. 4 and 5 and confirm the decrease in the relative pore volume for pore size diameters
between 10 and 100 nm.
Formation of macropores within the pore size diameter range from 100 to 1000
nm produced only a slight increase of relative surface area, as the ratio surface/volume
decreases as pore volume increases. Therefore the relative surface area decreased
significantly in all treated samples when the pore size diameter was within the 10 to
10,000 nm range. A direct consequence of these results may be in relation to the balance
between greater accessibility of the newly created pore network and the reduction of
surface accessible to the subsequent attack of chemical reagents or macromolecules such
as enzymes. Depending on the nature of the reaction or process that the material would be
subjected to, the porosity and surface changes would have a different effect.
CONCLUSIONS
1. Steam explosion is an appropriate alternative treatment in the fractionation of E.

globulus wood for different applications, as it produces modifications that could
enhance subsequent processes.
2. An increase in acetone and hot water extractives (between 1.0-6.2% and 3.6-7.1%,
respectively), and a decrease in holocellulose content (9.4-15.6%), were observed
after SE. However, there was only a minor variation of the relative Klason lignin
content when comparing the composition of samples before and after steam explosion
treatment.
3. Results of studying the water retention capacity, the relative porosity, and the relative
surface suggest that the wood structure was redistributed, resulting in a decrease of
the volume of mesopores and an increase of macropores in the exploded samples.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors wish to thank the Spanish Ministry of Science and Innovation for
funding this study via Projects CTQ 2006-00385 and CTQ 2009-11268, the “Ramón y
Cajal” Programme, and the FPI fellowship (BES2007 – 14528).
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Article submitted: September 4, 2011; Peer review completed: October 5, 2011; Revised
version received and accepted: October 14, 2011; Published: October 18, 2011.

PUBLICACIÓN II:
Lignin changes after steam explosion and laccase-mediator treatment of
eucalyptus wood chips.
Martín-Sampedro, R., Capanema, E.A., Hoeger, I.C., Villar, J.C., Rojas, O.J.
Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2011. 59(16): 8761-8769
187
ARTICLE
pubs.acs.org/JAFC
Lignin Changes after Steam Explosion and Laccase-Mediator

Treatment of Eucalyptus Wood Chips
Raquel Martin-Sampedro,† Ewellyn A. Capanema,§ Ingrid Hoeger,§ Juan C. Villar,† and Orlando J. Rojas*,§,#
†
Laboratorios de Celulosa y Papel, Instituto Nacional de Investigacion y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA),
Carretera de la Coru~
na, km 7.5, 28040 Madrid, Spain
§
Department of Forest Biomaterials, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, 27695-8005, United States
#
Faculty of Chemistry and Materials Sciences, Aalto University, FI-02015 Espoo, Finland
ABSTRACT: Eucalyptus globulus chips were steam exploded followed by treatment with a laccase-mediator system (LMS) under
different experimental conditions. Removal of hemicelluloses and, to a lesser extent, lignin was observed. Thermogravimetic
analyses of whole meal obtained from chips before and after steam explosion indicated an increase in lignin degradation temperature
due to lignin condensation. In contrast, application of LMS treatment caused a reduction in lignin and polysaccharide degradation
temperatures. Lignins were isolated from wood samples before and after each treatment and analyzed by 2D NMR and 13C NMR.
An increase in carboxyl and phenolic hydroxyl groups and a significant decrease in β-O-4 structures were found in steam-exploded
samples. The most relevant changes observed after laccase treatment were increased secondary OH and degree of condensation.
KEYWORDS: Eucalyptus globulus, steam explosion, laccase-mediator system, thermogravimetric analyses (TGA), milled wood
lignin (MWL), 2D NMR, HSQC, quantitative 13C NMR, lignin thermal properties, lignin chemistry
’ INTRODUCTION content of β-O-4 structures due to depolymerization reactions and

In steam explosion, biomass is subjected to high-pressure an increase in the content of CC condensed structures have been
steam followed by a rapid decompression, which forces the observed.6,7,13 Furthermore, Li et al.13 reported an increase in
fibrous material to “explode” into component fibers and fiber the average molecular weight and a more heterogeneous lignin
bundles. Therefore, steam explosion is effective in opening up structure with the severity of the steam explosion conditions. Such
biomass structure and increases chemical reactivity for further observations were explained by lignin condensation reactions.
The effect of steam explosion on the structure of lignin in
operations.1 Steam explosion has also been proposed as a pre-
wood, its properties, and tolerance for downstream delignifica-
treatment method to enhance the susceptibility of cellulose fibers
tion are subjects that have been addressed in the literature.
to enzymatic hydrolysis to produce fermentable sugars 2,3 and to
However, systematic studies are still needed to elucidate the
assist in the fractionation of its components.4,5
effect of wood species, steam explosion severity, method of lignin
When no other chemicals are added to the process, the main
isolation, etc. Most of the published results have been obtained
reaction that takes place is an autohydrolysis of the ether bonds
from alkali-extracted lignins, and data on the structure of the
present in polysaccharides and lignin. The high-temperature residual lignin are limited. Therefore, the aim of this work is to
steam leads to the release of acetic acid from wood components, elucidate the relationship between the intensity of the steam
which catalyze hydrolytic reactions of constituent polymers. These explosion process and key structural features of MWL lignin from
reactions result in a loss of hemicelluloses and amorphous cellulose Eucalyptus globulus, as well as the susceptibility of the exploded
and decrease the amount of β-O-4 structure in lignin.69 material to enzymatic oxidation by laccases. Related research
During steam explosion and other related processes, lignin is questions are relevant when the use of steam explosion assisted
one of the most recalcitrant polymers present. Lignin is a with enzymatic treatment is considered as a choice for effective
macromolecule containing aromatic and aliphatic moieties. De- transformation of lignocellulosics in biorefinery or biopulping
spite extensive investigations, the structure of lignin, especially platforms. For instance, in the production of bioethanol, the
that in hardwoods, is not completely understood. Lignin isola- laccase-mediator system (LMS) treatment has been used to
tion from wood and further structural characterization is usually remove inhibiting compounds.14,15 In paper production, LMS
difficult because it is covalently linked to carbohydrates, forming treatments between steam explosion and kraft pulping increase
a complex lignincarbohydrate network.10,11 Bj€orkman12 used the delignification rate,16 even when applied on substrates with
aqueous dioxane solvent to obtain a milled wood lignin (MWL), high lignin content.
which has been used as a reference for native lignin. In general, As such, changes in the structure of lignin isolated from
the most common techniques for lignin isolation are based on E. globulus chips were analyzed by 2D NMR and 13C NMR
extraction of ball-milled wood by neutral solvents.
Changes occurring in MWL from aspen, birch, and pine after Received: April 21, 2011
steam explosion have been studied by nuclear magnetic resonance Revised: July 9, 2011
(NMR), thioacidolysis, size exclusion chromatography (SEC), Accepted: July 12, 2011
nitrobenzene oxidation, and other techniques. A reduction in the Published: July 12, 2011
r 2011 American Chemical Society 8761 dx.doi.org/10.1021/jf201605f | J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 8761–8769
Journal of Agricultural and Food Chemistry ARTICLE
before and after steam explosion. Also, changes in lignin after Table 1. Summary of Conditions Used in Steam Explosion of
laccase treatment were investigated to elucidate the impact of Eucalyptus globulus Chips
steam explosion in downstream enzymatic treatments. Finally,
thermogravimetric analyses (TGA) were carried out on whole residence time during
meal biomass before and after steam explosion and enzyme steam explosion (min)
treatment to determine the effects of process conditions on the
water soaking prior to
thermal properties of the lignocellulosic material.
steam explosion severity
’ MATERIALS AND METHODS sample (16 h, 25 °C) cycle 1 cycle 2 factor (S0)
All of the chemicals used were of reagent grade and were obtained control no
from Sigma-Aldrich. SE1 no 5 3.14
Wood chips of E. globulus were kindly supplied by La Monta~ nanesa SE10 yes 5 3.14
pulp mill (Torraspapel group, Spain). The laccase used in enzymatic SE2 no 10 3.44
treatments (Novozym 51003) was supplied as a donation by Novo- SE20 yes 10 3.44
zymes (Bagsvaerd, Denmark).
SE3 no 5 3 3.35
Steam Explosion Treatment. The E. globulus chips were dried
and homogenized at room temperature for 2 weeks, and the moisture SE30 yes 5 3 3.35
content was determined (ISO 638). The size of the chips was around SE4 no 10 3 3.56
2 3 0.5 cm. Before the steam explosion treatment, the chips were SE40 yes 10 3 3.56
separated into eight 500 g batches. Four of them were immersed in SE40 +laccase a yes 10 3 3.56
distilled water during 16 h at 25 °C; the others were kept at room SE40 +control-L b yes 10 3 3.56
temperature. These two types of samples were used to evaluate the effect
of impregnation on the subsequent steam explosion treatment. The a
SE40 +laccase, same as SE40 but included a treatment of the chips
steam explosion treatment was performed in a 26 L stainless steel vessel after the second cycle of steam explosion with laccase-mediator system.
by charging steam to operation temperature and pressure of 183 °C and b
SE40 +control-L, a control sample after same treatment used in SE40
10 kg-f/cm2, respectively. After these conditions had been reached +laccase but with no laccase-mediator system added.
(typically within 3 min after steam injection), variable residence times
were applied. At the end of the steam treatment, the pressure was the isolation of MWL is shown schematically in Figure 1. Briefly, chips
reduced to 6 kg-f/cm2, and then the chips were discharged into an were ground to pass a 20 mesh screen in a Wiley mill and extracted with
expansion (blowing) tank at atmospheric pressure. After discharging, the an ethanol/toluene mixture 1:2 (v/v). The extractive-free wood meal
chips were washed with water. The steam explosion factors evaluated in was submitted to an alkaline extraction mainly to remove tannins. The
this work included the use of preimpregnation of wood chips in water, obtained extracted wood was then thoroughly washed until pH-neutral,
the number of steam explosion cycles (one or two), and the time dried under vacuum, and subjected to ball-milling in a planetary ball mill
employed during the first cycle (5 or 10 min). Table 1 summarizes the (Fritsch Planetary Mill P7). The resulting wood residue was extracted
conditions used and the nomenclature used thereafter to indicate the with dioxane/water solution (96:4) during 72 h. The dioxane extracts
respective steam-exploded (SE) samples. were combined and concentrated under vacuum. The extracted MWL
The severity factor, S0, for each treatment was calculated according to was dried under vacuum and stored in a desiccator for further analyses.
eq 1 defined by Overend and Chornet17 as a function of the temperature The liquor from the alkali extraction was acidified at pH 2 by adding
(T, °C) and the duration of the treatment (t, min). H2SO4 and the precipitated lignin recovered by filtration, water-washed
S0 ¼ logðeT100=14:75 tÞ ð1Þ until pH-neutral, air-dried, and stored for further analyses.
The milling time and intensity (as given by the number of balls per
Enzymatic Treatment. The steam-exploded sample denoted SE40 gram of sample) were adjusted to obtain yields between 30 and 50%.
was treated with a laccase-mediator system. Enzyme treatment was This was done to ensure MWL samples that could be taken as close as
performed in 500 mL flasks with air bubbling placed in a temperature- possible to the native lignin.11 Also, processing the material to a similar
controlled shaker operating at 100 rev/min. The LMS consisted of the isolation yield facilitates a better comparison between different samples.
laccase enzyme (30 U of laccase per gram of dry SE wood) and HBT Acetylation of the MWL, for NMR analysis, was carried out according to
(5 mM), which was used as mediator. The temperature, time, and pH of a procedure reported earlier by Capanema et al.19
treatment were 70 °C, 30 min, and 6 (100 mM phosphate buffer), Carbohydrate Composition and Klason Lignin. The carbo-
respectively. The final concentration of the substrate (steam-exploded hydrate composition was determined by high-performance liquid chro-
chips) was 7% (w/v). Here, 1 U of laccase is defined as the amount of matography (HPLC) analyses after acid hydrolysis of the wood
laccase required to convert 1 μmol/min of ABTS to its cationic radical samples.20 The equipment used consisted of an Agilent Technology
(0.1 M phosphate buffer, pH 6, at 24 °C). A control experiment with no 1200 series RID with an Aminex HPX-87H column operated at 50 °C
LMS was carried out (sample SE40 +control-L). with a mobile phase consisting of 5 mM sulfuric acid pumped at a rate of
Thermogravimetric Analysis. TGA of wood meal samples 0.6 mL/min. Klason lignin content in the wood samples and solid
(ground to pass a 20 mesh screen) were conducted in a TA Instruments fractions obtained during the isolation procedure (see Figure 1) were
model Q-500. Fifteen milligrams of the respective sample were used, and determined according to TAPPI T222 om-88 standard.
the thermograms were obtained by ramping the temperature from 30 to NMR Analyses. NMR spectra were recorded on a Bruker Avance
600 °C at a heating rate of 10 °C/min. An air atmosphere was 300 MHz spectrometer at 25 °C using DMSO-d6 as the solvent under
maintained at 60 mL/min flow rate. conditions optimized and reported earlier.19,21 Chemical shifts were
Isolation of Milled Wood Lignin. A modified MWL isolation referenced to TMS (0.0 ppm). Heteronuclear single-quantum coher-
procedure18 was used to isolate lignin from E. globulus wood. The same ence (HSQC) analysis was performed with a 5% solution of lignin by
procedure was employed in the isolation of lignin from wood after steam applying a 90° pulse width, a 512 ms acquisition time, a 1.2 s pulse delay,
explosion and enzymatic treatments. The detailed procedure followed in and 1JCH of 147 Hz. For the quantitative 13C NMR, the concentration
8762 dx.doi.org/10.1021/jf201605f |J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 8761–8769

Figure 1. Schematic block diagram of milled wood lignin isolation indicating main analyses performed such as Klason lignin, TGA, 2D and 13C NMR
(ovals), and samples with respective nomenclature (squares).
of lignin was ∼20%; a 90° pulse width, 1.4 s acquisition time, and 1.7 s weight and/or crystallinity, the lower the temperature for poly-
relaxation delay were used. Chromium(III) acetylacetonate (0.01 M) mer degradation.24 Therefore, the observed increase in lignin
was added to the lignin solutions to provide complete relaxation of all degradation temperature suggests possible condensation reac-
nuclei. A total of 20000 scans were collected. A quantitative 1H NMR tions during steam explosion. Furthermore, a shoulder around
spectrum of acetylated MWL was recorded at a lignin concentration 280 °C was observed in the control sample (untreated wood).
of ∼20% in DMSO, with a 90° pulse width and a 1.3 s acquisition time. This shoulder can be attributed to the degradation of xylans,
which are the main hemicelluloses in the hardwood considered in
’ RESULTS AND DISCUSSION this study25 but are extensively reduced upon steam explosion.13
This observation was corroborated by carbohydrate analyses of
Thermal Properties. Themogravimetric analyses were used related samples that showed a progressive reduction of xylans in
to characterize the different wood chip samples. The analysis was the exploded samples (see Table 2). A reduction of the amount
based on the fact that each of the fiber cell wall polymers has a of lignin was also observed upon steam explosion treatment.
distinctive degradation temperature and rate of energy release The degradation temperatures attributed to polysaccharides
upon thermal breaking and combustion. During TGA the and lignin after the different steam explosion treatments are
lignocellulosic samples were kept under air atmosphere, and shown in Figure 2B. It can be observed that after steam explosion
two main temperature ranges of degradation were observed, the degradation temperature corresponding to polysaccharides
250350 and 400500 °C. These are attributed to degradation remained approximately constant, at about 333 °C, whereas the
of polysaccharides and lignin, respectively.22 Relative to cellulose temperature for lignin degradation increased with the severity of
and hemicelluloses, which are aliphatic structures, the higher the treatment. For instance, compared with steam explosion in a
degradation temperature for lignin is ascribed to its aromatic single cycle, two cycles raised the lignin degradation temperature
structure. For hemicelluloses and cellulose two consecutive (see data for SE1SE3, SE10 SE30 , SE2SE4, or SE20 SE40
processes have been determined during biomass combustion. pairs). Except for sample pair SE3SE4, the same observation
The first one corresponds to a thermal decomposition (volatili- applies when the residence time during steam treatment was
zation) that produces volatiles and char. The second reaction increased (see data for SE1SE2, SE10 SE20 , and SE30 SE40
involves char oxidation in the presence of oxygen. Volatilization pairs). The higher TGA degradation temperature observed with
and oxidation of lignin-derived char are considered to be con- the number of cycles or with the residence time is hypothesized to be
current processes.23 the result of lignin condensation. It is also possible that the strong
TGA spectra for samples before (control) and after the most conditions used during steam explosion may promote removal of
intense steam explosion treatment (SE40 ) were analyzed, and the carbohydrates linked to lignin (lignincarbohydrate complexes,
first derivate of the thermograms is shown in Figure 2A. Shifts in LCC), as has been reported by others.13 This hypothesis is supported
degradation temperature were taken as indirect indication of by the decrease in intensity of the NMR signal at 81.25/5.1
collective changes that occurred in wood components during ppm assigned to benzyl ether linkages between lignin and xylan.26
steam explosion. After steam explosion, an increase by 20 °C in Laccase treatment of chips after steam explosion under the
the second degradation temperature (at about 490 °C), corre- most severe conditions (sample SE40 +laccase) changed further
sponding to lignin, was observed, whereas the degradation the respective degradation temperatures of the polysaccharides
temperature for polysaccharides (at about 330 °C) remained and lignin, as observed in Figure 3. In fact, a reduction in the
approximately constant. Generally, the lower the molecular degradation temperature by 19 and 31 °C for lignin and
Figure 2. (A) Thermal properties of steam-exploded samples: first derivate of thermograms of Eucalyptus globulus wood before (control sample, black
profile) and after steam explosion under conditions denoted S40 in Table 1 (gray profile). (B) Lignin and polysaccharide degradation temperatures for
the control and steam-exploded samples.
Table 2. Lignin, Glucan, Xylan, Arabinan, and Acetyl Group

Content in Exploded Wood Samples, Calculated as the
Relative Percent Amount of Each Compound Relative to the
Amount in the Original Wood Sample (Control)
% lignin % glucan % xylan % arabinan % acetyl groups
control 100 100 100 100 100

SE1 88 100 91 38 81
SE10 88 100 94 42 82
SE2 90 100 91 41 79
SE20 80 100 57 14 40
SE3 88 100 82 14 70
SE30 86 100 66 9 64
SE4 83 100 76 20 89
SE40 81 96 53 7 77
SE40 +laccase 74 93 46 5 32
SE40 +control-L 75 97 43 6 31 Figure 3. Polysaccharide and lignin degradation temperatures for
samples before and after steam explosion and after laccase-mediator
treatment (see Table 1 for nomenclature).
polysaccharide fractions, respectively, was observed after enzyme
treatment of the steam-exploded substrates (compare data for
SE40 and SE40 +laccase). Importantly, these changes cannot be related to changes that occurred in the molecular structure
ascribed to a change in composition due to the addition of the and/or bonding features of lignin and cellulose due to relatively
enzyme because no significant differences were observed when a high temperatures (70 °C) and the presence of oxygen (air
control sample (with no laccase and no mediator, SE40 +control-L) bubbling); for example, depolymerization reactions were possi-
and the laccase-treated sample (SE40 +laccase) were compared. ble. However, another plausible explanation is that during
Thus, it is possible that the shifts in degradation temperature are enzyme treatment some low molecular weight lignin fractions
Table 3. Weight and Lignin Content of Residues Obtained in

the MWL Isolation Procedure (See also Figure 1 for the
Nomenclature Used)
control SE40 SE40 +laccase
R0 yield (%) 100.0 100.0 100.0

Klason lignin (%) 21.1 23.8 22.5
acid-soluble lignin (%) 2.5 1.7 1.5
total lignin content relative to R0 23.6 25.5 24.0
S1 extractives % 2.7 9.6 4.5
R1 yield (%) respect R0 97.3 90.4 93.3

Klason lignin (%) 20.3 20.1 20.8
lignin yield (%) relative to lignin R0 93.6 76.5 88.3
ASL yield % relative to R0 2.3 6.9 6.0

yield % relative to lignin content R0 9.6 26.9 25.0
R2 yield (%) relative to R0 89.1 70.3 87.9

Klason lignin (%) 20.4 16.8 15.9
lignin yield (%) relative to lignin R0 84.8 49.7 62.6
Figure 4. HSQC spectrum of MWL from Eucalyptus globulus with the
MWL yield % relative to lignin content R2 40.5 44.8 42.4 respective lignin structures indicated in the upper panel.
yield % relative to lignin content R0 34.3 22.2 26.5
resulted in an appreciable delignification of steam-exploded
and/or small lignin fragments attached to carbohydrates were aspen.9,27 Robert et al.27 and Lora and Wayman 28 have reported
solubilized in the aqueous solution. This would imply not only a that most of the lignin in steam-exploded aspen can subsequently
decrease in the degree of polymerization (DP) of the carbohy- be removed either by extraction with an organic solvent, such as
drates but also the loss of some lignin, which all together can ethanol, acetone, or dioxane, or by extraction with aqueous alkali.
cause a reduction in the degradation temperature. However, in the present case the degree of delignification after
Isolation of MWL. Lignin was isolated from the untreated alkali extraction was comparatively lower than that observed in
wood chips (before steam explosion), after the most intense these studies (26.9 vs 98%). Such a difference can be explained by
steam explosion treatment (SE40 ), and from a sample subjected the fact that milder steam explosion conditions were used in the
to the same steam explosion followed by application of a LMS. present study (severity factor of 3.56 vs 4.32). Finally, it is worth
The optimization of the milling process that led to the selection mentioning that lignin from aspen, used in the cited references,
of conditions to obtain similar yields, as explained under Materi- was found to be the most readily extractable compared with
als and Methods, indicated that steam-exploded wood chips lignin from other hardwoods and also from softwoods.28,29
(sample SE40 ) required more intensive milling compared to the The ASL yield and extractive percentage for the SE40 +laccase
original wood. On the other hand, a less intense milling was sample were higher than those for the control sample, but lower
required in the case of the sample obtained after treatment with than those for sample SE40 . This fact could be due to the removal
LMS (SE40 +laccase). Under the hypothesis that noncondensed of lignin during laccase-mediator treatment, as Table 2 indicates
lignin is more easily removed in isolation procedure, the results (7% lignin reduction with respect to control sample).
just described for the milling intensity are in support of the TGA NMR Analysis. 2D NMR spectra of isolated lignin from
that suggested that steam explosion produced lignin condensa- E. globulus before and after steam explosion, and also after steam
tion reactions. On the other hand, laccase treatment was explosion and laccase treatment, are shown in Figures 4, 5, and 6,
expected to mainly cause some depolymerization reactions that respectively, and their signal assignments were made according
could reduce the milling intensity required compared to SE40 to previous studies.19,21
sample. A wide variety of saturated aliphatic moieties with chemical
After steam explosion of the wood chips the amount of organic shifts of about δH 0.8 and δH 1.21.3 was observed in the
extractives and alkali-soluble lignin (ASL in Figure 1 and Table 3) HSQC spectrum. They corresponded to extractives, which were
increased. Furthermore, the total lignin content with respect to likely chemically bonded to lignin.30 The cross-signal in the lower
the original sample (R0) after each extraction was lower for field (δH 1.52.5 and δC 2043) corresponded to aliphatic
samples after steam explosion than for untreated samples. This groups neighboring alkene and oxygen-containing groups such as
observation is in support of conclusions from other studies that alcohol, carbonyl, and ethers. Furthermore, some minor lignin
indicated that aqueous alkaline or organic solvent extraction structures, such as ArCOCH2CH2OH type moieties and
Figure 5. HSQC spectrum of isolated lignin from Eucalyptus globulus after steam explosion treatment (SE40 ) (a). The detailed oxygenated aliphatic
region is included in panel b.
dihydroferulic acid type units (ArCH2CH2COOH), were amounts of β-O-40 and β-β0 structures decreased after steam
identified on the basis of the reported chemical shifts. Weak explosion treatment (Table 4).
signals of dihydrocinnamyl alcohol type units (ArCH2 The cross-peak at δC/ δH 83.5/5.28 was assigned to β-CH in
CH2CH2OH) (I) were detected in MWL from control β-O-40 moieties of S-type with R-carbonyl groups according to
E. globulus wood, but not in lignin isolated from E. globulus after Capanema et al.21 The signals of the γ-CH in coniferyl alcohol
steam explosion and laccase treatments. type units were observed at 61.9/4.12 ppm. These signals were
In the oxygenated aliphatic region, the signals of the major observed in the three isolated lignins.
structures of native lignin such as (β-O-40 ) (A), phenylcoumaran Weak signals of spirodienone structures (F) were observed in
(β-50 ) (D), and pino/syringyresinol (β-β0 ) (E) were observed in the HSQC spectrum of the MWL from control E. globulus wood.
the three studied lignins (Figures 4, 5, and 6), although the The signals at 79.5/4.12 and 81.2/5.1 ppm were assigned to
Figure 6. HSQC spectrum of isolated lignin from Eucalyptus globulus after steam explosion and laccase-mediator treatment (SE40 +laccase sample)
(a). The detailed oxygenated aliphatic region is included in panel b.
β0 -CH in the second side chain in the spirodienone and R-CH In the aromatic region, a predominance of syringyl (S) over
in spirodienone plus lignin xylan moieties, respectively.21,26 guaiacyl (G) units was observed in the three lignins studied,
These signals were very weak or even disappeared in lignin which is in concordance with the high proportion of S units in
isolated from wood after steam explosion and steam explosion hardwood.
plus laccase treatment. Comparison of 2D NMR spectra before and after steam
The oxygenated aliphatic region also contained cross-signals explosion followed or not by laccase-mediator treatment
for xylans and other polysaccharides (δC/ δH 6375/3.23.8) made it evident that lignin preparation isolated from SE40 and
less abundant in MWL from control E. globulus wood than in the SE40 +laccase had higher sugar content than lignin isolated from
other lignins analyzed. Lignin carbohydrate linkages were re- original wood at the same yield, as observed in the oxygenated
vealed by cross-signals for some β-O-40 substructures that are aliphatic region (Figures 4, 5b, and 6b). Additionally, 2D NMR
R-C or γ-C-etherified with carbohydrates (J).31 spectra qualitatively indicated a very similar observation. Similar
Table 4. 13C NMR Data of the Most Important Lignin condensed lignin structures. However, it should be noted that
Functionalities (per 100 Ar Units) milled wood samples and not isolated lignin was used in TGA
measurements. Therefore, indirect and collective effects of lignin
isolated lignin COOR OHpra OHseca OHph β-O-4 OMe S/G DC
and other components are factored in the thermal analyses
original (control) 5 69 57 23 64 177 3.2 13 (structural changes). These results indicate a decrease in lignin
SE40 16 66 54 47 36 170 3.1 14 molecular weight during steam explosion followed by laccase-
SE40 +laccase 17 63 70 53 36 161 3.0 19 mediator treatment. This is also supported by the observed
a
Includes sugar OH groups. higher extractives yield and ASL yield (Table 3) compared to the
control sample; also, the lignin isolated from steam-exploded
samples had a more condensed structure.
results were found by Balakshin et al.30 and Ibarra et al.,31 who The amount of methoxyl groups (OMe) was reduced from
studied the residual lignin after LMS-E treatment and found the 1.77/Ar to 1.70/Ar after steam explosion treatment and from
HSQC NMR spectra very similar to those of the original residual 1.70/Ar to 1.61/Ar after a subsequent laccase treatment. A
kraft lignin. They ascribed their observations to a removal of the similar reduction in methoxyl groups has been observed by Chua
altered lignin from the pulp during the alkaline extraction, and Wayman.29
subsequent to the LMS treatment; the residual lignin that A slight reduction in S/G ratio was observed after steam
remained in the pulp did not undergo substantial changes. In explosion treatment and also after laccase-mediator treatment.
our case, the oxidized lignin could be removed during the alkali Chua and Wayman29 explained this reduction in S/G ratio
extraction performed in the lignin isolation procedure used to during mild steam explosion condition as being due to an initial
remove tannins. preferential removal of syringyl to guaiacyl units at short auto-
A quantitative study based on 13C NMR was carried out. The hydrolysis times. The decrase in S/G ratio after laccase-mediator
quantification of the most important lignin functionalities is treatment was also observed by Ibarra et al.31
indicated in Table 4. The calculations were performed according
to the method suggested by Capanema et al.21 ’ AUTHOR INFORMATION
The amount of aliphatic and conjugated COOH groups
estimated from the spectrum of the nonacetylated MWL from Corresponding Author
control E. globulus was found similar to that previously *E-mail: [email protected]. Phone: (919) 513-7464. Fax: (919)
reported.32 However, when wood was subjected to steam explo- 515-6302.
sion, the amount of carboxyl groups increased significantly. Funding Sources
The amount of primary hydroxyl groups observed in SE40 and Financial support from the Spanish Ministry of Science and Innova-
SE40 +laccase lignin was slightly lower than in the lignin isolated tion (FPI fellowship BES2007-14528) is gratefully acknowledged.
from original milled E. globulus wood. However, the amount of
secondary OH increased significantly after the laccase treatment.
In addition, the quantity of phenolic OH increased significantly ’ ACKNOWLEDGMENT
after the steam explosion treatment, which agrees with results We thank Professor M. J. Diaz of Universidad de Huelva
found by other authors.27,33 (Spain) for assistance with HPLC carbohydrate analyses. We
The total amount of β-O-4 structures was significantly re- acknowledge the contributions of Prof. F. Somolinos of Universidad
duced after steam explosion treatment, which was in agreement Complutense de Madrid (Spain).
with other papers.6,7,13 It is well-known that steam explosion
carried out only in the presence of steam is an autohydrolytic ’ ABBREVIATIONS USED
process catalyzed by the organic acids formed from the acetylated
wood components. The predominant reactions in lignin are MWL, milled wood lignin; NMR, nuclear magnetic resonance;
fragmentation by acidolysis of β-O-4 linkages and polymeriza- SEC, size exclusion chromatography; TGA, thermogravimetric
tion by acid-catalyzed condensation between the aromatic C6 or analyses; SE, steam exploded; LMS, laccase-mediator system; HBT,
C5 and a carbonium ion, normally located at R-C of the side 1-hydroxybenzotriazole; ABTS, 2,20 -azinobis(3-ethylbenzthiazoline-
chain.13 As a result of the substantial cleavage of β-O-4 linkages, 6-sulfonate); HPLC, high-performance liquid chromatography;
the molecular weight of lignin would be expected to decrease DMSO, dimethyl sulfoxide; HSQC, heteronuclear single-quantum
sharply as a result of the steam explosion treatment. However, Li coherence; LMS-E, laccase-mediator system treatment followed by
et al.13 observed a gradual increase in molecular weight with alkaline extraction.
increasing severity of the treatment. Thus, they postulated that
the cleavage of β-O-4 linkages in lignin during the steam ’ REFERENCES
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PUBLICACIÓN III:
Steam explosion and enzymatic treatments as pre-treatments to improve
enzymatic hydrolysis of Eucalyptus globulus.
Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., García, J.C., Lopez, F., Villar, J.C., Diaz, M.J.R.
Manuscrito
199
Steam explosion and enzymatic as pre-treatments to improve enzymatic
hydrolysis of Eucalyptus globulus
Martín-Sampedro, R. a; Eugenio, M.E. a; García, J.C.b; Lopez, F.b, Villar, J.C. a

and
.b*
Diaz, M.J
a
Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria INIA.
Carretera de la Coruña, km 7.5, 28040, Madrid (Spain)
b
Departamento de Ingeniería Química. Universidad de Huelva. Campus el Carmen,
21071, Huelva (Spain)
*Correponding Author: [email protected]. Telephone number: (+34) 959219990; Fax

number: (+34) 959218778
Abstract
Eucalyptus globulus wood chips were subjected to several steam explosion

treatments in order to evaluate the effect of the operational conditions on a subsequent
enzymatic hydrolysis. Steam explosion resulted in the enhancement of the enzymatic
hydrolysis of the solid fraction. A laccase-mediator system (LMS) treatment, prior to
the enzymatic hydrolysis, increased the glucose yield from 24.7 to 27.1 %, probably as
a result of the detoxification of the substrate. However, when xylanase was used to
boost the LMS treatment, the hydrolysis rates did not improve. In order to assess the
total amount of sugars obtainable from E. globulus, the liquid fraction obtained from the
steam explosion was subjected to hydrolysis too. The enzymatic hydrolysis of this
fraction turned out to be more efficient than the acid hydrolysis, breaking down 82.7%
of the xylooligosaccharides into xylose units. An overall yield of 210g of sugars from 1
kg of raw material was achieved.
Keywords
Eucalyptus globulus, steam explosion, enzymatic hydrolysis, laccases, xylanases,

bioethanol production.
201
1. Introduction
Biorefinery is a general concept which refers to an integrated and diversified

processing plant where biomass feedstocks are converted into a wide range of valuable
products, including fuels, power, heat, chemicals and materials [1,2]. Lignocellulosic
materials are considered a renewable resource of biomass to be used in the biorefinery
and to produce ethanol from their sugars. As a preliminary step, these materials are
normally subjected to a pre-treatment that removes physical and chemical impediments
to subsequent steps such as enzymatic hydrolysis and fermentation. These pre-
treatments must improve the formation of sugars, avoid the degradation or loss of
carbohydrates and the formation of inhibitory products and, last but not least, be cost-
effective [3]. Among the different existing pre-treatments, steam explosion is one of the
most commonly used. The steam explosion process entails exposing the lignocellulosic
material to high-pressure steam, followed by a rapid decompression, which forces the
fibrous material to “explode” into separated fibers and fiber bundles [4]. During this
process, the high-temperature steam leads to the release of acids from the acetylated
wood components which catalyze hydrolytic reactions in the wood polymers [5-8].
These autohydrolysis reactions result in a loss of hemicellulose, which is dissolved in
hot water and can be recovered in the liquid fraction to be further converted, as already
mentioned, into value-added products such as ethanol [9].
The main advantages of the steam explosion process are a significantly lower
environmental impact, lower capital investment and less hazardous chemicals released
in the process [10] in comparison with other pre-treatments. However, the degradation
of sugars and lignin during steam explosion is unavoidable, releasing degradation
products which can negatively impact further steps of the process [3,11,12]. To remove
these inhibiting products, several treatments have been assayed, including physical,
chemical and biological methods [13,14]. The application of the enzyme laccase is one
of the new biological methods used to clear inhibitors, as these enzymes are capable of
removing specifically phenolic compounds present in the biomass [15-18]. Moreover,
as the solid fraction resulting from the steam explosion process (exploded chips) shows
a more open structure compared with non-exploded chips [19], laccases have greater
accessibility to the steam exploded chips and the efficacy of the process increases [3,
16, 20-23].
202
Additionally, xylanases are known to enhance the effect of lacasses in some
applications. Thus, Valls and Roncero [24] have observed that, when a xylanase
treatment precedes the laccase treatment in the bleaching of crude eucalyptus kraft
pulps, the amount of residual lignin and hexenuronic acids is smaller than when pulps
are bleached using a laccase step alone.
Whereas a few studies have reported on the use of steam explosion together with
a laccase treatment to improve ethanol production from lignocellulosic materials, none
of them has evaluated the use of a xylanase to boost the laccase effect. Thus, the aim of
our study was not only to evaluate the different fractions obtained after applying steam
explosion and a laccase treatment to the production of ethanol, but also to assess the
contribution to the whole process of adding a xylanase treatment prior to the laccase
step. To that end, an acid or enzymatic hydrolysis was assayed over all fractions
obtained in the different steps. Sugars content before and after the hydrolysis, i.e. the
hydrolysis yield, was determined.
2. Materials and methods
2.1. Raw materials and chemicals
Eucalyptus globulus chips (EG) were kindly supplied by La Montañanesa pulp

mill (Torraspapel group, Spain). The chemical composition of the chips was: 0.7 %
etanol extractives, 20.6 % Klason lignin, 4.8 % acid soluble lignin, 46.0 % glucan, 15.6
% xylan, 0.24 % arabinan and 4.1 % acetil groups.
All chemicals used were reagent-grade and were acquired from Merck
(Barcelona, Spain), Panreac (Barcelona, Spain) or Sigma–Aldrich (Madrid, Spain),
except for 2,2´-Azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate (ABTS), which was
purchased from Roche (Madrid, Spain).
2.2. Steam explosion pre-treatments
The steam explosion treatments were performed in a 26 liter stainless steel

digester connected to a blowing (expansion) tank. The temperature inside the digester
was kept constant at 183ºC (10 kg cm-2) by adding steam, and at the end of the
203
treatment, the pressure was reduced to 6 kg cm-2 and the chips were discharged into the
blowing tank at atmospheric pressure. The steam explosion variables were the number
of cycles and the duration of the first cycle (the second cycle had a fixed duration of 3
minutes). Addition of a pre-extraction step (immersion of the chips in water for 16
hours at 25ºC) prior to steam explosion was also evaluated in order to study the effect of
water impregnation. The operational conditions applied were based on previous work
[4,19] and are summarized in Table 1.
The severity factor of each treatment was calculated according to the following
equation defined by Overend and Chornet [25].
T 100
S0 log e 14.75 · t (1)
where T is the temperature (ºC) and t the duration of the treatment (min).
2.3. Enzymatic hydrolysis of solid fractions obtained after the several steam explosion
treatments
The solid fractions resulting from all steam explosion pre-treatments (Table 1)
were ground in a Wiley mill to pass through a 1 mm screen. Wood meals obtained were
then subjected to enzymatic hydrolysis by action of a cellulolytic complex (Celluclast
1.5L), supplemented with β-glucosidase (Novozym 188) at a 1:3 ratio [11]. Both
enzymatic mixtures were kindly provided by Novozymes (Bagsvaerd, Denmark). The
celluclast 1.5 L dose was 20 EGU g-1 of substrate (at 40ºC and pH 6.0). The enzymatic
hydrolysis treatments were carried out at pH 4.8 (50 mmol L-1 citrate – phosphate
buffer) and 50ºC (according to the specifications listed in the product sheet) in a rotary
shaker (150 revolution per minute) for 72 h with 5 % concentration of the pre-treated
material. After enzymatic hydrolysis, samples were heated in boiling water for 5 min
and, after cooling, centrifuged to separate the hydrolysate and the solid residues. The
yield of the treatment and the sugars content (as per the method described in section
2.6.) of all liquid and solid fractions were determined. The steam explosion pre-
treatment which proved to be most efficient was selected for further assays (see Figure
1).
204
2.4. Laccase and xylanase pre-treatments of the solid fraction obtained from the
selected steam explosion pre-treatment
The solid fraction obtained from the selected steam explosion pre-treatment was
subjected to the xylanase and/or laccase treatment before the enzymatic hydrolysis.
These enzymatic treatments were carried out in sequence or separately (Figure 1). The
enzymes used were Pulpzyme HC (xylanase) and Novozym 51003 (laccase) produced
by submerged fermentation of genetically modified Bacillus sp. and Aspergillus sp.,
respectively. Both enzymes were donated by Novozymes (Bagsvaerd, Denmark).
Assays were performed in 500-mL flasks placed in a thermostatic shaker at 100

revolutions per minute. Based on the enzyme product sheets provided by the
manufacturer, 65ºC and pH 6.5 and 70ºC and pH 6 were the conditions selected to
perform the xylanase and laccase treatments, respectively. Both treatments used a 7 %
substrate concentration, for 30 min and 100 mmol L-1 phosphate buffer. The xylanase
and laccase doses were 50 AXU g-1 of substrate and 30 U laccase g-1 of substrate,
respectively. For the laccase treatments, flasks were equipped with an air bubbling
system, and 5 mmol L-1 1-hydroxybenzotriazole (HBT) was used as mediator.
After the enzymatic treatments, the solid fractions were isolated and subjected to
an enzymatic hydrolysis according to the method described in section 2.3.
2.5. Hydrolysis of the liquid fraction obtained from the selected steam explosion
treatment
The liquid fractions obtained from the selected steam explosion pre-treatment
were subjected to both acid and enzymatic hydrolysis. Acid hydrolysis was carried out
with 2 % H2SO4 at 115ºC for 60 min in an autoclave, based on Garrote et al. [26], to
avoid degradation of the monomers. Enzymatic hydrolysis was performed at pH 6.3 and
50ºC in a rotary shaker (150 revolutions per minute) for 72 h. According to Um and van
Walsum [27], a mixture of commercial enzyme preparations increases the hydrolysis
rate of xylan-rich extracts; therefore a combination of cellulolytic complex (Celluclast
1.5L) and xylanase (Pulpzyme HP) was used at a 3:1 ratio. The Pulpzyme dose was 150
AXU ml-1 of sample. After the enzymatic hydrolysis, samples were heated in boiling
water for 5 min and then cooled at room temperature.
205
Finally, the sugar contents of the hydrolysates obtained from both hydrolysis
processes were determined as per the method described in section 2.6.
2.6. Analysis
The composition of the raw material (EG) and all solid fractions was determined
by standard analytical methods. The extractives were determined as the soluble material
after a Soxhlet extraction with ethanol for 6 hours. The free-extractive samples were
subjected to quantitative acid hydrolysis to determine the carbohydrate composition.
This acid hydrolysis was performed in two steps according to Garrote et al. [28]. The
hydrolysed liquid obtained was then analysed for sugars and acetyl group contents by
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) using the Agilent Technology 1200
series RID with an Aminex HPX-87H column operated at 50ºC with a mobile phase
containing 5 mmol L-1 sulfuric acid pumped at a rate of 0.6 ml min-1. The solid residue
remaining after the acid hydrolysis is considered acid insoluble lignin (Klason lignin).
Additionally, the acid soluble lignin was quantified using UV spectrophotometry at 205
nm.
The compositions of the liquid fractions obtained during the experiments

described in sections 2.3 and 2.5 were also determined. An aliquot (1 ml) was filtered
through 0.45 µm membranes and used for direct HPLC determination of
monosaccharides, acetic acid, furfural and hydromethylfurfural. A second aliquot of 25
ml was subjected to quantitative posthydrolysis with 4 % H2SO4, at 120ºC, for 60 min,
before HPLC analysis. Increments in the concentrations of monosaccharides and acetic
acid caused by posthydrolysis were used to measure the concentrations of oligomers
and acetyl groups bound to oligosaccharides, respectively [28].
2.7. Statistical analysis
All treatments were run twice and samples for chemical analysis were
triplicated. Tukey's multiple comparison test (α = 0.05) was used to determine which
means, among a set of means, differ from the rest (Matlab 5.1).
206
3. RESULTS AND DISCUSSIÓN
3.1. Effects of steam explosion on the chemical composition of Eucalyptus globulus.
The effects of steam explosion on the obtained solid fractions are indicated by
the data in Table 2. The pre-extraction of EG did not affect significantly the chemical
composition of the chips (EG and SE0 samples), apart from a reduction in the soluble
lignin content. However, significant differences between the EG and the rest of the
steam exploded samples (SE1-SE8) were found for all evaluated parameters except for
acetyl groups (with the exception of SE4).
Steam explosion removes hemicelluloses and also some lignin depending on the
extent of the treatment. This has been previously described by Excoffier et al. [5] who
have found that, whereas the hemicellulose is removed by hydrolysis, lignin softens
under the heat and slowly depolymerizes. In general, the pre-extraction did not affect
the solid content under lower severity factors (SE1-SE2 or SE5-SE6). However, under
the more severe treatments, significant differences were observed (SE3-SE4, SE7-SE8)
mainly in yield and extractable values. The greatest differences among treatments were
observed for SE3 and SE4. These treatments have a medium-high severity factor and a
single cycle, though the duration of this cycle is long. These data suggest that cycle
duration is a major factor that could influence the extraction of the EG components.
Ethanol extractives were significantly different amongst treatments (mainly in

SE4 and SE8). As far as the Klason lignin content is concerned, although it was smaller
in the exploded samples than in controls (with the exception of SE3), it was similar for
all the different treatments. However, as expected, higher solubilization of
hemicelluloses meant that the xylan content of the solid fractions decreased as the
intensity of the treatment increased. On the other hand, it should be noted that the
highest content of glucan found in steam-explosion treated samples was a relative
increase caused by the fact that cellulose remained almost unaffected under those
conditions while hemicelluloses and some lignin were removed from the solid fractions
[29].
Based on treatment yield and baseline chemical composition, it is possible to

determine what percentage of each wood component remains in the solid fraction after
treatment of the raw material (Fig. 2). Thus, hemicelluloses underwent a progressive
207
solubilization after steam explosion: xylans and arabinans remaining in the solid
fraction decreased down to 53.4 % and 6.6 %, respectively, in SE8. Similar findings
have been reported by Ruiz et al. [3] who have described a complete solubilization of
arabinan and a solubilization of a fraction of 50 % of the original xylan after subjecting
sunflower stalks to steam explosion at 190ºC. Acetyl groups, bound to the xylan in the
native wood, were also removed during medium and severe steam explosion treatments
(SE4-SE8). Other authors have observed also a similar removal during steam explosion
and autohydrolysis of hardwood [6]. Acetyl groups can be removed from the wood by
means of two different reaction pathways: direct hydrolysis of acetyl groups from the
solid xylan backbone and dissolution of acetylated xylo-oligosaccharides [30]. Lignin is
partially dissolved also whereas glucan stays unchanged. Other authors have reported a
slight solubilization of glucan, but mostly after more severe treatments than those
reported here [3,7,8].
3.2. Effects of steam explosion on the enzymatic hydrolysis of the solid fractions.
After the steam explosion treatments, the solid fractions were subjected to
enzymatic hydrolysis. The chemical characterization of the solid and liquid fractions
obtained after these treatments is shown in Tables 3 and 4, respectively. A decrease in
the extractives and sugar contents of the solid fraction were evident, being higher for
exploded samples that had been exposed to more intensive steam explosion. Enzymatic
hydrolysis is known to accelerate the extraction of soluble and relatively easily
biodegradable organic products [31]. This solubilization and hydrolysis caused an
increase in the relative content of Klason lignin in all samples after enzymatic
hydrolysis.
As Table 4 shows, all hydrolysis conditions assayed produced mainly

monosaccharides, since oligomer concentrations were low in all liquid fractions. The
hydrolysis yield can be determined from monomers concentrations and the sugars
content of the solid fractions before the enzymatic treatment (Figure 3). For non-
exploded samples (EG-SE0) similar glucose and total sugars yields were observed (14-
15 %). In the exploded samples, hydrolysis of xylan took place also, resulting in higher
total sugar yields compared to glucose yields. Furthermore, more intensive steam
explosion pre-treatments resulted in higher hydrolysis yields. This finding has been
reported by other authors and has been attributed to the increased porosity and the
208
removal of hemicelluloses which increase the accessibility to cellulose [20-22].
Additionally, it is well recognized in the literature that the lignin content has an impact
on the enzymatic hydrolysis [32,33]. Nevertheless, the differences observed in the
hydrolysis yield could be due to the severity of the steam explosion pre-treatment but no
to variations in the lignin content, since differences in lignin content were barely
significant.
The highest hydrolysis yields were obtained in samples subjected to the longest
steam explosion treatments after water pre-extraction (24.1 % and 24.7 % glucose yields
and 35.8 % and 35.6 % total sugar yields for SE4 and SE8 respectively). Other authors
have reported slightly higher hydrolysis yields after steam explosions whose severity
was comparable to those performed in this study. Thus, glucose yields of 31 %, 32 %
and 35 % have been reported by Varga et al. [23] with corn stover (steam explosion at
190ºC, 5 min, severity factor of 3.35), Ruiz et al. [3] with sunflower stalk (180-190ºC, 5
min, S0 = 3.35-3.64) and Jurado et al. [16] with wheat straw (190ºC, 10 min, S0 = 3.65),
respectively. However, these authors have used non-wood materials, which have a more
porous and readily accessible tissue structure [34] that can facilitate the enzymatic
treatment. Reports of higher hydrolysis yields for eucalyptus consistently use higher
severity factors and/or the addition of a catalytic acid [11,35]. However, if the severity
or acidity of the pre-treatment were too high, greater degradation of carbohydrates
during steam explosion would result in less glucose recovery and more inhibitors
present in both the solid and liquid fractions [3,11,12]. In our case, the overall yield of
glucose and total sugars with respect to the original raw material (EG) were 23.7 % and
30.2 % respectively, with the most severe pre-treatment (SE8). Furthermore, the real
total sugar yield was higher than this value because sugar recovery in the liquid fraction
after steam explosion should be taken into account as well (see section 3.4).
In view of the difficulty of finding microorganisms capable of fermenting both

cellulose and xylose with high yield [36,37], the glucose yield, but not the total sugar
yield, has been considered to identify the most efficient pre-treatment for enzymatic
hydrolysis of the solid fraction. Consequently, the SE8 pre-treatment turned out to be
the most efficient, and both the solid and liquid fractions obtained after this pre-
treatment were subjected to further hydrolysis tests.
209
3.3. Effects of the laccase and xylanase pre-treatments on the enzymatic hydrolysis of
the exploded solid fractions.
SE8 was subjected to xylanase and/or laccase treatments in order to study their
effect on the enzymatic hydrolysis performed subsequently. The chemical composition
of the resulting samples is shown in Table 5. Comparing the chemical composition of
the samples after the laccase treatment (SE8-L) with that of SE8, a decrease in ethanol
extractives was observed. This finding could be related with the removal of lipophilic
extractives by the laccase, which has been reported by several authors using laccase to
combat pitch problems in pulp and paper production [38-40]. Also, a decrease in xylan
and acetyl groups was found after the enzymatic treatments. Consequently, an increase
in the relative percentage of glucan and Klason lignin was observed. The removal of
these products was likely the result of partial degradation during steam explosion and
the extractive effect of the subsequent enzymatic treatment at high temperature (70ºC).
Although the LMS treatment has been combined with an alkaline extraction stage to
efficiently delignify pulps and lignocellulosic materials [41,42], no reduction in Klason
lignin was observed here. This result might indicate that LMS did oxidize the lignin, but
the resulting products were not soluble at the pH of treatment (pH 6), and a subsequent
alkaline treatment would be needed to remove the oxidized products [40]. After the
xylanase treatment (SE8-X) reduction of the xylan content was greater and reduction of
acetyl groups was smaller. However, after sequential xylanase and laccase treatments no
significant differences in chemical composition were found with respect to the laccase
treatment, apart from a higher content of acetyl groups.
After the enzymatic hydrolysis of the treated samples, a reduction in both glucan
and xylan content was observed (Table 5), secondary to the degradation of cellulose and
hemicelluloses. Thus, glucose and xylose monomers were the main components of the
hydrolysates, as Table 6 shows.
Figure 4 shows the glucose and total sugar yield of the enzymatic hydrolysis. As
it can be observed, the LMS treatment increased the glucose yield compared to SE8
(27.1 % vs 24.7 %), although the total sugar yield was slightly smaller. An increase in
the hydrolysis yield has been made evident also by other authors after laccase and white
rot fungus treatments [43,44]. This can be a result of the modification of lignin by the
laccase, probably decreasing the hydrophobicity of lignin and eventually changing the
210
polarity characteristics of the surface, which in turn may have decreased the irreversible,
unproductive binding of cellulases to lignin [17]. However, although Jurado et al. [16]
have reported no effect of LMS on the hydrolysis rate, these authors have found an
increase in ethanol production in a subsequent fermentation, owing to the removal of
inhibiting products (phenolic compounds) during the LMS treatment of steam exploded
wheat straw.
The xylanase treatment also increased the glucose yield (28.3 %), although this
treatment did not enhance the effect of the LMS treatment in the enzymatic hydrolysis
(SE8-XL). However, lack of improvement of the hydrolysis does not mean lack of
beneficial effects on a subsequent fermentation process, as mentioned above [16].
Therefore, a fermentation process should be carried out in order to clarify the effect of
the laccase and the xylanase-laccase treatments on bioethanol production.
On the other hand, the beneficial effect of the xylanase treatment on the glucose
yield could be related to greater accessibility gained by the removal of xylan, as it could
be observed also after the steam explosion treatments. Nevertheless, the overall glucose
yield of the process, taking into account both the steam explosion and the xylanase
treatment yields, was found higher than that of the SE8 sample (27.8 % vs 23.7 %),
while the overall total sugar yield was slightly lower (29.6 % vs 30.2 %).
3.4. Hydrolysis of the liquid fraction obtained after the steam explosion treatment
selected as most effective
Two liquid fractions were isolated from the SE 8 treatment, one in each cycle.
The sugar content of these fractions is listed in Table 7. This table also presents the
percentage of sugar recovery, determined from the sugar concentrations in the liquid
and the potential sugar concentration of the original raw material (EG). It should be
noted that, in the first SE cycle, 8.2 % of xylose and 4.0 % of glucose were recovered in
the liquid fraction as oligosaccharides. In the second cycle, a higher amount of
xylooligosaccharides was recovered, even when this cycle was shorter than the first one
(3 min vs 10 min). This result can indicate that, during the first steam explosion
treatment, some carbohydrates were degraded partially but not completely solubilized in
the liquid fraction, requiring a longer treatment or a second cycle to be completely
solubilized. Furthermore, the decompression in the first cycle resulted in physical
211
rupture of the fiber walls and chip structure, which is likely to have enhanced the
subsequent extraction of hemicelluloses in the second cycle. The total xylose recovery
in the two liquid fractions was smaller than that estimated based on the extraction of
hemicelluloses in the solid fraction (25.3 % vs 46.6 %). The reason could be an
inefficient recovery of the extracted hemicelluloses since part of them could be
dissolved in the liquid that impregnates the chips after the explosion and is discarded
after washing the exploded chips. Another reason could be the degradation of the
dissolved xylooligosaccharides to furfural, which has been reported by other authors
during steam explosion with high severity factor [7,11]. However, in the liquid fractions
obtained in our study, neither furfural nor hydroxymethyl furfural (HMF) was detected
in the HPLC analysis, indicating that hydrolysis reactions largely predominated over
degradation reactions. Nevertheless, it is possible that these volatile products were not
quantitatively recovered in the liquid fraction because they were partially lost to the
atmosphere after explosive decompression [35].
Conversion of recovered oligosaccharides into monomers, a process which could

be of use in bioethanol production, was evaluated by acid and enzymatic hydrolysis.
Figure 5 shows the glucose and xylose hydrolysis yields for enzymatic and acid
hydrolysis of the two liquid fractions. Total hydrolysis yields (according to the sum of
monomers in the two liquid fractions) were determined for enzymatic and acid
hydrolysis.
The xylose hydrolysis yields for both the acid and the enzymatic process were
the lowest in the liquid fraction obtained from the second cycle (SE8.2). Contrary to
this, the glucose hydrolysis yields were the lowest in SE8.1. A plausible explanation for
this can be the differences in the concentration of substrates to be hydrolyzed
(oligosaccharides). Thus, for lower initial concentrations, the hydrolysis yields were
higher. However, the total amounts converted into glucose, in SE8.1, and xylose, in
SE8.2, were higher than in SE8.2 and SE8.1 respectively. Therefore, the observed
reductions in the hydrolysis yield could be a consequence of the increased initial
amount of oligosaccharides (which is in the denominator in the yield equation).
The total hydrolysis yields from the acid hydrolysis were lower than those
obtained from the enzymatic hydrolysis: 16.5 % vs 65.3 % for glucose and 61.4 % vs
82.7 % for xylose. However, the acid hydrolysis was not optimized, and an increase in
212
reaction time, temperature and/or acid concentration could increment its yield.
Nevertheless, raising these operational conditions would also enhance degradation of
monosaccharides, increasing the amount of inhibitors such as furfural and HMF [2,26].
On the other hand, the enzymatic hydrolysis yield could be increased also by modifying
the enzyme-substrate ratio and the enzyme activity. Thus, the enzymatic hydrolysis has
the advantage of requiring less severe operational conditions (temperature, pH),
generating less inhibiting products, which would contribute to a greater bioethanol
production rate [27].
Nevertheless, during the steam explosion pre-treatment, the degradation of

sugars and lignin could generate inhibitors, as it has been mentioned above [3]. As these
inhibitors are mainly hydrosoluble products, the liquid fraction obtained in this pre-
treatment, is expected to have a higher concentration of toxic products, including free
phenols [16]. Therefore, the detoxification of this fraction, before or after the
hydrolysis, could result in a greater fermentation yield. To this end, several
detoxification methods can be used, being one of the most promising the LMS
treatments [17,18]. The use of a less intensive steam explosion pre-treatment, as those
performed in this study, could be an alternative option to reduce the inhibiting products.
Furthermore, the development of pentose fermenting yeasts, capable of achieving high
bioethanol production rates and of tolerating high ethanol concentrations and also small
amounts of inhibitors, is of great interest for the utilization of these hydrolysates [45].
3.5. Overall hydrolysis yields
In order to optimize the overall process, several goals should be set. Recovery of
both cellulose, in the solid fraction, and hemicelluloses, in the liquid fraction, is
important in the steam explosion pre-treatment. The amount of inhibitors generated
during this pre-treatment, and the hydrolysis yields of both the solid and the liquid
fractions are also critical factors to be considered [3]. Accordingly, the overall yields of
the process were determined including all these considerations.
Taking into account that 25.3 % of the total xylan content in the original wood
(EG) was recovered as xylooligosaccharides in the liquid fractions, the enzymatic
hydrolysis rate with respect to the xylan present in EG was 21.0 %. Thus, the overall
xylose yield obtained after the enzymatic hydrolysis of both the solid and the liquid
213
fractions (section 3.2 and 3.4, respectively) in SE8 was 55.5 % of the hemicelluloses
contained in EG (8.6 % of the whole raw material). However, this yield could be
increased if recovery of extracted hemicelluloses was more efficient, as around 20 % of
the hemicelluloses were lost. On the other hand, the overall glucose yield, including the
enzymatic hydrolysis of the solid and the liquid fractions, was 26.8 % of the glucose
present in EG (12.3 % of the whole raw material); therefore, 210 g of total sugars could
be obtained from 1 kg of EG, and this yield could be increased by introducing some
modifications in the process, such as laccase detoxification, and improvements in the
recovery of the liquid fraction in SE, as it has been mentioned before. Nevertheless, a
similar overall yield (22 %) was obtained using sunflower stalks and a more severe
steam explosion pre-treatment [3], which could produce more inhibiting products and
also increase the operational cost of the pre-treatment.
4. Conclusions
Steam explosion has demonstrated to be an efficient pre-treatment to enhance

the enzymatic hydrolysys of E. globulus wood. In order to optimize the overall process,
hydrolysis of glucose in the solid fraction and of hemicelluloses in the liquid fraction
should be optimized. Reported results showed that a high severity SE pre-treatment is
not recommended, as hemicelluloses are lost and inhibitors are generated in the process.
Thus, two cycles of steam explosion (10+3 min) at 183ºC were enough to obtain 210g
of total sugars from 1kg of raw material. Moreover, this yield could be increased by
introducing some modifications in the process, such as laccase detoxification and
improvements in the recovery of the liquid fraction during steam explosion.
Acknowledgements
funding this study via the Projects CTQ 2006-00385 and CTQ 2009-11268 and the FPI
fellowship (BES2007-14528).
214
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219
Figure captions
Figure 1. Block diagram of assayes performed: First, selection of the most efficient
steam explosion pre-treatment (1); and then, study of the effect of xylanase and laccase
on the enzymatic hydrolysis of the solid fraction, and evaluation of acid and enzymatic
hydrolysis of the liquid fraction (2).
Figure 2. Percentage of each wood component remaining in the solid fraction after each
steam explosion treatment, compared to the original amount of these components in the
raw material (EG).
Figure 3. Glucose and total sugar yields during enzymatic hydrolysis of the solid
fractions obtained after steam explosion treatments.
Figure 4. Glucose and total sugar yields during enzymatic hydrolysis of the solid
fractions obtained after steam explosion and laccase/xylanase treatments.
Figure 5. Glucose and xylose yields during enzymatic hydrolysis (EH) and acid
hydrolysis (AH) of the two liquid fractions obtained from the SE8 pre-treatment (SE8.1
and SE8.2). The total glucose and xylose yield was calculated from the sum of
monomers present in the two liquid fractions.
220
Figure 1
1
Enzymatic
Solid fraction Hydrolysis rate
E. globulus Steam explosion hydrolysis Selection of steam
wood pre-treatments explosion pretreatment
Liquid fraction
2 Xylanase
Enzymatic
Solid fraction Laccase Hydrolysis rate
hydrolysis
Xylanase Laccase
E. globulus Selected steam
wood explosion
Acid hydrolysis Hydrolysis rate

Liquid fraction
Enzymatic
Hydrolysis rate
hydrolysis
Figure 2
100
90
80
% remained in solid
70
60 lignin
Glucan
50
Xylan
40
Arabinan
30
Acetyl groups
20
10
0
Figure 3
40
35
Enzymatic hydrolysis yield (%)
30
25
20 Glucose
Total sugars
15
10
0
EG SE 0 SE 1 SE 2 SE 3 SE 4 SE 5 SE 6 SE 7 SE 8
221
Figure 4
40
Enzymatic hydrolysis yield (%)
35
30
25
20
15
10
0
SE 8 SE8-L SE8-X SE8-XL
Glucose Total sugars
Figure 5
120
100
Hydrolysis yield (%)
80
60
40
20
0
SE8.1-EH SE8.2-EH Total-EH SE8.1-AH SE8.2-AH Total-AH
Glucose Xylose
222
Table 1. Steam Explosion Conditions
Number of Duration first Severity factor

Sample Pre-extraction
cycles cycle (min) (S0)
Control A (Euc. G.) No - - -
Control B (SE0) Yes - - -
SE1 No 1 5 3.14
SE2 Yes 1 5 3.14
SE3 No 1 10 3.44
SE4 Yes 1 10 3.44
SE5 No 2 5 3.35
SE6 Yes 2 5 3.35
SE7 No 2 10 3.56
SE8 Yes 2 10 3.56
Table 2. Chemical composition of the original Eucalyptus globulus (EG) and solid
fractions after steam explosion pre-treatments, expressed as g per 100 g of sample.
Ethanol Klason Ac. Sol. Acetil

Sample Yield Glucan Xylan Arabinan
extractives lignin lignin groups
E.G 100 0.7 20.6 4.8 46.0 15.6 0.24 4.1
SE0 99 0.8 20.1 3.1 47.7 15.8 0.21 4.4
SE1 94.6 3.9 19.4 4.1 49.3 14.6 0.09 4.6
SE2 94.8 3.8 19.5 4.1 48.3 15.0 0.10 4.7
SE3 93.8 2.8 20.0 4.2 48.9 14.7 0.10 4.5
SE4 84.5 8.7 17.9 3.1 54.6 10.4 0.04 1.9
SE5 90.4 3.4 19.1 4.1 51.6 14.0 0.04 3.2
SE6 88.1 3.1 19.6 3.7 55.2 11.6 0.0 3.0
SE7 87.6 6.4 18.9 3.0 54.0 13.5 0.1 4.2
SE8 79.7 8.3 18.6 2.7 55.5 10.4 0.0 4.0
223
Table 3. Chemical characterization of the solid fractions from steam explosion pre-
treatments, after the enzymatic hydrolysis, expressed as g per 100 g of sample.
Ethanol Klason Ac. Sol. Acetil

Sample Glucan Xylan Arabinan
extractives Lignin lignin groups
E.G 1.2 21.6 3.7 48.0 15.5 0.5 2.2
SE0 0.8 19.5 3.8 47.4 15.1 0.4 2.7
SE1 2.1 22.7 2.4 50.6 14.0 0.5 2.0
SE2 2.0 22.6 4.0 48.1 14.3 0.6 3.2
SE3 1.9 21.5 3.7 49.1 11.1 0.9 3.2
SE4 6.1 21.2 2.6 53.1 10.3 0.6 2.2
SE5 2.5 21.3 3.3 51.3 10.0 0.6 3.0
SE6 3.4 26.5 3.1 52.4 8.5 0.7 2.9
SE7 4.1 22.1 2.9 54.1 9.2 0.3 1.8
SE8 5.0 25.1 2.4 51.5 7.7 0.6 2.7
Table 4. Chemical characterization of the liquid (g/l) obtained after enzymatic

hydrolysis of the solid fractions from steam explosion treatments. [A] and [AO] indicate
the monomer and oligomer concentrations, respectively.
Glucose Xylose Arabinose Acetic Acid

[A] [AO] [A] [AO] [A] [AO] [A] [AO]
EG 3.54 0.06 0.52 0.35 0.65 0.22 0.17 0.07
SE0 3.57 0.29 0.29 0.22 0.63 0.12 0.1 0.02
SE1 3.90 1.35 1.31 0.84 0.47 0.45 0.32 0.11
SE2 5.17 0.2 1.61 0.51 0.7 0.23 0.49 0.17
SE3 4.61 0.62 1.17 0.44 0.8 0.23 0.23 0.1
SE4 6.47 0.46 3.75 0.92 1.06 0.12 0.99 0.16
SE5 5.53 0.18 2.42 0.53 0.81 0.25 0.64 0.11
SE6 6.49 0.42 3.28 0.15 0.93 0.15 1.1 0.23
SE7 6.49 0.16 2.83 0.52 0.79 0.2 0.61 0.17
SE8 7.21 0.01 3.55 0.4 0.92 0.04 0.65 0.14
224
Table 5. Chemical characterization before and after the enzymatic hydrolysis of the
SE8 solid fraction treated with laccase (L) and/or xylanase (X), expressed as g per 100 g
of sample.
Ethanol Klason Acid Sol. Acetil

Sample Glucan Xylan Arabinan
extractives Lignin lignin groups
Before enzymatic hydrolysis
SE8-L 5.6 21.1 2.7 58.8 9.1 0.6 2.1
SE8-X 5.8 19.7 2.8 58.6 8.7 0.6 2.9
SE8-XL 4.2 21.1 2.6 58.7 9.1 0.6 3.1
After enzymatic hydrolysis
SE8-L 4.5 22.1 2.6 52.9 8.0 0.6 2.3
SE8-X 4.3 21.9 2.7 52.8 8.0 0.6 2.3
SE8-XL 3.5 23.3 2.8 52.9 8.0 0.6 2.8
Table 6. Chemical characterization of the liquid (g/l) obtained after enzymatic

hydrolysis of the SE8 solid fraction treated with laccase (L) and/or xylanase (X). [A]
and [AO] indicate the monomer and oligomer concentrations respectively.
Glucose Xylose Arabinose AceticAcid

[A] [AO] [A] [AO] [A] [AO] [A] [AO]
SE8-L 8.27 0.72 2.27 0.00 0.85 0.02 0.54 0.14
SE8-X 8.73 0.58 2.32 0.16 0.83 0.07 0.58 0.14
SE8-
8.15 0.52 1.82 0.12 0.71 0.05 0.49 0.11
XL
225
Table 7. Chemical characterization of the liquid fractions (g/l) obtained during the two
SE8 cycles of steam explosion and percentage of sugar recovered in the liquid respect to
the sugar content in the raw material (EG). [A] and [AO] indicate the monomer and
oligomer concentrations respectively.
Glucose Xylose Arabinose AceticAcid % Recovery

[A] [AO] [A] [AO] [A] [AO] [A] [AO] Glucose Xylose
SE8-1 0.32 1.45 0.07 1.14 0.04 0.28 0.06 0.01 4.1 8.2
SE8-2 0.19 0.08 0.03 2.48 0.05 0.07 0.12 0.02 0.6 17.1
Total 4.7 25.3
226
PUBLICACIÓN IV:
Integration of Kraft pulping on a forest biorefiney by the addition of a steam
explosion pretreatment.
Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., Revilla, E., Martín, J.A., Villar, J.C.
BioResources. 2011. 6(1): 513-528.
227
INTEGRATION OF KRAFT PULPING ON A FOREST

BIOREFINERY BY THE ADDITION OF A STEAM EXPLOSION
PRETREATMENT
Raquel Martin-Sampedro, Maria E. Eugenio, Esteban Revilla, Juan A. Martín, and
Juan C. Villar *
Steam explosion has been proposed for a wide range of lignocellulosic

applications, including fractionation of biomass, pre-treatment of biomass
for ethanol production, or as an alternative to conventional mechanical
pulping. Nevertheless, a steam explosion process could also be used as
pretreatment before chemical pulping, expecting a reduction in cooking
time due to the open structure of the exploded chips. Thus, to evaluate
the effect of steam explosion as a pretreatment in the kraft pulping of
Eucalyptus globulus, steam exploded chips and control chips were
subjected to kraft cookings. Steam exploded chips provided pulps with
reductions of kappa number by up to 70% with no significant change in
viscosity. Therefore, the cooking time could be shortened by 60%,
increasing the productivity and obtaining pulps with similar delignification
degree to those of the control pulp. Furthermore, not only the production
rate could be increased, but also most of the hemicelluloses could be
recovered before pulping and converted to a value-added product.
Finally, although exploded pulp had inferior mechanical strength, the
optical properties, which are more important in eucalyptus pulps, were
found to be better.
Keywords: Eucalyptus globulus; Forest biorefinery; Kraft pulping; Steam explosion; Pulp properties
Contact information: Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria INIA.

Carretera de la Coruña, km 7.5, 28040, Madrid (Spain); *Corresponding author: [email protected]
INTRODUCTION
The concept of a forest biorefinery is based on the use of lignocellulosic biomass

as raw material in the integrated production of fuels, energy, and chemical products. The
possibility of transforming a chemical pulp mill into a forest biorefinery is attracting
widespread research interest. Such a transformed mill could produce higher value-added
products such as ethanol, polymers, carbon fibers, and diesel fuel, in addition to pulp
(San Martin et al. 1995; Van Heiningen 2006; Ragauskas et al. 2006). One of the ways to
achieve this goal is to extract a portion of the hemicelluloses from wood prior to pulping,
obtaining a liquid fraction that could be converted into ethanol and/or other chemical
products. The hemicelluloses extraction could be done by different treatments, such as
acid hydrolysis, autohydrolysis, steam explosion, or alkali extraction; however, steam
explosion treatment shows some advantages that make it a competitive process to extract
hemicelluloses.
Martin-Sampedro et al. (2011). “Steam explosion kraft,” BioResources 6(1), 513-528. 513
The steam explosion process consists of treatment of lignocellulosic material with
high-pressure steam, followed by a rapid decompression, which forces the fibrous
material to “explode” into separated fibers and fiber bundles. When no other chemicals
are added to the process, the high-temperature steam (due to the high rate of dissociation
of water) leads to the release of acids from the acetylated wood components; the released
acids then catalyze hydrolytic reactions in the wood polymers. These autohydrolysis
reactions result in a loss of hemicellulose and a decrease in the content of β-O-4
structures in lignin (Robert et al. 1988; Jakobsons et al. 1995; Josefsson et al. 2001,
2002). These chemical changes depend greatly on the temperature used and the treatment
time (Chua and Wayman 1979).
The earliest application of this process was developed by Mason in 1928. This
author proposed using a steam treatment followed by an explosive decompression for the
production of Masonite board stock (Mason 1928). Another application was suggested by
Babcock (1932), who used steam explosion as a pretreatment method for the production
of ethanol. Steam explosion has also been proposed as an alternative to improve
conventional mechanical or chemo-mechanical pulping methods (Delong 1987). During
this process, lignin is softened to allow higher defibration without excessive damage
and/or degradation to individual fibers. However, the process has not been industrially
implemented (Heitner et al. 1993) because pulps so produced have not shown any
superior properties over those from chemimechanical pulp (CMP) or chemithermo-
mechanical pulp (CTMP).
As has been mentioned before, steam explosion could be also used to remove
hemicelluloses, since during the steam treatment, hemicelluloses are depolymerized,
partially degraded, and solubilized in hot water, yielding a mixture of monomeric and
oligomeric sugars (Puls et al. 1985). Removed hemicelluloses can be a valuable source of
hexose and pentose sugars, and they can be further converted into value-added products
such as ethanol, polymers, and other chemicals (Li et al. 2010).
Removal of hemicelluloses from wood as a pretreatment step is being practiced
commercially in the production of dissolving pulps, where the hemicelluloses are
removed to allow the production of pure cellulose (Wafa Al-Dajani and Tschirner 2008).
The most common commercial procedure for extracting hemicelluloses is pre-steaming to
release natural wood acids (autohydrolysis) followed by water extraction or acid
hydrolysis with small amounts of mineral acids (sulfuric acid or hydrochloric acid).
Compared to these processes, steam explosion not only allows the recovery of wood
components without their degradation (Avellar and Glasser 1998; Britt 1970), but also
leaves a solid residue (exploded chips) that is expected to be pulped more easily than
those obtained conventionally due to the open structure of the exploded chips that might
encourage an efficient diffusion of cooking liquor into the fibers (Ahvazi et al. 2007).
Therefore, taking into account the advantages of the steam explosion pretreatment, it can
be concluded that this process could be used as an efficient pretreatment in pulping,
increasing the total revenue stream for the pulp industry and converting the pulp mill into
an integrated forest biorefinery (Ragauskas et al. 2006; Van Heiningen 2006).
Although some studies have assessed the pre-extraction of hemicelluloses before
kraft pulping (Li et al. 2010; Wafa Al-Dajani et al. 2009; San Martin et al. 1995; Ahvazi
et al. 2007), few of them have evaluated the potential of steam explosion to this end.
Therefore, deeper research would be needed to evaluate not only the effect of steam
explosion pretreatment on kraft pulping, but also the potential recovery of sugars from
the liquid fraction generated during this pretreatment.
The aim of this work was to evaluate the possibility of integrating a kraft pulping
into a forest biorefinery, studying the sugar recovery and the effect of steam explosion on
kraft pulping and pulp properties. We selected Eucalyptus globulus because it is the raw
material most commonly used to produce kraft pulp in Spain, and also because it has a
high content of hemicelluloses (pentosan content 17.9 % on o.d. wood).
EXPERIMENTAL
Steam Explosion Treatment

Eucalyptus globulus chips were kindly provided by La Montañanesa pulp mill
(Torraspapel group, Spain). After two days conditioning in the laboratory (inside
polyethylene bags) to guaranty the chips homogenization, chips were divided in two
groups. One of them was immersed in water at 25ºC (pre-extraction) during 16 hours to
evaluate the effect of the uniformity of impregnation on the subsequent steam explosion
treatment.
The steam explosion treatment was performed in a 26 liter stainless steel digester
(manufactured by Cadepla S. L.) capable of achieving 190 ºC temperature and 16 Kg/cm2
pressure. The digester is connected to a blowing tank into which chips are discharged at
the end of the treatment. In each experiment, 500 g of E. globulus chips were treated with
steam at 183ºC (10 Kg/cm2) during 5 or 10 minutes and discharged at 6 Kg/cm2. The
number of cycles was studied to prove that the improvement of the accessibility of the
exploded chips (due to their open structure) is more influenced by the final explosion
than by the steam treatment. When a second cycle was carried out, the exploded chips
were treated with steam again during 3 minutes and discharged into the blowing tank.
Table 1 summarizes the operational conditions applied.
The severity factor of each treatment was calculated according to the following
equation defined by Overend and Chornet (1987).
െͳͲͲ
Ͳ ൌ ቀ ͳͶ Ǥ͹ͷ ȉ ቁ (1)
in which T is the temperature (ºC) and t the duration of the treatment (min).
The treated chips were then removed from the blowing tank, washed with cold
water, air-dried, and finally weighted. The water content was measured to determine the
total yield of the steam explosion process.
The water retention, or hydration capacity, of the chips was the weight of water
absorbed by the chips after being immersed for 6 hours, and it was expressed as grams of
water per 100 grams of dry wood.
The pretreatment that provided the highest water retention was selected for further
studies. The pretreated chips were analyzed to determine: acetone extractives (UNE-EN
ISO 14453), hot water extractives (UNE 57-013), lignin content (TAPPI T 222 om-88;
UNE 57-100), and holocellulose content (Wise et al. 1946). Chips from control A were
also analyzed as reference. Also, the liquid fraction of the selected steam explosion was
recovered to determine the sugar content. An aliquot (1 mL) was filtered through 0.45
μm membranes and used for direct HPLC determination of monosaccharides and acetic
acid. A second aliquot of 25 mL was subjected to quantitative posthydrolysis with 4%
H2SO4, at 120ºC, for 60 min., before HPLC analysis. The increase in the concentrations
of monosaccharides and acetic acid caused by posthydrolysis was used as a measure of
the concentrations of oligomers and acetyl groups bound to oligosaccharides, respectively
(Garrote et al. 1999).
Table 1. Steam Explosion Conditions

Number of Time of first Severity factor
Sample Pre-extraction
cycles cycle (min) (S0)
Control A No - - -
Control B Yes - - -
SE1 No 1 5 3.14
SE2 Yes 1 5 3.14
SE3 No 1 10 3.44
SE4 Yes 1 10 3.44
SE5 No 2 5 3.35
SE6 Yes 2 5 3.35
SE7 No 2 10 3.56
SE8 Yes 2 10 3.56
Kraft Cooking Process

Kraft cooking was performed on the chips pretreated by steam explosion and on
those of control A in four 1-liter pressurized reactors. Reactors were placed in a 20 L
rotatory pressurized vessel that contained hot water for indirect heating of the reactors.
The rotatory vessel had a jacket-type electrical heater controlled by a computer to set the
cooking temperature. Cooking conditions (referred to steam exploded chips, or non
exploded chips in the control case) were: 60 g of dry chips, 4 L/Kg liquor to wood ratio,
16% active alkali, 20% sulfidity, 160 ºC cooking temperature, and 60 minutes to
maximum temperature. Time at maximum temperature was varied from 24 to 56 minutes
to obtain an H-factor ranging from 180 to 400 (a control parameter in the pulping process
which includes time and temperature as a single variable). The H-factor was calculated
according to the following equation:
ቀͶ͵Ǥʹെͳ͸ͳͳͷ ቁ
ൌ ‫ Ͳ׬‬ (2)
in which T is the temperature (K) and t the time (hours).

After each batch, the reactors were removed from the vessel, and the cooked chips
were washed, disintegrated and screened to determine their reject content and screened
and total kraft yields based on the solids content of the material submitted to kraft
pulping, whether steam-exploded or not. Moreover, the overall yield has been calculated
taking into account both the steam explosion and the kraft processes. Black liquor was
titrated with HCl to determine the chemical reagent consumption. The kappa number
(TAPPI T-236/UNE 57034), viscosity (UNE 57039-1), and hexenuronic acid content
(Gellersted and Li. 1996) were determined in the pulp samples. Also, the pulp quality
was assessed in an optical microscope (Vanox AH3 Olympus connected to a Color View
III digital camera).
The cooking process that produced the best pulp of those that were assayed was
scaled up, changing the liquid-wood ratio and the active alkali because of an equipment
limitation, as it will be explained below. Kraft cooking was done in a 26 L batch reactor
furnished with a system for recirculation and heating of the cooking liquor. The cooking
temperature was controlled by a computer running specially developed software. Due to
the volume of the liquor recirculation circuit and to the characteristics of the steam
exploded chips, the liquid-wood ratio had to be increased to 6 L/Kg in order to assure a
complete immersion of the chips. The active alkali was also raised to 18% to approach
the concentration in the small reactors, since a greater volume of water was used. Other
cooking conditions were fixed as follows: 1000 g of dry chips, 20% sulfidity, 160 ºC
cooking temperature, 40 minutes to maximum temperature, and 27 minutes at cooking
temperature (H-Factor of 200).
After the cooking process was completed, the chips were discharged into the
blowing tank, washed, disintegrated, and screened to determine their reject content,
screened and total yields, kappa number (ISO 302), and pulp viscosity (ISO 5351-1).
Control pulp, obtained from chips that were not subjected to the steam explosion
pretreatment, had a high lignin content, needing further delignification to be comparable
with the pulp from pretreated chips. Therefore, oxygen delignification was applied to this
pulp in a 20 L rotatory reactor. Conditions of this treatment were: 0.6 MPa oxygen
pressure, 10% consistency, 5% NaOH (on dry pulp), 0.5% MgSO4 (on dry pulp), and 60
minutes of treatment at 110 ºC. Control pulp characteristics were evaluated as previously
described for the other pulps.
Refining and Handsheets Characterization

The degree of refining (Schopper–Riegler) (UNE-EN ISO 5267-1) was
determined in exploded and control pulps (after oxygen delignification). Pulps were
subsequently refined in a PFI mill (UNE-EN ISO 5264-2/TAPPI T- 248) to different
refining degrees (1000, 2000, and 3000 revolutions) to obtain more conformable fibers
for papermaking.
Handsheets were obtained from unrefined and refined pulps in accordance with
ISO UNE-EN ISO 5269-2 and characterized in terms of apparent bulk density, tensile
resistance, burst resistance, tear resistance (UNE-EN ISO 5270), brightness (UNE
57062), and yellowness index (TAPPI T-1216).
Accelerated Ageing
Exploded, control, and commercial pulps were subjected to accelerated ageing in
order to study the evolution of their optical and mechanical properties and also the effect
of the steam explosion pretreatment on this evolution. The accelerated ageing consisted
of a moist heat treatment at 80ºC and 65% relative humidity during 6 days, according to
the standard UNE 57092-4.
RESULTS AND DISCUSSION
Steam Explosion Treatment

Different steam explosion pre-treatments were performed at 183ºC by changing
three variables, as shown in Table 1. Depending on the conditions, the yield varied
between 94.3 and 79.3%. The yield decreased with the intensity of the process, mainly
depending on the treatment time (Fig. 1a). These results are consistent with those found
by other authors (Wafa Al-Dajani et al. 2009; Li et al. 2010), who reported that the
amount of hemicelluloses dissolved in the liquid fraction was higher when the
autohydrolysis time increased.
The water retention capacity of the exploded chips could provide information
about changes in the internal structure of the material and correlates with the intensity of
the pretreatment. As shown in Fig. 1b, there was a significant increase in the water
retention capacity of all materials after steam explosion. This fact suggests that the
accessibility of the exploded chips was increased, which would also improve the
diffusion of cooking liquor during a subsequent chemical pulping process. The effect was
more pronounced for stronger treatments, for which the addition of a second steam
explosion cycle was the most influential factor (maximum increase 90%, comparing SE4
and SE8), followed by the treatment time (36%, comparing SE2 and SE4). The cold
water pre-extraction of the original material also increased the effect of steam explosion.
This finding may have two causes: (i) the removal of extractives during this pre-
extraction, which could make steam penetration easier and would improve chips’
hydrophilicity; and (ii) the higher amount of water in the pre-extracted chips, which
would produce a more intense explosion and chip opening.
a) b)
100% 300
Water / Wood (%)
80% 250
200
60%
Yield
SE1 SE2 SE 3 SE 4 150

SE 5 SE 6 SE 7 SE 8 SE8
40%
100 SE6 SE7
20% SE4 SE5
50 SE1 SE2 SE3
C.A C.B
0% 0
1C: 5 1C: 10 2C: 5+3 2C: 10+3 Control 1C: 5 1C: 10 2C: 5+3 2C: 10+3
No Pre-extracted Pre-extracted No Pre-extracted Pre-extracted
Fig. 1. Yield of steam explosion treatment (a) and water retention capacity of exploded chips (b)
Taking into account these results, the SE8 treatment, consisting of water pre-
extraction followed by two steam explosion cycles of 10 and 3 minutes, was selected as
the most appropriate pretreatment for kraft pulping. It provided chips with a more open
structure that could be pulped more easily. The low yield obtained under these conditions
would reduce the overall yield after the kraft process, but it would remove unaltered
hemicelluloses that could be converted into value-added products, polymers, or ethanol
for fuel (Li et al. 2010), increasing the total revenue stream for the pulp mill (Ragauskas
et al. 2006; Van Heiningen 2006).
The chemical composition of the SE8 and the Control A samples, as well as the
sugar content of the liquid fraction from the SE8 treatment are shown in Tables 2 and 3,
respectively. It can be observed that there was an increase in the extractives content
(water soluble and acetone soluble) and a reduction in the holocellulose content of the
wood chips after steam explosion. The increase in extractives could be due to the fact
that, during the steam explosion treatment, some macromolecules, such as lignin and
polysaccharides, are partially degraded, becoming extractible in a subsequent solvent
extraction. The holocellulose reduction was due to the hemicellulose degradation during
the steam explosion treatment, as has been mentioned above. The sugar content in the
liquid fraction obtained during this treatment also confirmed this hemicellulose
degradation, since xylose was the main sugar present in this fraction. Eight percent of the
original solid material (E. globulus) was recovered as xylose, after the SE8 treatment, and
this could be used to produce value-added products.
Table 2. Chemical Composition of Control (Control A) and Exploded Chips (SE8)
Control A SE8
a a
Acetone extractives 1.1% 4.9%
a a
Hot water extractives 2.8% 7.5%
a a
Lignin 18.0% 18.4%
a a
Holocellulose 73.9% 64.7%
a a
Pentosans 17.9% 10.4%
Holocellulose / lignin ratio 4.1 3.5
a
Referred to weight/weight over dry wood
Table 3. Sugar Contents of the Liquid Fraction from the Steam Explosion
Treatment SE8
a b
g/L % extracted
Acetyl groups 1.7 4.6%
Glucose 0.2 0.5%
Xylose 3.0 8.0%
Arabinose 0.04 0.1%
Total 4.96 13.2%
a
Including monomers and polymers
b
Weight of extracted sugar respect to weight of original material
Kraft Pulping Process

Non-pretreated chips (control A) and exploded chips (SE8) were pulped under the
same conditions to compare the resulting pulps. The cooking time varied from 24 to 56
minutes (corresponding to an H-Factor varying from 180 to 400), in order to evaluate the
effect of steam explosion at different cooking conditions.
Total and screened kraft yields (without taking into account steam explosion
yield; in other words, the yield calculation was based on the solids content of the material
submitted to kraft pulping, whether steam-exploded or not) have been plotted versus the
H-Factor in Fig. 2a and 2b, respectively. The total yield of both control and exploded
samples decreased with the cooking time (higher H-Factor) because more lignin, and also
more carbohydrates, were dissolved in the cooking liquor. Total and screened yields
obtained with control chips were higher than those obtained with exploded chips in all
cases, except from screened yields when the H-Factor was lower than 200. In order to
explain this phenomenon, it has to be taken into account that when short pulpings were
performed, control chips were not cooked long enough and a high amount of rejects was
obtained; therefore a higher total yield and a lower screened yield were achieved. On the
other hand, when longer pulping was carried out, control chips were cooked long enough,
but exploded chips were overcooked, dissolving a high amount of carbohydrates in the
cooking liquor and obtaining lower yields. However, the last comparison was made for
the same H-factor, and the exploded and control chips did not need the same pulping
intensity. Therefore, a comparison focusing on the kappa number of the pulps would be
more appropriate.
In Fig. 2c and 2d it can be observed that the steam explosion pretreatment
increased the consumption of both Na2S and NaOH during kraft pulping, in contrast to
what has been reported by San Martin et al. (1995). However, this higher chemical
consumption produced pulp with a lower kappa number (as it will be explained below),
suggesting a higher efficiency of the chemical in delignification.
a) b)
70% 70%
Screened Yield
60% 60%
Total Yield
50% 50%
40% 40%
30% 30%
20% 20%
150 250 350 450 150 250 350 450
ControlA ControlA
H-Factor H-Factor
SE8 SE8
c) d)
100% 100%
NaOH Consumption
Na2S Consumption
80% 80%
60% 60%
40% 40%
20% 20%
0% 0%
150 250 350 450 150 250 350 450
ControlA ControlA
H-Factor H-Factor
SE8 SE8
Fig. 2. Yields and chemical consumption during kraft pulping of control (Control A ) and
exploded chips (SE8 ): total yield (a), screened yield (b), Na2S consumption (c), and NaOH
consumption (d)
In Fig. 3a and 3b, the kappa number and viscosity of exploded and control pulps
are plotted versus the H-factor. Kappa numbers of exploded pulps were much lower than
those obtained for control pulps due to the open structure of exploded chips, which
increases the reagent accessibility. A maximum reduction of 70% in the kappa number
(from 49 to 16) was observed when exploded chips were cooked under the mildest
conditions (H-factor of 180). These results are similar to those found by San Martin et al.
(1995), although they obtained a lower decrease in the kappa number (44% from control
pulp). Moreover, the kappa number decreased, as it was expected, when cooking was
more intensive (higher H-factor) because more lignin was removed. This drop in the H-
factor was lower in the cases of exploded pulps because the kappa number obtained with
an H-factor of 180 was already low, and removing the residual lignin was more difficult
and caused the degradation of more carbohydrates (providing a lower screened yield with
longer pulping processes).
With regard to pulp viscosity, similar values were found in most of the samples
and were comparable with the values reported for commercial pulps. However, the
viscosity of the exploded pulp decreased dramatically when the H-Factor was higher than
360 due to overcooking of the chips, causing cellulose degradation (not observed in
control chips). For an H-Factor of 270, the same viscosity was found for exploded and
control pulps although the kappa number was much lower for the former (11.2 versus
30.4). Therefore, higher delignification could be obtained with exploded pulp without
degrading carbohydrates.
Moreover, the content of hexenuronic acids (HexA) was found to be lower in
exploded pulp than in control pulp (Fig. 3c). Taking into account that hemicelluloses are
dissolved during the steam explosion pretreatment and that HexA are formed from xylans
during kraft pulping, exploded chips gave pulps with lower HexA content. This could be
a great advantage of the steam explosion pretreatment because the presence of HexA is
detrimental to bleaching, since it increases the consumption of bleaching chemicals
(Vuorinen et al. 1999; Ragnar 2001). On the other hand, the loss of hemicellulose in the
steam explosion pretreatment could be detrimental to the refining and mechanical
properties of the handsheets. This effect will be considered later in this article.
a) b) c)
μmol HexA / g dry pulp
60 1400 40
Viscosity (ml/g)
Kappa Number
50 1200 35
1000 30
40 25
800
30 20
600 15
20
400 10
10 200 5
0 0 0
150 250 350 450 150 250 350 450 150 250 350 450
ControlA ControlA ControlA H-Factor
SE8
H-Factor SE8 H-Factor SE8
Fig. 3. Kappa number (a), viscosity (b) and hexenuronic acids content (c) of kraft pulps obtained
from control (Control A ) and exploded chips (SE8 )
In Fig. 4, fibers from exploded and control pulps can be observed. These pictures
show that, after the 24 minute pulping process (H-factor of 190), control chips had not
cooked long enough, presenting a high number of fiber bundles (shives). On the contrary,
neither shives nor broken or degraded fibers were found in pulp produced from exploded
chips.
a) b)
Fig. 4. Pulp fibers obtained from (a) control chips (Control A) and (b) steam exploded chips (SE8)
From all these results, an H-factor of 200 (27 minutes at maximum temperature)
was selected, because a more intensive cooking would overcook the steam exploded
chips, as has been indicated above. This process was scaled up in a 26-L digester in order
to evaluate the effect of the scale change as a first step prior to the industrial scale-up.
The kappa number, the viscosity, and the total and screened kraft yield obtained for steam
exploded (SE8) and untreated chips (control A) are shown in Table 4.
Tabla 4. Yields and Pulp Characteristics Obtained during Scaled Up Kraft

Cooking and Subsequent Oxygen Delignification
SE8 Control A Control A+O2 Industrial
Kappa Number 15.5 50.6 26.4 14.0
Viscosity (ml/g) 1166 - 915 1136
a b
Screened Yield (%) 49.6 28.6 25.7 -
a
Total Yield (%) 51.6 64.9 - -
a
Screened and total yield were determinate without considering steam explosion yield.
b
Taking into account screened kraft yield and oxygen delignification yield.
A bigger difference in kraft yields between a steam-exploded and a control

sample was obtained when pulping was scaled up. However, the difference in kappa
number was found to be similar to that observed when pulping was performed in small
reactors.
As was mentioned above, pulp obtained from untreated chips (Control A) had
much higher lignin content than that obtained from exploded chips. In order to obtain a
more comparable pulp in terms of refining and paper properties, the control pulp was
subjected to oxygen delignification. In Table 4 it can be observed that, after this
treatment, the kappa number decreased significantly, but the viscosity also decreased.
However, with a steam explosion pretreatment, both a low kappa number and high
viscosity could be simultaneously obtained. These results corroborate that steam
explosion followed by a short kraft pulping pretreatment is a more efficient process than
short kraft pulping followed by oxygen delignification.
From all these results, it can be concluded that, under the same cooking
conditions, the steam exploded chips cooked faster and more efficiently than the
untreated chips, or alternatively, they could be pulped at a lower temperature and/or with
lower active alkali, while maintaining the same production rate (Ahvazi et al. 2007; San
Martin 1995; Wafa Al-Dajani et al. 2009). With the first option, the cooking time could
be reduced, increasing the production rate of the pulp mill. Moreover, as the
hemicelluloses have been removed before pulping, the charge of solids in the recovery
furnace has been reduced also and an increase of pulp production could be possible.
In these trials, the cooking time was reduced from 50 to 20 minutes to obtain a
pulp of similar characteristics (kappa number ~16 and viscosity ~1000 ml/g) with a good
yield (+50%). Even though the overall pulp yield of the process (including steam
explosion and kraft pulping) was lower (~40%), the pulp production of a hypothetic mill
could be maintained at a similar level because of the increase in pulp production.
Moreover, most of the hemicelluloses were removed before pulping without excessive
degradation and converted into value-added products. Finally, since the exploded pulp
had a very low HexA content, the consumption of chemicals in a subsequent bleaching
process is expected to be reduced also.
Refining and Handsheet Properties
60
50
40
ºSR
30
20
10
0
0 1000 2000 3000
Nº Rev. PFI
SE Control Indust.
Fig. 5. Refining degree (ºSchopper-Riegler) vs. refining intensity (PFI revolutions): SE ;

Control ; Indust.
The response of exploded pulp to refining was evaluated and compared with the
control pulp response. As has been mentioned, before refining, the control pulp was
subjected to oxygen delignification to obtain a pulp with lignin content similar to that of
the steam explosion pulp. Moreover, an industrial pulp (kindly provided by Torraspapel
group) was also refined and used as reference. The variation of the refining degree
(measured as Schopper–Riegler) with the intensity of the PFI refining is plotted in Fig. 5.
It can be observed that the exploded pulp exhibited a slower increase of ºSR with
PFI revolutions than control and industrial pulps did. This means that the exploded pulp
requires more energy to obtain a certain ºSR. This could be due to the removal of
hemicelluloses during the steam explosion pretreatment, as has been mentioned above.
Moreover, the control pulp showed a higher ºSR for a given PFI revolution number
compared to the industrial pulp studied.
Handsheets were formed from unrefined and refined control, industrial, and
exploded pulps, and their mechanical and optical properties were determined. Results are
shown in Fig. 6.
The unrefined steam exploded pulp showed a ºSR of 17, similar to that obtained
for unrefined control and industrial pulps (15 and 16 ºSR respectively). Also, the
mechanical properties were found to be similar to those of unrefined industrial pulp, apart
from the tensile index. This index is related to the linking capacity between fibers, so the
low value obtained for the exploded pulp could be due to the loss of hemicelluloses
during the steam explosion pretreatment. Tear index was found to be similar for
unrefined exploded and industrial pulps, which would indicate a similar degree of fiber
degradation, consistent with what San Martin et al. (1995) have reported.
It can be observed also in Fig. 6 that the apparent bulk density increased with
refining in a similar way for exploded, control, and industrial pulps.
The mechanical properties also increased with refining in all pulp samples, as was
expected. Tensile and burst indexes were found similar for control and industrial pulps
but lower for the exploded pulp. As has been mentioned above, this could be due to the
removal of hemicelluloses during steam explosion.
Although control and industrial pulp tear indexes were higher than the exploded
pulp tear index, the differences between them were lower than those observed in tensile
and burst indexes. Unrefined exploded and industrial pulps gave similar values of tear
index; however when refining was performed, the industrial pulp showed a better
evolution, providing higher values of tear index.
In order to compare optical properties, the brightness, yellowness index, and
opacity of dried pulp sheets were measured. The steam exploded pulp presented the best
optical properties, since its yellowness index was found to be much lower than that of the
control and industrial pulps, its opacity was higher than that of the control pulp, and its
brightness was higher than that of the industrial pulp. Considering the evolution of the
optical properties with refining, it can be observed that yellowness index and opacity did
not change, but brightness decreased when the ºSR increased. This could be caused by
the homogenization of the pulp resulting from the split of the microscopic fiber bundles
present in the pulps.
a) b)
0,9 100
Tensile Index (Nm/g)

App. Bulk Density
90
0,8
80
0,7 70
(g/cm 3)
0,6 60
50
0,5 40
0,4 30
20
0,3 10
0,2 0
10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60
ºSR ºSR
SE Control Indust. SE Control Indust.
c) d)
Burst Index (KPam 2/g)

11 6
Tear Index (mNm2/g)
10
5
9
8 4
7
3
6
5 2
4
1
3
2 0
10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60
ºSR ºSR
e) f)
45 50
Yellowness (%)
45
Bightness (%)
40
40
35
35
30
30
25
25
20 20
10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60
ºSR ºSR
Fig. 6. Mechanical and optical properties of handsheets from exploded (SE ), control (Control
) and industrial (Indust. ) pulps: a) apparent bulk density, b) tensile index, c) tear index,
d) burst index, e) brightness, and f) yellowness index.
Based on the last results, it can be concluded that although exploded pulp showed
slightly lower mechanical properties, optical properties were better than those of control
and industrial pulps. Therefore, depending on the final paper use, exploded kraft pulp
could be a good alternative to conventional kraft pulp.
Accelerated Ageing
The exploded, control, and industrial pulps were subjected to accelerated ageing
in order to study the evolution of their optical and mechanical properties. Moreover, the
effect of the steam explosion pretreatment on this evolution was evaluated.
Table 5 shows the changes occurring in mechanical and optical properties with
ageing. The reduction percentage for each mechanical or optical property was calculated
as an average of the reductions (positive values in Table 5) or increases (negative values
in Table 5) observed at different ºSR in each pulp before and after the accelerated ageing.
Table 5. Reduction of Mechanical and Optical Properties in Exploded, Control

and Industrial Pulps after Accelerated Ageing
SE8 Control A+O2 Industrial
Tensile Index -1.2% 4.2% -3.8%
Tear Index 8.3% 10.7% 16.2%
Burst Index -1.0% 8.4% 8.0%
Brightness 4.6% 9.2% 2.7%
Yellowness Index -16.7% -2.0% -9.3%
After six days of accelerated ageing, the tensile index did not decrease
significantly, while the tear and burst indexes were more affected. The steam exploded
pulp showed the lowest decrease in brightness with ageing of all samples, but in the
control pulp, the decrease was more pronounced than in the other pulps (9.2%). However,
the steam exploded pulp presented the biggest increase in yellowness index (-16.7%), but
even after ageing, the exploded pulp exhibited lower values of yellowness index than the
control and industrial pulps.
From all these results, the steam explosion pulps exhibited a more favorable
evolution with time, experiencing a lower decrease in their mechanical and optical
properties after the accelerated ageing.
CONCLUSIONS
1. During steam explosion pretreatment most of the hemicelluloses could be recovered

before pulping and converted in value-added products. In this way, a Eucalyptus
globlus kraft pulp mill could be transformed into a forest biorefinery.
2. The steam explosion pretreatment reduced the cooking time from 50 to 20 minutes,
obtaining a similar pulp and increasing the production rate of the mill.
3. Although the exploded pulp required more energy during refining, the mechanical
properties were found to be just slightly lower and the optical properties higher than
those from control and industrial pulps.
4. After an accelerated ageing both mechanical and optical properties were found to be
more stable for exploded pulp than for control and industrial pulps.
ACKNOWLEDGMENTS
funding this study via Project CTQ 2006-00385, CTQ 2009-11268, the Ramón y Cajal
Programme, and the FPI fellowship (BES2007 – 14528).
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Article submitted: November 11, 2010; Peer review completed: December 18, 2010;
Revised version received and accepted: December 23, 2010; Published: December 28,
2010.
PUBLICACIÓN V:
Biobleaching of Eucalyptus globulus kraft pulps: Comparison between pulps
obtained from exploded and non-exploded chips
Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., Villar, J.C.
Bioresource Technology. 2011. 102: 4530-4535.
245
Bioresource Technology 102 (2011) 4530–4535
Contents lists available at ScienceDirect
Bioresource Technology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/biortech
Biobleaching of Eucalyptus globulus kraft pulps: Comparison between pulps

obtained from exploded and non-exploded chips
R. Martín-Sampedro, M.E. Eugenio, J.C. Villar ⇑
Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria INIA, Carretera de la Coruña, km 7.5, 28040 Madrid, Spain
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: The aim of this work was to evaluate the response to biobleaching of steam exploded kraft pulps and to
Received 25 November 2010 compare the results with the controls. For this end, a laccase-mediator treatment using commercial
Received in revised form 22 December 2010 laccase (Novozyme 51003) and a natural mediator (acetosyringone) were assayed, followed by alkaline
Accepted 22 December 2010
extraction and hydrogen peroxide stages.
Available online 30 December 2010
Our approach resulted in exploded biobleached pulps with lower kappa number and improved optical
properties compared to controls, even after subjecting pulps to accelerated ageing. Additionally, use of
Keywords:
hydrogen peroxide was reduced. The LMS (laccase-mediator system) had a smaller impact on the prop-
Steam explosion
Biobleaching
erties of the bleached pulps and on hydrogen peroxide consumption than the steam explosion process
Laccase did.
Acetosyringone Ó 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Eucalyptus globulus
1. Introduction exploded pulps have showed better optical properties and a lower
hexenuronic acid content than control pulps (non-exploded) (Mar-
The steam explosion process consists in the treatment of tin-Sampedro et al., 2010). Bearing in mind all these findings,
lignocellulosic materials with high-pressure steam followed by a improving the efficiency of the bleaching process by using ex-
rapid decompression which forces the fibrous material to ‘‘exploded pulps seems a reasonable expectation and the evaluation
plode’’ into separated fibers and fiber bundles. If no chemicals of the steam exploded pulps response to bleaching could provide
are added to the process, the high-temperature of the steam re- interesting results.
leases acids from the acetylated wood components which catalyze Elemental chlorine free (ECF) and totally chlorine free (TCF) se-
auto-hydrolytic reactions in the wood polymers with the resulting quences are the main bleaching processes used at the pulp and pa-
loss of hemicellulose and decreased content of b-O-4 structures in per industry. However, TCF sequences normally use reagents such
lignin (Robert et al., 1988; Jakobsons et al., 1995; Josefsson et al., as oxygen, ozone or hydrogen peroxide which, because of their low
2002, 2001). selectivity for lignin, degrade cellulose and yield bleached pulps of
Steam explosion has been proposed for a wide range of lignocel- lower quality which account only for a limited part of the market.
lulosic applications, such as biomass fractionation, pre-treatment The application of biotechnology to this process has attracted
in bioethanol production or alternatives to conventional chemi- considerable interest. Many researchers have pretreated pulps
mechanical pulping (CMP) and chemi-thermo-mechanical pulping with enzymes, mainly with the laccase-mediator system (LMS), be-
(CTMP). Also, recent reports have shown that the cooking liquor fore applying the standard bleaching sequences (Viikari et al.,
diffuses more freely into the open structure of exploded chips 1986; Moldes et al., 2008; Eugenio et al., 2010a). These biobleach-
which leads to easier and shorter kraft pulping (Ahvazi et al., ing studies have shown that enzymatically pretreated pulps re-
2007; Martin-Sampedro et al., 2010). Moreover, hemicelluloses require a smaller amount of chemicals in subsequent bleaching
moved during the steam explosion pre-treatment can be further processes, that the quality of the pulp is maintained, if not im-
converted into value-added products such as ethanol, polymers proved, and that the pollutant load of the process effluents is re-
and other chemicals (Li et al., 2010). As a result of all this, the total duced. However, these biobleaching processes have never been
revenue streams for the pulp and paper industry could be in- applied to exploded pulps. The improvement of pulp properties
creased, converting the pulp mill into an integrated forest biorefin- with steam explosion, combined with the advantages resulting
ery (Ragauskas et al., 2006; Van Heiningen, 2006). In addition, from the use of enzymes, could increase the effectiveness of
conventional industrial bleaching processes.
⇑ Corresponding author. Tel.: +34 913476761; fax: +34 913476767. All these considerations have led our team to evaluate the
E-mail address: [email protected] (J.C. Villar). response to biobleaching of steam exploded kraft pulps and to
0960-8524/$ - see front matter Ó 2010 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.biortech.2010.12.090
R. Martín-Sampedro et al. / Bioresource Technology 102 (2011) 4530–4535 4531
compare the results with those obtained using non-exploded kraft were set at 10% and 17.5 U/g (o.d.p.), respectively. Here 1 U of lac-
pulps. case is defined as the amount of laccase required to convert
1 lmol/min of ABTS to its cationic radical (0.1 M phosphate buffer,
pH 6, 24 °C). Acetosyringone was the natural mediator used in all
2. Methods
enzymatic treatments at a concentration of 1.5% o.d.p. A few drops
of 0.05% Tween 80 were added. We designated this enzymatic
treatment as LMO2.
Controls (No-LMO2) were included in our experimental design.
Eucalyptus globulus chips and E. globulus kraft pulp were kindly
Although the laccase and the mediator were omitted here, the pulp
provided by La Montañanesa pulpmill (Torraspapel group, Spain).
was treated with an aqueous solution (buffer) with the same pH,
This industrial pulp was obtained using standard kraft pulping
time and temperature values as those used in other laccase
without steam explosion pre-treatment, nor oxygen delignifica-
pre-treatments, but without adding oxygen.
tion. Its initial kappa number, brightness and viscosity were 14,
The importance of oxygen presence during the enzymatic
34.4 °ISO and 1136 ml/g, respectively.
bleaching stage is well established; nevertheless, in order to study
2,2́-Azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate (ABTS) was
its degree of influence, we carried out another enzymatic experi-
purchased from Roche (Madrid, Spain). All other chemicals: aceto-
ment (called LM-NoO2) using the same conditions as those of the
syringone (ASG), sodium hydroxide (NaOH), magnesium sulfate
LMO2 treatment and without the addition of oxygen.
(MgSO4), diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), sodium sul-
fide (Na2S) and hydrogen peroxide (H2O2) were reagent-grade and
supplied by Merck (Barcelona, Spain) or Sigma–Aldrich (Madrid, 2.4. Alkaline extraction (E) and hydrogen peroxide (P) treatments
Spain).
Conditions for the alkaline extraction subsequent to the enzy-
2.2. Pulps production matic treatment were: 1.5% NaOH, 5% consistency and 90 °C tem-
perature for 120 min. Thereafter, pulps were washed, and a
The steam explosion treatment of the E. globulus chips consists hydrogen peroxide bleaching stage was applied under the follow-
of cold water pre-extraction followed by two steam explosion cy- ing conditions: 2% H2O2, 1.5% NaOH, 1% DTPA, 0.2% Mg2SO4, 5%
cles of 10 and 3 min each. In each cycle, chips were treated with consistency and 90 °C for 90 min. Residual hydrogen peroxide
steam at 183 °C (10 kg/cm2) and discharged at 6 kg/cm2 into a was analyzed in the bleaching effluent by standard titration.
blowing tank. The process yield was 80%, and 50% of the hemicel-
luloses were extracted. The composition of the exploded chips 2.5. Accelerated ageing
was: lignin content, 18.4%; holocellulose, 64.7%; acetone extrac-
tives, 4.9%; and hot water extractives, 12.4%. Next after the bleaching sequence (LEP), pulps were subjected
Steam exploded chips and control chips (no steam explosion) to accelerated ageing in order to study the influence of steam
were subjected to kraft cooking in a 26-L digester connected to a explosion and enzymatic pre-treatment on optical properties.
blowing tank by a pneumatic valve. The cooking liquor was heated Accelerated ageing consisted of a moist heat treatment conducted
indirectly with steam in an external tubular heat exchanger, and at 80 °C and 65% relative humidity for 6 days, in accordance to the
the cooking temperature was controlled by computer software. standard ISO 5630-3.
Operational conditions were: 18% active alkali, 20% sulfidity,
40 min to maximum temperature, 27 min at maximum tempera- 2.6. Pulps characterization
ture (160 °C) and a 6 L/kg liquor-to-wood ratio.
The pulp obtained from control chips was treated with oxygen Unbleached pulps and pulps obtained after each step of the
for further delignification in a 20-liter rotatory reactor with a jack- bleaching sequence (LEP) were characterized in terms of their kap-
et-type electrical heater. Conditions of oxygen delignification were pa number, viscosity, brightness, yellowness index and CIE L⁄a⁄b⁄
110 °C, 60 min, 0.6 MPa of oxygen pressure, 5% NaOH o.d.p. (over and CIE L⁄C⁄ coordinates, in conformity with the standards ISO
dry pulp), 0.5% MgSO4 o.d.p. and 10% consistency. 302, ISO 5351-2, ISO 2470, T 1216 and T 527, respectively.
2.3. Enzymatic bleaching stage (L)

3. Results and discussion
The enzyme used in the enzymatic stage was a commercial
laccase from Aspergillus sp. (Novozyme 51003) supplied by Novo- After kraft pulping, exploded pulps had lower kappa number
zymes (Denmark). According to the product sheet, optimal laccase (15.5 vs 50.6), higher brightness (42 vs 29 °ISO) and higher viscos-
activity requires 70 °C temperature and a pH of 6 (100 mM phos- ity (1166 vs 980 mg/l) than non-exploded pulps. Due to their high
phate buffer); however, placed in these conditions, this enzyme be- lignin content, non-exploded pulps needed further delignification
comes unstable after 30 min. With longer treatments, the enzyme before entering the bleaching sequence, so an oxygen delignifica-
remained stable at 40 °C and a pH of 6. Also, under these last con- tion step was set up for them. Afterwards, both the exploded and
ditions, bleached pulps achieved better properties after 2 h of the oxygen-delignificated non-exploded pulps were subjected to
enzymatic treatment (data not shown). In view of all this, we se- a biobleaching process. An industrial kraft pulp was also put
lected 40 °C, pH 6 and 2 h as ideal conditions for the enzymatic through the same biobleaching sequence in order to be used as
bleaching. reference.
All assays were performed in 500 ml pressurized reactors, using
50 g of exploded kraft pulp (SE) and 50 g of control pulp (non-ex- 3.1. Pulps properties
ploded, NoSE). Also, we chose an industrial kraft pulp (Ind) to be
subjected to this process and used as reference pulp. Pulps were in- Figs. 1–4 represent the application of a biobleaching sequence
tensely mixed with the laccase and chemicals before adding oxy- to the exploded, non-exploded and industrial E. globulus kraft
gen at a pressure of 6 kg/cm2 and placing them, for 2 h, in a pulps, showing changes in kappa number, pulp viscosity, bright-
40 °C thermostatic bath at a pH of 6. Consistency and laccase dose ness and yellowness index, respectively, after the laccase-mediator
4532 R. Martín-Sampedro et al. / Bioresource Technology 102 (2011) 4530–4535
Fig. 1. Pulp kappa numbers for each stage in LEP sequences. L: laccase stage; E: alkaline extraction stage; P: hydrogen peroxide stage; Ind: industrial pulp; NoSE: control pulp
without steam explosion pre-treatment; SE: steam exploded kraft pulp; No-LMO2: no laccase, no mediator, no oxygen; LMO2: laccase, mediator and oxygen; LM-NoO2:
laccase, mediator and no oxygen.
stage (L), the alkaline extraction (E) and the bleaching by hydrogen end of the LEP sequence, a pulp with a slightly lower reduction
peroxide (P). of the kappa number (52.3%) than that observed with 6 kg/cm2 of
Fig. 1 shows that the kappa number of the unbleached exploded oxygen pressure (SE:LMO2) (54.5%). These findings suggested that
kraft pulp was lower than that found for the unbleached non- oxygen presence is not required during the enzymatic stage to im-
exploded kraft pulp. This means that a steam explosion pre-treat- prove delignification, and similar results have been reported else-
ment, followed by short kraft pulping, caused higher delignifica- where (Eugenio et al., 2010b).
tion than short kraft pulping followed by oxygen delignification. The viscosity is an indirect indicator of the length of the poly-
On the other hand, the unbleached industrial pulp had a slightly saccharide chains in cellulose pulps. As Fig. 2 shows, non-exploded
lower kappa number than the exploded kraft pulp, suggesting sim- pulps had slightly less viscosity than exploded pulps. This can be
ilar delignification in both pulping processes. However, the steam explained by the elimination of short chain polysaccharides, such
explosion pre-treatment had the advantage of reducing the cook- as hemicelluloses, in the steam explosion treatment, resulting in
ing time, which can potentially increase the pulpmill productivity an increase in the average length of the polysaccharides. Hydrogen
(Martin-Sampedro et al., 2010). peroxide bleaching was found the most influential stage for viscos-
In most cases, each stage in the biobleaching sequence led to a ity reduction in the non-exploded pulps, whereas viscosity was
reduction in the kappa number. Moreover, using the LMS resulted mainly affected by the laccase treatment in the exploded pulps.
in more pronounced reductions of the kappa number after each The industrial and the exploded pulps had similar viscosity. How-
stage, compared to control treatments, an outcome also reported ever, hydrogen peroxide bleaching was found to be the viscosity
by other authors (Fillat et al., 2010; Valls et al., 2010). Thus, in determining stage for industrial pulps, as it was the case with
non-exploded pulps, the total reductions of the kappa number at the non-exploded pulps.
the end of the LEP sequence were 27.7% and 14.5% for biotreated Despite viscosity reductions being small, there were not big dif-
pulp (NoSE:LMO2) and its control (NoSE:No-LMO2), respectively. ferences in viscosity across all the bleaching processes. The same
Other authors have reported a greater reduction of the kappa num- result has been observed by Oudia et al. (2008), who have demon-
ber. However, these authors included more stages in the TCF strated that high biodelignification can be achieved without
bleaching sequence, used longer enzymatic and hydrogen peroxide decreasing pulp viscosity.
treatments and added chemicals in higher concentrations (Moldes Fig. 3 shows that the brightness of the unbleached exploded
et al., 2010). kraft pulp was very similar to the brightness of the unbleached
Kappa number reductions in exploded kraft pulps were greater non-exploded kraft pulp, in spite of the higher lignin content found
than in non-exploded pulps (54.5% vs 41.7% for the SE LMO2 and in the non-exploded unbleached pulp. In contrast to this, the
SE:No-LMO2 treatments, respectively). These last results proved unbleached industrial pulp showed lower brightness than the
that the steam explosion pre-treatment significantly increased aforementioned pulps, probably because of the effect of a longer
the reduction of the kappa number not only in laccase treated sam- pulping process.
ples but also in control pulps. When exploded pulps were com- Also in Fig. 3, it can be observed that the highest increase in
pared with an industrial pulp, a lower delignification was brightness took place during the hydrogen peroxide stage, as it
observed in the industrial pulp after the LEP bleaching (47.0% in was expected, whereas the laccase stage resulted in a reduction
biobleached industrial pulp [Ind:LMO2] and 36.6% in the control of brightness, probably as a result of the formation of chromoph-
pulp [Ind:No-LMO2]). These results also suggested that a steam ores during the oxidation of lignin by the laccase-mediator system
explosion treatment previous to kraft pulping could improve any (Fillat et al., 2010). This reduction was found more pronounced
subsequent bleaching process. This statement is in agreement with when the LMS was present, being these results consistent with
Josefsson et al. (2002), who reported that the stronger the steam others reported elsewhere (Moldes et al., 2008; Eugenio et al.,
explosion pre-treatment, the lower is the lignin content in pulps 2010a). However, at the end of the LEP sequence, the effect was re-
after a chemical bleaching. versed, and higher brightness was obtained when using LMS as a
To evaluate the effect of oxygen pressure in the LMS treatment, pre-treatment. Therefore, it can be concluded that the LMS treat-
a control without addition of oxygen was performed on the pulp ment improved the effectiveness in the subsequent bleaching
which showed the most efficient LEP bleaching (highest delignifi- stages, as other authors have also showed (Vivekanand et al.,
cation degree). This experiment (SE:LM-NoO2) produced, at the 2008; Moldes et al., 2010).
Fig. 2. Pulp viscosity for each stage in LEP sequences. L: laccase stage; E: alkaline extraction stage; P: hydrogen peroxide stage; Ind: industrial pulp; NoSE: control pulp
Fig. 3. Pulp brightness for each stage in LEP sequences. L: laccase stage; E: alkaline extraction stage; P: hydrogen peroxide stage; Ind: industrial pulp; NoSE: control pulp
If the brightness of exploded pulps at the end of the LEP se- stage (L), being this increase more pronounced in the presence of
quence is compared to that of non-exploded pulps at the same LMS, and even more in the exploded kraft pulp. After the E stage,
point in the process, it is obvious that the steam explosion pre- the yellowness index decreased in most cases to values near to
treatment favored an increase in brightness during bleaching; spe- those of the unbleached pulp. However, it was in the P stage that
cifically 25.2% over 16.3% ISO, for SE:LMO2 and NoSE:LMO2 respec- the biggest reductions took place. On the other hand, if the whole
tively. The industrial pulp (Ind:LMO2) reached a final brightness LEP sequence is taken into consideration, a reduction in the yellow-
higher than the non-exploded pulp but lower than the exploded ness index between 7 and 15 was found in bleached pulps
pulp, which leads to conclude again (as when the kappa number compared to the unbleached ones. Furthermore, the lowest yellow-
was discussed above) that introducing the steam explosion before ness index was that of the steam exploded pulps, suggesting that
pulping improves the subsequent bleaching process. the steam explosion treatment contributes to yield pulps with less
Fig. 3 shows that, at the end of the LEP sequence, the control color and therefore closer to the ideal white.
pulp, SE:LM-NoO2, had higher brightness than SE:LMO2 (26.4% vs CIE L⁄a⁄b⁄ and CIE L⁄C⁄ color coordinates were measured after
25.2% ISO). Taking into account that this difference was not highly the P stage in pulps obtained by the most efficient bleaching se-
significant, and that the addition of oxygen did not improve the quence, corresponding in all cases to those in which LMS was used.
delignification considerably (as mentioned earlier in regards with These results were compared with those of unbleached pulps, in or-
the kappa number), it can be concluded that the addition of oxygen der to evaluate color changes undergone during the biobleaching
during the enzymatic bleaching was not a requisite to improve the process, since the color appearance of paper is an important param-
bleaching process. eter in many different applications. Therefore, a numerical defini-
Fig. 4 shows the yellowness index of pulps before and after each tion of color is essential for good quality control and for a good
bleaching stage. It can be observed that the unbleached steam ex- customer–producer relationship. Furthermore, good white base col-
ploded kraft pulp has a lower yellowness index than the non-ex- ors are necessary where products are to be dyed, printed, or other-
ploded and the industrial kraft pulps. During the LEP sequence, wise colored. The brightness and full range of color in color printing
an increase in the yellowness index occurred after the enzymatic depend to a large extent upon the whiteness of the base paper.
Fig. 4. Pulp yellowness for each stage in LEP sequences. L: laccase stage; E: alkaline extraction stage; P: hydrogen peroxide stage; Ind: industrial pulp; NoSE: control pulp
After a LEP bleaching sequence, all pulps increased L⁄ and de- tion of steam explosion and LEP bleaching provided the most effi-
creased C⁄ (i.e. lightness increased and color decreased) compared cient bleaching process, yielding pulp with better colorimetric and
to the unbleached pulps. However, although the decrease in color optical properties.
was lower for the SE:LMO2 pulp (DC⁄, 0.8 vs 2.9 and 4.7, for No-
SE:LMO2 and Ind:LMO2, respectively), this pulp showed the lowest 3.2. Hydrogen peroxide consumption
color (C⁄, 11.2 vs 16.3 and 12.6 for NoSE:LMO2 and Ind:LMO2,
respectively) and also the highest lightness (L⁄, 91.9 vs 90.5 and Hydrogen peroxide consumption was assessed in all our exper-
90.6 for NoSE:LMO2 and Ind:LMO2, respectively), suggesting that iments. Samples subjected to a steam explosion pre-treatment
the steam explosion helped to produce pulps with better colori- showed lower hydrogen peroxide consumption during the P stage
metric coordinates. The LEP bleaching also decreased the a⁄ and (55.7–54.0%) than control pulps (77.6–66.8%) and industrial pulps
b⁄ coordinates for the steam exploded pulp (Da⁄ = 4.1 and (79.5–59.1%). Keeping in mind that hemicelluloses dissolve during
Db⁄ = 0.3), the control pulp (Da⁄ = 2.1 and Db⁄ = 2.9) and the indus- the steam explosion pre-treatment and that acidic groups on xylan
trial pulp (Da⁄ = 2.9 and Db⁄ = 4.5). turn into hexenuronic acid during kraft pulping, there is reason to
In Fig. 5, reflectance is plotted vs wavelength. The LEP bleaching expect that exploded chips will yield pulps with less hexenuronic
sequence gets the unbleached pulps closest to the ideal white, i.e. acid. In our experience, the hexenuronic acid content of the ex-
100% reflection of all wavelengths within the visible spectrum. Fur- ploded pulp was 4 lmol/g, vs 30 and 37 lmol/g in non-exploded
thermore, the steam explosion pre-treatment resulted in higher and industrial pulps, respectively. According to Vuorinen et al.
reflectance for the bleached pulp (SE:LMO2), in spite of the low (1999) and Ragnar (2001), consumption of bleaching chemicals is
reflectance observed with wavelengths above 440 nm before the minimum when the hexenuronic acid content of pulps is the low-
bleaching process. Moreover, for wavelengths close to 457 nm est. Thus, a steam explosion pre-treatment, prior to kraft pulping,
(brightness measurement), the differences in reflectance between can be expected to reduce the chemical consumption in subse-
SE:LMO2 and the other bleached pulps (NoSE:LMO2 and Ind:LMO2) quent bleaching.
were more pronounced, as the brightness values showed (Fig. 3). A logical consequence of lignin removal (kappa number reduc-
Based on these last results, it can be concluded that the combination) in the LMS pre-treatment is less hydrogen peroxide use in a
further bleaching stage: the lignin remaining in the pulp has been
partially oxidized by the LMS and, as a consequence, the need for
hydrogen peroxide is reduced. Consequently, when LMS was not
used during the enzymatic treatment in our experiments, demands
for hydrogen peroxide were higher (55.7% vs 54.0% for exploded
pulps, 77.6% vs 66.8% for non-exploded pulps and 79.5% vs 59.1%
for industrial pulps).
However, if no oxygen was added during this enzymatic treat-
ment, hydrogen peroxide consumption decreased (51.2%). This
finding is consistent with the outcomes in kappa number and opti-
cal properties, suggesting that the addition of oxygen is not essen-
tial since no saving on chemical reagent nor improvement in pulp
quality was observed.
3.3. Accelerated ageing
Accelerated ageing of bleached pulps was conducted in order to

evaluate the effect that steam explosion and laccase treatments
Fig. 5. Reflectance curves of pulps before and after LEP sequences. Ind is related to
had on the optical properties of pulps.
industrial pulp; NoSE: control pulp without steam explosion pre-treatment; SE: Yellowness index measurements are used primarily to study
steam exploded kraft pulp; LMO2: laccase, mediator and oxygen. degradation of white color. The yellowing of paper caused by
Table 1 est optical properties, even after accelerated ageing. In addition,

Influence of an accelerated ageing treatment in brightness and yellowness of this process resulted in a 20% reduction of hydrogen peroxide
industrial, control and exploded kraft pulps.
consumed.
Brightness Yellowness The addition of oxygen during the enzymatic treatment did not
Originala Agedb Reduction Originala Agedb Increase improve significantly the properties of the bleached pulps but it
Ind: No-LMO2 52.9 38.9 15.3 29.7 40.1 10.4
could provide pulps with more stable properties.
Ind: LMO2 63.3 44.7 19.3 23.7 35.4 11.7
NoSE: No-LMO2 57.5 53.1 4.5 29.7 31.8 2.2 Acknowledgements
NoSE: LMO2 59.2 54.9 4.3 29.7 31.4 1.8
SE: No-LMO2 66.0 60.8 5.2 20.4 23.6 3.2
The authors wish to thank the Spanish Ministry of Science and
SE: LM-NoO2 68.5 61.8 6.7 20.2 23.9 3.7
SE: LMO2 67.3 62.6 4.7 20.8 22.9 2.1 Innovation for funding this study via the Projects CTQ 2006-00385
a
and CTQ 2009-11268 and the FPI fellowship (BES2007–14528).
Before the accelerated ageing treatment.
b
After the accelerated ageing treatment.
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ageing (from light exposure and/or high temperature and humid- exploded mixed hardwood chips. J. Wood Chem. Technol. 27 (2), 49–63.
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Table 1 lists the yellowness index and the brightness before and Eugenio, M.E., Santos, S.M., Carbajo, J.M., Martín, J.A., Martín-Sampedro, R.,
after accelerated ageing of industrial, non-exploded and exploded González, A.E., Villar, J.C., 2010a. Kraft pulp biobleaching using an
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soluble fraction of steam exploded birch wood. Holzforschung 49, 51–59.
Nevertheless, optical properties were best in the exploded pulp, Josefsson, T., Lennholm, H., Gellerstedt, G., 2001. Changes in cellulose
even after undergoing accelerated ageing, with the highest value supramolecular structure and molecular weight distribution during steam
in brightness and the lowest yellowness index. The different re- explosion of aspen wood. Cellulose 8, 289–296.
Josefsson, T., Lennholm, H., Gellerstedt, G., 2002. Steam explosion of aspen wood.
sponses to accelerated ageing showed by pulps in our study could Characterization of reaction products. Holzforschung 53 (3), 289–297.
result from the interaction of multiple factors, such as the lignin, Li, H., Saeed, A., Jahan, M.S., Ni, Y., Van Heiningen, A., 2010. Hemicellulose removal
hexenuronic acid and hemicellulose contents (Vuorinen et al., from hardwood chips in the pre-hydrolysis step of the kraft-based dissolving
pulp production process. J. Wood Chem. Technol. 30, 48–60.
1999; Sevastyanova et al., 2005). Martin-Sampedro, R., Revilla, E., Martin, J.A, Eugenio, M.E., Villar, J.C., 2010.
The effect of the LMS in the bleaching sequence can also be ob- Evaluation of steam explosion as a pretreatment prior to kraft pulping of
served in Table 1. With the only exception of the industrial pulp, Eucalyptus globulus wood. In: Proceeding of VI Iberoamerican Congress on Pulp
and Paper Research (CIADICYP), Lisboa, Portugal, pp. 62–63.
the enzymatic treatment provided pulps with more stable optical
Moldes, D., Díaz, M., Tzanov, T., Vidal, T., 2008. Comparative study of the efficiency
properties, reducing variations of brightness and yellowness. This of synthetic and natural mediators in laccase-assisted bleaching of eucalyptus
effect was more pronounced in the exploded pulp, suggesting that kraft pulp. Bioresour. Technol. 99, 7959–7965.
Moldes, D., Cadena, E.M., Vidal, T., 2010. Biobleaching of eucalypt kraft pulp with a
the combination of both treatments could be more advantageous.
two laccase-mediator stages sequence. Bioresour. Technol. 101, 6924–6929.
Other authors have reported that the enzymatic treatment in- Oudia, A., Queiroz, J., Simoes, R., 2008. Potential and limitation of Trametes
creases the brightness reversion (Cadena et al., 2010). However, versicolor laccase on biodegradation of Eucalyptus globulus and Pinus pinaster
it should be noted that their results were assessed after the alka- kraft pulp. Enzyme Microb. Technol. 43, 144–148.
Ragauskas, A.J., Nagy, M., Kim, D.H., Eckert, C.A., Hallett, J.P., Liotta, C.L., 2006. From
line extraction and not after the hydrogen peroxide stage, which wood to fuels: integrating biofuels and pulp production. Indus. Biotech. 2 (1),
could remove compounds that contribute to increase the bright- 55–65.
ness reversion. Ragnar, M., 2001. On the importance of the structural composition of pulp for the
selectivity of ozone and chlorine dioxide bleaching. Nordic Pulp Pap. Res. J. 16,
Finally, when a control was run with no addition of oxygen in 72.
the laccase treatment (SE:LM-NoO2), both the brightness and the Robert, D., Bardet, M., Lapierre, D., Gellerstedt, G., 1988. Structural changes in aspen
yellowness index were less stable than those of pulps obtained lignin during steam explosion treatment. Cell. Chem. Technol. 22, 221–230.
Sevastyanova, O., Lindström, M.E., Gellerstedt, G., 2005. Influence of a bleaching
with oxygen addition (SE:LM-O2). Therefore, although oxygen did sequence on the brightness stability of eucalyptus kraft pulp. Appita 251, 255.
not improve pulp properties before ageing, as indicated above, Valls, C., Vidal, T., Roncero, M.B., 2010. The role of xylanases and laccases on
there is a possibility that it could provide pulps with more stable hexenuronic acid and lignin removal. Process Biochem. 45, 425–430.
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Vuorinen, T., Fagerström, P., Buchert, J., Tenkanen, M., Teleman, A., 1999. Selective
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LMS and steam explosion took on the advantages of both pre-treat- bleaching of kraft pulps. Pulp Pap. Sci. 25 (5), 155.
ments and provided pulps with minimum kappa number and high-
PUBLICACIÓN VI:
Combination of steam explosion and laccase-mediator treatments prior to
Eucalyptus globulus kraft pulping.
Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., Carbajo, J.M., Villar, J.C.
Bioresource Technology. 2011. 102: 7183-7189.
253
Bioresource Technology 102 (2011) 7183–7189
Contents lists available at ScienceDirect
Bioresource Technology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/biortech
Combination of steam explosion and laccase-mediator treatments prior

to Eucalyptus globulus kraft pulping
R. Martín-Sampedro, M.E. Eugenio, J.M. Carbajo, J.C. Villar ⇑
Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria INIA, Carretera de la Coruña, km 7.5, 28040 Madrid, Spain
a r t i c l e i n f o a b s t r a c t
Article history: The effect of a pretreatment consisting of steam explosion (SE) followed by a laccase mediator system
Received 1 February 2011 (LMS) stage on Eucalyptus globulus kraft pulping has been evaluated and compared with fungal pretreat-
Received in revised form 14 April 2011 ments. Pretreatment with SE and LMS was more efficient than pretreatments using Pycnoporus sanguin-
Accepted 18 April 2011
eus and Trametes sp. I-62. Steam explosion not only improved the enzyme penetration into the wood
Available online 23 April 2011
chips and shortened the pulping process by 60%, but also extracted around 50% of the hemicelluloses
which could be converted into value-added products. The optimal conditions for the LMS treatment were
Keywords:
3 h, 3 UA/g and 40 °C. Compared to SE, the SE/LMS treatment yielded an increase in delignification of
Steam explosion
Biopulping
13.9% without affecting pulp properties, provided a similar screened kraft yield, and reduced consump-
Laccase tion of chemical reagents Na2S and NaOH by 11.5% and 6.3%, respectively. Therefore, SE/LMS is a prom-
White-rot fungi ising pretreatment for converting the pulp mill into a forest bio-refinery.
Eucalyptus globulus Ó 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction consumption (Maijala et al., 2008; Ramos et al., 2004) and in-
creased the extent of delignification (Dyer and Ragauskas, 2004;
Biopulping is the biological pre-treatment of wood chips to Jacobs-Young et al., 1998; Zhao et al., 2002).
modify wood composition such as lignin content, with the aim of One disadvantage of enzymes for biopulping is their low effec-
facilitating fiber separation or lignin removal in a subsequent tiveness due to difficulties in penetrating the chips (Grethlein,
mechanical or chemical pulping process. The concept of biopulping 1985). Therefore, enzymes have been applied to raw wood material
is based on the ability of some white-rot fungi to degrade lignin which has previously been defibrated to a certain extent (Burton,
selectively in the initial period of wood decay, leaving cellulose rel- 2001), or to chemical pulp in the bleaching process (Eugenio
atively intact (Bajpai et al., 2001; Ferraz et al., 2008; Mendonça et al., 2010). Alternatively, a vacuum (Jacobs-Young et al., 1998)
et al., 2008). White-rot fungi are not only capable of producing or pressure (Maijala et al., 2008; Pere et al., 2005) can be applied
lignin-degrading enzymes, but are also able to penetrate into the to facilitate enzyme penetration into the wood chips.
substrate to transport these enzymes into materials such as wood In the current study, steam explosion is being explored as a
chips (Messner and Srebotnik, 1994). means to facilitate enzymes penetration. This process consists in
Biotreatment could produce energy savings during defibration the treatment of lignocellulosic materials with high-pressure
or refining steps, increase in delignification rate, decrease in alkali steam followed by rapid decompression. The sudden release of
consumption, improve of pulp strength properties and reduce pul- pressure in the ‘‘explosion’’ results in fiber separation and physical
ping time and bleaching chemical consumption (Bajpai et al., 2001; rupture of the fiber walls. This open structure of the exploded chips
Islam et al., 2008; Mendonça et al., 2008; Messner and Srebotnik, not only increases the enzymatic hydrolysis of biomass for the pro-
1994; Oriaran et al., 1990; Wolfaardt et al., 2004), but fungal duction of fermentable sugars (Jurado et al., 2009; Ruiz et al., 2007;
growth can be slow, maintenance of aseptic and optimal condi- Wu et al., 1999), but also leads to easier and shorter kraft pulping,
tions during the long treatment time is required and yield loss owing to the efficient diffusion of cooking liquor into the fibers
due to fungal degradation of polysaccharides can occur. Therefore, (Ahvazi et al., 2007; Martin-Sampedro et al., 2011).
the direct application of enzymes on wood chips is being explored. The enzymes used in biopulping include cellulases, hemicellu-
It has been shown that enzymatic pre-treatments enhanced con- lases (xylanases), pectinases and ligninolytic enzymes such as lig-
ventional mechanical and chemical pulping, reduced energy nin peroxidases and manganese peroxidases. The laccase-mediator
system (LMS), which is used for biobleaching, has usually only
been used in combination with other enzymes for biopulping
⇑ Corresponding author. Tel.: +34 913476761; fax: +34 913476767. applications (Dyer and Ragauskas, 2004; Maijala et al., 2008;
E-mail address: [email protected] (J.C. Villar). Petit-Conil et al., 2002). In the current study, LMS treatment
0960-8524/$ - see front matter Ó 2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.biortech.2011.04.053
following steam explosion was carried out and results were com- to convert 1 lmol/min of ABTS to its cationic radical (k = 436 nm,
pared with those of treatment with Pycnoporus sanguineus and Tra- eo = 49600 M1 cm1, 0.1 M phosphate buffer, pH 6 at 24 °C).
metes sp. I-62 prior to kraft pulping of Eucalyptus globulus wood Assays were performed using steam exploded chips prepared as
chips. it was described in Section 2.2.1. The chips were placed into
500 mL pressurized reactors, 0.2 mL of 0.05% Tween 80 was added,
and oxygen was introduced until reaching a pressure of 6 kg/cm2.
2. Methods
The reactors were submerged into a thermostatic bath to assure
a constant temperature of 40 °C.
2.3. Inoculum preparation and fungal treatment

All chemicals used were reagent-grade and were obtained from
Merck (Barcelona, Spain), Panreac (Barcelona, Spain) or Sigma–
E. globulus chips were treated with the ligninolytic fungi, P. san-
Aldrich (Madrid, Spain), except for 2,20 -Azino-bis-3-ethylbenzthiaz-
guineus and Trametes sp. I-62, obtained from Instituto Jaime Ferrán
oline-6-sulphonate (ABTS) purchased from Roche (Madrid, Spain).
de Microbiología-CIB collection. The fungi were grown on 2% malt
E. globulus wood chips were kindly supplied by La Montañanesa
extract media plates supplemented with 2% agar at 28 °C for 7 days
pulp mill (Torraspapel group, Spain). The enzymes used in this
and stored at 4 °C. Media plugs overgrown with mycelium were
work were Novozym 51003 (laccase) and Pulpzyme HC (xylanase)
used to start a preinoculum in sterilized liquid medium (plugs
produced by submerged fermentation of genetically modified
from one plate of 90 mm Ø per 200 mL of distillated water). Cul-
Aspergillus sp. and Bacillus sp. respectively. Both enzymes were
tures were incubated at 28 °C on a rotary shaker at 100 rpm for
supplied as donation by Novozymes (Bagsvaerd, Denmark).
2 days. Two-hundred milliliter of the culture was used to inoculate
200 g of sterilized wood chips that were not steam exploded.
2.2. Enzymatic treatment The effect of extraction with solvents on the biokraft process
was studied with chips without any extraction steps (NoE), and
2.2.1. Steam explosion treatment chips extracted with hot water (W), acetone (AC) and acetone
Before enzymatic treatment, E. globulus chips were subjected to and then with hot water (AC + W), respectively. Each extraction
steam explosion pre-treatment in order to facilitate the enzymes was carried out for 36 h in a Soxhlet type extractor. After pre-
penetration into the chips. Steam explosion conditions were se- extractions, chips were autoclaved and inoculated with the indi-
lected according to previous work (Martin-Sampedro et al., 2011) vidual fungi. The biotreatments were performed in 2 L reactors
and consisted of cold water pre-extraction (16 h at 25 °C) followed equipped with a system that provide a flow of sterilized air into
by two steam explosion cycles of 10 and 3 min each. In each cycle, each reactor for 1 min each hour. Reactors were placed in a device
chips were treated with steam at 183 °C (10 kg/cm2) in a 26 L rotating at 1.25 rpm for 1 min each hour. After 28 days at 28 °C,
stainless steel vessel and discharged at 6 kg/cm2 into a blowing chips were washed with acetate buffer (pH 5.2) to remove the
tank. Then, steam exploded (SE) chips were washed with cold superficial mycelium. The decayed wood chips were air dried at
water and air-dried. room temperature, and their moistures were determined. The
Water retention, or hydration capacity, of the chips was calcu- weight losses were calculated from the initial and final chips dry
lated as the weight of water absorbed by the chips after being im- weights. Control samples (without fungi) of each extraction were
mersed in water for 6 h, and expressed as grams of absorbed water also prepared.
per 100 g of dry wood.
2.4. Production of pulps
2.2.2. Experimental design to optimize laccase-mediator treatment
Preliminary experiments had shown that LMS treatment at Chips not exposed to steam explosion, chips not treated with
40 °C with an oxygen pressure of 6 kg/cm2 was efficient and these the fungi and chips treated enzymatically or fungi were subjected
conditions were fixed in the experimental design, and thus laccase to kraft pulping in 1 L pressurized reactors. The pulping equipment
dose and the treatment time were the only independent variables. consisted of four reactors placed into a 20 L rotary pressurized ves-
A 32 factorial design was used to examine the influence of the inde- sel that contained hot water for indirect heating. This rotary vessel
pendent variables on a subsequent kraft pulping. The total number had a jacket-type electrical heater controlled by a computer to set
of experiments required for the considered experimental design the cooking temperature. Cooking conditions were: 60 g of dry
was nine (Table 1). The LMS, consisting of the laccase enzyme chips, 4 L/kg liquor–wood ratio, 16% active alkali, 20% sulfidity,
(Novozyme 51003) and HBT (5 mM) as mediator, was applied at 160 °C cooking temperature, and 60 min to maximum tempera-
40 °C and pH 6 (100 mM phosphate buffer) to the substrate with ture. The time at maximum temperature was adjusted to reach
a solid–liquid ratio of 75 g/L. The laccase dose was expressed as an H-Factor of 450 and 180 for non-exploded and exploded chips
units of laccase activity per gram of dry wood (UA/g) where 1 U respectively, to assure that the different control pulps had a similar
of laccase activity was defined as the amount of laccase required kappa number. After each batch, the reactors were removed from
the vessel, and the cooked chips were washed, disintegrated in a
pulp disintegrator and screened through 0.2 mm slots. Rejects
Table 1
Experimental design to study the laccase treatment: values of independent variables. and accepted pulps dry weights were determined to calculate
screened and total yields. Black liquors were titrated with HCl to
Experiments Time (h) Laccase (UA/g)
determine consumption of chemical reagents (Na2S and NaOH).
1 1 3.0 The kappa number and viscosity were determined in the pulp sam-
2 1 16.5 ples according to ISO 302 and ISO 5351-2, respectively.
3 1 30.0
4 3 3.0
5 3 16.5 2.5. Preparation and testing of handsheets
6 3 30.0
7 5 3.0 Pulps obtained after steam explosion and enzymatic pre-treat-
8 5 16.5
ment plus kraft pulping were used to evaluate the optical and
9 5 30.0
mechanical paper properties. The degree of refining (Schopper–
Riegler) was determined according to ISO 5267-1 and handsheets ing kraft pulping if the laccase or the mediator have been joined to
were formed from these unrefined pulps according to ISO 5269- the fibers. Thus, when medium and high laccase doses were as-
2. Apparent bulk density, tensile index and tear index were deter- sayed, the increase in the chemical consumption was higher than
mined according to ISO 5270; brightness and opacity according to the reduction due to the enzymatic oxidation of lignin, resulting
ISO 2470 and ISO 2471. in an increase in chemical consumption.
A higher delignification after kraft pulping was found in LMS
pretreated samples (Fig. 1e) without a strong degradation of the fi-
bers, since differences in viscosity lower than 10% were observed
when treated and exploded pulp are compared (Fig. 1f). The high-
3.1. Enzymatic treatment
est delignification was achieved when the pre-treatment was car-
ried out for 3 h with a laccase dose of 3 UA/g of dry wood,
3.1.1. Steam explosion treatment
obtaining an unbleached pulp with a kappa number of 13.7, which
To facilitate the enzymes penetration into the wood chips, a
means an increase in delignification of 13.9% (compared to kappa
steam explosion (SE) pre-treatment was carried out. The water
number of exploded control pulp: 16.0). When a longer treatment
retention capacity of the chips increased after SE treatment from
was carried out with the same laccase dose, lower but significant
67 to 272 g of water per 100 g of dry wood. This finding suggests
kappa number reduction was observed (14.8 vs 16.0). Significant
that the accessibility of the exploded chips has been increased,
delignification was also found when laccase dose was 16.5 UA/g,
which could also improve the diffusion of enzymes during a subse-
independently of the treatment time, obtaining pulps with kappa
quent enzymatic treatment.
number between 14.2 and 14.4 (increase in delignification of
The effect of this pre-treatment on kraft pulping was evaluated
10.0–11.1% compared to exploded control pulps). However, for
comparing the average kappa number, viscosity, screened kraft
high laccase dose (30 UA/g) and treatment times of 3 and 5 h, the
yield and chemical consumption of the exploded samples with
kappa number of the resulting kraft pulps was higher than those
those of controls without steam explosion pre-treatment. A reduc-
of exploded control pulps. This observation indicates possible
tion in kappa number of 67.8% (15.7 vs 48.8 in control pulp) was
grafting of the LMS onto the pulp fiber (Dyer and Ragauskas,
observed, while the viscosity and the NaOH consumption were in-
2004). Thus use of a low laccase dose requires an enzymatic treat-
creased by 23.8% and 9.1% respectively, in agreement with other
ment of at least 3 h; whereas with a medium dose, 1 h of treatment
works (Ahvazi et al., 2007; Martin-Sampedro et al., 2011). Further-
was enough to increase delignification after kraft pulping. Treat-
more, screened kraft pulping yield was found higher for exploded
ments in the presence of higher laccase for more than 1 h of treat-
sample (49.6%) than for control pulp (28.9%), even if the overall
ment had a negative effect on kappa number.
yield of the process (including steam explosion) is considered
Fig. 2 shows the mechanical and optical properties of the hand-
(39.3%). Control pulp has lower screened yield because non-ex-
sheets formed from the unrefined pulps obtained using the steam
ploded chips would need a longer pulping to reduce the amount
explosion and enzymatic pre-treatment plus kraft pulping. All
of uncooked material (rejects), due to their less open structure
pulps presented a degree of refining of 15° Schopper–Riegler and
compared to exploded chips.
no big differences (lower than 4%) were observed in apparent bulk
density (around 0.39 g/cm3). Tensile and tear indexes were similar
3.1.2. Experimental design to study laccase-mediator treatment to those of exploded control pulps in most of the cases, but slightly
The influence of the laccase dose and the treatment time in total higher variation for 1 h treatments was observed. Contrarily,
and screened kraft yield, NaOH and Na2S consumptions and kappa Petit-Conil et al. (2002) observed an increase in mechanical prop-
number and viscosity of the obtained pulps is shown in Fig. 1. erties when spruce chips were treated with LMS prior to thermo-
In Fig. 1a and b it can be observed that the highest total and mechanical pulping (TMP), likely due to the different behavior of
screened kraft yields were found for longer treatment (5 h), softwood and hardwood and the different pulping process used
although no clear correlation was observed between the treatment by these authors.
time and the kraft yields. Screened kraft yield decreased when the Regarding to optical properties, a change in opacity often relates
laccase dose increased, except for 1 h of treatment at the highest to a change in the brightness of the paper (darker paper shows
laccase dose. Therefore, when a LMS treatment was carried out higher opacity), but opacity is also related to the light scattering
for 5 h with a laccase dose of 3 UA/g the highest increase in ability of paper (Maijala et al., 2008). Although treated samples
screened kraft yield was found (2.8%) followed by the treatment presented optical property values close to those of exploded con-
with 16 UA/g of laccase during 5 h (2.3%). From these results it trol samples, opacity tended to decrease when laccase doses and
can be pointed out that to increase kraft yield, at least 5 h of enzy- treatment times were increased, except for 5 h treatments. In con-
matic treatment were needed and that, even in this case, high lac- trast, brightness showed a slight increase with treatment time in
case doses were detrimental. most of the cases, but no with laccase dose, as the highest bright-
NaOH consumptions during kraft pulping of the different lac- ness (one point higher than control) for a medium laccase dose
case treated samples were lower than those of control samples (16.5 UA/g) at 5 h was obtained. Therefore, despite the highest del-
(around 67% in most of the cases; Fig. 1c). When 5 h treatments ignification after 3 h in the presence of 3 UA/g, these conditions did
were carried out with a laccase dose of 30 UA/g, the lowest NaOH not cause a change in brightness compared to that of the control.
consumption was observed (58%). However, Na2S consumptions This finding is in concordance with that reported by Dyer and
were found higher than those of control samples in most of the Ragauskas (2004) who found that LMS treated chips were darker
cases when high and medium laccase doses were used (Fig. 1d). than control chips before pulping, but these color differences were
For low laccase dose (3 UA/g), reductions in Na2S consumption no longer apparent in most of the resulting pulps after kraft
were observed. Therefore, laccase pre-treatment could reduce both pulping.
NaOH and Na2S consumptions during kraft pulping when a low Therefore, when LMS treatment with 3 UA/g at 40 °C for 3 h was
laccase dose was used, but an increase in Na2S consumption could carried out after a steam explosion treatment and prior to kraft
take place for high laccase doses. An explanation for the reduction pulping of E. globulus, pulps with a lower kappa number than that
in chemicals needed after LMS treatment could be that lignin par- of exploded control pulp (reduction of 2.3 units) could be obtained.
tially oxidized by the LMS would needed less chemical input for This treatment showed no negative effects on mechanical and
solubilization whereas some chemicals have to be consumed dur- optical properties, resulted in screened kraft yields similar to those
(a) 56% (b) 54%

54% 52%
Screened Kraft Yield

52%
Total Kraft Yield
50%
50%
48%
48%
46%
46%
44% 44%
42% 42%
1h 3h 5h 1h 3h 5h
3 UA/g 16 5 UA/g
16.5 30 UA/g Control 3 UA/g 16 5 UA/g
16.5 30 UA/g Control
(c) 100% (d)100%

90% 90%
80% 80%
% NaOH Consumption
% Na2S Consumption
70% 70%
60% 60%
50% 50%
40% 40%
30% 30%
20% 20%
10% 10%
0% 0%
1h 3h 5h 1h 3h 5h
3 UA/
UA/g 16 5 UA/g
16.5 UA/ 30 UA/g
UA/ C t l
Control 3 UA/g 16 5 UA/g
16.5 30 UA/g Control
19
(e) (f) 1400
18
1200
17
1000
Viscosity (ml/g)
Kappa Number
16
15 800
14 600
13
400
12
200
11
10 0
1h 3h 5h 1h 3h 5h
Fig. 1. Total and screened kraft yield, NaOH and Na2S consumptions and kappa number and viscosity of exploded kraft pulps pretreated with laccase-mediator system at
different laccase doses and treatment times. Exploded kraft pulp without any enzymatic treatment was used as control. Error bars show the standard deviation of three
replicas.
obtained with exploded control sample, and reduced Na2S and could be shortened from 60 to 25 min and a kraft pulp with even
NaOH consumption by 11.5% and 6.3%, respectively. The observed lower kappa number than that of control pulp was obtained.
increase in delignification (13.9%) was higher than the 8.7% re- Therefore, the pulp productivity increased and the subsequent
ported by Dyer and Ragauskas (2004) when laccase-HBT treatment bleaching process might consume fewer chemical reagents. As a
at 45 °C was carried out for 2 h prior to kraft pulping of Pinus taeda. result, steam explosion followed by LMS treatment seems to be a
This higher delignification could be due to small differences in the promising concept for selective delignification and chemical
conditions of the laccase treatment and/or to different behavior of savings.
hardwood and softwood, but more likely, it may be due to the
addition, in our case, of the steam explosion pre-treatment prior 3.2. Fungal treatment
to the enzymatic treatment. Such a treatment improves reagent
diffusion into the chips in kraft pulping (Ahvazi et al., 2007; In order to compare the results obtained with steam explosion
Martin-Sampedro et al., 2011) and enhances enzymatic hydrolysis plus LMS pre-treatment with those obtained using a more common
of biomass (Jurado et al., 2009; Ruiz et al., 2007; Wu et al., 1999). biopulping process, E. globulus chips that had not undergone steam
Furthermore, due to the reduction in kappa number as a conse- explosion treatment, but were extracted with acetone and/or
quence of only using a steam explosion treatment prior to kraft water were treated with the ligninolytic fungi, P. sanguineus and
pulping (67.8%), the total improvement in delignification including Trametes sp. I-62.
the enzymatic treatment (13.9%) rose by up to 72.4%. In others The effects of extractions without fungal inoculation on the
words, when both pre-treatment were combined, pulping time kraft process and pulp quality are shown in Table 2. When an ace-
(a) 20 (b) 0.45

18 0.43
App. Bulk Density (g/cm3)

16 0.41
º Schopper - Riegler
14 0.39
12 0.37
10 0.35
8 0.33
6 0.31
4 0.29
2 0.27
0 0.25
1h 3h 5h 1h 3h 5h
(c) 16.0 (d) 2.5
14.0
2.0
12.0
Tensile Index (Nm/g)
Tear Index (mNm2/g)

10.0 1.5
8.0
6.0 1.0
4.0
0.5
2.0
0.0 0.0
1h 3h 5h 1h 3h 5h
(e) 44 (f) 100
99
42
Brightness (%ISO)
98
40
97
Opacity
38 96
95
36
94
34
93
32 92
1h 3h 5h 1h 3h 5h
Fig. 2. Mechanical and optical properties of exploded kraft pulps pretreated with laccase-mediator system at different laccase doses and treatment times: (a) Schopper–
Riegler degree, (b) apparent bulk density, (c) tensile index, (d) tear index, (e) brightness and (f) opacity. Exploded kraft pulp without any enzymatic treatment was used as
control. Error bars show the standard deviation of three replicas.
Table 2
Influence of different extractions on the pulp quality and on the kraft process.
Kappa number DKappa (%) DViscosity (%) Kraft yielda (%) DKraft yield Chemical Consumption
D%Na2S D%NaOH
NoE 15.6 49.9
AC 15.0 4.1b +12.1b 55.9 +6.0b 3.7b 1.9b
W 11.0 29.4b +5.9b 51.8 +1.9b +7.0b +0.3b
AC + W 11.3 27.6b +13.1b 51.9 +2.1b 0.4b 0.5b
a
Screened kraft yield in pulping process, without including pre-treatment.
b
Compared to control without any extraction (NoE).
tone extraction was carried out, the yield in kraft pulping increased after the kraft process was obtained. When an acetone extraction
while both kappa number and chemical consumption decreased. was carried out before water extraction, the reduction observed
However, the reduction in kappa number was higher when a water in kappa number was almost the same as in the case of only water
extraction was performed, as an increase in delignification of 29.4% extraction. These findings could be explained by improved liquor
Table 3
Influence of fungal treatment on the pulp quality and on the kraft process compared with control with the same extraction but without fungal inoculation.
Kappa number DKappa (%) DViscosity (%) Kraft yielda (%) DKraft yield Chemical Consumption
D%Na2S D%NaOH
NoE –P 15.8 +0.8b +2.1b 49.8 0.1b +2.6b +0.2b
NoE – T 14.2 9.3b +3.4b 48.4 1.5b +5.9b +0.5b
AC – P 14.5 3.7b 5.1b 51.9 4.0b +4.3b +1.7b
AC – T 13.6 9.5b 15.0b 53.3 2.6b +5.6b +2.4b
W–P 11.9 +7.9b +1.6b 50.0 1.8b 3.4b +0.3b
W–T 10.8 2.0b 1.8b 50.4 1.4b +0.5b +0.9b
AC + W – P 12.4 +9.0b 20.4b 51.6 0.3b +5.7b +1.2b
AC + W – T 12.5 +10.2b 3.0b 52.4 +0.5b +4.9b +1.4b
a
Screened kraft yield in pulping process, without including pre-treatment.
b
Compared to control with the same extraction but without fungal inoculation.
penetration and increased delignification during kraft pulping as a Phanerochaete chrysosporium with direct fungus treatment prior
result of the extractions (Ferraz et al., 2008). Furthermore, hydro- to thermomechanical pulping (TMP) and chemithermomechanical
lysis of polysaccharides, which takes place during hot water pulping (CTMP).
extraction, could facilitate delignification. Taking into account that during steam explosion pre-treatment,
A comparison of the outcomes of 28 days fungal treatments of most of the hemicelluloses are removed before pulping, the overall
extracted and non-extracted chips is provided in Table 3. Small dif- pulp yield of the process (including pre-treatments and kraft pul-
ferences were found in screened kraft yield during the pulping of ping) would be reduced by about 40%, but pulp production of a
biotreated chips compared to their controls; however, when hypothetic mill could be maintained at a similar level because of
weight losses during the fungal treatment were taking into ac- the reduction in pulping time. Moreover, the hemicelluloses are re-
count, the overall yields for biotreated pulps were around 5% lower moved without excessive degradation and could be converted into
than those of control pulps due to fungal degradation of polysac- value-added products, increasing the total revenue stream for the
charides. Nevertheless, in most cases, biotreated pulps showed a pulp industry and converting the pulp mill into an integrated forest
lower kappa number than their controls. bio-refinery (Martin-Sampedro et al., 2011; Van Heiningen, 2006).
NaOH and particularly Na2S consumptions were higher for bio- This potential could be one of the main advantages of a combined
treated samples compared to their controls. Despite these disad- steam explosion and LMS treatment compared to fungal treatment,
vantages, biotreatment with Trametes sp. I-62 promoted the in which polysaccharides are degraded.
pulping process, since this pre-treatment produces pulps with a
lower kappa number than those of control pulps in all cases, apart
4. Conclusions
from the AC + W samples. In contrast, P. sanguineus treatment did
not result in an increase in delignification under the assay condi-
Steam explosion followed by LMS treatment seems to be a
tions, contrary to what was reported by Wolfaardt et al. (2004).
promising pretreatment for increasing the delignification rate in
The reason could be differences in the P. sanguineus strains. These
the biopulping process since pulping times could be shortened
differences have been observed previously in other white rot fungi
by 60%, and most of the hemicelluloses could be extracted before
(Akhtar et al., 1992; Blanchette et al., 1992). Biotreated pulps
pulping and converted into a value-added product. The optimal
showed a viscosity similar to that of their controls in most of the
conditions assayed for LMS were 3 UA/g and 3 h of treatment at
cases.
40 °C. Compared with fungal treatment, lower kappa number and
When comparing biotreated and controls pulps that had under-
chemical consumptions were observed, and less polysaccharides
gone the same extraction process, the highest reductions in kappa
degradation took places as shown by better kraft yields.
number due to fungal treatment were observed in samples sub-
jected to acetone extraction and without any extractions. In these
samples, fungal colonization and laccase activity were also higher Acknowledgements
(data no shown). Overall, the lowest kappa number was observed
in pulp obtained from chips pre-extracted with hot water and trea- The authors wish to thank the Spanish Ministry of Science and
ted with Trametes sp. I-62. Innovation for funding this study via the Projects CTQ 2006-00385
and CTQ 2009-11268 and the FPI fellowship (BES2007 – 14528).
3.3. Comparison between steam explosion plus LMS treatment and

fungal treatment References
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PUBLICACIÓN VII:
Effect of steam explosion and enzymatic pre-treatments on pulping and bleaching
of Hesperaloe funifera.
Martín-Sampedro, R., Eugenio, M.E., Villar, J.C.
Manuscrito
263

Effect of steam explosion and enzymatic pre-treatments on pulping

and bleaching of Hesperaleo funifera
Martín-Sampedro, R. a; Eugenio, M.E. a, and Villar, J.C. a*
a
Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria INIA.
Carretera de la Coruña, km 7.5, 28040, Madrid (Spain)
*Corresponding author: [email protected]; phone number: (+34) 913476761; fax number:

(+34) 913476767
Abstract
A non-wood raw material with high potential for pulp and paper applications
(Hesperaloe funifera) was subjected to a steam explosion pre-treatment, and the
subsequent effect of this pretreatment on biopulping and biobleaching was studied. An
increase in the delignification rate, bigger than that reported for autohydrolysis and acid
hydrolysis pre-treatments, and a reduction in chemical consumption were found during
kraft pulping of the exploded samples. However, biopulping with the laccase-mediator
system (LMS) did not lead to a reduction in the kappa number in either non-exploded or
exploded unbleached pulps. On the other hand, the steam explosion pretreatment
boosted the advantages of the LMS pre-treatment (decrease in kappa number and
increase in brightness) favored biobleaching, with a 53.1% delignification rate and a
final brightness of 67 % ISO. Finally, the steam explosion pre-treatment also improved
the color properties of the bleached pulp and reduced the hydrogen peroxide
consumption by 24.6%.
Keywords:
Hesperaloe funifera; Biopulping; Biobleaching; Steam explosion; Laccase.
265

1. Introduction
One of the main goals of research in pulp and paper industry is to achieve a
sustainable development by using new eco-friendly technologies that improve pulping
and bleaching processes, optimize energy and chemical consumption and ensure an
appropriate use of resources. This objective could be reached by using biotechnology
(biopulping and biobleaching) and new raw materials such as agricultural residues and
non-woody plants rather than wood fiber. The advantages of the use of non-wood raw
materials include: 1) the added value given to agrifood crops by exploiting their
residues; 2) the availability of these materials in countries with limited forest resources;
3) the ability to obtain large amounts of special paper by virtue of the wide variability in
morphology and chemical composition of non-wood fibers; and 4) the reduced
consumption of chemicals and energy in cooking and bleaching operations by effect of
the more porous and readily accessible tissue structure of non-wood raw materials
(Alaejos et al. 2004; Sanchez et al. 2011). These advantages have brought about a
14.6% increase in the production of cellulose pulp from non-wood raw material in the
period 2000-2009, while the production of cellulose pulp from wood has decreased by
6.9% in the same period. Despite this fact, in 2009, the pulp production from non-wood
materials represented only an 8.4% of the total production in the same year (FAO
2011), probably due to the high ash and extractive contents of these materials, which
contribute to a low pulping yield. Other disadvantages of non-wood raw materials are:
low density, which complicates transportation; the need of specific environmental
growing conditions; and problems derived from a very short harvest period.
A promising non-wood raw material is Hesperaloe funifera, native to the

Chihuahuan desert of Northern Mexico. McLaughlin (2000) has evaluated its potential
as a papermaking raw material and has reported that its pulps are as good as high-cost
pulps (softwood kraft or abaca and sisal soda-anthraquinone pulps). Due to its low-
irrigation requirement, H. funifera grows in areas with scant water resources; and its
low lignin content increases the odds of reducing energy and chemicals consumption
during the pulping process.
Some authors have explored the potential of H. funifera as raw material for pulp
production (Fairbank and Detrick 2000; McLaughlin 2000; Revilla et al. 2010; Sanchez
et al. 2010a; Sanchez et al. 2010b; Wong and McLaughlin 2000), however only
266

Sanchez et al. (2011) have evaluated the effect of some pretreatments, such as acid
hydrolysis and autohydrolysis, on pulping of this non-wood raw material.
There have been no reports on the application of the steam explosion

pretreatment to H. funifera. However, some studies have shown that the cooking liquor
diffuses more freely into the open structure of steam exploded chips of wood raw
materials, leading to easier and shorter kraft pulping (Ahvazi et al. 2007; Martin-
Sampedro et al. 2011a). Moreover, hemicelluloses removed during the steam explosion
pretreatment can be further converted into value-added products (Li et al. 2010),
without a significant reduction of the black liquor’s calorific power, and increasing the
total revenue of the pulp mill as a final result (Ragauskas et al. 2006; Van Heiningen
2006). In addition, exploded-kraft pulps have showed better optical properties and lower
hexenuronic acid content than control pulps (non-exploded) (Martin-Sampedro et al.
2011a), which contributes to an easier bleaching process (Josefsson et al. 2002; Martin-
Sampedro et al. 2011b). Based upon all these facts, the study of how steam explosion
affects a non-wood raw material characterized by a less compact and more porous
structure than wood raw materials is of great interest.
On the other hand, the use of biological pre-treatments to boost pulping and
bleaching processes has attracted considerable interest in the last two decades. Most
studies of biopulping have examined the direct application of fungi to chips. However,
this approach has many disadvantages for industrial use, such as slow fungal growth,
the difficulty of keeping aseptic and optimal conditions during the long treatment
required, and yield loss due to the degradation of polysaccharides simultaneous to lignin
degradation. In an attempt to overcome these issues, the direct application of enzymes,
such a xylanases, laccases or manganese peroxidases, to wood chips has been suggested
as a more attractive alternative for industrial purposes. Nevertheless, in view of the fact
that penetration of the wood chips by these enzymes is rather difficult, researchers have
recommended pre-treating the chips by means of defribration (Burton 2001), vacuum
(Jacobs-Young et al. 1998), compression (Maijala et al. 2008; Pere et al. 2005) or steam
explosion (Martin-Sampedro 2011c) in order to open their structure. An alternative
option is to use a raw material more readily accessible, with a more porous structure,
such as non-wood materials (Qin et al. 2006; Ramos et al. 2004; Zhao et al. 2002).
Although, as mentioned above, some studies have tested the biopulping of a non-wood
267

raw material, we found no studies reporting on the use of H. funifera with (or without) a
steam explosion pre-treatment.
In order to boost the bleaching process, many researchers have pretreated pulps
with enzymes, mainly with the laccase-mediator system (LMS), before applying the
standard bleaching sequences (Viikari et al. 1986; Moldes et al. 2008; Eugenio et al.
2010). These biobleaching studies have shown that enzymatically pretreated pulps
require a smaller amount of chemicals in subsequent bleaching processes, maintain or
increase the pulp quality, and reduce the pollutant load of the effluents. According to
Martin-Sampedro et al. (2011b), the combination of LMS and steam explosion takes on
the advantages of both pretreatments when Eucalyptus globulus is used as raw material,
providing pulps with minimum kappa number and optimum optical properties and
consuming 20% less hydrogen peroxide compared to control pulps.
Building on this base of evidence, and keeping in mind that our overall goal as
researchers is to develop new eco-friendly technologies that save energy (reducing the
pulping time) and chemicals and ensure an appropriate utilization of resources, our
study was designed to evaluate how steam explosion impacts both the biopulping and
the biobleaching of H. funifera. In this work we used a non-wood raw material with
potential pulp and paper applications and combined traditional pulp processes with
enzymatic treatments that, boosted by the steam explosion pre-treatment, could increase
their benefits and the viability of their industrial application.
2. Materials and methods
2.1. Chemicals and raw materials
All chemicals used were reagent-grade and were supplied by Merck (Barcelona,
Spain), Panreac (Barcelona, Spain) or Sigma–Aldrich (Madrid, Spain), except for 2,2´-
Azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate (ABTS), which was purchased from
Roche (Madrid, Spain).
The laccase used in enzymatic treatments (Novozym 51003) was produced by

submerged fermentation of genetically modified Aspergillus sp., and was donated by
Novozymes (Bagsvaerd, Denmark).
268

H. funifera was kindly provided by the University of Valencia (Spain). Its

chemical composition was analyzed: ash content (TAPPI T 211 om-93), hot water
extractives (TAPPI T 207 om-93), ethanol extractives (TAPPI T 204 om-88) and lignin
(TAPPI T 222 om-88). Fiber length was measured by projection and fiber width was
directly measured from the pulp suspension using a microscope with a Visopan screen.
2.2. Steam explosion treatment
H. funifera was subjected to two different steam explosion pre-treatments,

summarized in Table 1. The SE2 conditions were selected based on a previous report
(Martin-Sampedro et al. 2011a), in which this treatment provided, among all the
conditions assayed, the most accessible structure of Eucalyptus globulus. However,
since non-wood raw materials have a less compact and more porous structure than
wood, it is reasonable to expect them to be more readily accessible (Sanchez et al. 2011)
and to require a less intensive steam explosion pretreatment. Thus, the SE1 treatment
consisted of one steam explosion cycle of 3 min, instead of the two cycles of the SE2
treatment. In each cycle, H. funifera was treated with steam at 183 ºC (10 kg/cm2) in a
26-L stainless steel vessel and discharged into a blowing tank at 6 kg/cm2. The exploded
samples were then removed from the blowing tank, washed with cold water, air-dried,
and finally weighted. The water content was measured to determine the total yield of the
steam explosion.
The severity factor of each treatment was calculated using this equation inferred
by Overend and Chornet (1987), in which T is the temperature (ºC) and t the duration of
the treatment (min).
. (1)
The water retention, or hydration capacity, of the chips was calculated as the
weight of water absorbed by the chips after being immersed for 6 hours, and it was
expressed as grams of water per 100 grams of dry sample.
2.3. Biopulping process
The biopulping process assayed consisted of applying a laccase mediator system

(LMS) followed by kraft pulping.
269

2.3.1. Laccase mediator system treatment
The laccase used was Novozym 51003. The enzyme dose was expressed as units
of laccase activity per gram of dry wood (UA/g), where 1 U of laccase activity is
defined as the amount of laccase required to convert 1μmol / min of ABTS to its
cationic radical ( =436nm, o=49600 M-1cm-1, 0.1M phosphate buffer, pH 6 at 24 ºC).
The mediator used was 1-hydroxybenzotriazole (HBT), based on Dyer and

Ragauskas (2004), who reported that using HBT as mediator in LMS biopulping of
Pinus tadea, versus other mediators such as violuric acid (VA) and ABTS, resulted in
the lowest kappa number.
All assays were performed in duplicate in 500 ml pressurized reactors, using 40

g of non-exploded or exploded samples. The reactors were placed in a thermostatic bath
at 40ºC for 5 hours. Phosphate buffer (100 mM) was used to keep the pH at 6.
Consistency, laccase dose, mediator concentration and oxygen pressure were 7%, 30
UA/ g dry sample, 5 mM and 6 Kg/cm2, respectively. Also, a few drops of 0.05%
Tween 80 were added. Control assays were performed skipping the addition of laccase
and mediator in the enzymatic treatment (control-buffer), and removing the whole
enzymatic treatment step from the process (control).
2.3.2. Kraft pulping
Enzymatically treated samples (both exploded and non-exploded) were

subjected to kraft pulping in 1-L pressurized reactors. Control samples (without the
LMS stage) and control-buffer samples (only buffer addition, without laccase and HBT)
were also pulped in a similar manner. The pulping equipment consisted of four reactors
placed into a 20-L rotary pressurized vessel that contained hot water for indirect heating
of the reactors. This rotary vessel had a jacket-type electrical heater controlled by a
computer to set and maintain the cooking temperature. Cooking conditions were: 60 g
of dry chips, a liquor to wood ratio of 6 L/kg, 16% active alkali (AA), 20% sulfidity (S),
160 ºC cooking temperature, 50 min to maximum temperature and 23 min at maximum
temperature.
After each batch, the reactors were removed from the vessel, and the cooked
chips were washed, disintegrated and screened to determine their reject content and
270

screened and total yields. Black liquors were titrated with HCl to determine the
chemical reagents consumption. The kappa number (ISO 302) and viscosity (ISO 5351-
2) were determined in the pulp samples.
2.4. Biobleaching process
The biobleaching process assayed consisted of a laccase mediator system (LMS)

treatment followed by a conventional TCF bleaching sequence (alkaline extraction plus
hydrogen peroxide bleaching).
2.4.1. Laccase mediator system treatment (L)
Novozym 51003 was the laccase used in these assays and the natural mediator
was acetosyringone. This natural mediator was selected for the biobleaching pre-
treatment based on Eugenio et al. (2010), who evaluated acetosyringone and HBT as
mediators in biobleaching of E. globulus and determined acetosyringone to be the most
efficient.
All the enzymatic assays were performed in a similar way to that described in
the 2.3.1. section but using the following operational conditions: 50 g of non-exploded
or exploded kraft pulps, 40ºC, 2 hours, pH 6 (phosphate buffer, 100 mM), 10%
consistency, 17.5 UA/ g dry pulp, 1.5% acetosyringone, 6 Kg/cm2 of oxygen pressure
and a few drops of 0.05% Tween 80. Controls without the addition of laccase nor
mediator in the enzymatic treatment were performed (control-buffer, named as -Lc).
2.4.2. Alkaline extraction (E) and hydrogen peroxide (P) bleaching stages
Conditions for the alkaline extraction were: 1.5 % NaOH, 5% consistency and
90 ºC temperature for 120 min. Thereafter, pulps were washed, and a hydrogen peroxide
bleaching stage was applied under the following conditions: 2 % H2O2, 1.5 % NaOH, 1
% DTPA, 0.2 % Mg2SO4, 5 % consistency and 90 ºC for 90 min. Residual hydrogen
peroxide was titrated in the bleaching effluent.
271

2.5. Pulps characterization
Unbleached pulps and pulps obtained after each stage of the bleaching sequence
(LEP) were characterized in terms of their kappa number, viscosity, brightness and CIE
L*a*b* and CIE L*C* coordinates, in conformity with the ISO 302, ISO 5351-2, ISO
2470 and T 527 standards, respectively.
3.1. Characterization of Hesperaloe funifera
High contents of ash, ethanol extractives and hot water extractives were
measured in H. funifera (5.2%, 3.1% and 15.9% respectively). These large amounts of
extractives indicate a reduction in pulping yield. However, the lower lignin content
detected for this material (9.4% klason lignin and 3.6% acid soluble lignin), compared
to other non-wood and wood materials, could make the pulping easier and compensate
for the expected low yield.
The biometric analysis shows that H. funifera has longer and thinner fibers (4.2
mm long and 7.2 μm wide) than other non-wood materials, such as cotton linters (3.5
mm and 21 μm), sisal (3.0 mm and 17 μm) or wheat straw (1.5 mm and 13 μm)
(Fairbank and Detrick 2000), and also compared to woody species such as Picea abies
(3.5 mm and 36 μm), Pinus taeda (4.0 mm and 43 μm) or Eucalyptus saligna (1.0 mm
and 19 μm) (McLaughlin and Schuck 1991). H. funifera’s relatively significant
slenderness (L/D ratio), compared to other raw materials, could provide more inter-fiber
bonding and increased paper strength.
3.2. Steam explosion treatment
H. funifera samples were steam exploded under two different sets of conditions;
and the most severe treatment resulted in a reduction of the yield (Table 1). These
results are consistent with those found by other authors (Al-Dajani et al. 2009; Li et al.
2010), who report that the amount of hemicelluloses dissolved in the liquid fraction was
larger with longer treatments, decreasing the yield of the process. The yield obtained for
H. funifera when the SE2 treatment was carried out was lower than that obtained when
272

E. globulus was subjected to the same steam explosion treatment (62.5% vs 79.3%)
(Martin-Sampedro et al. 2011a). This finding is likely to be the result of a higher
content of hot water extractives when using H. funifera (15.9% vs 1.8% with E.
globulus).
The water retention capacity could provide information about changes in the
internal structure of the material and correlates well with its accessibility to chemicals.
As it can be observed in Table 1, the non-exploded H. funifera sample showed a high
water retention capacity (267g of water per 100g of dry sample). If this value is
compared with those reported for E. globulus in a previous study (Martin-Sampedro et
al. 2011a), a big difference is evident: 65g of water per 100g of non-exploded chips and
272g of water per 100 g of wood after the same steam explosion treatment as the one
used in SE2. This finding suggests that the accessibility of non-exploded H. funifera is
similar to that of exploded E. globulus after a pre-extraction and 2 cycles of steam
explosion, each 10 and 3 minutes long (183ºC). These results can be attributed to the
more porous and readily accessible tissue structure of non-wood raw materials (Alaejos
et al. 2004; Sanchez et al. 2011).
Furthermore, both steam explosion pretreatments meant an increase in the water

retention capacity of H. funifera. Table 1 shows that, as the severity factor of the
treatment grows, the water retention capacity of the sample increases too, reaching
values of 359 and 434 g of water per 100 g of dry sample with SE1 and SE2,
respectively.
3.3. Biopulping
Non-exploded (HP) and exploded (SE1 and SE2) H. funifera samples were
subjected to a biopulping process consisting of a laccase mediator system (LMS)
treatment followed by kraft pulping.
Figure 1 shows the total and the screened yield obtained during the kraft pulping
of each sample. Both yields were similar because all pulps had low reject contents
(around 1%). Thus, the removal of extractives during the steam explosion pre-treatment
increased the relative cellulose content before pulping and brought about an increase in
both yields in the exploded samples (SE1 and SE2). However, if the yield of the steam
explosion pre-treatment is taken into account, the overall yield for HP, SE1 and SE2
273

was 37%, 36% and 29%, respectively (including both the kraft yield showed in figure 1
and the steam explosion yield). No other significant differences have been observed in
kraft yields.
The quality of the obtained pulps can be evaluated from Figure 2, which shows
the kappa number and the viscosity of the pulps. A reduction in the kappa number,
compared to non-exploded pulps, was evident when the steam explosion was performed
prior to kraft pulping. Moreover, this reduction was accentuated when the severity of
the treatment increased (17.8% and 28.4% for SE1 and SE2 respectively). Therefore,
the exploded material cooked faster and more efficiently than the untreated material, so
that the cooking time or the cooking temperature could be reduced obtaining a pulp of
similar characteristics (kappa number and viscosity) and reducing the energy
consumption. However, the kappa number reduction with the SE2 pre-treatment using
E. globulus (67.8%) (Martin-Sampedro et al. 2011c), was far greater than that obtained
for H. funifera. This finding could be explained considering that non-exploded H.
funifera already has a readily accessible tissue structure (as the water retention capacity
showed) and an increase in this accessibility did not mean an improvement in reagent
diffusion as that of E. globulus. Nevertheless, pre-treatment of H. funifera by means of
steam explosion was associated to more delignification during kraft pulping than
reported by Sanchez et al. (2011), who tested other pre-treatments, such as
autohydrolysis and acid hydrolysis, preceding soda-anthraquinone pulping.
On the other hand, a similar reduction in the kappa number was observed when
non-exploded H. funifera was subjected to enzymatic treatment. This reduction was a
consequence of the buffer treatment at 40ºC and not a result of the LMS effect, since no
significant differences in delignification were observed when the LMS was
incorporated. Therefore, the increase in delignification that accompanied the use of
steam explosion or enzymatic pre-treatments is likely to be caused by the removal of
extractives during steam/water treatment at high or moderate temperatures (183ºC
during few minutes in SE or 40ºC during 5 hours in enzymatic treatment). When both
treatments were performed sequentially, the delignification observed after kraft pulping
reached even higher levels, with the more intensive steam explosion leading to more
delignification. However, as it has been mentioned above, delignification levels with the
addition of LMS in the enzymatic treatment were not higher than those observed when
only buffer was added. Furthermore, the addition of LMS in non-exploded samples
274

(HP) caused an increase in the kappa number, versus control-buffer. This observation
could be evidence of grafting of the LMS onto the pulp fiber (Dyer and Ragauskas
2004). Improving the delignification rate with the LMS pre-treatment requires further
experiments to determine the optimal operational conditions (laccase dose, treatment
time, etc.)
The steam explosion pre-treatment was associated to a decrease in the viscosity

of the obtained pulps (Figure 2.b) due to fiber degradation. This effect was more
pronounced when the severity of the treatment increased. However, the degradation of
the fibers was not as intense as that reported when either autohydrolysis or acid
hydrolysis was performed before soda-anthraquinone pulping (Sanchez et al. 2011). On
the other hand, the enzymatic treatment did not cause a significant variation of the pulp
viscosity.
The chemical consumption during kraft pulping was evaluated by measuring the
residual active alkali (AA) and sulfidity (S) in the black liquors (Table 2). The use of
the steam explosion pretreatment was associated to an increase in the residual AA (4.0,
4.6 and 5.4 for HP, SE1 and SE2 control samples respectively), which means that
chemical consumption decreases (NaOH and Na2S) as the severity of the steam
explosion increases. This is likely the result of the removal of hemicelluloses, which
during the kraft pulping process are degraded to carboxylic acids that consume
significant amounts of alkali (San Martin et al. 1995). On the other hand, the addition of
a LMS treatment increased the consumption of Na2S (reduction in residual sulfidity: 17,
17.4 and 18.0 for HP, SE1 and SE2 laccase samples, compared to around 23 for control
and control-buffer samples). A similar effect has been observed by Martin-Sampedro et
al. (2011c), who introduced SE and LMS pre-treatments with a high laccase dose (30
UA/g) before kraft pulping of E. globulus. However, the residual AA showed that the
total chemical consumption did not varied significantly with the addition of the LMS
treatment (Table 2).
3.4. Biobleaching
A biobleaching process consisting of a laccase mediator system (LMS)

treatment, followed by a TCF bleaching sequence (alkaline extraction plus hydrogen
275

peroxide bleaching), was applied to the exploded and non-exploded H. funifera kraft
pulps.
In Figure 3, the kappa number and viscosity of the pulps after each stage of the
LEP bleaching sequence are showed. For all pulps assayed, a reduction of the kappa
number was observed after each stage, while the viscosity remained approximately
constant during the whole bleaching process. Furthermore, in all pulps, the LMS
treatment resulted in an even higher delignification rate without decreasing the pulp
viscosity. This finding reflects a significant biodelignification of H. funifera without
degradation of carbohydrate chains, which is consistent with results reported by other
authors that used eucalyptus (Eugenio et al. 2010; Oudia et al. 2008) and flax fibers
(Fillat et al. 2010).
As described above, the steam explosion pre-treatment resulted in a lower kappa

number of unbleached pulp, compared to samples without steam explosion, as well as a
slight degradation of the fibers. Comparing the two modalities of steam explosion pre-
treatment applied (SE1 and SE2), a more intensive steam explosion led to more intense
delignification during the LEP sequence. This finding is in agreement with that reported
by Josefsson et al. (2002) after chemical bleaching of aspen exploded pulps. Reductions
in the kappa number of 48.1% and 53.1% were achieved for SE2-Lc (control without
LMS) and SE2-L (biotreated) samples, respectively, while the reductions in non-
exploded samples were 36.6% and 42.4%, for HP-Lc and HP-L, respectively.
Therefore, the addition of a steam explosion pre-treatment prior to kraft pulping
improved both the bleaching and the biobleaching of H. funifera. Similar results were
found by Martin-Sampedro et al. (2011b) when the same steam explosion pre-treatment
and bleaching sequence were carried out with E. globulus, obtaining a delignification of
41.7% and 54.5% for control and biobleached exploded pulps, respectively.
Another goal of this research was to evaluate changes in optical properties.

Figure 4 shows the evolution of brightness throughout the bleaching sequence and the
change in color coordinates (CIE L*a*b* and CIE L*C*) before and after the bleaching.
An increase in brightness was observed after each stage in the LEP sequence, with the
largest increase occurring during the hydrogen peroxide stage (P), as expected. When a
LMS treatment was applied, higher brightness values were reached in all pulps,
therefore, it was concluded that the LMS treatment did boost the bleaching process for
276

all the H. funifera pulps assayed. Similar advantages of LMS treatments have been
found by other authors using different raw materials (Eugenio et al. 2010; Fillat et al.
2010; Vivekanand et al. 2008).
Comparing non-exploded and exploded bleached pulps, higher brightness values

were found for exploded pulps. When the severity of the steam explosion increased
(SE2), the final brightness was even higher (67%ISO). However, besides brightness, the
color appearance of paper is also an important parameter in many different applications
and good white base colors are necessary where products are to be dyed, printed, or
otherwise colored. For this reason, CIE L*a*b* and CIE L*C* color coordinates were
measured in non-exploded and exploded pulps before and after the biobleaching
sequence (Figures 4b and 4c). A reduction in the a* coordinate values (which indicate
the position between red and green) was observed at the end of the sequence with all
samples, being the a* coordinate values for bleached pulps very close to the ideal
neutral value (0). However, the b* coordinate (position between yellow and blue) for
non-exploded pulps hardly changed during the bleaching process, and even increased
(more yellow) for SE1 bleached pulps. In contrast to this, when a more intensive steam
explosion pre-treatment was carried out (SE2), the b* coordinate decreased during the
bleaching process. Thus, chroma (C* coordinate), which indicates the distance from a
perfectly neutral color, decreased for SE2 bleached pulps but remained approximately
constant for SE1 and HP samples. As far as lightness is concerned, the L* coordinate
values increased for all pulps after biobleaching. Based on these last results, it was
concluded that the most intensive steam explosion pre-treatment (SE2) did improve the
optical properties, not only increasing brightness and lightness, but also reducing the
color of the H. funifera biobleached pulp. Comparable improvements have been found
by Martin-Sampedro et al. (2011b) when a similar steam explosion and bleaching
sequence was performed using E. globulus. However, the mildest steam explosion pre-
treatment applied in our experiments (SE1) did not improve the pulp color compared to
non-exploded bleached pulps.
Another advantage of the steam explosion pre-treatment was the reduction of

hydrogen peroxide consumption during the bleaching process (Table 3). As it can be
observed, a more intensive steam explosion pre-treatment resulted in less hydrogen
peroxide consumed in the whole process. Thus, the SE2 pre-treatment was associated to
a reduction in the use of chemicals of up to 24.6% during biobleaching (92.7% vs
277

68.1% for HP-L and SE2-L respectively). A possible explanation of this effect is that
the steam explosion removes substances that compete with lignin for the hydrogen
peroxide. This effect has already been observed by Martin-Sampedro et al. (2011b) in
the biobleaching of E. globulus kraft pulp and it has been attributed to the low
hexenuronic acid content of exploded pulps. However, when a LMS pretreatment was
added to the bleaching sequence, slightly more hydrogen peroxide was consumed with
all H. funifera pulps, in contrast to what has been reported by other authors who have
used wood raw materials (Eugenio et al. 2010; Martin-Sampedro et al. 2011b; Valls et
al. 2009). Nevertheless, it should be taken into account that, in these studies, the LMS
pre-treated pulps had lower kappa numbers and higher brightness, and therefore, if
compared at the same delignification and brightness level, the chemical consumption of
the LMS pre-treated samples would probably be lower than that of the control pulps.
4. Conclusions
The steam explosion pre-treatment increased the delignification rate during the
subsequent kraft pulping of H. funifera, providing kraft pulps with lower kappa
numbers (or alternatively reducing the cooking time) and higher viscosity than those
reported with autohydrolysis and acid hydrolysis pre-treatments. Furthermore, a
reduction in the chemical consumption was observed. The addition of a LMS pre-
treatment before kraft pulping did not improve delignification in the assayed conditions.
However, the addition of a LMS pre-treatment as the first stage in the bleaching
sequence resulted in smaller kappa numbers and an increase in brightness in bleached
pulps. These improvements in biobleaching were boosted when a steam explosion pre-
treatment preceded the kraft pulping, reducing also the color of the pulp and
consumption of hydrogen peroxide during the bleaching process.
Acknowledgements
funding this study via the Projects CTQ 2006-00385 and CTQ 2009-11268 and the FPI
fellowship (BES2007 – 14528).
278

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Wong A, McLaughlin SP (2000) Alkaline sulphite pulping of Hesperaloe, and aridzone

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AK19833W
Zhao J, Li X, Qu Y, Gao P (2002) Xylanase pretreatment leads to enhanced soda

pulping of wheat Straw. Enzyme Microb Tech 30:734-740
282

Figure Caption
Fig. 1 (a) Total and (b) screened kraft yields for non-exploded (HP) and exploded (SE1
and SE2) pulps after LMS pre-treatment (laccase); compared with a control without the
addition of LMS in the enzymatic treatment (control-buffer) and a control without the
enzymatic treatment step (control)
Fig. 2 (a) Kappa number and (b) viscosity of non-exploded (HP) and exploded (SE1 and
SE2) pulps after LMS pre-treatment (laccase); compared with a control without the
addition of LMS in the enzymatic treatment (control-buffer) and a control without the
enzymatic treatment step (control)
Fig. 3 (a) Kappa number and (b) viscosity after biobleaching of non-exploded (HP) and
exploded (SE1 and SE2) pulps. Controls without addition of LMS (-Lc) were included.
The biobleaching sequence consisted of laccase stage (L), alkaline extraction stage (E)
and hydrogen peroxide stage (P)
Fig. 4 Optical properties after biobleaching of non-exploded (HP) and exploded (SE1
and SE2) pulps: (a) brightness evolution during the bleaching sequence; where L:
laccase stage, E: alkaline extraction stage and P: hydrogen peroxide stage; (b) CIE
L*a*b* coordinates and (c) CIE L*C*coordinates for unbleached (black symbols) and
biobleached (grey symbols) pulps
283

Figure 1
a) b)
55% 50% 46%
45% 45%
50% 47% 47% 44% 44% 44%
46% 45%
45% 45% 40%
Screened Kraft Yield

Total Kraft Yield
44%
45%
40% 40%
36% 36%
40% 37% 37%
35%
35%
30%
30%
25% 25%
20% 20%
HP SE1 SE2 HP SE1 SE2
Control Control-Buffer Laccase Control Control-Buffer Laccase
Figure 2
a) b)
16 1400
14,1
1200 113411141124
14 1064
10101020
11,6
Kappa Number
1000
11,1
798 832 817
Viscosity (ml/g)
12
10,3 10,4
10,1 800
9,6
10
600
7,9 8,2
8
400
6 200
4 0
HP SE1 SE2 HP SE1 SE2
Control Control-Buffer Laccase Control Control-Buffer Laccase
284

Figure 3
a)
16
14,1 14,1
14
12,5
12,1 11,6
12 11,611,2
11,2
10,2 9,8 10,1 10,1
9,6 9,5
Kappa Number
10 8,9
8,1 8,3 8,3
7,7
8 7,1
6,4 6,3
6 5,2
4,7
0
HP-Lc HP-L SE1-Lc SE1-L SE2-Lc SE2-L
Unbleached L LE LEP
b)
1400
1134 1134 1121

1200 1105 1076 1042 1051
1082 1010
1051 1040 1033 988
989 1006 989
1000 846
829 837 834
823
Viscosity (ml/g)
798 798 780

800
600
400
200
0
Unbleached L LE LEP
285

Figure 4
a)
80
67 68
70
60 61 62
58
60
53
Brightness (% ISO)
51
50 45 46 46
45 43 43 44 45 44 43
40 42
40 36 36 36 36
30
20
10
0
Unbleached L LE LEP
b) c)
13 95
90
12
HP HP
85
HP-LEP HP-LEP
b* 11 L*
SE1 SE1
SE1-LEP 80 SE1-LEP
SE2 SE2
10
SE2-LEP 75 SE2-LEP
9 70
-1 0 1 2 3 4 10 11 12 13
a* C*
286

Table 1. Steam explosion conditions, process yields and water retention capacity of the
samples.
HP SE1 SE2
Pre-extraction No Yes Yes
1st cycle (min) - 3 10
2nd cycle (min) - - 3
Severity S0 - 2.92 3.56
Yield (%) - 81.9 62.5
Water retentiona 267 359 434
a
Water retention capacity as grams of water per 100 grams of dry sample
Table 2. Residual active alkali (AA) and sulfidity (S) in the black liquors.
Sample AA S
HP - Control 4.0 23.1
HP - Control-Buffer 4.9 24.4
HP - Laccase 4.7 17.0
SE1 - Control 4.6 25.0
SE1 - Control-Buffer 3.9 20.3
SE1 - Laccase 3.8 17.4
SE2 - Control 5.4 19.8
SE2 - Control-Buffer 4.5 22.1
SE2 - Laccase 5.1 18.0
287

Table 3. Hydrogen peroxide consumption (%) measured in the different bleaching

effluents after the LEP sequence.
Sample H2O2 consumption (%)

HP-Lc 90.3
HP-L 92.7
SE1-Lc 87.5
SE1-L 88.0
SE2-Lc 66.1
SE2-L 68.1
288

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

INTEGRACIÓN DEL PROCESO KRAFT DE OBTENCIÓN

MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR

Raquel Martín Sampedro

Bajo la dirección de los doctores

Juan Carlos Villar Gutiérrez

©Raquel Martín Sampedro, 2011

INTEGRACIÓN DEL PROCESO KRAFT DE OBTENCIÓN

Que para optar al grado de Doctor

Raquel Martín Sampedro

Laboratorio de Celulosa y Papel (CIFOR)

INTEGRACIÓN DEL PROCESO KRAFT DE PRODUCCIÓN DE

Que el trabajo de investigación recogido en la memoria titulada “Integración del

Madrid, 29 de Agosto de 2011.

Juan Carlos Villar Gutiérrez Juan Antonio Martín Parra

Quisiera expresar mi más sincero agradecimiento a todos aquellos que de alguna

No se me olvidan mis compañeros de comidas en el INIA, gracias por las risas,

Y gracias a mis amigos, porque la distancia física no siempre equivale a

LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... v

2.1 - Composición de la biomasa lignocelulósica .................................................... 11

2.1.1 - Celulosa .................................................................................................... 13

2.1.2 - Hemicelulosa ............................................................................................ 14

2.1.3 - Lignina ...................................................................................................... 16

2.2 - Procesos implicados en la fabricación de pastas Kraft..................................... 18

2.2.1 - Materias primas utilizadas ........................................................................ 19

2.2.2 - Pasteado .................................................................................................... 21

2.2.3 - Blanqueo ................................................................................................... 25

2.3 - Concepto de biorrefinería ................................................................................. 27

2.4 - Adaptación de un proceso Kraft al concepto de biorrefinería lignocelulósica . 32

2.4.1 - Extracción de hemicelulosas previa al pasteado Kraft ............................. 34

2.4.2 - Pre-tratamiento de explosión por vapor ................................................... 36

2.5 - Biotecnología aplicada a la producción de pasta Kraft y bioetanol ................. 41

2.5.1 - Biopulpeo ................................................................................................. 45

2.5.2 - Bioblanqueo .............................................................................................. 47

2.5.3 - Producción de bioetanol ........................................................................... 49

4 - DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS.......................................................................... 57

4.1 - Cambios químicos y estructurales debidos al pre-tratamiento de explosión por

4.1.1 - Cambios en la composición química ........................................................ 64

4.1.3 - Cambios en las estructuras de lignina ...................................................... 70

4.1.4 - Análisis de la capacidad de retención de agua de las muestras ................ 78

4.1.5 - Cambios de la porosidad relativa y área superficial ................................. 79

4.2 - Hidrólisis de las fracciones líquida y sólida generadas en el pre-tratamiento de

4.2.1 - Hidrólisis ácida y enzimática de la fracción líquida ................................. 84

4.2.2 - Hidrólisis enzimática de la fracción sólida ............................................... 87

4.2.3 - Rendimiento global del proceso de hidrólisis enzimática ........................ 90

4.3 - Efecto del pre-tratamiento de explosión por vapor en el pasteado Kraft y en el

4.3.1 - Efecto del pre-tratamiento en el pasteado Kraft ....................................... 93

4.3.2 - Efecto del pre-tratamiento en el bioblanqueo ......................................... 100

4.4.2 - Biopulpeo con hongos ligninolíticos ...................................................... 116

4.4.3 - Comparación entre biopulpeo SE+LMS y biopulpeo fúngico ............... 119

4.5 - Utilización de Hesperaloe funifera en el esquema de biorrefinería forestal

4.5.1 - Caracterización de Hesperaloe funifera ................................................. 122

4.5.2 - Pre-tratamiento de explosión por vapor ................................................. 122

4.5.3 - Efecto del pre-tratamiento en el pasteado Kraft y en el biopulpeo de H.

4.5.4 - Efecto del pre-tratamiento en el bioblanqueo de H. funifera ................. 129

5 - CONCLUSIONES / CONCLUSIONS ........................................................................ 135

6 - TRABAJOS FUTUROS ............................................................................................. 143

7 - BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................... 147

PUBLICACIÓN I: ............................................................................................ 171